Stom Proteine-Enzime Rom

8/9/2019 Stom Proteine-Enzime Rom

1/19

CATEDRA BIOCHIMIE I BIOCHIMIE CLINICINDICAII METODICE

FACULTATEA STOMATOLOGIE, ANUL I Pag. 1/ 19

Analizat i aprobatlaedina catedrei

din 28.01.2015, proces verbal nr.11

eful Catedrei Biochimiei Biochimie ClinicTagadiuc O., conf. universitar, dr. hab. n medicin

____________________

Indicaia metodicnr. 1Tema nr. 1: Convorbire introductiv.

Importana biochimiei pentru disciplinile medicale.Aminoacizii structura, clasificarea i rolul biomedical.

Experiena 1. Identificarea aminoacizilor ce conin sulf (reacia Fol)Principiul metodei: Ladegradareaproteinelor i peptidelor sub aciunea hidroxidului de sodiu

din gruprile sulfhidril se elibereaz sulful sub form de sulfur de sodiu, care reacionnd cuplumbitul de sodiu, formeazprecipitatul de sulfurde plumb de culoare neagrsau brun.Mod de lucru: La 5 picturi de ovalbuminse adaug5 picturi de reactiv Fol. Amestecul se

pune la fiert. Dup1-2 minute de fierbere apare un precipitat negru sau brun de sulfurde plumb(PbS).

Rezultat:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Concluzie:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Experiena 2. Reacia xantoproteic(Mulder)Principiul metodei: Aminoacizii aromatici la fierbere cu HNO3concentrat se supun nitrrii.

Ca rezultat soluia capo culoare galbencare trece n oranj la adugare bazei.Mod de lucru: La 5 picturi de ovalbuminse adaug3 picturi de HNO3concentrat. n urma

fierberii, coninutul eprubetei se coloreazn galben. Dacduprcire n eprubetadugm 10-15picturi soluie de NaOH 20%, culoarea soluiei devine oranj ca rezultat al obinerii srii de sodiu adinitrotirozinei.

Rezultat:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Concluzie:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Experiena 3. Reacia cu ninhidrinPrincipiul metodei: Ninhidrina interacionez cu gruprile alfa-amino ale proteinelor i

aminoacizilor cu formarea unui compus colorat n albastru-violet.Mod de lucru: La 5 picturi de ovalbuminse adaug5 picturi soluie de ninhidrin0,5%.

Coninutul eprubetei se fierbe 1-2 minute. n cazul prezenei grupelor alfa-amino apare o culoare roz-violet, care trece apoi n albastr.

Rezultat:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Concluzie:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________


2/19



Experiena 4. Reacia biuretic(Piotrovschi)Principiul metodei: Legturile peptidice (-NH-CO-) ale proteinelor n mediul alcalin

interacioneazcu CuSO4formnd compui compleci colorai n rou- violet.Mod de lucru: La 5 picturi de ovalbuminse adaug5 picturi soluie de NaOH 10% i 2

picturi soluie de CuSO41%. Eprubeta se agit. Apare culoarea violet.Rezultat:____________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________

Concluzie:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Nivel iniial de cunoatere:1. Structura i proprietile aminoacizilor proteinogeni.

ntrebri pentru autopregtire:1. Obiectul biochimiei i importana n medicina practic, inclusiv, stomatologie.2.

Particularitile materiei vii. Proprietile generale de biomoleculelor.3.

Aminoacizii proteinogeni i neproteinogeni. Clasificarea aminoacizilor proteinogeni dupstructura chimic, proprietile fizico-chimice i biologic. Aminoacizii de interes stomatologic:prolina, hidroxiprolina, lizina, hidroxilizinz, alizina, acidul -carboxiglutamic strcutura i rolulbiologic.

4.

Teoria polipeptidic a structurii proteinelor, esena ei i dovezile experimentale. Modul delegtur a aminoacizilor n molecula proteic. Notarea i citirea aminoacizilor n peptide iproteine. Aminoacizii N i C terminali.

Probleme de situaie1. Divizai urmtorii aminoacizi n grupe conform clasificrii biologice: Thr, Cys, Phe, Gln, his, Met,

Gly, Arg. Scritei peptida formatdin aminoacizii indispensabili. Dai definiia noiunii, indicaice aminoacizi se referla acest grup i care sunt sursele acestor aminoacizi?

2.

Gasii care aminoacizi sunt n concentraii crescute n sange i urinn urmtoarele aminoaciduriiprimare prin flux crescut. Completati tabelul conform modelului.

Denumire boalaAminoacizi crescuin sange i n urin

Enzima defect Manifestri clinice

Fenilcetonurie Fenilalanina Fenilalaninhidroxilaza/dihdropterin reductaza

Retard mental,convulsii, eczema

Boala urinei cumiros

de sirop de arar

Hiperlizinemie

http://biochimia.usmf.md/info-studenti/indicatii-metodice


3/19



Hiperprolinemie

Hidroxiprolinemie

Teste pentru autoevaluare1.

Selectai polimerii biologici:a.

nucleozidele;b. aminoacizii;c.

glucoza;d.

ADN;e.

Colagenul.2. Ce grupe de aminoacizi sunt prezente n proteine?

a.

hidroxiaminoacizii;b.

aminoacizii homociclici;c. beta-aminoacizi;d.

aminoacizii diaminodicarboxilici;e.

aminoacizii seriei D.3. Unitile constituente ale aminoacizilor ntlnite n lanul polipeptidic sunt:

a.

purina;b.

tiofen;c.

imidazol;d.

pirimidin;e.

scatol.

4. Selectai aminoacizii hidrofobi nepolari:a.

Ser;b. Val;

c.

Ile;d. Trp;

e.

Glu.

5. Selectai aminoacizii bazici:a.

Ala;b. Ser;

c.

Tyr;d. Gln;

e.

Lys.

6. Afirmaiile corecte referitor la serinsunt:a.

este un hidroxiaminoacid;b. are punctul izoelectric n zona de pH bazic;c.

intra n categoria aminoacizilor neesentiali sau dispensabili;d. intra n categoria aminoacizilor esentiali sau indispensabili;e. n solutiile cu pH=4 migreazspre anod.

7. Care afirmaii sunt corecte referitor la arginin?a. la pH=3 are sarcinnegativ;

b.

are pH-uI izoelectric n mediul bazic;c. n formhidroxilatintrn structura colagenului;d. este un aminoacid acid;e. are n structurun rest de guanidin.

8. Care afirmaii sunt corecte referitor la metionin?a. este un derivat al acidului butanoic;b. n structura sa sulful este slab fixat;c.

la pH izoelectric aminoacidul migreazspre catod;d. n solutiile cu pH-ul mai mic dect pI migreaza spre anod;e. este un aminoacid neesenial.


4/19



Indicaia metodicnr. 2Tema: Structura proteinelor. Clasificarea proteinelor.

Caracteristica generala proteinelor simple i conjugate.Proteinele fixatoare de calciu.

Experiena 1. Identificarea aminoacizilor prin metoda cromatografiei pe hrtie.Principiul metodei: Metoda se bazeaz pe diferena coeficientului de repartiie a amino-

acizilor n ap i solvent organic (butanol), care nu se amesteccu apa. Viteza migrrii amino-acizilorpe hrtie este direct proporionalcu gradul de dizolvare n solventul organic (butanol).

Mod de lucru:1.

Pe banda de hrtie cromatograficcu creionul simpluse noteazlinia de start(aproximativ la 1cm).

2.

Pe linia de start cu ajutorul capilarului se aplico pictur de amestec de aminoacizi (pata nu maimare de 5 mm).

3.

Dupuscare la aer (fixare), banda se introduce ntr-un vas nchis cu amestec butanol-acid acetic-ap, astfel nct lichidul snu depeasc linia de start (5 mm). Cu ajutorul dopului banda sefixeazvertical, fsatingpereii vasului.

4.

Dup1,5 ore de incubare la temperatura camerei, banda se scoate din vas, se noteazcu creionulsimpluhotarul solventului i se usucn termostat (10 minute la temperatura de 70-100C).

5. Banda se trece prin soluia alcoolicde ninhidrinde 0,2%.6.

Banda se usuc n termostat la temperatura de 100C. Pe cromatogramapar pete violete saugalbene, localizate la diferite distane de linia de start.

7. Cu ajutorul riglei se msoarurmtoarele distane: de la linia de start pnla centrul fiecrei pete distana parcursde aminoacid (a); de la linia de start pnla hotarul solventului distana parcursde solvent (b).

8.

Raportul dintre distanele parcurse de aminoacid (a) i de solvent (b) poart denumirea decoeficient de repartiie(R), care este specific pentru fiecare aminoacid n condiii standard i secalculeazastfel: Rf=a/b. Duptabelul cu Rf standard identificm aminoacidul.

Valorile Rf standardAminoacidul Rf Aminoacidul Rfhistidina 0,11 cysteina 0,40glutamina 0,13 prolina 0,43lizina 0,14 tirozina 0,45arginina 0,20 asparagina 0,50acidul aspartic 0,24 metionina 0,55

glicina 0,26 valina 0,61serina 0,27 triptofan 0,66acidul glutamic 0,30 fenilalanina 0,68treonina 0,35 izoleucina 0,72alanina 0,38 leucina 0,73

Valoarea diagnostic. Metoda permite determinarea att calitativ, ct i cantitativ aaminoacizilor n obiectele biologice, ce permite aprecierea metabolismului aminoacizilor i cel alproteinelor. n diferite afeciuni ereditare (fenilcetonurie, tirozinemie, cistinozetc.) i dobndite aleficatului, rinichilor i altor organe se constatmodificarea coninutului de aminoacizi n lichidelebiologice (serul sanguin, urin, lichid cefalorahidian etc.)

Rezultat:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________



5/19



Concluzie:__________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________

Nivel iniial de cunoatere:1. Legturile chimice intra- i intermoleculare: covalente, de hidrogen, ionice, hidrofobe, forele

van der Waals mecanismele formrii lor.2. Histonele tipurile, rolul biologic.

ntrebri pentru autopregtire:1.

Funciile proteinelor. Rolul proteinelor n meninerea integritii sistemului stomatognat.2.

Nivelurile de organizare a moleculei proteice: structura primar, secundar, teriar i cuaternar;legturile specifice acestor structuri, aminoacizii ce participla formarea lor. Noiuni generale

despre structura domenic.3.

Clasificarea proteinelor.4. Proteinele simple, proprietile, particularitile structurale.5.

Proteinele conjugate: cromoproteinele, nucleoproteinele, fosfoproteinele, lipoproteinele,glicoproteinele i metaloproteinele caracteristica lor general. Exemple.

6.

Colagenul: particularitile componenei aminoacidice i structurale.7.

Proteinele fixatoare de Ca2+. Particularitile compoziiei aminoacidice ce determin fixareacalciului. Rolul acestor proteine n organism.

Probleme de situaie:1. Scriei urmtoarele peptide: a) pro-cis-ala, b) cis-pro-ala. Evideniai legturile peptidice clasice

i atipice i indicai asemrile i deosebirile lor. Care sunt aminoacizii N- i C-terminal i cumsunt ei identificai? Cum se numesc i cum se noteazaceste peptide?

2. Ce modificare a structurii hemoglobinei este caracteristicpentru anemia cu celule falciforme?Care sunt cauzele acestei modificri? Ce repercusiuni are modificarea structurii primare asupranivelurilor superioare structurale, funciei proteinei i a strii eritrocitelor?


6/19



3. Explicai, de ce complexul nucleoproteic nucleozomul, este stabilizat de legturi ionice.

4. Care sunt deosebirile dintre glicoproteine i proteoglicani?a.

b.

c.

5.

Colagenul, osteocalcina, calmodulina, factorii plasmatici ai coagulrii II, VII, IX i X etc. suntproteine fixatoare de calciu. Ce particularitate structuralcomunposedaceste proteine. Carevitamin asigur realizarea acestei proprieti? Scriei reacia respectiv. Care sunt surselevitaminei? Rolul acestor proteine n organism.

Teste pentru autoevaluare:1.

Structura primara proteinei:a.

prezinto succesiune de aminoacizi unii prin legturi peptidice;b. fiecare aminoacid se poate include n lannumai o singurdat;c. se distruge la denaturare;d.

nu este afectatde hidroliza;e. reprezintforma activbiologic a moleculei.

2.

Structura secundara proteinei prezint:a. aranjamentul intr-o structurordonat;b. e stabilitde interaciuni hidrofobe i ionice;

c.

este alfa helixul i beta structur;d. nu este stabilizatde legturi de hidrogen;e. este stabilizatde legturile peptidice.

3.

Referitor la structura teriarsunt corecte urmtoarele afirmaii:a.

este modalitatea de mpachetare 3D a moleculei proteice;b.

domeniile se includ in structura respectiv;c. domeniile determinfuncii speciale n protein;d.

radicalii AA nu contribuie la stabilizarea structurii teriare;e. e posibilinteraciunea ntre radicalii AA-Ser - Ser.

4. Structura cuaternar:a.

este organizarea subunitilor ntr-o moleculproteicunicfuncional;b.

se formeazgraie legturilor necovalente dintre suprafeele de contact ale domeniilor;



7/19



c. este rigid i nu se modificn timpul exercitrii funciei;d.

se realizeazexclusiv prin legturi covalente;

e.

molecula proteicposedmobilitate i suferfluctuaii conformaionale cooperatiste.

5. Selectai oligomerii:a. hemoglobina (Hb);b. mioglobina;c. LDH (lactatdehidrogenaza);d.

Imunoglobulinele;e.

creatinkinaza.

6. Selectai perechile corecte: monomeri oligomeri:a.2 HbA1;

b.

H2M2 LDH1;c.H3M1 LDH5;d.

2 fibrinei;e.

2 HbA1.

7.

Colagenul:a. circa 1/3 din aminoacizi sunt reprezentai de glicin;b.

secvena AA din lanul polipeptidic este de tipul (Gly-X-Y)n;c. lanul polipeptidic e constituit dintr-un numar mic de radicali ai AA;d. lanul polipeptidic prezintconformaie de alfa-elice clasic;e.

unitatea structuraldin care se asambleazfibrele este pro-tropocolagenul.

8.

Tropocolagenul (TC):a.

este unitatea structurala colagenului i elastinei;b. molecula de TC reprezintun helix triplu rsucit spre dreapta;c.

moleculele de TC sunt aranjate n trepte i deplasate una fade alta cu din lungimea lor;d.

TC este stabilizat de legaturi de hidrogen i disulfidice;e. are lungimea de 3000 nm i diametrul de 30 nm.

9. Colagenul tip I:a.

este unul din tipurile nefibrilare de colagen;b.

este format doar din catene primare de tip 1;c.

este prezent n piele, tendoane, oase, ligamente, dentin, tesuturile interstiiale;

d.

formeazfibre de diametru mic;e.

este sintetizat de osteoblaste i fibroblaste.

10.Osteocalcina (OCal):a.

este o proteinfixatoare de calciu;b. este un factor plasmatic al coagulrii;c.

esteo proteinnecolagenica esuturilor mineralizate;d.

fixeazde regul10 ioni de calciu;e. contribuie la includerea calciului n reeaua cristalina apatitei.


8/19



Indicaia metodicnr. 3Tema: Proprietile fizico-chimice ale proteinelor.

Metodele de separare i purificare ale proteinelor

Experiena 1. Dializa proteinelorPrincipiul metodei: Metoda se bazeazpe separarea macromoleculelor din soluiile coloidale

de substanele micromoleculare cu ajutorul membranelor semipermeabile, care pot fi traversate demicromolecule, dar sunt impermeabile pentru macromolecule.

Mod de lucru:1.

ntr-un balon se toarn 20 ml soluie de ovalbumin la care se adaug 20 picturi de soluiesaturatde sulfat de amoniu.

2.

Dintr-o foide celofan, umezitn prealabil cu apdistilat, se confecioneazun sculen carese toarnconinutul balonului.

3.

culeul se introduce ntr-un pahar cu apdistilat i se cufundastfel ca nivelul de lichid nculesfie mai jos de nivelul apei n pahar.4. Se efectueazdializa timp de 90 minute.5.

La finele dializei se iau cte 1 ml de soluie din scule i din vas i se transfern 2 eprubete.6.

Cu ambele soluii se efectueazreacia de identificare a ionului sulfat cu BaCl2: la 5 picturi desoluie de cercetat se adaug3-4 picturi soluie de BaCl2de 5%. n prezena ionului sulfat, reaciaeste pozitiv i se observapariia precipitatului de BaSO4, conform ecuaiei:

(NH4)2SO4+ BaCl2= 2NH4Cl + BaSO4

7. Cu ambele soluii se efectueazreacia biureticcu scopul identificrii proteinelor: la 5 picturide soluie de cercetat se adaug5 picturi de NaOH de 10% i 2 picturi de CuSO4de 1%. nprezena legturilor peptidice (-NH-CO-) ale proteinelor soluia se coloreazn roz-violet.

8.

Rezultatele experienei se introduc n urmtorul tabel i se trage concluzia despre capacitateamoleculelor, ce se deosebesc dup masa molecular i dimensiuni de a traversa membranelesemipermeabile.

Valoarea diagnostic:Rezultat:

Soluiacercetat

Substaneleprezente pnla

dializ

DIALIZA

Reaciabiuretic

Reacia cuBaCl2

Substaneleprezente dup

dializ

Soluiadin scule

Protein(ovalbumin),

(NH4)2SO4Soluia din

vas H2O

Concluzie:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Nivel iniial de cunoatere:1.

Proprietile amfotere ale aminoacizilor. Sarcina electrica aminoacizilor. Factorii ce determinsarcina electrica aminoacizilor.


Masa moleculara proteinelor. Noiuni generale referitor la metodele de determinare a masei

moleculare a proteinelor.2.

Proprietile amfotere ale proteinelor. Sarcina electric a proteinelor. Factorii ce determin



9/19



sarcina proteinei. Punctul i starea izoelectric.3.

Solubilitatea proteinelor. Proprietile hidrofile ale proteinelor n funcie de componena

aminoacizilor i de particularitile structurale. Factorii de stabilizare n soluie a substanelorcoloidale. Starea soluiilor coloidale: sol, gel, xerogel. Exemple.

4.

Saliva soluie coloidal proteic. Proprietile salivei determinate de prezena proteinelor.Originea, reprezentanii i rolul biologic al proteinelor salivare.

5. Denaturarea proteinelor, agenii ce provoacdenaturarea. Modificrile structurale ale proteinei ladenaturare.

6.

Metodele de studiere a componenei calitative i cantitative a proteinelor: a) hidroliza; b) croma-tografia; c) electroforeza; d) salifierea; e) dializa.

7.

Importana biomedicala metodelor de evaluare calitativ i cantitativa proteinelor.

Probleme de situaie

1.

Care sunt asemrile i deosebirile structurale i funcionale ale mioglobinei i hemoglobinei?Care este nivelul normal al hemoglobinei sangvine? Ce tip de hipoxie se dezvolt n carenelehemoglobinei?

2.

Divizai n grupe conform solubilitii urmtoarele proteine: albumina, hemoglobina, keratina,transferina, IgM, fibrina, protombina, colagenul. Ce factori influeneazsolubilitatea proteinelor?

Solubile Insolubile

3. ntr-o soluie sunt dizolvate histone i albumine. Alegei soluia tampon care trebuie utilizat

pentru precipitarea fiecrui tip de protein: sol. 1 pH=4,0; sol. 2 pH=7,0; sol. 3 pH=11,0.Care este mecanismul acestei metode de separare a proteinelor individuale din amestecuri?

4.

O soluie ce conine un amestede albumine i globuline este tratatcu soluie de sulfat de amoniu([NH4]2SO4) pnla semisaturare, iar ulterior pnla saturare. Ce efecte va avea aceasttratareasupra solubilitii albuminelor i globulinelor? Care este mecanismul de aciune a (NH4)2SO4asupra soluiei proteice?


10/19



5. Spre care electrod vor migra albuminele, globulinele i histonele la pH=7,0, daclinia de starteste la mijlocul distanei dintre anod i catod? Explicai.

6.

Ce caracter hidrofil sau hidrofob, are fragmentul -Gly-Ser-Asn-Trp-Tyr- din structura primara unei proteine? n conformaia proteinei secvena este localizat n interiorul structurii sau lasuprafaa ei? Explicai, de ce. Scriei structura secvenei.

Teste pentru autoevaluare:1. Solubilitatea proteinelor:

a. proteinele fibrilare sunt uor solubile n apa pur;b.

depinde de sarcina electric i membrana apoas;c.

depinde de natura solvenilor i temperatura lor;d. proteinele fibrilare sunt mai solubile ca cele globulare;e.

este maximn punctul izoelectric:2. Stabilitatea proteinei n soluie e determinatde:

a. membrana apoas, ce apare la hidratarea grupelor funcionale hidrofile;b.

sarcina electric, dependentde pH-ul mediului;c. sarcina electric, dependentde radicalii hidrofobi a aminoacizilor;d. membrana apoas, ce apare la hidratarea grupelor funcionale hidrofobe;e.

sarcina electric, dependentde aminoacidul N i C terminal.3. Condiiile de sedimentare ale proteinelor sunt:

a. nlturarea membranei apoase;

b.

neutralizarea sarcinei electrice;c. aducerea proteinei bazice la pI prin adaus de acid;d. aducerea proteinei acide la pI prin adaus de baza;e. deteriorarea membranei apoase prin nlturarea apei imobilizate.

4. Salifierea:a.

este hidratarea moleculei proteice;b. este dehidratarea moleculei proteice;c. este un proces ireversibil;d.

este trecerea micromoleculelor prin membrana semipermeabil;e. se distruge structura teriara proteinei.

5. Afirmaii corecte referitor la molecula proteicdenaturatsunt:a.

se distruge structura primar;b.

crete activitatea biologic;c.

se distruge structura teriar i cuaternar;



11/19



d. se distrug legturile peptidice;e.

nu se modificstarea nativ.

6. Sarcina neta proteinei depinde de:a. Componena aminoacidic;b.

pH-ul soluiei;c. grupele -COOH i -NH2terminale ale lanului polipeptidic;d. grupele -COOH i -NH2ale radicalilor aminoacizilor;e. radicalii hidrofobi.

7. Selectai proteinele exclusiv salivare:a.

mucinele;b.

lactoferina;c.

transferina;d. cistatinele;

e.

imunoglobulinele.8. Care din proteinele salivare enumerate sunt enzime?a. -amilaza;b.

lactoferina;c. cistatinele;d.

lizocimul;e. kalikreina.

9. Cu scop diagnostic n salivpot fi determinate urmtoarele proteine:a. proteina C-reactiv;b.

-amilaza pancreatic;c. IgA secretorie;d.

lactoferina;e.

ceruloplasmina.

Indicaia metodicnr. 4Tema: Natura chimic i structura enzimelor.

Vitaminele ca coenzime. Mecanismul de aciune al enzimelor

Experiena 1. Identificarea vitaminelor B1, B2, B6, PP (B5).

a) Identificarea vitaminei B1 (tiaminei).Principiul metodei: Lainteraciunea tiaminei cu diazoreactivul n mediul alcalin se formeaz

un compus complex de culoare oranj.Mod de lucru: La 5 picturi de diazoreactiv (care constdin volume egale de soluie de acid

sulfanilic 1% i soluie de nitrit de sodiu 5%), se adaug1-2 picturi soluie de cercetat. nclinndeprubeta se picuratent pe pereii ei 5-7 picturi de carbonat de sodiu (Na2CO3) 10%. La hotaruldintre lichide apare un inel colorat n oranj, dacsoluia de cercetat conine tiamin.

Rezultat:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

b) Identificarea vitaminei B2 (riboflavinei).Principiul metodei: Vitamina B2posedproprietatea de a se reduce. n formoxidatvitamina

are culoare galben, la nceputul reaciei de reducere roz, iar forma redusa vitaminei este incolor.Mod de lucru: ntr-o eprubetse iau 10 picturi de soluie de cercetare, se adaug5 picturi de

acid clorhidric concentrat i o granulde zinc metalic. Se observdegajarea bulelor de hidrogen,lichidul galben se coloreaztreptat n roz, dupcare se decoloreaz, dacsoluia de cercetare conineriboflavin.

Rezultat:____________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________


12/19



c)

Identificarea vitaminei PP (B5acidului nicotinic sau nicotinamidei)Principiul metodei: La interaciunea vitaminei PP cu acetatul de cupru se formeaz un

precipitat albastru al srii de cupru a acidului nicotinic.Mod de lucru: ntr-o eprubetse iau 20 picturi de soluie de cercetare se agit i se nclzete

pnla fierbere. Se agitsoluia de acetat de cupru 5% i se adaug20 picturi la soluia fierbinte decercetare. Eprubeta se nclzete din nou pnla fierbere i ulterior se rcete ntr-un jet de aprece.La fundul eprubetei se depune un precipitat de culoare albastrde sare de cupru a acidului nicotinic,dacsoluia de cercetare conine vitaminPP (B5).

Rezultat:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

d)

Identificarea vitaminei B6(piridoxinei)Principiul metodei: La interaciunea vitaminei B6 cu clorura de fier se formeaz o sare

complexde tipul fenolatului de fier de culoare roie.Mod de lucru: La 5 picturi soluie de cercetare se adaugun volum egal soluie de clorurde

fier 1%. Amestecul se agit. Apare o coloraie roie, dacsoluia de cercetare conine piridoxin.Rezultat:____________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________

Concluzii:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Experiena 2. Dozarea vitaminei C (acidului ascorbic) n urin.

Principiul metodei: Vitamina C posed capacitatea de a reduce 2,6-diclorfenolindofenolul(2,6-DCPIP), ce determinschimbarea coloraiei soluiei cercetate:Acid ascorbic + 2,6-DCPIP oxidat (coloraie albastr)

Acid dihidroascorbic + 2,6-DCPIP redus (coloraie roz).Mod de lucru: ntr-un balon se iau 10 ml urin, 10 ml apdistilat i 20 picturi soluie de HCl

de 10%. Amestecul se titreazcu soluie de 2,6-DCPIP 0,001 N pnla apariia culorii roz.Calculul: Cantitatea vitaminei C n urina cercetatse determindupformula:

C (mg/24ore) = (0,088 A C) / Bunde: 0,088 coeficientul de recalculare;

A cantitatea de 2,6-DCPIP consumatla titrarea probei;B cantitatea de urinutilizatn experien(10 ml);C diureza nictimeral(n medie 1500 ml la brbai i 1200 ml la femei).

Rezultat:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Concluzie:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Valoarea diagnostic: Peroxidazele constituie un important factor al proteciei antibacteriene iantioxidante a cavitii bucale.

Nivel iniial de cunoatere:1.Noiune de cataliz. Rolul i proprietile catalizatorilor neorganici.



13/19


14/19



Teste pentru autoevaluare:1. Centru activ al enzimelor reprezint:

a.

o linie frntn molecula enzimei;b. un plan in molecula enzimei;c.

o structurcompus, unical, tridimensional;d. un punct din structura teriara;e. locul unde se fixeazmodulatorii.

2. Centru activ al enzimelor:a. este partea enzimei care fixezesubstratul;b. grupele funcionale aparin aminoacizilor amplasai succesiv n lanul polipeptidic;c. n centrul activ se fixeazactivatorul sau inhibitorul;d. centrul activ se formeaznumai pe baza structurii cuaternare;e. centrul activ se formeaznumai pe baza structurii teriare.

3. Indicai afirmrile corecte referitor la substrat (S):a)

e substana asupra careia acioneazenzima;b) este inhibitor sau activator al enzimei;c)

toate enzimele fixeazdoar un singur substrat;d)

unele enzime interacioneazcu cteva substrate;e) este legat de centru activ prin legturi covalente.

4. Centrul alosteric:f) este separat spaial de centrul activ;g) este locul fixrii substratului;h)

este caracteristic tuturor enzimelor;i) este sinonimul centrului activ;j) este locul n care se fixeazactivatorii i inhibitorii.

5. Enzimele alosterice:a) modulatorii se leagcovalent n centrele alosterice;b)

cinetica reaciilor alosterice e asemtoare cu cea a enzimelor obinuite;c) efectorii fixndu-se nu modificconformaia moleculei enzimei;d) modulatorii se leagcovalent n centrul activ al enzimei;e)

modulatorii modificconformaia moleculei enzimei.6. Referitor la mecanismul de aciune al enzimelor sunt corecte afirmaiile:

a) scad energia de activare a reaciei;b)

are loc formarea complexului enzima-substrat [ES]c) complexul ES este o structura rigid, stabil;d) complexul ES este o structurinstabil;

e)

formarea complexului ES este prima etapa mecanismului de aciune.7. Mecanismul de aciune al enzimelor, afirmaiile corecte:a)

n complexul ES substratul nu se modific;b)

n complexul ES substratul se deformeaz;c)

n centrul activ al enzimi are loc cataliza covalent;d)

n centrul activ al enzimei are loc cataliza acido-bazic;e)

la interaciunea substratului i enzimei se modificatt structura enzimei, ct i a substratului.



15/19



Indicaia metodicnr. 5Tema: Proprietile generale ale enzimelor.

Determinarea activitii enzimatice. Enzimele salivare

Experiena 1. Determinarea activitii -amilazei urinare cu substrat stabil de amidon(metoda Caraway).

Principiul metodei: -amilaza scindeazamidonul cu obinerea produilor finali care nu secoloreazcu soluia de iod. Activitatea amilazei se apreciazdupmicoararea cantitii de amidonscindat.

Mod de lucru: Experiene se efectueazn eprubete calibrate de 10 ml!

Nr. Reagent Eprubeta de experien Eprubeta martor1. Soluie de amidon 1 ml

(conine 0,0004 g amidon)

1 ml

(conine 0,0004 g amidon)2. Incubare 5 minute n baia de aplatemperatura de 370C

-

3. Urin 0,02 ml -4. Amestecul se agit ise introduce din nou n baia de apla 370C exact 7,5 minute

(calculul timpului se face din momentul adugrii urinei)5. Soluie de iod 1 ml 1 ml6. Urin - 0,02 ml7. H2O dist. pnla 10 ml pnla 10 ml8. Imediat se determindensitatea opticasoluiilor din eprubeta de martor (Em) i de

experien(Eexp)faa de apa distilatla fotocolorimetru (filtrul rosu, =630-690 nm)

n cuve de 10 mm.Calculul: n unitii SI activitatea amilazei se exprim n grame de amidon hidrolizat decantitatea de enzimcare se conine ntr-un litru de urintimp de o orde incubare la temperatura de370C. Calculul se face conform formulei:

Activitatea amilazei (g/orL) = [(Em Eexp) / Em] 0,0004 8 50000 = [(Em Eexp) / Em] 160,

unde:Em extincia probei martor,Eexp extinia probei de experien;0,0004 cantitatea de amidon n prob(g);8 coeficientul de transformare la o orde incubare (60 min : 7,5 min = 8);50000 coeficientul de transformare la 1 L de urin(1000 ml : 0,02 ml = 50000).

Rezultat:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Concluzie:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Valorile normaleale activitii amilazei din urin 20-160 g/orLValoarea diagnostic. n pancreatitele acute i parotitele epidemice se observ creteri

importante ale -amilazei n snge i urin. Creteri moderate se depisteaz n pancreatitelecronice, litiazpancretic, tumori ale pancreasului, litiazbiliar, ulcerul gastric, insuficienrenalcronic i, uneori, dupadministrarea de opiacee (morfina, codeina, papaverina etc.).


16/19




Specificitatea enzimelor.

2.

Cinetica enzimatic. Influena concentraiei enzimei i a substratului, a pH-ului i a temperaturiiasupra activitii enzimatice.

3.

Inhibiia activitii enzimelor (specific i nespecific, reversibil i ireversibil, competitiv,necompetitiv i noncompetitiv).

4. Reglarea activitii enzimelor (reglarea alosteric, reglarea covalent, proteoliz parial,autostructurarea cuaternar). Importana principiului de retroinhibiie.

5.

Organizarea enzimelor n celul(ansamblurile enzimatice, compartimentalizarea). Deosebirile ncomponena enzimatica organelor i esuturilor. Enzimele organospecifice.

6.

Principiul determinrii activitii enzimelor. Unitile de activitate a enzimelor. Modificareaactivitii enzimatice n diferite afeciuni (enzimodiagnosticul).

7. Enzimele salivei reprezentanii principali, funciile lor, originea, modificrile activitii lor n

afeciunile sistemului stomatognat i de altnatur.

Probleme de situaie:1.

Ce tip de specificitate este caracteristic pentru urmtoarele enzime: carboanhidraza, fumaraza,amilaza, ureaza, alcool dehidrogenaza, monooxigenaza microzomal? Scriei reaciile catalizatede 3 dintre enzimele nominalizate.

2.

Oxidazele L-aminoacizilor catalizeaztransformarea diferitor L-aminoacizi, dar nu pot oxida D-aminoacizii. Ce tip de specificitate posedaceste enzime? Ce este caracteristic pentru acest tip despecificitate? Ce alte enzime umane posedacest tip de specificitate?

3. Explicai de ce enzimele proteolitice gastrice i pancreatice se produc i secret n form deproenzime neactive? Care este mecanismul activrii lor?

4. Ce mecanism de aciune posed sulfanilamidele, fluoruracilul i alopurinolul? De ce depindeeficiena tratamentului cu aceste medicamente? Explicai i ilustrai cu formulele corespunztoare.



17/19



5. Aceste enzime posed structur i proprieti fizico-chimice diferite, dar catalizeaz aceeaireacie. Frecvent ele sunt proteine oligomere formate din monomeri diferii. Aceste enzime sunt:

alosterice, izoenzime, proenzime sau zimogeni? Dai exemple concrete de asemenea enzime iexplicai care este valoarea lor clinico-diagnostic.

Teste pentru autoevaluare:1. Mecanismele activrii enzimatice sunt:

a.

proteolizparial;b. modificarea covalent;

c.

autoasamblarea secundar;d.

activarea alosteric;e. activarea prin exces de substrat;

2. Influena pH-ului asupra activitii enzimelor:a.

fiecare enzimare pH-ul su optim;b. pH-ul nu modificactivitatea catalitica enzimei;c.

pH-ul influeneazdisocierea grupelor funcionale ale enzimei;d. pH-ul optim pentru pepsineste de 7-8;e. pH-ul optim al tripsinei este de 1-2.

3. Inhibiia competitiv:a. nu se nlaturprin exces de substrat;b. reprezinto inhibiie ireversibil;c.

inhibitorul este analog structural al substratului;d. e posibilsimultan fixarea substratului i a inhibitorului;e.

inhibitorul se ataeazn centrul alosteric.4. Inhibiia alosteric:

a. apare la enzimele oligomereb.

inhibitorul se unete n centrul activ i schimbconformaia enzimeic. inhibitorul se nlaturprin exces de substratd. enzimele respective preponderent au structurteriare.

inhibitorul se leagn centrul alosteric5. Creatinfosfokinaza (CPK) :

a. este compusdin lanuri M si H, prezentnd 3 izoenzime;

b.

este compusdin lanuri M si B, prezentnd 5 izoenzime;c. este un dimer alctuit din asocierea de lanuri M i B;d. creterea concentraiei serice a formei MB confirminfarctul miocardic;e.

creterea concentraiei serice a formei BB confirminfarctul miocardic.6. Amilaza:

a.

face parte din clasa hidrolazelor;b. este o glicozidaz;c. scindeazlegturile -1,6-glicozidice din amidon i glicogen;d.

hiperactivitatea n snge sugerprezena pancreatitei;e. este sintetizatde celulele stomacului

7. Lipaza:a.

face parte din clasa hidrolazelor;b.

existformele izoenzimatice: lingual, esofageal, stomacal i intestinal;c.

scindeazfosfogliceridele alimentare;


18/19



d. lingualare pH-ul optim de 4,5-5,4;e.

lingualnu necesitemulsionarea lipdelor alimentare de ctre acizii biliari.

8. Succinatdehidrogenaz(SDH):a. face parte din clasa transferazelor;b.

acidul malic provoaco inhibiie ireversibil;c. n inhibiie se modificstructura primara substratului ;d. inhibiia nu depinde de concentraia acidului malic;e. SDH catalizeazreacia: Succinat + FAD Fumarat + FADH2.

Indicaia metodicnr. 6Totalizare pe capitolele I i II

Chimia proteinelor i Enzimele

1.

Obiectul biochimiei i importana n medicina practic, inclusiv, stomatologie.2. Particularitile materiei vii. Proprietile generale de biomoleculelor. Metodele de studiu utilizate

n biochimie.3.

Aminoacizii proteinogeni i neproteinogeni. Clasificarea aminoacizilor proteinogeni dupstructura chimic, proprietile fizico-chimice i biologic. Aminoacizii de interes stomatologic:prolina, hidroxiprolina, lizina, hidroxilizinz, alizina, acidul -carboxiglutamic strcutura i rolulbiologic.

4. Rolul biologic al proteinelor.5.

Teoria polipeptidic a structurii proteinelor, esena ei i dovezile experimentale. Modul delegtur a aminoacizilor n molecula proteic. Notarea i citirea aminoacizilor n peptide iproteine. Aminoacizii N i C terminali.

6.

Peptidele biologic active: rolul biologic, exemple.7.

Nivelurile organizrii structurale a moleculei proteice. Structura primara proteinelor. Legturapeptidic: strucutra, tipurile, proprietile ei. Modificrile ereditare ale structurii primare iimpliciile biomedicale (anemia falciform).

8. Nivelurile organizrii structurale a moleculei proteice. Structura secundara proteinei: tipurile,legturile ce stabilizeazstructura secundar.

9.

Nivelurile organizrii structurale a moleculei proteice. Structura teriara proteinei. Tipurile delegturi intramoleculare n protein. Proteinele globulare i fibrilare particulariti structurale iale proprietilor fizico-chimice, exemple.

10.

Nivelurile organizrii structurale a moleculei proteice. Structura cuaternara proteinelor. Tipurilede legturi intramoleculare n protein.Modificrile cooperatiste ale conformaiei protomerilor

(pe exemplul hemoglobinei n comparaie cu mioglobina). Noiune de "domen".11.

Colagenul: particularitile componenei aminoacidice i ale structurii.12.

Proteinele fixatoare de calciu colagenul, osteocalcina calmodulina, factorii coagulrii sngelui.Particularitile compoziiei aminoacidice ce determinfixarea calciului. Rolul acestor proteinen organism.

13.

Clasificarea proteinelor. Proteinele simple. Albuminele, globulinele, histonele caracteristicalor, rolul biologic.

14.

Clasificarea proteinelor. Proteinelor conjugate. Caracteristica general a cromoproteinelor,metaloproteinelor, nucleoproteinelor, fosfoproteinelor, glicoproteinelor i lipoproteinelor, rolullor biologic, exemple.

15.

Masa moleculara proteinelor. Noiuni generale referitor la metodele de determinare a maseimoleculare a proteinelor.

16.

Proprietile amfotere ale proteinelor. Sarcina electric a proteinelor. Factorii ce determinsarcina proteinei. Punctul i starea izoelectric. Importana biomedical.



19/19



17.Solubilitatea proteinelor. Proprietile hidrofile ale proteinelor n funcie de componenaaminoacizilor i de particularitile structurale. Factorii de stabilizare n soluie a substanelor

coloidale. Starea soluiilor coloidale: sol, gel, xerogel. Exemple.18.Saliva soluie coloidal proteic. Proprietile salivei determinate de prezena proteinelor.

Originea, reprezentanii i rolul biologic al proteinelor salivare.19.Denaturarea proteinelor, agenii ce provoacdenaturarea. Modificrile structurale ale proteinei la

denaturare.20.Metodele de determinare, separare i purificare a proteinelor: salifierea, dializa, electroforeza,

cromatografia i gelfiltrarea. Valoarea lor biomedical.21.

Enzimele. Natura chimic. Rolul biologic. Asemrile i deosebirile enzimelor de catalizatoriinebiologici.

22.

Noiune de apoenzim i cofactor, grupprostetic i coenzim. Exemple.23.Cofactorii. Structura vitaminelor B1 si B2, cofactorii acestor vitamine, rolul lor metabolic.

Exemple de reacii n care participtiamin-pirofosfatul i FAD-ul.24.

Cofactorii. Structura vitaminelor B6 si PP, cofactorii acestor vitamine, rolul lor metabolic.Exemple de reacii n care participNAD+, NADPHi piridoxal-fosfatul.

25.

Cofactorii. Structura vitaminei C, rolul ei metabolic. Exemple de reacii n care particip.26.

Funciile de coenzimatice ale microelementelor.27.Mecanismul de aciune al enzimelor. Centrul activ al enzimelor i rolul lui n formarea i

transformarea complexelor intermediare dintre enzim i substrat. Rolul modificrilorconformaionale reciproce ale moleculei enzimei i substratului la favorizarea catalizei (reaciei) modelul clasic (Fischer) i modelul coincidenei induse (Koshland).

28.

Specificitatea de aciune a enzimelor, tipurile. Exemple.29.Factorii ce determin viteza reaciei enzimatice (concentraia enzimei i a substratului,

temperatura, pH-ul).30.

Reglarea activitii enzimatice. Activarea enzimelor: alosteric, covalent (fosforilare-defosforilare), autostructurarea cuaternar, proteoliza limitat. Exemple de enzime activitatearora este reglatprin aceste mecanisme. Izoenzimele. Rolul biologic. Exemple.

31.Tipurile de inhibiie enzimatic (competitiv, necompetitiv, noncompetitiv, prin exces desubstrat). Enzime alosterice. Centrul alosteric. Reglarea alosteric.

32.

Clasificarea enzimelor. Oxidoreductazele, transferazele, hidrolazele. Cofactoriioxidoreductazelor i ai transferazelor. Exemple de reacii catalizate de enzime ale acestor clase.

33.Clasificarea enzimelor. Liazele, izomerazele, ligazele. Cofactorii acestor enzime. Exemple dereacii catalizate de enzime ale acestor clase.

34.Organizarea enzimelor n celul(ansamblurile enzimatice, compartimentalizarea). Deosebirile ncomponena enzimatica organelor i esuturilor. Enzimele organospecifice.

35.

Principiul determinrii activitii enzimelor. Unitile de activitate a enzimelor. Modificareaactivitii enzimatice n diferite afeciuni (enzimodiagnosticul).36.Enzimele salivei reprezentanii principali, funciile lor, originea, modificrile activitii lor n

afeciunile sistemului stomatognat i de altnatur.

Documents

Stom Proteine-Enzime Rom