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Stabilität von Proteinen
Physiologische Stressbedingungen - extreme Temperaturen (-5 - 115°C) - hydrostatischer Druck (> 1200 bar) - hohe Salzkonzentrationen (> 4 M NaCl) - extreme pH Werte (-1 < pH < 12)
Anpassung des Organismus - Ausschließen des Faktors (z.B. Kompartimentierung) - Neutralisierung des Faktors (z.B. Synthese osmotischer Substanzen) - Toleranz (Adaptation) Anpassung auf molekularer Ebene
- Thermophilie, Psychrophilie - Barophilie - Halophilie - Acidophilie
Denaturierter Zustand von Proteinen
Tanford (1968): alle Strukturen, die vom nativen Protein durch die höchste Energiebarriere getrennt sind
heute: random coil
Ene
rgie
Reaktionskoordinate
U
N
ÜS
Größenverteilung eines random coil
Methoden der Denaturierung - Harnstoff, Guanidin - pH oder Temperatur - Detergenzien - org. Lösungsmittel Nachweis: Spektroskopie, Aktivität, Viskosität
ΔG
Messung eines Denaturierungsüberganges
Bestimmung der Harnstoff- bzw Guanidinkonzentration
ΔN = Brechungsindex (Guanidin) - Brechungsindex (Puffer)
Messung eines Denaturierungsüberganges Fl
uore
scen
ce /
CD
frac
tion
unfo
lded
urea (M) urea (M) temperature
frac
tion
unfo
lded
Voraussetzung für thermodynamische Analyse:
- reversibel (gleicher Übergang für N & U aus Ausgangsmaterial)
- gleicher Übergang mit unterschiedlichen Methoden
Auswertung eines Guanidinüberganges nach 2-Zustandsmodell ΔG = ΔGD + RT lnK (K = FU/FF)
im Gleichgewicht: ΔG = 0
ΔGD = -RT lnK
Bestimmung von ΔG unter Standardbedingungen (O M Denaturans, 25°C)
Methoden der Extrapolation - Bindungsmodell - Gleichgewichtsmodell nach Tanford - linear
1) Bindungsmodell
ΔGD = ΔG(H20) - Δn RT ln(1 + Ka)
mit: n = unterschiedliche Anzahl der Bindungsstellen für Denaturans an Protein in N und D
K = Bindungskonstante für Denaturans (Gdm = 0.6 M, Harnstoff = 0.1 M)
a = chem. Aktivität des Denaturans
Extrapolation 2) Gleichgewichtsmodell nach Tanford
Transferenergien für Aminosäuren (Lösungsmittel: Wasser / Denaturans)
Extrapolation 3) Lineare Extrapolation
ΔGD = ΔG(H20) - m [Denaturans]
mit: m = Steigung der Geraden
häufigste (einfachste) verwendete Methode kein theoretischer Hintergrund
Voraussetzung für thermodynamische Analyse:
- reversibel (gleicher Übergang für N & U aus Ausgangsmaterial)
- 2-Zustandsmodell: N <-> U
Denaturierung nach 3-Zustandsmodell
U I N α-Laktalbumin
(o) Tertiärstruktur (Nah UV CD) (Δ) Sekundärstruktur (Fern UV CD)
mit Calcium: - 2-Zustandsmodell
ohne Calcium: - Tertiär- und Sekundärstruktur verhalten sich unterschiedlich => mindest. 3 Zustände
Qualitativer Nachweis des Überganges mit Harnstoff-Gradientengelen
Thermische Denaturierung von Proteinen ΔG = ΔGT + RT lnK (K = FU/FF)
im Gleichgewicht: ΔG = 0
ΔGT = -RT lnK
Problem: nichtlineare Abhängigkeit von dGT und Temperatur ==> keine einfache Extrapolation auf 20 (25) °C (Standardbedingung)
T
Thermische Denaturierung von Proteinen
°C
kcal
/mol
°C °C
ΔG = ΔH - TΔS
°C
kcal
/mol
ΔG = Gnative - Gunf
Thermische Denaturierung - Auswertung Berechnung von ΔGT wie bei Gdm-Übergang,
aber keine einfache Extrapolation auf 25°C, da Enthalpie und Entropie nicht linear von T abhängen
Berechnung von ΔG bei T nach:
ΔG(T) = ΔHm(1-T/Tm) - ΔCp[(Tm - T) + T ln(T/Tm)]
erforderliche experimentelle Größen: Tm ΔHm ΔCp
1) Tm aus Auftragung von ΔG gegen T bekannt ( ΔG(Tm) = 0 )
2) Berechnung von ΔHm : ΔG(Tm) = 0 = ΔHm - TΔSm Auftragung ΔG gegen T Steigung in Tm entspricht ΔSm und ΔHm = TmΔSm
3) Berechnung von ΔCp : d(ΔH) / d(T) = ΔCp Messung des Wertepaares ΔHm und Tm bei verschiedenen Bedingungen (z.B. pH) (Näherung: ΔCp = 12 cal/mol/deg/residue (Protein 100 aa -> 1200 cal/mol/deg )
Thermische Denaturierung - Auswertung -
Detaillierte Protokolle zu finden in:
Pace and Scholz Measuring the conformational stability of a protein in: Protein Structure, a practical approach 2nd edition, ed.: T.E. Creighton; IRL Press, Oxford pp. 299-321
Thermische Denaturierung Differential Scanning Calorimetry (DSC)
Messgrößen:
Peakfläche entspr. Enthalpie
Peakspitze entspr. Tm
Differenz der Vor- und Nach- Übergangsbaseline entspr. ΔCp
keine direkte Messung von ΔG, aber
ΔG(T) = ΔHm(1 - T/Tm) -ΔCp[(Tm - T) + T ln(T/Tm)]