Stiudiu de caz privind acidul folic si a derivatilor

Vizitati www.tocilar.ro ! Arhiva online cu diplome, cursuri si referate postate de utilizatori.

Studiu de caz privind acidul folic si derivatii sai

INTRODUCERE

Acidul folic şi derivaţii săi prezintă un larg interes în biologie şi medicină datorită

funcţiilor coenzimatice îndeplinite în organism într-o serie de reacţii de importanţă vitală.

Acidul folic participă la formarea timinei şi a bazelor purinice din ADN, deci deţine

un rol fundamental în creşterea şi reproducerea celulară.

Folat-coenzimele sunt derivaţi ai acidului tetrahidrofolic, acestea reprezentând forme

biologic active ale acidului folic. De aici derivă importanţa specială a reducerii acidului folic

şi mai ales aceea a transformării acidului dihidrofolic în acid tetrahidrofolic, proces ce se

desfăşoară în organism sub acţiunea enzimei dihidrofolatreductază.

Această enzimă “cheie” a metabolismului folaţilor a constituit obiectul unor

numeroase studii biochimice şi histoenzimologice.

Ea reprezintă cu cea mai mare probabilitate, receptorul molecular al analogilor

acidului folic, explicând marea eficacitate a unora dintre aceste substanţe ca agenţi citotoxici

şi în consecinţă, aplicabilitatea lor în terapia cancerului.

Dat fiind rolul derivaţilor acidului folic în biosinteza acizilor nucleici şi a proteinelor,

de un interes deosebit a beneficiat în această lucrare studiul implicaţiior acidului folic în

diferite situaţii fiziologice (sarcină, copil în creştere) sau patologice (neoplasme, în particular

leucemii, anemie megaloblastică, boli cronice exfoliative ale pielii). De asemenea, în lucrarea

de faţă s-a urmărit o reactualizare privind noile date apărute în literatura de specialitate în

legătură cu această temă: noutăţi referitoare la mecanismul absorbţiei, transportului şi

utilizării folaţilor, la carenţa de folaţi şi malformaţiile congenitale, la mecanismul de acţiune

al medicamentelor antiinflamatoare nesteroidiene (AINS).

De-a lungul ultimilor ani s-au făcut multe studii în ceea ce priveşte incidenţa

malnutriţiei la bătrâni (în special la pacienţii vârstnici spitalizaţi pe perioade mai mari, cât şi

la persoane care se hrănesc cu conserve).

Câteva studii au indicat o incidenţă crescută a malnutriţiei la persoanele trecute de 65

de ani. Malnutriţia a fost evaluată atât prin parametrii antropometrici cât şi biochimici

Pagina 2 din 59


(incluzând nivelul seric de acid folic). De asemenea a fost observată o incidenţă crescută a

anemiei la aceşti pacienţi, anemie datorată unui deficit de folaţi.

Mai mult, în ultimii ani hiperhomocisteinemia a fost propusă ca factor independent de

risc pentru boala arterială coronariană. De vreme ce deficitul de acid folic este o cauză

importantă de hiperhomocisteinemie în populaţia generală, scăderea hiperhomocisteinemiei

printr-un tratament simplu şi eficace cu acid folic poate scădea incidenţa bolii arteriale

coronariene.

Ţinând cont de informaţiile menţionate anterior am ales să studiez în partea

experimentală variaţia concentraţiei de acid folic din omogenate tisulare, în funcţie de vârstă

şi organ (ca factori independenţi).

Determinările le-am făcut pe şobolani împărţiţi în trei grupe de vârstă: tineri, adulţi şi

vârstnici şi concentraţiile de acid folic au fost măsurate din omogenatele tisulare din ficat,

creier, rinichi, splină.

Problema variaţiei acidului folic cu vârsta este de importanţă nu atât individuală, cât

socială, indicând oportunitatea unei suplimentări sistematice puţin costisitoare şi lipsită de

riscuri (cel puţin la cei ce prezintă manifestări clinice).

Abordarea acestei teme se impunea cu atât mai mult cu cât la noi în ţară există puţine

studii referitoare la acest subiect, iar în articolele de specialitate din întreaga lume este

menţionată tot mai frecvent.

ACIDUL FOLIC ŞI DERIVAŢII SĂI

1.1. Scurt istoric

Primele observaţii cu privire la existenţa unui nou factor alimentar, cu acţiune

vitaminică, s-au semnalat în perioada anilor 1931-1932, când s-a constatat că leucopenia şi

granulocitopenia maimuţelor poate fi vindecată cu ajutorul unui extract obţinut din drojdia de

bere.

În 1931, L.Wills şi B.S.Lond extrag din drojdia de bere un factor antianemic activ pe

maimuţă, numit vitamina M (M=monky). Tot în 1931, L.Wills, aflat în India, remarcă efectul

favorabil al unui extract din ficat şi drojdii asupra anemiei macrocitare tropicale,

concluzionând că această afecţiune trebuie să fie cauzată de lipsa unui factor nutritiv, a unei

deficienţe alimentare.

Pagina 3 din 59


În 1938, P.Day, W.C.Langeston, W.Y.Darby constată că extractul din drojdia de bere

este activ şi asupra puilor de găină, stimulând creşterea acestora. A fost numit factor de

creştere pentru pui sau “Factor U”. A.G.Hogan şi E.M.Parrott reuşesc să descopere în

extractele din ficat un factor antianemic pentru puii de găină, căruia îi dau numele de

“Vitamina Bc”(c=chick, pui de găină).

În perioada 1939-1940, E.E.Snell şi W.H.Peterson obţin din ficat un factor de creştere

pentru Lactobacillus casei, izolat prin adsorbţie pe cărbune activ (norit) şi eluare cu alcool

amoniacal şi îl denumesc “factor L.Casei”sau “norit-eluat-factor”.

În 1941, H.K.Mitchell, E.E.Snell, R.J.Williams reuşesc să izoleze din frunzele de

spanac acidul folic (folium=frunză), care stimulează creşterea la Streptococcus lactis şi

manifestă proprietăţi vitaminice la animale.

Ulterior s-a constatat că factorii nutritivi obtinuţi de diferiţi cercetători din drojdie,

ficat, spanac, microorganisme, fac parte din aceeaşi grupă şi s-a propus denumirea lor

generică de acizi folici.

Termenul de folaţi este utilizat să desemneze toţi membrii familiei acizilor folici şi a

derivaţilor acestora, inclusiv compuşii în care acidul folic este legat de unul sau mai multe

resturi de molecule de acid L-glutamic.

Stabilirea structurii chimice a acidului folic a fost efectuată de E.L.Wittle,

B.L.O’Dell, J.E.Vandenbelt, J.J.Pfiffner, în 1945, confirmată în acelaşi an prin sinteza de

R.B.Angir şi colab., care menţionează că în componenţa acidului folic intră şi unii pigmenţi

pteridinici izolaţi anterior din aripile fluturilor precum şi acidul p-amino-benzoic.

În 1962, C.Herbert consumă mai multe luni o dietă deficitară în folaţi şi stabileşte

simptomele care apar în starea carenţială. Totodată stabileşte necesităţile de folaţi pentru

oamenii adulţi.

Ulterior au fost identificaţi, în 1973, de către W.S.Osborne-White şi R.M.Smith

numeroşi factori nutritivi înrudiţi (aproximativ 28) din ficatul de oaie şi şobolan, dintre care o

importanţă deosebită o prezintă acizii folinici în reacţiile de transformilare.

În 1991, G.Wald stabileşte efectul favorabil al acidului folic în tratarea unor afecţiuni

neuropsihice. În 1992, Butterworth raportează că dozele mari de acid folic ajunse în sânge

reduc riscul apariţiei cancerului cervical la femeile infectate cu “papilloma virusul” uman.

În 1993 Serviciul de Sănătate Publică din S.U.A. hotărăşte ca toate femeile să

consume zilnic 0,4 miligrame de folaţi pentru a reduce riscul apariţiei unor malformaţii şi

afecţiuni cancerigene.

Pagina 4 din 59


1.2. Grupul acizilor folici

Grupul generic al “acizilor folici” este constituit dintr-un complex de vitamine B, care

din punct de vedere chimic sunt corelate cu acidul pteroilglutamic, au acţiune hematopoetică

şi leucopoetică, dar se deosebesc între ele prin acţiunea specifică pe care o au asupra

diferitelor microorganisme şi specii de animale.

Aparţin acestui grup: acidul folic, acidul folinic, acidul tetrahidrofolic, acidul

dihidrofolic, vitamina Bc-conjugată, vitaminele M, U, R etc.

Acidul folinic se mai numeşte şi “citrovorum factor” deoarece este indispensabil

culturilor de Leuconostoc citrovorum. Vitamina M este un factor nutritiv care vindecă anemia

nutriţională la maimuţă, de unde îi derivă şi numele. Vitamina Bc-conjugată vindecă anemia

macrocitară a puilor de găină şi este esenţială pentru creşterea microorganismelor

Lactobacillus casei L. şi Streptococcus faecalis R.

Dintre alţi factori nutriţionali corelaţi cu grupa acidului folic menţionaţi de diferiţi

cercetători fac parte factorul U, factorul R, factorul S, vitaminele B10 si B11 etc., factori

necesari creşterii unor microorganisme sau vindecării unor forme diferite de anemie la

animale. Toţi aceşti factori se pot obţine prin extracte apoase din drojdii, frunze de spanac,

ficat etc., prin adsorbţie pe cărbune activ (norit) şi apoi eluate de pe adsorbant cu diferiţi

compuşi. Prin metode fizice şi chimice compuşii din complex pot fi separaţi, identificaţi şi

dozaţi. Acizii folici au un rol însemnat în formarea globulelor roşii şi albe din sânge, în

prevenirea şi tratarea anemiilor, sunt factori de creştere pentru numeroase organisme;

deasemenea au un rol fundamental şi în activarea şi transportul unităţilor C1 active (-CH3, -

CH2OH, -C=O, HCOO-, -CH=NH etc.), în biosinteza bazelor azotate, a acizilor nucleici şi a

proteinelor, în metabolismul unor aminoacizi etc.

1.3. Structura acidului folic

Acidul folic se numeşte astfel deoarece a fost izolat prima dată din frunzele plantelor

(folium-frunza). Se mai numeşte şi acid pteroilglutamic, denumire ce provine din structura sa

chimică. Este identic cu vitaminele Bc, B4, M, U, R, Lactobacillus factor, precum şi cu cea de

Norit eluat factor, pentru că la izolarea sa din produsele naturale se foloseşte adsorbţia pe

cărbune Norit (cărbune activ) şi eluare cu soluţii amoniacale.

Acidul folic are o structură complexă, având molecula compusă din trei fragmente:

Pagina 5 din 59


-un inel pteridinic pe care se găseşte grefată o grupare amino în pozitia 2 şi o grupare

hidroxil în pozitia 4 (2-amino-4-hidroxipteridina);

-un radical al acidului para-amino-benzoic (PABA);

-un rest peptidic rezultat din una sau mai multe (până la 7) molecule de acid glutamic.

Primele două componente constituie acidul pteroic. Prin adăugarea la acesta a celui

de-al treilea component (un rest de acid glutamic), se obţine acidul pteroil-mono-glutamic

(Pte-Glu), derivat la care ne referim atunci când folosim denumirea de acid folic.

Structura moleculara a acidului folic

Structura chimică a acidului folic s-a stabilit iniţial prin identificarea compuşilor ce

rezultă din degradarea sa hidrolitică, în mediul alcalin aerob. În aceste condiţii din acidul

folic s-a obţinut o fracţiune cu funcţie aminică aromatică primară, din care prin hidroliza

ulterioară se eliberează acidul paraaminobenzoic şi acidul glutamic.

A doua fracţiune avea structură pteridinică, era fluorescentă şi prezenta caracter acid.

Utilizarea difracţiei cu raze X a facilitat stabilirea structurii cristaline a moleculei de

acid folic dihidratat; acesta are o conformaţie extinsă cu nucleu pteridinic în poziţia ceto.

Oxigenul de la carbonul 4 şi atomul de azot 10 sunt de aceeaşi parte a moleculei, legându-se

de restul moleculei prin legături de hidrogen.

Pagina 6 din 59


aranjarea intramoleculara a nucleului pteridinic

1.4. Caracterizarea compuşilor din categoria folaţilor

Folaţii reprezintă o mare familie de molecule naturale formate prin modificări a

moleculei de acid folic, structura de bază a grupului.

Derivaţii naturali ai acidului folic diferă între ei prin:

-starea de oxidare a ciclului pteridinic;

-natura substituienţilor de la carbonul din pozitiile N5 si N10;

-numărul resturilor de acid glutamic din moleculă.

Pteridinele au fost identificate în pigmenţii aripilor fluturilor, pe baza fluorescenţei

intense în U.V. (Hopkins, 1889-1893) şi ulterior au fost izolate o serie de pteridine

(xantopterina, leucopterina, izoxantopterina). Ele sunt prezente şi la microorganisme şi la

animale şi au fost supuse unor ample cercetări care au dus la stabilirea structurii (H.Wieland,

1925), la sinteza şi la elucidarea rolului lor biologic, de exemplu: cofactori şi hidrolaze ca

precursori ai vitaminei B12; în biosinteza şi/sau ca elemente structurale a acizilor folici şi

folinici.

Pteridina are o structură biciclică fiind formată dintr-un nucleu pirimidinic (A) şi unul

piramizinic (B).

Pteridina contribuie la formarea pterinei (2-amino-4-hidroxi-6-metil-pteridina).

Pterina împreună cu acidul para-amino-benzoic formează acidul pteroic (Pte).

Prin ataşarea la acidul pteroic a unui rest de acid glutamic (Glu) se obţine acidul

pteroilmonoglutamic (Pte-Glu), respectiv acidul folic.

Prin adăugarea unor noi resturi de acid glutamic la acidul folic prin legături γ, se pot

obţine diopterina (Pte-Glu2), teropterina (Pte-Glu3), vitamina Bc conjugată (Pte-Glu7).

Pagina 7 din 59


Structura pteridinei si a pterinei

Pagina 8 din 59


Structura unor compusi pteroidici si folici

Pagina 9 din 59


Structura unor compusi pteroidici si folici

Pagina 10 din 59


Structura xantopterinei si a biopterinei

Acidul pteroic nu prezintă activitate de creştere asupra L.casei şi nici antianemică.

Acidul N10-formil-pteroic (Rhizopterina-izolat din Risopus nigrigans) are activitate

limitată de creştere asupra microorganismelor, dar, prezintă proprietăţi antianemice. A fost

obţinut din diferite produse biologice. Are substituit un radical formil la N10 al acidului folic.

Este de zece ori mai activ decât acidul folic asupra creşterii microorganismelor L.casei şi

Str.faecalis R.

Diopterina se găseşte sub formă de acid pteroil-L-glutamil-α-glutamic şi sub formă de

acid pteroil-γ-glutamil-glutamic. Primul acid este eficace în tratarea anemiei macrocitare la

om şi atenuează la canceroşi simptomele dureroase.

Teropterina sau acidul pteroilglutamic se mai numeşte şi factor de creştere. Este

utilizat în tratamentul tumorilor maligne.

Rizopterina este un factor de creştere pentru Streptococcus faecalis R (SLR), dar nu

are acţiune asupra Lactobacillus casei şi nici asupra anemiei puilor de găină. Este un derivat

al acidului pteroic. S-a obţinut prin sinteză din acid pteroic şi acid folic. S-a izolat din lichidul

de fermentare de la Rhizopus nigricans.

Vitamina Bc conjugată sau acidul pteroilhexaglutamic are 7 resturi de acid glutamic

substituite la acidul pteroic. Reprezintă forma predominantă sub care se găseşte acidul folic în

ţesuturi. Vitamina Bc conjugată nu are o acţiune directă asupra anemiei macrocitare la om şi

nici nu stimulează creşterea la L.casei şi Streptococcus lactis R. Prezintă acţiune curativă în

anemia puilor de găină. Sub acţiunea unei enzime hepatice numită vitamina-Bc – conjugaza,

vitamina Bc conjugată eliberează acidul pteroil glutamic activ.

Vitamina Bc conjugată este forma cea mai răspândită sub care se găseşte acidul folic

în alimentele naturale. Ea este eficientă în tratarea anemiei macrocitare şi la maimuţă. Enzima

vitamin – Bc conjugaza are acţiune carboxipeptidazică a fost iniţial izolată din ficat, iar

ulterior şi din rinichi de porc, pancreas (pui de găină), de la gâşte şi din materiale vegetale

Pagina 11 din 59


(cartofi, migdale). Microorganismele nu conţin această enzimă şi de aceea nu pot utiliza

vitamina Bc conjugată.

1.5. Derivaţii metabolic activi

Acidul folic este inactiv ca atare în cadrul metabolismului celular, formele metabolic

active fiind constituite din compuşii rezultaţi din:

Reducerea acidului folic în poziţiile 5, 6, 7, 8 rezultând acid dihidrofolic şi acid

tetrahidrofolic.

Carbonul asimetric din poziţia 6 conferă moleculei FH4 stereospecificitate pentru

diferite funcţii metabolice şi mai ales permite trecerea în formele dihidro, în schimb, se pare

că gruparea NH2 din poziţia 2 a nucleului pteridinic deţine rolul fundamental în coordonarea

moleculei de folat cu funcţie de coenzimă.

Reducerea acidului folic în acid tetrahidrofolic se realizează în două etape succesive;

întâi se obţine acidul dihidrofolic (FH2) şi apoi acidul tetrahidrofolic (FH4), sub acţiunea

enzimei dihidrofolatreductaza.

Pagina 12 din 59


Reducerea acidului folic sub actiunea dihidrofolatreductazei

Acidul dihidrofolic se poate prepara prin reducerea catalitică cu oxid de platină sau

paladiu în mediu alcalin sau prin reducerea cu hidrosulfit de sodiu la pH=6, în prezenţa

acidului ascorbic. Sunt posibili trei izomeri ai acidului dihidrofolic:

5, 6 H2 Pt. Glu. ;

7, 8 H2 Pt. Glu. ;

5, 8 H2 Pt. Glu. ;

dintre care numai acidul 7, 8 dihidrofolic (acid dihidrofolic “standard”) s-a izolat şi

este stabil.

Acidul dihidrofolic este uşor degradat prin expunerea la aer sau sub acţiunea bazelor.

Degradarea sa este favorizată de EDTA în timp ce acidul ascorbic şi tiolic îl protejează.

Pagina 13 din 59


Spectrul de absorbţie al acidului dihidrofolic la pH neutru prezintă două maxime la

lungimea de undă de 282 nm, precum şi la 310 nm. Spre deosebire de acidul folic care nu este

fluorescent, derivaţii săi în forma redusă posedă spectre de absorbţie carecteristice în UV.

Acidul tetrahidrofolic (FH4) este acidul folic redus în poziţiile 5, 6, 7, 8. Poate fi

stabilizat în mediul acid (de exemplu în acid ascorbic 0,2-0,5% sau cu compuşi ce conţin

grupări tiolice cum ar fi mercaptoetanolul în soluţie 0,2-1 M).

Oxidarea cu aer produce o amină diazotabilă (acid para aminobenzoilglutamic).

Spectrul de absorbţie al acidului tetrahidrofolic prezintă două maxime, la lungimea de undă

de 298 nm, iar în absenţa agenţilor reducători maximul de absorbţie variază între limitele

270-298 nm.

Spectrul de absorbţie al derivaţilor acidului folic la diferite pH-uri

Compusul Maximul de absorbţie la diferite pH-uri (în nm)

Acid Neutru Bazic

Folat 292 280 257

Dihidrofolat 282 282, 310 283

Tetrahidrofolat 272 270, 298 -

N5 – formil FH4 - - 282

N5, N10 – metenil FH4 348 x x

N10 – formimino FH4 xx 258 255

N5, N10 – metilen FH4 292 293 297

N5 – metil FH4 - 290 -

Valoarea nu este cunoscută;

x compusul se transformă în N10 – formil FH4 în soluţie neutră sau bazică;

xx compusul se transformă în N5, N10 – metenil FH4 în soluţie acidă.

B. Substituirea de grupări monocarbonate în poziţiile N5 sau N5, N10 sau N10. Mai

jos sunt reprezentate structurile celor mai importanţi derivaţi ai acidului folic, metabolic

activi: N5 – metil FH4: N5 formil – FH4; N5, N10 – metilen – FH4; N5, N10 – metilenil –

FH4.

Pagina 14 din 59


Structura generală a derivaţilor N5–substituiţi în care R poate fi:

-CH3 în N5 – metil – FH4;

-CHO în N5 – formil – FH4;

-CH = NH în N5 formimino – FH4 este prezentată mai jos

Structura generala a derivatilor acidului folic N5 - substituiti

Acidul N5N10 metilen tetrahidrofolic

Modificarea numărului reziduurilor de acid glutamic din moleculă.

Resturile de acid glutamic sunt condensate între ele într–un mod special (gruparea –

COOH din poziţia γ a unui rest se leagă de gruparea – NH2 a altui rest de acid glutamic. Mai

des întâlnite sunt formele în care n = 3 (acid pteroiltriglutamic) şi n = 5 (acid

pteroilpentaglutamic) în celule animale şi

n = 7 (acid pteroilheptaglutamic) la plante.

Structura pteroilpoliglutamatilor

1. 6. Proprietăţi fizice şi chimice ale acidului folic

1. 6. 1. Proprietăţi fizice

Pagina 15 din 59


Acidul folic este o substanţă solidă, cristalină de culoare galbenă, greu solubil în apă

(0.16mg/100ml), piridină, în fenol, în metanol, în acid acetic glacial şi insolubil în cloroform,

benzen, eter şi acetonă. Ca sare de sodiu este solubil în apă. Este optic activ dextrogir (+) 16˚,

iar în mediul acid la pH 4 – 12 este stabil, cu ionii metalelor grele formează compuşi

complecşi (cu Fe 3+ roşu, Cu2+ verde, Co2+ galben), iar în mediul bazic formează săruri cu

metalele alcalinopământoase. Acidul folic se descompune sub influenţa luminii şi a razelor

UV, rezultând acid pteridoxamin – 6 – carboxilic şi alţi compuşi proveniţi din catena laterală.

Spectrul său de absorbţie în ultraviolet este asemănător cu cel al xantopterinei. Acidul folic se

prezintă sub formă de plăcuţe galbene, lenticulare, subţiri, birefringente, cu punct de topire la

250˚C. Prin autoclavare 30min, pierde 70% din activitate la pH = 1. La 100˚C, sub acţiunea

acizilor se descompune în acid p – aminobenzoil – glutamic şi partea pteridinică modificată.

Solubilitatea acidului folic în apă poate fi măsurată prin încălzire la 75˚C sau prin adăugare

de glicocol. Soluţiile neutre sunt mai stabile, iar cele alcaline se oxidează cu uşurinţă. Este

incompatibil cu substanţe oxidante sau reducătoare deoarece se degradează. Cu Ca2+

formează o sare insolubilă, iar în soluţie alcoolică este incompatibilă cu clorhidraţi, FeSO4,

preparate acide, siropuri acide, gume şi mucilagii vegetale. Este inactivat de acidul ascorbic,

acidul nicotinic, vitaminele B1, B2, sulfamide, etc.

1. 6. 2. Proprietăţi chimice

Dintre proprietăţiile chimice ale acidului folic menţionăm posibilitatea reducerii

ciclului pteridinic în derivaţi di – şi tetrahidrofolici; ataşarea la o serie de enzime prin

intermediul grupării – NH2 din poziţia 2 (legături peptidice); transportul de unităţi

monocarbonate în poziţiile N5, N10; atomul de carbon din poziţia 6 conferă stereospecificitate

moleculei.

2.FOLAŢII ÎN NATURĂ ŞI ÎN ORGANISM

2.1. Răspândire în natură

Pagina 16 din 59


Acidul folic şi derivaţii săi au o largă răspândire în alimente. Se găsesc în cantitate

mare în ficatul animalelor, în frunzele plantelor superioare, în special în spanac, în mazăre,

germeni de grâu, drojdii, sfeclă, lămâi şi în unele microorganisme.

Conţinutul substanţelor pteroilglutamice din plantule de porumb este de 11,5μg/g, iar

în frunzele mature de 6-7 μg/g. În ierburi, conţinutul acidului folic variază între 3-7,5 μg/g.

Cele mai mari cantităţi de acid folic şi de folaţi se găsesc în regnul animal. În ficatul de bou

se găsesc 290 μg%, în ficatul de pui se găsesc 370 μg%, iar în cel de porc 220 μg%. Cerealele

conţin în medie 35 μg%, iar dintre fructe lămâile 80 μg%, bananele 30 μg%, portocalele 33

μg%. Legumele au un conţinut mai redus, fiind cuprins între 8 şi 25 μg%.

O bună parte din acidul folic este sintetizat de flora intestinală fapt ce îngreunează

stabilirea necesităţilor pentru om şi animale.

Acidul folic se găseşte în cantităţi variabile în toate alimentele uzuale. Ficatul şi

muşchii mamiferelor sunt sursele cele mai bogate, dar şi sursele vegetale constituie un aport

însemnat. Laptele de vacă conţine cantităţi mici de acid folic.

În timpul preparării alimentelor o parte din folaţi se distrug, dar în acelaşi timp se

eliberează cele aflate în complexe inactive sau sub formă conjugată. Cele mai multe forme de

folaţi nu au stabilitate mare în alimente. Frunzele proaspete pot pierde prin uscare la

temperatura camerii până la 70% din activitatea folaţilor în decurs de 3 zile. Cantităţi mari de

folaţi se pierd în timpul extragerii, la prepararea hranei în soluţii apoase şi prin fierbere.

Uneori pierderile totale se ridică până la 85 - 90%.

2. 2. Necesarul de folaţi al organismului uman

Cantitatea de acid folic total dintr-o dietă normală variază între 50 – 2000 mg zilnic.

Necesarul minim de acid folic este de 50 μg /zi, dar această valoare poate creşte în

anumite stări fiziologice (sarcină, pubertate) sau patologice (neoplazii, dermatoze cronice,

etc.)

Comisia F. A. O.- O. M. S. recomandă următoarele valori pentru aportul zilnic de acid

folic: 60 μg/zi pentru sugari, 100 μg/zi de la 1 –12 ani, 200 μg/zi între 13 – 19 ani şi peste

200 μg/zi pentru adult.

Folaţii existenţi în natură sunt conjugaţi cu mai multe molecule de acid glutamic,

acidul pteroilmonoglutamic negăsindu-se ca atare în vreo sursă naturală; lanţul acid

poliglutamic fiind încărcat cu o sarcină electrică negativă, împiedică absorbţia vitaminei ca

Pagina 17 din 59


atare. Pentru a fi absorbiţi, poliglutamaţii alimentari trebuie să fie hidrolizaţi la

monoglutamaţi. Această hidroliză are loc la nivelul jejunului proximal, sub acţiunea unei

conjugaze (cel mai probabil intraenterocitară) pH-dependentă şi zinc-dependentă. După aceea

monoglutamaţii rezultaţi vor fi absorbiţi printr-un mecanism activ facilitat de glucoză.

Această absorbţie poate fi însă pasivă pentru doze crescute de folaţi. În cursul

transportului lor intraenterocitar monoglutamaţii sunt metilaţi şi apoi reduşi la dihidro- şi

tetrahidrofolaţi sub acţiunea dihidrofolatreductazei.

La individul normal, aproximativ 80% din acidul folic administrat oral este absorbit,

indiferent de doza administrată. La o doză mai mică de 200μg

/zi, excreţia urinară este minoră sau absentă. În schimb, la doze mai mari, aceasta

poate deveni considerabilă, şi anume: 6% pentru 1mg/zi; 10% pentru 2mg/zi; 50% pentru

50mg/zi, până la 80% pentru 15mg/zi.

Sângele conţine aproximativ 1mg% folaţi, cea mai mare parte (90%) aflându-se în

eritrocite, la nivelul cărora predomină pteroilglutamotetrahidrofolaţii.

Există proteine ce leagă folaţii în plasmă, dar rolul lor este încă neclar.

Folaţii plasmatici se află sub formă de monoglutamat (N5-metil-tetrahidrofolat) şi

sunt transportaţi în celule printr-un “carrier” care este specific pentru formele reduse (FH4).

Odată ajuns în celulă, folatul trece în forma poliglutamată după pierderea grupării N5-CH3

într-o reacţie de transfer a grupării metil. Forma poliglutamată pare a fi forma în care celulele

reţin şi depozitează folaţii.

În organism folaţii sunt depozitaţi în toate ţesuturile, dar cu precădere la nivelul

rinichilor, pancreasului şi mai ales ficatului. Rezervele normale de folaţi sunt estimate între 5-

20mg, din care jumătate în ficat; ţinând seama de necesarul zilnic minim de folaţi (50μg),

reiese faptul că rezervele organismului permit menţinerea unei hematopoeze normale timp de

2-4 luni. Totuşi, în caz de creştere importantă a necesităţilor (stări septice, traumatisme

grave), timpul scurs până la apariţia manifestărilor hematologice şi mai ales a trombopeniei,

poate fi mai scurt (15 zile sau mai puţin).

Pierderea folaţilor se produce prin descuamarea zilnică a celulelor epiteliale din piele

şi tractul intestinal, ca şi prin bilă, urină, transpiraţie şi salivă. Rata pierderii este de doar 1-

2% din totalul rezervelor hepatice, dar valoarea ei este de 10 ori mai mare decât a vitaminei

B12 deoarece cantitatea minimă de folaţi necesară a fi absorbită zilnic este de 100 de ori mai

mare decât cea a vitaminei B12, iar turn-over-ul folaţilor este mult mai mare, simptomele

deficienţei de folaţi se dezvoltă mult mai rapid decât cele ale vitaminei B12. Deficitul va fi

Pagina 18 din 59


totuşi aparent doar după câteva luni de la apariţia tulburării primare de aport, absorbţie sau

utilizare.

2.3.Manifestările clinice ale deficitului de folaţi în organism

Manifestările clinice ale deficitului de folaţi implică celulele din ţesuturile cu rată de

multiplicare rapidă, şi mai ales sângele şi mucoasa intestinală. Manifestările neurologice ce

apar în cadrul deficitului de vitamina B12 (deosebit de grave prin potenţialul lor de

ireversibilitate) sunt mai puţin frecvente.

Manifestările hematologice constau în primul rând în anemie megaloblastică, datorată

unei eritropoeze ineficiente.

Sinteza de ADN anormal (prin încorporarea de d-UTP în locul d-TTP) duce la

hematopoeză de tip megaloblastic, asincronism de maturaţie nucleo-citoplasmatic (nucleii

sunt mai puţin maturi decât era de aşteptat, cromatina nucleară este dispersată). În măduva

osoasă apar mitoze anormale, hipercelularitate, metamielocite gigante şi scăderea raportului

mieloido/eritrocitar. Precursorii anormali sunt distruşi prematur în măduva osoasă, rezultând

anemie prin eritropoeză ineficientă, bilirubină indirectă crescută şi hemosiderină normală sau

crescută.

În sângele periferic se identifică hematii macrocitare (VEM > de 100μ3),

hemoglobină scăzută sau chiar normală faţă de numărul de eritrocite scăzut (datorită VEM

crescut, acesta fiind şi motivul pentru care valori mici ale hemoglobinei sunt bine suportate

de către aceşti pacienţi); frotiul sanguin arată o marcată anizocitoză, poikilocitoză şi

macrocitoză.

În ceea ce priveşte celelalte serii celulare sanguine, modificările sunt mai rare, dar şi

mai precoce: numărul leucocitelor şi al plachetelor poate fi scăzut, iar apariţia PMN

hipersegmentate (mai mult de 6 lobuli) în periferie este cvasipatognomonică pentru anemie

megaloblastică.

Pe frotiul de măduvă osoasă se observă, deasemenea, precursori anormali ca mărime

şi morfologie şi pentru seria granulocitară, iar clinic se poate constata un sindrom

hemoragipar sau o scădere a imunităţii celulare.

Valorile plasmatice ale folaţilor sunt scăzute (normal 6-20ng/ml), dar aceste valori pot

reflecta variaţii recente în aportul dietetic. Măsurarea folaţilor eritrocitari este în acest sens o

măsurătoare cu grad crescut de precizie, nefiind supusă acestor fluctuaţii. Frecvent deficitul

de folaţi este asociat cu deficitul de B12 (evidenţiat prin testul Schilling).

Pagina 19 din 59


Clinic, anemia se manifestă prin slăbiciune, ameţeli, palpitaţii, angor, insuficienţă

cardiacă, tahicardie. Culoarea tegumentelor este palidă, cu nuanţă subicterică, rareori apare

purpura (datorită trombocitopeniei), iar uneori splina şi ficatul pot fi uşor mărite.

A doua mare categorie de simptome sunt cele digestive, reflectând afectarea

proliferării epiteliului intestinal (ce are un turn-over rapid) în cadrul deficitului de folaţi.

Pacienţii prezintă o limbă zmeurie (roşie, lucioasă, depapilată, dureroasă), anorexie (cu

uşoară scădere în greutate), diaree, steatoree, etc.

Manifestările neurologice şi psihice includ cel mai frecvent un tablou de polinevrită

senzitivo-motorie (mai rar sindrom piramidal), se mai poate observa un sindrom depresiv,

anxietate, demenţă sau psihoză.

Diagnosticul impune cercetarea frotiului periferic (PMN hipersegmentate, anemie

macrocitară normocromă aregenerativă), a frotiului de măduvă osoasă (hematopoeză

megaloblastică), a nivelului de folaţi plasmatic (mai puţin concludent) sau eritrocitar (se mai

pot folosi testul de supresie prin deoxiuridină, excreţia urinară de formiminoglutamat în

exces) şi excluderea unui deficit de B12 (test Schilling normal).

Diagnosticul etiologic presupune o anamneză amănunţită cu privire la dietă şi

explorarea funcţiei intestinului subţire.

2.4. Tratamentul deficitului de folaţi

Tratamentul deficitului de folaţi este un tratament de substituţie, pe toată durata vieţii

(sau până la excluderea cauzei primare).

Folaţii sunt utilizaţi în scop terapeutic sub formă de:

acid pteroilglutamic (acid folic) administrat oral (1cp = 5mg)

acid N5-formil-tetrahidrofolic (acid folinic) sub formă de soluţie pentru injectare

parenterală, dar la fel de eficace şi pe cale orală.

O doză de 50-100μg/zi permite obţinerea unui răspuns hematologic, dar doze mai

importante, de ordinul a 1mg/zi timp de 2-3 săptămâni sunt necesare pentru a corecta

rezervele organismului. Această doză, administrată pe cale orală, este suficientă chiar şi în

caz de malabsorbţie.

3. METABOLISMUL FOLAŢILOR

Pagina 20 din 59


3.1. Extragere, sinteza şi biosinteza folaţilor

Acidul folic se poate obţine în stare cristalină din diferite surse naturale (ficat, spanac,

drojdii, cojile cerealelor,etc) prin extracţie cu apă la pH 3, adsorbţie pe cărbune activ (norit),

eluţie cu soluţie amoniacală 2,8%, purificat prin readsorbţie pe cărbune, eluare cu anilină şi

precipitare cu acetat de plumb, AgNO3, acid picric, baritină, etc. În prezent se realizează

iniţial inactivarea enzimelor, care distrug cofactorii naturali prin încălzirea rapidă a

materialului la 95˚C, în prezenţă de tampon ascorbat sau amestec cu uree 6M si cloroform.

Cromatografierea extractului se face pe coloane cu schimbători de ioni şi separare prin eluare

în gradient de concentraţie cu soluţii amoniacale sau de anilină.

Prin sinteză acidul folic se obţine prin condensarea acidului p-aminobenzoil-L (-)-

glutamic, cu aldehida 2,3-dibrompropionică şi cu compusul 2,4,5-triamino-6-

hidroxipiridinclorhidrat în prezenţă de NaOH, O2 şi acetal.

Schema sintezei acidului folic

În produsele naturale acidul folic se găseşte în stare liberă în cantitate relativ redusă,

deoarece se găseşte în cantitate mai mare sub formă de compuşi chimici diferiţi, unii cu mai

multe resturi de acid glutamic, care au însă aceeaşi importanţă nutritivă pentru organismele

vii.

Prin experienţe “in vitro” s-a observat că prin adăugarea de acid folic pe secţiunile

hepatice din mediul de reacţie, în prezenţa acidului ascorbic, se obţine acidul folinic, care este

un derivat formilat al acidului formic. Acidul folinic obţinut prin sinteză este de două ori mai

puţin activ decât cel natural, deoarece prin sinteză se obţin 2 stereoizomeri din care numai

unul este activ.

Pagina 21 din 59


Acidul folinic (N-5-COH-FH4) se obţine “in vitro” prin formilarea şi hidrogenarea sa

la temperatură ridicată, în prezenţa acidului ascorbic, iar “in vivo” sub acţiunea

piridinnucleotidreductazei şi a vitaminei C, se formează iniţial acidul dihidrofolic (FH2), care

prin hidrogenare trece în acidul folinic.

Mecanismul biosintezei acidului folic la om nu este destul de bine cunoscut. Până în

prezent s-au efectuat cercetări în acest domeniu pe microorganisme şi pe animale, cu ajutorul

unor inhibitori. Acidul folinic este sintetizat de majoritatea bacteriilor intestinale. Biosinteza

acidului folic este stimulată de acidul ascorbic.

Experimental s-a dovedit că unele microorganisme sunt capabile să biosintetizeze

acidul folic din precursori mai simpli, prin reacţii de condensare, sub acţiunea unor enzime.

Astfel, extractele celulare de E. coli, realizează biosinteza acidului folic din acid glutamic,

acid p-aminobenzoic şi 2-amino-4-hidroxipteridin-6-carboxialdehida, iar extractele de

Lactobacillus arabinosus sunt capabile să utilizeze ca şi compuşi pteridinici 2-amino-4-

hidroxi-6 hidroximetilpteridina şi 2-amino-4-hidroxi-6-carboxildehidropteridina în prezenţa

ATP şi a ionilor de Mg2+. Biosinteza acidului folic se realizează mai repede dacă compusii

pteridinici conţin acidul pirofosforic la C-9.

În experienţele efectuate cu Mycobacterium avium s-a observat că în prezenţa

ATP, HS-CoA şi acidului p-aminobenzoic se formează un derivat adenilic monofosforic al

acidului p-aminobenzoic, care reacţionează cu acidul glutamic şi formează compusul p-

aminobenzoilglutamic. Prin unirea acestui produs cu pterina se formează acidul folic.

Schema biosintezei acidului folic la Mycobacterium avium

Pagina 22 din 59


Extractele de Clostridium striklandii au transformat acidul folic în acid dihidrofolic,

iar din ficatul puilor de găină s-a izolat un sistem enzimatic capabil să transforme acidul

dihidrofolic în acid tetrahidrofolic.

Transformarea acidului folic in acizii dihidrofolic si tetrahidrofolic

Transformarea acidului folic în acid folinic s-a pus in evidenţă atât la animale, cât şi la

microorganisme în prezenţa ATP, FAD, Mg2+, acid ascorbic şi a unor enzime specifice. În

ficatul puilor de găină s-a identificat o enzimă care în prezenţa ATP si Mg2+ realizează

transformarea acidului N-5-tetrahidrofolic în acid N-10-tetrahidrofolic.

3.2. Absorbţie, excreţie şi necesităţi

Acidul folic în stare liberă, ca acid pteroilmonoglutamic este uşor şi rapid absorbit de

organism în cantităţi de până la 15-20mg/zi. Absorbţia are loc mai ales incepând din partea

proximală a intestinului subţire şi continuă, pe toată lungimea sa, cu un consum de energie,

cu implicarea unor procese active (energodependente) pentru cantităţi fiziologice mici.

Dozele mari sunt absorbite mai ales prin difuzie pasivă. În multe produse alimentare acidul

folic se prezintă predominant sub forme poliglutamate. Din aceşti derivaţi acidul folic este

absorbit numai după o deconjugare prealabilă a acestor compuşi. În tubul digestiv şi în

rinichi, s-a pus în evidenţă existenţa unor sisteme enzimatice hidrolizante (conjugaze) care

scindează complexele acidului folic. Absorbţia acidului folic poate fi perturbată şi micşorată

Pagina 23 din 59


de diferiţi compuşi cum sunt: difenilhidrantoina, pirimidine, cicloserine, etanol, glicocol,

serina, homocisteina şi metionina.

Se consideră că acidul folic, precum şi derivaţii acestora, sunt convertiţi în mucoasa

intestinală sub acţiunea unor acidfolicreductaze în derivaţi metilici (CH3-FH4), forme sub

care trec în sângele venei porte şi apoi la ficat.

Din totalul de aproximativ 70mg acizi folici şi folinici existenţi la oamenii adulţi,

aproximativ 30-40% se găsesc în ficat (5-15μg/g), de unde prin circulaţia sanguină se

aprovizionează toate organele şi ţesuturile. Imediat după absorbţie şi parţial chiar în timpul

absorbţiei, acidul folic este convertit în diferiţi compuşi metabolici activi cum sunt:

acid N-5-formil-tetrahidrofolic (f5FH4);

acid N-10-formil-tetrahidrofolic (f10FH4);

acid N-5-formimino-tetrahidrofolic (fiFH4);

acid N-5, 10-metenil-tetrahidrofolic (f5-10FH4);

acid N-5-metil-tetrahidrofolic (m5FH4).

În toţi aceşti derivaţi apare ca structură de bază acidul tetrahidrofolic (FH4), care joacă

rolul unei coenzime de acceptor si transportor al unei unităţi C1.

Acidul folic este transportat în organism sub formă de CH3-FH3 legat de proteine

transportoare, având în sânge o concentraţie de 300ng/ml. Folaţii se găsesc în cantitate mai

mare în eritrocite, cu variaţii normale între 160-640ng/ml de eritrocite. Conţinutul folaţilor

din eritrocite, se menţine relativ constant şi reflectă gradul de aprovizionare a întregului

organism cu aceşti compuşi. Cantitatea de folaţi din sânge scade în bolile de cancer

(leucemii), carenţa folinică şi anemie pernicioasă, în ciroza alcoolică, anemii gravidice, etc.

Plasma sanguină conţine 5-20ng/l, iar eritrocitele conţin cantităţi de 30 de ori mai mari de

folaţi.

În sânge şi ţesuturi, acizii folici suferă procese de interconversiune şi de catabolizare.

Acidul folic se transformă mai ales în derivaţi tetrahidrofolici. În eritrocite acidul folic prin

metabolizare dă naştere la acid p-aminobenzoilglutamic şi la un derivat aldehidic al pterinei.

În ficat, acidul folinic se degradează în compuşi similari, reacţia fiind activată de acidul

glutamic şi inhibată de acidul ascorbic. Tot la nivelul ficatului se transformă acidul folic în

acid N-10-formil-folinic.

Eliminarea folaţilor şi a metaboliţilor acestora se face în cantitate mai mare prin

fecale, aproximativ 200-500μg/zi la omul adult, cuprinzând aproximativ 20% din cantitatea

ingerată şi partea neabsorbită produsă de flora intestinală.

Pagina 24 din 59


Excreţia prin urină este mică, aproximativ 2-5 μg/zi, dar creşte prin administrarea de

doze orale, după saturarea organismului cu folaţi. Eliminarea folaţilor prin urină reprezintă

sub 1% din cantitatea acestora în organism.

Dacă se administrează intravenos doze mici de acid folic (1μg/kg corp), aproximativ

90% din cantitatea administrată este distribuită din fluxul sanguin în tot corpul în decurs de 3

minute, iar aproximativ 2% se elimină prin urină. Dacă însă se măresc dozele până la

150μg/kg corp, până la 90% din cantitatea administrată se elimină prin urină, în decurs de 6-

12 ore, sub formă de acid folic sau derivaţi apropiaţi sub aspect structural.

La o dietă normală, corespunzătoare la o ingestie de 600 μg de acid folic pe zi,

cantitatea acestui acid din organism se apreciază a fi între 6-10mg, cantitate suficientă pentru

trei sau patru luni, dacă este blocată absorbţia. O altă cale de eliminare a acidului folic este

cea cutanată. Prin transpiraţie se elimină cantităţi destul de însemnate de folaţi, precum şi prin

bilă.

3.3. Rol şi activitate biochimică

Acizii folici, sub formă de acizi tetrahidrofolici, reprezintă coenzimele unor sisteme

enzimatice, implicate în activarea şi transportul unor fragmente monocarbonice (C1) sub

formă de hidroximetil (-CH2OH), formil (-COH), formiat (HOOC-), metil (-CH3),

formimino (CH=NH), care iau parte la reacţii deosebit de importante pentru organism.

Formele coenzimatice active, care poartă fragmente sau radicali cu un atom de

carbon, sunt derivaţi ai acidului tetrahidrofolic (FH4) din care fac parte:

acid N-5-formil-tetrahidrofolic (N-5-COH-FH4);

acid N-10-formil-tetrahidrofolic (N-10-FH4);

acid N-5, 10-metenil-tetrahidrofolic (N-5,N-10=CH-FH4);

acid N-5, 10-metenil-tetrahidrofolic (N-5,N-10-CH2-FH4);

acid N-5-metil-tetrahidrofolic (N-5-CH3-FH4).

Pagina 25 din 59


Derivati coenzimatici ai acidului tetrahidrofolic

Derivaţii coenzimatici ai acidului tetrahidrofolic se pot obţine pe două căi principale:

-tratarea directă a aldehidei formice sau a acidului formic cu acid tetrahidrofolic

(FH4);

-transferul direct al acestor unităţi pe FH4. Ca substanţe donatoare de unităţi C1, cele

mai active sunt serina, histidina, xantina, metionina, colina, betaine, nicotina, timina, acidul

glutamic etc. Ca acceptori de grupări C1 funcţionează glicocolul, colamina, nornicotina,

uracilul, homocisteina, gliconamidoribozida, acidul folic etc.

Pagina 26 din 59


Existenţa acidului N-5-formil-tetrahidrofolic, care este inert, sub aspect

coenzimatic nu constituie un balast pentru organism deoarece poate fi uşor transformat pe

cale enzimatică în acid N-10-metenil-tetrahidrofolic, iar acesta cu apa dă acidul N-10-formil-

terahidrofolic care este cel mai activ metabolit.

Acidul N-10-formil-tetrahidrofolic se poate forma şi prin reacţia directă dintre

aldehida formică şi FH4:

Reacţia este catalizată de formiltetrafolatsintetaza, care a fost izolată din ficatul de

porumbel şi din diferite microorganisme. Fragmentele monocarbonice sunt, sub aspect

metabolic, interconvertibile, deoarece pot trece reciproc una în alta, sub acţiunea unor sisteme

enzimatice de tipul hidroximetildehidrogenazei în prezenţă de NADP+şi NAD+.

Transportul fragmentelor C1 de la o substanţă la alta se realizează de acidul

tetrahidrofolic şi derivaţii săi menţionaţi anterior.

Dintre reacţiile chimice la care iau parte coenzimele tetrahidrofolice, face

parte şi transformarea serinei în glicocol în prezenţa piridoxalfosfatului (PALP):

Din histidină, se obţine ca produs intermediar acidul formiminoglutamic care

transferă radicalul formimino pe FH4 cu formare de acid N-5-formimino-tetrahidrofolic.

Pagina 27 din 59


Acidul N-5-formimino-tetrahidrofolic (N-5-fi-FH4), sub acţiunea unei

ciclodezaminaze, formează acidul N-5,N-10-metilenil-tetrahidrofolic (N-5,N-10=CH-FH4).

Acelaşi mecanism de reacţie se produce şi la transformarea xantinei în formiminoglicocol.

Glicocolul, printr-o reacţie de transaminare, formează acid glicoxalic, care cedează

gruparea formil acidului glutamic, în prezenţă de NAD+ cu formare de acid N-formil-

glutamic.

Acidul formilglutamic cedează radicalul formil acidului FH4 şi se formează acidul

folinic, care este mai puţin activ. Acesta în prezenţa ATP se transformă în acidul N-10-

formil-tetrahidrofolic.

Pagina 28 din 59


Coenzimele folinice, care au fixate unităţi C1, se comportă ca donori în reacţiile care

necesită acceptarea fragmentelor –CH2OH, -CHO, -CH=NH, HCOO-, -CH3. În funcţie de

felul compuşilor care se sintetizează în urma transferului de unităţi C1, participă la reacţie

una sau alta din formele active.

În reacţiile cu cedare de radicali formil vor funcţiona ca donori acizii N-10-formil-

FH4 şi N-5, N-10=CH-FH4. Ca donori de grupări –CH2-OH este mai activ acidul N-5, N-10-

CH2-FH4, iar ca donori de radicali CH3 funcţionează acidul N-5-CH2-FH4 şi uneori acidul

N-5,N-10-CH2-FH4.

Acceptorii de grupări C1 active sunt mai numeroşi în procesul de biosinteză a bazelor

şi a nucleotidelor purinice, în biosinteza colinei, betainei, nicotinei, etc. În procesul de

biosinteză a bazelor purinice sunt cedate două grupări formil, localizate la C-2 si C-8 al

nucleului purinic. Dintre compuşii intermediari care se formează în procesul de biosinteză a

bazelor purinice, în urma primirii unor unitaţi C1 active fac parte :

-formilglicinamidoribozida(FGAR)

-formilaminoimidazolcarboxiamidribozida(FAICAR)

Datorită participării coenzimelor folinice în biosinteza nucleotidelor purinice, ce iau

parte la formarea acizilor nucleici, rezultă rolul important pe care îl au acizii folici în

procesele de creştere şi reproducere celulară.

Acidul N-5,N-10-metilen-FH4 are un rol însemnat în biosinteza ADN, deoarece se

comportă ca o coenzimă în reacţia de transformare a uracilului în nucleozide şi nucleotide în

timină. Ea donează un radical metil la 2’-deoxiuridin-nucleotide (sau nucleozide) şi acestea

se transformă în 2’-deoxitimidin-nucleotide, respectiv nucleozide. Transformarea uracilului

în timină se face în molecula nucleotidelor (nucleozidelor), care reprezintă cărămizile de bază

în biosinteza acidului deoxiribonucleic.

În cazul biosintezei metioninei se realizează transferul grupării metil de la N-

5-CH3-FH4 la homocisteină.

Pagina 29 din 59


În procesul de biosinteză a metioninei se produce neogeneza grupei metil şi nu

transferul acesteia de la alţi donori. Metionina are rol însemnat în formarea

colinfosfolipidelor deoarece grupele metil din colină provin din metionina activată (S-

adenozilmetionina).

Dintre reacţiile la care participă N-10-formil-FH4 si N-10-CH2OH-FH4,e importantă

trasformarea betainei în serină.

Ultima reacţie este reversibilă fapt important deoarece serina se poate transforma în

glicocol, constituind o importantă sursă de fragmente –CH2OH.

Există date experimentale care dovedesc că timina poate substitui acidul folic în

stimularea creşterii unor microorganisme (Str. faecalis), iar efectul optim al acidului folic

asupra acestor microorganisme se obţine când se administrează împreună cu vitamina B12.

Datorită acestor corelaţii se consideră că acidul folic funcţionează direct sau indirect ca o

coenzimă în biosinteza timinei. Unele microorganisme transformă uşor uracilul în timină sau

citozină, dar pentru biosinteza timinei au nevoie de acid folic. În prezenţa formiatului marcat

cu 14C, acesta se regăseşte în atomul de carbon al grupării metil din timină.

Pagina 30 din 59


Acidul N-5-formil-tetrahidrofolic, pe lângă transformarea glicocolului în serină, şi a

homocisteinei în timină, contribuie activ la transformarea uracilului în timină şi a metioninei

în creatină precum şi la biosinteza inelelor porfirinice. Prin administrarea de formiat marcat

cu 14C se regăseşte în hem, numai la animalele tratate cu acid folic, nu şi la cele aflate în

carenţă de folaţi.

Acidul folic stimulează activitatea colinesterazei, a cărei diminuare ar duce la o

creştere a acetilcolinei, cu influenţă negativă asupra hematopoezei, dar inhibă activitatea

tirozinazei şi a xantinoxidazei. Acidul tetrahidrofolic stimulează biosinteza nucleelor

porfirinice şi a nucleoproteidelor. La maimuţe cu deficienţe de acid folic, conţinutul

nucleoproteidelor scade în mod accentuat, iar situaţia se redresează prin administrare de acid

folic.

Acidul folic este un factor important pentru creşterea animalelor tinere şi pentru

microorganisme. Este utilizat tot mai mult în lupta împotriva cancerului. Asigură

funcţionarea optimă a sistemului nervos. A manifestat efecte antiteratogene la animalele

tratate cu pirimetamină.

4. PERTURBAREA METABOLISMULUI FOLAŢILOR LA OM

4.1. Cauze ce duc la scăderea acidului folic în organism

Cauzele ce duc la scăderea acidului folic în organism sunt multiple, implicând aportul

de acid folic, necesităţile metabolice crescute (sarcină, anemie cronică hemolitică, neoplasm),

malabsorbţia (sprue, medicamente-fenitoina, barbiturice, etanol) sau interferarea căilor

metabolice (inhibitori DHFR-Metotrexat, etanolul) şi altele.

Deficitul de aport dietetic de acid folic este mai frecvent întâlnit decât deficitul de

vitamină B12. Dintre categoriile mai frecvent afectate fac parte bătrânii cu aport alimentar

nediversificat (conserve, regimul “tea and toast”) şi ocazional adolescenţii- alcoolicii şi

toxicomanii. În cazul alcoolicilor sursa lor principală o constituie băuturile alcoolice, acestea

având conţinut de acid folic scăzut (berea, vinul) sau practic nul (băuturile distilate). În

alcoolismul cronic se cumulează aportul scăzut cu scăderea utilizării acidului folic.

Necesităţile metabolice crescute de folaţi apar atât în condiţii fiziologice (sarcină,

perioadele de creştere în copilărie şi adolescenţă) precum şi în condiţiile patologice de

Pagina 31 din 59


creştere a ratei de multiplicare a ţesuturilor cu turn-over crescut (mucoasa intestinală, măduva

osoasă).

Astfel, în timpul sarcinii necesarul zilnic de acid folic este crescut de câteva ori faţă

de normal, iar deficitul de acid folic este de 3 ori mai frecvent la multipare faţă de primipare.

Pentru un organism sănătos şi o dietă raţională, echilibrată, necesităţile suplimentare nu

constituie un impediment. Anemia ce apare in timpul sarcinii este rezultatul unui consum

crescut de acid folic pe fondul unor factori favorizanţi ca: alimentaţie deficitară, ignoranţa,

etc. Important de reţinut este că anemia poate fi anterioară sarcinii şi o agravează prin

necesităţile crescute; existând cazuri în care anemia din perioada iniţială a sarcinii se

datorează unor deficienţe alimentare sau menometroragiilor.

Cauza principală a deficienţei de folaţi în sarcină este reprezentată de creşterea

sintezei de ARN, ADN asociată cu dezvoltarea fătului, placentei şi uterului, precum şi cu

expansiunea masei eritrocitare a mamei. Pot interveni şi alţi factori precum: anorexia,

reducerea absorbţiei de folaţi şi creşterea necesarului favorizată de infecţiile urinare

frecvente. Gemelaritatea accentuează nevoile de acid folic, determinând creşterea de

aproximativ 5 ori a posibilităţii de apariţie a deficienţei de acid folic în ultimul trimestru al

sarcinii.

Lipsa acidului folic, necesar pentru sinteza ADN, determină tulburări de maturaţie şi

multiplicare celulară, cu repercursiuni asupra produsului de concepţie, mergând de la

malformaţii ale tubului neural, pâna la avort. Rolul acidului folic în etiologia defectului de

tub neural precum şi metodele de profilaxie ale acestor malformaţii prin suplimentarea dietei

femeii gravide sunt foarte importante.

În condiţii patologice, necesităţile de acid folic cresc cel mai frecvent datorită unei

eritropoeze foarte active (de ex. anemia hemolitică cronică). Malabsorbţia poate duce la un

deficit de acid folic în condiţiile unui aport de folaţi normal; ea are drept cauză afecţiuni ale

intestinului (sprue tropical, enteropatia glutenică etc.), alcoolismul cronic sau medicamente

ce acţionează probabil pe această cale (fenitoina, barbiturice).

Interferarea căilor metabolice ale acidului folic se datorează alcoolului, unor rare

deficite enzimatice (DHFR) sau cel mai frecvent inhibitorilor DHFR (Metrotrexat). În

celulele în care aceşti inhibitori de DHFR se acumulează este împiedicată transformarea

deoxiuridinmonofosfat (dUMP) în deoxitimidinmonofosfat (dTMP) şi drept consecinţă are

loc fosforilarea dUMP ce va fi inserat în lanţurile de ADN într-o proporţie ce va depăsi

cantitativ capacitatea sistemelor ce recunosc, excizează şi repară eroarea, rezultând astfel

false lanţuri de ADN ce explică eritropoeza megaloblastică.

Pagina 32 din 59


I aport inadecvat dieta neechilibrată(alcoolici, adolescenţi, copii în

creştere)

II necesităţi crescute 1.sarcina

2.copilărie

3.neoplasm

4.eritropoeză crescută(anemie hemolitică cronică)

5.boli cronice exfoliative ale pielii

6.hemodializă

III malabsorbtia 1.sprue tropical

2.enteropatie glutenică

3.medicamente:fenitoina, barbiturice

IV interferarea căilor

metabolice

1.inhibitori DHFR(Metotrexat)

2.etanol

3.rare deficite enzimatice (DHFR)

Cauzele deficitului de folati

4.2. Folaţii şi sarcina; profilaxia malformaţiilor fetale prin administrarea acidului folic

Datorită rolului fundamental al folaţilor în replicarea celulară, s-a stabilit pentru prima

oară în 1964, de către Hibbard că deficitul de folaţi, cunoscut deja ca fiind răspunzător de

hematopoeza anormală, ar putea induce modificări şi asupra produsului de concepţie şi a

placentei, putând (mai ales dacă apare la începutul gestaţiei) da avorturi spontane sau

malformaţii. În ultimul timp, interesul cercetătorilor a fost focalizat mai ales spre relaţia

deficit de acid folic –malformaţii ale tubului neural (prima asociere în acest sens a fost facută

de Hibbard, 1965, când 66% dintre mamele cu produs de concepţie afectat au avut

concentraţii crescute de acid forminoglutamic în urină). Un studiu prospectiv privind nivelul

folaţilor eritrocitari la gravide în primul trimestru de sarcină a arătat o incidenţă semnificativ

crescută a malformaţiilor la gravidele cu nivel al folaţilor eritrocitari redus (<130μg/ml).

Problema efectului protector al administrării preventive a acidului folic a fost obiectul

unui amplu program de cercetare administrat în Marea Britanie în 1983 şi finalizat în 1991

(MRC Vitamin Study Group 1991); astfel, una din patru femei având în antecedente o sarcină

Pagina 33 din 59


afectată din această cauză a primit 4 mg acid folic timp de minimum 12 săptămâni înaintea

concepţiei şi în timpul primelor 3 luni de sarcină. Riscul apariţiei malformaţiilor de tub neural

la produsul de concepţie a fost semnificativ mai mic la gravidele ce au primit acid folic faţă

de lotul martor.

Confirmarea efectului protector al suplimentării folaţilor în profilaxia recurenţei

malformaţiilor de tub neural susţine utilitatea administrării de folaţi la femeile ce aparţin unei

grupe de risc (din punct de vedere al apariţiei malformaţiilor neurale fetale) şi pune problema

extinderii administării profilactice a folaţilor la toate femeile gravide.

Un mare număr de femei gravide au un aport dietetic de folaţi sub valorile

recomandate (300μg de folaţi/zi), dar numai o mică parte din acestea vor avea un produs de

concepţie normal; oricum până în prezent este imposibilă determinarea certă a apartenenţei

gravidei la o grupă de risc crescut din acest punct de vedere, făcând foarte greu o profilaxie

ţintită.

Cele trei mari direcţii ale strategiei privind profilaxia deficitului de folaţi şi a

consecinţelor acestuia, sunt: educaţia generală privind dieta (cu o atenţie specială privind

grupurile cu cerinţe crescute: utilizatorii de medicamente citotoxice, sindroame de

malabsorbţie, tulburări metabolice), suplimentare a alimentelor cu acid folic şi administrarea

suplimentară de acid folic la toate femeile ce vor deveni gravide în scurt timp.

Din punct de vedere al avizului privind dieta, se recomandă consumul crescut de

legume proaspete, spanac, fulgi de porumb, lapte (de exemplu o supă de spanac conţine

aproximativ 125 μg, o porţie de fulgi de porumb cu un pahar de lapte 80 μg). Astfel, se

combate ipoteza că deficitul de acid folic s-ar datora exclusiv unui statut socio-economic

scăzut, accentul fiind pus pe alimentele populare şi nici foarte scumpe. Orientarea populaţiei

pe baza unui aviz dietetic a specialistului este extrem de deficitară, atât în perioada

antenatală, cât şi în şcoli şi în rândurile adolescenţilor.

Suplimentarea artificială cu folaţi a alimentelor comerciale disponibile pune problema

libertăţii de opţiune şi a posibilelor reacţii adverse, precum neuropatia datorată unui exces de

acid folic la vârstnici. Alimentele alese trebuie să fie consumate cu precădere de către

populaţia ţintă, iar nivelul suplimentării trebuie să fie cel minim protector (pentru a evita

aportul excesiv de acid folic); cele mai frecvente alimente îmbogăţite în folaţi sunt pâinea

(există deja pâine suplimentată cu conţinut în folaţi 120μg/100 grame), iar fulgii de porumb

sunt fortificaţi la 250 μg/100g (75μg/porţie medie); aceste evaluări aparţin Expert Advisory

Group şi sunt valabile pentru produse alimentare in Marea Britanie.

Pagina 34 din 59


Problema suplimentării acidului folic la femeile gravide se pune mai ales pentru

marea masă a populaţiei, întrucât numărul restrâns al celor cu risc crescut va beneficia

probabil de consult şi tratament adecvat. Din nefericire, în general concepţia nu este

planificată şi numai un număr restrâns de cupluri se vor prezenta la un consult prenatal.

Multe studii au recomandat folosirea dozelor farmacologice de acid folic (4mg/zi) în

scop profilactic, dar grija unei supradozări a ridicat problema folosirii unor doze “fiziologice”

(0,5mg/zi) pentru profilaxia generală antenatală. Astfel, deşi nu se cunosc posibilele reacţii

adverse ale acidului folic asupra femeilor în perioada de fertilitate, se recomandă doze mici

pentru mamele cu risc mic şi doze mari (4mg/zi) pentru femeile cu risc crescut. În orice caz,

suplimentarea trebuie începută cu trei luni înaintea concepţiei şi continuată primele 8-12

săptămâni de sarcină. Un efect protector, dar de intensitate mai mică, poate fi obţinut şi dacă

suplimentarea este începută mai tarziu, chiar la începutul gestaţiei.

În concluzie, dozele sugerate au fost stabilite empiric şi nu se ştie dacă efectul

protector al folaţilor împotriva apariţiei malformaţiilor este la fel de cert ca şi cel împotriva

recurenţei lor. Deşi nu s-au evidenţiat încă reacţiile adverse pentru doze mari, ele pot apărea

abia după mulţi ani, aşa cum a fost cazul unor posibile efecte teratogene ale vitaminei A

(1990). Strategia cea mai corectă ar consta în evitarea administrării dozelor farmacologice

dacă nu există o justificare clară.

Punerea la punct a unui protocol de “screening” prenatal privind femeile cu risc

crescut ar putea reorienta întreaga strategie profilactică şi poate fi obiectul unor cercetări

ulterioare la noi în ţară.

4.3. Acidul folic, ţinta terapiei anticanceroase

Terapia antineoplazică depăşeşte în vechime vârsta de 50 de ani. Dacă înainte de 1940

cuvântul cancer apărea în indexul tratatelor de farmacologie doar accidental, astăzi

chimioterapia reprezintă o piatră de temelie în terapia cancerului. Principalul progres al

ultimilor ani nu constă în lărgirea numărului de agenţi antineoplazici descoperiţi, ci în

dezvoltarea conceptuală a terapeuticii. Aceasta constă în: stabilirea unor regimuri terapeutice

mai eficace prin administrarea simultană a diverse medicamente, incluzând agenţi

antineoplazici şi stimulatori ai răspunsului biologic; înţelegerea mecanismelor de acţiune ale

medicamentelor, lucru care duce la prevenirea sau micşorarea efectelor toxice; aprofundarea

mecanismelor de rezistenţă la terapie; creşterea întrebuinţării terapiei adjuvante (prevenirea

recidivelor şi distrugerea micrometastazelor, după radioterapie şi/sau chirurgie) şi

Pagina 35 din 59


neoadjuvante (administrarea înainte de radioterapie sau chimioterapie sau chirurgie pentru

scăderea masei tumorale); lărgirea cunoştinţelor despre iniţierea tumorală, diseminarea,

implantarea şi creşterea metastazelor.

Antimetaboliţii sunt substanţe proiectate ca inhibitori competitivi ai reacţiilor

enzimatice ale metabolismului intermediar, sau cu analogi inactivi ai substraturilor reacţiilor

specifice. Majoritatea sunt specifici doar în timpul anumitor faze ale ciclului celular.

Antimetaboliţii nu sunt administraţi obişnuit ca medicatie unică, datorită specificităţii de fază

şi a faptului că afectează sinteza macromoleculară în puncte multiple.

Acidul folic reprezintă o ţintă atractivă pentru chimioterapia antitumorală, datorită

rolului său esenţial în sinteza precursorilor ADN. Formele reduse de acid folic

(tetrahidrofolaţi) sunt necesare pentru sinteza purinelor şi a timidilatului. N10-formil-FH4 şi

N5, N10-metenil-FH4 contribuie cu o grupare monocarbonată la sinteza acidului inozinic,

precursorul adenilatului (AMP) şi guanilatului (GMP). Într-o altă cale metabolică importantă,

N5, N10-metilen-FH4 asigură o grupare metil şi doi atomi de hidrogen pentru sinteza

timidilatului (dTMP) din deoxiuridilat. Farber şi colab. au propus că analogii acidului folic

pot inhiba proliferarea celulelor maligne, o ipoteză care a fost confirmată de testele iniţiale,

cu aminopterină (acid 2,4 diamino 4 dezoxifolic), în 1948. Acest compus a fost înlocuit mai

târziu cu derivatul său N10 metilat, metotrexatul (MTX).

Antifolaţii ocupă un loc important în terapia antineoplazică; aceştia au produs prima

remisie temporară a leucemiei (Farber et al. 1948) şi prima vindecare a unei tumori solide,

coriocarcinomul (Hertz, 1963). Procentajul crescut de remisiuni complete ale

coriocarcinomului a impulsionat cercetarea în domeniul chimioterapiei. Interesul pentru

antifolaţi a crescut semnificativ după introducerea terapiei cu doze mari combinate cu

leucovorină (acid folinic, factor C), care scade efectul toxic al metotrexatului. Folosirea

dozelor crescute de MTX a extins utilitatea acestuia la tumori ca sarcomul osteogenic, tumori

ce nu răspund la doze mici. MTX este folosit şi în terapia psoriazisului, o boală non-

neoplazică caracterizată prin proliferare rapidă, anormală a celulelor epidermoide (McDonald

1981). În plus, antifolaţii sunt inhibitori puternici ai reactivităţii imune mediate celular, având

şi rol de agenţi imunosupresori ce se folosesc în transplantele de organe, în tratamentul

artritei reumatoide şi în granulomatoza Wegener (Jackson 1984, Chabner et al. 1985).

Metotrexatul (ametopterina) a fost primul antimetabolit care a primit recunoaştere

clinică, ca medicament eficace, cu toxicitate acceptabilă. În ultimii 20 de ani au fost testaţi

clinic noi compuşi antifolaţi, cum ar fi diaminopirimidinele şi chinazolinele. Cel mai recent

dintre acestea este trimetrexatul, un antifolat chinazolinic lipofil, care ocoleşte obligativitatea

Pagina 36 din 59


din cazul folaţilor şi a metotrexatului de a folosi transportul activ. Trimetrexatul are activitate

puternic antiparazitară şi efecte antineoplazice, testate încă în ambele specialităţi. Un alt folat

din ce în ce mai interesant este 10-EDAM (10-etil-5-diazo-aminopterina), un inhibitor potent

al dihidrofolat reductazei, care posedă transport şi poliglutamare îmbunătăţite faţă de

metotrexat. Trimetrexatul şi 10-EDAM au demonstrat o activitate antitumorală în tratamentul

carcinoamelor de intestin, plămân.

MTX face parte din clasa drogurilor specifice pentru ciclul celular faza S (CCS),

alături de toţi ceilalţi antimetaboliţi. În general, drogurile CCS s-au dovedit eficace împotriva

malignităţilor hematologice şi a altor tumori în care proliferează o proporţie relativ crescută

de celule.

O problemă majoră a chimioterapiei anticanceroase este rezistenţa la drog. Unele

tipuri tumorale, cum ar fi cancerul colonic sau cancerul pulmonar prezintă o rezistenţă

primară, adica o lipsă de răspuns la prima expunere la drog. Rezistenţa dobândită se dezvoltă

în diferite tipuri de tumori iniţial sensibile la tratament. Experimental, se poate observa

apariţia unei rezistenţe specifice pentru un anumit drog, care apare datorită fenomenului de

amplificare genică. Alteori se observă un fenotip cu rezistenţă multiplă, după expunerea la un

singur agent. Acesta este frecvent asociat cu creşterea expresiei genei MDR 1 pentru o

glicoproteină membranară (glicoproteina-P), implicând efluxul medicamentului. Această

proteină transportoare, care apare atât în celule normale cât şi în celule tumorale, foloseşte

energia ATP pentru evacuarea multor molecule străine, nefiind limitată doar la agenţii

antineoplazici. Un alt mecanism de rezistenţă multiplă implică modificări calitative şi

cantitative în topoizomeraza II, enzima care repară leziunile produse în ADN de

medicamentele antineoplazice.

Principalele mecanisme de rezistenţă cunoscute sunt:

transportul deficitar al MTX în celule (Assaraf & Shimke 1987);

producţia de forme de DHFR alterată, care are afinitate scăzută pentru inhibitor (Thill

et colab. 1988);

creşterea concentraţiei intracelulare a DHFR;

scăderea abilităţii de a sintetiza poliglutamaţi de MTX;

scăderea activităţii timidilat-sintetazei (Curt 1985).

Pagina 37 din 59


Pagina 38 din 59


Structura chimica a unor analogi structurali ai folatilor

4.4. Mecanisme de acţiune şi rezistenţă

Activitatea antitumorală a analogilor de folaţi este rezultatul substituţiei unei grupări

amino cu una hidroxil în poziţia 4 a inelului pteridinic, schimbare care transformă molecula

de folat din substrat, într-un inhibitor ce se leagă strâns de enzima cheie a metabolismului

folic intracelular, dihidrofolatreductaza (DHFR).

Pentru a întelege acţiunea metotrexatului şi a altor antifolaţi, este necesar să se

determine rolul determinant al DHFR în metabolismul folaţilor. Derivaţii acidului folic sunt

coenzime active doar în forma complet redusă de tetrahidrofolaţi. În reacţia timidilat

sintetazei (TS), acidul N5, N10 metilen FH4 este convertit la DHF. Acest cofactor inactiv

devine apoi substrat pentru DHFR, care transferă doi atomi de hidrogen de la cofactorul

NADPH la DHF pentru a forma FH4. În celulele cu ritm crescut a sintezei de timidilat,

inhibiţia DHFR cu MTX sau analogi similari duce la acumularea de cofactori folat în formă

inactivă, de DHF, ceea ce are ca rezultat inhibiţia sintezei purinelor şi timidilatului.

Astfel, citotoxicitatea MTX-ului este determinată de perturbarea sintezei de novo a

purinelor şi a sintezei timidilatului, iar importanţa relativă a fiecărui efect variază la diferitele

tipuri de celule cultivate in vitro şi, probabil, la celulele normale şi maligne in vivo.

Borsa şi Whitmore au demonstrat că citotoxicitatea MTX-ului faţă de limfocite de

şoarece poate fi crescută prin administrarea de purine, probabil datorită creşterii efectului

antitimidilat al MTX. Totuşi, în modelele de limfom L5178, MTX a avut un efect antipurinic

letal. În general, întreruperea sintezei de novo a purinelor apare în prezenţa unor nivele

crescute de timidilat sintază şi se produce prin consumarea rezervelor de folaţi reduşi

necesare sintezei acestora. Deoarece legarea strânsă de DHFR şi depleţia consecutivă a

folaţilor reduşi sunt esenţiale pentru mecanismul de acţiune a MTX, activitatea timidilat

sintazei modulează citotoxicitatea MTX. Inhibiţia timidilat sintazei (prin administrarea F-

pirimidinelor şi reducerea rezervelor de dUMP) scade turnover-ul folaţilor reduşi şi reduce

citotoxicitatea MTX. Importanţa activităţii timidilat sintazei în determinarea citotoxicităţii

MTX a fost confirmată recent de Tattetersall şi colaboratorii, care au investigat capacitatea

timidinei de a proteja culturi de celule mamare împotriva unei doze letale de MTX. Când a

fost administrată cu două ore înaintea MTX, timidina a protejat ambele linii celulare, normale

şi maligne. Măsurarea rezervelor intracelulare de nucleotide a demonstrat că timidina

realizează o depleţie a rezervei de dUMP (prin inhibiţia cu TTP a dCMP deaminazei) şi

Pagina 39 din 59


încetineşte reacţia timidilat sintazei, conservând astfel folaţii reduşi şi păstrând sinteza de

novo a purinelor. MTX-ul poliglutamat are un efect inhibitor puternic şi direct asupra

timidilat sintazei şi a enzimelor sintezei purinelor; prin aceste efecte inhibitorii pot contribui

direct la citotoxicitatea drogului.

Evenimentele care conduc la acţiunea citotoxică a MTX, începând cu transformarea

membranelor celulare, transformarea în derivaţi poliglutamaţi, legarea de DHFR, deleţia

folaţilor reduşi intracelulari şi inhibiţia sintezei ADN constituie paşi importanţi în

determinarea răspunsului la tratament şi a toxicităţii acestui medicament.

4.5.Transportul transmembranar

Traversarea de către antifolaţi a membranelor celulare a fost studiată cu multă atenţie

datorită legăturii dintre anomaliile de transport şi rezistenţă. Studiile clasice ale lui Goldman

şi colab. au stabilit că MTX intră în celule pe baza unui proces activ sensibil la temperatură,

dependent probabil de o proteină transmembranară. Influxul poate fi observat şi în vezicule

membranare izolate.

Aportul celular de folaţi se produce prin cel puţin două mecanisme independente:

folaţii reduşi sunt internalizaţi printr-un sistem “carrier” (RFC-reduced folate carrier) cu

afinitate redusă (Km=1-5μM) prin transport anionic, întâlnit în majoritatea celulelor, iar

acidul folic şi 5-metil-FH4 intră în celulă în complex cu o proteină membranară care leagă

folatul (FBP folate binding protein). FBP leagă folaţii cu afinitate crescută (Kd de ordinul

nM) şi apoi îi eliberează în citoplasmă printr-un proces de endocitoză mediată de receptori.

Se pare că FBP acţionează la concentraţii scăzute de folaţi (<50 nM) iar carrierul la

concentraţii normale sau crescute.

Macromoleculele care leagă folaţii au fost izolate din membranele unor celule de

mamifere, dar nu li s-a dovedit vreun rol în transport. Mecanismul transportor al MTX în

celulele leucemice murinice şi umane este deasemenea utilizat de folaţii reduşi naturali,

incluzând agentul de salvare 5-formil-FH4 (leucovorina). MTX şi folaţii reduşi concurează,

deci, pentru a intra în celulă. În plus, printr-un proces cunoscut sub numele de heteroschimb,

MTX intracelular liber este forţat să iasă din celule atunci când intră în celule cantităţi

crescute FH4 extracelular.

Gena RFC e localizată distal, pe braţul lung al cromozomului 21. Afinitatea “carrier”-

ului pentru MTX se situează între 1μM-6μM pentru diverse linii de celule tumorale (murine

Pagina 40 din 59


şi umane), în timp ce afinitatea celulelor epiteliale intestinale este oarecum mai scăzută

Km=87 μM. Acestă afinitate mai mare a carrier-ului celulelor tumorale este considerată ca

fiind explicaţia persistenţei mai îndelungate a MTX liber intracelular şi poate contribui la

selectivitatea acţiunii antifolaţilor împotriva tumorilor, faţă de celulele normale. Acumularea

MTX în celulele tumorale poate fi influenţată de alţi agenţi antitumorali, incluzând

medicamente frecvent utilizate ca antifolaţi în terapiile combinate. Vincristina creşte MTX

intracelular, inhibând efectul medicamentului. Concentraţia vincristinei necesară pentru a

produce acest efect (10μM) nu este uşor obţinută în timpul chimioterapiei clinice, care

produce frecvent niveluri sanguine maxime ale vincristinei mai mici de 0,1μM. Influxul

MTX este inhibat de ouabaină, glucocorticoizi şi cefalotin, în timp ce acumularea este

crescută de probenecid, prin inhibarea efluxului. Nici una dintre aceste interacţii nu a dovedit

că afectează chimio terapia clinică.

Faza proliferativă sau cinetică a celulelor influenţează puternic procesul de transport.

Celulele leucemice murinice rapid proliferative au o viteză de preluare a MTX de 3 ori mai

mare şi o viteză de eflux a drogului cu 50% mai mică decât o au celulele în faza staţionară de

creştere. Aceste modificări cresc nivelele MTX intracelular de 5-6 ori. Dependenţa

transportului de ritmul de creştere poate contribui la creşterea citotoxicităţii MTX pentru

celulele care se divid rapid, dar şi mărirea necesarului de folaţi reduşi în fazele de creştere

rapidă pentru a contribui la aceasta. În continuare la procesul de transport activ cu afinitate

crescută, descris mai sus, un al doilea mecanism de intrare apare la concentraţii crescute ale

drogului (peste 20μM). Acest al doilea proces poate fi difuzie pasivă, sau un proces realizat

pentru un “carrier” specific. Alte aspecte ale acestui proces de transport sunt lipsa competiţiei

dintre MTX şi FH4 pentru intrare, precum şi absenţa heteroschimbului dintre MTX si FH4.

Mecanismul de intrare explică abilitatea celulelor rezistente la transport de a prelua drogul la

concentraţii extracelulare crescute şi reprezintă o motivaţie raţională a utilizării dozelor

crescute de MTX în chimioterapie. Un studiu recent a lui Henderson şi Zeveny a evidenţiat

doar o singură cale de influx cu afinitate crescută pentru concentraţii de până la 50μM, dar

trei sisteme de eflux pentru MTX. Cel mai important dintre acestea pare să fie acelaşi care

mediază şi influxul de MTX. A doua cale a fost caracterizată prin sensibilitatea la

bromosulfonftaleină, în timp ce a treia a fost insensibilă la această substanţă şi la inhibitori

competitivi ai MTX. Contribuţia acestor componente la eflux poate fi modificată în funcţie de

prezenţa extracelulară a anionilor glucozei, sau a inhibitorilor metabolici. Acumularea şi

persistenţa drogului în tumori faţă de ţesutul normal determină în mod clar durata sa de

acţiune în teritorii specifice. Au fost observate nivele maxime intracelulare mai mari şi o

Pagina 41 din 59


persistenţă mai îndelungată a drogului în celulele leucemice ale murinelor, sensibile la MTX,

faţă de epiteliul intestinal, în timp ce linia celulară sarcomatoasă 180 rezistentă, a acumulat

concentraţii mai scăzute de drog, a avut perioade mai scurte ale inhibiţiei sintezei ADN şi a

fost neafectată în experimentele chimioterapice. Analiza specifică in vitro a ratelor de

preluare a medicamentului de către celulele leucemice a evidenţiat o relaţie pozitivă similară

între răspunsul la medicament şi transport.

Există diferenţe semnificative ale caracteristicelor de transport între diverşi antifolaţi.

Antifolaţii chinazolinici au o rată de eflux mai crescută. Aceste diferenţe se corelează cu

acumularea intracelulară mai mare a chinazolinelor şi aminopterinei faţă de MTX, după doze

echimolare în vivo. Importanţa transportului MTX în determinarea răspunsului clinic este

nesigură. Alte mecanisme de rezistenţă, în special creşterea concentraţiei de DHFR ca urmare

a amplificaţiei genice, au fost observate în tumori umane şi murinice expuse la creşteri

treptate ale concentraţiei drogului in vitro care poate fi un mecanism la fel de important şi în

practica clinică. Înţelegerea rezistenţei la antifolaţi la nivel clinic rămâne incompletă. Au fost

propuse noi investigaţii, cu scopul de a ocoli rezistenţa cauzată de deficienţa de transport.

Antifolaţii liposolubili, cum sunt esterii de MTX, diaminopirimidinele, triazinaţii şi

trimetrexatul au o excelentă activitate antitumorală în culturile de celule în tratamentul

experimental al tumorilor la rozătoare şi ar trebui să penetreze celulele deficiente în transport.

Dibutilester-MTX are deasemenea proprietatea neobişnuită de a inhiba încorporarea timidinei

în ADN, aparent datorită inhibiţiei transportului nucleozidelor. Diesterii MTX sunt rapid

hidrolizaţi la compusul de bază în plasma de şoarece, dar sunt mai stabili în plasma maimuţei,

câinelui şi omului; când sunt inhibate în aceste plasme dibutilesterii sunt convertiţi la derivaţi

α şi γ monobutilici, fiind inhibitori stabili şi eficace ai DHFR. Proprietăţile de transport ale

monobutilesterilor nu au fost încă definite. Conjugaţii de MTX şi polilizină, care sunt toxici

pentru culturile de celule ovariene de hamsteri cu transport eficient, oferă şi posibilitatea de a

ocoli rezistenţa la transport. Deoarece conjugatul polilizin-MTX nu inhibă direct DHFR şi

toxicitatea sa poate fi anulată prin administrarea simultană de leucovorină, este probabil că şi

compusul suportă liza intracelulară, cu eliberarea antifolatului.

Shen şi colab. au postulat că conjugatul intră în celulă prin pinocitoză şi prin liza

enzimatică ce apare în lizozomi. Astfel, conjugatul polilizină-MTX este transportat printr-un

sistem “carrier” independent. Tiamin pirofosfatul, care inhibă transportul MTX, protejează

fibroblaştii de şoarece de toxicitatea MTX, dar nu de aceea a polilizin-MTX. Deşi acidul folic

este capabil să salveze celulele hepatom Reuber H35 de citotoxicitatea MTX, este incapabil

Pagina 42 din 59


să salveze o murină rezistentă la transport de efectele polilizin-MTX, probabil deoarece, ca şi

MTX, acidul folic este incapabil să intre în celulele rezistente la transport.

O altă încercare de a depăşi rezistenţa la transport este încapsularea MTX în vezicule

fosfolipidice bistrat, numite lizozomi. Aceste plachete microscopice ce conţin medicament

pot, teoretic, transporta MTX la suprafaţa celulară, unde intrarea poate fi făcută prin

pinocitoză, sau prin contopirea membranelor celulare şi lipozomice. Lasserman şi colab. au

reuşit să îndrepte lipozomi cu purtători de haptene, conţinând MTX, spre celulele

mielomatoase murinice care exprimau pe suprafaţa lor imunoglobuline cu afinitate pentru

haptene. Deşi lipozomii localizau celule ţintă mielomatoase cu acurateţe nu a fost observată

nici o inhibiţie a încorporării deoxiuridinei, deoarece conţinutul veziculelor nu a putut intra în

celulă. Deşi rezultate încurajatoare cu lipozomi încărcaţi cu MTX au fost raportate pe modele

animale, majoritatea dovezilor sugerează că îmbunătăţirea supravieţuirii provine de la

întârzierea nespecifică a clearence- lui plasmatic şi nu din transportul selectiv al

medicamentului la tumora. O excepţie posibilă a acestei concluzii este tehnica de încapsulare

a MTX in lipozomi termolabili. Dacă tumora este apoi incălzită, eliberarea preferenţială a

MTX apare la sediul tumorii, ducând la o activitate terapeutică îmbunătăţită.

MTX – γ - aspartat

Legarea reziduurilor de aspartat la MTX prin legături γ - peptidice

Un alt experiment a fost folosit de Heath şi colab., folosind MTX-γ aspartat, conţinut

în lipozomi înveliţi în anticorpii specifici antitumorali. Acest analog de MTX are capacitate

limitată de a traversa membrana celulară şi este de 200 de ori mai puţin toxic decât MTX,

datorită transportului deficitar. Citotoxicitatea a apărut doar prrin eliberarea intracelulară a

Pagina 43 din 59


drogului via lipozomi îmbrăcaţi cu anticorpi specifici pentru fibroblaşti murinici L 929. În

mod ideal, va fi nevoie de identificarea unor antigene tumorale umane comune în scopul de a

face acest experiment util din punct de vedere clinic.

4.6. Legarea metotrexatului la dihidrofolatreductază

Caracteristicile fizice ale legării NADPH şi a MTX de DHFR au fost stabilite prin

studii cristalografice cu raze X şi prin determinarea secvenţelor de aminoacizi ale enzimelor

naturale şi ale celor modificate chimic. Au fost studiate enzime bacteriene şi de la mamifere;

secvenţele de aminoacizi posedând similitudini puternice în poziţiile implicate în legarea

cofactorilor sau a inhibitorilor. În general, MTX este legat printr-o porţiune lungă, hidrofobă,

formată din izoleucina-7 (sau leucina-7), alanina-9, leucina-31, fenilalanina-34 şi alte

reziduuri. Două interacţii mai importante participă la potenţarea legării 4-amino-antifolaţilor:

oxigenul carbonilic al izoleucinei-7 realizează o legătură de hidrogen cu gruparea 4-

aminei ;

gruparea carboxil a aspartatului-30 (sau glutamatului-30) protonează atomul N al

MTX, dar nu şi pe cel al substratului fiziologic (FH4). În plus, substratul fiziologic pare să se

lege de enzimă într-o configuraţie răsturnată, în comparaţie cu inhibitorul.

În prezenţa NADPH-ului în exces, afinitatea de legare a MTX de reductază a fost

estimată între 1nM şi 1pM. Această afinitate este crescută de pH-ul acid, potenţată de ionii de

K+ şi oxidarea grupărilor sulfhidril ale enzimei. În condiţiile unui pH scăzut, a excesului de

NADPH şi a unei afinităţi scăzute a inhibitorului faţă de enzimă, legarea este

stoechiometrică, ceea ce inseamnă că fiecare moleculă de MTX va lega o moleculă de

enzimă. Complexul enzimă-NADPH-inhibitor este extrem de stabil, supravieţuind

electroforezei în gel şi filtrării în gel.

NADH are deasemenea capacitatea de a acţiona ca şi cosubstrat pentru DHFR în locul

NADPH, pentru reducerea folatului şi a dihidrofolatului. Spre deosebire de NADPH, NADH

nu asigură legarea MTX de DHFR. Importanţa raportului dintre NADH şi NADPH în

determinarea răspunsului la MTX rămâne să fie stabilită.

Legarea MTX la reductaza izolată de la Streptococcus faecium generează lent un

complex cu un Ki al inhibitorului de 58 pM. Procesul a fost denumit inhibiţie strâns legată şi

lentă. Alţi analogi de folaţi, incluzând diaminopirimidinele, trimetroprimul şi aminopterina

urmează acelaşi proces cinetic, de “legare strânsă şi lentă”, în timp ce pteridinele ce nu au

Pagina 44 din 59


gruparea acid amino benzoic se comportă ca inhibitorii competitivi clasici ai enzimei.

Cinetica a fost evaluată folosind şi modele de simulare .

În terapeutică, MTX acţionează ca un inhibitor cu legare strânsă, dar reversibil. În

condiţiile unor concentraţii crescute de substrat competitiv şi la un pH normal, este necesar

un exces considerabil de MTX liber pentru realizarea unei inhibiţii complete a enzimei. În

culturile de celule şi în sisteme acelulare, 3H-MTX (MTX marcat cu 3H) legat de enzimă

poate fi deplasat de pe aceasta prin expunere la noi doze de drog, fenomen ce indică o

disociere lentă, dar stabilă a MTX de pe enzimă. Acestă disociere lentă este considerabil mai

rapidă decât cea calculată în experimente cu enzimă pură în prezenţa unui exces de NADPH.

Motivul acestei diferenţe este încă neclar, dar poate fi rezultatul diferenţelor din mediul ionic,

de legare prin complexe cu afinitate scăzută a drogului cu DHFR şi NADP+, sau doar cu

enzima. Deci este necesar un exces de drog liber, nelegat, pentru a menţine inhibiţia totală a

DHFR şi a sista sinteza timidilatului. De exemplu, dacă se incubează celule tumorale cu

cantităţi crescute de MTX pentru a permite titrarea totală a enzimei şi apoi se scoate drogul

nelegat din soluţie, sinteza timidilatului va reîncepe imediat în ciuda persistenţei MTX

intracelular legat de enzimă.

5. REZULTATE EXPERIMENTALE

În studiul prezent am folosit o metodă spectrofotometrică pentru a determina

concentraţia de acid folic din omogenate tisulare din diferite organe (ficat, rinichi, creier,

splină) la şobolanii albi; acest studiu a fost

realizat în scopul aflării variaţiei concentraţiei de acid folic în funcţie de:

vârstă;

organ.

Pentru curba de etalonare am folosit:

metoda biuretului pentru determinarea proteinelor celulare;

reactivul naftiletilendiamină pentru determinarea acidului folic.

Concentraţiile acidului folic în funcţie de vârstă şi de organ le-am estimat prin metoda

descrisă de Lowry (Lowry, 1951), cu ajutorul acidului fosfomolibdenowolframic.

Determinarea concentraţiei de acid folic la şobolani

Pagina 45 din 59


5.1. Material şi metodă

Animale şi dietă

Pentru studiu s-au folosit trei grupuri de şobolani albi, de sex masculin, fiecare grup

constând în cinci şobolani de vârstă şi greutăţi apropiate, astfel:

1)-primul grup: şobolani tineri, cu vârsta mai mică de şase luni şi greutate mai mică

de 50 de grame;

2)-al doilea grup: şobolani adulţi, cu vârste cuprinse între şase luni şi un an şi greutate

cuprinsă între 100 grame şi 125 grame;

3)-al treilea grup: şobolani bătrâni, cu vârste în jur de un an sau chiar mai mult şi

greutate mai mare de 125 grame.

Toţi şobolanii au fost supuşi la aceeaşi dietă.

Prepararea omogenatelor tisulare

Toate operaţiunile de preparare a omogenatelor tisulare pentru investigaţii biochimice

se fac la 0-4˚ C. Sticlăria de lucru, eprubetele şi cupele de centrifugă, soluţiile de spălare şi

mediile de omogenizare au fost păstrate la gheaţă şi au fost reci în momentul întrebuinţării.

Animalele de laborator au fost decapitate şi apoi supuse exsanguinării.

S-au izolat organele necesare experimentului: ficat, rinichi, creier şi splină, iar apoi s-

au presat uşor pe hârtie de filtru, pentru a îndepărta sângele. S-au cântărit foarte repede.

Fiecare organ a fost spălat de câteva ori (într-un pahar Berzelius menţinut în gheaţă)

cu soluţie rece de NaCl 0,15M până ce lichidul de spălare a rămas limpede.

Apoi, cu o foarfecă s-a mărunţit bine organul şi s-a spălat cu NaCl 0,15M, pâna ce

soluţia de spălare a rămas limpede.

Pentru omogenizare 5 ml de soluţie de NaCl 0,15M au fost adăugaţi pe gramul de

ţesut (cu scopul de a obţine un omogenat de concentraţie 10%).

Ţesuturile uşor poterabile (ficat şi creier) au fost omogenizate la 1500rpm, timp de 2

minute, într-un omogenizator de sticlă tip Potter-Elvehjem. Ţesuturile mai dure (rinichi şi

splină) au necesitat o omogenizare cu o durată mai crescută.

Omogenatele obţinute s-au centrifugat la 700 g timp de 10 minute (după o prealabilă

echilibrare). Sunt sedimentaţi:

-nucleii;

-celulele întregi;

-debriurile celulare;

-hematiile.

Pagina 46 din 59


Supernatantul se decantează şi se păstreaza în gheaţă pentru alte determinări

biochimice.

Pentru a putea compara şi interpreta rezultatele determinărilor biochimice pe

omogenate, materialul biologic s-a standardizat în două moduri:

-prin raportare la greutatea produsului la începutul determinării (standard de

preparare);

-prin raportare la conţinutul proteic al omogenatului.

Standard de preparare

Iniţial organul sau fragmentul de organ se cântăreşte. În funcţie de greutatea sa se

realizează omogenate de 10-20%, diverse soluţii de omogenizare.

Standardizarea se obţine preparând totdeauna omogenate de aceeaşi concentraţie.

Raportarea la conţinutul proteic

Este metoda de standardizare cea mai utilizată.

Metoda de determinare a proteinelor celulare folosită pentru standardizare

(metoda biuretului)

-sensibilitate de 0,25-10mg/ml omogenat

Principiu:

Proteinele celulare dau cu reactivul biuret un derivat de culoare albastră caracteristică,

a cărei intesitate este direct proportională cu concentraţia proteinelor din probă.

Reactivi:

1.reactivul biuret;

2.NaOH 10%.

Reactivul biuret se prepară astfel:

-tartrat de sodiu şi potasiu –9g;

-CuSO4·5H2O –3g;

-KI-5g;

Se dizolvă şi se aduce la 1000ml cu NaOH 0,2N.

Pagina 47 din 59


Reactivul preparat corect este de culoare albastră. Se păstrează timp nelimitat. Dacă

reactivul este contaminat cu alte substanţe apare un precipitat roşcat şi nu se mai foloseşte.

Tehnica

Deoarece omogenatele tisulare nu sunt soluţii limpezi, ele prezintă o anumită

turbiditate, dând cu reactivul biuret un efect secundar ce interferă cu reacţia de culoare. Se

face pentru fiecare determinare şi un martor de turbiditate.

Martor de culoare Martor de turbiditate Proba

2 ml apa distilată 1,8 ml apa distilată 1,8 ml apa distilată

0,2 ml omogenat 0,2 ml omogenat

1 ml NaOH-10% 1 ml NaOH-10% 1 ml NaOH-10%

3 ml reactiv biuret 3 ml apa distilată 3 ml reactiv biuret

Se agită bine. Se lasă în repaus 30 de minute la temperatura camerei, după care se

citeşte extincţia la lungimea de undă de 540 nm, cu grosimea stratului de 10 nm.

Se citeşte extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare , iar extincţia martorului

de turbiditate faţă de cea a apei distilate.

Calculul cantităţii de proteine se face prin raportarea valorii corespunzătoare

diferenţei dintre cele două mărimi la o curbă etalon.

Curba etalon

-se prepară o soluţie standard de albumină serică de bou;

-se pregăteşte o scară de diluţii de concentraţii cunoscute cuprinse între 0,25-60

mg/ml ;

-se respectă pentru fiecare diluţie protocolul prezentat în tabelul anterior ;

-se reprezintă grafic modul de variaţie a extincţiei în funcţie de concentraţia soluţiei

de proteine

Pagina 48 din 59


Concentraţie (mg/ml) Extincţie (p/c-t/H2O)*

60 0,617

30 0,320

15 0,166

7,5 0,090

3,75 0,042

1,875 0,024

0,9375 0,012

0,46875 0,006

0,234375 0,003

*)-extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare minus extincţia martorului de

turbiditate faţă de cea a apei distilate

5.2.Determinarea conţinutului în acid folic

Reactivi

-fosfat dibazic de potasiu soluţie 3%;

-permanganat de sodiu 0,4%;

-azotit de sodiu soluţie 2%;

-acid clorhidric soluţie 5N;

-acid sulfamic soluţie 5%;

-diclorhidrat de N (1-naftil) etilendiamina NED soluţie 0,1%.

Tehnica

Proba Martor de turbiditate Martor de culoare

2,5 ml omogenat 2,5 ml omogenat 2,5 ml KmnO4

0,5 ml KMnO4 0,5 ml apă 0,5 ml KMnO4

Se lasă 2-3 minute

Pagina 49 din 59


0,5 ml NaNO2 0,5 ml NaNO2 0,5 ml NaNO2

0,5 ml HCl 0,5 ml HCl 0,5 ml HCls

Se agită puternic şi se lasă 2 minute

O,5 ml acid sulfamic O,5 ml acid sulfamic O,5 ml acid sulfamic

Se agită puternic până la îndepărtarea NO2

0,5 ml NED 0,5 ml NED 0,5 ml NED

Se citeşte extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare şi a martorului de

turbiditate faţă de cea a apei distilate după 10 minute la lungimea de undă 530 nm în cuvă de

10 mm.

Calculul cantităţii de acid folic se face prin raportarea valorii corespunzătoare

diferenţei dintre cele două mărimi la o curbă etalon.

Curba etalon:

-se prepară o soluţie standard de acid folic;

-se pregăteşte o scară de diluţii cu concentraţii cunoscute cuprinse între 1,2023-130

μg/ml;

-se respectă pentru fiecare diluţie protocolul prezentat în tabelul anterior;

-se reprezintă grafic modul de variaţie al extincţiei în funcţie de concentraţia soluţiei

de acid folic.

Concentraţie

μg/ml

Extincţie

p/t*

Extincţie

p/c –t/H2O

130 1,226 1,2648

108,33 1,0508 1,0728

86,66 0,8756 0,8555

65 0,6198 0,565

43,33 0,3585 0,2905

21,66 0,2758 0,1766

10,83 0,1555 0,0718

7,22 0,1394 0,0431

3,61 0,1180 0,0303

Pagina 50 din 59


*)extincţia probei faţă de cea a martorului de turbiditate

**)-extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare minus extincţia martorului de

turbiditate faţă de a apei distilate.

Măsurarea cantităţilor de acid folic din omogenatele tisulare

Concentraţiile de acid folic au fost estimate prin metoda NED (N-1-naftiletilen

diamina), o metodă de bază, spectrofotometrică. Această metodă se foloseşte ca tehnică de

dozare în industria farmaceutică (Atanasiu şi colab., 1989)

Reactivi

-_monofosfat de potasiu –3%;

permanganat de potasiu –0,4% ;

NaNO2 -2%

acid hidrocloric – 5%;

acid sulfamic –5%

NED-0,1%

Tehnica

Proba Martor de culoare

2,5 ml omogenat 2,5 ml K2HPO4

0,5 ml KMnO4 0,5 ml KMnO4

Se lasă 2-3 minute

0±,5 ml HCl 0,5 ml HCl

0,5 ml NaNO2 0,5 ml NaNO2

Pagina 51 din 59


Se agită şi se lasă 2 min

0,5 ml acid sulfamic 0,5 ml acid sulfamic

Se agită până când N2 este complet înlăturat

0,5 ml NED 0,5 ml NED

Se lasă 10 minute

Se citeşte extincţia faţă de martorul de culoare la lungimea de undă de 530 de nm;

concentraţia de acid folic corespunzătoare acestei extincţii s-a calculat prin raportarea la

curba standard (prin metoda expusă anterior).

Rezultatele obţinute s-au exprimat atât în funcţie de greutatea iniţială a organului (μg

de acid folic/g de ţesut), cât şi în funcţie de concentraţia de proteine din omogenat (μg de acid

folic/mg de proteine).

Măsurarea concentraţiei de proteine din omogenat

Concentraţia de proteine a fost calculată prin metoda descrisă de Lowry (Lowry,

1951), metodă bazată pe acidul fosfomolibdenowolframic (reactivul “Folin-Ciocalteu”).

Reactivi

Reactivul A: - 4g NaOH;

-10g sare Seignette;

-apă distilată până la 1000ml;

Reactivul B: -5g CuSO4·5 H2O;

-apă distilată până la 1000 ml;

Reactivul C: -25 ml reactiv A + 0,5 ml reactiv B;

Reactivul D: -acid fosfomolibdenowolframic.

Pagina 52 din 59


Tehnica

Peste 20 μl de omogenat se adaugă 180 μl de apă distilată, iar apoi se adaugă 5ml

reactiv C şi 0,5ml reactiv Folin-Ciocâlteu; întregul amestec a fost agitat şi după aceea lăsat

timp de 30 de minute. Extincţia s-a citit la o lungime de undă de 660 nm, faţă de un martor ce

conţinea 20μl de apă distilată în loc de 20μl de omogenat. Rezultatele au fost deasemenea

raportate la o curbă etalon, curbă construită pe baza unor concentraţii proteice cunoscute (prin

metoda descrisă anterior).

Pagina 53 din 59


Pagina 54 din 59


5.3.Rezultate şi discuţii

Variaţia concentraţiei de acid folic: în funcţie de vârstă şi organ

Acid folic

Concentraţie

(valoare ±eroare)

Proteine

Concentraţie

(valoare±eroare)

Organ Grupa de

vârstă

μg de acid folic/g

de ţesut

μg de acid

folic/mg de

proteine

mg de proteină/ml

omogenat

Ficat

tânăr 431,48±4,76 25,74±1,76 2,80±0,99

adult 322,07±3,36 30,12±1,12 2,71±0,43

bătrân 195,52±2,83 18,54±2,55 2,11±0,33

Rinichi

tânăr 333,13±8,08 27,93±6,54 2,13±0,41

adult 208,57±4,54 20,37±3,88 1,25±0,13

bătrân 227,31±2,03 46,73±9,07 1,13±0,13

Pagina 55 din 59


Creier

tânăr 336,36±9,23 29,04±1,43 2,06±0,72

adult 110,48±3,17 27,81±2,87 1,61±0,33

bătrân 27,08±2,31 7,44±2,77 1,23±0,27

Splină

tânăr 120,73±1,68 20,03±3,88 1,07±0,04

adult 109,03±9,74 17,08±2,53 1,13±0,17

bătrân 91,53±3,83 6,41±1,74 1,25±0,28

Variaţia concentaţiei de acid folic pe grupe de vârstă exprimată în μgAF/g de ţesut

Pagina 56 din 59


Variaţia

concentaţiei de acid folic pe

grupe de vârstă exprimată

în μgAF/mg prot.

Variatia concentratiei de acid folic pe grupe de varsta exprimata in μg AF/g de tesut

Variaţia concentraţiei de acid folic pe grupe de vârstă

Din studiul grafic al variaţiei concentraţiei de acid folic pe grupe de vârstă (exprimată

în μg de AF/g de ţesut) s-a observat o scădere gradată de la tineri spre adulţi şi spre bătrâni,

cu excepţia concentraţiilor de acid folic din omogenatul din rinichi. În acest caz particular

concentraţia de acid folic scade de la tineri la adulţi, ca apoi să crească paradoxal la şobolanii

bătrâni.

Sunt două posibile explicaţii prentru aceste variaţii neaşteptate.

prezenţa unei concentraţii crescute de folaţi în omogenatul de rinichi la tineri;

Pagina 57 din 59


prezenţa unei concentraţii scăzute de proteine în acest omogenat.

Dintre aceste două ipoteze ultima este mai plauzibila. Această ipoteză

s-a justificat prin corelarea cu valorile calculate a concentraţiilor proteinelor din

omogenatul de rinichi de la tineri şi de la adulţi.

În ceea ce priveşte concentraţiile de acid folic din creier nu are valoare faptul că s-a

obţinut o scădere a concentraţiilor de acid folic (de aproximativ trei ordine de mărime) de la

tineri spre adulţi.

Variaţiile concentraţiilor de acid folic în funcţie de organ:

Din toate tipurile de reprezentări grafice, pe grupe de vârstă, rezultă faptul că

indiferent de modalitatea de exprimare a acidului folic (μg acid folic/g de ţesut sau μg acid

folic/ mg de proteine) nivelul cel mai crescut de folaţi s-a obţinut în omogenatul de ficat;

aceste rezultate sunt în concordanţă cu studiile histologice făcute anterior (Onicescu şi colab.,

1979) şi cu nivelul activităţii metabolice din ficat (implicând metabolismul hepatic a unei

singure unităţi carbonice).

S – au obţinut cantităţi mult mai mari de acid folic în ficat şi rinichi, faţă de valorile

corespunzătoare din splină şi creier.

Pagina 58 din 59


Variaţiile concetraţiilor de acid folic în funcţie de organ (exprimate în μg AF/mg de

proteine)

Concluzii

În acest studiu s-a dovedit o incidenţă crescută a deficitului de acid folic la bătrâni,

deficit cauzat în principal de malnutriţie. Este necesară o evaluare ulterioară pentru a

demonstra rolul patogenic a deficitului de acid folic în diferite sindroame clinice la bătrâni

(ca de exemplu deficite imunologice şi neuropsihiatrice). Tabloul clinic nespecific al

malnutriţiei la bătrâni (care este adesea greşit diagnosticată) însoţit de deficienţă de folaţi

induc homocisteinemia şi se asociază cu un risc crescut cardiovascular. Aceste observaţii sunt

argumente în favoarea următoarelor concluzii:

stării nutriţionale a bătrânilor trebuie să i se acorde o mai mare importanţă decât unui

diagnostic de rutină

soluţia este suplimentarea de acid folic la bătrâni (măcar la pacienţii cu risc de a

dezvolta o deficienţă de acid folic, la pacienţi instituţionalizaţi la geriatrie, la pacienţii ce

consumă mâncare conservată etc.); această soluţie este atât sigură cât şi ieftină (singura

reacţie adversă a fost observată la epileptici).

Pagina 59 din 59


Pagina 60 din 59

http://www.tocilar.ro/

Documents

Stiudiu de caz privind acidul folic si a derivatilor