Embed Size (px)
Citation preview
Steroïdprofilering in saliva aan de
hand van GC/CI/MSMS
Laurie De Wilde
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: dr. Michaël Polet
Co-promotor: prof. dr. ir. Peter Van
Eenoo
Vakgroep: Klinische biologie,
microbiologie en immunologie
Academiejaar 2015 – 2016
Steroïdprofilering in saliva aan de
hand van GC/CI/MSMS
Laurie De Wilde
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: dr. Michaël Polet
Co-promotor: prof. dr. ir. Peter Van
Eenoo
Vakgroep: Klinische biologie,
microbiologie en immunologie
Academiejaar 2015 – 2016
Voorwoord
Het tot een goed einde brengen van deze thesis zou niet gelukt zijn zonder de hulp en steun van
anderen. Ik wil dan ook iedereen bedanken die hier op een of andere manier toe bijgedragen
heeft.
Ten eerste wil ik prof. dr. ir. Peter Van Eenoo bedanken om mij, als niet-West-Vlaming, de
kans te geven om mijn thesis in het DoCoLab te maken. Bedankt om mijn werk na te lezen en
bij te sturen waar nodig.
Ik wil dr. Michaël Polet bedanken voor de begeleiding, zowel bij mijn praktisch werk als bij
het schrijven van deze thesis. Bedankt voor het vrijmaken van je tijd, het geven van nuttige tips,
het beantwoorden van mijn vragen en het nalezen van mijn schrijfwerk.
Ik zou ook iedereen uit het DoCoLab willen bedanken. Ann, Dominique, Fiona, Jan, Koen,
Kris, Leen, Lore, Monica, Peter, Pieter, Ruth, Steven en Wim, bedankt voor de leuke sfeer in
het labo en tijdens de pauzes. Dankzij jullie was het aangenaam om aan mijn thesis te werken.
Ik wil ook Ann-Sofie bedanken voor de productieve schrijfmomenten, de fijne babbels
tussendoor en het mee invullen van onze thesisdagen in het labo.
Verder wil ik Marjolijn bedanken en alle mensen die bereid waren om te zeveren voor het goede
doel.
Joyca, Kelly en Tim verdienen zeker ook een dankjewel. Jullie speelden een fijne rol in mijn
studententijd, fleurden mijn notities op en maakten het volgen van de lessen aangenamer. Sofie
en Elke wil ik bedanken voor de sportieve ontspanningen en de gezellige tijd op kot. Ik wil ook
mijn vrienden in Zele bedanken voor de steun gedurende de afgelopen jaren.
Ik ben mijn broer en zus ook zeker dank verschuldigd. Zij gaven mij de moed en kracht om
door te bijten. Fabian, naar jou kon ik altijd opkijken. Nina, bedankt voor je onvoorwaardelijk
vertrouwen in je grote zus, je enthousiasme als ik in het weekend thuiskwam en je amusante
manieren om me op te peppen.
Tot slot wil ik mijn ouders bedanken voor hun financiële en morele steun, hun vertrouwen en
de kansen die ik kreeg. Zonder hen zou het volbrengen van deze studies niet mogelijk geweest
zijn.
Lijst van afkortingen
µ Gemiddelde
A Androsteron
AAS Anabole androgene steroïden
ADION Androsteendion
AR Androgeenreceptor
BI Betrouwbaarheidsinterval
CBG Cortisolbindend globuline
CI Chemische ionisatie
CV% Variatiecoëfficiënt
DHEA Dehydroepiandrosteron
DHT Dihydrotestosteron
EI Elektron impact
E Epitestosteron
Etio Etiocholanolone
GC Gaschromatografie
GC/MS Gaschromatografie-Massaspectrometrie
GC-C-IRMS Gas chromatography-combustion-isotope
ratio mass spectrometry
hCG Humaan choriongonadotrofine
HPLC High pressure liquid chromatography
IQ1 1e kwartiel
IQ3 3e kwartiel
IRMS Isotoop-ratio massaspectrometrie
LC Liquid chromatography of
vloeistofchromatografie
LOQ Limit of quantification of
bepaalbaarheidsgrens
m/z Massa-tot-ladingverhouding
MeT Methyltestosteron
MRM Multiple Reaction Monitoring
MSTFA N-methyl-N-(trimethylsilyl)
trifluoroacetamide
OC Orale contraceptiva
OFN Oxygen free nitrogen of zuurstofvrije
stikstof
PAP Phosphatidic acid phosphatase
PAPS 3'-Phosphoadenosine-5'-phosphosulfate
QC Quality control of kwaliteitscontrole
RL Referentielimiet
RSD Relatieve standaarddeviatie
SD Standaarddeviatie
SG Specific gravity
SHBG Sex hormone-binding globulin of
geslachtshormoonbindend globuline
SULT Sulfotransferases
T Testosteron
TMS Trimethylsilyl
UDP Uridine diphospho
UDPGA Uridine 5'-diphospho-glucuronic acid
UGT (UDP)-glucuronosyl transferase
WADA Wereld Anti-Doping Agentschap
α Significantieniveau
Inhoud Samenvatting .............................................................................................................................. 1
Summary .................................................................................................................................... 2
1 Inleiding ............................................................................................................................. 3
1.1 Doping en sport ........................................................................................................... 3
1.2 Anabole androgene steroïden (AAS) ........................................................................... 3
1.2.1 Structuur ............................................................................................................... 3
1.2.2 Endogene aanmaak en metabolisatie AAS ........................................................... 4
1.2.3 Werking ................................................................................................................ 7
1.2.4 Bijwerkingen ........................................................................................................ 7
1.3 Detectie van steroïdmisbruik ....................................................................................... 8
1.3.1 Chromatografie ..................................................................................................... 8
1.3.2 Massaspectrometrie .............................................................................................. 9
1.3.3 Steroïdprofiel ...................................................................................................... 10
1.3.4 GC-C-IRMS ....................................................................................................... 11
1.4 Matrices voor analyse ................................................................................................ 11
1.4.1 Urine ................................................................................................................... 11
1.4.2 Bloed .................................................................................................................. 12
1.4.3 Speeksel .............................................................................................................. 12
1.5 Doel ........................................................................................................................... 19
2 Materiaal en methoden ..................................................................................................... 20
2.1 Producten en reagentia ............................................................................................... 20
2.2 Instrumenten .............................................................................................................. 20
2.2.1 GC/CI/MSMS ..................................................................................................... 20
2.3 Staalcollectie: referentiepopulatie en excretiestudie ................................................. 22
2.3.1 Referentiepopulatie: inter-individuele variatie ................................................... 22
2.3.2 Intra-individuele variatie .................................................................................... 23
2.3.3 Administratiestudie ............................................................................................ 23
2.3.4 Staalafname ........................................................................................................ 24
2.4 Methode ..................................................................................................................... 24
2.4.1 Staalvoorbereiding ............................................................................................. 24
2.4.2 Kwaliteitscontrole .............................................................................................. 25
2.4.3 Validatie ............................................................................................................. 25
2.5 Dataverwerking en statistische analyse ..................................................................... 25
3 Resultaten en discussie ..................................................................................................... 26
3.1 Validatie ..................................................................................................................... 26
3.2 Referentiepopulatie (inter-individuele variatie) ........................................................ 27
3.2.1 Vrouwen ............................................................................................................. 27
3.2.2 Mannen ............................................................................................................... 29
3.2.3 Leeftijd ............................................................................................................... 32
3.2.4 Geslacht .............................................................................................................. 33
3.2.5 Hormonaal anticonceptiegebruik ....................................................................... 33
3.2.6 Menstruele fase .................................................................................................. 34
3.2.7 Alcohol ............................................................................................................... 34
3.2.8 Drugs .................................................................................................................. 34
3.2.9 Gebruik van voedingssupplementen .................................................................. 34
3.2.10 Sport ................................................................................................................... 34
3.2.11 Stressniveau ........................................................................................................ 35
3.2.12 Tijdstip speekselcollectie ................................................................................... 35
3.3 Intra-individuele variatie ........................................................................................... 35
3.3.1 Korte termijn ...................................................................................................... 35
3.3.2 Lange termijn ..................................................................................................... 43
3.4 Administratiestudie .................................................................................................... 45
3.4.1 Saliva .................................................................................................................. 45
3.4.2 Urine ................................................................................................................... 46
4 Besluit ............................................................................................................................... 48
5 Referentielijst ................................................................................................................... 49
1
Samenvatting
Dopinggebruik is niet alleen een bedreiging voor sport, maar ook voor de gezondheid. Het
gebruik van anabole androgene steroïden (AAS) leidt, via binding op de androgeenreceptor
(AR) in het cytoplasma van het targetweefsel, tot een masculinisering en stimulering van de
eiwitopbouw en het botmetabolisme. Voor de detectie van steroïdmisbruik kan een beroep
gedaan worden op verschillende methoden, zoals vloeistof- of gaschromatografie gekoppeld
aan een massaspectrometer. Verschillende matrices zoals urine en bloed zijn geschikt voor
dopinganalyse. Naast deze gebruikelijke matrices, werd speeksel onderzocht als matrix voor
dopinganalyse, met als voordelen dat het gemakkelijk en op een niet-invasieve manier kan
gecollecteerd worden zonder de privacy van de atleet te schenden. Doordat de concentratie van
testosteron een factor 100 stijgt in speeksel bij een transdermale administratieroute, werd een
steroïdprofiel ontwikkeld in speeksel dat het makkelijker maakt om verdachte stalen te vinden
bij personen die deze administratieroute gebruikten.
Met behulp van GC/CI/MSMS (gaschromatografie/chemische ionisatie/ massaspectrometrie)
werd een methode ontwikkeld om speekselstalen te analyseren. Aan de hand van een
referentiepopulatie, die bestond uit 149 mannen en 170 vrouwen tussen de 18 en 79 jaar, die
een informed consent ondertekenden en een medische vragenlijst invulden, werd de inter-
individuele variatie bestudeerd. Ook de intra-individuele variatie werd bekeken op korte en
lange termijn. Een administratiestudie werd uitgevoerd om de analyseprocedure te testen en te
kijken of speeksel een meerwaarde heeft als analysematrix.
Uit de resultaten van de kortetermijnstudies blijkt dat het moment van collectie belangrijk is
voor het interpreteren van de steroïdconcentraties. Het collectietijdstip beïnvloedt veel minder
de verhoudingen van de steroïden.
De berekende intra-individuele referentielimieten (gemiddelde + 3x de standaarddeviatie)
zouden gehanteerd kunnen worden in een biologisch paspoort.
Ten slotte is speeksel een geschikte matrix om het gebruik van een testosterongel te detecteren.
De testosteronconcentraties stijgen met een factor 170 ten opzichte van het basale niveau. In
urine worden slechts enkele verdachte stalen verkregen. De detectietijd is bovendien langer in
speeksel (128 u) dan in urine (72 u).
2
Summary
BACKGROUND: Blood and urine are the most commonly used fluids for doping analysis.
Saliva was examined as a possible matrix for the detection of steroid abuse. The collection
procedure is non-invasive and does not violate the privacy of the athlete. A steroid profile in
saliva was developed to facilitate the detection of transdermal administration of doping
substances. These are difficult to detect in urine or blood.
METHODS: Gas chromatography chemical ionization mass spectrometry (GC/CI/MSMS)
was used for the quantitative analysis of saliva. A reference population of 149 men and 170
women was studied for the inter-individual variation. The intra-individual variation was studied
on short (nwomen=5, nmen=4) and long (nmen=1) term. An administration study was performed to
verify the applicability of the procedure.
RESULTS: The upper reference limits at 99 % were assessed for male and female populations.
CONCLUSIONS: The moment of collection was important in order to interpret the
concentrations, whereas it is not essential when studying the ratios of these steroids. The intra-
individual reference value could be used in a biological passport. Saliva seems to be an excellent
fluid to detect the use of a testosterone gel. The concentrations in saliva increase with a factor
170 compared to the normal values. In urine only a few suspicious samples were seen. In
addition, the detection time is longer in saliva (128 h) compared to urine (72 h).
3
1 Inleiding
1.1 Doping en sport
Het gebruik van doping in sport is verboden. Het WADA (Wereld Anti-Doping Agentschap)
werd in 1999 opgericht en streeft naar dopingvrije sport. Zijn belangrijkste activiteiten zijn
onderzoek, opleiding, ontwikkeling van anti-dopingmogelijkheden en monitoring van de
Wereld Anti-Doping Code. Dit is een document waarin het anti-dopingbeleid in alle sporten en
alle landen wordt samengebracht.1 Op dit ogenblik zijn er wereldwijd 35 labo’s geaccrediteerd
om dopinganalyses uit te voeren. DoCoLab, een van deze geaccrediteerde labo’s, is gevestigd
op het Technologiepark te Zwijnaarde.
Doping is niet enkel een probleem binnen sport, het houdt ook risico’s in voor de gezondheid
en het welzijn van de gebruiker. Dit misbruik is ook niet langer beperkt tot de topatleten,
recreatieve sporters maken eveneens gebruik van verboden middelen.2,3 Men kan misbruik
definiëren als het gebruik of de manipulatie van een substantie, synthetisch of autoloog, met de
intentie sportprestaties te verbeteren. Het WADA verbiedt dan ook deze middelen, net als
middelen die een potentieel risico vormen voor de gezondheid of die in strijd zijn met de geest
van de sport.3 In en buiten competitie zijn dit anabolen, peptidehormonen, groeifactoren en
gerelateerde substanties, bèta-2 agonisten, hormonen en metabole modulatoren, diuretica en
maskerende middelen.
Ook bepaalde methoden worden verboden door het WADA, namelijk manipulatie van bloed en
zijn componenten, chemische en fysische manipulatie en gendoping. Daarnaast worden
stimulantia, narcotica, cannabinoïden en glucocorticoïden niet getolereerd in competitie. In
sommige sporten zijn alcohol en bèta-blokkers verboden.4
1.2 Anabole androgene steroïden (AAS)
1.2.1 Structuur
Figuur 1: A: structuur van testosteron; B: basisstructuur van steroïden, het perhydrocyclopentano-
fenantreen ring systeem5
Steroïden bevatten allemaal dezelfde basisstructuur, namelijk het perhydrocyclopentano-
fenantreen ring systeem (Figuur 1).
4
1.2.2 Endogene aanmaak en metabolisatie AAS
1.2.2.1 Endogene aanmaak AAS
De steroïdogenese start vanuit cholesterol. Dat wordt omgezet door het ‘cholesterol side-chain
cleavage enzyme’ tot pregnenolone, waarna verdere metabolisatie gebeurt door 17-
hydroxylase, 3β-hydroxysteroïde dehydrogenase, 17-20 lyase, 17β-hydroxysteroïde
dehydrogenase, 5α-reductase, aromatase en 16-ene-synthase (Figuur 2). 6
Figuur 2: Steroïdogenese van androgenen uit cholesterol en overeenkomstige enzymes: (1) cholesterol side-
chain cleavage enzyme; (2) 17-hydroxylase; (3) 3β-hydroxysteroïde dehydrogenase; (4) 17-20 lyase; (5) 17β-
hydroxysteroïde dehydrogenase; (6) 5α-reductase; (7) aromatase
5
1.2.2.2 Metabolisatie AAS
De metabolisatie van AAS kan op verschillende plaatsen ingrijpen en kan opgedeeld worden in
2 fasen.
1.2.2.3 Fase 1
In fase 1 zullen steroïden geconverteerd worden door enzymatisch gekatalyseerde reacties. Dit
kan gaan om een oxidatie, reductie of hydroxylatie. Bij deze omzetting wordt een meer polaire
component gevormd om het steroïde te inactiveren en de eliminatie ervan te vergemakkelijken.
Een voorbeeld van metabolisatie treedt op bij de A-ring. De initiële en snelheidsbepalende stap
bij de metabolisatie van de 3-keto-4-ene steroïden, zoals testosteron, is de reductie van de
C-4,5 dubbele binding. Hierdoor ontstaat er een asymmetrisch centrum op de C-5 positie zodat
twee isomeren met 5α- en 5β-configuratie kunnen worden gevormd. Na deze eerste stap zal de
3-keto groep in het 5α-isomeer snel gereduceerd worden door 3α-hydroxysteroïde
dehydrogenase of door 3β-hydroxysteroïde dehydrogenase. Bij de reductie van het 5β-steroïde
wordt de 3α-hydroxy structuur gevormd (Figuur 3).5
Figuur 3: het A-ring metabolisme: reductie van 3-keto groepen met 3α-hydroxysteroïde dehydrogenase en
3β-hydroxysteroïde dehydrogenase
Metabolisatie van de C-ring is beperkt. Bij het metabolisme van de D-ring is de meest bekende
metabolische weg van 17β-hydroxy steroïden de enzymatische oxidatie door 17β-
hydroxysteroïde dehydrogenase. Hierbij wordt een 17-keto steroïde gevormd. De 17-keto groep
kan opnieuw geconverteerd worden tot de hydroxyl groep door hetzelfde enzyme waarbij de
17β-hydroxy configuratie wordt gevormd. Er kan ook hydroxylatie optreden op de 16α- en 16β-
positie.5
5α-isomeer 5β-isomeer
3α-
hydroxysteroïde
dehydrogenase
3α-hydroxy metabolieten
5α-isomeer 5β-isomeer
3β-
hydroxysteroïde
dehydrogenase
Niet of beperkt
gedetecteerd
3β-hydroxy
metaboliet
6
1.2.2.4 Fase 2
In fase 2 treedt conjugatie op met vorming van een glucuronide, door middel van het uridine
diphospho (UDP)-glucuronosyl transferase (UGT), of een sulfaat door sulfatases.
Door deze reacties wordt het apolaire steroïde meer wateroplosbaar, wat de eliminatie via urine
vergemakkelijkt.6 Deze fase 2 reacties worden afgebeeld in Figuur 4 voor testosteron.
Figuur 4: Glucuronidatie en sulfatatie van testosteron met respectievelijke co-substraten UDPGA en PAPS
Bij de conjugatie van de A-ring zal er sulfatatie of glucuronidatie optreden op de 3-hydroxy
groep. De 3-keto groep werd gereduceerd in fase 1 waardoor er een 3-hydroxy groep ontstond.
De 3α-groep wordt dan geconjugeerd met glucuronzuur. 3β-hydroxy steroïden worden als
sulfaten gesecreteerd (Figuur 5).5
7
Figuur 5: Conjugatie van de 3-hydroxy groep: glucuronidatie van de 3α-hydroxy groep en sulfatatie van de
3β-hydroxy groep
De glucuronidatie van de secundaire 17β-hydroxy groep is bekend voor testosteron (T). Op
deze plaats kan het β-glucuronidase van E. coli ingrijpen en zal het testosteron hydrolyseren.
Ook sulfatatie van de secundaire 17β-hydroxy groep is bekend bij testosteron. De
geglucuroniseerde steroïden zijn de voornaamste metabolieten van AAS, hoewel sommige
androgenen zoals androsteron (A), etiocholanolone (Etio), epiandrosteron, testosteron en
epitestosteron (E) ook gesecreteerd kunnen worden als sulfaten. 5
1.2.3 Werking
In de categorie van dopingsubstanties met een laag moleculair gewicht zijn androgene anabole
steroïden (AAS) de belangrijkste en de vaakst misbruikte klasse. Binnen de AAS zijn er 2
groepen: de exogene en endogene. De androgene factor heeft een masculiniserend effect en
zorgt voor de mannelijke secundaire geslachtskenmerken, terwijl de anabole factor de
eiwitopbouw en het botmetabolisme stimuleert. Toename in spiergrootte, sterkte en vetvrije
massa zijn dan ook de effecten van AAS. AAS binden op de androgeenreceptor (AR) in het
cytoplasma van het targetweefsel en zetten een moleculaire cascade in gang die resulteert in
androgene en anabole effecten. De AR is betrokken bij de transcriptieregulatie van genen die
verantwoordelijk zijn voor spierontwikkeling. AAS verdringen cortisol van zijn receptor en
gaan de katabole werking van glucocorticoïden tegen.2,3
1.2.4 Bijwerkingen
Het gebruik van AAS gaat gepaard met zowel lichamelijke als psychische bijwerkingen. De
3α-hydroxy isomeer 3β-hydroxy isomeer
glucuronidatie sulfatatie
β-glucuronide 3β-sulfaat
8
meest voorkomende neveneffecten zijn cardiovasculaire complicaties, onderdrukking van de
hypothalame-hypofysaire-testiculaire as, hypogonadisme, seksuele disfunctie. Bij mannen
zullen ook het reduceren van de testes en aantal spermacellen, gynaecomastie, acne, kaalheid
en een toename in hemoglobine optreden. Bij vrouwen ontstaan symptomen zoals borstatrofie,
hirsutisme en een onregelmatige menstruatiecyclus.
Hepatische disfunctie en neoplasmen worden vooral gezien na oraal testosterongebruik.
Spierscheuren en pees- en ligamentblessures worden geassocieerd met een disproportionele
toename in spiermassa zonder een toename in sterkte van de ondersteunende weefsels.
Naast de lichamelijke bijwerkingen, kunnen ook psychische neveneffecten optreden zoals
agressie en schommelingen in de gemoedstoestand. Het gebruik van andere drugs en alcohol
en een verhoogd risico op moord en zelfmoord worden in relatie gebracht met het gebruik van
AAS.2,3,7
1.3 Detectie van steroïdmisbruik
1.3.1 Chromatografie
Chromatografie is een van de meest gebruikte methoden in de strijd tegen doping. Door een
evenwicht tussen een stationaire fase en een mobiele fase, worden moleculen gescheiden op
basis van bijvoorbeeld hun kookpunt en hun polariteit. Wanneer een component interageert met
de kolom, zal er een vertraging of retentie optreden. De retentietijd is karakteristiek voor een
bepaalde component en geldt als een kwalitatief criterium. De piekoppervlakte is een
kwantitatief criterium.8
1.3.1.1 Vloeistofchromatografie
Vloeistofchromatografie (LC) heeft een vloeistof als mobiele fase. Bij ‘high pressure liquid
chromatography’ (HPLC) wordt gebruikgemaakt van een of meerdere pompen die de mobiele
fase doorheen de kolompakking sturen. Deze pompen worden continu gestuurd en
gecontroleerd om een constant debiet te verzekeren en drukpulsaties te vermijden. Wanneer de
mobiele fase een constante samenstelling heeft (isocratische mode), volstaat één pomp. Bij
gradiëntelutie, waarbij de samenstelling van de mobiele fase wijzigt in functie van de tijd, zijn
meerdere pompen nodig en kunnen verschillende methoden worden toegepast. Gradiëntelutie
wordt bekomen door de polariteit van de mobiele fase te wijzigen naarmate de scheiding
vordert. Bij ‘normal phase’ is de stationaire fase polair en de mobiele fase apolair. Bij ‘reversed
phase’ is de stationaire fase apolair en de mobiele fase polair.8
1.3.1.2 Gaschromatografie
Gaschromatografie (GC) is een onderdeel van chromatografie waarbij de mobiele fase een gas
9
is. Vloeibare of vaste monsters moeten eerst worden verdampt alvorens ze geanalyseerd kunnen
worden. De te analyseren bestanddelen moeten dus thermostabiel zijn en voldoende vluchtig.
De analyse start met het verdampen van het monster en het homogeen mengen met de mobiele
fase in de injector. Vervolgens wordt het monster op de kolom gebracht. De kolom, die de
stationaire fase bevat, bevindt zich in een temperatuurgecontroleerde oven. De detector bevindt
zich aan het einde van de kolom.
De viscositeit en het debiet van het draaggas beïnvloeden de verspreiding van de component in
de kolom en hebben dus ook een effect op de efficiëntie en de gevoeligheid.
GC kan men op twee manieren uitvoeren afhankelijk van de temperatuurregeling, namelijk
isothermisch, waarbij de temperatuur constant wordt gehouden, of met
temperatuurprogrammatie. Bij temperatuurprogrammatie kan men nog een onderscheid maken
tussen het continu verhogen of het in stappen verhogen van de temperatuur.8
1.3.2 Massaspectrometrie
De gaschromatograafkolom wordt gekoppeld aan een massaspectrometer. Hier worden de
intussen gescheiden moleculen geïoniseerd en op basis van hun massa-tot-ladingverhouding
(m/z) gedetecteerd. Het bekomen chromatogram en de spectra kunnen dan geanalyseerd
worden.8
1.3.2.1 Ionisatie
Bij gaschromatografie-massaspectrometrie (GC/MS) wordt standaard gebruikgemaakt van EI
(‘electron impact’) als ionisatietechniek. Dit is een harde ionisatietechniek waarbij een elektron
botst met een neutraal atoom. Hieruit wordt een elektron losgeslagen met vorming van een
moleculair ion met overschot aan energie, waarna het fragmenteert. De bekomen fragmenten
zijn karakteristiek voor een bepaalde component en worden in de MS gedetecteerd.
Tot voor kort werd ook bij GC/MS/MS gebruikgemaakt van EI. Recent werd er overgeschakeld
op een zachte ionisatietechniek, namelijk CI (chemische ionisatie). Hierdoor wordt een veel
hogere gevoeligheid verkregen en dit laat toe om nieuwe metabolieten te zoeken. De ionisatie
komt tot stand door botsingen tussen het te detecteren bestanddeel en geladen deeltjes gevormd
door een reagensgas in de gasfase. Dit gas wordt in de ionenbron gebracht en gebombardeerd
met elektronen. Het voordeel van CI is dat er minder fragmentionen, maar met een hogere
intensiteit, worden gevormd dan bij EI en hierdoor wordt de gevoeligheid van de methode sterk
opgedreven. Door deze hogere gevoeligheid, kan het gebruik van standaarden gereduceerd
worden en stijgt de kostenefficiëntie. Een nadeel van chemische ionisatie is dat het niet zo
universeel is als EI.9,10 Uit een studie blijkt dat CI met ammonium als reagensgas resulteert in
10
meer geschikte spectra bij MS/MS dan bij methaan.10
1.3.2.2 GC/MS/MS
In het DoCoLab wordt bij GC/MS/MS gebruikgemaakt van 3 quadrupolen. De eerste en laatste
quadrupool staan in voor massaselectie, de middelste doet dienst als een collisiecel. Hierin
komen de gassen samen en fragmenteren de ionen die uit de eerste quadrupool komen (Figuur
6).
Figuur 6: Triple quadrupool11
1.3.2.3 Detector
Er wordt gebruikgemaakt van een ‘electron multiplier’. Positieve ionen van het te bepalen
bestanddeel vallen hierbij uit de massaspectrometer in op een kathode en stellen hieruit
elektronen vrij. Deze elektronen worden versneld via een reeks dynodes waardoor een
elektronencascade wordt gevormd.8
1.3.3 Steroïdprofiel
Op dit moment wordt er voor de endogene AAS gebruikgemaakt van een steroïdprofiel in urine
om stalen als verdacht te bestempelen. Het profiel bestaat uit concentraties en ratio’s van
verschillende endogeen geproduceerde steroïden, hun precursoren en metabolieten zoals
testosteron, epitestosteron, dihydrotestosteron (DHT), androsteron, etiocholanolone,
dehydroëpianodrosteron (DHEA), 5α-androstane-3α, 17β-diol en 5β-androstane-3α,17β-diol.
Een stijging of daling van deze concentraties en/of hun ratio’s kan als verdacht bestempeld
worden. Dit steroïdprofiel is een van de meest veelzijdige en informatieve screeningsmethoden
voor de detectie van steroïdmisbruik in sport. Deze methodologie wordt gebruikt om het
testosteronmisbruik na te gaan, maar ook om misbruik met gerelateerde componenten te
identificeren.
Het gebruik van het urinair steroïdprofiel in dopingcontroles is van groot belang en is essentieel
voor een succesvolle screening van AAS. Kennis van factoren die het steroïdprofiel
Ionenbron Detector Quad 3
Massaselectie
Massaselectie
fragmentionen
Quad 2
Collisiecel
Fragmentatie
precursor ion
Quad 1
Massaselectie
Selectie precursor ion
11
beïnvloeden bovenop parameters zoals pH-waarde, geslacht en sporttak, staat dan ook centraal.
Ook technische en biologische aspecten moeten in acht genomen worden bij het interpreteren
van steroïdprofielen.
Wanneer de derivatisatie van een staal onvolledig wordt uitgevoerd, kunnen wijzigingen
optreden in het steroïdprofiel.12,13
De parameters in het steroïdprofiel worden beïnvloed door training, zware fysieke
inspanningen, de menstruele cyclus, het 24uurs-ritme en het jaarlijkse ritme. Men probeert
hiervoor te corrigeren door de referentielimieten van de parameters zodanig te definiëren dat
fluctuaties in die parameters nog onder de referentielimiet vallen. Wijzigingen in het
steroïdprofiel kunnen ook veroorzaakt worden door de inname van alcohol, de toediening van
ketoconazole, humaan choriongonadotrofine (hCG) bij mannen, inhibitoren van het 5α-
reductase, het gebruik van maskerende middelen, diuretica en microbiële groei.
Verdachte stalen worden geconfirmeerd met IRMS (isotoop-ratio massaspectrometrie) om na
te gaan of het staal echt positief is of niet, want een verdachte stijging van een parameter kan
veroorzaakt zijn door bijvoorbeeld een uitzonderlijk zware fysieke inspanning.12–17
1.3.4 GC-C-IRMS
De verhouding testosteron/epitestosteron (T/E) is een merker voor testosteronmisbruik. De
inname van testosteron verhoogt de urinaire excretiesnelheid van testosteron, maar verlaagt
tegelijk de urinaire excretiesnelheid van epitestosteron. T/E neemt dus toe bij
testosterongebruik. Wanneer T/E > 4 is dit een indicatie voor testosteronmisbruik volgens
WADA. Bij sommige atleten is deze verhouding van nature verhoogd. Om vals positieven uit
te sluiten, wordt er gebruikgemaakt van ‘gas chromatography-combustion-isotope ratio mass
spectrometry’ (GC-C-IRMS). Synthetische steroïden zijn chemisch identiek aan endogene
steroïden, maar er zijn kleine verschillen in de 13C/12C verhouding. Volgens WADA is bij een
concentratie van etiocholanolone en/of androsteron > 10 000 ng/ml, T en/of E > 200 ng/ml en
DHEA > 100 ng/ml een GC-C-IRMS procedure aangewezen. Doordat deze procedure duur en
zeer arbeidsintensief is, wordt ze enkel ter confirmatie gebruikt. 16,17
1.4 Matrices voor analyse
1.4.1 Urine
Urine is een van de standaard matrices die worden gebruikt voor dopinganalyse. Het kan
gemakkelijk en op een niet-invasieve manier gecollecteerd worden en er is voldoende volume
beschikbaar voor meerdere analyses. Een voordeel van urine is dat het metabolieten bevat die
langer te detecteren zijn dan de parent compound.
12
Aan het gebruik van urine zijn ook nadelen verbonden. Urine is makkelijk te vervalsen door
bijvoorbeeld te verdunnen of door het toevoegen van proteasen.18 Na een inspanning kan het
moeilijk zijn om urine te collecteren doordat er dehydratatie is opgetreden. Daarnaast kunnen
er componenten gevonden worden met een lange detectietijd die enkel in competitie verboden
zijn. Conclusies omtrent de administratieroute, de dosis en de resulterende biochemische
effecten zijn beperkt. 19,20
1.4.2 Bloed
Naast urine is bloed een veelgebruikte matrix voor dopinganalyse. Het is mogelijk om
verschillende manieren van bloeddoping en het misbruik van erythropoëse stimulerende
middelen via het atletisch bloedpaspoort te detecteren. Bloedanalyse vereist zelden diepgaande
kennis van het metabolisme, de intacte stof kan rechtstreeks worden gedetecteerd. Bloed heeft
ten opzichte van urine een groot voordeel wanneer tijdsgebonden informatie is gewenst,
bijvoorbeeld wanneer een product enkel verboden is in competitie. Een nadeel van deze matrix
is het invasieve karakter van de collectiemethode.21
1.4.3 Speeksel
Sommige vormen van dopingmisbruik zoals testosterongels die transdermaal werken zijn
echter moeilijk te detecteren met een steroïdprofiel in urine. Testosteron wordt zeer traag
vrijgegeven bij gels, waardoor zijn concentratie niet zoveel stijgt in urine. In speeksel neemt de
testosteronconcentratie wel sterk toe bij gebruik van testosterongels. Concentraties van
verschillende drugs in speeksel correleren met die in bloed. 20,22–26
In bloed bevinden zich hormoonbindende proteïnen zoals geslachtshormoonbindend globuline
(SHBG), cortisolbindend globuline (CBG) en albumine. 95-99 % van de steroïden is gebonden
op zo’n proteïne.20,24
1.4.3.1 Samenstelling
Speeksel is een exocriene secretie die hoofdzakelijk bestaat uit water (99 %) en daarnaast
verschillende elektrolyten en proteïnen. Het heeft een pH van 5,5 tot 7,5. Er zijn drie paar grote
speekselklieren, namelijk de parotis, de sublinguale en de submandibulaire klieren (Figuur 7).
Per dag wordt zo’n 1 à 1,5 liter speeksel geproduceerd. 65 % van het speeksel wordt
geproduceerd door de submandibulaire klier, 20 % door de parotisklier, 5 % door de sublinguale
klier en 10 % door kleinere speekselklieren. Het totale speeksel is een mengsel van vloeistoffen
afkomstig van de speekselklieren en de orale mucosa. Het bevat ook mucus van de neusholte
en farynx, voedselresten, orale bacteriën, afgeschilferde epitheel- en bloedcellen en sporen van
medicatie of chemische producten.23–25,27
13
Figuur 7: De grote speekselklieren28
In de acinuscellen wordt primair speeksel gesecreteerd isotoon aan plasma. Afhankelijk van de
klier kan dit speeksel sereus (parotisklier), muceus (kleine speekselklieren) of seromuceus
(submandibulaire en sublinguale klieren) zijn. De klieren met een sereuze productie staan onder
controle van het sympatisch zenuwstelsel, terwijl de klieren met een seromuceuze secretie
onder controle staan van zowel het sympatisch als het parasympatisch zenuwstelsel. Diegene
met een muceuze secretie staan enkel onder controle van het parasympatisch zenuwstelsel.25
1.4.3.2 Functies
Speeksel is een van de meest veelzijdige lichaamsvloeistoffen en kent verschillende functies.
Het speelt een belangrijke rol in de fysiologie van de oesofagus, in het verteringsproces en in
de bescherming van de gastrische cellen. Speeksel is belangrijk bij de smaakgevoeligheid, het
kauwen, praten, de ionenbalans bij het remineraliseren van het glazuur, het remmen van
zuurdiffusie en de bescherming van de mondmucosa. Het werkt ook antibacterieel, antifungaal
en antiviraal.29
1.4.3.3 Transfer van moleculen naar speeksel
De vrije fractie, de fractie van de steroïden die niet gebonden en biobeschikbaar is, bereikt de
speekselklier en haar kanalen via verschillende mechanismen. Voor de neutrale en vetoplosbare
steroïden is passieve diffusie door de acinuscellen de meest gebruikte. De concentratie is
onafhankelijk van het speekseldebiet. Bij geladen steroïden gebeurt de diffusie op een actieve
manier via de tight junctions van de acinuscellen. De concentratie is hier omgekeerd evenredig
met het speekseldebiet (Figuur 8). De pH van speeksel wijzigt ook afhankelijk van het
14
speekseldebiet en heeft een effect op geladen steroïden. Steroïden kunnen ook in het speeksel
komen via ultrafiltratie, bloed of plasma via wondjes in de mond of onmiddellijk door
contaminatie met exogene steroïden.19,20,23–25,30 Speeksel bevat weinig getransformeerde
metabolieten zoals geconjugeerde metabolieten omdat het moleculair gewicht, de hydrofiliteit,
en de zuurtegraad toenemen.30
Figuur 8: a) passage via filtratie; b) passage van vetoplosbare componenten via passieve diffusie; c) passage
via actief transport; d) Na+ ionen actief binnengepompt vergezeld van water; e) componenten geproduceerd
en gesecreteerd door de speekselklieren; f) Na+ ionen worden in het bloed gepompt, hierdoor wordt een
hypotonische vloeistof verkregen.25
1.4.3.4 Relatie tussen speeksel en serum
De hormonen teruggevonden in speeksel vertegenwoordigen 1-5 % van de niveaus gevonden
in serum. Een belangrijke uitzondering op dit principe is dat bij het transdermaal toedienen van
steroïden, de concentraties gevonden in het speeksel sterk stijgen, namelijk met een factor 100
ten opzichte van het basale level. Dit in tegenstelling tot de concentraties in serum, die een veel
kleinere (factor 1,4) stijging vertonen (Figuur 9).20,24
Figuur 9: Testosteronconcentraties na transdermale toediening in serum (a) en speeksel (b). De totale
testosteronconcentratie (vrij en eiwitgebonden) blijft onaangetast terwijl de concentratie in speeksel een
factor 100 hoger ligt in vergelijking met het basale niveau.20
15
Deze sterke stijging is waarschijnlijk te wijten aan de sterke binding van de steroïden aan
hormoonbindende proteïnen. Door de transdermale toediening zou het evenwicht tussen vrije
en gebonden fracties tijdelijk verstoord zijn.20
1.4.3.5 Geslachts- en leeftijdsafhankelijkheid van testosteronconcentraties
In een studie werd de relatie bekeken tussen geslacht, leeftijd en de testosteronniveaus
gevonden in speeksel van 400 kinderen. De data van de ochtendstalen worden weergegeven in
Figuur 10 en Tabel 1. Hieruit blijkt dat speekseltestosteron bij jongens sterk gecorreleerd is aan
de leeftijd. Bij meisjes is dit beperkter. De relatie tussen testosteronlevels en ontwikkeling werd
ook onderzocht (Figuur 11). Hierbij komt men tot dezelfde vaststelling dat er een sterkere
correlatie is bij jongens dan bij meisjes.31
Figuur 10: De relatie tussen testosteronconcentratie (pg/ml) en leeftijd31
16
Tabel 1: Testosteronniveaus (pg/ml) bij verschillende leeftijden31
Figuur 11: De relatie tussen ontwikkeling en testosteronconcentratie (pg/ml)31
1.4.3.6 De invloed van orale contraceptiva
Het innemen van orale contraceptiva (OC) heeft een gevolg voor de testosteronconcentraties in
het speeksel. De wijziging van de cortisolconcentraties is beperkt, maar bij testosteron en
DHEA wordt een afname gezien; bij testosteron gedurende de hele dag, bij DHEA enkel ‘s
morgens (Figuur 12). Voor testosteron wordt gesteld dat OC de androgeenlevels reduceren door
de ovariële androgeensynthese en de androgeensynthese van de bijnier te inhiberen,
gecombineerd met verhoogde levels van SHBG. De mechanismen die zorgen voor de daling in
DHEA-concentratie moeten verder onderzocht worden.32–34
17
Figuur 12: Dagelijks patroon van speekselcortisol (A), testosteron (B) en DHEA (C) tijdens een menstruele
cyclus: dag 1 (D1), dag 8 (D8), dag 15 (D15) en dag 22 (D22) bij vrouwen zonder gebruik van OC (non-OC)
en vrouwen die OC gebruiken (OC). Dag 1 verwijst naar de eerste dag van OC inname bij ontwaken (W)
en elke 3u van 9:00 tot 21:00.32
1.4.3.7 De invloed van sport
Wanneer men speekselstalen bekijkt van vrouwen voor en na een volleybalmatch, blijkt dat de
concentraties van cortisol en testosteron gestegen zijn na de match ten opzichte van de
concentraties voor de match. Dit effect werd niet vastgesteld bij vrouwen die niet speelden. Bij
hen is de concentratie testosteron gedaald na de match (Figuur 13). De stijging van testosteron
tijdens een aerobe inspanning, proportioneel met de intensiteit en duur van de inspanning, wordt
veroorzaakt door een daling in metabole klaring, hemoconcentratie en een stijging in secretie.35
Bij mannen wordt hetzelfde effect waargenomen voor cortisol (Figuur 14), maar bij testosteron
18
is het verschil tussen voor en na de match niet significant. Ook het verschil tussen een gewonnen
en verloren match bleek niet significant.36
Figuur 13: Gemiddelde voor en na 2 gewonnen volleybalmatches bij vrouwen. Vierkantjes: vrouwen die
speelden, bolletjes: vrouwen die niet speelden35
Figuur 14: Gemiddelde speekselconcentraties bij mannen, voor en na de voetbalmatch voor mannen die
speelden (n=13) en niet speelden (n=8) in een gewonnen match36
19
1.4.3.8 Voordelen
Speeksel kan gebruikt worden als matrix voor dopingcontrole. Het kan gemakkelijk en op een
niet-invasieve manier gecollecteerd worden zonder de privacy van de atleet te schenden. Bij
toediening via gels stijgt het hormoonlevel in het speeksel snel met een factor 100 ten opzichte
van het basale level, in tegenstelling tot serum en urine, waar de concentratiestijging niet zo
uitgesproken is. 19,20,22–26
1.4.3.9 Nadelen
Aan het gebruik van speeksel voor dopingcontrole zijn ook enkele nadelen verbonden. Zo vormt
een droge mond een probleem voor de speekselcollectie. De benodigde sensitiviteit ligt ook
veel hoger ten opzichte van andere matrices. Er kan contaminatie optreden van bepaalde
voedselbestanddelen en dranken, maar ook met zweet en bloed door wondjes in de mond. De
contaminatie met bloed kan de toediening van testosterongels maskeren. Bij bepaalde soorten
kauwgom en wanneer hormonen ’s avonds sublinguaal gebruikt worden en de speekselcollectie
gebeurt ’s morgens, kunnen er vals verhoogde resultaten optreden. Bij topische toediening kan
er contaminatie optreden met speeksel door hormonen die nog op de handen en/of lippen zitten
en dit heeft een vals verhoogd resultaat tot gevolg. 20,24,26
1.5 Doel
Het doel is een nieuw soort steroïdprofiel te ontwikkelen, maar dan in speeksel. De
concentraties in speeksel en serum zijn gecorreleerd aan elkaar, maar een factor 10 tot 1000
keer lager in speeksel. Een mogelijke correlatie tussen de concentraties in urine en speeksel zal
onderzocht worden.
Met dit nieuw steroïdprofiel is het misschien makkelijker verdachte stalen te vinden, ook voor
administratieroutes, zoals gels, die moeilijk te detecteren zijn in urine. Voor de analyse van
speeksel, zal de procedure voor het analyseren van urine aan de basis liggen.
20
2 Materiaal en methoden
2.1 Producten en reagentia
DHEA werd bekomen bij Serva (Duitsland, Heidelberg). Androsteendion (ADION),
testosteron, progesteron, cortisone en cortisol zijn afkomstig van Sigma Aldrich (België,
Bornem). Methyltestosteron (MeT) werd bekomen bij Organon (Nederland, Oss). Testosteron-
d3 werd verkregen bij ‘the National Measurement Institute’ (NMI) (Australië, Pymble).
Cortisol-d4 en progesteron-d9 werden aangekocht bij Cerilliant (Verendigde Staten, Texas).
Diëthylether is afkomstig van Fisher Scientific (Verenigd Koninkrijk, Loughborough).
Natriumsulfaat werd bekomen bij Merck (Duitsland, Darmstadt). De gebruikte gassen (helium,
zuurstofgas en stikstofgas) zijn afkomstig van Air Liquide (België, Aalter). Hexaan is
afkomstig van Biosolve (Nederland, Valkenswaard).
N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (MSTFA) werd verkregen bij Chem. Fabrik
Karl Bucher (Duitsland, Waldstetten). Ammoniumjodide is afkomstig van Sigma Aldrich
(België, Bornem). Ethaanthiol werd aangekocht bij Acros (België, Geel). Water werd bekomen
bij J. T. Baker (Nederland, Deventer).
2.2 Instrumenten
2.2.1 GC/CI/MSMS
Er werd gebruikgemaakt van een Agilent Technologies (Verenigde Staten, Californië, Palo
Alto) GC 7890 gaschromatograaf gekoppeld aan een Agilent 7000C triple quadrupool
massaspectrometer en een MPS2 autosampler van Gerstel (Duitsland, Mülheim an der Ruhr).
De starttemperatuur van de oven was 110 °C en werd een halve minuut aangehouden.
Vervolgens werd de temperatuur met 80 °C/min verhoogd tot 235 °C, waarna de temperatuur
onmiddellijk verhoogd werd met 10 °C/min tot een temperatuur van 290 °C bereikt werd. Ten
slotte werd 320 °C bereikt met een snelheid van 100 °C/min. Deze temperatuur werd 0,4 min
aangehouden.
De snelheid van het He Quench Gas en het N2 Collision Gas waren respectievelijk 2,25 ml/min
en 1,5 ml/min.
Er werd gebruikgemaakt van een splitless injectiemethode bij 280 °C met een injectievolume
van 2 µl.
De analyse gebeurde op een HP1MS kolom (12 m x 250 µm x 0,25 µm) met een mobiele
fasesnelheid van 1,1 ml/min. Na 9,5 min werd de mobiele fasesnelheid verhoogd met een
snelheid van 50 ml/min tot een mobiele fasesnelheid van 4 ml/min werd bereikt.
De massaspectrometer werd gebruikt in de Multiple Reaction Monitoring (MRM) mode.
21
De parameters voor massaspectrometrie worden weergegeven in Tabel 2.
Tabel 2: Parameters voor massaspectrometrie
Retentietijd
(min) Precursor ion Product ion
Collisie
energie (eV)
Mono TMS Et-d5 4,019 368 260 10
368 278 5
Et-d5 4,220 440 260 10
440 220 15
DHEA 4,605 433 343 10
433 253 10
ADION 4,898 431 341 20
431 181 20
431 169 20
Testosteron 5,010 433 181 30
433 169 30
Testosteron-d3 5,014 436 181 30
436 169 30
Methyltestosteron 5,628 447 181 30
447 169 30
Progesteron-d9 6,485 466 376 15
466 212 30
466 185 30
466 172 30
Progesteron 6,509 459 209 25
459 195 25
459 181 25
459 169 25
Cortisone 8,711 631 283 35
631 217 25
631 193 45
631 169 35
Cortisol-d4 9,270 637 547 15
22
637 457 20
637 367 20
637 236 20
637 195 20
Cortisol 9,281 633 363 35
633 245 35
633 235 35
633 221 35
633 195 35
633 181 35
633 169 35
De componenten aanwezig in de methode zijn: DHEA, ADION, testosteron, progesteron,
cortisone en cortisol (hydrocortisone). De inwendige standaarden van deze componenten
worden weergegeven in Tabel 3.
Tabel 3: Componenten aanwezig in de methode en hun overeenkomstige inwendige standaarden
Steroïde Inwendige standaard
DHEA Testosteron-d3
ADION Testosteron-d3
Testosteron Testosteron-d3
Progesteron Progesteron-d9
Cortisone Cortisol-d4
Cortisol Cortisol-d4
2.3 Staalcollectie: referentiepopulatie en excretiestudie
2.3.1 Referentiepopulatie: inter-individuele variatie
De populatie (n=319) bestond uit 149 mannen en 170 vrouwen tussen de leeftijd van 18 en 79
jaar. De proefpersonen hebben een informed consent ondertekend en kregen een medische
vragenlijst (waar gevraagd werd naar geslacht, leeftijd, lengte, gewicht, medicatiegebruik,
medische geschiedenis aan geslachtsorganen/reproductief systeem, hormonale anticonceptie,
fase menstruele cyclus, zwangerschap, het gebruik van alcohol, drugs en
voedingssupplementen, sportactiviteit, stressniveau en de eventuele deelname aan andere
23
klinische testen) die via een codenummer aan hun staal werd gekoppeld. Op deze manier waren
de stalen niet terug te koppelen aan de persoon en bijgevolg anoniem. De studie kreeg de
goedkeuring van het ethisch comité (EC/2015/1316).
De stalen zijn voornamelijk afkomstig van personeelsleden van Universiteit Gent die op hun
jaarlijkse medische controle op het UZ kwamen.
2.3.2 Intra-individuele variatie
2.3.2.1 Korte termijn
Bij 5 vrouwen en 4 mannen werden er gedurende 1 week elke ochtend, middag en avond
speekselstalen gecollecteerd.
2.3.2.2 Lange termijn
Bij 1 persoon werd de intra-individuele variatie op lange termijn nagegaan door gedurende 4
maanden enkele speekselstalen te collecteren.
2.3.3 Administratiestudie
Bij 1 persoon werd gedurende 3 dagen, elke 24 u, testosterongel (Testim 50 mg/5 g)
aangebracht ter hoogte van de arm en de borst. Speeksel- en urinestalen werden afgenomen
volgens volgend schema (Figuur 15).
Figuur 15: Administratieschema Testim (50 mg/5 g)
17
2u
14
8u
13
2u
12
8u
12
4u
12
0u
10
8u
10
4u
10
0u
96
u
84
u
80
u
76
u
72
u
60
u
56
u
52
u
50
u
48
u
38
u
32
u
28
u
26
u
24
u
12
u
10
u
8u
6u
4u
2u
Bla
nco
0u
Bla
nco
-1d
ag
Adm
inis
trat
ie 1
Adm
inis
trat
ie 2
Adm
inis
trat
ie 3
24
2.3.4 Staalafname
Voor elk staal werd minstens 3 ml speeksel gecollecteerd. 30 minuten voorafgaand aan de
collectie mocht niets gegeten of gedronken worden (behalve water). Het staal werd vervolgens
ingevroren.
2.4 Methode
2.4.1 Staalvoorbereiding
Aan elk salivastaal, dat 1,5 ml speeksel bevat, werd 50 µl interne standaard (50 ng/ml) en 5 ml
diëthylether toegevoegd.
Vervolgens werden de stalen 20 minuten op de rollen gelegd en 5 minuten gecentrifugeerd
(2800 rpm), gevolgd door het overbrengen van de organische fase en deze te drogen met
natriumsulfaat. Na het overgieten van de organische fase, werden de stalen gedroogd onder een
zuurstofvrije stikstofstroom (OFN). Na het drogen werden de stalen 10 minuten in een oven
van 80 °C geplaatst. Vervolgens werd 75 µl hexaan toegevoegd en werden de stalen, na
vortexen, overgedragen in vials. Deze werden gedroogd onder een zuurstofvrije stikstofstroom.
Voor de derivatisatiestap werd een mengsel (MSTFA/ethaanthiol/ammoniumjodide 500:4:2)
gebruikt. Van deze oplossing werd 15 µl aan elk staal toegevoegd en vervolgens werden de
stalen gederivatiseerd gedurende 45 minuten bij 80 °C.
Bij elke batch werd een kalibratiecurve gemaakt door water aan te reiken op 6 niveaus volgens
de concentraties weergegeven in Tabel 4. Naast deze kalibratiecurve werden een systeem
blanco (water + interne standaard) en een kwaliteitscontrole (QC) meegenomen (Tabel 4).
Tabel 4: Gebruikte concentraties (pg/ml) voor de kalibratiecurves en de QC
C1 C2 C3 C4 C5 C6 QC
DHEA 10 25 50 300 450 600 150
ADION 20 50 100 125 187,5 250 62,5
Testosteron 10 25 50 100 150 200 50
Progesteron 100 250 500 600 900 1200 300
Cortisone 1000 2500 5000 10000 15000 20000 5000
Cortisol 500 1250 2500 3000 4500 6000 1500
Voor de staalvoorbereiding van urine werd gebruikgemaakt van de procedure beschreven in de
publicatie van Van Gansbeke et al.10
25
2.4.2 Kwaliteitscontrole
Bij elke batch werden kwaliteitscontroles ingebouwd. Een systeem blanco werd meegenomen
om eventuele contaminatie na te gaan. Een tweede kwaliteitscontrole gebeurde door water aan
te reiken aan de concentraties weergegeven in Tabel 4 (QC). Deze waarden werden voor en na
elke batch gecontroleerd.
Per staal werden de waarden Et-d5 mono trimethylsilyl (TMS) en Et-d5 gecontroleerd. Het
percentage mono-TMS werd geëvalueerd om de derivatisatie-efficiëntie na te gaan. Et-d5 mono
TMS is 1 keer gederivatiseerd, terwijl Et-d5 2 keer gederivatiseerd is. Wanneer de derivatisatie
correct gebeurt, zal enkel Et-d5 te zien zijn. Bij een slechte derivatisatie zal vooral Et-d5 mono
TMS waargenomen worden.
Per staal werd ook de intensiteit van methyltestosteron gecontroleerd. De waarde van MeT moet
boven 105 liggen en dient ter controle van de gevoeligheid van de bron van de MS.
2.4.3 Validatie
Voor de validatiebatch werd gebruikgemaakt van 3 kalibratiecurves. De hoogste, laagste en
vierde kalibrator werden nog eens 3 keer meegenomen alsook een systeem blanco. Deze werden
aangereikt aan concentraties weergegeven in Tabel 4. Naast deze kalibratiecurve worden een
systeem blanco (water + interne standaard) en een kwaliteitscontrole (QC) meegenomen.
De 3 validatiebatchen werden uitgevoerd door 3 verschillende personen op 3 verschillende
tijdstippen. De juistheid, precisie en R² (R > 0,98) werden berekend. De grens bij het evalueren
van de juistheid ligt op ± 20 %. Voor RSD (relatieve standaarddeviatie) ligt dit op 15 % en op
20 % voor het laagste niveau.
2.5 Dataverwerking en statistische analyse
Voor de dataverwerking en de statistische analyse werd gebruikgemaakt van Microsoft Office
Excel, RefVal en SPSS. De data onder de LOQ werden weggelaten, de stalen waarvan de
concentratie de hoogste kalibrator overschreed, werden verdund en opnieuw geanalyseerd.
26
3 Resultaten en discussie
3.1 Validatie
R en R² voor de verschillende kalibratiecurves worden weergegeven in Tabel 5. Uit de
resultaten van de validatie (Tabel 6) kan besloten worden dat deze geslaagd is. Alle waarden
vallen onder de vooropgestelde grenzen. De slechtste R-waarde (0,988) is terug te vinden bij
cortisone, maar deze waarde ligt nog boven de vooropgestelde grenzen (R > 0,98).
Tabel 5: R en R² bij de verschillende kalibratiecurves
R² R
Batch1 Batch2 Batch3 Average Average
DHEA 0,993 0,998 0,998 0,996 0,998
ADION 0,997 0,996 0,997 0,997 0,998
T 0,994 0,994 0,997 0,995 0,998
Progesteron 0,994 0,992 0,997 0,994 0,997
Cortisone 0,971 0,969 0,989 0,976 0,988
Cortisol 0,988 0,980 0,996 0,988 0,994
Tabel 6 bevat data omtrent de reproduceerbaarheid en de juistheid. De RSD en juistheid bij
LOQ (limit of quantification of bepaalbaarheidsgrens), bij de 4de kalibrator en bij de 6de
kalibrator van de 3 validatiebatchen samen, worden weergegeven. De juistheid is het laagst bij
DHEA op het LOQ-level (19 %). Dit is het laagste punt van de kalibratiecurve waar de meting
altijd het moeilijkst is. Ook deze waarde valt binnen de vooropgestelde grenzen (juistheid < 20
%). Cortisone scoort het slechtst op de RSD (15,8 %; 15,9 % en 13,7 %). Dit is te wijten aan
het feit dat dit een analytisch moeilijkere component is en het feit dat cortisone geen eigen
interne standaard heeft. Ook cortisol haalt een hoge RSD op LOQ-niveau (18,4 %), maar valt
binnen de vooropgestelde grenzen (RSD < 20 % bij LOQ).
27
Tabel 6: RSD en juistheid bij LOQ, de 4e kalibrator en de 6e kalibrator van de 3 validatiebatchen
RSD
bij
LOQ
(%)
Juistheid
bij LOQ
(%)
RSD bij
4de
kalibrator
(%)
Juistheid
bij 4de
kalibrator
(%)
RSD bij
hoogste
kalibrator
(%)
Juistheid
bij
hoogste
kalibrator
(%)
DHEA 16,4 19,0 10,2 6,0 5,7 2,2
ADION 12,9 6,6 5,5 -0,5 6,5 -1,6
Testosteron 16,8 8,9 7,3 0,6 5,4 -0,17
Progesteron 11,5 1,8 7,0 -0,2 6,8 -4,7
Cortisone 15,8 -9,8 15,9 1,2 13,7 -0,1
Cortisol 18,4 1,7 8,5 -0,2 9,2 -2,2
3.2 Referentiepopulatie (inter-individuele variatie)
Enkel de bovenste referentielimieten werden berekend omdat in dopingcontrole enkel de
bovenste referentielimiet van belang is. Stalen waarbij de bovenste referentielimiet
overschreden wordt, zullen als verdacht bestempeld kunnen worden. De invloed van bepaalde
factoren, zoals leeftijd en geslacht, werd ook bestudeerd.
3.2.1 Vrouwen
In Figuur 16 worden de resultaten van de populatiestudie bij vrouwen weergegeven. Voor elke
component werden, met behulp van het programma RefVal en SPSS, het gemiddelde, de
standaarddeviatie, de variatiecoëfficiënt (CV%), het eerste kwartiel (IQ1, de waarde waarbij 25
% van de concentraties onder deze waarde valt) en het derde kwartiel (IQ3, de waarde waarbij
75 % van de concentraties onder deze waarde valt), de 99 % referentielimiet (RL) en het 95 %
betrouwbaarheidsinterval (BI) berekend (Tabel 7).
In Figuur 17 en Tabel 8 worden de resultaten weergegeven voor de verhoudingen van deze
componenten, namelijk ADION/DHEA en cortisone/cortisol.
Uit deze resultaten is af te leiden dat de CV% voor de verhoudingen kleiner is dan bij de
individuele componenten.
28
Figuur 16: Populatieresultaten voor DHEA (n=170), ADION (n=137), Cortisone (n=164) en Cortisol (n=142)
bij vrouwen
Tabel 7: Gemiddelde (pg/ml), SD (pg/ml), CV%, IQ1 (pg/ml), IQ3 (pg/ml), 99 % referentielimiet (pg/ml) en
95 % betrouwbaarheidsinterval (pg/ml) bij vrouwen
DHEA (n=170) ADION (n=137) Cortisone (n=164) Cortisol (n=142)
Gemiddelde 94,97 50,57 5562,70 1535,36
SD 76,79 26,84 2978,43 1092,61
CV% 80,86 53,06 53,54 71,16
IQ1 45,08 31,17 3311,30 797,55
IQ3 115,60 63,86 7338,00 1842,58
99 % RL 430,34 145,15 15332,73 5683,50
95 % BI 318,75-475,49 124,97-151,68 12246,41-7424,75 4644,34-5839,76
29
Figuur 17: ADION/DHEA (n=137) en Cortisone/Cortisol (n=139) bij vrouwen
Tabel 8: Gemiddelde, SD, CV%, IQ1, IQ3, 99 % referentielimiet en 95 % betrouwbaarheidsinterval voor
ADION/DHEA en Cortisone/Cortisol bij vrouwen
ADION/DHEA (n=137) Cortisone/Cortisol (n=139)
Gemiddelde 0,60 4,59
SD 0,29 2,15
CV% 49,18 46,89
IQ1 0,40 0,04
IQ3 0,76 0,18
99 % RL 1,94 14,43
95 % BI 1,20- 2,00 9,34-14,89
3.2.2 Mannen
In Figuur 18 worden de resultaten van de populatiestudie bij mannen weergegeven. Voor elke
component werden het gemiddelde, de standaarddeviatie, de CV%, IQ1, IQ3, de 99 %
referentielimiet en het 95 % betrouwbaarheidsinterval berekend (Tabel 9). In Figuur 19 en
Tabel 10 worden de resultaten weergegeven voor de verhoudingen van deze componenten,
namelijk ADION/DHEA, T/DHEA en cortisone/cortisol.
Bij de verhouding van cortisone/cortisol ligt de CV% merkelijk lager dan wanneer de CV% van
de individuele concentraties wordt bekeken. Er kon voor deze verhouding geen 99 %
referentielimiet opgesteld worden omdat er te weinig stalen waren die boven de LOQ vielen.
Een 97,5 % referentielimiet werd berekend.
30
Figuur 18: Populatieresultaten voor DHEA (n=147), ADION (n=135), Testosteron (n=147), Cortisone
(n=121) en Cortisol (n=101) bij mannen
31
Tabel 9: Gemiddelde (pg/ml), SD (pg/ml), CV%, IQ1 (pg/ml), IQ3 (pg/ml), 99 % referentielimiet (pg/ml) en
95 % betrouwbaarheidsinterval (pg/ml) bij mannen
DHEA
(n=147)
ADION
(n=135)
Testosteron
(n=147)
Cortisone
(n=121)
Cortisol
(n=101)
Gemiddelde 143,49 51,62 58,90 6102,15 1592,82
SD 107,72 23,64 26,37 3139,56 1115,03
CV% 75,07 45,79 44,77 51,45 70,00
IQ1 61,84 35,22 39,01 3850,04 868,34
IQ3 185,69 62,64 74,06 8197,70 1931,25
99 % RL 493,57 123,99 141,12 15628,06 5917,27
95 % BI
425,34-
531,58
112,46-
128,31
120,80-
151,71
13507,25-
16140,05
4842,11-
5932,36
Figuur 19: ADION/DHEA (n=135), T/DHEA (n=146) en Cortisone/Cortisol (n=99) bij mannen
32
Tabel 10: Gemiddelde, SD, CV%, IQ1, IQ3, 99 % referentielimiet, 95 % betrouwbaarheidsinterval en
aantal stalen voor ADION/DHEA, T/DHEA en Cortisone/Cortisol bij mannen
ADION/DHEA (n=135) T/DHEA (n=146) Cortisone/Cortisol (n=99)
Gemiddelde 0,48 0,57 4,91
SD 0,31 0,35 2,07
CV% 65,24 61,54 42,14
IQ1 0,26 0,32 3,45
IQ3 0,59 0,73 6,42
99 % RL 1,73 1,95 9,53 (97,5 % RL)
95 % BI 1,27-1.80 1,45-1,96 8,60-10,13
In Tabel 11 worden de resultaten van de populatiestudie samengevat. De 99 % RL wordt
weergegeven, alsook de limiet om stalen als verdacht te bestempelen.
Tabel 11: 99 % referentielimiet en limiet voor verdachte stalen
99 % Referentielimiet Limiet voor verdachte stalen
Vrouwen Mannen Vrouwen Mannen
DHEA (pg/ml) 430,34 493,57 500 600
ADION (pg/ml) 145,15 123,99 200 200
Testosteron (pg/ml) 141,12 150
Cortisone (pg/ml) 15332,73 15628,06 17000 17000
Cortisol (pg/ml) 5683,50 5917,27 6000 6500
ADION/DHEA 1,94 1,73 2 2
T/DHEA 1,95 2
Cortisone/Cortisol 14,43 9,53
(97,5 % RL) 15 15
3.2.3 Leeftijd
Aan de hand van een Kruskal-Wallis test met significantieniveau α=0,05 werd bij vrouwen
gezien dat er een significant verschil is tussen de verschillende leeftijdsgroepen (18-29 (n=136),
30-39 (n=15), 40-49 (n=7), 50-59 (n=5), 60-69 (n=4), 70-79 (n=3)) bij DHEA en cortisone. Bij
mannen (18-29 (n=79), 30-39 (n=30), 40-49 (n=12), 50-59 (n=17), 60-69 (n=8), 70-79 (n=2))
33
werd met een Kruskal-Wallis test (α=0,05) gezien dat er een significant verschil was tussen de
verschillende leeftijdsgroepen voor DHEA, ADION, testosteron en cortisone, net als bij de
verhoudingen ADION/DHEA en T/DHEA. Er is een invloed mogelijk van het collectietijdstip.
Ook zijn de leeftijdsgroepen niet gelijk verdeeld. Om te kunnen beslissen of de invloed van
leeftijd algemeen geldig is, zou de onderzochte populatie groter moeten zijn. Uit de bekomen
resultaten kan bij mannen een uitgesproken leeftijdsgerelateerde daling van DHEA en
testosteron waargenomen worden (Figuur 20). Dit is in overeenstemming met de literatuur.37–
39
Figuur 20: Leeftijdsgerelateerde daling bij mannen voor DHEA en testosteron
3.2.4 Geslacht
Testosteron is een mannelijk geslachtshormoon dat geproduceerd wordt door de testes en de
bijnieren. Bij vrouwen vindt de productie ook plaats in de bijnieren, maar in veel mindere mate.
Wanneer beide geslachten vergeleken werden met een Mann-Whitney U test (α=0,05), was er
dan ook een significant verschil te merken bij testosteron (p=0,000). Een significant verschil
werd ook waargenomen bij DHEA (p=0,000), ADION/DHEA (p=0,000) en T/DHEA
(p=0,000). Bij mannen zijn de concentraties van zowel DHEA als testosteron significant hoger
dan die bij vrouwen, net als de verhouding T/DHEA. De verhouding ADION/DHEA is dan
weer groter bij vrouwen. Er moet wel rekening gehouden worden met het feit dat de
testosteronconcentraties van slechts 25 vrouwen boven de LOQ vielen.
3.2.5 Hormonaal anticonceptiegebruik
Uit de resultaten van een Mann-Whitney U test met α=0,05 blijkt dat het gebruik van hormonale
anticonceptievormen (n=115) een significant verschil geeft bij de concentraties van DHEA
(p=0,004), ADION (p=0,000) en ADION/DHEA (p=0,001). Hierbij zijn de concentraties van
deze steroïden significant lager bij de groep die contraceptiva gebruikt. Voor testosteron wordt
dit ook verwacht, maar aangezien er te weinig resultaten zijn die boven de LOQ lagen, kan hier
34
geen besluit over gevormd worden. De resultaten voor het gebruik van OC komen overeen met
de literatuur waarbij gesteld werd dat OC, voor testosteron, de androgeenlevels reduceren door
de ovariële androgeensynthese en de androgeensynthese van de bijnier te inhiberen,
gecombineerd met verhoogde levels van SHBG. 32
Ook de verhouding cortisone/cortisol is significant (p=0,032) kleiner bij de groep die
contraceptiva gebruikt.
Wanneer verschillende vormen van anticonceptie vergeleken worden (pilgebruik (n=62),
spiraal (n=11) en nuvaring (n=6)) werd een significant verschil gezien met een Mann-Whitney
U test (α=0,05) voor ADION (p=0,015), cortisol (p=0,007) en cortisone/cortisol (p=0,030)
tussen pilgebruik en het gebruik van een spiraal. De concentratie ADION is kleiner bij
pilgebruik, net als de verhouding cortisone/cortisol, terwijl de cortisolconcentratie groter is.
Opnieuw is een grotere populatie nodig om hier definitieve conclusies uit te trekken en
invloeden van andere factoren (zoals collectietijdstip) uit te sluiten.
3.2.6 Menstruele fase
Bij de vergelijking van de verschillende fases van de menstruele cyclus (nweek1=29; nweek2=36;
nweek3=38; nweek4=31) werd met een Kruskal-Wallis test (α=0,05) geen significant verschil
aangetoond tussen de concentraties van de verschillende steroïden. Om zeker te zijn van deze
conclusie, is een grotere populatie vereist.
3.2.7 Alcohol
Alcoholgebruik (nmannen=50; nvrouwen=40; Mann-Whitney U test, α=0,05) heeft geen invloed op
de concentraties.
3.2.8 Drugs
Bij druggebruikers (n=3) is geen verschil te merken met een Mann-Whitney U test (α=0,05) in
vergelijking met mensen die geen drugs gebruikten.
3.2.9 Gebruik van voedingssupplementen
Het gebruik van voedingssupplementen (n=34) heeft geen invloed op de steroïdconcentraties
(Mann-Whitney U test, α=0,05).
3.2.10 Sport
Bij het vergelijken van de groep die aangegeven heeft dat ze in de 24u voor de speekselcollectie
aan sport gedaan hebben (n=99) en de groep die niet aan sport deed in de voorafgaande 24u
(n=208) werd met een Mann-Whitney U test (α=0,05) geen significant verschil gevonden. Om
deze conclusie te bevestigen, moet een grotere populatie onderzocht worden.
35
3.2.11 Stressniveau
Wanneer verschillende stressniveaus (0= weinig stress; 5 = veel stress met n0=29; n1=74; n2=84;
n3=73; n4=42; n5=4) werden vergeleken met een Kruskal-Wallis Test (α=0,05), werd er geen
significant verschil gevonden terwijl men dit wel zou verwachten voor het ‘stresshormoon’
cortisol. Dit kan verklaard worden door het feit dat het aangegeven stressniveau zeer subjectief
is en de geteste populatie klein is.
Ook het moment van de afname speelt hierin een belangrijke rol (3.2.12).
3.2.12 Tijdstip speekselcollectie
Het tijdstip van de speekselcollectie werd opgedeeld per uur van 7u tot 23u en heeft een
significante invloed op de concentraties van DHEA, cortisone en cortisol bij vrouwen. Bij
mannen heeft het tijdstip van collectie een invloed op alle steroïdconcentraties (Kruskal-Wallis,
α=0,05). Hierbij moet wel rekening gehouden worden met het feit dat de geteste populatie klein
is en dat er per tijdstip niet evenveel stalen zijn. De productie van deze hormonen is afhankelijk
van het slaap-waakritme waarbij de concentraties ’s morgens het hoogst zijn en verminderen
gedurende de rest van de dag.23,32,34,40
3.3 Intra-individuele variatie
3.3.1 Korte termijn
Uit de resultaten van de kortetermijnstudie bij 5 vrouwen (Figuur 21 en Figuur 22) is een
duidelijke dalende trend te merken gedurende het verloop van de dag. Ook blijkt dat de
spreiding op de resultaten ’s morgens het grootst is. Voor ADION en cortisol worden geen
waarden voor de avond weergegeven, net als voor de verhoudingen ADION/DHEA en
cortisone/cortisol. De meeste waarden vielen onder de LOQ en werden daarom weggelaten. De
gemiddelden, CV%, IQ1, IQ3 en het aantal waarden per tijdstip worden weergegeven in Tabel
12 en Tabel 13. Het kruisje geeft het gemiddelde weer, de dwarse lijn in de boxplot is de
mediaan.
Wanneer de resultaten statistisch vergeleken worden met een Kruskal-Wallis Test (DHEA en
cortisone) en Mann-Whitney U test (ADION, cortisol, ADION/DHEA en cortisone/cortisol),
kan besloten worden dat, bij een significantieniveau van α=0,05, de resultaten significant
verschillen tussen de verschillende tijdstippen (pDHEA=0,000; pADION=0,014; pcortisone=0,000;
pcortisol=0,000;) behalve voor de verhoudingen ADION/DHEA (p=0,165) en cortisol/cortisone
(p= 0,064). Hieruit kan besloten worden dat het tijdstip bij een kortetermijnprofiel minder vat
heeft op de verhoudingen ADION/DHEA en cortisone/cortisol.
36
Figuur 21: Resultaten kortetermijnstudie bij 5 vrouwen. De kruisjes stellen de gemiddelden voor, de dwarse
lijn in de boxplot is de mediaan.
Tabel 12: Gemiddelden (pg/ml), CV%, IQ1 (pg/ml) en IQ3 (pg/ml) van de kortetermijnstudie bij vrouwen
DHEA
(nper tijdstip=34)
ADION
(nper tijdstip=26)
Cortisone
(nper tijdstip=31)
Cortisol
(nper tijdstip=24)
Gemiddelde ochtend 106,14 52,26 10374,20 3117,55
CV% ochtend 76,16 47,39 51,89 49,24
IQ1 60,19 31,61 6026,66 2163,78
IQ3 141,80 79,64 13651,78 4144,41
Gemiddelde middag 60,00 35,00 5710,22 1140,96
CV% middag 64,76 35,62 57,49 43,75
IQ1 31,53 24,04 3547,76 748,28
IQ3 74,66 45,64 6399,47 1465,93
Gemiddelde avond 39,17 2462,41
CV% avond 49,28 52,59
IQ1 23,03 1699,08
IQ3 52,04 2704,40
37
Figuur 22: Resultaten voor de verhoudingen ADION/DHEA en cortisone/cortisol van de kortetermijnstudie
bij 5 vrouwen. Het kruisje geeft het gemiddelde weer, de dwarse lijn in de boxplot is de mediaan.
Tabel 13: Gemiddelde, CV%, IQ1, en IQ3 voor de verhoudingen ADION/DHEA en cortisone/cortisol van
de kortetermijnstudie bij vrouwen
ADION/DHEA
(nper tijdstip=25)
Cortisone/Cortisol
(nper tijdstip=22)
Gemiddelde ochtend 0,54 4,21
CV% ochtend 46,52 64,73
IQ 1 0,32 1,70
IQ3 0,69 6,47
Gemiddelde middag 0,64 5,95
CV% middag 43,63 48,79
IQ1 0,38 3,93
IQ3 0,80 7,28
Bij het bekijken van een kortetermijnprofiel van 1 vrouw, wordt opnieuw het belang van het
tijdstip van afname duidelijk (Figuur 23). Sommige concentraties worden niet afgebeeld omdat
ze onder de LOQ vielen. Het gemiddelde (µ) en gemiddelde ±2 keer standaarddeviatie (SD)
worden weergegeven.
38
Figuur 23: Kortetermijnprofiel van 1 vrouw. De stippellijn stelt het gemiddelde voor, de rode lijnen µ±2SD
In Tabel 14 worden het gemiddelde, de standaarddeviatie en µ±2SD weergegeven voor de
kortetermijnstudie bij 1 vrouw. De absolute spreiding is het grootst voor cortisone, terwijl de
relatieve spreiding (CV%) het grootst is voor cortisol. De kleinste spreiding, zowel absoluut als
relatief, wordt gezien bij ADION.
39
Tabel 14: Gemiddelde (pg/ml), CV%, standaarddeviatie (pg/ml) en µ±2SD (pg/ml) bij de kortetermijnstudie
van 1 vrouw
DHEA ADION Cortisone Cortisol
ADION/
DHEA
Cortisone/
Cortisol
µ 34,97 29,93 4262,30 2239,60 0,81 2,74
CV% 57,47 20,70 48,99 70,35 46,88 49,79
SD 20,10 6,20 2088,26 1575,61 0,38 1,36
µ+2SD 75,16 42,32 8438,82 5390,83 1,57 5,47
µ-2SD -5,23 17,54 85,79 -911,63 0,05 0,01
RL
(µ+3SD) 95,25 48,52 10527,08 6966,45 1,95 6,83
Bij mannen (Figuur 24) wordt dezelfde trend gezien. De gemiddelden, CV%, IQ1 en IQ3
worden weergegeven in Tabel 15. De avondwaarden voor cortisol vielen meestal onder de LOQ
en worden niet weergegeven. De verhoudingen voor ADION/DHEA en T/DHEA worden
weergegeven in Figuur 25 en Tabel 16. De verhouding cortisol/cortisone wordt niet
weergegeven omdat er te weinig waarden waren. Opnieuw blijkt dat het tijdstip minder invloed
heeft op de verhoudingen dan op de individuele concentraties.
40
Figuur 24: Resultaten kortetermijnstudie bij 4 mannen (pg/ml)
Tabel 15: Gemiddelde (pg/ml), CV%, IQ1 (pg/ml) en IQ3 (pg/ml) van de kortetermijnstudie bij mannen
DHEA
(nper
tijdstip=27)
ADION
(nper
tijdstip=27)
Testosteron
(nper
tijjdstip=27)
Cortisone
(nper
tijdstip=19)
Cortisol
(nper
tijdstip=15)
Gemiddelde
ochtend 164,32 54,00 52,38 6202,01 1945,88
CV% 71,55 39,25 45,95 70,92 55,34
IQ1 100,87 44,86 57,38 6663,51 1648,61
IQ3 343,34 74,24 76,28 9823,06 2837,98
Gemiddelde
middag 160,42 50,32 51,82 5551,35 1846,70
CV% 71,29 36,53 47,21 61,79 60,38
IQ1 88,15 34,33 34,21 3552,23 738,60
IQ3 176,7464 54,2050 56,0470 6110,4161 1631,1668
Gemiddelde
avond 162,64 47,60 49,95 5129,52
CV% 69,60 39,81 50,83 62,90
IQ1 56,51 30,35 24,30 1295,76
41
IQ3 156,03 43,16 43,09 4570,97
Figuur 25: Resultaten voor de verhoudingen ADION/DHEA en T/DHEA van de kortetermijnstudie bij
mannen. Het kruisje geeft het gemiddelde weer, de dwarse lijn in de boxplot is de mediaan.
Tabel 16: Gemiddelde, CV%, IQ1 en IQ3 van de kortetermijnstudie bij mannen
ADION/DHEA
(nper tijdstip=27)
T/DHEA
(nper tijdstip=27)
Gemiddelde ochtend 0,44 0,40
CV% 49,52 46,32
IQ1 0,20 0,21
IQ3 0,56 0,56
Gemiddelde middag 0,42 0,41
CV% 51,55 46,62
IQ1 0,24 0,25
IQ3 0,56 0,53
Gemiddelde avond 0,39 0,39
CV% 55,95 50,81
IQ1 0,2385 0,2554
IQ3 0,5988 0,5075
Uit de resultaten van het kortetermijnprofiel van 1 man kan opnieuw dezelfde trend afgeleid
worden (Figuur 26). Opnieuw werden sommige waarden niet afgebeeld omdat ze onder de LOQ
vielen. Het gemiddelde, de standaarddeviatie en µ±2SD worden voor elke component voor de
kortetermijnstudie van 1 man weergegeven in Tabel 17. Hieruit kan afgeleid worden dat de
absolute spreiding het grootst is voor cortisone, de relatieve spreiding (CV%) is het grootst voor
cortisol. Testosteron kent de kleinste variatie. In Tabel 18 worden de verhoudingen
42
ADION/DHEA, T/DHEA en cortison/cortisol weergegeven. De variatie voor de verhoudingen
is kleiner dan voor de individuele concentraties.
Figuur 26: Kortetermijnprofiel van 1 man. De stippellijn stelt het gemiddelde voor, de rode lijnen µ±2SD.
43
Tabel 17: Gemiddelde (pg/ml), CV%, standaarddeviatie (pg/ml) en µ±2SD (pg/ml) bij de kortetermijnstudie
van 1 man
DHEA ADION Testosteron Cortisone Cortisol
µ 231,04 52,80 47,92 4824,16 1747,08
CV% 46,47 43,03 27,82 69,25 75,56
SD 107,37 22,72 13,33 3340,70 1320,11
µ+2SD 445,79 98,24 74,58 11505,56 4387,29
µ-2SD 16,30 7,36 21,26 -1857,24 -893,13
RL
(µ+3SD) 553,17 120,96 87,91 14846,26 5707,40
Tabel 18: Gemiddelde, SD en µ±2SD voor de verhoudingen ADION/DHEA, T/DHEA en cortisone/cortisol
van de kortetermijnstudie van 1 man
ADION/DHEA T/DHEA Cortisone/Cortisol
µ 0,24 0,23 4,45
CV% 24,58 35,37 39,24
SD 0,06 0,08 1,75
µ+2SD 0,36 0,39 7,94
µ-2SD 0,12 0,07 0,96
RL (µ+3SD) 0,42 0,47 9,69
3.3.2 Lange termijn
Bij 1 persoon werden, gedurende 4 maanden, speekselstalen afgenomen en hun concentraties
werden vergeleken. De resultaten van persoon 1, in de periode 13/07/2015 – 26/10/2015,
worden hier weergegeven (Figuur 27). Uit de resultaten blijkt dat de concentratie van de
steroïden, rekening houdend met de standaardafwijking, constant blijven. In Tabel 19 en Tabel
20 worden het gemiddelde en SD voor elke component en de verhoudingen ADION/DHEA,
T/DHEA en cortisone/cortisol weergegeven.
44
Figuur 27: Concentraties van DHEA, ADION, testosteron, cortisone, cortisol in het tijdsinterval 13/07/2015
– 26/10/2015. De stippellijn geeft het gemiddelde weer, de rode lijnen zijn het gemiddelde ± 2SD
Tabel 19: Gemiddelde (pg/ml), CV%, SD (pg/ml), µ±2SD en RL (µ+3SD) (pg/ml) voor persoon 1
DHEA ADION Testosteron Cortisone Cortisol
µ 176,77 37,73 41,23 4747,55 671,64
CV% 20,55 29,39 17,69 30,73 38,26
SD 36,33 11,09 7,29 1458,82 256,99
µ+2SD 249,43 59,90 55,81 7665,21 1185,62
µ-2SD 104,12 15,55 26,64 1829,89 157,66
RL (µ+3SD) 285,76 70,99 63,10 9124,03 1442,61
45
Tabel 20: Gemiddelde, SD, µ±2SD en RL (µ+3SD) voor persoon 1
ADION/DHEA T/DHEA Cortisone/Cortisol
µ 0,22 0,24 7,82
CV% 33,71 26,61 28,97
SD 0,07 0,06 2,27
µ+2SD 0,37 0,37 12,35
µ-2SD 0,07 0,11 3,29
RL (µ+3SD) 0,44 0,44 14,62
De kortetermijnstudie van 1 man en de langetermijnstudie werden bij dezelfde persoon
uitgevoerd. Uit de vergelijking van de langetermijnstudie en de kortetermijnstudie van deze
persoon blijkt dat bij de langetermijnstudie de standaarddeviatie en de CV% kleiner worden.
Indien deze informatie als biologisch paspoort zou gebruikt worden, de µ+3SD als eigen
referentielimiet, kan een abnormale variatie met een hogere gevoeligheid gedetecteerd worden.
3.4 Administratiestudie
3.4.1 Saliva
Uit de resultaten van de administratiestudie (Figuur 28) blijkt dat de concentratie van
testosteron in speeksel tot een factor 170 stijgt in vergelijking met de gemiddelde
testosteronconcentratie. Na elke administratie worden duidelijke schommelingen
waargenomen. Dit kan verklaard worden door het feit dat het lichaam gaat compenseren voor
het toegediende testosteron. De maximumconcentratie wordt bereikt 80 u na de eerste
administratie. Omdat het over dezelfde persoon gaat als in de langetermijnstudie, werden het
gemiddelde en de standaarddeviatie uit de bekomen resultaten van de langetermijnstudie en de
kortetermijnstudie van deze persoon gehaald. De gemiddelde testosteronconcentratie bedraagt
43,49 pg/ml, de standaarddeviatie is 10,17 pg/ml en µ+3SD is 74,00 pg/ml (intra-individuele
grens). In de figuur geeft de rode lijn µ+3SD weer. Hieruit kan men afleiden dat het gebruik
van een testosterongel kan gedetecteerd worden in speeksel en dat de waarden na toediening
boven de normale grens van de basale waarden vallen. Wanneer de concentraties, gevonden na
het gebruik van een testosterongel, worden vergeleken met de inter-individuele referentielimiet
die eerder werd opgesteld voor testosteron (126,57 pg/ml), kan opnieuw besloten worden dat
het gebruik van zo’n gel kan gedetecteerd worden in speeksel. Tot 80 u (128u op de grafiek) na
de laatste administratie zijn waarden waar te nemen die buiten de bovenste grens vallen.
46
Figuur 28: Resultaten van de administratiestudie. De rode lijn geeft de intra-individuele grens weer (µ+3SD)
Voor ADION en ADION/DHEA wordt dezelfde, maar veel minder uitgesproken, trend gezien.
Om hierover definitieve conclusies te kunnen trekken, moet de studie herhaald worden met
meer proefpersonen. Bij de verhouding T/DHEA worden ook waarden waargenomen die ver
boven de vooropgestelde intra-individuele referentielimiet van deze persoon (0,45) vallen
(Figuur 29). Deze verhouding stijgt tot een factor 150 in vergelijking met de gemiddelde
T/DHEA verhouding van deze persoon. Deze intra-individuele referentielimieten werden
berekend aan de hand van de resultaten van de kortetermijn- en langetermijnstudie van deze
persoon.
3.4.2 Urine
De steroïdconcentraties in de urinestalen werden, naar analogie met het biologisch paspoort,
gecorrigeerd voor verschillen in densiteit met behulp van de formule Conccorr = Concmeasured *
(1,020-1)/(SG-1) waarbij SG de densiteit voorstelt (specific gravity). Wanneer de T/E ratio
groter is dan 4, de A/T ratio kleiner is dan 20, de 5αAdiol/5βAdiol verhouding groter is dan 2,4,
de concentraties van T of E groter zijn dan 200 ng/ml bij mannen of groter dan 50 ng/ml bij
vrouwen, de concentratie voor A of Etio groter is dan 10000 ng/ml, de concentratie 5αAdiol
groter is dan 250 ng/ml bij mannen of groter dan 150 ng/ml bij vrouwen, gecombineerd met
een 5αAdiol/E ratio groter dan 10 in beide geslachten, wordt een urinestaal als verdacht
47
beschouwd.17
Wanneer de resultaten in speeksel vergeleken worden met de resultaten in urine, kan besloten
worden dat het misbruik in speeksel wel te detecteren is, terwijl dit in urine bijna niet het geval
is. De concentraties stijgen nergens spectaculair, enkel bij de T/E ratio zijn er enkele verdachte
stalen (na 38 u, 48 u, 56 u, 60 u en 72 u) te zien en de detectietijd is slechts 72 u. In speeksel is
er een duidelijke respons te zien na elke toediening, terwijl de responstijd in urine veel trager
is en de verschillende toedieningen bijna niet waarneembaar zijn. Er is eerder een stelselmatige
opbouw te merken. Het gebruik van speeksel als dopingtest is dus effectief om deze vorm van
misbruik te achterhalen.
Figuur 29: Resultaten van de administratiestudie voor DHEA, ADION, cortisone, cortisol, ADION/DHEA,
T/DHEA en cortisone/cortisol in speeksel. De rode lijn is de intra-individuele referentielimiet (µ+3SD)
48
4 Besluit
Het doel van deze thesis was het opstellen van een steroïdprofiel in speeksel. Hierbij werden
inter-individuele referentielimieten opgesteld. Deze limieten werden bepaald voor
verschillende steroïden en hun verhoudingen om een staal als verdacht te kunnen bestempelen.
Deze worden weergegeven in Tabel 21. De invloed van bepaalde factoren werd onderzocht,
maar een grotere populatie is nodig voor definitieve conclusies.
Tabel 21: Referentielimieten voor DHEA, ADION, testosteron, cortisone, cortisol, ADION/DHEA, T/DHEA
en cortisone/cortisol bij vrouwen en mannen
99 % Referentielimiet Limiet voor verdachte stalen
Vrouwen Mannen Vrouwen Mannen
DHEA (pg/ml) 430,34 493,57 500 600
ADION (pg/ml) 145,15 123,99 200 200
Testosteron (pg/ml) 141,12 150
Cortisone (pg/ml) 15332,73 15628,06 17000 17000
Cortisol (pg/ml) 5683,50 5917,27 6000 6500
ADION/DHEA 1,94 1,73 2 2
T/DHEA 1,95 2
Cortisone/Cortisol 14,43 9,53
(97,5 % RL) 15 15
Uit de resultaten van de kortetermijnstudies (intra-individuele variatie) kan besloten worden dat
het tijdstip van collectie een belangrijke rol speelt bij de concentraties van de verschillende
steroïden. Dit is veel minder van belang bij de verhoudingen van deze steroïden.
De berekende intra-individuele referentielimieten (gemiddelde + 3x de standaarddeviatie)
zouden gebruikt kunnen worden in een biologisch paspoort.
Verder is speekselanalyse een zeer krachtige tool voor het detecteren van dopinggebruik onder
de vorm van een testosterongel. De testosteronconcentraties in speeksel stijgen met een factor
170 ten opzichte van het basale level, in tegenstelling tot in urine, waar de concentraties bijna
nergens de limiet voor verdachte stalen bereiken. De detectietijd in speeksel (128 u) is ook veel
langer dan de detectietijd in urine (72 u). Ook de T/DHEA verhouding kent een stijging met
een factor 150 ten opzichte van de gemiddelde T/DHEA verhouding van deze persoon.
49
5 Referentielijst
1. WADA, “World Anti-Doping Code,” World Anti-Doping, pp. 1–116, 2015.
2. F. Sjöqvist, M. Garle, and A. Rane, “Use of doping agents, particularly anabolic steroids, in sports and
society,” The Lancet, vol. 371, pp. 1872–1882, 2008.
3. A. Momaya, M. Fawal, and R. Estes, “Performance-Enhancing Substances in Sports: A Review of the
Literature,” Sports Medicine, vol. 45, pp. 517–531, 2015.
4. WADA, “The World Anti-Doping Code THE 2014 PROHIBITED LIST INTERNATIONAL,” Wada,
vol. 0, no. May, pp. 1–10, 2014.
5. W. Schänzer, “Metabolism of Anabolic Androgenic Steroids : 5a-and 5b-Reduction of 3-Keto-4-ene
Steroids,” Clinical Chemistry, vol. 42, pp. 185–201, 1997.
6. P. Van Renterghem, “Alternative Steroid Profiling,” 2010.
7. V. Birzniece, “Doping in sport: effects, harm and misconceptions,” Internal Medicine Journal, vol. 45,
pp. 239–248, 2015.
8. R. M. H. Verbeeck, “Biomedische Analyse I,” Universiteit Gent, 2011.
9. M. Raro, T. Portolés, J. V. Sancho, E. Pitarch, F. Hernández, J. Marcos, R. Ventura, C. Gõmez, J. Segura,
and O. J. Pozo, “Mass spectrometric behavior of anabolic androgenic steroids using gas chromatography
coupled to atmospheric pressure chemical ionization source. Part I: Ionization,” Journal of Mass
Spectrometry, vol. 49, pp. 509–521, 2014.
10. W. Van Gansbeke, M. Polet, F. Hooghe, C. Devos, and P. Van Eenoo, “Improved sensitivity by use of gas
chromatography—positive chemical ionization triple quadrupole mass spectrometry for the analysis of
drug related substances,” Journal of Chromatography B, vol. 1001, pp. 221–240, 2015.
11. Agilent Technologies, “Agilent 7000 Series Triple Quadrupole LC / MS System: Concepts Guide,” pp. 1–
66, 2011.
12. M. K. Parr and W. Schänzer, “Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology Detection of the
misuse of steroids in doping control ଝ,” Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, vol. 121,
pp. 528–537, 2010.
13. U. Mareck, H. Geyer, G. Opfermann, M. Thevis, and W. Sch, “Factors influencing the steroid profile in
doping control,” Journal of Mass Spectrometry, vol. 43, pp. 877–891, 2008.
14. P. Van Eenoo, W. Van Gansbeke, N. De Brabanter, K. Deventer, and F. T.Delbeke, “A fast ,
comprehensive screening method for doping agents in urine by gas chromatography – triple quadrupole
mass spectrometry,” Journal of Chromatography A, vol. 1218, pp. 3306–3316, 2011.
15. P. Van Renterghem, M. Polet, L. Brooker, W. Van Gansbeke, and P. Van Eenoo, “Development of a GC
/ C / IRMS method – Confirmation of a novel steroid profiling approach in doping control,” STEROIDS,
vol. 77, pp. 1050–1060, 2012.
16. M. Polet, W. Van Gansbeke, K. Deventer, and P. Van Eenoo, “Development of a sensitive GC-C-IRMS
method for the analysis of androgens,” Biomedical Chromatography, vol. 27, pp. 259–266, 2012.
17. WADA, “WADA Technical Document – TD2016EAAS Endogenous Anabolic Androgenic Steroids
WADA Technical Document – TD2016EAAS,” pp. 1–9, 2016.
18. M. Thevis, J. Maurer, M. Kohler, H. Geyer, and W. Schänzer, “Proteases in doping control analysis.,”
International journal of sports medicine, vol. 28, no. 7, pp. 545–9, 2007.
19. S. Anizan and M. A. Huestis, “The Potential Role of Oral Fluid in Antidoping Testing,” Clinical
Chemistry, vol. 60, pp. 307–322, 2014.
20. M. Schönfelder, H. Hofmann, P. Anielski, D. Thieme, R. Oberhoffer, and H. Michna, “Gene expression
profiling in human whole blood samples after controlled testosterone application and exercise,” Drug
Testing and Analysis, vol. 3, pp. 652–660, 2011.
21. M. Thevis, A. Thomas, and W. Schänzer, “Targeting prohibited substances in doping control blood
50
samples by means of chromatographic–mass spectrometric methods,” Analytical and Bioanalytical
Chemistry, vol. 405, pp. 9655–9667, 2013.
22. W. Gao, T. Stalder, and C. Kirschbaum, “Quantitative analysis of estradiol and six other steroid hormones
in human saliva using a high throughput liquid chromatography–tandem mass spectrometry assay,”
Talanta, vol. 143, pp. 353–358, 2015.
23. J. G. Lewis, “Steroid analysis in saliva: an overview.,” The Clinical biochemist. Reviews / Australian
Association of Clinical Biochemists, vol. 27, pp. 139–146, 2006.
24. D. Zava, “Saliva Hormone Testing,” Townsend Letter for Doctors & Patients, pp. 120–124, 2004.
25. Lázaro Alessandro Soares Nunes; Denise Vaz de Macedo, “Saliva as a diagnostic fluid in sports medicine :
potential and limitations,” J Bras Patol Med Lab, vol. 49, pp. 247–255, 2013.
26. P. Kintz and N. Samyn, “Use of alternative specimens: drugs of abuse in saliva and doping agents in hair.,”
Therapeutic drug monitoring, vol. 24, pp. 239–246, 2002.
27. E. A. Almeida, P.D.V, “Saliva Composition and Functions :,” The journal of comtemporary dental
practice, vol. 9, pp. 72–80, 2008.
28. E. Marieb, P. Wilhelm, and J. Mallatt, Human Anatomy. 2012.
29. D. P. Lima, D. G. Diniz, S. A. S. Moimaz, D. H. Sumida, and A. C. Okamoto, “Saliva: reflection of the
body,” International Journal of Infectious Diseases, vol. 14, pp. e184–e188, 2010.
30. V. Bessonneau, E. Boyaci, M. Maciazek-Jurczyk, and J. Pawliszyn, “In vivo solid phase microextraction
sampling of human saliva for non-invasive and on-site monitoring,” Analytica Chimica Acta, vol. 856, pp.
35–45, 2015.
31. D. Granger, “The ‘trouble’ with salivary testosterone,” Psychoneuroendocrinology, vol. 29, pp. 1229–
1240, 2004.
32. N. Vibarel-Rebot, N. Rieth, F. Lasne, C. Jaffré, and K. Collomp, “Oral contraceptive use and saliva diurnal
pattern of metabolic steroid hormones in young healthy women.,” Contraception, vol. 91, pp. 245–7, 2015.
33. D. a. Edwards and J. L. O’Neal, “Oral contraceptives decrease saliva testosterone but do not affect the rise
in testosterone associated with athletic competition,” Hormones and Behavior, vol. 56, pp. 195–198, 2009.
34. S. H. Liening, S. J. Stanton, E. K. Saini, and O. C. Schultheiss, “Salivary testosterone, cortisol, and
progesterone: Two-week stability, interhormone correlations, and effects of time of day, menstrual cycle,
and oral contraceptive use on steroid hormone levels,” Physiology and Behavior, vol. 99, no. 1, pp. 8–16,
2010.
35. A. Edwards, David; Waters, Jennifer; Weis, Alexis; Jarvis, “Intercollegiate athletics: competition increases
saliva testosterone in women soccer, volleyball, and softball players,” in Testosterone Research Trends,
2007, pp. 195–209.
36. D. Edwards, K. Wetzel, and D. Wyner, “Intercollegiate soccer: Saliva cortisol and testosterone are elevated
during competition, and testosterone is related to status and social connectedness with teammates,”
Physiology & Behavior, vol. 87, pp. 135–143, 2006.
37. A. Walther and U. Ehlert, “Slowing down age-related DHEA-decline in men 40+,”
Psychoneuroendocrinology, vol. 61, p. 67, 2015.
38. “Salivary cortisol and DHEA levels in the Korean population.pdf.” .
39. E. Stearns, J. MacDonnell, B. Kaufman, R. Padua, T. Lucman, J. Winter, and C. Faiman, “Declining
testicular function with age.,” American Journal of Medicine, vol. 57, no. November, pp. 761–766, 1974.
40. U. Turpeinen and E. Hämäläinen, “Determination of cortisol in serum, saliva and urine,” Best Practice
and Research: Clinical Endocrinology and Metabolism, vol. 27, no. 6, pp. 795–801, 2013.
Steroïdprofilering in saliva aan de
hand van GC/CI/MSMS
Laurie De Wilde
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: dr. Michaël Polet
Co-promotor: prof. dr. ir. Peter Van Eenoo
Vakgroep: Klinische biologie,
microbiologie en immunologie
Academiejaar 2015 – 2016
