STABILITAS TERMAL DAN PERGERAKAN DINAMIS

KLENOW-LIKE DNA POLIMERASE I ITB-1 BERDASARKAN

SIMULASI DINAMIKA MOLEKUL

DISERTASI

Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor dari

Institut Teknologi Bandung

SANTI NURBAITI

NIM : 30505007

(Program Studi Kimia)

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2009

ABSTRAK

STABILITAS TERMAL DAN PERGERAKAN DINAMIS

KLENOW-LIKE DNA POLIMERASE I ITB-1 BERDASARKAN

SIMULASI DINAMIKA MOLEKUL

Oleh

Santi Nurbaiti

NIM : 30505007

Penelitian sifat stabilitas termal protein telah membuka wawasan baru terhadap pengembangan ilmu dasar maupun aplikasi praktis khususnya di dunia industri. Faktor penyebab stabilitas termal dari suatu protein telah ditentukan dengan berbagai teknik eksperimen maupun pendekatan komputasi. Keseluruhan penelitian yang telah dilakukan, telah menyimpulkan bahwa sifat stabilitas termal tidak terfokus pada satu jenis interaksi intramolekul dalam protein, tetapi lebih menyarankan bahwa faktor penentu ini dapat berbeda dari satu protein ke protein yang lain. Oleh karena itu, penelitian untuk mengungkap faktor penentu sifat stabilitas termal dari suatu protein masih terus dilakukan.

Model enzim yang digunakan dalam penelitian ini adalah DNA Polimerase (Pol) I yang diisolasi dari isolat lokal Geobacillus thermoleovorans. Enzim DNA Pol I umum digunakan dalam bioteknologi seperti pengembangan teknologi PCR dan penentuan urutan nukleotida. Gen penyandi DNA Pol I dari bakteri di atas, selanjutnya disebut sebagai DNA Pol I ITB-1 telah diklon dan diekspresikan secara heterolog di Escherichia coli. Aktivitas polimerase optimum enzim ini pada 65oC (338 K) dan pH 7.4. Hasil penjajaran asam amino terhadap keluarga Pol I lainnya menunjukkan bahwa enzim ini terdiri atas tiga domain yaitu eksonuklease 5’�3’, eksonuklease 3’�5’ dan polimerase 5’�3’. Fragmen besar enzim ini yang hanya terdiri atas dua domain yaitu eksonuklease 3’�5’ dan polimerase 5’�3’ dinamakan sebagai Klenow-like DNA Pol I ITB-1, selanjutnya digunakan sebagai model untuk mengkaji struktur fungsi serta pemahaman mengenai sifat stabilitas termal dan dinamika enzim.

Untuk mendapatkan pemahaman sifat stabilitas termal Klenow-like DNA Pol I ITB-1 telah dilakukan studi dinamika molekul (MD) pada berbagai temperatur yaitu 300, 350, 400 dan 500 K. Hasil simulasi pada temperatur di atas temperatur optimum dari aktivitas polimerase (350, 400 dan 500 K) telah memberikan gambaran terhadap proses awal pembukaan lipatan (unfolding) enzim yang terkarakterisasi melalui proses pemisahan antarmuka domain eksonuklease 3’�5’

ii

dan polimerase 5’�3’. Hal ini menyarankan bahwa daerah tersebut merupakan daerah yang relatif labil dibandingkan daerah-daerah lain pada DNA Pol I ITB-1, disamping itu integritas kedua domain merupakan faktor kunci stabilitas enzim. Selain itu, hasil ini juga mengindikasikan bahwa proses awal unfolding merupakan proses yang tidak tergantung temperatur.

Kajian lebih mendalam difokuskan pada proses pemisahan kedua domain untuk mendapatkan informasi residu-residu yang berperan penting dalam mempertahankan daerah antarmuka tersebut dengan menggunakan data simulasi pada 350 K. Hasilnya menunjukkan adanya beberapa residu asam amino berperan penting dalam mempertahankan stabilitas daerah antarmuka yaitu interaksi elektrostatik antardomain antara Lys374-Glu489 dan Lys381-Glu487. Untuk mengevaluasi pentingnya interaksi antardomain tersebut, dilakukan mutasi pada salah satu residu asam amino secara in silico dan mengevaluasi energi bebas solvasi (∆∆Gsolv) mutan-mutan tersebut. Substitusi Glu menjadi Gln pada posisi 487 dan 489 akan mengubah interaksi elektrostatik menjadi ikatan hidrogen. Hasil perhitungan (∆∆Gsolv) menunjukkan bahwa protein mutan lebih tidak stabil dibandingkan wild type-nya. Sedangkan hasil perhitungan (∆∆Gsolv) untuk penggantian Glu menjadi Asp dengan tetap mempertahankan interaksi elektrostatiknya mengindikasikan bahwa protein mutan memiliki kestabilan termal yang lebih tinggi. Hasil ini menyarankan bahwa interaksi elektrostatik pada daerah antarmuka domain berperan penting dalam mempertahankan kestabilan struktur Klenow-like DNA Pol I ITB-1.

Informasi tentang stabilitas termal keluarga DNA Pol I masih sangat terbatas, untuk itu telah dilakukan studi komparasi terhadap padanan enzim yang sama namun berasal dari kelompok organisme yang berbeda yaitu Fragmen Klenow (KF) dari Escherichia coli yang merupakan mikroorganisme mesofilik dan Klenow Taq I (Klentaq) yang berasal dari mikroorganisme termofilik Thermus aquaticus. Simulasi MD terhadap KF telah dilakukan pada temperatur 300, 315, 328 dan 350 K. Hasilnya mengindikasikan bahwa proses awal unfolding terjadi melalui proses yang sama yaitu terpisahnya domain eksonuklease 3’�5’ dengan polimerase 5’�3’. Analisis lebih lanjut mengindikasikan bahwa integritas kedua domain dipengaruhi oleh interaksi elektrostatik antara Lys422-Glu541 dan ikatan hidrogen antara Arg425-Ser538. Interaksi antardomain tersebut telah dievaluasi lebih lanjut melalui mutan in silico. Sedangkan simulasi MD terhadap Klentaq telah dilakukan pada temperatur 300, 350 dan 400 K dengan hasil yang mengindikasikan bahwa proses awal unfolding Klentaq ditandai dengan rusaknya subdomain ibu jari dan jemari pada domain polimerase, diikuti dengan pemisahan domain eksonuklease 3’�5’ dan polimerase 5’�3’. Analisis lebih lanjut pada daerah tersebut menunjukkan bahwa Klentaq mempunyai 4 interaksi elektrostatik antardomain yaitu Lys354-Glu445, Asp355-Arg563, Glu363-Arg556, Asp371-Arg435. Hal ini menyarankan bahwa interaksi antarmuka domain pada Klentaq jauh lebih stabil dibanding 2 padanan enzim lainnya

iii

Pendekatan SDM juga telah dilakukan untuk mempelajari pergerakan dinamis Klenow-like DNA Pol I ITB-1 dengan menggunakan 2 sistem solvasi yaitu secara implisit dan eskplisit pada temperatur 300 dan 350 K. Hasil simulasi memperlihatkan adanya pergerakan konformasi secara periodik yang terkonsentrasi pada subdomain ibu jari dan jemari. Pergerakan ini diperlukan untuk aktivitas enzimatis. Namun tanpa kehadiran substrat pergerakan ini diduga karena potensial permukaan elektrostatik pada daerah antarmuka kedua subdomain tersebut didominasi oleh muatan positif yang menyebabkan terjadinya saling tolak menolak secara berkesinambungan. Berdasarkan hasil-hasil yang telah diperoleh, dapat disarankan bahwa proses awal unfolding terutama untuk Klenow-like DNA Pol I ITB-1 dan KF terjadi melalui pemisahan domain eksonuklease 3’�5’ dengan polimerase 5’�3’. Sedangkan pada Klentaq ditandai dengan rusaknya subdomain ibu jari dan jemari pada domain polimerase, diikuti dengan pemisahan domain eksonuklease 3’�5’ dan polimerase 5’�3’. Stabilitas protein sangat ditentukan oleh konektivitas kedua domain yang dipengaruhi oleh interaksi antardomain. Peningkatan jumlah interaksi elekstrostatik antardomain dapat menyebabkan kenaikan sifat stabilitas termal enzim di keluarga DNA Pol I. Interaksi antardomain diduga juga berperan penting terhadap pergerakan dinamis Klenow-like DNA Pol I ITB-1. Informasi ini belum pernah dilaporkan sebelumnya, sehingga diharapkan dapat menambah khasanah ilmu pengetahuan terutama yang berkaitan dengan stabilitas termal keluarga enzim DNA Pol I. Kata kunci: DNA polimerase I, mutasi in silico, stabilitas termal protein,

simulasi dinamika molekul, perubahan energi bebas mutasi, pergerakan dinamis, proses awal unfolding

iv

ABSTRACT

THERMAL STABILITY AND DYNAMIC MOTION OF

KLENOW-LIKE DNA POLYMERASE I ITB-1 BASED ON

MOLECULAR DYNAMICS SIMULATION

By

Santi Nurbaiti

NIM : 30505007

Research on the mechanisms of thermal stability of protein has extensively been carried out to development of basic sciences and practical applications, especially for protein engineering. This subject has been performed through various experimental and computational studies. Some of the results showed that no general rule for the factors of thermal stability in protein. Thermal stability depends on the combination of many factors. Therefore, research to elucidate the factors that maintaines the thermal stability of protein are still carried out. DNA polymerase (Pol) I from local isolate Geobacillus thermoleovorans has used as a model system to study thermal stability of thermostable enzyme. DNA Pol I have been used extensively in molecular biological research, especially in PCR and sequencing techniques. The pol I gene from the above bacteria has been cloned and overexpressed in Escherichia coli, namely DNA Pol I ITB-1. The enzyme has optimal polymerase activity at 65oC (338 K) and pH 7.4. Based on amino acids sequences homology showed that the enzyme consist of three structural domain, 5’�3’ exonuclease, 3’�5’ exonuclease and 5’�3’ polymerase. The large fragment consisting only two domains i.e 3’�5’ exonuclease and 5’�3’ polymerase is namely as Klenow-like DNA Pol I ITB-1. The fragment used as a model system to understand the molecular basis for dynamics and thermal stability. Factors that govern thermal stability of Klenow-like DNA Pol I ITB-1 at atomic level was elucidated by using molecular dynamics (MD) simulation at various temperature: 300, 350, 400 and 500 K. From the trajectories at 350, 400 and 500 K, it has been found that there was similarity in the unfolding process of the enzyme through disruption of the interface between 3’�5’ exonuclease and 5’�3’ polymerase domains. However, the unfolding process occurred very rapidly at higher temperature. This implies that the interface region was relatively unstable compared to other regions. In addition, the results also indicating that the initial unfolding process of enzyme was temperature independent.

v

In order to identify amino acids residues responsible for the stability of the interface domain, further analysis was carried out focusing on the separation of the two domains trough simulation at 350 K. It was found that at least two pairs of amino acid residues i.e Lys374-Glu489 and Lys381-Glu487, formed electrostatic interaction at the interface domain and played important role in the contact between two domains. These interaction were examined through in silico mutation by comparing the free energy solvation changes (∆∆Gsolv) between the wild type and the mutants. The substitution of Glu�Gln at 487 and 489 were designed to change the electrostatic interaction into charge-neutral hydrogen bond between the side chain. The mutant caused positive values of ∆∆Gsolv suggesting that the mutant protein was less stable compared to the wild type. While the substitution of Glu to Asp at position 487 and 489 preserved the electrostatic interaction. The last two mutants showed negative value of ∆∆Gsolv suggesting that the protein were more stable. All the results suggested that the electrostatic interaction between Lys374-Glu489 and Lys381-Glu487 have essential role in maintaining the stability of interface domain on Klenow-like DNA Pol I ITB-1, and thus the whole structure of the enzyme. Very limited information is available concerning thermal stability of DNA Pol I family. Therefore, molecular dynamics simulation at various temperatures also performed to Klenow Fragment (KF) from Escherichia coli and Klenow Taq Pol I (Klentaq) from Thermus aquaticus for comparison with the Klenow-like DNA Pol I ITB-1. MD simulation of the KF was carried out at temperature 300, 315, 328 and 350 K. The results showed that the unfolding of KF was initiated by the separation of interface between 3’�5’ exonuclease and 5’�3’ polymerase domains. Further analysis indicated that at leat two pairs of amino acid residues, i.e. Lys422-Glu541 and Arg425-Ser538 were apparently responsible for maintaining domain integrity. The first pair of amino acid residues form electrostatic interaction and the second pair form hydrogen bond at the interface domain of KF. The role of these interactions was also evaluated by performing in silico mutations. While the MD simulations of Klentaq was carried out at temperatures 300, 350 and 400 K. The unfolding process was started by destruction of thumb and fingers subdomain, followed by separation between 3’�5’ exonuclease and 5’�3’ polymerase domains. Klentaq shows the most stable enzyme, this might due to the existing of 4 electrostatic interactions between Lys354-Glu445, Asp355-Arg563, Glu363-Arg556, Asp371-Arg435 at the interface domain. The dynamic motions of Klenow-like DNA Pol I ITB-1 was studied by MD simulations with implicit and explicit solvent at 300 and 350 K. The simulations showed that there was existence of periodic movements, concentrated in thumb and fingers subdomains. These motions are important for their enzymatic activity. Further analysis on the electrostatic potential surface of Klenow-like DNA Pol I ITB-1 showed that the outer surface of fingers and thumb subdomain showed negative charge with patches of positive electrostatic potential concerted at the interface of these subdomains which caused repulsion between the subdomain.

vi

Based on the data obtained, the early stage of unfolding process of Klenow-like DNA Pol I ITB-1 and KF were occured by disruption of the interface domain, meanwhile for the Klentaq the initial unfolding process was occured by destruction of thumb and fingers subdomain, followed by separation of interface between 3’� 5’ exonuclease and 5’�3’ polymerase domains. Hence, the protein stabilities are determined by domain integrity which influenced by interdomain interactions. Furthermore, this studies also suggested that increasing the number of electrostatic interaction at the interface region contributed to increase thermal stability of DNA Pol I family. Besides that, interdomain interactions might be play an important role to the dynamic motions of Klenow-like DNA Pol I ITB-1. These informations have not been reported yet, so it is expected to contribute for development of basic science, especially on understanding of thermal stability of DNA Pol I family . Keywords : DNA polymerase I, dynamic motion, free energy perturbation,

in silico mutant, initial unfolding process, molecular dynamics simulation, thermal stability

vii

STABILITAS TERMAL DAN PERGERAKAN DINAMIS

KLENOW-LIKE DNA POLIMERASE I ITB-1 BERDASARKAN

SIMULASI DINAMIKA MOLEKUL

Oleh

Santi Nurbaiti

NIM : 30505007

(Program Studi Kimia)

Institut Teknologi Bandung

Menyetujui

Tim Pembimbing

Tanggal 01 Oktober 2009

Ketua

___________________________

(Dr. Akhmaloka)

Anggota Anggota

_______________________ _______________________ (Dr. Rukman Hertadi) (Dr. Muhamad A. Martoprawiro)

viii

Hope…. is the thing with feathers that perches in the soul and sings the tune without the words and never stops—at all (Emily Dickinson)(Emily Dickinson)(Emily Dickinson)(Emily Dickinson)

Bakti bagi para dosen saya,

Dedikasi bagi siapapun yang mendapatkan manfaat dari tulisan ini

Dipersembahkan kepada Ma, Pa, Deki Ersanda, Zahra, Dzakwan dan segenap keluarga tercinta

ix

PEDOMAN PENGGUNAAN DISERTASI

Disertasi Doktor yang tidak dipublikasikan terdaftar dan tersedia di Perpustakaan

Institut Teknologi Bandung, dan terbuka untuk umum dengan ketentuan bahwa

hak cipta ada pada pengarang dengan mengikuti aturan HaKI yang berlaku di

Institut Teknologi Bandung. Referensi kepustakaan diperkenankan dicatat, tetapi

pengutipan atau peringkasan hanya dapat dilakukan seizin pengarang dan harus

disertai dengan kebiasaan ilmiah untuk menyebutkan sumbernya.

Memperbanyak atau menerbitkan sebagian atau seluruh disertasi haruslah seizin

Direktur Program Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung.

x

UCAPAN TERIMA KASIH/ KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, Segala Puji bagi Allah SWT karena dengan Rahmat dan Karunia-

Nya penulis dapat merampungkan penelitian beserta penulisan disertasi sebagai

suatu rangkaian dalam menempuh pendidikan Program Doktor di Institut

Teknologi Bandung.

Penulis ingin menyatakan penghargaan sedalam-dalamnya pada semua pihak yang

berkontribusi selama melakukan penelitian dan penulisan, dalam berbagai peran.

Tanpa pengetahuan, keahlian, dedikasi, kemurahan hati, dan pengorbanan,

disertasi ini tidak mungkin diselesaikan. Ucapan terima kasih yang tulus penulis

haturkan kepada,

� Dr. Akhmaloka sebagai ketua Tim Pembimbing, Rukman Hertadi, DSc

dan Muhamad Abdulkadir Martoprawiro, PhD selaku anggota Tim

Pembimbing atas kesabaran dan kesediannya untuk memberikan saran, ilmu,

serta meluangkan waktu bimbingan selama penelitian berlangsung dan

selama penulisan disertasi ini.

� Institut Teknologi Bandung atas bantuan Beasiswa Voucher ITB yang

diterima selama menempuh pendidikan Program Doktor.

� Direktur Jendral Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional

Republik Indonesia yang telah memberikan beasiswa sandwich selama

melaksanakan sebagian penelitian di Kanazawa University, Jepang

� Dekan Sekolah Pascasarjana, Dekan FMIPA dan Ketua Prodi

Pascasarjana Kimia beserta staf pengajar yang telah memberikan bantuan

serta layanan kepada penulis selama menjalani Program Doktor di Institut

Teknologi Bandung

� Prof. Hidemi Nagao, PhD, Hiroaki Saito, PhD dan Dr. Taku Mizukami

yang telah memberikan ilmu dan bantuan selama pelaksaan penelitian di

Kanazawa University, Jepang

� Ketua KK Biokimia beserta seluruh staf atas pengertian yang diberikan

selama penulis menempuh Program Doktor

xi

� Rekan-rekan di kelompok sal4-termofilik : Dr. Laksmi Ambarsari,

Febriani Tahar MSi, Dr. Prima Endang, Dr. Heni Yohandini, Savante

Arreneuz MSi, Made Puspasari MSi, Baiq Viera MSi, Suharti MSi dan

drh. Safika MSi atas kerjasama, diskusi maupun dukungan yang diberikan

� Rekan-rekan di kelompok biokomputasi : Indrajaya MSi, Hira

Helwati MSi, Reza Aditama SSi, Suharta SSi serta Khabiburrahman atas

diskusi, bantuan dan kebersamaan selama ini

� Rekan-rekan di kelompok kimia teori : Rahmat Gunawan MSi, Yustinus

TM MSi, Hasan Al-Rasyid SSi atas semua bantuan dan diskusi yang

diberikan terkait dengan program-program komputasi

Ungkapan kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya penulis haturkan

kepada orang tua tercinta (Papa Bai, Papa Ermis, Mama Emi, Mama Asmah),

suami Deki Ersanda, anak-anak Zahra dan Dzakwan serta adik satu-satunya

Fahmy atas doa, pengertian, pengorbanan serta dorongan semangat yang tak

pernah padam hingga akhirnya penulis dapat menyelesaikan disertasi ini.

Penulis berharap disertasi ini, yang lahir dari pengamatan, penelitian, hipotesa

serta ditulis dalam rangkaian kata, memberikan manfaat bagi pembacanya.

Demikian akhirnya, disertasi ini penulis persembahkan.

Bandung, Agustus 2009.

Santi Nurbaiti

xii

DAFTAR ISI

ABSTRAK ........................................................................................................... i

ABSTRACT ....................................................................................................... iv

PEDOMAN PENGGUNAAN DISERTASI........................................................ ix

UCAPAN TERIMA KASIH/ KATA PENGANTAR........................................... x

DAFTAR ISI .....................................................................................................xii

DAFTAR LAMPIRAN...................................................................................... xv

DAFTAR GAMBAR DAN ILUSTRASI .......................................................... xvi

DAFTAR TABEL ............................................................................................ xix

DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG...................................................... xx

Bab I PENDAHULUAN................................................................................ 1

I.1 Latar Belakang Penelitian..................................................................... 1

I.2 Masalah Penelitian ............................................................................... 4

I.3 Pendekatan dan Metode Penelitian Yang Digunakan ............................ 5

I.4 Pelaksanaan Penelitian ......................................................................... 5

I.5 Sistematika Disertasi ............................................................................ 6

Bab II TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................... 7

II.1 Stabilitas Termal Protein ...................................................................... 7

II.1.1 Komposisi Asam Amino............................................................... 8 II.1.2 Interaksi Elektrostatik ................................................................. 11 II.1.3 Ikatan Disulfida .......................................................................... 13 II.1.4 Interaksi Hidrofob....................................................................... 14 II.1.5 Interaksi Aromatik...................................................................... 14 II.1.6 Ikatan Hidrogen.......................................................................... 16 II.1.7 Interaksi Antardomain ................................................................ 17 II.1.8 Parameter Ekstrinsik ................................................................... 18

II.1.8.1 Stabilisasi oleh garam ............................................................. 19 II.1.8.2 Stabilisasi oleh substrat ........................................................... 20

II.2 Simulasi Dinamika Molekul ............................................................... 20

II.2.1 Gaya Intramolekul ...................................................................... 22 II.2.1.1 Uluran Ikatan (Bond Streching)............................................... 23 II.2.1.2 Sudut Ikatan............................................................................ 24 II.2.1.3 Sudut Dihedral........................................................................ 25 II.2.1.4 Interaksi van der Waals (Potensial Lennard-Jones).................. 26 II.2.1.5 Interaksi Elektrostatik (Potensial Couloumb) .......................... 26

II.2.2 Parameter Simulasi ..................................................................... 27

xiii

II.2.2.1 Sistem Protein-Pelarut............................................................. 28 II.2.2.2 Parameter Temperatur dan Tekanan ........................................ 30

II.2.2.2.1 Kontrol Temperatur dengan Metode Berendsen................... 30 II.2.2.2.2 Kontrol Temperatur dengan Metode Langevin Dynamics .... 31 II.2.2.2.3 Kotrol Temperatur dengan Metode Noose-Hover ................ 31

II.2.2.3 Minimisasi .............................................................................. 33 II.2.2.3.1 Metode Steepest Descent (SD) ............................................ 34 II.2.2.3.2 Metode Conjugate Gradient (CG)........................................ 35

II.2.2.4 Ekuilibrasi .............................................................................. 35 II.2.3 Simulasi Dinamika Molekul Untuk Mempelajari Stabilitas Protein. ................................................................................................... 36

II.3 DNA Polimerase ................................................................................ 37

II.3.1 Klasifikasi DNA Polimerase ....................................................... 38 II.3.2 Struktur dan Fungsi DNA Polimerase ......................................... 42

II.3.2.1 Aktivitas dan Domain Eksonuklease 5’�3’ ............................ 43 II.3.2.2 Aktivitas dan Domain Eksonuklease 3’�5’ ............................ 44 II.3.2.3 Aktivitas dan Domain Polimerase 5’�3’ ................................ 46

II.3.3 DNA Polimerase I (Pol I)............................................................ 48 II.3.3.1 DNA Pol I E.coli..................................................................... 48 II.3.3.2 DNA Pol I ITB-1 .................................................................... 49 II.3.3.3 DNA Pol I T.aquaticus............................................................ 50

Bab III METODOLOGI PENELITIAN.......................................................... 51

III.1 Alat .................................................................................................... 51

III.2 Metode ............................................................................................... 51

III.2.1 Model 3 Dimensi Protein dan Parameterisasi .............................. 51 III.2.2 Solvasi........................................................................................ 52

III.2.2.1 Solvasi secara implisit......................................................... 52 III.2.2.2 Solvasi secara eksplisit menggunakan perangkat lunak

AMBER.............................................................................. 53 III.2.2.3 Solvasi secara eksplisit menggunakan perangkat lunak

NAMD................................................................................ 53 III.2.3 Kondisi Simulasi ........................................................................ 54 III.2.4 Minimisasi.................................................................................. 55 III.2.5 Pemanasan dan Ekulibrasi .......................................................... 57 III.2.6 Simulasi Dinamika Molekul ....................................................... 61

III.3 Analisis .............................................................................................. 61

III.3.1 Root-mean-square deviation (RMSD)......................................... 62 III.3.2 Root-mean-square fluctuation (RMSF) ....................................... 62 III.3.3 Solvent Accessible Surface Area (SASA) .................................... 62 III.3.4 Analisis Struktur Sekunder (Secondary Structure Analysis) ........ 63 III.3.5 Ikatan Hidrogen.......................................................................... 65 III.3.6 Perhitungan Potensial Elektrostatik............................................. 65 III.3.7 Dynamic Cross Correlation Map (DCCM) ................................. 66

xiv

III.3.8 Principal Component Analysis (PCA)......................................... 66 Bab IV HASIL DAN PEMBAHASAN........................................................... 68

IV.1 Model Enzim Klenow-like DNA Pol I ITB-1 ...................................... 69

IV.2 Stabilitas Enzim Pada Temperatur 300 K............................................ 73

IV.2.1 Klenow-like DNA Pol I ITB-1..................................................... 74 IV.2.2 Fragmen Klenow Pol I (KF)........................................................ 77 IV.2.3 Klenow Taq Pol I (Klentaq)........................................................ 82

IV.3 Interaksi Antardomain dan Stabilitas Termal Enzim ........................... 88

IV.3.1 Klenow-like DNA Pol I ITB-1..................................................... 88 IV.3.2 Klenow Fragment (KF)............................................................... 99 IV.3.3 Klenow Taq Pol I (Klentaq)...................................................... 108

IV.4 Pergerakan Dinamis Klenow-like DNA Pol I ITB-1 .......................... 119

IV.5 Diskusi Umum ................................................................................. 129

Bab V KESIMPULAN................................................................................ 132

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 135

RIWAYAT HIDUP ......................................................................................... 156

LAMPIRAN .................................................................................................... 156

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran A Publikasi Jurnal ........................................................................ 159

xvi

DAFTAR GAMBAR DAN ILUSTRASI

Gambar II.1. Perbandingan komposisi asam amino protein yang diisolasi dari

mikroorganisme mesofil (hijau) dan termofil (merah). (a) mesofil versus moderat termofil dan (b) mesofil versus hipertermofil. ......................................................................... 10

Gambar II.2. Representasi jaringan interaksi elektrostatik pada antarmuka subunit GDH P.furiosus (Yip dkk., 1998). .............................. 12

Gambar II.3. Klaster aromatik yang teridentifikasi pada protein RnaseH dari termofil T.thermofilus HB8 (Kode PDB : 1RIL). (Ishikawa dkk., 1993; Kannan dan Vishveshwara, 2000) ................................. 15

Gambar II.4. Normalisasi jumlah ikatan hidrogen pada sejumlah protein yang berasal dari mesofil, termofil dan hipertermofil (Szilàgyi dan Zàvodszky, 2000). .................................................................. 16

Gambar II.5. Model hipotetik untuk mengilustrasikan energi potensial pada persamaan di atas. .................................................................. 23

Gambar II.6. Uluran ikatan antara atom i dan j ........................................... 23 Gambar II.7. Interaksi sudut ikatan yang dibentuk antara atom i, j dan k...... 25 Gambar II.8. Salah satu jeni interaksi van der Waals dimana suatu molekul

menginduksi pembentukan dipol molekul lain ........................ 26 Gambar II.9. Interaksi elektrostatik antara partikel i dan j ............................ 27 Gambar II.10. Representasi jari-jari cutoff Rco suatu sistem dalam simulasi

dinamika molekul ................................................................... 28 Gambar II.11. Kondisi batasan berkala dalam penggambaran 2 dimensi (2D)

pada proses simulasi ............................................................... 30 Gambar II.12. Permukaan energi potensial suatu protein ............................... 33 Gambar II.13. Representasi perbedaan algoritma minimisasi antara metode SD

dan CG. . ................................................................................ 36 Gambar II.14. Struktur Kristal 3D dari Taq Pol I. . ........................................ 43 Gambar II.15. Model yang diajukan untuk proses polimerisasi maupun

pengeditan pada DNA Pol. ..................................................... 45 Gambar II.16. Mekanisme reaksi polimerisasi yang dimediasi oleh dua ion

logam divalent. . ..................................................................... 47 Gambar III.1 Pola dasar α-helix (digambarkan dalam bentuk batang) yang

terbentuk akibat interaksi hidrogen (garis putih putus-putus) antara atom H yang terikat pada atom N (k+4) dengan residu karbonil (k)............................................................................. 63

Gambar III.2 Pola dasar β-sheet (digambarkan dalam bentuk batang) yang melibatkan dua ikatan hidrogen (garis putih terputus-putus). .. 64

Gambar III.3 Ilustrasi ikatan hidrogen yang dibentuk oleh atom akseptor, H dan donor dengan sudut ω dan θ ............................................. 65

Gambar IV.1 Hasil penjajaran urutan asam amino antara BF (Kode PDB 1XWL) dengan Klenow-like DNA Pol I ITB-1.. ..................... 72

Gambar IV.2 Komparasi antara cetakan protein yaitu BF (biru) dengan model Klenow-like DNA Pol I ITB-1 (merah). .................................. 73

Gambar IV.3 Evaluasi stabilitas model enzim Klenow-like DNA Pol I ITB-1 pada temperatur simulasi 300 K.............................................. 75

xvii

Gambar IV.4 (a) Profil perubahan perubahan struktur tersier dan (b) perubahan komposisi struktur sekunder protein selama proses simulasi.. ................................................................................ 76

Gambar IV.5 Struktur 3D KF tanpa dNTP dan PPi....................................... 78 Gambar IV.6 Evaluasi stabilitas model enzim KF pada temperatur 300 K.

............................................................................................... 80 Gambar IV.7 (a) Perubahan struktur tersier KF selama proses simulasi di 300

K, (b) Analisis perubahan komposisi struktur sekunder........... 81 Gambar IV.8 Struktur 3D Klentaq yang telah dipisahkan dari dNTP.. .......... 83 Gambar IV.9 Evaluasi stabilitas model enzim Klentaq pada temperatur 300 K.

. .............................................................................................. 84 Gambar IV.10 (a) Perubahan struktur tersier Klentaq selama proses simulasi di

300 K, dan (b) Komposisi komponen struktur sekunder.......... 85 Gambar IV.11 Peta fleksibilitas residu-residu asam amino antara Klenow-like

DNA Pol I ITB-1, KF dan Klentaq berdasarkan nilai RMSF pada temperatur 300 K............................................................ 87

Gambar IV.12 Kurva RMSD Klenow-like DNA Pol I ITB-1 terhadap waktu simulasi pada temperatur 350 (hitam), 400 (merah) dan 500 K (hijau)..................................................................................... 89

Gambar IV.13 Perubahan konformasi Klenow-like DNA Pol I ITB-1 yang teramati pada simulasi (a) 500 K; (b) 400 K dan (c) 350 K.. ... 92

Gambar IV.14 (a) Evaluasi perubahan konformasi global yang ditandai dengan kenaikan nilai SASA total dan SASA non-polar selama berlangsungnya simulasi di 400 dan 500 K (b) Persentase perubahan komposisi struktur sekunder selama simulasi di 400 dan 500 K. .............................................................................. 93

Gambar IV.15 Analisis perubahan struktur sekunder dan tersier Klenow-like DNA Pol I ITB-1 selama proses simulasi di 350 K. ................ 95

Gambar IV.16 Jarak ikatan interaksi elektrostatik antara Lys381-Glu487 (merah) dan Lys374-Glu489 (hitam) selama proses simulasi pada 350 K. ............................................................................ 96

Gambar IV.17 Kurva ∆∆Gsolv sebagai fungsi dari parameter kopling (λ) ketiga mutan in silico yaitu Glu487Gln (merah), Glu478Asp (hitam); Glu489Asp (hijau) .................................................................. 98

Gambar IV.18 (a) Profil RMSD KF terhadap waktu simulasi pada berbagai temperatur yaitu 315 (hijau), 328 (merah) dan 350 K (hitam). (b) Superposisi struktur protein hasil simulasi pada 315 K (hijau) terhadap struktur awalnya (merah)............................. 101

Gambar IV.19 Perubahan konformasi KF yang teramati pada simulasi (a) 315 K; (b) 328 K dan (c) 350 K.. ................................................. 103

Gambar IV.20 Analisis kestabilan struktur sekunder dan tersier protein pada 328 K (a) Nilai SASA total KF dan (b) Persentasi komponen struktur sekunder α-helix (hitam) dan β-sheet (merah) selama simulasi. ............................................................................... 104

Gambar IV.21 Jarak interaksi antardomain Lys422-Glu541 (abu-abu) dan Arg425-Ser538 (hitam) pada antarmuka kedua domain KF pada simulasi di 328 K.................................................................. 105

xviii

Gambar IV.22 Kurva perubahan energi bebas (∆∆Gsolv) sebagai fungsi dari parameter kopling λ terhadap ke empat mutan in silico KF. Mutan Glu541Gln (hitam), Glu541Asp (merah), Ser538Ala (hijau) dan Ser538Thr (kuning)............................................. 107

Gambar IV.23 Stabilitas Klentaq selama proses simulasi di berbagai temperatur yaitu 350 (hijau), 373 (merah) dan 400 K (hitam) yang dievaluasi berdasarkan nilai RMSD terhadap waktu.............. 109

Gambar IV.24 Snapshot trajektori Klentaq pada berbagai temperatur simulasi (a) 350 K; (b) 373 K dan (c) 400 K. ...................................... 111

Gambar IV.25 Perubahan persentase komponen struktur sekunder Klentaq sebagai fungsi dari waktu simulasi (a) di 350 K dengan komponen α-helix (hitam), β-sheet (merah), turn (hijau) serta coil (kuning) dan (b) di 373 K dengan komponen α-helix (hitam) dan β-sheet (merah).................................................. 112

Gambar IV.26 Evaluasi struktur tersier Klentaq selama proses simulasi berlangsung (a) di 350 K dan (b) di 373 K. ........................... 114

Gambar IV.27 Jarak empat pasang interaksi elektrostatik antardomain selama proses simulasi Klentaq di 337 K. Pasangan interaksi Asp355-Arg563 (hitam), Asp371-Arg435 (merah), Glu363-Arg556 (hijau) dan Lys354-Glu445 (kuning)..................................... 115

Gambar IV.28 Kurva perubahan energi bebas (∆∆Gsolv) sebagai fungsi dari parameter kopling λ terhadap ke empat mutan in silico Klentaq. Mutan Asp371Glu (hitam), Asp371Asn (merah), Glu445Asp (hijau) dan Glu445Gln (kuning)............................................ 117

Gambar IV.29 Komparasi nilai RMSD antara Klentaq (hitam), Klenow-like DNA Pol I ITB-1 (hijau) dan KF (merah) pada simulasi di 350 K. ......................................................................................... 118

Gambar IV.30 Analisis pergerakan dinamis subdomain ibu jari dan jemari selama proses simulasi di 300 dan 350 K dengan sistem solvasi implisit.. ............................................................................... 121

Gambar IV.31 Analisis pergerakan dinamis subdomain ibu jari dan jemari selama proses simulasi di 350 K dengan sistem solvasi eksplisit. . ............................................................................................ 123

Gambar IV.32 Representasi hasil proyeksi pergerakan dinamis protein selama proses simulasi di 300 K dan 350 K dengan sistem solvasi eksplisit.. .............................................................................. 124

Gambar IV.33 Hasil perhitungan correlated motions antar residu dalam Klenow-like DNA Pol I ITB-1 dipetakan dalam bentuk DCCM.............................................................................................. 126

Gambar IV.34 Hasil perhitungan potensial permukaan elektrostatik Klenow-like DNA Pol I ITB-1, KF dan Klentaq. ...................................... 128

xix

DAFTAR TABEL

Tabel II.1. Komparasi komposisi interaksi elektrostatik pada enzim GDH

Clostridium symbiosum dan P.furiosus (Yip dkk., 1998)........ 12 Tabel II.2. Komparasi jumlah subunit pada enzim hipertermofil dengan

mesofil (diambil dari : Vieille dan Zeikus, 2001) .................... 18 Tabel II.3. Pengaruh garam klorida terhadap kinetika dan stabilitas termal

xylosa isomerase B.licheniformis. (Vieille dan Zeikus, 2001) . 19 Tabel II.4. Karakteristik klasifikasi DNA Polimerase (Perler dkk., 1996). 39 Tabel II.5. Motif lestari yang terdapat pada domain 5’�3’ eksonuklease

(Perler dkk., 1996). ................................................................. 44 Tabel II.6. Motif lestari yang terdapat pada domain 3’�5’ eksonuklease

(Perler dkk., 1996).................................................................. 45 Tabel IV.1. Karakteristik data struktur 3D Klenow-like DNA Pol I ITB-1

hasil permodelan..................................................................... 71 Tabel IV.2. Karakteristik data struktur 3D KF........................................... 77 Tabel IV.3. Karakteristik data struktur 3D Klentaq.................................... 82 Tabel IV.4. Komparasi rantai samping, pKa dan nilai indeks hidropati antara

Ser, Thr dan Tyr (Kyte dan Doolittle, 1982; Mathews dan van Holde, 1996)......................................................................... 106

xx

DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG

SINGKATAN Nama Pemakaian pertama kali pada halaman

PCR

Pol

DNA

SDM

3D

BF

KF

PDB

VMD

AMBER

NAMD

WT

GDH

GADPH

MkFT

ATP

NADPH

NMR

BPTI

LJ

GB

PBC

2D

NPT

NVT

Polymerase Chain Reaction

Polimerase / Polymerase

Deoxyribo nucleic acids

Simulasi Dinamika Molekul

Tiga Dimensi

Bacillus Fragment

Klenow Fragment

Protein Data Bank

Visual Molecular Dynamics

Assisted Model Building with Energy

Refinement

Not Just Another Molecular Dynamics

Wild type

Glutamat dehidrogenase

Gliseraldehid 3-fosfat dehidrogenase

Methanopyrus kandleri formiltransefrase

Adenosine triphosphate

Nicotinamide adenine dinucleotide

phosphate

Nuclear Magnetic Resonance

Bovine pancreatic trypsin inhibitor

Lennard-Jones

Generalized Born

Periodic boundary condition

Dua dimensi

Isothermal-isobaric ensemble

Canonical ensemble

1

1

1

4

4

4

4

5

5

5

5

6

12

17

20

20

20

21

21

26

29

29

30

30

30

xxi

SD

CG

Rd

dNTP

ddNTP

BM

Da

BER

RT

Ppi

rRNA

APBS

RMSD

RMSF

SASA

DCCM

PCA

CI2

FEP

dCTP

Steepest descent

Conjugate gradient

Rubredoxin

deoxyribonucleotide triphosphate

dideoxyribonucleotide triphosphate

Berat Molekul

Dalton

Base excision repair

Reverse transcriptase

Pirofosfat

Ribosomal ribonucleic acids

Adaptive Poisson-Boltzmann Solver

Root-mean-square deviation

Root-mean-square fluctuation

Solvent accessible surface area

Dynamic cross-correlation map

Principal component analysis

Cymotrypsin inhibitor type 2

Free energy perturbation

deoxycytidine triphosphate

34

34

36

38

38

39

39

41

41

46

49

51

62

62

62

66

66

89

97

131

xxii

LAMBANG

oC

K

Å

b

Kb

θ

Kθ

χ

Kχ

σ

r

∆t

Rco

Km

Tm

derajat Celcius

derajat Kelvin

Angstrom

Panjang ikatan

tetapan panjang ikatan

Sudut ikatan

tetapan sudut ikatan

Sudut dihendral

tetapan sudut dihedral

fasa sudut dihedral

jarak antara dua atom

tahapan waktu (timestep)

jari-jari cutoff

Konstanta Michaelis-Menten

Temperature melting

Pemakaian pertama kali pada halaman

1

5

20

23

23

24

24

25

25

25

26

27

28

39

99