Biomaterials Research (2007) 11(4) : 151-155

151

Biomaterials

Research

C The Korean Society for Biomaterials

조직공학을 위한 생분해성 고분자 지지체의 멸균

Sterilization of Biodegradable Polymer Scaffolds for Tissue Engineering

김혜리1,2·이승진

3·박종철

1,2*

Hye-Lee Kim1,2, Seung Jin Lee3, and Jong-Chul Park1,2*

1BK 21 연세의과학사업단, 2연세대학교 의과대학 의학공학교실, 3

이화여자대학교 약학대학1Brain Korea 21 Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, Seoul 120-752, Korea2Department of Medical Engineering, Yonsei University College of Medicine, Seoul 120-752, Korea3College of Pharmacy, Ewha Womans University, Seoul 120-750, Korea(Received November 9, 2007/Accepted November 20, 2007)

It is necessary to sterilize all medical implants after fabrication and prior to their surgical placement to reduce the riskof infections and associated complication. Biodegradable polymers are susceptible of moisture and heat. Also, the ster-ilization techniques by EO gas, gamma irradiation or plasma treatment can significantly affect the mechanical and phys-ical properties of the scaffolds made of polyglycolide acid(PGA), polylactide acid(PLA) or polylactide-co-glycolideacid(PLGA). Sterilization techniques especially change the biodegradation rate of the scaffolds. The changes of themechanical and physical properties of the scaffolds cause them to fail in vivo. Therefore, it is necessary to develop newsterilization standards, which do not change the special character of biodegradable scaffolds.

Kye words: Sterilization, biodegraded polymer, Ethylene oxide, Gamma irradiation, Plasma treatment

서 언

활수준의 향상으로 야외활동 및 여가생활이 늘어남에 따

라 사고가 증가하고 의학발달로 인류의 평균수명이 연장

되어 고령인구가 증가하였다. 결과적으로 손상된 신체조직을 복

원하는 의료기술에 대한 관심이 높아지게 되었다. 손상된 신체

조직을 복원하기 위해 타인의 장기를 이식하는 방법과 생체재

료로 만든 인공조직 및 장기를 이용하여 손상된 부위를 복원

하는 방법이 있다. 장기의 기증은 제한되어 있는데 반해 이식

을 기다리는 환자의 수는 계속 증가하고 있어서 타인의 장기

를 이식하는 방법으로는 수요를 충족시킬 수 없게 되었다1). 따

라서 인공조직 및 장기를 이용하여 신체조직을 복원하는 의료

기술에 대한 연구가 지속적으로 이루어질 것이고 인공조직과

장기의 수요도 증가할 전망이다.

일정기간 후에 손상된 부위가 회복될 수 있는 경우 생분해

성 고분자화합물을 이용하여 손상된 부위와 유사한 지지체

(scaffold)를 만들어서 손상된 부위에 매식하게 된다. 생분해성

고분자화합물로 만든 지지체는 손상된 부위가 재생되는 동안

서서히 분해되어 생체에서 차후에 지지체를 적출할 필요가 없

다. 또한, 생분해성 고분자화합물은 여러 가지 크기나 형상으

로 제작이 가능하며, 화학적물리적 성질을 사용 용도에 맞게

조절할 수 있다는 장점을 갖고 있다2). 현재 독일과 프랑스에서

생분해성 고분자화합물의 시장 점유율이 지속적으로 증가하는

경향을 보이고 있으며3), 앞으로 우리나라에서도 이와 유사한

경향을 보일 것으로 예상된다. 생분해성 고분자화합물 중

polyglycolide acid(PGA), polylactide acid(PLA)은 체내 안정

성이 좋으며, 이들을 다양한 비율로 혼합하여 만든 polylactide-

co-glycolide acid(PLGA)은 비율을 조절해줌으로써 생체 분해도

를 쉽게 조절할 수 있다. 따라서 이들을 이용하여 뼈2,4,5)와 피

부2,6,7), 혈관2,8,9)

등을 대체하기 위한 연구가 진행되고 있다.

체내에 매식되기 전에 생체재료로 제조한 모든 지지체들은

반드시 멸균해야 한다. 의료용 도구는 일반적으로 고압과 고

열, 가스, 감마선을 이용하여 멸균하며10), 이들을 이용한 멸균

법의 장단점을 Table 1에 나타내었다. 가장 일반적으로 사용되

는 멸균법은 고압증기멸균법(steam sterilization)으로 고열로 가

열된 증기를 이용하여 피멸균품을 가열하여 살균한다. 이 방법

은 피멸균품에 열을 빠르고 균일하게 전달할 수 있으며, 미생

물의 단백질 응고를 촉진시켜서 멸균효과를 높일 수 있는 장

점을 갖고 있다10). 그러나 물과 열을 이용하여 멸균하기 때문

에 친수성 고분자화합물인 PLA, PGA, PLGA로 제조한 지지체

를 고압증기멸균법으로 처리하면, 지지체의 변형과 용해를 야

기시킨다13,14). 반면, 건열멸균법(dry heat sterilization)은

160~180oC로 가열된 공기를 이용하기 때문에 열에 약한 고

분자화합물이 용융되어 분자구조가 변할 수 있으므로 고분자화*책임연락저자: parkjc@yuhs.ac

생

<Review>

152 김혜리·이승진·박종철

Biomaterials Research 2007

합물에 대한 멸균방법으로 적합하지 않다10,15). 그러므로 최종

적으로 요구되는 형태와 분자구조를 갖는 지지체를 얻기 위해

서는 재료와 형상에 알맞은 멸균법을 선택하는 것이 중요하다.

본고에서는 고열을 사용하지 않는 ethylene oxide(EO) gas 멸

균법과 감마선(gamma irradiation) 멸균법이 PLA, PGA,

PLGA로 제조한 지지체에 미치는 영향에 대하여 상세히 기술

하고자 한다. 또한, 새로운 멸균법 중 열과 화학약품을 사용하

지 않는 플라스마(plasma) 멸균법16,17)이 지지체에 미치는 영향

에 대해서도 기술하고자 한다.

EO gas 멸균법

EO gas 멸균법은 고열과 물을 사용하지 않기 때문에 고압증

기멸균법만큼 광범위하게 사용된다. 피멸균품에 있는 미생물의

물과 유기산, 아미노산, 아민 등이 EO gas와 반응하여 사멸하

여 멸균하는 방법으로 광범위한 미생물을 사멸시킬 수 있다.

EO gas의 효율을 높이기 위하여 멸균기 내부의 습도는 25~

50%로 유지한다. EO gas 침투력에 의해 멸균력이 정해지므로

피멸균품의 형상에 따라서 멸균의 효율이 변하며, 세균포자에

대해서는 침투력이 떨어져서 살균력이 약하다. 또한, 피멸균품

의 표면에 침투한 EO gas가 흡착이 되면 멸균 후 제품에서

세포독성을 보이기도 한다10,18).

EO gas로 멸균 후 PLA와 PGA, PLGA 지지체의 분자량

(molecular weight)과 총 부피가 감소한다는 보고가 있다19).

PLA와 PGA의 화학구조는 Figure 1에서 보이는 바와 같이 카

르복시기를 갖고 있는데20), 카르복시기가 EO gas와 화학반응

을 하여 변형되어서 지지체의 분자량과 총 부피가 감소하는 것

으로 판단된다19,21). 이러한 분자량과 분자구조의 변화는 고분

자화합물의 생체내 분해도에 영향을 미치지만22), EO gas 멸균

한 지지체의 생체내 분해도는 멸균전과 큰 차이를 보이지 않

았다21). EO gas 멸균을 하는 동안 PLA의 결정성이 향상되어

PLA 지지체의 탄성계수는 EO gas 멸균 전 600 kN/m에서

멸균 후 613 kN/m으로 증가하였고23), PLGA 지지체에서도

유사한 경향을 보일 것으로 예상된다. Microparticle PLGA를

EO gas 멸균하면 Figure 2와 같이 particles의 형상이 무너지

고 서로 뭉치는 형상을 보이는데21), 이러한 현상은 멸균하는

온도에 의한 영향이 아니라 위에서 언급한 화학반응에 의한 영

향으로 판단된다24). 따라서 나노섬유나 다공성으로 이뤄진 PLA

와 PGA, PLGA지지체를 EO gas로 멸균하면 나노섬유나 기공

의 형태가 없어지고 서로 뭉쳐져서 원하는 형상을 얻을 수 없

을 것으로 예상된다. 그러므로 EO gas로 멸균하면 PLA와

PGA, PLGA지지체의 생체내 분해도는 유지할 수 있지만 원하

는 형태의 지지체를 얻기는 어려운 것으로 판단된다.

감마선(Gamma Irradiation) 멸균법

최근 감마선 멸균법은 열과 화학약품을 사용하지 않고 멸균

할 수 있어서 점차적으로 사용도가 증가하고 있다. 감마선 멸

균법은 주로 60Co 방사성 동위원소에서 나오는 감마선을 피멸

Table 1. Standard sterilization techniques and application10-12)

Sterilization technique(temperature) Advantages Disadvantages

Steam sterilization (100-135 oC)Simplicity

Degradation of polymer and some ceramicNo toxic residues

Dry heat sterilization (160-180 oC)Non-aqueous system

Melting and softening of polymerNo toxic residues

Ethylene oxide gas (38-60 oC)Low temperature Toxic residues

Compatibility with various materials React with some funcional groups

Gamma irradiation (-)High penetration

Cross-linking/breakage of polymer chainsLow chemical reactivity

Figure 1. Structural formulae of polylactic acid and polyglucolic acid.

Figure 2. Surface morphology of PLGA microparticles (a), (c) non-ster-ilized and (b), (d) EO treated25).

조직공학을 위한 생분해성 고분자 지지체의 멸균 153

Vol. 11, No. 4

균품에 쬐어 미생물을 사멸시킴으로써 멸균시키는 방법이다. 감

마선은 투과력이 우수하여 세균과 기생충 및 해충들까지 완전

히 사멸시킬 수 있으며, 피멸균품의 형태와 재료에 크게 영향

을 받지 않고 균일하게 멸균할 수 있다. 그러나 감마선을 발생

시키는 장비가 크기 때문에 다른 멸균기에 비해 넓은 설치공

간이 요구되며 테플론과 같은 고분자화합물은 감마선의 높은

에너지에 의해 화학결합이 분리되는 문제가 있다10,25,26).

감마선으로 멸균 후 PLA와 PGA, PLGA로 제조한 지지체의

분자량은 감소하고19,27,28), 지지체의 부피는 거의 변하지 않았

다19). PLGA 지지체는 감마선 멸균 후에 분자량이 54% 감소

하여 EO gas 멸균한 지지체 분자량의 감소량보다 4.5배 크게

감소하였지만, EO gas 멸균한 지지체는 부피가 50% 감소한

것에 반해 감마선 멸균한 지지체는 부피가 전혀 줄지 않았다

는 연구결과도 있다. 하지만 지지체의 분자량이 크게 변했기

때문에 멸균 후 지지체의 생체내 분해도는 급격하게 증가하였

다21). 감마선에 의해 PLA와 PGA, PLGA의 화학결합이 Figure

3과 유사한 과정을 통해 분리되어 지지체의 분자량이 감소하

는 것으로 판단된다29). 지지체 표면형상의 변화는 감마선의 세

기와 비례하므로27), 약한 감마선을 이용하여 멸균하면 표면형

상의 변형을 억제할 수 있다. 그러므로 감마선 멸균법으로

PLA와 PGA, PLGA 지지체를 살균하면 지지체의 형태는 유지

할 수 있지만, 화학결합이 분리되어 분자량이 감소하기 때문에

생체내 분해도를 조절할 수 없는 문제점이 발생할 것으로 판

단된다.

플라스마(Plasma) 멸균법

플라스마 멸균법으로 멸균되는 과정을 Figure 4에 나타내었

다. 초기, 전류를 가해주게 되면 플라스마가 형성되기 시작하

는데, 충분한 플라스마가 형성되기 전 발생하는 UV

irradiation에 의해 미생물이 살균된다. 플라스마가 충분히 형성

되면 photodesorption에 의해 지지체는 멸균되며, 이때 지지체

의 표면식각16,29-31)과 표면에 있던 미생물의 식각이 동시에 일

어나게 된다. 마지막으로 멸균을 마칠 때 플라스마가 사라면서

초기와 같은 UV irradiation이 발생하여 미생물의 멸균이 이뤄

진다16,32). 플라스마 멸균법은 열이 발생하지 않고 짧은 시간에

멸균할 수 있으며, 플라스마의 침투 깊이가 0.01~0.1 mm으

로 매우 얕기 때문에 지지체의 물리적·화학적 특성을 변화시

키지 않는다. 또한, 표면을 식각하여 멸균된 미생물의 잔해를

제거할 수 있으며, 지지체의 계면활성을 향상시키고 표면적을

넓혀서 세포와의 반응을 향상시킬 수 있다29,32-35). 그러나 플라

스마 멸균을 하는 방법에 대한 충분한 연구가 이뤄지지 않고

있어서 정형화된 멸균방법이 없다. 따라서 플라스마의 에너지

가 약하면 피멸균품에 대한 충분한 멸균이 이뤄지지 않을 수

있으며 반대로 플라스마의 에너지가 과잉되면 표면의 식각이

과도하게 일어나서 피멸균품의 본래 형태를 잃어버리게 된다.

또한, 침투 깊이가 얕기 때문에 멸균 후 패킹이 필요하므로 패

킹을 하는 동안 오염물에 노출될 가능성이 높다32).

플라스마 멸균법을 이용하여 PLA, PGA, PLGA 지지체를 멸

균한 연구자료가 충분하지 않았다. 우선 봉형의 PLA 지지체를

플라스마 멸균법으로 처리하였을 때, 지지체의 분자량과 녹는

점, 기계적 특성은 거의 변하지 않았고 지지체의 표면은 플라

스마에 의해 식각되었다36). 나노섬유형태의 PLGA 지지체를 플

라스마 멸균법으로 처리하면 지지체의 분자량이 감마선 멸균법

보다 적게 감소하였지만 EO gas 멸균법보다는 크게 감소하였

다. 그러나 PLGA지지체의 부피와 생체 분해도는 거의 변하지

않았다21). PLA의 지지체는 봉형으로 만들었고 PLGA 지지체는

나노섬유로 만들어서 플라스마 멸균을 하였으므로 플라스마에

노출되는 두 지지체의 면적이 차이가 있을 것으로 판단된다.

따라서 적게 노출된 봉형의 지지체가 나노섬유로 형성된 지지

체보다 분자량의 변화가 적었던 것으로 예상된다. 또한, 공정

기체에 따라 플라스마 멸균법은 조금씩 차이를 보이는데 두 지

지체를 멸균한 방법의 차이에 의해 다른 결과를 보일 것으로

예상된다.

Figure 3. Proposed mechanism of gamma radiolysis of polylactide-co-glycolid acid.

Figure 4. Schematic illustration of the three-phase survival curve char-acterizing plasma sterilization, showing the mechanisms predomi-nantly acting during each phase.

154 김혜리·이승진·박종철

Biomaterials Research 2007

결 언

주로 생분해성 고분자화합물은 친수성 고분자화합물로써 물

과 고열에 민감하다. 따라서 생분해성 고분자화합물로 만든 지

지체를 멸균하기 위해서는 여러 가지 멸균방법들의 장단점과

지지체의 용도를 충분히 이해하는 과정이 필요하다. EO gas

멸균법과 감마선 멸균법, 플라스마 멸균법들은 모두 PLA,

PGA, PLGA 지지체에 물리적·화학적으로 영향을 미쳤으며,

이러한 영향들은 멸균한 지지체를 체내에 적용하였을 때 의도

하지 않는 결과를 야기시킨다. 이러한 멸균방법들의 가장 큰

문제점은 생분해성 고분자화합물로 만든 지지체가 체내에서의

분해도를 변화키는 것이다. 따라서 지지체를 체내에 적용하였

을 때 지지체가 분해되는 정확한 시간을 조절하기가 어려워져

서 손상된 장기나 조직이 충분히 회복되기 전에 분해되거나 회

복된 후에도 잔재하는 문제점을 야기시킨다. 그러므로 낮은 습

도와 온도를 유지하며 지지체의 형태와 분자구조의 변형을 야

기시키지 않는 멸균법의 연구개발이 요구된다.

감사의 글

본 연구는 한국과학재단 나노바이오기술개발 사업의 지원에

의하여 이루어진 것임. (Grant NO. 2005-00009)

참고문헌

1. 국립장기이식관리센터 통계자료.2. A. Vats, N. S. Tolley, J. M. Polak, and J. E. Gough, “Scaffolds and

biomaterials for tissue engineering; a review of clinicalapplications,” Clin. Otolaryngol. 28, 165-172, (2003).

3. 김정경, “흡수성 분해성 생체재료 시장의 조사 분석(독일과프랑스),” KOSEN Expert Review.

4. G. Wei, Q. Jin, W. V. Giannobile, and P. X. Ma, “The enhance-ment of osteogenesis by nono-fibrous scaffolds incorporatingrhBMP-7 nanospheres,” Biomaterials, 28, 2087-2096 (2007).

5. L. Rimondici, N. Nicoli-Aldini, M. Fini, G. Guzzardella, M.Tschon, and R. Giardino, “In vivo experimental study on boneregeneration in critical bone defects using and injectablebiodegradable PLA/PGA copolymer,” Oral. Surg. Oral. Med.Oral. Pathol. Oral. Radiol. Endod., 99, 148-154 (2005).

6. G. Chen, T. Sato, H. Ohgushi, T. Ushida, T. Tateishi, and J.Tanaka, “Culturing of skin fibroblasts in a thin PLGA-collagenhybrid mesh,” Biomaterials, 26, 2559-2566 (2005).

7. J. J. Lee, S. G. Lee, J. C. Park, Y. I. Yang, and J. K. Kim,“Investigation on biodegradable PLGA scaffold with various poresize structure for skin tissue engineering,” Current Appl. Phys., 7,e37-e40 (2007).

8. J. Stitzel, J. Liu, S. J. Lee, M. Komura, J. Berry, S. Soker, G. Lim,M. V. Dyke, R. Czerw, J. J. Yoo, and A. Atala, “Controlledfabrication of a biological vascular substitute,” Biomaterials, 27,1088-1094 (2006).

9. P. X. Ma and J. H. Elisseeff, “Scaffolding in tissue engineering,”Taylor & Francis group, NW, USA, 2006.

10. 김용호, 함건주, “소독멸균학,” 고려의학, Seoul, Korea, 1995.11. D. -W. Han, D. H. Lee, K. -H. Shin, and J. -C. Park, “Sterilization

of human tissues for allo-transplantation,” J. Korea Musculoskelet.

Tissue Transplant. Soc., 2, 81-91 (2002).12. P. R. Marreco, P. de L. Moreira, S. C. Genari, and A. M. Moraes,

“Effects of different sterilization methods on the morphology,mechanical properties, and cytotoxicity of chitosan membranesused as wound dressings,” J. Biomed. Mater. Res. Part B: Appl.Biomater., 71B, 268-277 (2004).

13. F. W. Cordewener, M. F. van Geffen, C. A. P. Joziasse, J. P.Schmitz, R. R. M. Bos, F. R. Rozema, and A. J. Pennings, “Cyto-toxicity of poly(96L/4D-lactide): The influence of degrada- tionand sterilization,” Biomaterials, 21, 2433-2442 (2000).

14. B. Aditya, H. Ganesan, H. Stanley, and K. Alok, “Effect of steamsterilization on the rheology of polymer solutions,” Pharm,Develop. Tech., 8, 219-228 (2003).

15. H. Y. Hou, M. Q. Zhang, K. C. Mai, M. Z. Rong, G. Yu, and H.M. Zeng, “Heat treatment-induced melting behavior of carbonblack-filled polymer blends in relation to the conductive per-formance stabilization,” J. Appl. Polymer Sci., 80, 1267-1273,(2001).

16. S. Lerouge, C. Guignot, M. Tabrizian, D. Ferrier, N. Yagoubi, andL. H. Yahia, “Plasma-based sterilization: Effect on surface andbulk properties and hydrolytic stability of reprocessed poly-urethane electrophysiology catheters,” J. Biomed. Mater. Res.,52. 774-782 (2000).

17. J. Lauderbak and D. A. Timm, “Compatibility of PETG with low-temperature hydrogen peroxide gas plasma sterilization,” Phar-maceutical and Med. Packaging News Magazine. 2000.

18. 의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준규격 (제2006-32호).19. C. E. Holy, C. Cheng, J. E. Davies, and M. S. Shoichet,

“Optimizing the sterilization of PLGA scaffolds for use in tissueengineering,” Biomaterials, 22, 25-31 (2001).

20. K. A. Athanasiou, G. Niederauer, and C. M. Agrawal, “Steriliza-tion, toxicity, biocompatibility and clinical applications of poly-lactic acid/polyglycolic acid copolymers,” Biomaterials, 17, 93-102 (1996).

21. W. Friess and M. Schlapp, “Sterilization of gentamicin containingcollagen/PLGA microparticle composites,” Eur. J. Pharm. Biopharm.,63, 176-187 (2006).

22. A. A. Ignatius and L. E. Claes, “In vitro biocompatibility of bio-resorbable polymers: poly(L, DL-lactide) and poly(L-lactide-Co-glycolide),” Biomaterials, 17, 831-839 (1996).

23. S. J. Peniston and J. Choi, “Effect of sterilization on thephysicochemical properties of molded poly(L-lactic acid),” J.Biomed. Mater. Res. PartB: Appl. Biomater., 80B, 66-77 (2007).

24. Y. Choi, S. Y. Kim, M. -H. Moon, S. H. Kim, K. -S. Lee, and Y.Byun, “Poly(ethylene glycol)-poly(L-lactide) dibilock copolymerprevents aggregation of poly(L-lactide) microspheres duringethylene oxide gas sterilization,” Biomaterials, 22, 995-1004(2001).

25. L. Zhang, C. C. Chu, and I. –H. Loh, “Effect of a combinedgamma irradiation and parylene plasma treatment on thehydrolytic degradation of synthetic biodegradable sutures,” J.Biomed. Mater. Res., 27, 1425-1441 (1993).

26. D. Milicevic, S. Trifunovic, S. Galovic, and E. Suljovrujic,“Thermal and crystallization behaviour of gamma irraditedPLLA,” Radiation Phy. Chem., 76, 1376-1380 (2007).

27. G. G. Henn, C. Birkinshaw, and M. Buggy, “A comparison of theeffects of γ-irradiation and ethylene oxide sterilization on thepreperties of compression moulded poly-d,l-lactide,” J. Mater.Sci.: Mater. Med., 7, 591-595 (1996).

28. L. Montanari, F. Cilurzo, L. Valvo, A. Faucitano, A. Buttafava, A.Groppo, I. Genta, and B. Conti, “Gamma irradiation effects onstability of poly(Lactide-Co-glycolide) microspheres containing

조직공학을 위한 생분해성 고분자 지지체의 멸균 155

Vol. 11, No. 4

clonazepam,” J. Control. Release, 75, 317-330, (2001). 29. M. Moisan, J. Barbeau, M. -C. Crevier, J. Pelletier, N. Philip, and

B. Saoudi, “Plasma sterilization. methods and mechanisms,” Pureand Appl. Chem., 74, 349 (2002).

30. H. Park, K. Y. Lee, S. J. Lee, K. E. Park, and W. H. Park, “Plasma-treated poly(lactic-co-glycolic acid) nanofibers for tissueengineering,” Macromol. Res., 15, 238-243, (2007).

31. H. T. Oyama and J. P. Wightman, “Surface characterization ofPVP-sized and oxygen plasma-treated carbon fibers,” Surf.Interface Anal., 26, 39-55 (1998).

32. S. Crow and J. H. Smith, “Gas plasma sterilization – applicationof space – age technology,” Infection Control and HospitalEpidemiology, 16, 483-187 (1995).

33. K. E. Park, K. Y. Lee, S. J. Lee, and W. H. Park, “Surface

characteristics of plasma-treated PLGA nanofibers,” Macromol.Symp., 249-250, 103-108 (2007).

34. P. Daphne, A. Eleftherios, M. Dimitrios, L. Vasilis, P. Nikolopoulos,“Improved surface energy analysis for plasma treated PET films,”Plasma Processes and Polymers, 4, S1057-S1062 (2007).

35. S. Lerouge, M. R. Wertheimer, R. Marchand, M. Tabrizian, andL. H. Yahia, “Effect of gas composition on spore mortality andetching during low-pressure plasma sterilization,” J. Biomed.Mater. Res., 51, 128-135 (2000)

36. S. Gogolewski, P. Mainil-Varlet, and J. G. Dillon, “Sterility,mechanical properties, and molecular stability of polylactideinternal-fixation devices treated with low-temperature plasmas,”J. Biomed. Mater. Res., 32, 227-235 (1996).