Struktur- und Funktionsuntersuchungen von … · über die Struktur und unktionswF eise der Komplexe der Photosynthese könnten hier ... funktion durch die gebundenen Carotinoide

Struktur- und Funktionsuntersuchungen

von Lichtsammelkomplexen aus dem

Dino�agellaten Amphidinium carterae

Dissertation

zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

in der Fakultät für Biologie und Biotechnologie

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Silke Johanningaus

Remscheid

Bochum

April 2009

Structural- and functional inquiries of Light

Harvesting comlexes from the Dino�agellate

Amphididnium carterae

Dissertation

to obtain the degree

Doctor of natural sciences

at the Faculty of Biology and Biotechnology

Ruhr-University Bochum

submitted by

Silke Johanningfrom

Remscheid, Germany

Bochum

April 2009

Erstgutachter: Prof. Eckhard Hofmann

Zweitgutachter: Prof. Dr. M. Rögner

iv

Keep calm and carry on

(Plakat 1939, Groÿbritannien)

Inhaltsverzeichnis v

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

1.1 Die Photosynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.2 Lichtsammelproteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2.1 Membrangebundene Lichtsammelkomplexe . . . . . . . . . . . 3

1.2.2 Wasserlösliche Lichtsammelproteine, die Phycobilliproteine . . 5

1.3 Pigmente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.4 Dino�agellaten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.4.1 Die Chloroplasten der Dino�agellaten . . . . . . . . . . . . . . 11

1.4.2 Die Photosynthese von Dino�agellaten . . . . . . . . . . . . . 12

1.4.3 Lichtsammelproteine von Dino�agellaten . . . . . . . . . . . . 14

Der membrangebundene Lichtsammelkomplex LHC . . . . . . 14

Das lösliche Peridinin-Chlorophyll-a- Protein (PCP) . . . . . . 15

1.5 Ziel der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2 Material und Methoden 19

2.1 Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.1.1 Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.1.2 Pu�er und Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.1.3 Material und Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.2 Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

2.2.1 SDS-Polyacylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) . . . . . . . 30

2.2.2 UV/VIS Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.2.3 Proteinmengenbestimmung von PCP und LHC über UV/VIS

Absorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

2.2.4 Anzucht von Amphidinium carterae (A. c.) . . . . . . . . . . . 33

Inhaltsverzeichnis vi

2.2.5 Anzucht von A. c. unter verschiedenen Lichtbedingungen . . . 34

2.2.6 Ernte von Amphidinium carterae . . . . . . . . . . . . . . . . 35

2.2.7 Aufreinigung LHC aus Amphidinium carterae . . . . . . . . . 35

Membranpräparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

Solubilisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

Anionenaustauschchromatographie . . . . . . . . . . . . . . . 37

Gel�ltration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

2.2.8 Aufreinigung von PCP aus Amphidinium cartreae . . . . . . . 38

Chromatofokussierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

2.2.9 Gel�ltration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

2.2.10 PCP Proben für Interaktionsstudien . . . . . . . . . . . . . . 40

2.2.11 Rekonstitution von LHC in Lipidvesikel . . . . . . . . . . . . . 40

2.2.12 Ober�ächenplasmonresonanzspektroskopie (SPR) . . . . . . . 42

2.2.13 ATR- FTIR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

2.2.14 Kristallisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

Kristallisation von LHC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

Kristallisation von PCP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

2.2.15 Messungen der Proteinkristalle am Di�raktometer . . . . . . 53

2.2.16 Die Auswertung der Datensätze . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

XDS Programmpaket . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

XDS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

XSCALE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

XDSCONV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

SHELX . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

CCp4i . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

COOT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

3 Ergebnisse 59

3.1 Proteinmengenbestimmung von LHC über UV/VIS Spektren . . . . . 59

3.2 Zellkultur Amphidinium carterae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

3.3 Belichtungstest von Amphidinium carterae . . . . . . . . . . . . . . . 60

3.4 Aufreinigung von LHC aus Amphidinium carterae (A. c.) . . . . . . . 62

3.5 Die Rekonstitution von LHC in Lipidvesikel . . . . . . . . . . . . . . 67

3.6 Interaktionsuntersuchung von LHC und PCP mit SPR . . . . . . . . 70

Inhaltsverzeichnis vii

3.7 FTIR-ATR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

3.8 Kristallisation von LHC aus Amphidinium carterae . . . . . . . . . . 78

3.9 Röntgenbeugungsexperimente an LHC Kristallen . . . . . . . . . . . 90

3.10 Die Aufreinigung von PCP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

3.11 Hochaufgelöster Datensatz von PCP aus A. c. . . . . . . . . . . . . . 109

4 Diskussion 114

4.1 Belichtungstest von Amphidinium carterae . . . . . . . . . . . . . . . 114

4.2 Aufreinigung von LHC aus Amphidinium carterae . . . . . . . . . . . 115

4.3 Rekonstitution von LHC in Lipidvesikel . . . . . . . . . . . . . . . . . 116

4.4 Interaktionsuntersuchung von LHC und PCP mit SPR . . . . . . . . 117

4.5 FTIR-ATR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

4.6 Kristallisation von LHC aus Amphidinium carterae . . . . . . . . . . 121

4.7 Röntgenbeugungsexperimente an LHC Kristallen . . . . . . . . . . . 122

4.8 Aufreinigung von PCP aus A.c. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

4.9 Highresolution Datensatz von MFPCP . . . . . . . . . . . . . . . . . 126

5 Zusammenfassung 129

6 Summary 132

7 Ausblick 134

Literaturverzeichnis 136

Abbildungsverzeichnis 146

Abkürzungsverzeichnis 153

1.1 Die Photosynthese 1

1 Einleitung

1.1 Die Photosynthese

Die Photosynthese ist der Prozess bei dem Sonnenenergie in chemische Energie um-

gewandelt wird. Vereinfacht dargestellt in folgender Bruttoformel:

6 CO2 + 12 H2O + h * ν → C6H12O6 + 6 H2O + 6 O2

(1.1)

Hierbei entsteht der für lebende Organismen wichtige Sauersto�. Auch die klas-

sischen Energiequellen sowie fast alle natürlich vorkommenden organischen Sto�e

haben ihren Ursprung in der lichtgetriebenen CO2 Assimilation [dtv, 1992]. Alter-

nativen zur Energiegewinnung aus Kohle, Öl oder Erdgas nehmen durch die gerin-

ger werdenden natürlich vorkommenden Ressource an Bedeutung zu. Informationen

über die Struktur und Funktionsweise der Komplexe der Photosynthese könnten hier

zu Innovationen in diesem Bereich führen.

Der Ort der Photosynthese bei höheren P�anzen und Algen sind die Chloropla-

sten. Die Kompartimente der Plastiden, die Thylakoide sind bei höheren P�anzen

in Grana- und Stromathylakoide aufgeteilt und enthalten die für die Photosynthese

wichtigen Komplexe, Photosystem I (PSI), Photosystem II (PSII), Cytochrom b6f,

ATP-Synthase und die Lichtsammelkomplexe I und II (LHCI, LHC II)(Abb. 1.1).

Bei der Photosynthese wird Lichtenergie in chemische Energie umgewandelt. Dieser

Prozess wird in zwei Reaktionskaskaden aufgeteilt, der Lichtreaktion bei der ATP

1.1 Die Photosynthese 2

und NADPH gebildet werden (Abb. 1.1) und der Dunkelreaktion in Folge derer

energiereiche Verbindungen entstehen [Helmich, 2002; Kirchho� et al., 2004, 2007;

Nultsch, 1991].

LHC II

Chl a/b

P680 Phe QA QB

P680

PQ

PQH2

Cytb6

FeS

Cytf

LHC I

Chl a/b

P700 A0 A1

P700

Mn

H2O ½ O2 + 2 H+

2 e-

PC

2 H+FD

FD

2 H+

2 H+2 H+

Stroma

Lumen

FAD

2 H+

NADPH/H+NADP

ADP + Pi + ATP

3 H+

PSII PSICytb6f ATP-Synthase

Abbildung 1.1: Die schematische Darstellung der Elektronentransportkette und der ander Photosynthese beteiligten Proteinkomplexe

Bei der Lichtreaktion werden Lichtquanten, von den in den Komplexen gebunde-

nen Pigmenten absorbiert. Diese führen zu einer Anregung des Chlorophylls und

einer nachfolgenden Energieübetragung auf die Reaktionszentren der Photosysteme

[Iwata and Barber, 2004; Horton and Ruban, 2005; de Weerd et al., 2002]. Diese Re-

aktionszentren verfügen über Chlorophylle, die sogenannten special pairs [Ben-Shem

et al., 2003], die in der Lage sind bei Strahlung bestimmter Wellenlängen eine rever-

sible Absorptionsänderung zu erfahren. Die Absorptionsmaxima dieser Paare von

Chlorophyll a liegen im Fall des Photosystems II bei 680, die des Photosystem I

bei 700. Auf Grund dessen werden diese auch als P680 und P700 bezeichnet. Durch

die von den LHCs übertragene Anregungsenergie auf das Reaktionszentrum P680

des Photosystems II wird dieses in den angeregten Zustand überführt und es erfolgt

eine Elektronenübertragung auf ein Phaeophytin a Molekül [Holzwarth et al., 2006].

Das P680 ist ein starkes Oxidationsmittel und kann durch die Spaltung von Wasser

Sauersto� freisetzten, wodurch wieder der Ausgangszustand des Reaktionszentrums

erreicht wird [Ferreira et al., 2004; Rivas et al., 2007]. Das Elektron vom Phaeophy-

tin wird auf ein an das Photosystem gebundenes Plastochinon Qa übertragen. Von

Plastochinon Qa gehen die Elektronen auf Plastochinon Qb über [Demetriou et al.,

1.2 Lichtsammelproteine 3

1988; Iwata and Barber, 2004]. Nach Aufnahme von zwei Elektronen erfolgt eine Elek-

tronenübertragung an den in der Tylakoidmembran lokalisierten Pool von Plastochi-

nonen (ca.7). Nach zusätzlicher Aufnahme zweier Protonen wandert ein nicht an ein

Protein gebundenes Plastochinon (PQH2) innerhalb der Membran zum Cytochrom

b6f Komplex (Cytb6f) [Ben-Shem et al., 2003]. Durch Bindung an der PQ Binde-

stelle Qz werden zwei Elektronen übertragen und zwei Protonen freigesetzt. Diese

Protonen wandern wiederum in den Thylakoidinnenraum. Plastocyanin, ein periphe-

res Protein an der Innenseite der Thylakoidmembran wird durch Cytb6f reduziert

und überträgt die Elektronen auf das P700 im Reaktionszentrum des Photosystems

I. Das so angeregte P700 wirkt als starkes Reduktionsmittel auf den Komplex A0 des

Reaktionszentrums. Dieser überträgt nachfolgend die Elektronen auf den A1 Kom-

plex des Reaktionszentrums I. Dieser Redoxcarrier reduziert das an der Auÿenseite

der Thylakoidmembran liegende Ferredoxin. Von dort gehen die Elektronen auf das

Enzym Ferredoxin-Oxidoreduktase über, welches mittels zweier zusätzlicher Proto-

nen NADP zu NADPH+H+ umwandelt. Dieser gesamte Energietransport vom LHC

bis zur NADP Reduktion wird nichtzyklischer Elektronentransport genannt. Bei ei-

nem hohen NADPH+H+/ NADP Verhältnis erfolgt der zyklische Transport, bei

dem das durch das PS I reduzierte Ferredoxin seine Elektronen auf den Cytochrom

b6f Komplex überträgt [P.Sitte, 1999; Nultsch, 1991].

1.2 Lichtsammelproteine

Es existieren verschiedene Formen von Lichtsammelkomplexen, bei höheren P�anzen

kommen nur die membrangebundenen Lichtsammelkomplexe LHC vor. In Rotalgen

und Cyanobakterien sind die wasserlöslichen Phycobiliproteine die Lichtsammelkom-

plexe. Im Dino�agellaten Amphidinium carterae sind sowohl membrangebundene

LHC wie auch das wasserlösliche Peridinin-Chlorophyll a- Protein (PCP) für die

Lichtabsorption verantwortlich [Formaggio et al., 2001; Ruban et al., 2007].

1.2.1 Membrangebundene Lichtsammelkomplexe

Ein gemeinsames Merkmal aller membrangebundener Lichtsammelkomplexe sind die

drei Transmembranhelices [Kirchho� et al., 2004]. Die Lichtsammelproteine höherer

P�anzen kommen an PSI assoziiert als LHCI oder als Antennenkomplex LHCII vor


[Hoober and Eggink, 1999]. Der LHCI leitet nach Lichtabsorption durch gebundene

Chlorophylle seine Energie auf das P700 weiter. Er bildet ein Trimer oder Dimer

aus Polypeptiden, die aus vier verschiedenen Genprodukten bestehen [Ben-Shem

et al., 2003]. Jedes Monomer hat eine Gröÿe von 21-24 kDa [Ben-Shem et al., 2003;

Dunahay and Staehelin, 1985]. Als Teil des PSI bindet er ca. 20 % des gesamten

in der Thylakoidmembran gebundenen Chlorophylls [Zolla et al., 2003]. Der LHCII

Komplex macht 30 % aller Proteine im Chloroplasten aus (Abb. 1.2). Das Trimer

ist ein Polypeptid aus 3 verschieden Genprodukten, LHCb1-3, wobei LHCb1 und

zwei nur im N-Terminus unterschiedlich ist [Kirchho� et al., 2004]. Jedes Monomer

hat ein 232 Aminosäuren umfassendes Polypeptid welches 14 Chlorophylle gebunden

hat.

Stroma

Lumen

Abbildung 1.2: Die Struktur des Lichtsammelkomplexes LHCII aus der Erbse[Standfuss2005]

Der LHCII Komplex überträgt absorbierte Energie auf die Photosysteme [Lyon

and Unwin, 1988]. In den Granathylakoiden erfolgt eine Übertragung der Energie

auf das PSII wodurch dieses Plastochinon reduziert [Nilsson et al., 1997]. Daraufhin

wird LHCII durch eine Phosphokinase phosphoryliert in Folge dessen die Beweg-

lichkeit des Komplexes innerhalb der Thylakoide erhöht wird. Eine Wanderung von

den Grana- in die Stromathylakoide macht eine Energieübertragung auf PSI mög-

lich. Nach einer solchen Energieübertragung erfolgt die Dephoshphorylierung und

ein Zurückwandern in die Granathylakoide [Nultsch, 1991]. Neben der Absorption

von Solarenergie und dessen Transfer haben die Antennenkomplexe auch eine Schutz-


funktion durch die gebundenen Carotinoide bei Starklichtbedingungen.

Bislang wurden die Strukturen vom LHC der Erbse (Abb. 1.3) und des Spinates

[Liu et al., 2004] gelöst. Drei Helices durchspannen die Membran und verankern das

Protein in den Thylakoiden [Liu et al., 2004; Standfuss et al., 2005; Zigmantas et al.,

2002]. Die Struktur des Spinates hat eine maximale Au�ösung von 2,72 A und liegt

als Trimer in der Membran vor (Abb. 1.3). Jedes Monomer hat acht Chlorophyll a

und sieben Chlorophyll b Moleküle gebunden. Des Weiteren sind drei Carotinoide

und zwei Lipide gebunden [Helmich, 2002; Liu et al., 2004]. Bei den Carotinoiden

handelt es sich um Lutein, Neoxanthin und Violaxanthin [Peterman et al., 1995;

Salverda et al., 2003]. Das Phosphatidylglycerol und das charkteristische Thylako-

idlipid DGDG stellen die Lipide. Im Gegensatz dazu bindet ein LHC Monomer der

Erbse 14 Chlorophylle, von denen acht Chlorophyll a und sechs Chlorophyll b sind.

Auÿerdem sind hier auch vier statt drei Carotinoide gebunden. Die Au�ösung dieser

Struktur liegt bei 2,5 A (Abb. 1.3).

Abbildung 1.3: Die Struktur des Lichtsammelkomplexes LHCII aus dem Spinat[Liu2004](links) und der Erbse [Standfuss2005] (rechts)

1.2.2 Wasserlösliche Lichtsammelproteine, die Phycobilliproteine

Chromophyten und Rotalgen verfügen über sogenannte Phycobiliproteine die wie

das PCP der Dino�agellaten wasserlöslich sind. Die Grundeinheit ist ein 30-40 kDa

1.3 Pigmente 6

groÿes Monomer an dem z.B. Phycocyanobilin (blau) oder Phycoerythrobilin (rot)

kovalent gebunden ist. Neben diesen gibt es noch Phycobiliviolon und Phycourobilin

[Grossmann et al., 1993]. Sie bilden groÿe Aggregate, die Phycobilisomen, mit einem

Durchmesser von 40 nm und Massen bis zu 15.000 kDa. Die Phycobillisomen sind

stangenförmig auf der Thylakoidober�äche aufgelagert (Abb. 1.4) [Grossmann et al.,

1993; Jiang et al., 2001; P.Sitte, 1999]. Eine Untereinheit besteht aus 15-21 kDa und

hat 3-5 Phylibiline gebunden. Aufgrund unterschiedlicher Absorption von Licht zwi-

schen 450 und 600 nm wird in drei Hauptgruppen unterschieden, in Phycoerythrin

(PE), Phycocyanin (PC) und Allophycocyanin (APC) [Jiang et al., 2001].

PE PC APC

Abbildung 1.4: Schematische Darstellung eines Phycobilisoms

1.3 Pigmente

Zwei Gruppen lichtabsorbierender Pigmente spielen bei der Photosynthese eine groÿe

Rolle. Die Chlorophylle und Carotinoide. Alle Chlorophyllmoleküle haben als Grund-

gerüst ein Porphyrinringsystem mit Magnesium als Zentralatom. Charakteristisch

ist auch ein Propionsäurerest. Eine Unterscheidung in Chlorophyll a (Abb. 1.5), b

und c erfolgt durch Unterschiede in den Substituenten. So ist z.B. bei Chlorophyll

a und b der Propionsäurerest mit Phytol verestert. Das im LHC bei Dino�agellaten

vorkommende Chlorophyll c2 (Abb. 1.6) unterscheidet sich vom Chlorophyll a vor

allem durch das Fehlen des veresterten Phytols (Abb. 1.6) [Lehniger, 1994; Nultsch,

1991; P. Karlson, 1994; P.Sitte, 1999].

1.3 Pigmente 7

Abbildung 1.5: Chlorophyll a

Abbildung 1.6: Chlorophyll c2

Das Chlorophyll a ist das Hauptpigment der Photosynthese und ist in der Lage

nach Anregung Energie weiterzuleiten. Die Anregung von Chlorophyll kann durch

die Einstrahlung von Licht, erfolgen wobei bei einer Wellenlänge von 680 nm das

Pigment in den ersten Singulettzustand (S1)überführt wird. Aus diesem kann eine

Energieweiterleitung erfolgen (Abb. 1.7). Licht der Wellenlänge 440 nm überführt

es in den zweiten Singulettzustand (S2). Aus diesem fällt es schnell in den ersten

Singulettzustand (S1)unter Abstrahlung von Wärme zurück (Abb. 1.7). Das Zurück-

fallen auf den Grundzustand erfordert chemische Arbeit. Ein Zurückfallen vom S1 in

den Grundzustand kann zur Abstrahlung eines Photons führen (Fluoreszenz) oder

es erfolgt ein Übertreten in den Triplettzustand (Abb. 1.7). Dieser ist stabiler als die

1.3 Pigmente 8

anderen und wird bei isoliertem LHC genutzt, um diesen in Experimenten anzuregen

[P.Sitte, 1999; Wikipedia].

S0

S2

S1

Fluoreszenz

Triplett

Wärme

430 nm

680 nm

Abbildung 1.7: Schema der Anregungszustände des Chlorophyll a

Carotinoide sind Tetraterpene, deren konjugierte Doppelbindungen zu einer gel-

ben, roten oder purpurnen Färbung des Moleküls führen. Sie haben neben der Über-

tragung der Anregungsenergie auch eine Schutzfunktion gegen die Photoxidation

des Chlorophylls [Lohr and Wilhelm, 1999; Nultsch, 1991; P.Sitte, 1999]. Die Caroti-

noide werden in zwei Klassen aufgeteilt, den Carotinen und den Xanthophyllen. Die

Carotine sind reine Kohlenwassersto�e deren Grundgerüst immer aus acht Isopren-

einheiten aufgebaut ist. Ein Vertreter dieser Klasse ist das β-Carotin, das Hauptcaro-

tin der P�anzen. Xanthophylle sind Derivate der Carotine die Sauersto� enthalten

und überwiegend aus 40 Kohlensto�en aufgebaut sind [Lehniger, 1994; P. Karlson,

1994]. Ein Beispiel ist Fucoxanthin welches für die charakteristische Färbung der

Diatomeen verantwortlich ist. Die Xanthophylle Peridinin und Dinoxanthin sind für

Dino�agellaten spezi�sch (Abb. 1.8, 1.9) [Je�rey and Haxo]. Das Peridinin kommt

in den verschiedenen Lichtsammelproteinen vor und bestimmt neben Chlorophyll

die charakteristische Färbung der Komplexe.

1.3 Pigmente 9

O

O

O

OH

OH

O

O

Abbildung 1.8: Peridinin [Botanik online 2005]

Abbildung 1.9: Diadinoxanthin [Botanik online 2005]

Das Hauptcarotinoid der Dino�agellaten, das Peridinin ist auch durch eine kon-

jugierte Carbonylgruppe gekennzeichnet. Nach Anregung geht dieses Carotinoid in

den zweiten Anregungszustand S2 über. Aus dem S2 Zustand kann der S1 Zustand/

bzw. der hier angenommene intramolekulare Transfer ITC erreicht werden. Durch

Zurückfallen in den Grundzustand kommt es zu einer Emittierung von Licht in Form

von Fluoreszenz (Abb. 1.10) [Macpherson and Hiller].

Peridinin

S0

S2

S1/ITC

FluoreszenzFluoreszenz

Abbildung 1.10: Schema der Anregungszustände des Peridinin

1.4 Dino�agellaten 10

1.4 Dino�agellaten

Dino�agellaten (Dinophyta) bilden einen Teil des Phytoplanktons [Taylor, 1987]

und sind bekannt durch die red tides, ein verstärktes Wachstum von Zellen, welches

zu einer Rotfärbung der Wasserober�äche führt, die z.B an der Küste von Florida

vorkommen und für im Wasser lebende Tiere eine tödliche Bedrohung durch Aus-

scheidung von Toxinen darstellen [Schrope, 2008]. Es ist eine Gruppe verschiedener

eukaryotische Einzeller die in Süÿ- und Salzwasser vorkommen und sowohl freilebend

wie auch als Symbionten auftreten [Taylor, 1987]. Viele Vertreter sind photosynthe-

tisch aktiv. Die freischwimmende Zelle, die sogenannte Mastigote, ist eiförmig bis

birnenförmig mit zwei Flagellen (Abb. 1.11)[Taylor, 1987].

Abbildung 1.11: Schematische Darstellung einer freischwimmenden Dino�agellatenzelleLF: longitudinale Flagella, TF: transversale Flagelle, M: Mitochondrium, Cp: Chloroplast,Cr: Chromosom, N: Nucleus, Pu: Pusules, V: Vakuole [Taylor1998]


Diese können an unterschiedlichen Positionen der Zelle sitzen, werden jedoch im-

mer in eine longitudinale, hauptsächlich für die Orientierung verantwortliche Flagelle

und eine transversale, eine Geiÿel für die Fortbewegung, unterschieden[Taylor, 1987].

Alle Zellen sind von einer Auÿenmembran umhüllt, die die Flagellen bindet[Taylor,

1987]. Die Auÿenmembran kann aus Zelluloseplatten bestehen die dann einen soge-

nannten Panzer bilden[Taylor, 1987]. Amphidinium gehört zur Gruppe der sogenann-

ten �nackten Zelle” bei denen dieser Panzer fehlt. Unter der äuÿeren Membran liegt

eine Einzelschicht �acher Vesikel unterhalb derer Mikrotubuli zu �nden sind[Taylor,

1987]. Als Zellkompartimente verfügen alle Dinophyta über einen Zellkern, Mitochon-

drien, einen Golgi Apparat, eine Vakuole und vakuolenähnliche Strukturen, den Pu-

sules [Taylor, 1987]. Der Zellkern ist von zwei mit Poren durchzogenen Membranen

umhüllt und enthält permanent kondensierte Chromosomen�brillen [Taylor, 1987].

Ein weiteres Charakteristikum dieser Art ist das Fehlen von Nukleosomen und die

nur bei diesen Eukaryoten vorkommende Nucleinbase 5-Hydroxymethyluracil (HO-

MeU) [Howe et al., 2008]. Alle photosynthesebetreibenden Arten besitzen Chloropla-

sten als Ort der Photosynthese. Einzigartig für diese Organismen ist das Carotino-

id Peridinin, welches im membrangebundenen Lichtsammelkomplex LHC und dem

löslichen Lichtsammelkomplex Peridinin-Chlorophylla Protein gebunden vorliegen

[Taylor, 1987]. Amphidinium carterae ist ein gut untersuchter Vertreter dieser Klas-

se und produziert das Toxin Haemolysin A [Nayak et al., 1997] und Cholinderivate,

die toxisch auf Fische und Mäuse wirken (Shimizu).

1.4.1 Die Chloroplasten der Dino�agellaten

Chloroplasten sind Organellen, die bei höheren P�anzen und Algen den Ort der

Photosynthese darstellen. Sie entstanden bei Dino�agellaten durch sekundäre Endo-

symbiose, besitzen jedoch nur drei statt vier Auÿenmembranen [Howe et al., 2008;

Patron et al., 2005; Wang et al., 2005]. Des Weiteren unterscheiden sich die Plastiden

aus der Klasse der Dino�agellaten grundsätzlich von denen anderer photosyntheti-

scher Organismen durch die starke Reduktion des Plastidengenoms [Barbrook et al.,

2006; Howe et al., 2008]. Anders als in höheren P�anzen, wo die Hälfte der Chloro-

plastenproteine durch dessen Genom kodiert werden, sind hier nur kleine Plasmide

vorhanden [Barbrook et al., 2006; Howe et al., 2003, 2008; Laatsch et al., 2004; von

Wettstein, 2001]. Diese enthalten Gene für den Cytochrom b6f-Komplex, die ATP-


Synthase sowie für Untereinheiten der Photosysteme I und II [Howe et al., 2008].

Die Kompartimente der Chloroplasten werden Thylakoide genannt und bestehen

zum gröÿten Teil aus den Galactolipiden Monogalactosydiacylglycerol (MDGD) und

Digalactosyldiacylglycerol(DGDG) [Dörmann and Benning, 2002; Dörmann, 2005;

Heise and Jacobi, 1973; Ongun et al., 1968] und enthalten die Komplexe der Pho-

tosynthese. In höheren P�anzen sind diese in Grana- und Lammellenthylakoiden

organisiert. Die Plastiden der Dino�agellaten weisen nur Lammelenthylakoide auf.

Diese liegen parallel angeordnet im Chloroplasten und sind bei Amphidinium car-

terae aus jeweils drei nahe beieinanderliegenden Thylakoiden aufgebaut (Abb. 1.12)

[Taylor, 1987].

Abbildung 1.12: Der Chloroplasten von Amphidinium carterae [Taylor 1998]

1.4.2 Die Photosynthese von Dino�agellaten

Der Photosyntheseapparat entspricht bei Dino�agellaten prinzipiell dem von höhe-

ren P�anzen und Algen. Die Photosysteme sind �ankiert von membrangebundenen

Lichtsammelkomplexen (LHC) in die Membran eingebettet. Am LHC Komplex sind

lösliche Lichtsammelkomplexe assoziiert, die bei Dino�agellaten PCP Komplexe sind.

Ein Modell der Anordnung der Komplexe der Photosynthese ist in der Abbildung


dargestellt (Abb. 1.13).

Abbildung 1.13: Der Photosyntheseapparat in der Thylakoidmembran vonDino�agellaten

In der photosynthetischen Einheit (Abb. 1.14) erfolgt die Anregung der Photosy-

steme über Lichtabsorption des LHCs, der die Energie auf die Chla des PSI und

PSII überträgt. Der integrale Membrananteil des Komplexes ist verbunden mit PSI

und II während der Teil im Lumen nahe dem PCP liegt.

Abbildung 1.14: Ein Modell der photosynthetischen Einheit PSU [Govindjee et all 1979]


1.4.3 Lichtsammelproteine von Dino�agellaten

Photosynthetisch aktive Dino�agellateten verfügen neben einem membrangebunde-

nen Lichtsammmelkomplex, dem LHC, auch über einen löslichen Komplex, das PCP.

Beide Komplexe haben eine groÿe Anzahl an Pigmenten gebunden welche zu einer

charakteristischen Färbung der Komplexe wie auch der Zellen führt. Die Transkripti-

on der Lichtsammelkomplexe ist dahingehend von der einwirkenden Lichtintensität

abhängig, dass eine Steigerung der Transkriptionsrate bei Schwachlichtbedingungen

(20 µ E) um das dreifache im Vergleich zu Starklichtbedingungen (100 µE) erfolgt

[ten Lohuis MR and Miller, 1998; Roman et al., 1988; Samuelsson and Richardson,

1982]. Der Anteil des PCPs an der Gesamtproteinmenge kann daraufhin von 2 % auf

bis zu 50 % steigen, was auch Ein�uss auf die Färbung der Zellen hat [ten Lohuis MR

and Miller, 1998].

Der membrangebundene Lichtsammelkomplex LHC

Der membrangebundene Lichtsammelkomplex LHC von Amphidinium carterae ist

unabhängig von Photosystemen isolierbar und mit den LHCs von Chromophyten

und den CAb Proteinen verwandt. Die gröÿte Übereinstimmung �ndet sich mit dem

FcP von Phaedactylum [Hiller et al., 1995]. Er verfügt wie alle membrangebundenen

LHCs über drei die Membran durchspannende Helices. Der als Trimer vorkommen-

de Komplex wird durch eine Multigenfamilie kodiert. Das Apoprotein ist 19 kDa

groÿ [Hiller et al., 1995] und bindet 11 Chlorophylle und 10/12 Carotinoide. Des

Weiteren sind zwei Lipidmoleküle gebunden [Hiller et al., 1993]. Im Gegensatz zu

höheren P�anzen sind neben 7 Chlorophyll a Molekülen 4 Chlorophyll c anstelle

von Chlorophyll b Moleküle gebunden [Hiller et al., 1993]. Auch die groÿe Anzahl

von Carotinoiden unterscheidet diesen LHC gegenüber dem von höheren P�anzen.

Hierbei handelt es sich um das Xanthophyll Peridinin, welches neben der Schutz-

funktion im Komplex auch eine Lichtsammelfunktion übernimmt. Das Lipid ist das

für Dino�agellaten charakteristische Diadinoxanthin.

Innerhalb des LHC erfolgt ein Energietransfer vom Peridinin auf die Chlorophylle a

und c. Das angeregte Chlorophyll c überträgt seine Energie auf das Chlorophyll a.

Von hier erfolgt eine Übertragung auf die Photosysteme [Polívka et al., 2006].


Peridinin Chlorophyll aS0 S0

Qy

S2

S1/ITC

Qx

Fluoreszenz FluoreszenzFluoreszenz

Chlorophyll c2S0

Qy

Qx

Abbildung 1.15: Energietransfer innerhalb des LHCs von A. c.

Das lösliche Peridinin-Chlorophyll-a- Protein (PCP)

Der lösliche Lichtsammelkomplex der photosynthetischen Dino�agellaten wird als

Peridinin-Chlorophyll-a-Protein (PCP) bezeichnet und liegt im Lumen der Thyla-

koide. Er liegt als Trimer vor und weist durch den hohen Anteil an Perdinin eine

rote Färbung auf. Die PCP Formen innerhalb der Klasse der Dino�agellaten sind in

ihrer DNA-Sequenz sehr ähnlich [Sharples et al., 1996]. PCP kann in verschiedenen

Zusammensetzungen vorkommen. Zum einen als Monomer mit einem 32 kDa groÿen

Apoprotein, mit gebundenen acht Peridininen, zwei Chlorophyll a Molekülen und

zwei Lipiden [Sharples et al., 1996]. Andererseits als Homodimer mit einem Apo-

protein von 16 kDa. Das nur bei Amphidinium carterae auftretende High salt PCP

(HSPCP) mit einem Apoprotein von 34 kDa unterscheidet sich in der Pigmentzu-

sammensetzung und in der Absorption im UV/VIS Spektrum [Ilagan et al., 2004;

Schulte et al., submitted]. Die Hauptform von PCP ist aus Monomeren mit einer

Gröÿe von 32 kDa aufgebaut und hat einen pI von 7,5. Sie stellt 90 % des gesam-

ten PCPs (Abb. 1.16). Neben dieser Hauptform existieren Isoformen des Komplex

mit einem pI von 4,0 bis 8,0 [Haxo et al., 1976]. Neben dem gleichen Gewicht sind

auch die Aminosäuresequenzen und die gebundenen Chromophoren nicht signi�kant


unterschiedlich. Im UV/VIS Spektrum sind keine Unterschiede feststellbar. Eine Un-

terscheidung ist nur im pI möglich [Haxo et al., 1976]. Alle sind reich an Alaninen

und besitzen keine Cysteine.

Abbildung 1.16: Die Struktur der Hauptform von PCP [Hofmann et al., 1996].

Der Energietransfer innerhalb von PCP erfolgt vom Peridinin zum Chlorophyll

[Linden et al., 2004; Polívka et al., 2007; Zigmantas et al., 2002]. Nach Anregung

durch Licht wird das Peridinin in den zweiten Singulettzustand angehoben[Polívka

et al., 2007; Zigmantas et al., 2002]. Von hier aus erfolgt eine Energieübertragung auf

das Qx des Chlorophylls, welcher 25 % des gesanmten Energietransfers ausmachen.

Aus dem S2 Zustand kann das Peridinin in den S1/ITC Zustand zurückfallen [Linden

et al., 2004; Polívka et al., 2007; Zigmantas et al., 2002]. Aus diesem wird wieder-

um Energie auf Chlorophyll übertragen, hier auf den Qy- Anteil des Chlorophylls

[Polívka et al., 2007; Zigmantas et al., 2002]. Eine Weiterleitung von Energie auf

das Chlorophyll a in den membrangebundenen Lichtsammelkomplex ist aufgrund

1.5 Ziel der Arbeit 17

der Anordnung der Proteine zueinander sehr wahrscheinlich.

Peridinin Chlorophyll aS0 S0

S2

S1/ITC

Fluoreszenz FluoreszenzFluoreszenz

Abbildung 1.17: Energietransfer innerhalb des PCP

Die Struktur der Hauptform bei 2 A (Abb. 1.16) zeigt eine enge Assoziation von

Peridininen und Chlorophylllen und hat die oben beschriebene Zusammensetzung

[Hofmann et al., 1996]. Die HSPCP Struktur hat eine Au�ösung von 2,1 A und

zeigt die auch in MFPCP vorkommende pseudozweizählige Symmetrie [Schulte et al.,

submitted]. Trotz der geringen Sequenzidentität zeigt die Struktur groÿe Ähnlichkeit

mit der Hauptform[Schulte et al., submitted]. Der gröÿte Unterschied liegt in dem

Verlust eines Peridinins bei HSPCP [Schulte et al., submitted].

1.5 Ziel der Arbeit

Im Rahmen dieser Arbeit sollten mehr Informationen über Grundlagen der Photo-

synthese am Beispiel von Lichtsammelkomplexen aus A.c. erhalten werden.

Neue Erkenntnisse über den Enerieübertragungsweg sollten durch eine biochemische

Charakterisierung der molekularen Interaktion zwischen dem löslichen und dem int-

rinsischen Lichtsammelkomplex gewonnen werden. Hierzu war eine Etablierung und

1.5 Ziel der Arbeit 18

nachfolgende Optimierung der Rekonstitution von LHC in Lipidvesikeln nötig.

Auch sollte der Ein�uss von Licht auf die Zellen und die Bildung der Lichtsammel-

komplexe durch Belichtungstest an Zellkulturen untersucht werden.

Voraussetzung für Informationen der Lichtsammelkomplexe auf atomarer Ebene

durch Röntgenstrukturanalyse sind Proteinkristalle. Innerhalb der vorangegangenen

Diplomarbeit konnten Kristallschauer oder stark verwachsene Kristalle von LHC ge-

züchtet werden. Auf diesen Ergebnis aufbauend sollten Einkristalle gezüchtet werden,

die zu Datensätzen für die Strukutraufklärung führen sollten. Eine Verbesserung

der Strukturinformationen der Pigmente sollten über eine hochaufgelöste MFPCP

Struktur erhalten werden. Der dafür benötigte optimierte Screen wurde während der

Diplomarbeit entwickelt.

Weitere Informationen über Anzahl und Art der Isoformen von PCP sollte zum einen

durch eine Optimierung der Aufreinigung aus der Diplomarbeit erreicht werden. Zum

anderen sollten Gröÿenbestimmungen und die Untersuchung durch UV/VIS Spek-

troskopie Informationen über durch die Chromatofokussierung erhaltenen Peaks hin-

sichtlich der Isoformen liefern.

2.1 Material 19

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Chemikalien

Acrylamidstock (30 %) AppliChem, Darmstadt

ADA Sigma, Steinheim, Lotnr.:121K5430

Al�s Öl Hamton Research, Aliso Viejo (USA),

Lotnr.:341712

Aluminiumkaliumsulfatdodecahydrat

(AlKSO4x12H2O)

Merck, Darmstadt

Ammoniumperoxodisulfat (APS) Merck, Darmstadt

Ammoniumacetat Fluka, Neu-Ulm, Lotnr.:424076/144701

B12 (Vitamin) Fluka, Neu-Ulm

Biobeads SM2 Biorad, München

Biotin Fluka, Neu-Ulm

Bis-Tris Propane Sigma, Steinheim, Lotnr.:085K5450

Borsäure J.T. Baker, Groÿ-Gerau

Bromphenolblau Merck, Darmstadt

BSA (Albumin Fraktion V, biotinfrei) Roth, Karlsruhe

Cadmiumsulfat Fluka, Neu-Ulm,

Lotnr.:455190/110807023

Calciumchlorid Fluka, Neu-Ulm,

Lotnr.:125183823807054

Coomassieblue AppliChem, Darmstadt

β-n-Decylmatosid Biomol, Hamburg

EDTA (Titriplex III ) Merck, Darmstadt

Eisen-(II)-sulfat Riedel-de Haen, Seelze

2.1 Material 20

Essigsäure J.T. Baker, Groÿ-Gerau

Ethanol J.T. Baker, Groÿ-Gerau

Glycerin J.T. Baker, Groÿ-Gerau

HEPES Natriumsalz Sigma, Steinheim, Lotnr.:076K5429

JBScreen Heavy Jenabbioscience, Jena

Kaliumchlorid (KCl) J.T. Baker, Groÿ-Gerau

Kobaldchlorid (CoCl2x 6H2O) Merck, Darmstadt

Lithiumsulfat Fluka, Neu-Ulm, Lotnr.:131981212807167

Low Range Marker Biorad, München

Magnesiumacetat Fluka, Neu-Ulm, Lotnr.:135577723507149

Magnesiumchlorid (MgCl2x 6H2O) J.T Baker, Groÿ-Gerau

Magnesiumchlorid Fluka, Neu-Ulm, Lotnr.:133280833907273

Manganchlorid (MnCl2x 4H2O) Merck, Darmstadt

β-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt

MPD Fluka, Neu-Ulm

Natriumacetat Fluka, Neu-Ulm, Lotnr.:135320943707195

Natriumchlorid Fluka, Neu-Ulm, Lot.:134432343107167

Natriumcacodylat Fluka, Neu-Ulm, Lotnr.:132123224507201

Natriumcacodylat Sigma, Steinheim, Lotnr.:103K0036

Natriumcitrat Fluka, Neu-Ulm

Natriumglycerinsulfat Sigma Aldrich, Taufkirchen

Natriumglycerolphosphat Sigam, Taufkirchen

Natriumnitrat J.T.BAker, Groÿ-Gerau

Natrumphosphat Fluka, Neu-Ulm, Lotnr.:135267913607074

Para�nöl Hamton Research, Aliso Viejo (USA), Lot-

nr.:341712

Phenylsulfonyl�uorid (PMSF) AppliChem, Darmstadt

Phosphatidylcholin siehe Sojalecithin

Phosphorsäure J.T Baker, Groÿ-Gerau

Polypu�er 96 Ge Healthcare, München

Polyethylenglykol (PEG) 400 Fluka, Neu-Ulm

Polyethylenklygol 600 Fluka, Neu-Ulm

Polyethylenglykol 1500 Fluka, Neu-Ulm


2.1 Material 21


Reef Salt Aqua medic, Bissendorf

Serva Blue G250 AppliChem, Darmstadt

Sodiumdodecylsulfat(SDS) AppliChem, Darmstadt

Sojalecithin aus der Sojabohne Applichem, Darmstadt

Sticksto�(�üssig) Chemikalienlager, Bochum

Stickso� (gasförmig) Chemikalienlager, Bochum

Sucrose AppliChem, Darmstadt

Temed Merck, Darmstadt

Thiamine HCL Sigma Aldrich, Taufkirchen

Tricine AppliChem, Darmstadt

Trilon B (Na4EDTA) BASF, Ludwigshafen

tri-Natrium citrate Fluka, Neu-Ulm, Lotnr.:134165243107170

TRIS-HCL Sigma, Seelze, Lotnr.:116K5446

Tris (Trizima base) Sigma Aldrich, Taufkirchen

Zinksulfat (ZnSO4x7H2O) Riedel-de Haen, Seelze

QSepharoseXL Ge-Healthcare, München

2.1.2 Pu�er und Lösungen

APS 10 % 0,01 l

1 g APS

Bradfordreagenz 1 l

0,1 g Serva Blue G250

0,1 l 85 % (v/v) ortho-Phosphorsäure

0,0467 l Ethanol

Lösung mischen und dann durch einen

Whatmannpapier�lter �ltrieren. Lagerung in

brauner Glas�asche bei Raumtemperatur

Coomassiefärbelösung 1 l

20 % Essigsäure

0,2 % Coomassieblue

80 % A.dest

2.1 Material 22

Eisenchelatlösung 0,9 l

7,45 g EDTA

0,9 l A.dest

20 min. rühren

3,02 g Eisen(II)sulfat zugeben

rühren bis die Lösung klar ist, steril�ltrieren, La-

gerung unter Lichtausschluÿ bei RT

Elektrophoresepu�er

zehnfach

1 l

144 g Glycin

30 g Tris pH 8,6 -8,8

10 g SDS

Elutionspu�er 0,49 l

0,035 l Polypu�er 96

0,455 l A.dest

Entfärber

10 % Essigsäure

10 % Ethanol

80 % A.dest

LHCP1 1 l

50 mM Tricine pH 7,5

20 mM KCl

LHCP2 1 l


20 mM KCl

LHCP3 0,5 l


0,16 % DM

LHCP4 0,25 l


500 mM KCl

0,16 % DM

LHCP5 0,5 l


150 mM KCl

0,16 % DM

2.1 Material 23

Meerwasser 10 l

10 l A.dest

333,33 g reef salt

über Nacht mit Aquariumpumpe gelöst und be-

gast, autoklaviert

Macronutriens 1 l

5,5 g Natriumnitrat

8,0 g Tris pH 8,2

0,54 g Natriumglycerolphosphat

Lösung autoklavieren

Micronutriens 1 l

1,145 g Borsäure

0,00788 l Eisenchelatlösung

0,004 g Kobaldchlorid

0,144 g Manganchlorid

1,120 g Trilon B

0,023 g Zinksulfat

Lösung autoklavieren

Parvasoli�s enriched sea

water (PES)

1 l

1 l Meerwasser

0,01 l Macronutriens

0,01 l Micronutriens

0,00001 l Vitamine

0,00032 l Eisenchlelatlösung

2.1 Material 24

PCPP1 1 l

1 mM Tris pH 8,3

PCPP2 1 l

1 mM Tris pH 8,3

250 mM NaCl

PMSF-Stocklösung

0,05 g PMSF

0,001 l Ethanol p.a.

Sammelgelpu�er 1 l

0,5 M Tris pH6,8

Sammelgel 2 Gele

1,25 ml Sammelgelpu�er

0,05 ml 20 %SDS

0,65 ml Acrylamidstock

3,10 ml A.dest

0,005 ml Temed

0,025 ml 10% APS

Säulenreinigunslösung 1 l

2 % LDAO

0,5 M NaOH

2 M NaCl

20 % Ethanol

2.1 Material 25

Startpu�er 1 l

25 mM Tris pH 10

SDS-Lösung 20% 0,1 l

20 g Sodiumdodecylsulfat

in 100ml A.dest lösen

SDS-Marker Probenpu-

fer Stammlösung

4,8 ml A.dest

1,2 ml 0,5 M Tris-HCl pH 6,8

1 ml Glycerin

10 % (w/v) SDS

0,1 % (w/v) Bromphenolblau

1: 20 mit β-Mercaptoethanol mischen

SDS-Probenpu�er zwei-

fach

0,095 l

0,02 l 20 % SDS

0,025 l Sammelgelpu�er

0,04 l Glycerin

1 Spatelspitze Bromphenolblau

SDS-Probenpu�er zwei-

fach + β Me

0,5 ml

0,475 ml 2x SDS-Probenpu�er

0,025 ml β-Mercaptoethanol

Sucrosegradienten 30%

120 g Sucrose

280 g Pu�er LHCP2

32 ml Lösung in SW28 Röhrchen überführt und

bei -20°C eingefroren und gelagert

vor Gebrauch bei Raumtemperatur aufgetaut

2.1 Material 26

Trenngelpu�er 1 l

1,5 M Tris pH 8,8

Trenngel 2Gele

3,75ml Acrylamid

3,6ml A.dest

0,037ml 10% APS

0,075ml 20%SDS

0,0015ml Temed

3,75ml Trenngelpu�er

Vitaminlösung 100ml

0,016 g Biotin

0,200 g Thiaminhydrochlorid

0,016 g Vitamin B12

Lösung steril�ltriert

2.1.3 Material und Geräte

Material

CryoCap mit DatenMatrix Molecular DimensionLimited, Su�olk

(GB)

Crystalwand Hamton Reasearch, Aliso Viejo(USA)

Erlenmeyerkolben Schott, Mainz

Falkontubes Corning, Hagen

Filter 0,2µm Sarstedt, Nümbrecht

Fleischerkisten 35l Korten, Bochum

Gel�ltrationssäule HR10/60 Amersham Biosciences, Freiburg

Germaniumkristall ACM, Paris (Frankreich)

Glas�aschen (Blue cap) Schott, Mainz

Kristallisationsplatten

24well Hampton Research, Aliso Viejo (USA)

Stripes Douglas Instruments, Hungford (USA)

3550 corning (Roboter) Corning Incorporated, Corning(USA

Konzentratoren MiliQ Milipore, Schwalbach

Konzentratoren Vivaspin Sartorius, Göttigen

2.1 Material 27

Kristallisationsscreens:

MB class Quiagen, Hilden

MB class II Quiagen, Hilden

PEG Quiagen, Hilden

Cryo Quiagen, Hilden

Classic Quiagen, Hilden

SM1 Quiagen, Hilden

SM2 Quiagen, Hilden

JCSG Quiagen, Hilden

Memfac Hamton Research, Aliso Viejo (USA)

Lampen: 34883 F18W/54 daylight (An-

zucht)

GE Healthcare, München

Loops Nylon Hamton Research, Aliso Viejo(USA)

Litholoops Molecular Dimension Limited, Su�olk

(GB)

Loops Micromounts MiTeGen, Ithaca (USA)

Magnetic Cryovial Molecular DimensionLimited, Su�olk

(GB)

Quarzküvetten Hellma, Mülheim

Säule Superdex 200 HR 16/60 GE Healthcare, München

Säule Superdex 200 HR 16/30 GE Healthcare, München

Säule XK 16/20 Leersäule GE Healthcare, München

Säule XK 26/20 Leersäule GE Healthcare, München

Säule C 16/100 Leersäule GE Healthcare, München

Säule C 16/40 Leersäule GE Healthcare, München

Säule Hitrap-QXL 1 ml GE Healthcare, München

Säule Hitrap-DEAE 1 ml GE Healthcare, München

Säule Hitrap-Source15S 1 ml GE Healthcare, München

Säulenmaterial DEAE GE Healthcare, München

Säulenmaterial PBE94 Polypu�erAustau-

scher

GE Healthcare, München

Säulenmaterial Sephacryl S300 GE Healthcare, München

Säulenmaterial Sepharose QXL GE Healthcare, München

Silikonschläuche Chemikalienlager, Bochum

2.1 Material 28

Spritze 50 ml Luer-Lok BD,Heidelberg

Spritze 2 ml BD, Heidelberg

Sprudelsteine Hagen, Bönen

Zentrifugentubes:

Ti45 Beckmann, München

SS34 Sorvall, Bad Homburg

SW28 Beckmann, München

SLC600 Sorvall, Bad Homburg

Viskosetuch Rewe, Bochum

Geräte

Äkta Puri�er GE Healthcare, München

Aquariumpumpe WS2 Schego, O�enbach

Autoklav Modell C Webco, Bad Schwartau

Becherresonanzsoni�er Branson, Raleigh (USA)

Becherresonanzsoni�er-Kühlung FE Haake, Berlin

Biofuge pico Heraeus, Hanau

Cell disrupter TS constant Sytsmes Ltd, Königswinter

Distille:Aquatron A 4000 Bibby, Stone (GB)

Emulsi�ex-C5 Avestin, Mannheim

Feinwaage CP225 Sartorius, Göttingen

French Press Cell Press Thermo Spectronic, Rochester (USA)

Fluidizer 110L Micro�uidics, Newton (USA)

Glashomogenisator nach Dounce (Glaspi-

still)

Glasbläserei, Bochum

Glashomogenisator nach Potter-Elvehjem

(Te�onpistill)

KIMBLE KONTEs, Vineland (USA)

JBSC Heavy atom screen Jena Biosciences, Jena

Kristallisationsschrank WBK200 Mytrom, Heiligenstadt

Kristallisationsroboter Phoenix Dunn, Asbach

Kühlbrutschrank memmert, Schwabach

2.1 Material 29

Kühlge�rekombination Liebherr, Ochsenhausen

Kühlzentrifuge 5415R Eppendorf, Wesseling-Berzdorf

Lagerdewar VHC35 (Kristalle) Taylor-Wharton, Husum

Mikroskop SZX2FOF Olympus, Hamburg

Kaltlichtquelle KL 2500LCD Olympus, Hamburg

Mikroskop CX41RF Olympus, Hamburg

Mini-Extruder Avanti Polar Lipids, Alabaster (USA)

Mini-Protean II Zelle (SDS-Gele) Biorad Laboratories, München

MiliQ-Anlage Millipore, Schwalbach

Peristaltikpumpe Ismatec, Wertheim-Mondfeld

Plasma cleaner Harrick Plasma, Ithaca (USA)

Power Supply PPS 200-1D(SDS-Gele) Biorad, München

Power PAck 300 (SDS-gele) Biorad, München

Particle Sizer Malvern, Worcestershire (GB)

pH-Meter 766 Knick, Berlin

Phometer:Ultrocpec 3000pro Amersham Biosciences, Freiburg

Plexiglasdeckel für Anzuchtkästen Universitätswerkstatt, Bochum

Puri�er Amersham Biosciences, Freiburg

Rollerrad Universitätswerkstatt, Bochum

Röntgendi�raktometer:

FR-591 Bruker AXS, Rheinstetten

Cryostream Oxford Cryosystems, Oxford (GB)

Imageplate Mar345DTB Mar Research, Norderstedt

Schüttelinkubator 3017 GFL, Burgwedel

Tensor 27 Bruker, Ettlingen

Thermomixer Eppendorf, Wessling-Berzdorf

Tischzentrifuge Eppendorf, Wesseling-Berzdorf

Tischkühlzentrifuge 5415R Eppendorf, Wesseling-Berzdorf

Ultrazentrifuge Optima Beckmann, München

2.2 Methoden 30

Rotoren:

Ti45 Beckmann, München

SW28 Beckmann, München

Zentrifuge Evolution Sorvall,Bad Homburg

Rotoren:

SS34 Sorvall, Bad Homburg

SLC6000 Sorvall, Bad Homburg

Vortex Yelow line Ika Works, Wilmington (USA)

Waage SBA 41 Scaltec

2.2 Methoden

2.2.1 SDS-Polyacylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page)

In der SDS-Page werden Proteine aufgund ihrer unterschiedlichen Molekulargewich-

te getrennt. Zuerst wird Sodiumdodecylsulfat (SDS), ein anionisches Detergenz zu

den Proben gegeben. Es überdeckt die Eigenladung der Proteine. Das Gel besteht

aus zwei Teilen, dem Sammelgel und dem Trenngel. Im Sammelgel kommt es bei

angelegter Spannung durch den pH-Wert 6,8 zu einem �Stapele�ekt” in einem he-

terogenen Pu�er aus Glycin und Chloridionen. Aufgrund seiner geringen Mobilität,

wandert Glycin in diesem pH-Bereich hinter der Proteinfront, während das Chloridi-

on als Leition vor der Front läuft. Während der Wanderung durch das Gel stapeln

sich die Proteine dabei in Reihenfolge ihrer Mobilität. Beim Eintritt in das Trenngel

kommt es jedoch zu einem Staue�ekt, da hier der Reibungswiderstand im Gegen-

satz zum Sammmelgel aufgrund der höheren Acrylamidkonzentration sehr hoch ist.

Das Glycin überholt hier aufgrund des pH Wechsels die Proteinfront und es ent-

steht ein homogener Pu�er, in dem die Proteine in Abhängigkeit von ihrer Gröÿe

wandern. Zur elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen wurden 15 % ige SDS-

Polyaacrylamidgele verwendet [Laemmli, 1970]. Die Elektrophorese wurde mit einer

Mini-Protean II Zelle durchgeführt. Als Marker wurde der Low Range Marker von

Biorad verwendet. Der Sammelgelpu�er war ein 0,5 M Trispu�er mit einem pH Wert

von 6,8. Als Trenngelpu�er wurde ein 1,5 M Trispu�er mit einem pH Wert von 8,8

verwendet. Die Färbung der Gele wurde mit Coomassiefärbelösung durchgeführt.

2.2 Methoden 31

Das Entfärben erfolgte mit einer Entfärberlösung. Die Proben wurden eins zu eins

mit 2 X SDS-Probenpu�er gemischt, der 4 % reduzierendes SDS enthielt.

2.2.2 UV/VIS Spektroskopie

Die UV/VIS Spektroskopie ist ein Verfahren, bei dem Strahlung mit einer Wellen-

länge von 230 nm bis 800 nm auf eine Probe tri�t. Durch die in der Probe enthal-

tenen Teilchen wird ein Teil der einfallenden Strahlung absorbiert. Die Beziehung

zwischen der Intensität der einfallenden und ausfallenden Strahlung wird durch das

Lambert-Beersche Gesetz beschrieben. Dabei hängt die Extinktion von Konzentrati-

on der Moleküle, Wellenlänge des Strahls und dem molaren Extinktionskoe�zienten

ab [Lehniger, 1994].

log I0/I = Extinktion (Absorption)

I0 = einfallende Strahlung

I = ausfallende Strahlung

(2.1)

Absorption = ε× c× d

(2.2)

ε = Extinktionskoe�zient

c = Konzentration

d = Schichtdicke der Küvette

Es wurden Spektren zwischen 250 nm und 800 nm aufgenommen. Im UV Bereich

zwischen 260 nm und 280 nm absorbieren DNA und RNA, sowie aromatische Amino-

2.2 Methoden 32

säuren. Die Pigmente von LHC und PCP absorbieren im sichtbaren Bereich (Abb.

2.1). PCP absorbiert aufgrund des hohen Peridiningehaltes vorwiegend zwischen

460 nm und 560 nm, wobei das Maximum bei 478 nm liegt. LHC enthält neben

Perdinin Chlorophylla und Chlorophyllb, die das Absorptionsspektrum bestimmen.

Chlorophylla hat in LHC bei 440 nm und bei 672 nm jeweils ein Absorptionsmaxi-

mum, das Absorptionsmaximum von Chlorophyll c2 liegt bei 461 nm [Sharples et al.,

1996].

0

0,1

0,2

0,3

0,4

300,0 400,0 500,0 600,0 700,0

Wellenlänge [nm]

Abs

orpt

ion

Abbildung 2.1: UV/VIS Spektren von LHC und PCP aus Amphidinium carterae.Schwarz : LHC, rot: PCP

Das Spektrum von denaturiertem LHC unterscheidet sich in der Absorption der

Chlorophylle signi�kant von nativem LHC. Die zwei Peaks von Chlorophyll a und c

im Bereich von 400 nm bis 480 nm verschmelzen zu einem Peak, dessen Maximum

bei ca. 450 nm liegt [Sharples et al., 1996].

2.2 Methoden 33

2.2.3 Proteinmengenbestimmung von PCP und LHC über UV/VIS

Absorption

Die oben beschriebene UV/VIS Spektroskopie konnte auch zur Proteinmengenbe-

stimmung genutzt werden. Die Berechnung der PCP Konzentration erfolgte nach

folgender Formel:

PCP [mg/ml]= A478 nm x 0,046 mg/ml [Hofmann, 1996]

(2.3)

Auch die Berechnung der LHC Konzentration sollte über Spektren erfolgen. Hierzu

wurde die Proteinkonzentration von aufgereinigtem LHC mit der Bradfordmethode

(595 nm) bestimmt und dann die OD der Probe bei 672 nm im Spektrum ermittelt.

Die Bestimmung mit dem Bradfordreagenz erfolgte in sechs Doppelmessungen. Die

OD Messungen mit UV/VIS Spektren wurden zweimal mit der 1:100 verdünnten

Probe durchgeführt. Dadurch sollte der Extinktionskoe�zient für die Konzentrati-

onbestimmung von LHC mit UV/VIS Spektroskopie ermittelt werden.

2.2.4 Anzucht von Amphidinium carterae (A. c.)

Die Anzucht der Dino�agellaten erfolgte unter Schwachlicht, da hier die Translations-

raten der Lichtsammelkomplexe und die produzierte Proteinmenge erhöht sind [ten

Lohuis MR and Miller, 1998; Roman et al., 1988; Samuelsson and Richardson, 1982].

Als Medium wurde Provasoli enriched sea media (PES) verwendet. Aus Dauerkultu-

ren von Amphidinium carterae wurden für Vorkulturen wöchentlich 5 ml entnommen

und zusammen mit 35 ml PES in einen 200 ml Erlenmeyerkolben überführt. Diese

wurden drei Wochen bei 19 - 20 °C und 20 µ E m−2 s−1 inkubiert. Die Anzucht

der Groÿkulturen der Zellen erfolgte in 35 l Fleischerkästen mit Plexiglasdeckel bei

19 - 20 °C unter semisterilen Bedingungen (Abb. 2.2). Für eine Groÿkultur wurden

zweimal 15 l PES mit je 20 ml Vorkultur angeimpft. Nach drei Wochen wurde die

2.2 Methoden 34

Kultur durch Zugabe von 1,7 l 2x PES mit Nährsto�en versorgt. Die Ernte erfolgte

nach insgesamt vier Wochen Wachstum.

Abbildung 2.2: Anzuchtkästen von Amphidinium carterae

2.2.5 Anzucht von A. c. unter verschiedenen Lichtbedingungen

Die Produktion von Translationsprodukten der Lichtsammelkomplexe in A. c. ist

abhängig von der Belichtung der Kulturen [ten Lohuis MR and Miller, 1998; Roman

et al., 1988; Samuelsson and Richardson, 1982]. Je höher die Lichtintensität desto we-

niger Produkt ensteht. Um den Ein�uss der Belichtung auf die Zellen zu beobachten

wurden Kulturen bei verschiedenen Lichtbedingungen inkubiert. Die Anzucht erfolg-

te in 0,05 l, 0,25 l und 2 l Erlenmeyerkolben. Das Volumen der Proben betrug 50 ml

im kleinen Kolben und 100 ml, 500 ml in den gröÿeren. Die Animpfung der Proben

erfolgte mit 1-2 ml Vorkultur (siehe Anzucht). Als Medium wurde PES verwendet.

Nach zweiwöchigem Wachstum bei ca. 100 µE (Starklicht), 20 µE (Schwachlicht)

oder ca. 5 µE (Schatten) (Abb. 2.3) erfolgte die Begutachtung. Durch Zugabe von

AlkSO4 konnten die Zellen geerntet werden. Die Zellsedimente wurden mit dem Puf-

fer LHCP1 gewaschen und mit dem Soni�er aufgeschlossen. Der Überstand und die

Membranpellets wurden begutachtet.

2.2 Methoden 35

A B

Abbildung 2.3: Anzucht unter verschiedenen Belichtungen A: vorne sind die Kuturenunter Schwachlichtbedingungen abgebildet, direkt vor den Lampen sind die Starklichtan-zuchten, B: die Anzucht im Schatten

2.2.6 Ernte von Amphidinium carterae

Die Zellen wurden durch ein Viskosetuch in drei 10 l Glas�aschen �ltriert und dann

mit Aluminiumkaliumsulfatdodecahydrat (AlKSO4 x 12 H2O) gefällt. Nach Zugabe

des Fällungsmittels wurde die Suspension gemischt. Nach ca. einer Stunde hatten

sich die Zellen abgesetzt und der klare Überstand wurde abgenommen und verworfen.

Die verbliebenen Kulturen wurden vereinigt nach einer weiteren Stunde Absetzzeit

wurde erneut der klare Überstand verworfen und die Suspension in SLC 6000 Tubes

überführt. Danach erfolgte eine Zentrifugation bei 3700 rpm für 10 Minuten. Als

Rotor wurde der SLC 6000 verwendet. Der Überstand wurde verworfen und das

Zellsediment wurde mit Pu�er LHCP1 gewaschen (Zentrifugation: 10 min, 3700 rpm,

SLC 6000). Das erhaltene Pellet wurde in ein 50 ml Falkontube überführt und bei

-20 °C eingefroren und gelagert.

2.2.7 Aufreinigung LHC aus Amphidinium carterae

Membranpräparation

Für die Isolierung von LHC aus den Thylakoidmembranen sollte die Vorschrift aus

der Diplomarbeit optimiert werden.

Das Zellsediment wurde bei 18 °C aufgetaut, dann im Pu�er LHCP1 aufgenommen

und mit einem Glashomogenisator homogenisiert. Die weiteren Arbeitsschritte er-

folgten auf Eis bei Rotlicht und unter Zugabe von PMSF als Proteaseinhibitor in

der Endkonzentration von 0,1 mg/ml. Das Homogenisat wurde bei 10.000 rpm bei

4 °C im SS34 Rotor zentrifugiert. Das Zellsediment wurde in Pu�er LHCP1 aufge-

2.2 Methoden 36

nommen und homogenisiert. Der Aufschluss der Zellen erfolgte mit verschiedenen

Aufschlussgeräten bei der die Zellen mittels Druck durch eine enge Ö�nung gepresst

wurden. Die dabei entstehenden Scherkräfte sollten die Zellen zerstören. Der Auf-

schluss erfolgte mit French Press, Fluidizer, Emulsi�ex und Cell disrupter (Tab. 2.7).

Beim Emulsi�ex musste um Verstopfungen der Apparatur zu verhindern die Probe

stark verdünnt werden. Durch Zugabe von ca. 3 µl Antifoam auf 60 ml Zellsuspension

konnte eine Schaumbildung beim Zellaufschluss mit dem Cell Disrupter vermieden

werden.

Gerät Druck Anzahl der Durchgänge Probenvolumen

French Press 96 MPa 2 60 mlFluidizer 69 MPa 3 60 mlEmulsi�ex 50- MPa 4-7 300 ml

Cell Disrupter 100 MPa 3 60 mlTabelle 2.7: Die verschiedenen Aufschlussgeräte

Durch Zugabe von PMSF in der Endkonzentration von 0,1 mg/ml sollten Pro-

teasen, die LHC und PCP abbauen können, inhibiert werden. Die Membranen wur-

den von den löslichen Bestandteilen der aufgeschlossenen Zellen durch Ultrazen-

trifugation mit 22.000 rpm bei 4 °C im Ti45 Rotor 30 min. getrennt. Der rote

Überstand enthält PCP. Das Membransediment wurde in LHCP1 Pu�er aufgenom-

men und homogenisiert. Durch eine nachfolgende zwanzigminütige Zentrifugation

bei 10.000 rpm im SS34 Rotor bei 4 °C sollten Nicht-Membranbestandteile ausgewa-

schen werden. Der rötliche Überstand wurde für weitere Versuche bei 4°C gelagert.

Es erfolgte ein weiterer Waschschritt mit LHCP2 (Zentrifugation: 10.000 rpm im

SS34, 4 °C). Die Membranen wurden in ca. 20 ml Pu�er LHCP2 aufgenommen und

homogenisiert. Das Homogenisat wurde auf sechs 30 % Saccharosegradienten ver-

teilt und 17 h bei 22.000 rpm und 4 °C im SW28 Rotor zentrifugiert um verbliebene

lösliche Bestandteile von den Membranen zu trennen. Die Membranen setzten sich

am Boden der Gradienten ab und wurden weiter verwendet. Der klare Überstand

wurde verworfen. Die nach der Dichtezentrifugation erhaltenen Pellets wurden in

Pu�er LHCP2 aufgenommen und homogenisiert.

2.2 Methoden 37

Solubilisierung

Membranproteine wie LHC können normalerweise nur durch Detergenzien aus der

Membran in Lösung gebracht werden. Detergenzien wie z.b. Beta-n-Decylmaltosid

(DM) sind amphiphile Moleküle, die einen polaren hydrohpilen und einen unpolaren

hydrophoben Anteil besitzen. Sie bilden Micellen aus, bei denen der hydrophobe Teil

nach innen und der hydrophile Teil nach auÿen gerichtet ist. Die Membranproteine

werden in diese Micellen eingebaut und so aus der Membran gelöst [Blaicher, 2005].

Für die Solubilisierung des intrinsischen Lichtsammmelkomplexes wurde die Protein-

konzentration des Homogenisats aus der Membranpräparation mit der Bradfordbe-

stimmung ermittelt und dann auf 2 mg/ml eingestellt. Durch Zugabe von 1 % DM

sollte der LHC Komplex aus der Membran herausgelöst werden. Die Solubilisierung

erfolgte für 135 min. bei 190 rpm auf einem Schüttelinkubator ohne LichtEin�uss

bei ca. 8 °C. Zur Trennung der solubierten Proteine von den Membranen wurde

eine Ultrazentrifugation bei 14.000 rpm und 4 °C im Ti45 Rotor durchgeführt. Der

dunkelbraune Überstand wurde zur weiteren Reinigung mit einem Filter (0,2 mm

Porengröÿe) �ltriert.

Anionenaustauschchromatographie

Bei der Anionenaustauschchromatographie erfolgt die Trennung eins Proteingemi-

sches aufgrund der unterschiedlichen Ladungen. Die geladenen Proteine binden

durch elektrostatische Wechselwirkungen reversibel an die geladenenen Gruppen

der Säulenmatrix. Die Elution der Proteine erfolgt durch einen steigenden Salzgra-

dienten, da die Salzionen eine höhere A�nität zum Säulenmaterial besitzen und die

Proteine von der Säule verdrängen [Risch and Seitz, 1989]. Der aus der Aufreinigung

erhaltene Überstand wurde auf eine XK16/20 QSepharoseXL Säule aufgetragen. Die

Equilibrierung der Säule erfolgte mit dem Pu�er LHCP3 (20 mM Tricine pH 7,5,

0,16 % DM). Der Salzgradient wurde durch Mischung des Equilibrierungspu�ers

mit dem Pu�er LHCP4 (20 mM Tricine pH 7,5, 500 mM KCl, 0,16 % DM) erhalten.

Die Anionenaustauschchromatographie mit linearem Salzgradienten wurde mit dem

Äkta Puri�er-FPLC System bei 4 °C und Rotlicht durchgeführt. Der Verlauf der

Reinigung wurde durch SDS-Gele und UV/VIS Spektren verfolgt. Die braungrün

gefärbten LHC haltigen Fraktionen aus der Anionenaustauschchromatographie wur-

den vereinigt.

2.2 Methoden 38

Gel�ltration

Bei der Gel�ltration erfolgt die Trennung von Molekülen aufgrund der Gröÿe. Die

Probe wird auf eine Säule aus porösen Kügelchen mit de�nierter Porengröÿe aufge-

tragen, die aus einem unlöslichen, aber stark hydratisierten Polymer, wie Sepharo-

se besteht. Kleinere Moleküle können in die Poren eindringen. Je kleiner sie sind,

desto länger ist ihre Aufenthaltsdauer in den Poren. So passieren groÿe Moleküle

die Säule schneller als kleine. Die mobile Phase dient nur als Lösungsmittel, und

somit antikorrelliert die Verweildauer der Moleküle in der Matrix mit ihrem Mole-

kulargewicht [Lottspeich and Zorbas, 1998]. Die Gel�ltrationssäulen wurden mittels

einer Mischung aus dem High Molecular Weight und dem Low Molecular Weight Ka-

librierungskits (GE Healthcare) nach Anleitung des Herstellers kalibriert. Für den

Auftrag auf eine High Load HR16/60 Superdex 200 Säule wurden die LHC hal-

tigen Fraktionen der Anionenaustauschchromatographie vereinigt und mit einem

Milipore/Vivaspinkonzentrator mit einer Aufschlussgröÿe von 50 kDa oder 100 kDa

eingeengt. Der Auftrag erfolgte über eine 2 ml Schleife. Als Laufmittel wurde Pu�er

LHCP5 (20 mM Tricine pH 7,5, 150 mM KCl, 0,16 % DM) verwendet. Die Gel�ltra-

tion wurde mit dem Äkta Puri�er-FPLC System bei 4 °C und Rotlicht durchgeführt.

Der Verlauf der Reinigung wurde durch SDS-Gele und UV/VIS Spektren verfolgt.

Für weitere Experimente wurden die LHC-haltigen Fraktionen verwendet.

2.2.8 Aufreinigung von PCP aus Amphidinium cartreae

Innerhalb dieser Arbeit sollte die Aufreinigung im Vergleich zur Vorherigen [Johan-

ning, 2005] optimiert werden.

Eine bessere Auftrennung von PCP Isoformen sollte durch den Einsatz einer Io-

nenaustauschchromatographie, statt der ursprünglich verwendeten Chromatofokus-

sierung [Johanning, 2005] erfolgen. Es wurden neben der für die Aufreinigung von

PCP bekannten Matrix, DEAE [Haxo et al., 1976], auch die Säulenmaterialien Hi-

trapQXL und Source15S auf ihre Auftrennungseigenschaften getestet. Für den Auf-

trag wurden die PCP haltigen Überstände aus der LHC Aufreinigung verwendet und

mit einem 10 kDa Konzentrator eingeengt. Die Umpu�erung in PCPP1 (1 mM Tris

pH 8,3) erfolgte über eine PD10 Säule. Das Protein wurde mit einer 2 ml Schleife

aufgetragen. Der Salzgradient wurde durch Mischung des PCPP1 mit dem Pu�er

PCPP2 (1 mM Tris pH 8,3, 250 mM NaCl) gebildet. Der Säulenverlauf wurde mit

2.2 Methoden 39

dem Äkta Puri�er-FPLC System bei 4 °C und Rotlicht durchgeführt. Der Verlauf

der Reinigung wurde durch SDS-Gele und UV/VIS Spektren verfolgt. Das am besten

geeignete Material wurde weiterverwendet und die Anionenaustauschchromatogra-

phie wurde mit einer XK 26/20 Säule mit den oben genannten Pu�ern durchgeführt.

Der Auftrag erfolgte über eine 2 ml Schleife.Der Säulenlauf wurde mit dem Äkta

Puri�er-FPLC System bei 4 °C und Rotlicht durchgeführt. Der Verlauf der Reini-

gung wurde durch SDS-Gele und UV/VIS Spektren verfolgt.

Eine Vorreinigung der PCP Probe vor Auftrag auf die Chromatofokussierung und

die Anionenaustauschchromatographie (XK 26/20) erfolgte durch den Auftrag auf

eine Gel�ltrationssäule, Sepharose S300 XK 16/100. Bei der Gel�ltration erfolgt

die Trennung von Molekülen aufgrund der Gröÿe (siehe LHC Aufreinigung). Die

rötlichen Überstände aus der LHC Aufreinigung wurden �ltriert (Filter 0,2 mm Po-

rengröÿe) und mit einem 10 kDa oder 30 kDa Konzentrator eingeengt. Als Laufpu�er

wurde der Startpu�er (25 mM Tris pH 8,5) oder der PCPP1 Pu�er (1 mM Tris pH

8,3) verwendet. Der Säulenlauf wurde mit dem Äkta Puri�er-FPLC System bei 4 °C

und Rotlicht durchgeführt. Der Verlauf der Reinigung wurde durch SDS-Gele und

UV/VIS Spektren verfolgt.

Chromatofokussierung

Proteine enthalten geladene Gruppen, deren Ladung sich in Abhängigkeit vom pH-

Wert ändert. Der isolelektrische Punkt ist der pH-Wert, bei dem keine elektrische

Nettoladung vorhanden ist. Das Protein wandert nicht mehr in einem elektrisch ge-

ladenen Feld. Chromatofokussierung ist eine Auftrennung nach dem isoelektrischen

Punkt (pI): hierbei wird ein pH-Gradient erzeugt, indem die Säule mit Startpu�er

equilibriert wurde und die Proteine mit einem Pu�er mit geringem pH-Wert ihrem

pI nach getrennt wurden.

Für den Auftrag auf die PBE 94 Polypu�er Exchanger C16/40 Säule wurde das

aus der Gel�ltration konzentrierte PCP verwendet. Als Anfangspu�er wurde der

Startpu�er verwendet. Der pH-Gradient wurde mit dem Elutionspu�er gebildet. Die

Chromatofokussierung wurde mit dem Äkta Puri�er-FPLC System bei 4 °C und Rot-

licht durchgeführt. Der Verlauf der Reinigung wurde durch SDS-Gele und UV/VIS

Spektren verfolgt.

2.2 Methoden 40

2.2.9 Gel�ltration

Eine Untersuchung der Peaks der Chromatofokussierung erfolgte über eine Superdex

200 HR16/30 Säule. Die Proteine werden mit dieser Methode nach Gröÿen getrennt

(siehe LHC Aufreinigung) Die einzelnen Peakfraktionen wurden vereinigt und mit

einem 30 kDa Konzentrator eingeengt. Es erfolgte über eine 2 ml Schleife der Auftrag

auf eine Superdex 200 HR10/30 Säule. Als Laufpu�er wurde der LHCP2 Pu�er

(20 mM Tricine pH 7,5, 20 mM KCl) verwendet. Die Gel�ltration wurde mit dem

Äkta Puri�er-FPLC System bei 4 °C und Rotlicht durchgeführt. Der Verlauf der

Reinigung wurde durch SDS-Gele und UV/VIS Spektren verfolgt. Eine Eichung der

Säule erfolgte mit den HMW und LMW Kits nach Herstellervorschrift.

2.2.10 PCP Proben für Interaktionsstudien

Für Interaktionsstudien wurde der PCP Überstand aus der Aufreinigung von LHC

mit ZellAufschluss durch Fluidizer vereinigt, �ltriert und mit einem Filter mit

0,2 mm Porengröÿe �ltriert. Das erhaltene Filtrat wurde mit einem 30 kDa Kon-

zentrator eingeengt und über eine 2 ml Schleife auf eine Superdex200 Hr16/60 Säule

aufgetragen. Als Laufpu�er wurde der LHCP2 Pu�er oder der LHCP2 Pu�er mit

zugegebenen 20 mM MgCl2 verwendet.

2.2.11 Rekonstitution von LHC in Lipidvesikel

Die natürliche Umgebung von Membranproteinen ist eine Lipiddoppelschicht die

aus verschiedenen Phospholipiden aufgebaut ist [Vogel and Angermann, 1994]. Die

Zusammensetzung der Membran ist in verschiedenen Organellen und Organismen

unterschiedlich. Damit Membranproteine aus diesem Bilayer in Lösung gebracht wer-

den können werden Detergenzien verwendet. Für Untersuchungen der Funktion von

intergralen Membranproteinen müssen diese in künstlich hergestellte Lipiddoppel-

schichten eingebaut (rekonstituiert) werden. Dies kann unter anderem Detergenz-

vermittelt erfolgen [Rigaud et al., 1995]. Der anschlieÿende Entzug des Detergenz

erfolgt über Dialyse [Alpes et al., 1988; Rigaud et al., 1995] oder Biobeads [Rigaud

et al., 1995]. Eine sorgfältige Entfernung von nicht eingebautem Protein erfolgt über

einen Sukrosegradienten [Rigaud et al., 1995].

Da PCP durch das Detergenz DM denaturiert wird mussten für Interaktionsstudien

2.2 Methoden 41

von LHC mit PCP LHC in Phosphatidylcholinvesikeln rekonstituiert werden und

die bestehende Vorschrift [Johanning, 2005] optimiert werden. Dazu sollten unter

anderem zwei Methoden der Vesikelbildung gegenübergestellt werden. Die Herstel-

lung von Liposomen mittels Ultraschall [Sprague et al., 1985] und das ursprünglich

[Johanning, 2005] verwendete Verfahren.

Für das Verfahren mit hochfrequentem Schall wurden 20 mg Sojalecithin in einem

Milliliter LHCP2 aufgelöst. Zur Bildung von Liposomen wurde diese Lösung dann im

Becherresonatorsoni�er mit 40 % Beschallung und einer von der Spitze anhängigen

Amplitude (75 oder 20) in einem gekühlten System für zehn Minuten beschallt. Es

war darauf zu achten, dass die Amplitude für jede Spitze neu ausgetestet wurde, da

es bei einer zu hoher Amplitude zur Ausbildung sehr kleiner Vesikel (Durchmesser

unter 100 nm) kam. Die erhaltene Probe wurde dann mit dem Pu�er LHCP2 auf

10 mg/ml Phosphatidylcholin verdünnt. Bei der bestehenden Vorschrift erfolgte die

Vesikelbildung mit einer auf 10 mg/ml verdünnten Sojalecithinlösung. Die Bildung

der Liposomen erfolgte durch dreimaliges Schockgefrieren in �üssigem Sticksto� mit

anschlieÿendem langsamen Auftauen bei Raumtemperatur. Die mit beiden Metho-

den erhaltenen Vesikel wurden durch zehnmaligen Durchgang durch eine 200 nm

Membram mit dem Extruder auf eine Gröÿe zwischen 150-200 nm gebracht. Die

Gröÿe wurde über dynamische Lichtstreuung bestimmt. Sofort nach dem Extru-

der wurde den Vesikeln DM in der Endkonzentration von 0,16 % zugegeben und

die Liposomenlösung mit einer konzentrierten Proteinlösung gemischt. Das einge-

setzte Volumen der Proteinprobe betrug immer 0,5 ml. Nach einer Inkubation der

Vesikel-LHC-Mischung von fünfzehn Minuten bei 20 °C und 600 rpm im Thermo-

mixer wurden die Ansätze über Nacht bei 8 °C auf einem Rollinkubator gemischt.

Das Detergenz wurde durch SM2Biobeads entfernt [Rigaud et al., 1995]. Zur Vor-

bereitung der Biobeads wurden diese erst mit Methanol und danach zweimal mit

A. dest gewaschen (Zentrifugation: 10 min, 13.000 rpm, 4 °C in Eppendorftisch-

zentrifuge). Die Ansätze wurden mit 400 mg/ml Biobeads versetzt und für 6-7 h

bei 18 °C auf einem Rollerrad inkubiert. Nach zweiminütiger Zentrifugation mit

7.200 rpm in einer Eppendorftischzentrifuge bei 8 °C wurden die Überstände auf

30 %ige Sucrosegradienten aufgetragen und 17 h bei 22.000 rpm und 4 °C im SW28

Swingoutrotor zentrifugiert. Als Kontrolle wurden LHC ohne Vesikel, LHC ohne

Vesikel und Biobeadzugabe und leere Vesikel verwendet. Die entstandenen Banden

des rekonstituierten LHCs wurden abgenommen und ca. zehnfach mit Pu�er LHCP2

2.2 Methoden 42

verdünnt. Das Pelletieren erfolgte im Ti45 Rotor für 30 min bei 4 °C und 22.000 rpm

pelletiert. Das Pellet wurde in ca. 500 µl LHCP2 aufgenommen und die Qualität

der Probe durch ein UV/VIS Spektrum überpüft. Wurde die Lösung nicht sofort

weiter verwendet, erfolgte eine erneute Zentrifugation bei 4 °C und 10.000 rpm in

einer Eppendorftischzentrifuge. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet

bei 4 °C gelagert.

Für die Optimierung der Rekonstitution wurden LHC Konzentration von 1,5 mg/ml,

5 mg/ml und 10 mg/ml verwendet. Des Weiteren wurden verschiedene Lipid: Pro-

teinverhältnisse (1:1, 4:1, 10:1, 1:10) getestet. Die Durchführung der Rekonstitution

erfolgte mit verschiedenen Salzkonzentrationen von Kaliumchlorid wie auch mit zwei

verschiedenen Salzen (KCl, MgCl2).

2.2.12 Ober�ächenplasmonresonanzspektroskopie (SPR)

Die Ober�ächenresonanzspektroskopie wird unter anderem zum Nachweis und der

Untersuchung der Kinetik von Protein-Protein Interaktionen genutzt. Das Messprin-

zip beruht auf der Totalre�ektion eines einfallenden Lichtstrahls an der Grenz�äche

zweier Medien. Voraussetzung hierfür ist, dass das Medium an der Einstrahlseite

einen niedrigeren Brechungsindex aufweist als das zweite Medium, um bei einem

Einfallswinkel der Strahlung, die zu einem Brechungswinkel von 90 ° führen würde,

nur Re�exion auf zu weisen. Die in der SPR genutzten Sensorchips bestehen aus einer

mit Gold bedampften Glasschicht an der ein Lichtstrahl re�ektiert wird [Fägerstam

et al., 1992; Meyer]. Gold besitzt einen groÿen Brechungsindex, so dass an der Grenz-

schicht zwischen Glas und Medien mit geringerem Brechungsindex, wie Luft oder

lösliche Pu�er, ein Winkelbereich der Totalre�ektion existiert. Das elektrische Feld

der Lichtphotonen durchdringt trotz dieser Totalre�ektion die Goldschicht und regt

hier Elektronen an die zu elektromagnetischen wellen führen, den sog. Ober�ächen-

plasmonen [Eva-Kathrin Sinner, 2003; Schneider].Von der Goldschicht treten elektri-

sche Feldkomponenten bis oberhalb der Glasschicht heraus (evaneszentes Feld), wo

sie mit dort gebunden Partikeln interagieren [Schneider]. Dort können sie absorbiert

oder Phasenverschoben werden welches Auswirkungen auf den Totalre�ektionswin-

kel hat. Die Änderung ist abhängig von der Masse der gebundenen Partikel (Abb.

2.4) [Schneider].

2.2 Methoden 43

GlasträgerAufgedampfte Goldschicht

Fließkanal

Reaktionspartner

Immobilisierte Proteine

Licht Detektor

Abbildung 2.4: Die schematische Darstellung einer in der SPR genutzten Flieÿzelle

Bei einer Protein-Protein Interaktion erfolgt eine Massenänderung die zu einer

Änderung des Winkel führt. Kinetische Daten zu dieser Reaktion sind durch Aufnah-

me der Winkel über die Zeit möglich [Malmqvist, 1993], [Raghavan and Bjorkman,

1995].

Mit der SPR sollte die Interaktion zwischen LHC und PCP aus Amphidinium car-

terae nachgewiesen und untersucht werden. Die Experimente wurden an einem

Biacore T100 (GE Healthcare) in Kooperation mit Alexander Wolf vom BMZ in

Dortmund durchgeführt. Die bei der Rekonstitution hergestellten Vesikel mit ein-

gebautem LHC wurden in 0,5 ml LHCP2-MgCl2 aufgenommen und sollten auf der

Ober�äche eines L1 Chips (GE Healthcare) immobilisiert werden. Dieser L1 Chip

hat als Matrix lipophile Gruppen kovalent an kaboxmethyliertes Dextran gebun-

den [Erb et al., 2000], [Stenlund et al., 2003] wodurch eine Ober�äche entsteht,

die besonders für die Membranen- und Lipidvesikelanheftung konzipiert wurde. Als

Laufpu�er wurde der �ltrierte und entgaste LHCP2-MgCl2 Pu�er(20 mM Tricine

2.2 Methoden 44

pH 7,5, 20 mM KCl, 20 mM MgCl2) verwendet. Als Negativkontrolle dienten Phos-

phatidylcholinvesikel mit ca. 150 nm Durchmesser. Als Ligand wurde PCP als Pool

aus den Peakfraktionen der Gel�ltration in Pu�er LHCP2 verwendet. Kurz vor der

Messung wurde MgCl2 in der Endkonzentration 20 µM zugegeben. Es wurden zwei

Konzentrationsreihen mit PCP Konzentrationen von 8,7 µM, 20 µM, 40 µM und

60 µM durchgeführt. Eine Langzeitdissoziationsmessung erfolgte mit 60 µM PCP.

Alle Messungen wurden bei 20 °C durchgeführt. Zur Reinigung des L1 Chips wurden

dieser mit 0,05 % SDS gespült und anschlieÿend mit einem Isopropanol : 50 mM

Natriumhydroxidgemisch im Verhältnis 2 zu 3 gewaschen um alle Vesikelreste zu

entfernen. Die Sensogramme wurden mit der Biacore control softwareT1001.1.1 auf-

genommen. Als Hintergrund diente die Negativkontrolle. Diese wurde von den ge-

messenen Sensogrammen vor der Auswertung subtrahiert. Die Analyse erfolgte mit

der Biacor evaluation 4.1 Software. Dabei wurden die Daten an eine Reaktion erster

Ordnung ge�ttet: A+B AB. Als Maÿ für die A�nität zweier Proteine gilt die

Dissoziation KD die aus dem Quotienten der Dissozitationsrate und der Assoziati-

onsrate berechnet wird. Unter der Annahme einer Reaktion erster Ordnung kann

die Dissoziationsrate koff aus der Gleichung Rt = R0 · e−koff (t−t0) erhalten werden

[O'Shannessy et al., 1993; de Keyzer et al., 2003]. Hierbei ist Rt die Resonanz zum

Zeitpunkt t, und die Resonanz zum Zeitpunkt t0 ist R0 [de Keyzer et al., 2003]. Die

Assoziationsrate kon ist abhängig von der Konzentration des Liganden und kann aus

folgender Gleichung abgeleitet werden: Rt = Requ(1− e−(kon(C)+koff )(t−t0) [de Keyzer

et al., 2003]. Sie wurde durch Anlegen einer monoexponentiellen Funktion an die

Anbindung ge�ttet. Für den Fit wurde nur der Anfangsbereich verwendet, indem

koff vernachlässigbar war. Die daraus erhaltene Geschwindigkeit stand im direkten

Zusammenhang mit der eingesetzten PCP Konzentration.

2.2.13 ATR- FTIR-Spektroskopie

Die Fourier-Transformations-Infrarot Spektroskopie (FTIR) in Kombination mit der

abgeschwächten Totalre�ektion (ATR) ist eine Methode, die neben der Sekundär-

strukturanalyse auch zur Untersuchung von Funkionsbeziehungen membrangebun-

dener Proteine genutzt werden kann. Das Meÿprinzip beruht wie die Methode bei

Bioacore auf der Totalre�ektion eines einfallenden Lichtstrahls an der Grenz�äche

zweier Medien. Hierfür muss das Medium an der Einstrahlseite einen höheren Bre-

2.2 Methoden 45

chungsindex besitzen als das zweite Medium. Der einfallende Lichtstrahl erfährt

während der Re�ektion eine Versetzung und erhält damit formal einen gekrümmten

Strahlenverlauf [Kellner and Gida�ly, 1978]. Es kommt zur Ausbildung von evanes-

zenten Wellen an der Grenz�äche [Harrick, 1967,]. Eine Probe die an der Ober�äche

des internen Refelektions Element (IRE) immobilisiert wurde kann mit dem evanes-

zenten Feld wechselwirken und es erfolgt eine wellenlängenabhängige Abschwächung

der Totalre�ektion [Kellner and Gida�ly, 1978; Per]. Zur Verstärkung des E�ektes

werden IRE�s aus z.B. Germanium oder Thalliumbromoiodid verwendet, an deren

Ober�äche Mehrfachre�ektionen möglich sind [Kellner and Gida�ly, 1978] (Abb.

2.5).

immobilisierte Probe

Infrarotstrahl

ATR-Kristall zum Detektor

Abbildung 2.5: Schematische Darstellung einer ATR Flieÿzelle

Die Wellenlängen des verwendeten Lichts liegen im Infraroten. Durch die Verwen-

dung eines Interferometeres ist eine Simultanaufnahme aller Wellenlängen möglich.

Das erhaltene Interferogramm wird durch die Fourier-Transformation in ein Infra-

rotspektrum umgerechnet. Die einzelnen Banden im Spektrum sind verschiedenen

Molekülschwingungen zuzuordnen. Im wesentlichen sind dies die C=O Streckschwin-

gung, und die N-H Biegeschwingung des Proteinrückgrades. Spezi�sch für Proteine

sind die Amid I- (ca. 1700 - 1600 cm−1) und Amid II-Bande (ca. 1600- 1500 cm−1),

2.2 Methoden 46

wobei die die der ersten stark durch die Bande der OH2- Biege-Schwingung überla-

gert wird.

Mit der ATR-FTIR-Spektroskopie sollte die Interaktion zwischen LHC und PCP un-

tersucht werden. Auch die Zusammensetzung des Rekonstitutionskonstruktes sollte

hier untersucht werden. Die Experimente und deren Auswertung wurden in Zusam-

menarbeit mit Jörn Güldenhaupt vom Lehrstuhl für Biophysik durchgeführt. Es

wurden IRE�s aus Germanium verwendet. Der Kristall wurde zur Vorbereitung ge-

reinigt und dann für 10-20 min. in konzentrierter Schwefelsäure inkubiert. Dies führte

zur Herstellung einer hydrophilen Ober�äche. Nach dem Abspülen mit A. dest und

trockenen des Kristalls mit Stickso�gas erfolgte eine Inkubation für 5 min in einem

Plasma Cleaner. Organische Verunreinigungen der Ober�äche konnten somit ent-

fernt werden. Danach erfolgte der Einbau des Kristalls in die Messzelle des Tensors

27 (Abb. 2.6).

Abbildung 2.6: ATR Meÿzelle mit eingebautem Germaniumkristall

Das System wurde mit LHCP2 + 20 mM MgCl2 equilibriert. Als Kontrolle wur-

den zum einen 0,5 ml Sojalecithinvesikel ohne rekonstituiertem LHC verwendet. Zum

anderen wurde eine Messung nur mit BSA immobilisiert auf der Ober�äche durch-

geführt. Für Absättigungen mit Rinderserumalbumin wurden 2,5 µl einer 40 mg/ml

Lösung BSA in 500 µl Pu�er mit MgCl2 aufgelöst. Die Pellets der Liposomen mit

2.2 Methoden 47

LHC wurden kurz vor der Messung in Pu�er LHCP2+20 mM MgCl2 aufgenom-

men. Als Ligand wurde der Pool aus den Fraktionen der Gel�ltration (Superdex 200

HR16/60) in Ausgangskonzentrationen von 87 µM und 60 µM verwendet. Kurz vor

der Messung wurde MgCl2 zugegeben. Es wurde immer ein Probenvolumen 0,5 ml

eingesetzt. In Abhängigkeit der Küvette betrug das Volumen im Gesamtsystem 2 ml.

Der Probenauftrag erfolte über eine Peristaltikpumpe mit einem Kreislaufsystem.

Das Waschen zwischen den Anlagerungen erfolgte im Durch�uss. Zunächst erfolgte

die Anbindung der Vesikel. Eventuell noch freie Stellen des Kristalls wurden dann

mit BSA abgesättigt. Danach sollte die Bindung von PCP untersucht werden. Die

erhaltenen Spektren wurden mit dem Programmm OPUS ausgewertet. Die Spek-

tren wurden Basislinien korrigiert. Der Verlauf der Vesikelanbindung wurde durch

die Änderung der CH Bande verfolgt. Der Verlauf der Proteinbande wurde mit der

Änderung in der Amid II-Bande untersucht.

2.2.14 Kristallisation

Für die Strukturanalyse mittels Röntgenbeugung werden Proteinkristalle benötigt.

Diese sollten in dieser Arbeit von PCP und LHC hergestellt werden. Dabei sollten

die Bedingungen aus vorherigen Experimenten [Johanning, 2005] verfeinert werden.

Kristallisation ist der Vorgang, bei dem Moleküle aus einer übersättigten Lösung

in einen kristallinen Zustand übergehen. Dieser Übergang kann durch Verdunstung

des Lösungsmittels, Zugabe eines Präzipitans, Änderungen des pH-Wertes, der Tem-

peratur oder einer Kombination aus diesen Faktoren erreicht werden. Salze wie z.B.

Ammoniumsulfat, organische Verbindungen wie z.B. Polyethylenklykol (PEG) oder

auch organische Lösungsmittel wie Ethanol können dabei als Präzipitant wirken.

Das Präzipitans verdrängt bei einer bestimmten Konzentration das Protein aus der

Lösung. Es gibt dabei verschiedene Phasen, in denen sich das Protein be�nden kann.

Diese hängen vom Verhältnis der Proteinkonzentration zur Fällungsmittelkonzen-

tration ab (Abb. 2.7). Ein Ausfall an Protein tritt dann auf, wenn die Fällung zu

schnell erfolgt. In der metastabilen Zone entstehen keine neuen Kristallen bestehende

Kristalle können aber hier weiter wachsen. Kristalle entstehen erst in der Nukleati-

onszone, wobei das Protein aus der Lösung entfernt wird (Abb. 2.7).

2.2 Methoden 48

Abbildung 2.7: Löslichkeitsdiagramm von Proteinen

Die zwei gebräuchlichsten Methoden der Kristallisation sind sitting drop (Abb.

2.8) und hanging drop (Abb. 2.8). Bei beiden verringert sich durch Dampfdi�usion

das Tropfenvolumen und die Konzentration im Tropfen steigt an der Unterschied

der beiden Verfahren liegt darin, dass bei dem hanging drop Verfahren der Tropfen

über der Reservoirlösung hängt und bei der sitting drop Methode in einer Mulde

oberhalb des Reservoirs sitzt [Ham, 2009].

H2O

Deckglas Kristallisationstropfen

H2O

Deckglas Kristallisationstropfen

Reservoir(700 µl)

H2O

Abbildung 2.8: Schmatische Darstellung der Kristallisation mit hanging drop und sittingdrop

2.2 Methoden 49

Weitere Arten der Kristallisation sind die kubischen Phasen und die Kristallisa-

tion unter Öl. Bei kubischen Phasen wird ausgenutzt, dass sich Lipide spontan zu

sogenannten Mesophasen zusammenlagern. Eine Art der Mesophase ist die wässri-

gen Mediums abhängig [Ca�rey, 2003]. Proteine interagieren mit diesen kubischen

Phasen indem sich Lipid-Proteinmicellen ausbilden die sich in das Kubische Gitter

einlagern und umgeben sind von Wasser. Es können auch Bikontinuierliche kubische

Phase ausgebildet werden. Dies sind dreidimensionale kontinuierliche Membranbi-

layer mit einem System aus zwei Wasserkanälen (Abb. 2.9) [Ca�rey, 2003; Landau

and Rosenbusch, 1996; Rummel et al., 1998].

Abbildung 2.9: Ein schematisches Modell bicontinuierlicher kubischer Phasen [Landauand Rosenbusch, 1996]

Das Verfahren der Kristallisation unter Öl beruht auf dem gleichen Prinzip wie

das der gebräuchlichsten Methoden, jedoch wird hier das Kristallisationslösung-

Proteingemisch unter eine Ölschicht plaziert (Abb. 2.10). Flüssigkeit verdampft

durch das Öl und die Konzentrationen im Tropfen nehmen zu. Die Geschwindig-

keit der Flüssigkeitsdi�usion nach auÿen ist abhängig von der Zusammensetzung

des Öles [Ham, 2009].

2.2 Methoden 50

Kristallisationstropfen

H2O

Öl

Abbildung 2.10: Schematische Darstellung der Kristallisation unter Öl

Für die Kristallisation mit der hanging drop und sitting drop Methode wurden 24

well Platten, 96 well Platten und Stripes mit acht Vertiefungen verwendet. Bei den

24 well Platten wurden die Ränder der einzelnen Vertiefungen mit Vaseline bedeckt.

Die Deckgläser wurden vor Gebrauch silikonisiert, indem sie in eine Silikonisierlö-

sung getaucht und eine halbe Stunde bei 160°C gebacken wurden. Das Reservoir

war mit 700 µl Kristallisationslösung gefüllt. Die Protein- und die Kristallisations-

lösung wurden gemischt und auf das Deckglas, oder bei sitting drop in der Vertie-

fung abgesetzt. Die Abdeckung der Reservoire erfolgte mit Deckgläsern. Die 96 well

Platten wurden für die Arbeit mit dem Phoenix Roboter verwendet. Das Reservoir

wurde mit 100 µl Kristallisationslösung gefüllt. Die Tropfen setzen sich aus 100 nl

Kristallisationslösung und 100 nl Proteinlösung zusammen. Die Platten wurden mit

einer Folie abgedichtet. Für den Roboter wurden kommerzielle Screens der Firma

Quiagen verwendet. Die Ansätze mit Stripes erfolgte mit 100 µl Reservoir und einer

Tropfenzusammensetzung von 1 µl Proteinlösung gemischt mit 1 µl Reservoirlösung.

Eine Abdichtung erfolgte mit Folie. Die Kristallisationsansätze wurden bei 18 °C und

Rotlicht pipettiert und bei 18 °C ohne Lichtein�uss inkubiert. Begutachtet wurden

die Bedingungen mit dem Stereomikroskop bei 18 °C und Kaltlicht.

Kristallisation von LHC

Innerhalb dieser Arbeit sollten die Bedingungen aus vorherigen Kristallisationsexpe-

rimenten [Johanning, 2005] optimiert werden und Kristalle für die Vermessung mit

2.2 Methoden 51

Röntgenstrahlung hergestellt werden. Es wurden Ansätze in 24 well Platten, 96 well

Platten und Stripes durchgeführt. Die Ansätze wurden mit unterschiedliche Trop-

fengröÿen und Mischungsverhältnisse erstellt.

Für die Kristallisation des intrinsischen Lichtsammelkomplexes wurden die LHC

haltigen Fraktion der Gel�ltration von 0,56 CV bis 0,61 CV (der erste Peak im Elu-

tionspro�l) vereinigt und mit einem Vivaspin /MilliQ Konzentrator in der Gröÿe

von 50 kDa oder 100 kDa eingeengt. Für Proben aus der Anionenaustauschchroma-

tographie wurden ebenfalls die LHC-haltigen Fraktionen vereinigt und mit einem

Konzentrator eingeengt.

Auch Experimente in kubischen Phasen sollten zur Kristallausbildung führen. Hierzu

wurden 300 mg 1-Oleoyl-rac-glycerol bei 60 °C erwärmt bis sich das Lipid ve�üssigte.

Es erfolgte die Aliquotierung in 5 µl. Jeweils eine Lipidprobe wurde mit gleichem Vo-

lumen an LHC in einem 250 µ l Reaktionsgefäÿ versetzt. Hierzu wurde der Komplex

aus der Gel�ltration verwendet und auf 10 mg/ml und 100 mg/ml konzentriert. Es

erfolgten mehrere Zentrifugationen bei 22 °C in der Kühlzentrifuge (Tab. 2.8). Nach

jedem Schritt erfolgte die Drehung der Eppendorfreaktionsgefäÿe um 90 Grad.

Zeit Drehzahl1 min 10.000 rpm10 min 5.000 rpm10 min 6.000 rpm10 min 7.000 rpm10 min 8.000 rpm10 min 9.000 rpm10 min 10.000 rpm

Tabelle 2.8: Zentrifugationen bei der Kristallisation mit kubischen Phasen

Nach einer Inkubation von 24 h bei 22 °C wurde Ansätzen Kaliumchlorid oder

Magnesiumchlorid in den Konzentrationen von 0,2 M, 0,4 M, 0,6 M, 0,8 M, 1,0 M,

1,5 M, 2,0 M, 2,5 M, 3,0 M und 4, M zugegeben. Es erfolgten Zentrifugationen (Tab.

2.8) bei denen die Reaktionsgefäÿe nach jedem Schritt um 90 ° gedreht wurden. Der

Ansatz in kubischen Phasen erfolgte jeweils in Doppelbestimmung.

2.2 Methoden 52

Kristallisation von PCP

Es sollte eine hochau�ösende Struktur der Hauptform von PCP bei einem pI von 7,5

erhalten werden. Dazu war die Produktion von Einkristallen essentiell. Die Kristal-

lisation erfolgte mit zwei aus der Diplomarbeit entwickelten Screens (Tab. 2.9, 2.10)

mit der hanging drop Methode in 24 well Platten. Die Tropfen setzten sich aus 3 µl

Proteinlösung gemischt mit 3 µl Reservoirlösung zusammen. Für die Kristallisation

von PCP wurden die Peaks Gel�ltration oder der ungetrennte �ltrierte Überstand

verwendet und auf 5 mg/ml konzentriert.

Nr. PEG 8000 CAPSpH 10,5

CHESpH 9,5

Tris-HClpH 8,5

Tris-HClpH 7,5

MgCl2

1 12 % 0,1 M - - - 0,2 M2 14 % 0,1 M - - - 0,2 M3 16 % 0,1 M - - - 0,2 M4 12 % - 0,1 M - - 0,2 M5 14 % - 0,1 M - - 0,2 M6 16 % - 0,1 M - - 0,2 M7 12 % - - 0,1 M - 0,2 M8 14 % - - 0,1 M - 0,2 M9 16 % - - 0,1 M - 0,2 M10 12 % - - - 0,1 M 0,2 M11 14 % - - - 0,1 M 0,2 M12 16 % - - - 0,1 M 0,2 MNr. PEG 8000 CAPS

pH 10,5CHESpH 9,5

Tris-HClpH 8,5

Tris-HClpH 7,5

NaCl

13 12 % 0,1 M - - - 0,2 M14 14 % 0,1 M - - - 0,2 M15 16 % 0,1 M - - - 0,2 M16 12 % - 0,1 M - - 0,2 M17 14 % - 0,1 M - - 0,2 M18 16 % - 0,1 M - - 0,2 M19 12 % - - 0,1 M - 0,2 M20 14 % - - 0,1 M - 0,2 M21 16 % - - 0,1 M - 0,2 M22 12 % - - - 0,1 M 0,2 M23 14 % - - - 0,1 M 0,2 M24 16 % - - - 0,1 M 0,2 M

Tabelle 2.9: Screen 1a für die Kristallisation von PCP

2.2 Methoden 53

Nr. PEG 8000 CAPSpH 10,5

CHESpH 9,5

Tris-HClpH 8,5

Tris-HClpH 7,5

MgCl2

25 15 % 0,1 M - - - 0,1 M26 15 % 0,1 M - - - 0,2 M27 16 % 0,1 M - - - 0,1 M28 16 % 0,1 M - - - 0,2 M29 13 % - 0,1 M - - 0,1 M30 13 % - 0,1 M - - 0,2 M31 14 % - 0,1 M - - 0,1 M32 14 % - 0,1 M - - 0,2 M33 15 % - 0,1 M - - 0,1 M34 15 % - 0,1 M - - 0,2 M35 16 % - 0,1 M - - 0,1 M36 16 % - 0,1 M - - 0,2 M37 15 % - - 0,1 M - 0,1 M38 15 % - - 0,1 M - 0,2 M39 16 % - - 0,1 M - 0,1 M40 16 % - - 0,1 M - 0,2 M41 15 % - - - 0,1 M 0,1 M42 15 % - - - 0,1 M 0,2 M43 16 % - - - 0,1 M 0,1 M44 16 % - - - 0,1 M 0,2 M

Tabelle 2.10: Screen 1b für die Kristallisation von PCP

2.2.15 Messungen der Proteinkristalle am Di�raktometer

Von den gebildeten PCP und LHC Kristallen sollten mittels eines Rötgendi�rakto-

meters Datensätze aufgenommen und nachfolgend ausgewertet werden.

Röntgenstrahlung kann im Vakuum durch Beschuss eines Metallziels mit hoch ener-

getischen Elektronen erzeugt werden. Am Synchotron entsteht die für die Röntgen-

strukturanalyse benötigte Strahlung in Elektronenspeicherringen mit einer hohen

Intensität. Es ist auch möglich am Synochtron Messungen mit verschiedene Wel-

lenlängen zwischen 1,6 A und 0,5 A durch zu führen. Welches MAD oder SAD

Messungen zur experimentellen Bestimmung der Phasen möglich macht.

Ein Kristall besteht aus mehreren identisch aufgebauten Einheiten, den Einheitszel-

len. Diese werden im Raum durch die drei Vektoren a, b und c aufgespannt, mit

den Winkeln α, β und γ. Aufgrund der Rotationssymmetrie und Zentrierung der

2.2 Methoden 54

Einheitszelle kann in die 14 Bravaigitter unterschieden werden. Jeder Gitterpunkt

in diesem Grundmuster kann noch weiter Symmetrien aufweisen (Punktsymmetrie).

Aus diesen und aus den anderen das Grundmuster bestimmenden Faktoren ergeben

sich die sogenannten asymmetrischen Einheiten. Daraus erfolgt eine weitere Eintei-

lung in Punktklassen. Die Kombination aus Bravaigitter und Punktklassen führt

zu 230 verschieden Arten des Kristallaufbaus. Aufgrund dessen das Aminosäuren

in Proteinen nur in der L-Form vorkommen und damit verbunden keine Spiegelung

und Inversion möglich ist, wird die Anzahl der Raumgruppen auf 65 möglichen be-

schränkt.

Tri�t ein Röntgenstrahl auf einen Kristall so ist es möglich ein spezi�sche Muster an

Beugungre�exen zu beobachten. Mit dem Bragg�schen Ansatz lässt sich die Positi-

on der Re�exe erklären. Die Basis ist das Konzept der Gitterebenen. Diese werden

durch Gitterpunkte aufgespannt, die über die Indizies h,k und l in Klassen einge-

teilt werden. Ebene einer Klasse haben den Abstand dhkl zueinander. Eine Re�exion

an den Gitterebenen entspricht der Beugung am Kristall. Es ergibt sich folgende

Beziehung für Re�exe:

nλ = 2∆x = 2d_hklsinϑ

(2.4)

Strahl 1

Strahl 2

è

è

dhkl

Abbildung 2.11: Re�exbedingung für die Beugung am Kristlall (Bragg).

2.2 Methoden 55

Strahlung, wie z.B Röntgenstrahlung kann als eine Wellenfunktion beschrieben wer-

den. Gestreute Wellen haben die gleiche Wellenlänge wie der einfallende Strahl,

jedoch hat der gestreute Strahl eine von der Einheitszelle abhängige Phase und

Amplitude. An einem Kristall, der aus vielen Einheitszellen aufgebaut ist erfolgt

eine vielfache Streuung des Strahls. Solche sich wiederholenden Wellenfunktionen

können durch eine Fourieranalyse untersucht werden. Unter Berücksichtigung der

Laue-Bedingung ergibt sich daraus für die Elektronendichte:

ρ~r = 1VΣhkl Fhkl x e−π∗~s∗~r

(2.5)

Der Strukturfaktor Fhkl setzt sich aus der Amplitude und der Phase zusammen. Die

Amplituden sind durch Messungen des Rötgendetektors bestimmbar. Die Phasenin-

formation kann so nicht berechnet werden. Eine Bestimmmung ist durch multiplen

isomorphen Ersatz (MIR) oder molekularem Ersatz (MR) möglich. Für MIR werden

Schwermetallen in den Kristall eingebaut. Durch die Harkerkonstruktion ist dann

eine Berechnung der Phasen für die Elektronendichte des Proteins möglich. Beim

molekularen Ersatz wird ein verwandtes Molekül dessen Struktur schon gelöst wer-

den konnte als Modell benutzt um die Phasen für die zu lösende Struktur berechnen

zu können. Dieses Verfahren basiert darauf, das kleine Änderungen in der Struktur

auch geringe Änderungen der Phase zur Folge haben. Wird das Modell auf die ex-

akt gleichen Koordinaten wie die reale Einheitszelle verschoben so sind die Phasen

die berechnet werden können den realen sehr ähnlich. Das Problem hierbei ist die

richtige Plazierung des Modells. Das angewandte Verfahren ist die Pattersonsythese.

Hierbei erfolgt eine Zerlegung der sechdimensionalen Suche in zwei dreidimensiona-

le. Durch die Rotation wird die richtige Orientierung gefunden. Danach erfolgt die

Translationssuche, bei der das Modell in der Zelle verschoben wird bis eine Überein-

stimmung mit dem gemessenen Daten erfolgt.

Nachdem die Phase bestimmt wurde wird das Ergebnis manuell wie auch durch ver-

schiedene Programme verfeinert. Zur Kontrolle wird dabei ein Teil des Datensatzes

2.2 Methoden 56

bei der Verfeinerung nicht berücksichtigt und der hier erhaltene Wert R-free ist ein

Maÿ für den Fit. Mathematisch ist es möglich eine Struktur zu über�tten, so das

sie realen Proteinen nicht mehr entspricht. Eine starke Abweichung des R-free vom

R-faktor ist eine Möglichkeit eine Über�ttung zu vermeiden.

Für Aufnahme von Re�exmustern bei Tiefentemperaturen müssen die Kristalle ge-

�scht und in �üssigem Sticksto� schockgefroren werden. Um die Bildung von Eis zu

verhindern sollten optimierte Einfrierlösungen verwendet werden. Es wurden LHC

und PCP Kristalle ge�scht. An der Homesource wurden Testmessungen durchge-

führt. Datensätze wurden am ESRF und SLS aufgenommen. Als optimierte Einfrier-

lösung für LHC Kristalle hatte folgende Zusammensetzung: 30 % PEG400, 0,05 M

MgCl2, Na-cacodylate pH 6,5 und 0,16 % DM.

2.2.16 Die Auswertung der Datensätze

Die Auswertungen der Datensätze erfolgte mit dem im folgenden aufgeführten Pro-

grammen.

XDS Programmpaket

Das Programmpaket XDS wurde von Wolfgang Kabsch [Kabsch, 1988] entwickelt für

die Auswertung von Rohdaten von Einkristallen. Alle erhaltenen Datensätze wurden

mit dem XDS Porgrammpaket prozessiert. Die hier benutzen Programme waren:

XDS

Rohdaten werden durch das Programm XDS induziert, integriert und reduziert. Bei

der Induzierung erfolgt eine Analyse der Positionen der Peaks (Re�exe) und deren

Projektion im reziproken Gitter. Daraus ergeben sich Einheitszellparameter sowie

die Orientierung der Kristalls und die Bestimmung des Bravaisgitters ist möglich.

XDS zeigt eine Liste aller möglichen Gittertypen mit den dazugehörenden Zellach-

sen an, die von der die Gruppe mit der höchsten Geometrie und dem niedriegsten

Fehler angeführt wird. Im weiteren Verlauf der Prozessierung werden der Kristall-

parameter, der Detektorabstand und die Strahlparameter verfeinert. Bei der dar-

au�olgenden Integration werden Re�expositionen vorhergesagt und die Intensität

der Peaks abgeschätzt, ebenso der Fehler der Intensität. Unzuverlässige Re�exe wer-

den ausgesondert. Zuletzt erfolgt eine Skalierung der Refelxintensitäten, welche der

2.2 Methoden 57

Raumgruppensymmetrie entsprechend gemittelt werden. Die R-Faktoren als Maÿ

für eine Datenkonsistenz wie auch ein reduzierter Datensatz werden ausgegeben.

XSCALE

In XSCALE ist es möglich verschiedene Datensätze zu vereinen. Hierbei werden die

unterschiedlichen Messungen aneinander skaliert und gemittelt. Die Korrelation und

die R-faktoren erlauben eine Beurteilung ob Datensätze zusammen skaliert werden

sollten und wie die Datenqualität vor und nach dem Mitteln ist.

XDSCONV

Die aus XDS erhaltenen Daten�les sind nicht immer mit den weiteren Programme

zur Auswertung der Struktur verwendbar. Deshalb müssen diese z.B in CCP4i oder

Shelx kompatible �les konvertiert werden. Dies übernimmt das Programm XDS-

CONV welches auch gleichzeitig in der Lage ist eine R_free zu generieren, bzw.

Re�exe für die Berechnung von R_free zu markieren.

SHELX

Das Programm SHELX wurde ursprünglich zur Verfeinerung kleiner Moleküle ent-

wickelt und beruht auf dem Least Squares (LS) Verfahren. Es wird heutzutage auch

zur Verfeinerung hochaufgelöster Makromolekülstrukturen verwendet. Aus dem Pro-

grammpaket wurden nur SHELXH für groÿe Moleküle und SHEXPRO ein Umfor-

mungsprogramm verwendet. Es sind wie die XDS Programme Skriptprogramme

die es aber erlauben viele verschiedene Parameter zu variieren. Über einen durch

SHELXPRO generierten Input�le erfolgt die Steuerung.

ShelX wurde für die Verfeinerung der PCP Struktur der Hauptform verwendet.

CCp4i

Das Programmpaket CCp4i ist eine Sammlung verschiedener Programme zur Aus-

wertung eines Datensatzes. In dieser Arbeit wurde das Programme Molrep und Pha-

ser für den molekularen Ersatz bei LHC verwendet.

2.2 Methoden 58

COOT

Das hier verwendete Programm COOt dient dazu eine Vefeinerung der Aminosäuren

durchzuführen. Dabei wird die Aminosäuresequenz mit ihrer Anordnung im Raum

als PDb �le aufgerufen und die aus den gemessenen Daten ermittelte Dichtekarte

untergelegt. Die Vefeinerung erfolgt manuell und ermöglicht es visuell Abweichungen

der Dichte von der Anordnung der Aminosäuren aus der Sequenz zu ermitteln und

zu verfeinern. Diese Verfeinerung anhand der einzelnen Aminosäuren wurde für alle

gelösten Datensätze mit COOT durchgeführt.

3.1 Proteinmengenbestimmung von LHC über UV/VIS Spektren 59

3 Ergebnisse

3.1 Proteinmengenbestimmung von LHC über

UV/VIS Spektren

Es konnte eine Formel für die Proteinkonzentrationsbestimmung von LHC mit

UV/VIS Spektroskopie ermittelt werden. Aus der Proteinbestimmung mit der Brad-

fordmethode wurde die Konzentration von LHC auf 4 mg/ml bestimmt. Die Spek-

tren ergaben einen Mittelwert bei der OD bei 672 nm von 0,307 mit einer 1:100

Verdünnung der Probe. Die Schichtdicke der Küvette betrug einen Zentimeter. Dar-

aus ergab sich für den Extinktionskoe�zienten ε der Bruch zwischen der Absorption

bei 672 nm und der Proteinkonzentration 0,04 mg/ml. Demnach kann die LHc Kon-

zentration wie folgt berechnet werden:

LHC [mg/ml]= (OD672nm x 0,130 mg/ml

(3.1)

3.2 Zellkultur Amphidinium carterae

Durch die eigene Aufzucht in Bochum war eine kontinuierliche Produktion von Zell-

sediment zur Aufreinigung der Lichtsammelkomplexe gewährleistet. Die Ausbeute

an Zellsediment betrug zwischen 30 und 45 g pro 30 l Zellkultur. Die Schwankun-

gen zwischen den Groÿkulturen sind in Temperaturschwankungen und durch leicht

unterschiedlich stark gewachsene Vorkulturen als Ausgangsmaterial begründet.

3.3 Belichtungstest von Amphidinium carterae 60

Die Anzuchten mit einem Tag/Nacht Rhythmus wuchsen langsamer, waren jedoch

Zentrifugationen gegenüber unemp�ndlicher. Eine Zentrifugation von Zellen mit kon-

tinuierlicher Belichtung führte immer zu deren Zelltod. Die Zellen mit diskontinuier-

licher Belichtung überlebten zu 75 % Geschwindigkeiten bis zu 2.000 rpm im SLC

6000 Rotor. Diese Eigenschaft ermöglicht die Überführung der Kulturen in Zellsus-

pensionen mit hoher Zelldichte.

3.3 Belichtungstest von Amphidinium carterae

Es sollte der Ein�uss der Belichtung auf die Zellen untersucht werden. Die Licht-

stärke bei der Anzucht hatte einen direkten Ein�uss auf die Färbung der Kultur. So

waren die Zellen bei 100 muE mehr grün-gelblich, währenddessen die Zellen die un-

ter den hier sonst verwendeten Bedingungen inkubiert die typische braune Färbung

aufwiesen (Abb. 3.1). Das Wachstum von Amphidinium carterae bei Schwachlicht

(ca. 5 µE) war stark eingeschränkt (Abb. 3.1).

A

Abbildung 3.1: Zellkulturen bei unterchiedlicher Belichtung

Die nach Aufschluss der Zellen erhaltenen Pellets zeigten ähnliche Farbunterschie-

de (Abb. 3.2).

Der Überstand der bei 20 µE angezogenen Zellen enthielt PCP. Dieser Lichtsammel-

komplex konnte bei den anderen Anzuchtbedingungen nicht im Überstand nachge-

wiesen werden (Abb. 3.2, 3.4). Augfrund der geringen Zelldichte der Schwachlicht-

kultur wurden nur die Spektren der Schwachlicht- und Starklichtanzucht verglichen.


A CB

Abbildung 3.2: Membransedimente nach Zellaufschluss. A: Starklicht, B: Schwachlicht,C: Schatten

A C C

Abbildung 3.3: Überstände nach Zellaufschluss. A: Starklicht ( ca. 100 µE), B: Schwach-licht ( 20 µE), C: Schatten, (ca. 5 µE)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

250,0 350,0 450,0 550,0 650,0 750,0

Wellenlänge [nm]

Abs

orpt

ion

Abbildung 3.4: UV/VIS Spektren der Überstände nach ZellAufschluss. Blau: Starklicht,pink: Schwachlicht

Es konnte keine Veränderung in der Mobilität der Zellen festgestellt werden.

3.4 Aufreinigung von LHC aus Amphidinium carterae (A. c.) 62

3.4 Aufreinigung von LHC aus Amphidinium

carterae (A. c.)

Innerhalb dieser Arbeit sollte die Aufreinigung im Vergleich zur Vorherigen [Johan-

ning, 2005] optimiert werden. Der Aufschluss der Dino�agellatenzellen war neben

optimierten Parametern für die Solubilisierung entscheident für die Ausbeute an

LHC. Diese konnte von ursprünglich erhaltenen 0,05 - 0,07 mg LHC pro Liter Groÿ-

kultur auf 1 - 2 mg LHC pro Liter Groÿkultur erhöht werden. Dies entspricht einer

Steigerung der LHC-menge von 30 %.

Die göÿere Ausbeute wurde durch die Umstellung von einem Glas- auf einen Te�on-

homogenisator und ebenso durch die Festlegung von 60 ml als Aufschlussvolumen

pro Groÿkultursediment erreicht. Beides hatte eine besseren Zerstörung der Zellen

und eine gute Reproduzierbarkeit zur Folge. Die Verwendung von Sucrosegradienten

anstelle einer Dialyse zur Entfernung von Nicht-Membranbestandteilen führte zu ei-

ner optimierten Solubilisierung des LHCs, da neben DNA Verunreinigungen auch

noch vorhandene PCP Reste entfernt werden konnten (Abb. 3.5).

Abbildung 3.5: Gradient mit PCP Bande (rötlich) und Membranpellet (braun) am Bo-den des SW28 Röhrchen

Die Einstellung auf 2 mg/ml Proteinmenge anstelle einer von 0,15 mg/ml Chlo-

rophyllmenge [Johanning, 2005] entsprach einer Proteinmenge von 1,65 mg/ml und


ergab eine Steigerung der LHC-Menge. Eine vollständige Herauslösung des Komple-

xes aus den Membranen war selten möglich (Abb. 3.6).

21,5 kDa

31,0 kDa

66,2 kDa

45,0 kDa

97,4 kDa

1 2 3 4 5 7 8 9 106 11 12 13

Abbildung 3.6: SDS Gel der Aufreinigung. 1: Marker, 2: Waschen der Zellen, 3: vor Zel-laufschluss , 4: Überstand nach UZ, 5: Homogenisat nach UZ, 6: Überstand nach Waschender Membranen, 7: Homogenisat nach Waschen der Membranen, 8: Überstand nach Wa-schen der Membranen, 9: Homogenisat nach Waschen der Membranen, 10: Homogenisatnach Saccharosegradient, 11: nach Solubilisierung, 12: Pellet nach UZ, 13: Auftrag aufAnionenaustauschchromatographie

Die Qualität des Aufschlusses von A. c. war unabhängig vom verwendeten Gerät.

Die Anzahl aufgeschlossener Zellen war nach Beobachtung unter dem Mikroskop

gleich. Die Elutionspro�le der Anionenaustauschchromatographie und der Gel�ltra-

tion sind ähnlich. Unterschiede resultieren nicht aus der Aufschlussart, sondern le-

diglich in der aufgetragenen Menge an LHC (Abb. 3.7). Im Fall des Fluidizers lag

jedoch eine Zeitersparnis vor, weshalb diese Apparatur bevorzugt angewendet wur-

de.

Die Graphen der Anionenaustauschchromatographie befanden sich meist in der Sät-

tigung und zeigten einen breiten Proteinpeak. Die Elution erfolgte bei einem Salzge-

halt von ca. 30 % bis ca. 65 %. Denaturiertes Protein wurde nicht an die Säulema-

trix gebunden. Es wurden die LHC-haltigen Fraktionen von 10 CV bis 14 CV weiter

verwendet. In diesen konnten keine Proteinverunreinigungen nachgewiesen werden

(Abb. 3.8). Das Protein lag in reiner Form vor und wurde auf Grund dessen auch

für die Kristallisation genutzt.


0

50

100

150

200

250

10 1,60 3,26 4,91 6,56 8,22 9,87 11,52 13,18 14,83

Säulenvolumen CV

AU

0

10

20

30

40

50

60

70

% S

alz

Abbildung 3.7: Elutionspro�l der Anionenaustauschchromatographie.

1 2 3 4 5 8 9 10 117 12 13 14 15 16 17 18 2019 21 22

21,5 kDa

31,0 kDa

66,2 kDa

45,0 kDa

97,4 kDa

Abbildung 3.8: SDS-Gel der Anionenaustauschchromatographie. 1, 11: Marker, 2-4 Frak-tionen bis zu Elution, 5-10 und 12-18: Elution des Proteins, 19-21 Fraktionen nachProteinelution

Die einzelnen Gel�trationsläufe unterschieden sich in der Elutionsbreite des Pro-

teins. Diese war von dem einzukonzentrierenden Volumen für den Auftrag auf die

Gel�ltration in der Weise abhängig, dass mit stärkerer Konzentrierung die Breite

zunahm. Die Graphen befanden sich meist in der Sättigung, weshalb eine Unter-

scheidung in einzelne Peaks hier schwierig war. Je nach Breite konnten zwei bis


drei Peaks zugrunde gelegt werden, deren Maxima bei ca. 0,6 Säulenvolumen (CV),

0,62 CV und 0,68 CV lagen (Abb. 3.9).

0,00

100,00

200,00

300,00

400,00

500,00

600,00

0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80

Säulenvolumen (CV)

AU

Abbildung 3.9: Auschnitt des Elutionspro�ls der Gel�ltration, gezeigt wird die Proteine-lution von LHC bei einer Wellenlänge von 672 nm

Das Protein lag in reiner Form vor, Banden oberhalb von 19 kDa sind eher durch

nicht vollständig durch SDS denaturiertes Protein zu erklären. Die Bande unterhalb

von 19 kDa zeigte wahrscheinlich ein Abbauprodukt von LHC.

Die UV/VIS Spektren zeigten annähernd den gleichen Verlauf wie das Elutionspro�l,

1 2 3 4 5 8 9 10 117 12 13 14

21,5 kDa

31,0 kDa

66,2 kDa

45,0 kDa

97,4 kDa

Abbildung 3.10: SDS-Gel der Gel�ltration. 1: Marker, 2-4: Fraktionen vor Proteinelution,5-8 Proteinelution, 9-11:Fraktionen nach Proteinelution, 12: Auftrag Gel�ltration


mit der Unterscheidung in drei Peaks (Abb. 3.11). Es wurde nachgewiesen, dass bei

ca. 0,59 CV ein Maximum vorlag.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0,5 0,55 0,6 0,65 0,7 0,75 0,8

Säulenvolumen

Abs

optio

n be

i 461

nm

Abbildung 3.11: Absorption bei 461 nm (Chlorophyll c) der Elutionsfraktionen der Gel-�ltration, Volumen der Fraktionen wurde in CV umgerechnet

Die UV/VIS Spektren der vermuteten Peaks waren nahezu deckungsgleich (Abb.

3.12).

0,0

1,0

2,0

3,0

250 350 450 550 650 750Wellenlänge [nm]

Abs

orpt

ion

Abbildung 3.12: UV/VIS Spektren der Proteinpeaks der Gel�ltration normiert auf672 nm. Blau: Peak1 (0,6 CV), rot: Peak2 (o,62 CV) und grün: Peak3 (0,68CV)

3.5 Die Rekonstitution von LHC in Lipidvesikel 67

Durch Eichung der Säule mit den Markerkits konnte den einzelnen Peaks anhand

der Eichgeraden molekulare Massen zugeordnet werden. Die Maxima der Kurven

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

10 100 1000

kav

Molekulargewicht [kDa]

Abbildung 3.13: Eichunggerade der Gel�ltrationssäule Superdex 200 HR16/60

entsprachen Gröÿen von ca.110 kDa, 74 kDa und 40 kDa. Aufgrund der molekula-

ren Zusammensetzung von LHC [Hiller et al., 1993] konnte die Gröÿe des Monomers

ohne Detergenzmicelle mit 35,1 kDa berechnet werden. Die Gröÿe der reinen De-

tergentmicelle in Lösung ist bei DDM 50 kDa, Daten für DM sind nicht erhältlich.

Sie wurde auf ca. 40 kDa abgeschätzt. Unter Berücksichtigung der Ungenauigkeit

der Gröÿenbestimmung durch die Gel�ltration handelt es sich damit hierbei um das

Trimer, das Dimer und das Monomer von LHC.

3.5 Die Rekonstitution von LHC in Lipidvesikel

Der LHC Komplex konnte in Phosphatidylcholinvesikel rekonstituiert werden und

die Vorschrift wurde optimiert. Es konnten 10 % bis 17 % der eingesetzten LHC

Menge in die erstellten Vesikel eingebaut werden.

Liposomen konnten mit den beiden verwendeten Methoden hergestellt werden. Auch

eine Kombination der Schockgefriermethode mit anschlieÿender Ultraschallbehand-

lung führte zur Bildung von Vesikeln. Im Fall der ausschlieÿlichenVerwendung des

Bechersoni�ers lag jedoch eine erhebliche Zeitersparnis vor, so dass diese Methode

bevorzugt wurde.

Die Charge der vewendeten SM2 Biobeads (Biorad) stellte sich als essentiell für


die Reproduzierbarkeit heraus, da verschiedene Biobeadschargen zu einem unter-

schiedlich guten Detergenzentzug führten. Nur Biobeads einer älteren Charge (SM2,

Biorad, Lotnr.:24030) zeigten einen reproduzierbaren guten Detergenzentzug.

Es stellte sich heraus das ein Lipid:Proteinverhältnis von 1:1 bei einer Proteinkon-

zentration von 10 mg/ml am Besten für den Einbau geeignet war. Andere Protein-

konzentrationen sowie auch andere Mischungsverhältnisse führten meist zu keiner

oder nur zu einer geringen Rekonstitution des Komplexes in die Liposomen. Die Ver-

wendung von Salzkonzentrationen, die von der im Pu�er LHCP2 abwichen führten

ebenfalls nicht zum Einbau von LHC in Vesikel. Auch Magnesiumchlorid als Salz

stellte sich für die Herstellung LHC haltiger Liposomen als unbrauchbar heraus. Die

Banden dieser verschiedenen Ansätze lagen im Saccharosegradienten entweder auf

Höhe der PC Vesikel oder des LHCs nach Detergenzentzug (Abb. 3.14). Die auf die

Gradienten aufgetragenen leeren Liposomen waren älter als 24 h. Dadurch kam es

zu einer Fusion der Lipidvesikel die zu einem gröÿeren Durchmesser führten. Ein

Durchmesser bis zu 1000 nm konnte bei älteren Liposomen mit dem Particle sizer

nachgewiesen werden. Die Dichte der Probe verringerte sich, da es zu einer geringen

Massen- im Gegensazt zu einer erheblichen Volumenänderung kam. Somit be�ndet

sich die Bande weit oben im Gradienten.

Abbildung 3.14: Gradienten der Rekostitution. Von links nach rechts: nicht erfolgreicherEinbau von LHC in PC Vesikel, denaturiertes LHC, PC Vesikel


Die Bande des rekonstituierten LHCs liegt tiefer oder auf gleicher Höhe wie die

des freien LHCs (Abb. 3.15). Da denaturiertes LHC eine Bande im unteren Viertel

des Gradienten aufweist, handelt es sich hierbei um LHC eingebaut in PC Vesikel.

Abbildung 3.15: Gradienten der Rekonstitution. Von links nach rechts: LHC rekonstitu-iert in PC Vesikel, LHC rekonstituiert in PC Vesikel, LHC

Durch das UV/VIS Spektrum wird dies bestätigt, da hier im Gegensatz zum freien

LHC ein Vesikelstreukurveanteil zu sehen war (Abb. 3.16).

0

1

2

250,0 350,0 450,0 550,0 650,0 750,0

Wellenlänge [nm]

Abs

optio

n

Abbildung 3.16: Spektren des freien LHCs ,des LHCs in Vesikeln und der Liposomen-streukurve. Es erfolgte eine Normierung der Proteinkurven auf den Chlorophyllpeak bei671 nm

3.6 Interaktionsuntersuchung von LHC und PCP mit SPR 70

Auch konnte anhand des Spektrums gezeigt werden, dass es sich um intaktes LHC

handelte [Hiller et al., 1993]. Somit wurde die Grundlage für Interaktionsstudien

zwischen LHC und PCP gelegt, da PCP in Anwesenheit von DM denaturiert.

3.6 Interaktionsuntersuchung von LHC und PCP

mit SPR

Mit der Ober�ächenplasmonenresonanzspektroskopie sollte der Nachweis einer In-

teraktion zwischen dem intrinsischen Lichtsammelkomplex LHC und dem löslichen

PCP erbracht werden. Die Phosphatidylcholinvesikel (PC Vesikel), mit und ohne

rekonstituiertem LHc wurden an der Ober�äche des L1 Chips immobilisiert. Es er-

folgte keine Anbindung von PCP an die PC Vesikel, weshalb diese als Messungen

des Hintergrundes verwendet werden konnten. Eine Anbindung und Ablösung des

PCP an die an die Ober�äche des Chips gebundenen Vesikel mit eingebautem LHC

wurde in Abhängigkeit der Zeit aufgenommen (Abb. 3.17, 3.18).

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 300 600 900 1200Zeit [s]

RU

Abbildung 3.17: Konzentrationsreihe 1 der Interaktion zwischen PCP und dem immo-bilisierten LHC. Die einzelnen Konzentrationen sind farblich unterschiedlich dargestellt:türkis: 60 µM PCP, gelb: 40 µM PCP, rosa:20 µM PCP und blau: 8,7 µM PCP.


Die Graphen der Konzentrationsreihen zeigen, dass die Anbindung des PCPs an

LHC von der Konzentration an PCP abhängig war, da die Geschwindigkeit mit an-

steigender Konzentration zunahm (Abb. 3.17, 3.18).

0

500

1000

1500

2000

0 300 600 900 1200Zeit [s]

RU

Abbildung 3.18: Konzentrationsreihe 2 der Interaktion zwischen PCP und dem immobili-sierten LHC. Die einzelnen Konzentrationen sind farblich unterschiedlich dargestellt: türkis:60 µM PCP, gelb: 40 µM PCP, rosa:20 µM PCP und blau: 8,7 µM PCP. Die schwarzenLinien zeigen die ge�tteten Kurven

Die unterschiedlichen Signalhöhen der beiden Konzentrationsreihen sind mit un-

terschiedlichen Vesikelchargen zu erklären. Dabei sind unterschiedliche Mengen an

LHC in die PC Vesikel rekonstituiert worden. Unter der Annahme einer Reaktion

erster Ordnung zwischen PCP und LHC ( LHC + PCP = LHC-PCP), wurden die As-

soziation mit einer monoexponentiellen Funktion ge�ttet. In dem hier verwendeten

Anfangsbereich konnte kon vernachlässigt werden und es ergab sich für die jeweilig

eingesetzte Konzentration von PCP eine Geschwindigkeit. Diese wurden logarith-

misch gegen die Zeit aufgetragen und eine Gerade durch die erhaltenen Messpunkte

gelegt (Abb. 3.19, 3.20). Aus der Steigung der Geraden konnte die Geschwindigkeits-

konstante kon berechnet werden. Die kon aus den Konzentrationsreihen betrugen


3,6*102 mol−1s−1 und 4,8*102 mol−1 s−1.

y = 0,0004x + 0,0239

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0 10 20 30 40 50 60 70Konzentration [µM]

Ges

chw

indi

gkei

t [µM

/s]

Abbildung 3.19: Die Anbindungsgeschwindigkeiten abhängig von der PCP Konzentrati-on (Konzentrationsreihe 1) in logarithmischer Auftragung. Aus der durch die Messpunkteangelegten Geraden wurde kon berechnet

y = 0,0005x + 0,0236

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0 10 20 30 40 50 60 70Konzentration [µM]

Ges

chw

indi

gkei

t [µM

/s]

Abbildung 3.20: Die Anbindungsgeschwindigkeiten abhängig von der PCP Konzentrati-on (Konzentrationsreihe 2) in logarithmischer Auftragung. Aus der durch die Meÿpukteangelegten Geraden wurde kon berechnet


Die Konzentrationsreihen zeigten auch eine schnelle Dissoziation des PCP wo-

durch zur Berechnung der koff , der Anteil der Dissoziation aus den Konzentrati-

onsreihen und eine Langzeitmessung verwendet wurden. Für die Berechnung der

Koff wurde auch hier eine monoexponentielle Kurve an die Dissoziationskurve

angelegt (Abb. 3.21, 3.23). Die aus diesen Kurven berechneten koff betrugen

0

500

1000

1500

0,00 300,00 600,00 900,00 1200,00Zeit [s]

RU

Abbildung 3.21: Dissoziation des PCP vom LHC als Langzeitmessung

Abbildung 3.22: Dissoziationskurve des PCP vom LHC mit angelegtem Fit (monoexpo-nentiellen Funktion

Abbildung 3.23: gdsgsg

3.7 FTIR-ATR 74

1,39*10−2 s−1, 1,56*10−2 s−1 und 1,42*10−2 s−1. Hieraus ergab sich ein Mittelwert

von 1,46 *10−2 s−1. Die Fits für die Anbindung wie auch die Ablösung von PCP an

LHC zeigten Abweichungen von den gemessen Graphen die darauf hinweisen das es

sich hier um eine Liposomenschicht gehandelt haben könnte. Die Anlagerung und

Ablösung von PCP an LHC in den Zwischenräumen der einzelnen Liposomen führte

durch die veränderte Erreichbarkeit zu einem von der monoexponentiellen Funktion

abweichenden Verhalten. Für die Berechnung der A�nität wurden jeweils die konund koff gemittelt. Als Maÿ für die A�nität zweier Reaktionspartner gilt die Disso-

ziationskonstante. Diese ist der Quotient aus koff und kon und betrug hier 35 µM.

Somit konnte eine Interaktion zwischen LHC und PCP im zweistelligen mikromola-

ren Bereich nachgewiesen werden.

3.7 FTIR-ATR

Mit der FTIR-ATR Methode sollte die Interaktion zwischen LHC und PCP unter-

sucht werden. Auch die Vesikelzusammensetzung des Rekonstitutionsproduktes soll-

te hier untersucht werden. Die Spektren der Anbindung von Vesikeln aus der Rekon-

stitution von LHC zeigten eindeutige Amid-I und Amid-II Banden die hier das Signal

vom LHC darstellen. Auch die Lipidbanden waren deutlich erkennbar (Abb. 3.24).

Bei den Lipidbanden handelt es sich um die Asymmetrische CH2 Streckschwingung,

die symmetrische CH2 Streckschwingung und die C=O-Schwingung. Die CO-Bande

bei 2.400 Wellenzahl ist ein Messartefakt, da sie den Rest an CO2 in der Trockenluft

darstellt und kein Signal der Proben ist. Es konnte mit dem Spektrum nicht gezeigt

werden ob der Einbau von LHC in die Lipidbilayer oder in das Lumen der Vesikel

erfolgte. Da zwischen den Messungen hier keine Verschiebung stattfand, konnten

alle Graphen bei den gleichen Wellenzahlen untersucht werden. Für die Auswertung

der Lipidanbindung wurde die Änderung in der Intensität der asymmetrischen CH-

Schwingung bei einer Wellenzahl von 2926 beobachtet. Die Anbindung von Protein

wurde nach Basislinienlorrektur bei einer Wellenzahl von 1547, der Amid-II Bande

untersucht. Es wurde mit einem wässrigen System gearbeitet, weswegen keine Aus-

wertung mit der Amid I Bande erfolgen konnte, da H2O hier stark absorbiert (Abb.

3.24).

3.7 FTIR-ATR 75

Wellenzahl [cm-1]

Abs

orpt

ion

100015002000250030003500

-0.0

10-0

.005

0.00

00.

005

0.01

0

symmetrische CH2 Streckschwingung Amid II

Amid I

asymmetrsicheCH2 Streckschwingung

Differenzsignal CO2-Bande

C=O

Abbildung 3.24: Infrarotspektrum der angebunden LHC-haltigen Vesikel. Zu sehen sinddie Amid I und II Bande des Proteins und die Banden die von den Liposomen herrühren.Die Banden der Liposomen sind: die Asymmetrische CH2 Streckschwingung, die symme-trische CH2 Streckschwingung und die C=O-Schwingung

Es wurde nachgewiesen, dass PCP nicht an BSA bindet weshalb dieses Protein

zur Absättigung der Kristallober�äche verwendet werden konnte (Abb. 3.25).

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0 100 200 300 400

Zeit [min]

Extin

ktio

n

Abbildung 3.25: Änderung der Intensität bei einer Wellenzahl von 1547

Die Anbindung der Lipsomen ist stark von ihrer Gröÿe abhängig, so konnten Lipid-

vesikel die nach gleicher Vorschrift wie die Rekonstitutionprodukte erstellt wurden,

3.7 FTIR-ATR 76

nach der Aufnahme des Lipidpellets in Pu�er LHC2MgCl2 kaum noch an die Ober-

�äche gebunden werden. Auch Vesikel mit gröÿerem Durchmesser konnten nicht

angebunden werden (Abb. 3.26).

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0 100 200 300 400

Zeit [min]

Abs

orpt

ion

Abbildung 3.26: Anbindungskurve von Vesikeln mit einem Durchmesser von mehr als200 nm

Die Liposomen aus der Rekonstitution von LHC konnten an der Ober�äche des

Germaniumkristalls immobilisiert werden. Für die Anbindung war die Anwesenheit

zweiwertiger Ionen, hier Magnesium essentiell (Abb. 3.27, 3.28).

LHC BSA PCP

Abbildung 3.27: Messung 1 zur Interaktion von LHC und PCP. Blau: Proteinsignal bei1547 cm1, pink: Lipidsignal bei 2926 cm1. Die PCP Konzentration im System betrug 15 µM

3.7 FTIR-ATR 77

LHC PCPBSA

Abbildung 3.28: Messung 2 zur Interaktion von LHC und PCP. Blau: Proteinsignal bei1547 cm1, pink: Lipidsignal bei 2926 cm1. Die PCP Konzentration im System betrug 22 µM

Es enstand jedoch keine gechlossene Schicht, da eine Anbindung von BSA erfolgte

(Abb. 3.27, 3.28, 3.29). BSA bindet nicht an Liposomen aber an Germanium. Es

war ein direkter Zusammenhang zwischen der Qualität der Vesikelimmobilisiation

und der Menge des angebunden BSA zu beobachten. Bei einer geringen Anbindung

der Vesikel wurde eine gröÿere Menge BSA immobilisiert (Abb. 3.29)

LHC PCPBSA

Abbildung 3.29: Messung 1 zur Interaktion von LHC und PCP. Blau: Proteinsignal bei1547 cm1, pink: Lipidsignal bei 2926 cm1. Der Peak bei ca. 75 min. ist auf das Eindringenvon Wasserdampf zurück zu führen.

3.8 Kristallisation von LHC aus Amphidinium carterae 78

Eine vollstängige Absättigung mit Rinderserumalbumin wurde in allen drei Mes-

sungen hier nicht erreicht. An dieser so erhaltenen Ober�äche fand eine Bindung von

PCP statt, die nicht von der Menge des gebunden BSA abhing. Die Steilheit der

Anbindung von PCP nahm mit zunehmender PCP Konzentration zu (Abb. 3.27,

3.28)Eine Interaktion von PCP mit den Lipiden der Vesikel kann ausgeschlossen

werden. Eine Anheftung an den Kristall kann nicht ausgeschlossen werden, da die

Anbindung von BSA nicht konstant wurde und so noch freie Stellen auf dem Kristall

sein konnten. Jedoch ist dieser Anteil bei allen Messungen hier gering. Nach erfolgter

Anlagerung von PCP konnte eine Dissoziation des Komplexes gezeigt werden. Die

Graphen zeigen auch das die Anbindung von PCP während des Experimentes noch

nicht vollständig abgeschlossen war.

Die Untersuchungen mit FTIR-ATR haben gezeigt, dass LHC mit PCP interagiert.

Somit muss LHC auch in die Membran integriert sein, da sonst keine Anbindung

von PCP an LHC möglich gewesen wäre. Es konnte hier bestätigt werden, dass die

Rekonstitution von LHC in die Vesikelbilayer erfolgreich war.

3.8 Kristallisation von LHC aus Amphidinium

carterae

Zur Au�ösung einer Proteinstruktur mittels Röntgenbeugung sind Proteinkristalle

nötig. Innerhalb dieser Arbeit sollten diese in Kristallisationsexperimenten von LHC

hergestellt werden. Erste Experimente wurden schon während der Diplomarbeit [Jo-

hanning, 2005] durchgeführt und die dort erhaltenen erfolgreichen Bedingungen soll-

ten auf die Bildung göÿerer Einkristalle optimiert werden

Bei der Kristallisation mit den kommerziellen Screens CryoI (Emerald BioStructu-

res), CryoII (Emerald BioStructures), Membfac(Hamilton), CrystalI(Hamilton) und

CrystalII in Strips erfolgte bei zwei Bedingungen ein Kristallwachstum (Abb. 3.30).

Hierbei handelte es sich um die Bedingung 19 des CryoII Screens (Acetat pH 4,5,

40 %PEG 600, 0,2 M MgCl2 und der Bedingung 15 des Crystal I Screens (0,2 M

Ammonoumsulftat, Na-cacodylate pH 6,5, 30 % PEG 8000). Die gebildeten Kristalle

waren kleiner als 50 µm und meist verwachsen.


A B

50 µm50 µm

Abbildung 3.30: Kristalle nach kommerziellen Screens. A: Crystal I Screen, B: Cryo II

Screen

Basierend auf diesen Kirstallisationslösungen und aus den Bedingungen der Di-

plomarbeit [Johanning, 2005] wurde ein Screen entwickelt, der eine Variation der

Magnesiumchloridkonzentraztion von 0,05 M bis 2 M beinhaltete. Die PEG 400

Konzentration betrug 20 %, 30 % oder 40 %. Es wurden verschiedene Pu�er einge-

setzt, Hepes pH 7,5. Na-cacodylate pH 6,5 und Na-acetat pH 4,5. Dies führte bei

drei Bedingungen zur Ausbildung von Kristallen (Abb. 3.31).

A CB

500 µm500 µm500 µm

Abbildung 3.31: LHC Kristalle nach 6 Monaten Inkubation bei 18 °C. A: 30 % PEG400,0,05 M MgCl2, 0,1 M Hepes pH 7,5. Kristallhaufen, B: 30 % PEG400, 0,1 M MgCl2, 0,1 MHepes pH 7,5. Kleine Kristalle, C: 30 % PEG400, 0,05 M MgCl2, 0,1 M Na-cacodylate pH6,5 Kristalle bis 700 µm Länge

Jedoch nur die Zusammensetzung von 30 % PEG400, 0,05 M MgCl2 und 0,1 M

Na-cacodylate pH 6,5 ergab nach einem Monat Inkubation Einkristalle von 100 µm

Gröÿe. Diese wuchsen im Laufe von 6 Monaten bis zu einer Kantenlänge von 700 µm.

Diese Kristalle wurden ge�scht und es konnten Datensätze von einem Kristall am

Synchotron aufgenommen werden. Im Verlauf der Auswertung stellte sich heraus,

dass die gemessenen Daten nicht für die Au�ösung der Struktur ausreichten. Die


dafür notwendige Reproduktion der Kristalle mit dem Screen schlug fehl, weshalb

neue Variationen getestet wurden.

Der Austausch von PEG 400 zu PEG 600 in den Kristalllisationslösungen führte

nicht zur Ausbildung von Kristallen. Das Verfeinern der PEG 400 Konzentration in

1 % Schritten von 25 % bis 35 % führte ebenfalls nicht zur Ausbildung von Kristallen.

Die Variation durch Zusatz von verschiedenen Salzen (NaCl, LiSO4, Na-citrat und

MgCl2) und der Einsatz verschiedener Pu�er, Tris pH 8,5 Hepes pH 7,5 Na cacodyla-

te pH 6,5 führte erst ab einer Proteinkonzentration von 4,65 mg/ml in Kombination

von min. 28 % PEG 400 zur Kristallbildung. Hierbei war die Detergenzkonzentration

ebenso entscheident wie die Salzkonzentration in der Proteinprobe. Proteinproben

bei denen durch Dialyse gegen LHCP2 das Salz entfernt wurde und die mit einer

2 ml Q-SepharoseXL Tropfsäule (PD10) in LHCP3 umgepu�ert wurden entstanden

nur bei einer Zusammensetzung von 30 % PEG 400, 0,1 M Tris-HCL pH 8,5 und

0,2 M Na-citrat Kristalle. Diese erreichten eine maximale Kantenlänge von 30 µ m

und lagen nicht eindeutig als einzelne Kristalle vor.

50 µm

A

Abbildung 3.32: Kristalle von Proteinprobe nach Salz- und Detergenzentzug

Erst durch Zugabe von min. 0,5 % DM zur Reservoirlösung kam es mit min 28 %

PEG als Fällungsmittel zur Bildung von Einkristallen (Abb. 3.33, 3.34). Die bei den

verschiedenen erfolgreichen Bedingungen die gleiche Form zeigten.


CB

500 µm500 µm500 µm

A

50µm 50µm 50µm

500 µm500 µm

Abbildung 3.33: Kristalle die enstanden durch Zugabe von Detergenz zur Reservoirlö-sung. A: 29 % PEG400, 0,1 M Na-cacodylate pH 6,5, 0,1 M MgCl2, 0,5 % DM , B: 32 %PEG400, 0,1 M Na-cacodylate pH 6,5, 0,1 M MgCl2, 0,5 % DM , C:28 % PEG400, 0,1 MNa-cacodylate pH 6,5, 0,1 M MgCl2, 1,0 % DM

CB

500 µm500 µm500 µm

A

500 µm500 µm

50µm150 µm 150µm50µm150 µm

500 µm500 µm

Abbildung 3.34: Kristallbildung durch Zugabe von Detergenz. A: 31 % PEG400, 0,1 MNa-cacodylate pH 6,5, 0,1 M MgCl2, 0,5 % DM, B: 35 % PEG400, 0,1 M Tris-HCl pH 8,5,0,2 M NaCl, 0,5 % DM , C:30 % PEG400, 0,1 M Hepes pH 7,5, 0,1 M NaCl, 1,0 % DM

Unterschiede waren hier in der Anzahl und Dicke der Kristalle zu beobachten. Alle

wiesen ein gegenüber dem ersten Kristall, von dem ein Datensatz aufgenommen wur-


de, abweichendes Längen- zu Breitenwachstum auf. Bis auf die Bedingung mit 35 %

PEG400, 0,1 M Tris-HCl pH 8,5, 0,2 M NaCl, und 0,5 % DM war ein 4: 3 statt einem

10:1 Verhältnis zu beobachten(Abb. 3.33, 3.34). Die oben genannte Kristallisations-

lösung führte sogar zu einem 2:1 Wachstum (Abb. 3.34). Kristalisationsansätze mit

Proteinlösungen, ohne vorherigem Salz- und Detergenzentzug, zeigten bei Magnesi-

umchlorid keine Bildung von Kristallen. Dieser erfolgte nur bei Natriumchlorid, Na-

triumcitrat und Lithiumsulfat als Salzzusatz. Ansätze mit Protein aus der Anionen-

austauschchromatographie wiesen ein Kristallwachstum bei LHC-Konzentrationen

von 5 und 10 mg/ml auf, wohingegen die Proben aus der Gel�ltration erst bei der

höheren Konzentration in die Nucleationszone übergingen (Tab. 3.1). Die hier en-

standenen Kristalle zeigten bis auf Bedingung 8 keine neue Kristallform (Abb. 3.35).

Nr. PEG 400 Tris-HCl pH 8,5 Nacitrat Probe1 35 % 0,1 M 0,1 M Anion. 5 mg/ml2 35 % 0,1 M 0,2 M Anion.10 mg/mlNr. PEG 400 Na-cacodylate pH 6,5 Nacitrat Probe3 35 % 0,1 M 0,2 M Anion. 10 mg/mlNr. PEG 400 Tris-HCl pH 8,5 NaCl Probe4 30 % 0,1 M 0,2 M Anion. 5 mg/ml5 35 % 0,1 M 0,2 M Anion. 5 mg/ml, Gelf. 10 mg/mlNr. PEG 400 Hepes pH 7,5 NaCl Probe6 30 % 0,1 M 0,2 M Gelf. 10 mg/mlNr. PEG 400 Na-cacodylate pH 6,5 NaCl Probe7 30 % 0,1 M 0,2 M Anion. 5 mg/mlNr. PEG 400 Hepes pH 7,5 LiSO_4 Probe8 30 % 0,1 M 0,2 M Gelf. 10 mg/ml

Tabelle 3.1: Erfolgreiche Kristallisationsbedingungen

BA

150µm150µm

Abbildung 3.35: Kristalle der Bedingung 8 A: verwachsene Kristalle, B: Einkristalle


Es konnten jedoch nur Datensätze von Kristallen der Bedingung 6 aufgenommen

werden. Diese führten wiederum trotz erhöhter Datenmenge nicht zur Strukturauf-

klärung. Eine weitere Optimierung war deshalb notwendig.

Aufgrund des Ein�usses der Detergenzmenge auf die Kristallisation wurden kommer-

zielle Screens (CryoI ,CryoII, Crystal I, Crystal II, Wizrad I, Wizard II, PEGIon

und Memstart Memfac) mit dem Roboter unter Zugabe von 0,5 % und 1 % DM

zur Proteinlösung durchgeführt. Es wurden die gepoolten und konzentrierten Frak-

tionen der Anionenaustauschchromatographie und der Gel�ltration ohne Salz- und

Detergenzentzug verwendet. Neben den schon bekannt erfolgreichen Zusammenset-

zungen wurden zwei neue Mischungen für die Ausbildung von Kristallen entdeckt.

Hierbei handelt es sich um die Bedingung 25 (0,1 M Magnesiumchlorid, 0,1 M ADA

pH 6,5 und 12 % (w/v) PEG 6000)und 26(0,1 M ADA pH 6,5, 12 % MPD) aus dem

Memstart+Memfac Screen(Abb. 3.36).

500 µm500 µm

A

50µm

500 µm500 µm

50µm

B

Abbildung 3.36: LHC Kristalle mit der neuen Kristallisationslösungen aus dem Screen.A: Memstart+Memfac;25, B: Memstart+Memfac;26

Es entstand keine neue Kristallform. Der Ersatz von Na-cacodylate durch ADA

verbesserte die Kristallisation nicht. Die Variation aus den Bedingung 25 und 26,

mit 10 % bis 30 % MPD bei ADA pH 6,5 als Pu�er sowie dem Zusatz von 0,1 M

oder 0,2 M MgCl2 führte zu keiner Optimierung.

Andere Detergenzmengen die der Proteinlösung zugegeben wurden (0,8 % und 1,5 %)

führten ebensowenig bei den ursprünglich verwendeten Variationen, mit verschiede-


nen Salzen (NaCl, LiSO4, Na-citrat und MgCl2) und dem Einsatz verschiedener

Pu�er (Tris pH 8,5 Hepes pH 7,5 Na cacodylate pH 6,5) bei einer PEG Konzen-

tration von 10 - 35 % zu einer Verbesserung, wie die Verwendung anderer Pu�er

(CHAPS pH 9,5, MES pH 6,5,). Es enstanden immer kleine längliche Kristalle mit

geringer Di�raktion.

Auch die Einführung eines Konzentrators mit 100 kDa Ausschlussvolumen und die

Erhöhung der Ausgangssalzkonzentration in der Probe auf 500 mM KCl optimierte

die Kristallisation nicht. Um Kristalle mit gröÿerer Kantenlänge zu erhalten erfolgte

daraufhin die Inkubation bei 4 °C anstelle von 18 °C. Die in diesen Ansätzen gebilde-

ten Kristalle (Abb. 3.37) wiesen schlechte Beugungseigenschaften bei Testmessungen

am Synchotron auf.

A

100µm

Abbildung 3.37: Beispiel für die gebildeten Kristalle.

Im weiteren Verlauf wurde nur noch der erste Peak der Gelilftration von LHC

verwendet, da hier eine konstante Salzkonzentration vorlag und die Gröÿe des LHC

in den Ausgangsfraktionen bekannt war.

Da PCP ein stabiles Protein darstellt, welches leichter in eine kristalline Form über-

geht, wurde der Versuch einer Kokristallisation gemacht. Das Experiment wurde mit

LHC und PCP in 10 mg/ml Proteinkonzentrationen mit verschiedenen Zusammen-

setzungen (LHC:PCP: 1:1; 2:1; 3:1) und Screens (MBclassic (Quiagen), MB II classic

(Quiagen), PEG (Quiagen)) mit dem Phoenix Roboter durchgeführt. Diese Ansätze

führten trotz Detergenz aus der LHC Proteinlösung nur zu einer Ausbildung von

PCP Kristallen. Der LHC Komplex �el in allen Fällen aus. Auch die Verwendung

eines LHC und des PCP Kristallisationsscreens führte nur beim PCP Screen (siehe

Material und Methoden Kristallisation PCP) zur Ausbildung von Kristallen. Hierbei


handelte es sich wieder um PCP Kristalle. Eine Ausbildung von Kokristallen oder

LHC Kristallen konnte nicht beobachtet werden (Abb. 3.38).

Abbildung 3.38: Kokristallisationsversuch von LHC mit PCP. Von links nach rechtsLHC-Ausfall und PCP Kristalle, PCP Kristalle, LHC-Ausfall und PCP Kristalle

Die Verwendung eines anderen Detergenz bei Kristallisationsexperimenten als bei

der Aufreinigung kann zur Bildung neuer Kristallformen und Verbesserung der Kri-

stallisation insgesamt führen. Der Austausch von DM gegen DDM oder β-OG über

eine Anionenaustauschersäule (QXL 1 ml Testsäulen) schlug jedoch fehl. Die Um-

pu�erung in DDM führte zum Ausfall des Proteins auf der Säule. Die Verwendung

von β-OG führte zur Denaturierung des Proteins (Abb. 3.39).

0,000

1,000

2,000

3,000

250,0 350,0 450,0 550,0 650,0 750,0Wellenlänge [nm]

Abs

orpt

ion

Abbildung 3.39: Detergenzaustausch mit β-OG. Spektrum des eluierten Proteins nor-miert auf 672 nm.


Die Zugabe von Tween 80 und Triton X100 führte nach 30 min. zu einer leichten

Denaturierung des LHC Komplexes, da die Peaks bei 440 nm und 461nm auf nahezu

gleicher Höhe liegen (Abb. 3.40). Deshalb wurde dieser Ansatz nicht weiter verfolgt.

0,000

1,000

300,0 400,0 500,0 600,0 700,0 800,0Wellenlänge [nm]

Abs

orpt

ion

Abbildung 3.40: Spektren des LHCs , 30 min. nach Zugabe von Triton X100 (2xCMC)oder Tween 80 (2xCMC). Schwarz: Tween80, Pink: TritonX100

Da eine erhöhte Proteinkonzentration von 5-10 mg/ml zu besseren Ergebnissen

führte wurden Kristallansätze mit dem Phoenix Roboter durchgeführt. Es wurden

die kommerziellen Screens JSCG, MBclassic, MBclassic II, Classic, Cryo, PEG, SM1

und SM2 verwendet und die Proteinkonzentrationen 5 mg/ml und 10 mg/ml. Es wur-

de eine konzentrierte Probe und eine nach Dialyse gegen LHCP2 erhaltene konzen-

trierte Proteinlösung verwendet. Es erfolgte bei 10 mg/ml neben der 1:1 Mischung

auch eine 2:1 Mischung. Bei verschiedenen Bedingungen erfolgte ein Kristallwachs-

tum (Tab. 3.41, 3.42).

Screen Bedingung Salz Puffer

Classic 7 0,1 M tri-Natriumcitrate pH5,6

Mbclassic 42 0,35 M Natriumchlorid 0,1 M Tricine pH 8,0

Mbclassic 36 0,05 M Magensiumacetat 0,05 M Natriumacetat pH 4,6

Mbclassic II 30 0,1 M Lithiumsulfat 0,1 M Hepes pH 7,5

0,1 M Natriumchlorid

PEG 73 0,2 M Magnesiumacetat

Cryo 74 0,19 M Calciumchlorid 0,095 M pH7, 5

Abbildung 3.41: Bedingen bei denen Kristalle entstanden. A: LHC aus der Gel�ltration,B: LHC aus der Gel�ltration vor Kristallisation gegen Pu�er 3 dialysiert


Screen Bedingung Salz Puffer

Classic 39 0,05 M Kadmiumsufat 0,1 M Hepes pH 7,5

40 Natriumcacodylat pH 6,5

46 0,1 M Hepes pH 7,5

77 0,2 M Natriumcitrat 0,1 M Tris pH 8,5

Mbclassic 25 Bis-Tris Propane pH 7,0

28 0,3 M Lithiumsulfat 0,1 M ADA pH 6,5

32 0,1 M Magnesiumchlorid 0,1 M Natriumacetat pH 4,6

36 0,05 M Magnesiumacetat 0,05 M Natriumacetat pH 4,6

38 0,2 M Calciumchlorid 0,1 M Hepes pH 7,5

41

43 0,1 M Magnesiumchlorid

44

96

JSCG 95 0,2 M Magensiumchlorid 0,1 M Bis-Tris pH 5,5

Abbildung 3.42: Bedingen bei denen Kristalle entstanden. A: LHC aus der Gel�ltration,B: LHC aus der Gel�ltration vor Kristallisation gegen Pu�er 3 dialysiert

Neue Zusätze waren Kalciumchlorid, Ammoniumsulfat, Magnesiumacetat und

Kadmiumsulfat als Salz sowie Bicine pH 9,0 und Bis-Tris Propane pH 7,0 als Puf-

fer sowie Natrium- und Kaliumphosphat als Fällungsmittel. Eine neue Kristallform

wurde nicht gefunden. Die meisten Lösungen enthielten PEG 400. Daraufhin wur-

den diese Bedingungen hinsichtlich ihrer PEG Konzentration und Salzkonzentration

variiert. Es entstand immer eine rechteckige Kristallform unabhängig von Salz und

Pu�er. Da keine Kristallform entstanden war, die bei Messungen an die Qualität

des ersten Datensatzes heranreichte wurde die Bedingung 30 % PEG 400, 0,05 M

MgCl_2 und 0,1 M Na-cacodylate pH 6,5 wieder als Ausgang für weitere Experi-

mente verwendet. Durch eine Erhöhung der Proteinkonzentration auf min. 20 mg/ml

konnten Kristalle mit einer Kantenlänge von 100 µ m erhalten werden. Daraufhin

wurde die Reservroirlösung von 25-16 % PEG 400 in 0,5 % Schritten variiert. Als

Pu�er wurde Na-cacodylate pH 6,5 (0,1 M) verwendet und das Salz war MgCl2(0,05 M). Die Anfangs PEG 400 Konzentration im gemischten Tropfen wurde auf

15 % gesetzt. Dies führte zum Wachstum von Kristallen, die am Synchotron Re�ex-

muster bis 3,5 Angström zeigten (Abb. 3.43). Eine Verfeinerung auf einen Screen

mit 18-16 % PEG 400 führte reproduierbar zum Wachstum von Kristallen mit bis

zu 200 µm Kantenlängen (Abb. 3.43)

In Tropfen mit verringertem Volumen (0,5 µl)kam es zu einem schnelleren Kristall-

waschtum. Diese Tropfen gelangten früher in die Nucleatiosnzoine als die gröÿeren.

Neben der Tropfengröÿe beEin�usste auch die Proteinkonzentration die Geschwin-

digkeit der Kristallbildung. So konnte die Ausbildung von Kristalle, bei einer Protein-


konzentration von 100 mg/ml schon nach fünf Tagen beobachtet werden wohingegen

eine Konzentration von 20 mg/ml erst nach drei Wochen zur Bildung nachweisbarer

Kristalle zur Folge hatte. Deshalb wurde im folgenden nur der Screen von 25-16 %

PEG 400 verwendet.

A

500 µm

Abbildung 3.43: Beispiel von Kristallen, die beim optimierten Screen wuchsen

Aufgrund dessen, dass die PEG 400 Konzentration in der Reservoirlösung und im

Tropfen zu Beginn der Kristallisation nahezu gleich waren wurde eine Kristallisation

unter Öl durchgeführt. Hierbei wurden verschiedene Tropfengröÿen verwendet (1 µl,

3 µl, 6 µl) und zwei verschiedene Ölzusammensetzungen verwendet (Al�s Öl, Paraf-

�nöl). Die Proteinkonzentration betrug 100 mg/ml. Es kam nur zur Ausbildung von

Ausfall und Phasentrennung (Abb. 3.44). Ein Einkristallwachstum oder das Auftre-

ten einer neuen Kristallformen als Verbesserung der hanging drop Versuche konnte

nicht beobachtet werden weshalb dieser Ansatz nicht weiter verfolgt wurde.

A CB

Abbildung 3.44: Kristallisation unter Öl. A: 1 µl Tropfen, B: 3 µl Tropfen, C: 6 µlTropfen

Der membrangebunden LHC Komplex ist im Chloroplasten eingebettet in eine Li-

piddoppelschicht. Deshalb wurde auch eine Kristallisation in kubischen Phasen nach


dem bR Vorbild durchgeführt [Landau and Rosenbusch, 1996; Rummel et al., 1998].

Bei den Kristallisationsansätzen in kubischen Phasen war ein Ausfall des Proteins

sowie die Ausbildung von Salzkristallen zu beobachten. Ein Wachstum von Protein-

kristallen erfolgte nicht (Abb. 3.45).

A B C

Abbildung 3.45: Kirstallisation von LHC in kubischen Phasen. A: klare Protein-Lipidlösung mit Salzkristallen, B: Ausfall, C: Ausfall mit Salzkristallen

Es war nun möglich mit einem optimierten Screen Kristalle gleicher morphologoi-

scher Form bis zu einer Kantenlänge von 200 µm reproduzierbar zu erstellen die

alle ein ähnliches Beugungsverhalten zeigten. Die Au�ösung der Re�exe betrug bis

zu 3,5 Angström. Es konnten insgesamt 4 verschiedene Kristallformen bei verschie-

denen Bedingungen beobachtet werden die als Grudnform ein Rechteck aufwiesen.

Unterschiede lagen im Längen- Breitenwachstumsverhältnis (von 2:1 bis 10:1). Die

Benutzung eines Konzentrators mit einem Ausschlussvolumen von 100 kDa statt

50 kDa führte nicht zu einer Optimierung. Aussschlaggebend für die reproduzierba-

re Bildung von Kristallen war die PEG 400 Konzentration und die Proteinkonzen-

tration. Eine zu hohe Konzentration an PEG führt eher zum Ausfall des Proteins.

Die Zusammensetzung des Tropfens im Vergleich zum Reservoir ist entscheident für

die Geschwindigeit des Kristallwachstums von LHC. Ebenso die Tropfengröÿe. So

konnte die Wachstumszeit von 6 Monate auf ca. 2 Monate bis zur Endgröÿe der

Kristalle verringert werden

Da die Gel�ltration reproduzierbar min. zwei Peaks zeigte, wurden vom zweite Peak,

der das Dimer von LHC darstellt, Kristallisationsansätze mit dem Phoenixroboter

hergestellt. Es wurden die Screens MB class II, Cryo und Classic (alle Quiagen) ver-

wendet. Die verwendeten Proteinkonzentrationen wurden aufgrund der Erfahrungen

in der Kristallisation vom Trimer auf 10 mg/ml, 30 mg/ml und 60 m/ml eingestellt.

Die Konzentrierung erfolgte mit dem 50 kDa Konzentrator. Das Protein konnte auch

hier erfolgreich kristallisiert werden (Abb. 3.46) (Tab. 3.47).

3.9 Röntgenbeugungsexperimente an LHC Kristallen 90

A B C

E F

D

50µm50µm10µm 50µm

50µm 50µm60µm 50µm

G H

Abbildung 3.46: Kristall der Dimerkristallisation. A: classic 7, B: classic 74, C: classic89, D: classic 92, E: MBclass II 21, F: MBclass II 25, G: MB class II 31. MB class II 44

Screen Nr. Salz Puffer

MB class II 21 0,1 M Natriumchlorid 0,1 M MES pH6,5

MB class II 25 0,1 M Natriumchlorid 0,1 M Hepes pH7,5

MB class II 31 0,1 M Natriumchlorid 0,1 M Tris pH8,5

0,1 M Litiumsulfat

MB class II 44 0,1 M Ammoniumsulfat 0,1 M Hepes pH7,5

classic 7 0.1 M tri-Sodium citrate pH 5.6

classic 74 0,2 M Calciumchlorid 0,1 M Hepes pH7,5

classic 89 0,2 M Litiumsulfat 0,1 M Tris pH8,5

classic 92 0,2 M Ammoniumsulfat 0,1 M MES pH6,5

Abbildung 3.47: Erfolgreiche Kristallisationsbedingungen des LHC �Dimers”

Ebenso wie beim Trimer ist auch hier der Einsatz von PEG 400 entscheident für die

Bildung von Kistallen. Auch die Pu�ersubstanzen und Salze sind aus erfolgreichen

Kristallisationsbedingungen des Trimers bekannt.

3.9 Röntgenbeugungsexperimente an LHC

Kristallen

Die Struktur von LHC sollte mittels Röntgenbeugung gelöst werden. Hierzu wurden

insgesamt 220 Kristalle ge�scht und es erfolgten Messungen mit einem Röntgendif-

fraktometer. Von diesen wurden 87 Kristalle mit dem optimierten Screen hergestellt.

Es wurden 170 Kristalle an einem Synchotron getestet. Die meisten Kristalle zeigten

nur wenige Re�exe und diese waren teilweise noch verschmiert (Abb. 3.48). Wie in


Abschnitt Kristallisation von LHC beschrieben, wurden aufgrund qualitativ minder-

wertiger Beugungmuster die Kristallisationslösungen weiter verändert oder Zusam-

mensetzungen wurden nicht weiter verfolgt.

12 Å

Abbildung 3.48: Beispiel eines Beugungsbildes eines Kristalls mit schlechtenBeuhungseigenschaften

Von 11 Kristallen wurden Datensätze aufgenommen (Tab. 3.2). Allen gemeinsam

war eine Aniosotropie der Beugunsmuster und das Auftreten von Re�exen bis maxi-

mal 3,5 A (Abb. 3.48).

Abbildung 3.49: Beugungsbilder von Kristall 4. Rechts schlechter Beugungsbereicht,links: guter Beugunbgsbereich


Kristall. Bedingung Anzahl GradNr. Messungen4 30 % PEG 4000, 1 M Na-cacodylate pH 6,5,

0,05 M MgCl22 highres:

180,lowres:60lowres:60

55 30 % PEG 400, 0,1 M Hepes pH 7,5, 0,2 M NaCl,1 % DM2

4 highres:230, 180,81lowres:180

56 30 % PEG 400, 0,1 M Hepes pH 7,5, 0,2 M NaCl,1 % DM2

3 138, 23,24

135 Tropfen: 30 % PEG 400, 0,1 M Na-cacodylatepH 6,5, 0,05 M MgCl2

2 60, 30

Reservoir: 15 % PEG 400, 0,1 M Na-cacodylatepH 6,5, 0,05 M MgCl2


1 60



2 175, 90



1 180



1 89



3 230 SLS,360, 360ESRF



2 360,360

Reservoir: 16,6 % PEG 400, 0,1 M Na-cacodylate pH 6,5, 0,05 M MgCl2Tabelle 3.2: Kristalle von denen Datensätze aufgenommen wurden


Abbildung 3.50: Beugungsbilder von Kristall 56. Rechts schlechter Beugungsbereicht,links: guter Beugunbgsbereich

Abbildung 3.51: Beugungsbilder von Kristall 161 als Beispiel. Rechts schlechter Beu-gungsbereich, links: guter Beugungsbereich

Es konnten ein Highresolution und Lowresolution-Datensatz des gröÿten Kristalls

(4) aufgenommen werden. Die Messung erfolgte am SLS in 1° Schritten. Die Re-

duktion der Daten erfolgte mit XDS [Kabsch, 1988]. Als Raumgruppe wurde P2

(monoklin zentriert) bestimmt. Die nachfolgenden Tabellen zeigen die Statistik der

beiden Datensätze. Die maximale Au�ösung der Daten wurde aufgrund eines Inten-

sitäts zu Rauschen Wertes von min. 3 A und einem R-meas Wert von unter 40 %

ermittelt. So ergab sich für den Highresdatensatz eine maxmale Au�söung von 3,5 A

und für den Lowresdatensatz von 6 A.


A AnzahlRe�exe

Vollst. R-faktor

I/Sigma R- R

gesamt red. möglich meas mrgd-F8.99 5221 1461 1573 92.9 % 3.9 % 24.48 4.5 % 2.7 %6.41 10076 2676 2688 99.6 % 5.9 % 20.76 6.9 % 4.3 %5.25 13161 3442 3449 99.8 % 6.5 % 14.33 7.5 % 6.3 %4.56 15573 4057 4063 99.9 % 7.5 % 10.71 8.8 % 9.3 %4.08 17579 4565 4577 99.7 % 12.0 % 7.78 14.0 % 15.2 %3.73 19443 5049 5061 99.8 % 21.0 % 4.85 24.4 % 25.0 %3.45 21127 5493 5497 99.9 % 36.4 % 3.13 42.3 % 38.6 %3.23 20624 5870 5870 100.0 % 60.4 % 1.80 71.4 % 81.6 %3.04 9762 5577 6290 88.7 % 272.6 % 0.07 383.2 % 979.6 %total 132566 38190 39068 97.8 % 10.2 % 7.13 12.0 % 23.2 %

Tabelle 3.3: Kristall4: Highresolution Datensatz.

A AnzahlRe�exe

Vollst. R-faktor

I/Sigma R- R


Tabelle 3.4: Kristall 4 Lowresolution Datensatz

Durch XSCALE wurden die Datensätze zusammen skaliert und gemittelt. Die

Korrelation der beiden Datensätze lag bei 0,87. Da es sich jedoch um Messungen am

gleichen Kristall bei gleicher Position handelte wurden die aus XSCALE erhaltene

Daten weiter verwendet. Es wurde ein vollständiger Datensatz erhalten.


A AnzahlRe�exe

Vollst. R-faktor

I/Sigma R- R

gesamt red. möglich meas mrgd-F10.00 6116 1118 1166 95.9 % 5.3 % 26.27 5.9 % 2.8 %7.00 13140 2183 2186 99.9 % 8.8 % 22.86 9.6 % 4.0 %5.20 22620 4761 4773 99.7 % 11.5 % 15.07 2.7 % 6.1 %4.50 16423 4290 4308 99.6 % 7.7 % 10.33 9.0 % 9.6 %4.00 19956 5206 5249 99.2 % 13.4 % 7.33 15.7 % 16.4 %3.70 17650 4598 4619 99.5 % 24.2 % 4.53 28.2 % 28.3 %3.50 15301 3984 4004 99.5 % 37.5 % 3.27 43.7 % 38.9 %total 111206 26140 26305 99.4 % 9.8 % 10.23 11.1 % 12.6 %

Tabelle 3.5: Kristall 4, XSCALE der zusammengefügten Datensätze

Die fehlenden Phasen sollten durch molekularen Ersatz mit der Struktur der Erb-

se [Standfuss et al., 2005] als Modell erhalten werden. Dies schlug jedoch mit dem

Trimer des Erbsen-LHCs ebenso wie mit dem Monomer, mit und ohne Wasser im

Modell, fehl. Auch eine Entfernung der Pigmente aus der gelösten LHC Struktur

führte nicht zur Lösung des Phasenproblems. Das von Eckhard Hofmann angefer-

tigte Homologiemodell des LHCs aus A. c. hatte keine Lösung in Molrep zur Folge.

Für die Strukturlösung mit isomorphen Ersatz oder durch MAD Experimnete sollten

neue Kirstalle gezüchtet werden und Datensätze über einen gröÿeren Winkelbereich

aufgenommen werden. Nachfolgend wurde die Zusammensetzung der eingesetzen

Kryolösung optimiert, da Kristalle aus dem Ansatz wie Kristall 4, die über einen

längeren Zeitraum in der eingesetzten Lösung verblieben, sich au�östen.

A

500 µm 500 µm 500 µm

B C

Abbildung 3.52: Au�ösung der LHC Kristalle in der Einfrierlösung. A: t = 0 min., B: t= 10 min., C: t = 30 min.


Die Verwendung eines anderen Pu�ers sowie die Zugabe von 1 % DM, zur ge-

gen Pu�er LHCP3 dialysierten Proteinlösung führte zur Ausbildung von Kristallen

mit einer maximalen Au�ösung von 3,8 A (Kristall 55,56). In höheren Au�ösungs-

schalen waren keine eindeutigen Re�exe vorhanden, da hier der I/Sigma Wert nur

maximal 1,13 war. Die einzelnen Messungen wiesen keine Vollständigkeit über 90 %

auf. Die Kristalle wurden an verschiedenen Stellen gemessen, die einzelnen Datensät-

ze wiesen eine trikline Raumgruppe auf. Für einen vollständigen Datensatz in dieser

Raumgruppe sind Messungen über den ganzen Winkelbereich notwendig. Für eine

bessere Redundanz der erhaltenen Daten sollten die einzelnen Messungen der bei-

den Kristalle miteinander skaliert und gemittelt werden. Die Korrelattion zwischen

den Datensätzen des Kristalls 55 war jedoch zu gering für eine weitere Auswertung

(Tab. 3.6). Möglicherweise lagen hier verschiedene Kristalle miteinader verwachsen

vor und abhängig von der Position im Strahl wurde jeweils ein anderer Kristall ge-

messen. Die Daten von LHC 56 konnten zusammengefügt werden(Tab. 3.6). Die

Tabelle aus XSCALE zeigt auch durch die erhaltenen Statistik das die Messungen

jedoch bei der Raumgruppe P1 nicht ausreichend für die Lösung der Struktur (Tab.

3.7). Messungen über einen Winkelbereich von min. 360 Grad wären hier notwendig

gewesen.

Kristall 55Datensatz gemeinsame Re�exe Korrelation

1 2 2768 0.4681 3 644 0.1582 3 797 0.1941 4 1023 0.8442 4 1819 0.7883 4 677 0.863

Kristall 56Datensatz gemeinsame Re�exe Korrelation

1 2 123 0.9541 3 144 0.9442 3 446 0.979

Tabelle 3.6: Skalierung der Datensätze von Kristalle 55 und 56


A AnzahlRe�exe

Vollst. R-faktor

I/Sigma R- R

gesamt red. möglich meas mrgd-F10.00 2029 955 1146 83.3 % 2.4 % 38.56 3.1 % 2.2 %7.00 4178 1969 2164 91.0 % 4.2 % 22.67 5.5 % 6.1 %6.00 3782 1785 1927 92.6 % 7.4 % 14.02 9.7 % 14.5 %5.00 5721 3171 3842 82.5 % 5.7 % 10.09 8.0 % 16.9 %4.50 4948 2780 3373 82.4 % 6.7 % 8.12 9.5 % 23.6 %3.80 11355 6511 8201 79.4 % 12.5 % 4.80 17.7 % 43.6 %total 32013 17171 20653 83.1 % 5.8 % 11.20 8.0 % 18.9 %

Tabelle 3.7: Die gemittelten Datensätze von Kristall 56

Die durch die Optimierung der Kristallisation reproduzierbar gezüchtete Kristalle

zeigten Re�exmuster bis zu einer Au�ösung von maximal 3,5 Angström. Für eine

eindeutige Raumgruppenbestimmung waren Messungen über min. 180 ° notwendig.

Die höchste Redundanz wurde bei Kristall 161 erreicht. Hier wurden zwei Daten-

sätze über 360 ° am ESRF aufgenommen und eine Messung über 230 ° am SLS

durchgeführt (Tab. 3.8, 3.9, 3.10). Die Datenreduktion erfolgte mit XDS [Kabsch,

1988]. Als dem Re�exmuster zugrunde liegende Raumgruppe wurde P2 bestimmt.

A AnzahlRe�exe

Vollst. R-faktor

I/Sigma R- R


Tabelle 3.8: Die 1. Messung des Kristalls 161, 360 Grad ESRF


A AnzahlRe�exe

Vollst. R-faktor

I/Sigma R- R


Tabelle 3.9: Die 2. Messung des Kristalls 161, 360 Grad ESRF

Die Messungen am SLS konnten aufgrund der starken Anisotropie der Daten nur

durch eine Einschränkung in Spotrange auf zwei Bereiche 1-71 ° und 180 ° bis 230 °

ausgewertet werden.

A AnzahlRe�exe

Vollst. R-faktor

I/Sigma R- R

gesamt red. möglich meas mrgd-F8.92 2279 500 511 97.8 % 10.6 % 2278 11.9 % 7.5 %6.34 4172 891 901 98.9 % 12.4 % 4171 13.8 % 11.6 %5.18 5357 1129 1137 99.3 % 15.8 % 5355 17.7 % 15.5 %4.49 6272 1314 1320 99.5 % 17.2 % 6270 19.3 % 16.5 %4.02 7132 1514 1524 99.3 % 18.7 % 7128 20.9 % 21.3 %3.67 7666 1646 1657 99.3 % 25.8 % 7664 29.0 % 34.3 %3.40 8271 1803 1808 99.7 % 38.3 % 8268 43.2 % 51.6 %3.18 8528 1926 1937 99.4 % 73.4 % 8522 83.5 % 91.1 %3.00 7812 1992 2044 97.5 % 119.6 % 7737 138.6 % 169.0 %total 57489 12715 12839 99.0 % 24.1 % 57393 27.2 % 37.0 %

Tabelle 3.10: Die 3. Messung des Kristalls 161, 230 Grad SLS

In Bereichen schlechter Beugunsqualität konnte kaum Übereinstimmung mit den

vorhergesagten Re�exen auf der Grundlage von P2 festgestellt werden. Die Bereiche

guter Qualität entsprachen dem Beugungsmuster eines monoklinen Kristalls. Die

Statistiken zeigen einen hohen R-meas auch bei geringer Au�ösung (Tab. 3.8, 3.9,


3.10). Bei Datensätzen deren Messbereich im guten Beugungsbereich an�ng sind die

Werte für R-meas niedriger (Tab. 3.9). Die einzelnen Datensätze wurden mit dem

Programm XSTATT aus XDS untersucht und es konnte kein Strahlenschaden am

Kristall festgestellt werden. Diese Form der Kristalle war daher stabil genug um

ausreichend Daten sammeln zu können. Es wurde kein Hinweis auf eine fehlerhafte

Auswertung bzw. Problemen bei dieser mit XDS gefunden.

Die mit XDS ausgewerteten Messungen wurden miteinander in XSCALE zu einem

Datensatz mit einer maximalen Au�ösung von 3,7 A skaliert und gemittelt. Es wur-

den die Daten der ersten Messung aufgrund des Ergebnisses bei XDS bis zu einer

Au�ösung von 4,0 A verwendet. Die Daten der zweiten und dritten Messung bis

3,7 A (Tab. 3.11 3.12). Aufgrund der hohen Korreleation zwischen den Datensätzen

und der Statistik aus XSCALE der wurde das Ergebnis für den molekularen Ersatz

verwendet.

Datensatz gemeinsame Re�exe Korrelation1 2 123 0.9741 3 144 0.9522 3 446 0.967

Tabelle 3.11: Skalierung der Datensätze von Kristalle 161

A AnzahlRe�exe

Vollst. R-faktor

I/Sigma R- R


Tabelle 3.12: XSCALE von Kristall 161 alle Messungen zusammen


Trotz der hohen Datenredundanz bei Kristall 161 konnte auch hier keine Bestim-

mung der Phasen durch molekularem Ersatz in Molrep erreicht werden. Auch mit

dem um die Loopregionen reduzierten Modell der Erbse kam es zu keiner Lösung in

Molrep.

Der Vergleich der Zellparameter in Raumgruppe P1 zwischen den Kristallen der Da-

tensätze ergab, das der erste Kristall (4) wie auch Kristall 55 eine stark verlängerte

Achse aufwiesen.

Kristall EinheitszellkonstantenNr. a b c alpha beta gamma4 80,83 99,65 136,33 89,9 89,64 75,6655 84,20 102,65 142,70 104,57 99,76 110,8356 72,12 84,12 102,82 110,92 103,81 100,54135 72,97 72,97 79,60 64,27 64,27 69.51138-3 76,01 76,08 76,10 98,41 113,55 116,87138-6 15,85 64,88 65,28 79,62 89,95 89,98139 72,75 73,12 79,48 64,53 64,74 69,56146 75,53 76,11 76,98 98,80 117,46 112,14151 15,84 65,40 65,44 100,79 90,00 90,05161 70,76 70,77 77,47 65,41 65,74 71,52196 72,53 72,99 78,19 64,90 64,95 69,64

Tabelle 3.13: Zellparametervergleich bei Raumgruppe P1 (trikline) der gemessenenKristalle

Hingegen hatten LHC-138 Datensatz 6 und 151 eine stark verkürzte Achse. Die

deutet auf eine falsche Indizierung hin. Bei beiden Messungen wurde nur ein geringer

Winkelbereich gemessen.Die Zellparameter der anderen Kristalle sind ähnlich (Tab.

3.13). Den Kristallen der opimierten Bedingungen lag somit nicht nur morphologisch

sondern auch nach Auswertung die gleiche Kristallsymmetrie zugrunde.

Das Phasenproblem konnnte nicht mit dem molekularen Ersatz gelöst werden. Eine

experimentelle Bestimmung ist mit SAD Messungen möglich. Durch die Reprodu-

zierbarkeit der Kristalle war es nun möglich Kristalle in Schwermetallösungen zu

soaken um SAD Experimente durchführen zu können. Es wurden die Schwermetall-

verbindungen Cl4K2Pt, KAu(CN)2, HgCl2, K2Pt(NO2)4 und KAuCl4 des Schwerme-

tallscreen von Jena Biosciences verwendet. Die Konzentration in der Kristallisations-

lösung mit 0,16 % DM betrug 10 mM. Die Kristalle wurden in die schwermetallhal-

tige Kristallisationslösung mit einem Loop überführt und für 1 h inkubiert. Danach

3.10 Die Aufreinigung von PCP 101

erfolgte das backsoaken in der Kristallisationslösung mit 0,16 % DM ohne Schwer-

metall. Die Dauer des soaken von 1 h Stunde führte zu einem Schwermetallsignal

bei Messungen am Synchotron. Es konnte ein Qualitätsverlust der Beugung festge-

stellt werden. Daraufhin wurde die Vorschrift für das soaken von Kristallen in Gold

optimiert und es wurde ein Datensatz eines LHC Kristalls an der Goldkante aufge-

nommen werden. Ob Gold in den Kristall eingebaut wurde konnte am ESRF nicht

gezeigt werde, es wurde nur ein Goldsignal der montierten Probe nachgewiesen. Für

den Vergleich mit den schon gemessenen Daten wurde ein nativer Datensatz dieses

Kristalls aufgenommen.

3.10 Die Aufreinigung von PCP

Innerhalb dieser Arbeit sollte das Protokoll für die Aufreinigung von PCP optimiert

werden. Die Auftrennung von PCP in die einzelnen Isoformen sollte im Vergleich zur

Diplomarbeit[Johanning, 2005] verbessert werden. Die einzelnen Peaks der Chroma-

tofokussierung sollten näher untersucht werden.

Eine Optimierung sollte die Umstellung auf eine Anionenaustauschchromatographie-

säule statt der Chromatofokussierung sein. Die beste Auftrennung des PCP Gemi-

sches wurde durch die DEAE Matrix erreicht. Die Elution erfolgte in zwei Peaks , die

bei der Verwendung des QXL und des Materials weniger gut getrennt wurde (Abb.

3.53). Eine Anbindung an die Matrix Source15S erfolgte nicht (Abb. 3.53). Das in

anderen Arbeiten verwendete Material DEAE [Haxo et al., 1976; Song et al., 1976]

war auch für eine Aufreinigung mit dem isolierten PCP aus der eigenen Anzucht

von A.c. am besten geeignet.

Die Verwendung des Anionenaustauschers führte jedoch nicht zu einer besseren Auf-

trennung der Isoformen. Die Elution bei Verwendung der XK26/20 Säule erfolgte in

ein oder drei Peaks in Abhängigkeit des Gradienten. Ein �acherer Gradient führte

zu einer besseren Auftrennung (Abb. 3.54). Das UV/VIS Spektrum der Peaks zeigte

das es sich nicht um drei Isoformen handelte, da der zweite Peak weniger Pigmente

gebunden hatte (Abb.3.55). Der erste und zweite Peak waren nahezu deckungsgleich

und es könnte sich hierbei um zwei Isoformen gehandelt haben. Dies stellte keine


Verbesserung im Vergleich zur Chromatofokussierung dar.

1000

1500

2000

500

3000

0

10 30 ml

AU

4020

2500

3500

50

%B

80

60

40

20

0

Abbildung 3.53: Elutionspro�le der Anionaustauschchromatographiesäulen. Pink: Sour-ce15S, grün: DEAE, schwarz: QXL

0

1 3 CV

AU

62

500

7

%B

80

60

40

20

0

400

300

200

100

0 4 5

Abbildung 3.54: Elutionspro�l der Anionenaustauschchromatographie DEAE �acherGradient. Schwarz: 478 nm, blau: 280 nm, pink: 672 nm


0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

250 350 450 550 650 750Wellenänge [nm]

Abs

orpt

ion

Abbildung 3.55: UV/VIS Spektren der drei Peaks der Anionenaustauschchromatogra-phie mit der XK26/20 DEAE Säule. Blau: Peak 1, pink: Peak 2, grün: Peak 3

Die Reinigung über eine Gel�ltration mit dem Säulenmaterial SepharoseS300 führ-

te zu Elutionspro�len mit ein, zwei oder fünf Peaks unabhängig von der Art des

Aufschlussgerätes (Abb. 3.56).

Abbildung 3.56: Beispiele der Elutionspro�le der Gel�ltration mit dem SäulenmaterialSepharoseS300


Es konnte auch keine Korrelation der Elution mit der Lagerzeit des PCP Gemi-

sches fest gestellt werden. Die Auftrennung in fünf Peaks erfolgte nur bei einem

Pu�er 1 mM Tris pH 8,4. Die Reproduzierbarkeit des Ergebnisses war schwierig.

Für die Chromatofokussierung wurde meist ein Pool aus PCP von CV 0,52 bis 0,57

verwendet. Alle Chromatofokussierungsläufe zeigten eine Auftrennung des PCP in

neun Proteinpeaks. Die Elutionspro�le sind in Ahängigkeit von der Steilheit des pH-

Gradienten verschoben (Abb. 3.57). Die Ausprägung der einzelnen Peaks variierte

in den Säulenläufen. Dies ist durch unterschiedliche Chargen an PCP begründet, da

PCP gleicher Gröÿe aufgetragen wurde.

1

2

3

3

4

4

5

5

6

6

7

7

8899

1000

1500

2000

AU

500

0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 CV

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

pH

Abbildung 3.57: Elutionspro�le der Chromatofokussierung bei unterschiedlich steilen pHGradienten. Blau: �acher Gradient, Pink: steiler Gradient

Den hier getrennten PCP Peaks hatten unterschiedliche Molekulare Gröÿen in

der Gel�ltration (Abb. 3.58). Der Peak sechs zeigt in der Gel�ltration ebenso zwei

Peaks wie der Peak 4. Der Pool für die einzelnen Peaks war aufgrund der geringen

Trennung schwierig und so können Gemische entstanden sein.


4

1000

1500

2000

500

2500

0

0,5 0,55 0,60 0,65 0,70 CV

3000

AU6

9

8 34

1

7

2

Abbildung 3.58: Die Gel�ltration der einzelenen Peaks der Chromatofokussierung

Durch die Eichung der Gel�ltration (Abb. 3.59) konnten die Molekülmassen be-

stimmt werden (Tab. 3.14. Nur die Gröÿe des Peak sechs entspricht dem Trimer von

PCP. Der pI war nach dem Gradienten der Chromatofokussierung 6,8. Das PCP der

Hauptform hat einen pI von 7,5 hier konnte nur Protein in die Gröÿe eines Dimer

nachgewiesen werden (Peak5).

Peaknr. kav ca. Masse kDa Peaknr. kav ca. Masse kDa1 0,44 55 6 0,33 0,42 103, 632 0,44 55 7 0,41 703 0,43 61 8 0,4 694 0,38, 0,42 80, 63 9 0,41 705 0,39 78Tabelle 3.14: Gröÿenverteilung der Peaks der Chromatofokussierung


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

10 100 1000Molekulrgewicht [kDa]

kav

Abbildung 3.59: Eichegrade der Gel�ltration Superdex200 HR10/30 für die Gröÿenbe-stimmung der Peaks

Alle Peaks hatten ein 32 kDa groÿes Approtein. Die UV VIS Spektren zeigten

leichte Unterschiede der einzelnen Peaks in der Peridinin und Chlorophyll a Absorp-

tion.

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

250 350 450 550 650Wellenlänge [nm]

Abs

orpt

ion

Peak2Peak3Peak4Peak5Peak7Peak8Peak9Peak6

Abbildung 3.60: UV/VIS Spektren der einzelnen Peaks. Verwendet wurde jeweils dieFraktion mit dem Absorptionsmaximum in der Gel�ltration.


Durch die Chromatofokussierung konnte keine Auftrennung von PCP Isoformen

als Trimere gezeigt werden. Den Peaks der Chromatofokussierung lagen Dimere oder

Monomere zugrunde die Unterschiede in der Peridinin und Chlorophyllabsorption

aufwiesen.

Für Studien zur Interaktion von LHC und PCP sollte das Trimer von PCP aufgerei-

nigt werden. Es konnte gezeigt werden, das der Zusatz von Magnesiumchlorid zur

Elution in zwei Peaks führte (Abb. 3.61). Das Elutionvolumen von 0,6 CV für den

ersten und ca. 0,7 CV für den zweiten Peak entsprach, unter Berücksichtigung der

Ungenauigkeit der Eichung der Gel�ltration, dem Trimer und dem Monomer von

PCP. Es konnte mehr Trimer im Verhältnis zum Monomer eluiert werden. Säulen-

läufe ohne Magnesiumchlorid wiesen einen Peak bei ca. 0,7 CV auf und einen bei

0,61 CV oder 0,63 CV auf (Abb. 3.61)Der Peak bei 0,61 CV entspricht ca. 70 kDa

und der bei 0,63 CV ca. 60 kDa. Hierbei handelt es sich um Dimere oder Abbau-

produkte des PCP. Der Peak bei 0,7 CV entsprach wieder dem Monomer des PCP.

Der Unterschied in der Signalhöhe ist geringer als bei der Elution mit zweiwertigen

Ionen im Pu�er. Das SDS Gel zeigte (Abb. 3.62), dass den Monomerfraktionen auch

Peptide unter 32 kDa auftraten. Somit handelt es sich beim zweiten Peak um ein

Monomer- Abbauproduktgemisch.

1000

1500

2000

500

2500

0

0,2 0,60 CV

AU

0,800,4

Abbildung 3.61: Elutionspro�le der Gel�ltration mit Superdex200 HR10/60. Pink: mit20 mM MgCl2 im Laufpu�er, grün und blau: Laufpu�er ohne MgCl2


21,5 kDa

31,0 kDa

66,2 kDa

45,0 kDa

97,4 kDa

1 2 3 4 5 7 8 9 106 11 12 13

14,4 kDa

14 15

Abbildung 3.62: SDS-Gel der Gel�ltration mit einem PEak bei 0,37 CV. 1-2:vor Protei-nelution 3: Peak bei 0,37 CV,4: Fraktion nach Peak1, 5 und 7-11: Proteinelution, 6: Marker,12-15 Fraktionen nach Proteinelution

Teilweise konnte ein Peak bei 0,37 CV beobachtet werden. Dieser trat nur bei

Zellaufschlüssen mit dem Fluidizer unregelmäÿig auf.Das Elutionsvolumen lagt ge-

ringfügig über dem Auschlussvolumen der Säule. Das eluierte Protein wies damit

eine Gröÿe über 1000 kDa auf.Die Fraktionen waren grünbraun gefärbt und wiesen

das Spektrum von LHC auf (Abb. 3.63). Im SDS-Gel trat eine Bande bei 19 kDa

auf (Abb. 3.62).

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

250,0 350,0 450,0 550,0 650,0 750,0Wellenlänge [nm]

Abs

orpt

ion

Abbildung 3.63: Spektrum des Peaks bei 0,37 CV.

Ein ATR Spektrum der Probe zeigte die AmidI und die Amid II Banden sowie

kleine Lipidbanden

3.11 Hochaufgelöster Datensatz von PCP aus A. c. 109

100015002000250030003500Wavenumber cm-1

-0.0

2-0

.01

0.00

0.01

0.02

Abs

orba

nce

Uni

ts

Amid I

C=O, Lipid

AmidII

symmetrische CH2 Streckschwingung

asymmetrsiche CH2 Streckschwingung

Abbildung 3.64: ATR-Spektrum des Peaks bei 0,37 CV

3.11 Hochaufgelöster Datensatz von PCP aus A. c.

Das aus der Aufreinigung von LHC erhaltene PCP im Überstand besteht zu 90 %

aus der Hauptform von PCP und wurde nach beschriebenem Protokoll kristallisiert.

Die erhaltenen Kristalle wuchsen bis zu einer Gröÿe von 300 mum Kantenlänge.

Die native Datensätze wurden am SLS aufgenommen. Aufgrund der Kenntnisse über

PCP Kristalle wurden Messungen mit min. 180 Grad vorgenommen. Um in allen

Au�ösungsbereichen vollständige Daten zu erhalten wurde ein Highresolution und

eine Lowresolution Datensatz aufgenommen. Zur Minimierung eines Strahlenscha-

dens wurden die Messungen bei 100 K durchgeführt.

Belichtungszeit 1.0 sGrad pro Bild 0,75

Anzahl aufgenommener Bilder 239Wellenlänge 0,980 Angström

Detektorabstand 120 mmTabelle 3.15: Highresolution-Daten der Messung am SLS


Belichtungszeit 1.0 sGrad pro Bild 1.0

Anzahl aufgenommener Bilder 239Wellenlänge 0,980 Angström

Detektorabstand 400 mmTabelle 3.16: Lowresolution-Daten der Messung am SLS

Mit dem Programm XDS [Kabsch, 1988] erfolgte die Datenreduktion (Tab. 3.17,

3.18). Die Statistik zeigte eine maximale Au�ösung von 1,27 A im Highresolution

Datensatz. Die Raumgruppe wurde auf mC bestimmt.

A AnzahlRe�exe

Vollst. R-faktor

I/Sigma R- R


Tabelle 3.17: PCP Kristall: Highresolution Datensatz.

Die Daten konnten miteinander in XSCALE skaliert werden, mit einer Korrela-

tion von 0,993 Die erhaltene Statistik zeigt für die zugrunde gelegte Raumgruppe

vollständige Daten.


A AnzahlRe�exe

Vollst. R-faktor

I/Sigma R- R

gesamt red. möglich meas mrgd-F8.66 4026 2113 2413 87.6 % 1.6 % 35.87 2.2 % 1.8 %6.15 7899 4032 4327 93.2 % 2.0 % 31.57 2.8 % 2.3 %5.03 10262 5221 5565 93.8 % 2.2 % 29.70 3.0 % 2,5 %4.36 11866 6062 6573 92.2 % 2.2 % 30.35 3.0 % 2.5 %3.90 13510 6937 7482 92.7 % 2.4 % 28.88 3.3 % 2.7 %3.56 13597 7458 8261 90.3 % 2.6 % 26.08 3.6 % 3.0 %3.30 10878 6953 8950 77.7 % 2.7 % 21.40 3.8 % 3.3 %3.09 7024 5072 9630 52.7 % 2.7 % 17.25 3.9 % 3.5 %2.91 2627 2156 10309 20.9 % 3.5 % 14.31 5.0 % 4.5 %total 81689 46004 63510 72.4 % 2.3 % 26.17 3.2 % 2.7 %

Tabelle 3.18: PCP Kristall: Lowresolution Datensatz.

A AnzahlRe�exe

Vollst. R-faktor

I/Sigma R- R

gesamt red. möglich meas mrgd-F10.00 3913 759 843 90.0 % 2.3 % 70.96 2.5 % 1.1 %5.00 37726 5531 5637 98.1 % 3.4 % 55.16 3.6 % 1.4 %3.00 137207 22753 23103 98.5 % 4.1 % 38.66 4.4 % 2.1 %2.30 127374 34747 35772 97.1 % 3.9 % 25.06 4.6 % 3.0 %2.00 120099 33197 33834 98.1 % 4.7 % 20.42 5.5 % 3.9 %1.80 133289 36433 36718 99.2 % 6.0 % 16.63 7.1 % 5.5 %1.65 148963 40237 40334 99.8 % 7.7 % 13.58 9.1 % 7.5 %1.55 134030 36219 36239 99.9 % 10.6 % 10.64 12.5 % 10.9 %1.45 171608 46792 46864 99.8 % 15.3 % 7.93 17.9 % 16.3 %1.40 105016 28665 28691 99.9 % 21.4 % 5.94 25.1 % 23.4 %1.35 116616 33088 33134 99.9 % 25.9 % 4.91 30.5 % 29.4 %1.27 57395 56811 64323 88.3 % 32.0 % 3.43 38.9 % 43.1 %total 1393236 375232 385492 97.3 % 4.8 % 13.92 5.4 % 8.1 %

Tabelle 3.19: XSCALE der PCP Datensätze

Mit XDSCONV wurden die Daten in andere Formate konvertiert um in Shelx und

CCp4i für die Auswertung genutzt werden zu können.

Die Phasen wurde durch molekularen Ersatz mit Molrep erhalten. Als Modell diente

die bekannte Struktur der Hauptform von PCP [Hofmann, 1996]. Die Verfeinerung

der Daten erfolgte mit Shelx H für groÿe Proteine und manuell mit COOT in mehre-


ren Zyklen. Daten für Rfree wurden mit Shelx generiert. Die Restraints für DGDG,

PID und CLA wurden aus dem PDB �le der Struktur von MFPCP [Hofmann, 1996]

bei 2 A mit ShelX H erstellt. Nach dem Verfeinerungslauf sechs wurden die Res-

traints für DGDG mit PRODRG [Schuettelkopf and van Aalten, 2004] generiert.

Die R-faktoren verringerten sich mit jeder Verfeinerung. Die Kontrolle durch den

Run Programm Rfree Rfac1 Shelx rigid body 33,97 % 34,01 %2 Shelx restaindes 27,1 % 25,53 %3 Coot4 Shelx restrained 26,8 % 25,2 %5 Coot6 Shelx restrained 26,44 % 24,87 %7 Coot Einbau von Wasser8 Shelx 23,93 % 22,37 %

Tabelle 3.20: Verfeinerung der Daten von PCP mit Shelx und Coot

Rfree zeigt das keine Über�ttung der Daten stattfand. Folgenden Pigmente und

Aminosäuren sind noch fehlerhaft positioniert:

Monomer 1 Monomer 2 Monomer 3DGDG 1615 DGDG 2615 DGDG 3615Glu 1227 Glu 3227

Thr 2159Lys 2148Ile 2073

Lys 3223Lys 3148

Die hier erhaltene Struktur entsprach der publizierten [Hofmann, 1996] (Abb.

3.65).


Abbildung 3.65: Die Struktur von MFPCP bei 1,27 A


4 Diskussion

4.1 Belichtungstest von Amphidinium carterae

Es konnte nachgewiesen werden, das die Lichtintensität das Wachstum, wie auch die

Färbung der Zellen beein�usste.

Die Veränderung der Zellfarbe nach grünlich-gelb bei steigender Belichtung und da-

mit die Verringerung der zur Braunfärbung führenden Peridinine wies daraufhin

das nicht nur die Transkriptionsraten der Lichtsammelkomplexe durch steigende

Belichtung sinken [ten Lohuis MR and Miller, 1998][Roman et al., 1988], sondern

auch die Bildung der gesamten Komplexe. Auch das kein PCP bei Starklichtanzuch-

ten nachweisbar war unterstützt dies. Der fehlende Nachweis von PCP bei Zellen

die im Schatten wuchsen ist hier auf die geringe Zellzahl zurückzuführen. Neben

den Lichtsammelkomplexen existieren auch andere Chlorophyll-haltige Komplexe

[Boczar and Prezelin, 1987], die die Photosysteme darstellen. Diese enthalten weniger

Karotinoide. Durch die Verringerung der Lichtsammelkomplexmenge bei Starklicht-

anzuchten könnte die Färbung der Zellen dann vorwiegend von den Photosystemen

hervorgerufen werden. Wenige LHC Moleküle �ankieren die Photosysteme und über-

tragen nach Anregung Energie auf diese. Bei einer Belichtung von 20 µE ändert sich

dieser Zustand. Die Bildung der Lichtsammelkomplexe LHC und PCP wird gestei-

gert und die Zellen erhalten eine braune Färbung. Es kommt zu einer optimalen

Ausnutzung des einstrahlenden Lichts. Der Energietransfer erfolgt PCP vorwiegend

zum LHC und nachfolgend zu den Photosystemen.

4.2 Aufreinigung von LHC aus Amphidinium carterae 115

4.2 Aufreinigung von LHC aus Amphidinium

carterae

Die Ausbeute an LHC konnte stark gesteigert werden, so dass dies kein limitierender

Faktor bei weiteren Experimenten ist.

Nicht alles LHC konnte aus den Zellen isoliert werden, da keine vollständige So-

lubilisierung stattfand. Trotz des schon verbesserten Systems kann hier noch eine

Optimierung in Bezug auf die Proteinmengeneinstellung für die DM Zugabe erfolgen

um die Ausbeute an LHC noch zu erhöhen.

Die Anionenaustauschchromatographie trennte andere Proteine von LHC. Das Elu-

tionspro�l zeigte einen breiten Peak der sich möglicherweise in zwei bis drei Peaks

aufgespalten werden könnte. Die Verwendung eines �acheren Gradienten könnte hier

mehr Aufschluss geben. Möglicherweise lag das Protein hier schon als Trimer und

Dimer oder als Trimer-, Dimer- und Monomer-gemisch vor. Dies kann anhand des

Elutionspro�ls nicht beurteilt werden. Eine nachfolgende Gel�ltration war deshalb

unerlässlich.

Das LHC aus dem Spinat und der Erbse liegen als Trimer [Liu et al., 2004; Salverda

et al., 2003] vor. Da LHC aus A. c. einen ähnlichen Aufbau besitzt kann davon ausge-

gangen werden dass die Organisation von LHC in der Membran ebenfalls ein Trimer

ist. Die Elutionspro�le der Gel�ltration zeigten, das der Komplex in Abhängigkeit

der Konzentrierung zerfällt. Durch die Verwendung von 50 kDa Konzentratoren er-

höht sich die Detergenzmenge während der Einengung [Strop and Brunger, 2005].

Diese führt nicht zur Denaturierung des Komplexes, da die Spektren der Peakfrak-

tionen der Gel�ltration deckungsgleich sind, sondern zu einer Dissoziation. Da dem

LHC Komplex eine Multigenfamilie zugrunde [Hiller et al., 1995] liegt ist eine He-

terogenität des Trimers wahrscheinlich. Es ist daher möglich, dass es innerhalb des

Trimers unterschiedlich starke Bindungen zwischen den Monomeren gibt. Das erklärt

den Zerfall zuerst in Dimere. Ein Monomerpeak ist bei dem Zerfall von Trimer zum

Dimer nicht zu beobachten. Möglich ist, dass das abgespaltene Monomer Dimere

mit sich selbst ausbildet. Das aufgrund stärkerere Bindung entstandene Dimer wird

erst durch weitere Erhöhung der Detergenzkonzentration aufgespalten.

4.3 Rekonstitution von LHC in Lipidvesikel 116

4.3 Rekonstitution von LHC in Lipidvesikel

Das LHC aus Amphidinium carterae konnte zum ersten Mal intakt in Liposomen mit

einem maximalen Durchmesser von 200 nm rekonstituiert werden. Das verwendete

Lipid, Phosphatidylcholin ist auch für die Rekonstitution anderer Lichtsammelkom-

plexe beschrieben [Sprague et al., 1985; Staehelin et al., 1984]. Hier wurde ein Lipid:

Chlorophyll Verhältnis von 10:1 verwendet [Sprague et al., 1985; Staehelin et al.,

1984]. Das in dieser Arbeit am besten geeignete Verhältnis war eine Lipid:LHC Mi-

schung von 1:1. Aufgrund des Chlorophyllanteils im LHC von ca. 25 % [Hiller et al.,

1993] stellt dies ein 5:1 Verhälntis von Lipid zu Chlorophyll dar. Eine Erhöhung des

Proteinanteils stellte sich beim Einbau von LHC in diesem System als weniger gut

heraus.

Der Lichtsammelkomplex LHC ist denen von höheren P�anzen ähnlich, so das de-

ren Gröÿe von Oligomeren Partikeln, wie dem Trimer, von 7,5 nm [Sprague et al.,

1985; Varga and Staehelin, 1985] auch hier angenommen werden kann. Auch unter

Berücksichtigung der Detergenzmicellen ergab sich hier eine gröÿere Dichte als bei

den aufgetragenen freien Liposomen. Dadurch liegt die Bande des freien LHCs tiefer

als die der freien Vesikel. Die bei der Rekonstitution eingesetzen Vesikel besaÿen

eine Gröÿe von durchschnittlich 175 nm. Diese Gröÿe wurde durch den Einbau von

LHC verändert. Die Zunahme der Gröÿe mit der Massenzunahme durch das LHC

führte zu einer dem LHC ähnlichen, oder höheren Dichte in Abhägigkeit der Göÿe

der eingesetzten Vesikel.

Durch die Bande im Gradienten und das UV/VIS Spektrum konnte nicht gezeigt

werden in welcher Form das Protein in die Vesikel eingebaut wurde. Durch die Ver-

meidung von zweiwertigen Kationen bei der Rekonstitution kann jedoch davon aus-

gegangen werden, dass es nur zu einem geringen Anteil von Aggregatbildung kam

[Sprague et al., 1985].

Da PC nur einen kleinen Bestandteil der Chloroplastenmembran ausmacht [Sprague

et al., 1985] könnte die E�zienz des Einbaus durch die Verwendung von DGDG,

MDGD oder einem Gemisch dieser Lipide erhöht werden. Die hier optimierte Vor-

schrift zum Einbau von LHC in Vesikeln könnte zukünftig für Experimente mit den

Chloroplastenlipiden MDGD und DGDG verwendet werden um so ein mehr physio-

logisches System für weitere Untersuchungen an LHC oder Interaktionsstudien zu

erhalten.


4.4 Interaktionsuntersuchung von LHC und PCP

mit SPR

Mit der Ober�ächenplasmonresonanzspektroskopie konnte hier erstmals eine Interak-

tion zwischen dem intrinsischen Lichtsammelkomplex LHC und dem löslichen Licht-

sammelkomplex PCP aus Amphidinium carterae nachgewiesen werden. Dadurch

konnte auch nachgewiesen werden das bei der Rekonstitution LHC in die Lipiddopp-

leschicht eingebaut wurde, da sonst keine Interaktion nachweisbar gewesen wäre. Die

A�nität der Komplexe zueinander liegt im zweistelligen mikromolaren Bereich. Die

Annahme einer einfachen 1:1 Reaktion zwischen den beiden Lichtsammlern konnte

bestätigt werden, da die monoexponentiellen Fits weitgehend dem Kurvenverlauf

der Sensogramme folgten. Abweichungen liegen eher in der Annahme begründet,

dass die Vesikel hier als Liposomen und nicht als Bilayerschicht vorlagen. Durch den

Verlauf der Sensogramme und der Konzentrationsabhängigkeit der Anbindungsge-

schwindigkeit kann auch eine unspezi�sche Anbindung ausgeschlossen werden.

Das in den Biacoreexperimenten verwendetet PCP ist ein PCP Gemisch mit gleichen

molekularen Massen, wovon über 90 % der Hauptform entsprechen. Deswegen ist hier

auch davon auszugehen, dass die gemessene Interaktion zwischen der Haupform von

PCP und dem LHC Komplex ist. Inwieweit oder ob eine der PCP Isoformen eine

andere A�nität zu LHC hat, konnte hier noch nicht gezeigt werden.

Nach erfolgter Bindung des aus dem Lumen der Thylakoide kommenden PCPs mit

dem membrangebundenen LHC ist eine Energieübertragung vom löslichen auf den

intrinsischen Komplex sehr wahrscheinlich. Innerhalb der Komplexe konnte die Ener-

gieweiterleitung aufgeklärt werden [Linden et al., 2004; Polívka et al., 2007; Zigman-

tas et al., 2002]. Hierbei erfolgt eine Energieweiterleitung innerhalb der PCP Haupt-

form vom angeregten Peridinin auf Chlorophyll a. Beim LHC ist neben dem Peridinin

auch das Chlorophyll c2 in der Lage Energie auf das Chlorophyll a zu übertragen.

Der Energieübertragungsweg zwischen den Komplexen wurde noch nicht aufgeklärt.

Wahrscheinlich ist, das auch hier eine Übertragung der Energie vom angeregten Chlo-

rophylla des PCP auf das Chlorophyll a des LHCs erfolgt (Abb. 4.1). Vom LHC aus

wird die Energie dann auf die Photosysteme weitergeleitet.


O

O

O

OH

OH

O

O

O

O

O

OH

OH

O

O

PCP

LHC

Abbildung 4.1: Schematische Darstellung eines Energietransfers von PCP auf LHC

4.5 FTIR-ATR 119

Ein Modell wie die Anbindung von PCP an LHC aussehen könnte zeigt ein Mo-

dell der LHC Struktur von Eckhard Hofmann in Zusammenhang mit der von ihm

gelösten PCP Struktur (Abb. 4.2).

Abbildung 4.2: Darestellung von LHC und PCP

Eine mögliche Interaktion des PCPs mit den Photosystemen kann aufgrund dieser

Ergebnisse nicht ausgeschlossen werden. Er stellt jedoch, aufgrund der hier nach-

gewiesenen starken Interaktion zwischen PCP und LHC, wahrscheinlich nicht den

Hauptenergieübertragungsweg dar. Ein Nachweis dessen könnte durch Messungen

mit PCP an immobilisierten Photosystemen erfolgen. Eine Interaktion zwischen

LHC und PCP wurde nachgewiesen, jedoch ist nicht aufgeklärt worden inwieweit

die Isoformen hier eine Rolle spielen.

4.5 FTIR-ATR

Mit der FTIR-ATR Methode sollte die Interaktion zwischen LHC und PCP un-

tersucht werden. Auch die Vesikelzusammensetzung des Rekonstitutionsproduktes

sollte hier untersucht werden.

Durch die FTIR-ATR konnte wie auch mit SPR eine Interaktion zwischen LHC und

PCP nachgewiesen werden. Eine Berechnung der kon und koff ist hier nicht möglich,

da in diesem System Massentransporte�ekte dazu führen, dass erst nach ca. 20 min

ein stabiles System entsteht. Die aus Biacore erhaltene Anbindungsgeschwindigkeit

4.5 FTIR-ATR 120

ist aber so hoch, dass der Anfangsbereich aus dem die kon bestimmt wird hier nicht

aufgelöst wurde. Gleiches gilt für die Dissoziation. Es ist möglich eine Abhängigkeit

der maximalen Höhe des Anbindungssignals von der eingesetzen Konzentration des

Bindungspartners nachzuweisen. Da die Reproduktion der Rekonstitution schwierig

war konnten diese Versuche noch nicht durchgeführt werden. Es ist zu erwarten

das hier eine Bestätigung der Ergebnisse, von der für diese Art der Untersuchung

etablierten Methode der SPR mit Biacore erhalten wird. Es ist hierbei zu berück-

sichtigen, dass bei Biacore eine für die Anbindung der Vesikel optimierte Ober�äche

zur Verfügung stand, während bei ATR die Qualität der Messung stark vom Kristall

und dessen Vorbereitung der Ober�äche anhängig war.

Die Kontrolle, dass keine Anbindung von PCP an BSA erfolgte zeigt im Spektrum

bei der ersten Anbindung von BSA ein Abwaschen des Proteins während der An-

bindung. Dies ist auf Luft im System zurückzuführen, welche hier zu einem starken

Hintergrund geführt hat, der die Bandenhöhe stark beein�usste. Die zweite Anbin-

dung von BSA zeigte den normalen Anbindungsverlauf.

Die Anbindung von BSA trotz erfolgreicher Vesikelimmobilisation spricht auch da-

für das hier kein vollständiges Spreiten der Liposomen stattfand sondern teilweise

nur eine Anlagerung der Vesikel an der Kristallober�äche. Für ein Spreiten der Ve-

sikel wären höhere Temperaturen als Raumtemperatur von Nöten, die aber zu einer

Zerstörung des Komplexes führen würden( Efremov). Eine vollständige Absättigung

der freien Stellen mit BSA würde ein Hintergrundsignal der PCP Bindung an den

Kristall vermeiden. Die Spreitung der Vesikel ist stark von deren Gröÿe abhängig. Je

kleiner die Vesikel desto besser deren Spreitung. Die pelletrierten Liposomen ohne

LHC konnten kaum an die Ober�äche angebunden werden, da durch die Pelletie-

rung eine Fusion der kleinen Vesikel stattfand. Nicht pelettierte Vesikel von max.

200 nm konnten erfolgreich immobilisiert werden. Die Rekonstitutionprodukte schei-

nen durch die Einlagerung von LHC eine geringere Varianz in der Vesikelgröÿe zu

besitzen, da hier eine Anlagerung nachgewiesen werden konnte.


4.6 Kristallisation von LHC aus Amphidinium

carterae

Innerhalb dieser Arbeit sollten Kristalle von LHC hergestellt werden die zur Auf-

nahme von Datensätzen mittels eines Röntgendi�raktiometers führen sollten.

Nach dem anfänglichen Kristallisationserfolg konnte dieser nicht reproduziert werden

und es bedurfte zahlreicher Kristallisationsexperimente bis ein Set von Bedingungen

gefunden wurde, die reproduzierbar zu Kristallen führten mit denen es möglich und

sinnvoll war Datensätze auf zu nehmen.

Die Entstehung der jeweilige Kristallform war mehr abhängig von der Charge an

LHC als von der Zusammensetzung der Kristallisationslösung. Immer jedoch ent-

standen Kristalle mit einer morphologisch rechteckigen Form. Diese Form ist auch

für andere LHC Kristalle bekannt. Dadurch das eine starke Konzentrierung statt-

fand und es bekannt ist das der 50 kDa Konzentrator zur Aufkonzentrierung von

Detergenzien führt [Strop and Brunger, 2005] ist die Möglichkeit gegeben das es sich

bei Kristallisation des Trimers in Wahrheit immer um Kristalle des Dimers oder so-

gar des Monomers handelte. Da gezeigt werden konnte, dass das Dimer Kristalle

bei ähnlichen Bedingungen ausbildet und über die gleiche Kristallform verfügt ist

es sehr wahrscheinlich das das Protein in den erhaltenen Kristallen ein Zerfallspro-

dukt des Trimers war. Auch die Experimente mit dem Dimer wurden mit stark

aufkonzentrierten Proben durchgeführt. Das Elutionspro�l der Gel�ltration zeigte

schon, das mit steigender Konzentrierung des Proteins auch das Auftreten mehrerer

Peaks einhergeht. Dies könnte auch die Verkürzung der Zeit bis zum Auftreten der

ersten Kristalle erklären. Mit dem stark konzentrierten Proben lag schon zu Beginn

der Kristallisation ein Teil des LHC-Komplexes als Monomer vor. Bei weniger stark

konzentrierten Proben war nur ein geringer Anteil des Monomers vorhanden und

die verbliebenen Trimere zer�elen erst im Laufe der Zeit durch die durch Dampf-

di�usion erfolgte Erhöhung der Detergenzkonzentration. Wenn nur das Monomer

Kristalle ausbildet, erfolgte so bei hohen Proteinkonzentrationen schneller der Über-

gang in die Nucleationszone. Dies wurde durch die Ergebnisse mit dem 100 kDa

Konzentrator gestützt da hier keine oder nur sehr kleine Kristalle gebildet wurden.

Die Detergenzkonzentration wurde durch diese Einengung nicht erhöht somit konnte

nur durch Verdunstung von Wasser aus dem hängenden oder sitzenden Tropfen eine


Erhöhung statt �nden. Andrerseits besteht die Möglichkeit das alle Formen gleich

gut kristallisieren und nur die hohe Proteinkonzentration einen schnellen Übergang

in die Nucleationszone zur Folge hatte. Ein natives Gel könnte hier neben dem Auf-

trag der Kristallisatonsprobe auf eine Gel�ltration mehr Aufschluss geben.

Des Weiteren könnten Kristallisationsexperimnete durch Zugabe von Lipiden zur

Proteinlösung, durch die neue Zusammensetzung des Ausgangsmaterials neue Kri-

stallformen zur Folge haben. Da LHC Komplexe in der Membran als Trimere vorlie-

gen [Standfuss et al., 2005; Liu et al., 2004] könnte die Lipidzugabe zur Stabilisierung

des Trimers führen, die dann auch zu dessen Kristallisation führen könnte. Erste Ver-

suche durch Zugabe von einem nicht näher de�nierten Lipid/Pigmentgemisch aus

ganzen Zellen (Isolierung nach Blythe und Dyer) zeigte ein Wachstum von Kristallen,

die aber nicht für die Aufnahme eines Datensatzes geeignet waren. Es ist möglich,

dass eine Zugabe von nur DGD, MDGD oder einem Gemisch aus beiden die Art der

Kristalle und deren Beugungsqualität verändern.

Die Kristallisation in kubischen Phasen ist nur für wenige Proteine erfolgreich be-

schrieben worden. Durch die Verwendung einer Lipidumgebung sollen Membranpro-

teine stabilisiert werden. Dies stellt zwar eine mehr physiologische Umgebung dar

ist aber bisher für nur wenige Proteine erfolgreich beschrieben worden. Bei dem für

diese Art von Versuchen meist verwendetet bR handelt es sich um ein in fast al-

len Lösungen stabiles Protein. Der LHC-Komplex ist wie der Detergenzaustausch

schon gezeigt hat emp�ndlicher. Die Bildung der kubischen Phasen mit dem Chlo-

roplastenlipid MDGD/DGDG könnte somit eher erfolgversprechend sein als weitere

Verfeinerungen des bestehenden Protokolls mit Monoolein.

4.7 Röntgenbeugungsexperimente an LHC

Kristallen

Es konnten zum ersten Mal Datensätze des membrangebundenen LHC Komplexes

aus Amphidinium carterae bis zu einer Au�ösung von 3,5 A aufgenommen werden.

Die Verwendung von Hepes pH 7,5 in der Kristallisationslösung führte zu Kristallen,

denen keine höhere Raumgruppensymmetrie als triklin zuzuordnen waren. Hier lag

auch ein anderes Breiten- zu Längenverhältnis der Kristalle vor (siehe Kristallisation


von LHC). Allen anderen Kristallen konnte die Raumgruppe P2 zugeordnet werden.

Es ist auch möglich das ein triklines Gitter zugrunde lag welches monoklin ähnlich

war.

Die Qualität der Kryolösung kann das Beugungsverhalten eines Kristalles erheblich

beein�ussen so ist es möglich das die Daten bei Kristall 4 durch das Einfrieren

beinträchtigt wurden. Diese Kristall zeigte trotz suboptimaler Einfrierlösung die

geringste Anisotropie der Daten und wies Re�exe mit hoher Intensität auf. Die Aus-

wertung über den ganzen Messbereich führte hier nicht zu hohen R-meas faktoren.

Die Auswertung zeigte das für eine sinnvolle Raumgruppenbestimmung Daten über

30 Grad nicht ausreichend waren. Da im Verlauf dieser Arbeit 360 ° Datensätze

aufgenommen werden konnten war es möglich die Raumgruppe der LHC Kristalle

zu bestimmen. Eine hohe Redundanz der Daten verbesserte die Auswertung und

es konnte gezeigt werden das die verwendeten Kristalle eingefroren mit optimierter

Kryolösung keinen Strahlenschaden auch bei insgesamt 950 gemessen Grad aufwie-

sen. Die Kristallform ist somit sehr stabil. Messungen mit hoher Redundanz sind

möglich. Alle gezüchteten Kristalle zeigten ein stark anisotropes Beugungsverhalten.

Dieses Beugungsverhalten tritt bei Membranproteine häu�g auf. Eine Erhöhung der

aufgenommenen Datenmenge pro Kristall mit mehr als 720° an verschiedenen Stel-

len eines Kristalls könnten die Prozessierung verbessern.

Die starke Anisotropie könnte auch ein Grund für die hohen Rmeas Faktoren bei

der Auswertung über den gesamten Datenbereich gewesen sein. Die XDS Statistik

bei der die Messungen in einem guten Beugungsbereich begannen zeigten hier nied-

rigere Rmeas Faktoren. Eine hohe Redundanz in diesem Bereich würde hier eine

Verbesserung der Ausgangsdaten für den Versuch des molekularen Ersatzes zur Fol-

ge haben, da die schlechten Bereiche die Indizierungsmatrix veränderten und somit

das Gesamtergebnis verschlechtert wurde. Die Ergebnisse der Messungen 138-6 und

151 untermauern dies, da hier nur ein kleiner Bereich mit hohem Anteil an wenig

beugenden Bereichen gemessen wurde. Aufgrund der geringen Datenmenge konnte

hier keine sinnvolle Indizierung erfolgen welches sich in der geringen Achsenlänge

wiederspiegelte.

Die Lösung des Phasenproblems mit molekularem Ersatz war nicht möglich. Das

hierfür verwendete Strukturmodell des LHCs der Erbse besitzt nur eine Sequen-

zidentität mit LHC aus A. c. von 18 %. Die könnte für den molekularen Ersatz

unzureichend sein. Auch kann aufgrund der unterscheidlichen Pigmentzusammen-

4.8 Aufreinigung von PCP aus A.c. 124

setzung die Struktur des LHC aus A.c. stark abweichend sein, so das ein Modell aus

der Erbse nicht für den molelkularen Ersatz geeigent war. Dies würde auch erklären

warum das Homologiemodel nicht erfolgreich als Model verwendet werden konnte.

Die Daten des Modells könnten hier auch von zu geringer Qualität für einen mo-

lekularen Ersatz gewesen sein. Sequenzanalysen des LHC ergaben eine Voraussage

von drei Transemembranhelices. Diese sind auch in der gelösten Stuktur des LHC

der Erbse zu �nden. Die Anordnung im Raum scheint sich jedoch stark von denen

im LHc zu unterscheiden, da auch die Struktur der Erbse als Monomer und nach

Entfernung der Loopregionen nicht als Modell erfolgreich war.

Die Aminosäuresequenz von LHC weist nur wenige Methionine auf, und es existiert

kein Protokoll für die Suppression der Methioninproduktion, so dass für die expe-

rimentelle Bestimmung der Phasen ein soaken der Kristalle mit schweren Atomen

nötig war. Die Verwendeten Verbindungen enthielten Schwermetalle der Klasse B

die in dem pH-Bereich der Kristallisationslösung an polare Gruppen wie Phosphate

und Sulfate binden. Es konnte ein Goldsignal gemessen werden, ob ein Einbau in den

Kristall stattfand kann nur die Auswertung der Daten hinsichtlich eines anormalen

Signals ergeben.

Die erreichte Reproduzierbarkeit der Bildung von Kristallen die zu Datensätzen bis

zu 3,5 Angström führten und die Entwicklung einer Vorschrift für das soaken dieser

Kristall mit Schwermetallen sind die Voraussetzung für die Aufklärung der Protein-

struktur von LHC. Die Lösung ist nun nicht mehr abhängig von der Kristallbildung,

sondern von der Lösung des Phasenproblems. Kristalle mit geringerer Anisotropie

im Beugungsverhalten können die Auswertung verbessern, so dass der molekulare

Ersatz für die Phaseninformation genutzt werden kann. Eine weitere Optimierung

der Kristallisation in Bezug auf das Dimer oder Monomer von LHC sind daher viel-

versprechend, denn möglicherweise werden hier Kristalle mit geringerer Anisotropie

gebildet.

4.8 Aufreinigung von PCP aus A.c.

Mit der Anionenaustauschchroamtographie konnten zwei unterschiedliche PCP ge-

trennt werden. Ob es sich hierbei um Isoformen des PCP-Trimers handelte konnte

4.8 Aufreinigung von PCP aus A.c. 125

nicht gezeigt werden. Eine Elution in einem Hauptpeak und mehreren kleinen Peaks

[Haxo et al., 1976] erfolgte nicht. Das in dieser Arbeit verwendetet Verfahren des

Zellaufschlusses kann möglicherweise teilweise zur Zerstörung des PCP geführt ha-

ben. Ein Aufschluss durch Zermahlen der Zellen unter Sticksto�kühlung [Haxo et al.,

1976] könnte eine schonendere Methode darstellen.

PCP zeigte in verschiedenen Chargen unterschiedliche Gröÿeverteilungen. Es konnte

hier kein direkter Zusammnenhang zwischen Aufschlussgerät und Lagerzeit festge-

stellt werden. Jedoch wurde nachgewiesen, dass Magnesiumchlorid stabilisierend auf

das Trimer wirkte. Da die üblicherweise verwendeten Pu�er keine zweiwertigen Ka-

tionen enthielten ist eine Destabilisierung des Trimers nicht aus zu schlieÿen. Ein

stabiles natürlich vorkommendes Dimer ist für Amphidinium carterae nicht bekannt.

Das erhaltene Protein mit dem Molekulargewicht des Dimers ist eher durch eine

Dissoziation des Komplexes und dem Verlust von Pigmenten zu erklären. Eine Zu-

gabe von anderen Proteasen als PMSF könne möglicherweise auch die Dissoziation

des Komplexes verhindern, da Peptide des zweiten Peaks der Gel�ltration auch vom

Apoprotein von 32 kDa abweichende Gröÿen aufwiesen. Möglicherweise kann durch

auch eine nachträgliche Zugabe von MgCl2 eine Zusammenlagerung des Monomers

zum Trimer erfolgen.

Alle Interaktionsstudien wurden in Anwesenheit von Magnesiumchlorid durchge-

führt, somit kann davon ausgegangen werden das PCP hier als Trimer vorlag.

Es war möglich das Trimer durch Zugabe von 20 mM MgCl2 zum Laufpu�er aus

dem Überstand nach dem Zellaufschluss durch eine Gel�ltration zu isolieren. Dieses

wurde für die Interaktionsstudien verwendet.

Über die Chromatofokussierung wurden PCPs mit verschiedenen pI getrennt. Die

Analyse durch eine Gel�ltration zeigte das es sich hierbei nicht um verschieden Trime-

re des Komplexes handelte sondern meist um Dimere oder Monomere. Die UV/VIS

Spektren waren nicht vollständig deckungsgleich was auf den Verlust von Pigmenten

hinweist. Es ist möglich das durch das Umpu�ern in LHCP2 eine Destabilisierung

des PCP stattfand. Gel�ltrationsläufe mit anderen Pu�erzusammensetzungen könn-

ten hier Aufschluss geben, ob es sich um Trimere in der Chromatofokussierung han-

delte. Eine Zugabe von zweiwertigen Kationen zu den Pu�ern kann die Stabilität

des Trimers erhöhen. Es ist somit unklar ob die verschiedenen Isoformen immer auf

dem Trimer basierten. Es ist auch vorstellbar, das einzelne Monomere die Isoformen

stellen. Eine Unterscheidung in Monomer und Trimer ist über SDS-Gele und Spek-

4.9 Highresolution Datensatz von MFPCP 126

tren nicht möglich. Untersuchungen der Peaks mit Massenspektrometrie könnte hier

mehr Informationen liefern.

Teilweise trat ein Peak in der Aufreinigung mit der Gel�ltration auf der eine grün-

braune Färbung aufwies. Es konnte gezeigt werden das es sich hierbei spektrosko-

pisch wie auch in der Gröÿe des Apoproteins um LHC handelte. LHC ist bisher nur

als Membranprotein beschrieben worden, welches in wäÿrigen Lösungen unlöslich

ist. Die Gröÿe des eluierten Proteins lieÿ die Vermutung zu, dass es sich hierbei

um kleine Membranvesikel handelte die bei der Präparation entstanden. Das ATR

Spektrum zeigte jedoch nur geringe Lipidsignale im Vergleich zum Proteinsignal.

Erste Kristallisationsversuche unter Verwendung des optimierten LHC Screens führ-

ten nur zu einer Phasentrennung. Die Art dieser Phasentrennung deutete auch auf

Lipide in der Proteinlösung hin. Es könnte sich auch um Oligomere des LHCs han-

deln die durch die verwendteten Pu�er entstanden. Zweiwertige Ionen stabilisieren

das trimer von PCP und es ist nicht aus zu schlieÿen das auch dieses in Lösung

nachgewiesene LHC durch diese Kationen in einer Trimeren form vebleibt und es

nicht zu einer Aggregatbildung kommt. Es konnte nicht genau geklärt werden unter

welchen Umständen dieses Phänomen des �löslichen” LHC auftrat es scheint jedoch

mit dem Aufschluss der Zellen zusammen zu hängen. Eine weitere Untersuchung ist

vieversprechend, eventuell handelt es sich hierbei um eine neue Form von LHC oder

die vollständige Bildung des Komplexes �ndet bei A. c. nicht erst in der Membran

statt.

4.9 Highresolution Datensatz von MFPCP

Es konnte ein hochaufgelöster Datensatz von der Hauptform von PCP augenommen

werden. Die maximale Au�ösung betrug 1,27 A. Der Rmeas liegt bei 39 % doch da

I/Sigma einen Wert über drei annahm wurden die Daten erst hier geschnitten und

nicht bei 1,35 A. Der R-faktor über 20% nach Einbau von Wassermolekülen deutete

daraufhin das Teile der Proteinstruktur einer weiteren Verfeinerung bedürfen. Auch

kann nicht ausgeschlossen werden, das die Wahl des cutes der Daten bei 1,27 A die

Qualität hier verminderte. Eine Auswertung mit Daten bis zu einer maximalen Auf-

lösung von 1,35 A könnten zu einer stärkeren Verringerung des R-fakros im Vergleich

zu den verwendeten führen.


Loopbereiche sind beweglicher als die Aminosäuren im Inneren des Protein und die

Dichte zeigte auf Grund dessen mitunter zwei mögliche Anordnungen einer Amino-

säure im Raum (Abb. 4.3).

Abbildung 4.3: Aminosäure im äuÿeren Bereich des Proteins mit zwei möglichen Positio-nen im Raum

Es wurde keine Übereinstimmung der Restaints für das DGDG 615 in Shelx H

gefunden. Die Elektronendichtekarte ist hier im Vergleich zu DGDG 625 weniger gut

(Abb. 4.4).

DGDG625 DGDG615

Abbildung 4.4: DGDG 625 und DGDG 615


Zum einen war das DGDG mehr dem Lösungsmittel exponiert als das DGDG 625

weshalb dieses �exibler war und somit die Elektronendichte weniger de�niert war.

Andererseits wurden die Restraints für DGDG aus dem PDB �le mit PRODRG

generiert. Eine Erstellung von Restraints auf der Basis der Molekülstruktur mit

PRODRG könnte hier eine Verbesserung zur Folge haben.

Die Elektronendichte ist schon zu diesem Zeitpunkt der Verfeinerung für Chlorophyll

und Peridinin gut de�niert. Weitere re�nement Zyklen sind jedoch notwendig um

hier eine genaue Postitonsbestimmung zu ermöglichen. Zu diesem Zeitpunkt der

Verfeinerung sind Aussagen hinsichtlich der Postion der Pigmente im Vergleiche

zur Struktur bei 2 A nicht sinnvoll, da weitere Zyklen die Position noch verändern

können.


5 Zusammenfassung

Die Photosynthese ist essentiell für ein Leben auf der Erde. Als Nebenprodukt ent-

steht hier bei der Umwandlung von Lichternergie in chemische Energie der für Le-

ben wichtige Sauersto�. Auch die meisten genutzten Energiequellen haben ihren

Ursprung in der Photosynthese. Lichtsammelkomplexe sind ein Teil dieses Systems.

Im Rahmen dieser Arbeit sollten mehr Informationen über Grundlagen der Photo-

synthese am Beispiel von Lichtsammelkomplexen aus A.c. erhalten werden. Dino-

falgellaten besitzen neben membrangebundenen Lichtsammelkomplexen auch einen

löslichen Lichtsammelkomplex, das PCP. Die Anzahl der Karotinoide ist in beiden

Komplexen höher als in denen von höheren P�anzen. Auch hat der intrinsische Kom-

plex Chlorophyllc anstelle von Chlorophyll b gebunden. Das gebundene Karotinoid

Perdinin ist spezi�sch für Dino�agellaten. Der lösliche Lichtsammelkomplex PCP

tritt in verschiedenen Isoformen auf, die nur in ihrem pI unterschieden werden.

Neue Erkenntnisse über den Enerieübertragungsweg sollten durch eine biochemi-

sche Charakterisierung der molekularen Interaktion zwischen dem löslichen und dem

intrinsischen Lichtsammelkomplex gewonnen werden. Hierzu war eine Etablierung

und nachfolgende Optimierung der Rekonstitution von LHC in Lipidvesikeln nötig.

Auch sollte der Ein�uss von Licht auf die Zellen und die Bildung der Lichtsammel-

komplexe durch Belichtungstest an Zellkulturen untersucht werden. Voraussetzung

für Informationen der Lichtsammelkomplexe auf atomarer Ebene durch Röntgen-

strukturanalyse sind Proteinkristalle. Innerhalb der vorangegangenen Diplomarbeit

konnten Kristallschauer oder stark verwachsene Kristalle von LHC gezüchtet wer-

den. Auf diesen Ergebnis aufbauend sollten Einkristalle gezüchtet werden, die zu

Datensätzen für die Strukutraufklärung führen sollten. Eine Verbesserung der Struk-

turinformationen der Pigmente sollten über eine hochaufgelöste MFPCP Struktur

erhalten werden. Der dafür enötigte optimierte Screen wurde während der Diplomar-

beit entwickelt. Weitere Informationen über Anzahl und Art der Isoformen von PCP

sollte zum einen durch eine Optimpierung der Aufreinigung aus der Diplomarbeit


erreicht werden. Zum anderen sollten Gröÿenbestimmugen und die Untersuchung

durch UV/VIS Spektroskopie Informationen über durch die Chromatofokussierung

erhaltenen Peaks hinsichtlich der Isoformen liefern

Die Lichtintensität hatte einen direkten Ein�uss auf die Färbung der Zellen. Schwach-

licht führte zu einer stark erhöhte Produktion von Lichtsammelkomplexen wohinge-

gen bei Starklichbedingungen kein PCP mehr nachweisbar war.

Die Aufreingung von LHC konnte optimiert werden und die erhalten Menge an LHC

wurde um 30% gesreigert. Somit war dies keine limitierenden Faktor mehr bei der

weiteren Experimentplanung.

Der intrinsische Lichtsammelkomplex konnte zum ersten mal erfolgreich in 200 nm

Sojalecithinvesikel rekonstituiert werden mit einer Einbaurrate von 10 bis 17%. Die

Vorschrift für die Rekonstitution wurde etaliert und optimiert. Eine Bindung zwi-

schen PCP und LHC konnte erstmalig mit Biacore und ATR nachgewiesen werden.

Die A�nität der Komplexe zueinader lag im mikromolaren Bereich. Ein Energie-

transfer vom PCP zum LHC ist somit sehr wahrscheinlich.

Es konnten zum ersten mal Proteikristalle erzeugt werden, die eine Au�ösung bis

zu 3,5 A aufwiesen. Die ursprünglich in dieser Arbeit hergestellten Kristalle mit

einer Kantenlänge von 700 µm konnten nicht reproduziert werden. Viele verschiede-

ne Bedingungen wurden getestet bis ein Screen entwickelt werden konnte bei dem

Kristalle mit einer Beugung bis zu 3,5 A reproduzierbar gezüchtet wurden. Hier war

die PEG Konzentration und die Proteinmenge entscheident. Da der Komplex bei

hoher Detergenzkonzentration zerfällt ist es möglich das den erhaltenen Kristallen

das Dimer oder Monomer und nicht das Trimer zugrunde lag.

Von 230 ge�schten Kristallen wurden von elf Kristallen Datensätze aufgenommen.

Allen gmeinsam war eine Anisotropie im Beugungsmuster. Messungen über 360 Grad

führten zu einer Raumgruppenbestimmung. Trotz hoher Datenredundanz konnten

die Phasen nicht durch molekularem Ersatz mit verschiedenen Modellen bestimmt

werden. Die experimentelle Berechnung der Phasen ist nur durch MIR möglich. Ein

Protokoll zum Schwermetallsoaken wurde erstellt und erste Datensätze wurden an

der Goldkante aufgenommen.

PCP kommt in verschiedenen Isoformen vor die sich nur im pI unterscheiden. Es

war nicht nachweisbar, das die PCP mit unterschiedlichen pI Isoformen der Haupt-

form waren, da das Protein nicht stabil war. Es wurde festgestellt, das zweiwertige

Kationen das Trimer stabilisierten. Bei der Aufreinigung von PCP wurde LHC ohne


Detergenz in einer wäÿrigen Lösung nachgewiesen. Möglicherweise handelt es sich

hierbei um eine noch nicht beschriebene Form von LHC.

Es konnte ein hochaufeglöster Datensatz von der PCP Hauptform aufgenommen

werden. Die maximale Au�ösung betrug 1,27 A wodurch eine genaue Positionsbe-

stimmung der Pigmente im Raum möglich wurde. Für eine genaue Aussage sind

weiter Verfeinerungszyklen notwenid, doch konnte schon jetzt eine gute Qualität der

Daten nachgewisen werden.


6 Summary

Photosynthesis is essentiell for life on earth. During the transformation of solar

energy into chemical energy the lifedepending Oxygen will be produced. Also most

energy sources have their basis in photosynthesis. The Light Harvesting Complexes

are part of this system. On the example of the Dino�agellate Amphidinium carterae

the aim of this work was to gain more information about basics of the photosynthesis.

Dino�agellates have next to the membrane bound LHC soluble antenna complexes,

the PCP. The amount of carotenoids di�ers from the LHC of higher plants. Also the

binding of Chlorophyll c instead of chlorphyll b in the intrinsic LHC divides them.

The bound Perdinin is a carotenoid which occours only in Dino�agellates. PCP ap-

pears in di�erent Isoforms wich di�er only in the pI.

To achieve more knowledge about the energytransferpathway the interaction bet-

ween the soluble light harvesting complex and the membrane bound LHC should be

examinated with biochemical characterization. For that, the reconstituion of LHC

in lipisveciles was to be established and optimized.

The in�uence of light on the cells and production of light harvesting complexes

should be examinated with lightintensitiy test on whole A.c cells. To get structural

information of the light harvesting complexes on atomar basis, proteincrystals are

essential. Showers of crystals and adnate crystals were produced during the previous

diploma thesis. Single crystals were to be breed based on this result. These should

lead to datasets for a structural solution. An improvement of structural information

about the pigments in MFPCP should be gained with an high resolution structure.

An optimized screen was established during the diploma work. To gain more infor-

mation about the PCP Isofoms an optimization of the puri�cation was necessary.

The determination of the proteinweight and the UV/VIS spectroskopy should lead

to more information about the PCPs after Chromatofocussing.

The cells are in�uenced by the light intensity. On low light conditions a huge amount

of light harvesting complexes was produced. The increase of light ernergy lead to an


decrease of LHC production. PCP was not detectable under this growth condition.

The pu�citaion of the LHC complex had been increased by 30% and the amount of

LHC is no longer an breaking point for experiments especially the crystallization.

The puri�ed intrinsic LHC had been reconstituted in PC vesicles with an incorporati-

on rate of 10-17 %. An protocl for the reconstitution was established and optimized.

This was the basis for further experiments to analyze the interaction between LHC

and PCP. A binding beween PCP and LHC has been proven by Biacore and ATR

measurements. The mycromolar A�nity between these complexes underlined the

theory of an energtransfer from PCP to the LHC.

For the �rst time LHC crystals with a maximal difrcation of 3.5 A were produced.

The reproduction of the original crystals with an length of 700 µm was not possible

and several conditoins were tested until a setup was made which lead to a reproduci-

ble growth of crystals with a maximal di�ract of 3.5 A. It was unclear if this crystals

are made of dimers, monomers or trimers, because huge detergent concentrations

disintegrated the protein. The way to get the needed proteinconcentration of min.

20 mg/ml could result in high detergentconcentrations.

From eleven crystals out of 230 �shed datasets were measured. The LHC complex

has been crystalized and several datasets with a maximum resolution of 3,5 A were

measured. The re�ection patterns showed alsways an anisotropy of the di�ration.

Measuremnt of more than 360 degree were necessary for an secure spacegroup deter-

mination. The MR with di�erent models failed. The similarity was not good enough

to get the phase information for the structure solution. Experiments to get the pha-

ses experimental had been made and �rst datasets were measured.

The PCP appears in di�enrent isoform. It was not possible to determine the trimeric

Isoforms of PCP with Chromatofokussing. Gel�ltration showed sizes of dimeric or

monomeric PCP. The experiments showed, that Magnesiumchlorid was essential for

the stability of the trimeric form of PCP. Without kations like this a loss of pigments

had ben observed and the decay into dimeric forms.

During the PCP puri�cation a LHC in solution without any detergent had been

detected. It is possible that this is a new form of LHC which had not been described

before. A high resolution dataset of the MFPCP had been measured. The resolutoin

maximum of 1.27 A will lead to precise coordinates of the bound pigments. In this

state of re�nement a conclusion and comparison with the published structure of 2 A

was not maeningful.


7 Ausblick

Mit Belichtungstest wurde der Ein�uss von Licht auf ganze Zellen von A. c. gezeigt

. Eine genaue Analyse der Raten der Lichtsammelproduktion über SDS Gele und

Bestimmung der gebildeten Mengen könnten genauere Information über die Regula-

tion ergeben.

Die Aufreingung wurde optimiert jedoch kam es in Abhängigkeit der Detergenzkon-

zentration zum Zerfall des Trimers in Dimere und Monomere. Aufgrund dessen dass

die Kristalbildung erst bei Konzentrationen ab 20 mg/ml reproduzierbar war ist

es warhscheinlich, das den Kristallen das Dimer oder Monomer zugrunde lag. Ei-

ne Kristallisation des Dimers war erfolgreich und eine Optimierung könnte hier zu

Kristallen mit einer besseren Au�ösung führen. Auch die Kristallisation des in der

Gel�ltration nachgewiesenen Monomers könnte zu einem Wachstum von Kristallen

führen, die neben einer besseren Au�ösung eventuell auch eine geringere Anisotro-

pie aufweisen. Das Protokoll für die Kristallisation des Trimers aus der Gel�ltration

wurde optimiert und somit können Schwermetallsoaks von diesen durchgeführt wer-

den um experimentell die Phasen zu bestimmen. Auch Aufgrund der Stabilität der

Kristalle können nun Messungen mit hoher Redundanz erfolgen die die Qualität der

Daten nach XDS verbessern könnten. Die Kristallisation mit Zusatz von stabilisie-

renden Lipiden ist vielversprechend um eine Struktur des Trimers zu erhalten.

Das in dieser Arbeit für die Rekonstitution verwendete PC ist nur in geringer Men-

ge im Chloroplasten vorhanden. Rekonstituionsexperiment mit den Lipiden DGDG

und MDGD würden eine physiologischeres System darstellen. Auch die Isolierung

des Photosystems zur Untersuchung der Interaktion zwischen PCP und den PS wä-

re ein weiterer Ansatz um den Energieübertragungsweg bei Amphidinium carterae

vollständig auf klären zu können.

Das Trimer von PCP wird durch Magnesiumchlorid stabilisiert. Aufreinigungen in

Anwesenheit dieser Kationen könnte eine Di�erenzierung der Isofomen des Trimers

ermöglichen. Auch könnte dadurch mit der Methode der Chromatofokussierung ei-


ne Trennung der Isoformen des Trimers erfolgen. Weiterhin ist eine schonendere Art

des Zellaufschlusses ein Ansatz dieses Ziel zu erreichen. Die erhaltenen verschiedenen

Formen sollten durch Massenspektrometrie untersucht werden um die Unterschiede

zu analysieren.

Eine weitere Vefeinerung der hochaufgelösten Daten der MFPCP ist norwendig für

eine genaue Positionsbestimmung der Pigmente im Raum.


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Abbildungsverzeichnis

1.1 Die schematische Darstellung der Elektronentransportkette und der

an der Photosynthese beteiligten Proteinkomplexe . . . . . . . . . . . 2

1.2 Die Struktur des Lichtsammelkomplexes LHCII aus der Erbse [Stand-

fuss2005] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.3 Die Struktur des Lichtsammelkomplexes LHCII aus dem Spinat

[Liu2004](links) und der Erbse [Standfuss2005] (rechts) . . . . . . . . 5

1.4 Schematische Darstellung eines Phycobilisoms . . . . . . . . . . . . . 6

1.5 Chlorophyll a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.6 Chlorophyll c2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.7 Schema der Anregungszustände des Chlorophyll a . . . . . . . . . . . 8

1.8 Peridinin [Botanik online 2005] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.9 Diadinoxanthin [Botanik online 2005] . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.10 Schema der Anregungszustände des Peridinin . . . . . . . . . . . . . 9

1.11 Schematische Darstellung einer freischwimmenden Dino�agellatenzel-

le LF: longitudinale Flagella, TF: transversale Flagelle, M: Mitochon-

drium, Cp: Chloroplast, Cr: Chromosom, N: Nucleus, Pu: Pusules, V:

Vakuole [Taylor1998] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.12 Der Chloroplasten von Amphidinium carterae [Taylor 1998] . . . . . . 12

1.13 Der Photosyntheseapparat in der Thylakoidmembran von Dino�agel-

laten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

1.14 Ein Modell der photosynthetischen Einheit PSU [Govindjee et all 1979] 13

1.15 Energietransfer innerhalb des LHCs von A. c. . . . . . . . . . . . . . 15

1.16 Die Struktur der Hauptform von PCP [Hofmann et al., 1996]. . . . . 16

1.17 Energietransfer innerhalb des PCP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.1 UV/VIS Spektren von LHC und PCP aus Amphidinium carterae.

Schwarz : LHC, rot: PCP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32


2.2 Anzuchtkästen von Amphidinium carterae . . . . . . . . . . . . . . . 34

2.3 Anzucht unter verschiedenen Belichtungen A: vorne sind die Kuturen

unter Schwachlichtbedingungen abgebildet, direkt vor den Lampen

sind die Starklichtanzuchten, B: die Anzucht im Schatten . . . . . . . 35

2.4 Die schematische Darstellung einer in der SPR genutzten Flieÿzelle . 43

2.5 Schematische Darstellung einer ATR Flieÿzelle . . . . . . . . . . . . . 45

2.6 ATR Meÿzelle mit eingebautem Germaniumkristall . . . . . . . . . . 46

2.7 Löslichkeitsdiagramm von Proteinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

2.8 Schmatische Darstellung der Kristallisation mit hanging drop und

sitting drop . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

2.9 Ein schematisches Modell bicontinuierlicher kubischer Phasen [Land-

au and Rosenbusch, 1996] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

2.10 Schematische Darstellung der Kristallisation unter Öl . . . . . . . . . 50

2.11 Re�exbedingung für die Beugung am Kristlall (Bragg). . . . . . . . . 54

3.1 Zellkulturen bei unterchiedlicher Belichtung . . . . . . . . . . . . . . 60

3.2 Membransedimente nach Zellaufschluss. A: Starklicht, B: Schwach-

licht, C: Schatten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.3 Überstände nach Zellaufschluss. A: Starklicht ( ca. 100 µE), B:

Schwachlicht ( 20 µE), C: Schatten, (ca. 5 µE) . . . . . . . . . . . . . 61

3.4 UV/VIS Spektren der Überstände nach ZellAufschluss. Blau: Stark-

licht, pink: Schwachlicht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.5 Gradient mit PCP Bande (rötlich) und Membranpellet (braun) am

Boden des SW28 Röhrchen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

3.6 SDS Gel der Aufreinigung. 1: Marker, 2: Waschen der Zellen, 3: vor

Zellaufschluss , 4: Überstand nach UZ, 5: Homogenisat nach UZ, 6:

Überstand nach Waschen der Membranen, 7: Homogenisat nach Wa-

schen der Membranen, 8: Überstand nach Waschen der Membranen,

9: Homogenisat nach Waschen der Membranen, 10: Homogenisat nach

Saccharosegradient, 11: nach Solubilisierung, 12: Pellet nach UZ, 13:

Auftrag auf Anionenaustauschchromatographie . . . . . . . . . . . . . 63

3.7 Elutionspro�l der Anionenaustauschchromatographie. . . . . . . . . . 64


3.8 SDS-Gel der Anionenaustauschchromatographie. 1, 11: Marker, 2-4

Fraktionen bis zu Elution, 5-10 und 12-18: Elution des Proteins, 19-

21 Fraktionen nach Proteinelution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

3.9 Auschnitt des Elutionspro�ls der Gel�ltration, gezeigt wird die Pro-

teinelution von LHC bei einer Wellenlänge von 672 nm . . . . . . . . 65

3.10 SDS-Gel der Gel�ltration. 1: Marker, 2-4: Fraktionen vor Proteine-

lution, 5-8 Proteinelution, 9-11:Fraktionen nach Proteinelution, 12:

Auftrag Gel�ltration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

3.11 Absorption bei 461 nm (Chlorophyll c) der Elutionsfraktionen der

Gel�ltration, Volumen der Fraktionen wurde in CV umgerechnet . . . 66

3.12 UV/VIS Spektren der Proteinpeaks der Gel�ltration normiert auf

672 nm. Blau: Peak1 (0,6 CV), rot: Peak2 (o,62 CV) und grün: Peak3

(0,68CV) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

3.13 Eichunggerade der Gel�ltrationssäule Superdex 200 HR16/60 . . . . . 67

3.14 Gradienten der Rekostitution. Von links nach rechts: nicht erfolgrei-

cher Einbau von LHC in PC Vesikel, denaturiertes LHC, PC Vesikel . 68

3.15 Gradienten der Rekonstitution. Von links nach rechts: LHC rekonsti-

tuiert in PC Vesikel, LHC rekonstituiert in PC Vesikel, LHC . . . . . 69

3.16 Spektren des freien LHCs ,des LHCs in Vesikeln und der Liposomen-

streukurve. Es erfolgte eine Normierung der Proteinkurven auf den

Chlorophyllpeak bei 671 nm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

3.17 Konzentrationsreihe 1 der Interaktion zwischen PCP und dem im-

mobilisierten LHC. Die einzelnen Konzentrationen sind farblich un-

terschiedlich dargestellt: türkis: 60 µM PCP, gelb: 40 µM PCP, ro-

sa:20 µM PCP und blau: 8,7 µM PCP. . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

3.18 Konzentrationsreihe 2 der Interaktion zwischen PCP und dem im-

mobilisierten LHC. Die einzelnen Konzentrationen sind farblich un-

terschiedlich dargestellt: türkis: 60 µM PCP, gelb: 40 µM PCP, ro-

sa:20 µM PCP und blau: 8,7 µM PCP. Die schwarzen Linien zeigen

die ge�tteten Kurven . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

3.19 Die Anbindungsgeschwindigkeiten abhängig von der PCP Konzentra-

tion (Konzentrationsreihe 1) in logarithmischer Auftragung. Aus der

durch die Messpunkte angelegten Geraden wurde kon berechnet . . . 72


3.20 Die Anbindungsgeschwindigkeiten abhängig von der PCP Konzentra-

tion (Konzentrationsreihe 2) in logarithmischer Auftragung. Aus der

durch die Meÿpukte angelegten Geraden wurde kon berechnet . . . . . 72

3.21 Dissoziation des PCP vom LHC als Langzeitmessung . . . . . . . . . 73

3.22 Dissoziationskurve des PCP vom LHC mit angelegtem Fit (monoex-

ponentiellen Funktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

3.23 gdsgsg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

3.24 Infrarotspektrum der angebunden LHC-haltigen Vesikel. Zu sehen

sind die Amid I und II Bande des Proteins und die Banden die von den

Liposomen herrühren. Die Banden der Liposomen sind: die Asymme-

trische CH2 Streckschwingung, die symmetrische CH2 Streckschwin-

gung und die C=O-Schwingung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

3.25 Änderung der Intensität bei einer Wellenzahl von 1547 . . . . . . . . 75

3.26 Anbindungskurve von Vesikeln mit einem Durchmesser von mehr als

200 nm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

3.27 Messung 1 zur Interaktion von LHC und PCP. Blau: Proteinsignal bei

1547 cm1, pink: Lipidsignal bei 2926 cm1. Die PCP Konzentration im

System betrug 15 µM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76


1547 cm1, pink: Lipidsignal bei 2926 cm1. Die PCP Konzentration im

System betrug 22 µM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77


1547 cm1, pink: Lipidsignal bei 2926 cm1. Der Peak bei ca. 75 min.

ist auf das Eindringen von Wasserdampf zurück zu führen. . . . . . . 77

3.30 Kristalle nach kommerziellen Screens. A: Crystal I Screen, B: Cryo II

Screen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

3.31 LHC Kristalle nach 6 Monaten Inkubation bei 18 °C. A: 30 % PEG400,

0,05 M MgCl2, 0,1 M Hepes pH 7,5. Kristallhaufen, B: 30 % PEG400,

0,1 M MgCl2, 0,1 M Hepes pH 7,5. Kleine Kristalle, C: 30 % PEG400,

0,05 M MgCl2, 0,1 M Na-cacodylate pH 6,5 Kristalle bis 700 µm Länge 79

3.32 Kristalle von Proteinprobe nach Salz- und Detergenzentzug . . . . . . 80


3.33 Kristalle die enstanden durch Zugabe von Detergenz zur Reservoirlö-

sung. A: 29 % PEG400, 0,1 M Na-cacodylate pH 6,5, 0,1 M MgCl2,

0,5 % DM , B: 32 % PEG400, 0,1 M Na-cacodylate pH 6,5, 0,1 M

MgCl2, 0,5 % DM , C:28 % PEG400, 0,1 M Na-cacodylate pH 6,5,

0,1 M MgCl2, 1,0 % DM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

3.34 Kristallbildung durch Zugabe von Detergenz. A: 31 % PEG400, 0,1 M

Na-cacodylate pH 6,5, 0,1 M MgCl2, 0,5 % DM, B: 35 % PEG400,

0,1 M Tris-HCl pH 8,5, 0,2 M NaCl, 0,5 % DM , C:30 % PEG400,

0,1 M Hepes pH 7,5, 0,1 M NaCl, 1,0 % DM . . . . . . . . . . . . . . 81

3.35 Kristalle der Bedingung 8 A: verwachsene Kristalle, B: Einkristalle . . 82

3.36 LHC Kristalle mit der neuen Kristallisationslösungen aus dem Screen.

A: Memstart+Memfac;25, B: Memstart+Memfac;26 . . . . . . . . . . 83

3.37 Beispiel für die gebildeten Kristalle. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

3.38 Kokristallisationsversuch von LHC mit PCP. Von links nach rechts

LHC-Ausfall und PCP Kristalle, PCP Kristalle, LHC-Ausfall und

PCP Kristalle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

3.39 Detergenzaustausch mit β-OG. Spektrum des eluierten Proteins nor-

miert auf 672 nm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

3.40 Spektren des LHCs , 30 min. nach Zugabe von Triton X100 (2xCMC)

oder Tween 80 (2xCMC). Schwarz: Tween80, Pink: TritonX100 . . . . 86

3.41 Bedingen bei denen Kristalle entstanden. A: LHC aus der Gel�ltra-

tion, B: LHC aus der Gel�ltration vor Kristallisation gegen Pu�er 3

dialysiert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

3.42 Bedingen bei denen Kristalle entstanden. A: LHC aus der Gel�ltra-

tion, B: LHC aus der Gel�ltration vor Kristallisation gegen Pu�er 3

dialysiert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

3.43 Beispiel von Kristallen, die beim optimierten Screen wuchsen . . . . . 88

3.44 Kristallisation unter Öl. A: 1 µl Tropfen, B: 3 µl Tropfen, C: 6 µl

Tropfen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

3.45 Kirstallisation von LHC in kubischen Phasen. A: klare Protein-

Lipidlösung mit Salzkristallen, B: Ausfall, C: Ausfall mit Salzkristallen 89

3.46 Kristall der Dimerkristallisation. A: classic 7, B: classic 74, C: classic

89, D: classic 92, E: MBclass II 21, F: MBclass II 25, G: MB class II

31. MB class II 44 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90


3.47 Erfolgreiche Kristallisationsbedingungen des LHC �Dimers” . . . . . . 90

3.48 Beispiel eines Beugungsbildes eines Kristalls mit schlechten Beuhungs-

eigenschaften . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

3.49 Beugungsbilder von Kristall 4. Rechts schlechter Beugungsbereicht,

links: guter Beugunbgsbereich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

3.50 Beugungsbilder von Kristall 56. Rechts schlechter Beugungsbereicht,

links: guter Beugunbgsbereich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

3.51 Beugungsbilder von Kristall 161 als Beispiel. Rechts schlechter Beu-

gungsbereich, links: guter Beugungsbereich . . . . . . . . . . . . . . . 93

3.52 Au�ösung der LHC Kristalle in der Einfrierlösung. A: t = 0 min., B:

t = 10 min., C: t = 30 min. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

3.53 Elutionspro�le der Anionaustauschchromatographiesäulen. Pink:

Source15S, grün: DEAE, schwarz: QXL . . . . . . . . . . . . . . . . . 102

3.54 Elutionspro�l der Anionenaustauschchromatographie DEAE �acher

Gradient. Schwarz: 478 nm, blau: 280 nm, pink: 672 nm . . . . . . . . 102

3.55 UV/VIS Spektren der drei Peaks der Anionenaustauschchromatogra-

phie mit der XK26/20 DEAE Säule. Blau: Peak 1, pink: Peak 2, grün:

Peak 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

3.56 Beispiele der Elutionspro�le der Gel�ltration mit dem Säulenmaterial

SepharoseS300 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

3.57 Elutionspro�le der Chromatofokussierung bei unterschiedlich steilen

pH Gradienten. Blau: �acher Gradient, Pink: steiler Gradient . . . . . 104

3.58 Die Gel�ltration der einzelenen Peaks der Chromatofokussierung . . . 105

3.59 Eichegrade der Gel�ltration Superdex200 HR10/30 für die Gröÿenbe-

stimmung der Peaks . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106

3.60 UV/VIS Spektren der einzelnen Peaks. Verwendet wurde jeweils die

Fraktion mit dem Absorptionsmaximum in der Gel�ltration. . . . . . 106

3.61 Elutionspro�le der Gel�ltration mit Superdex200 HR10/60. Pink: mit

20 mM MgCl2 im Laufpu�er, grün und blau: Laufpu�er ohne MgCl2 . 107

3.62 SDS-Gel der Gel�ltration mit einem PEak bei 0,37 CV. 1-2:vor Pro-

teinelution 3: Peak bei 0,37 CV,4: Fraktion nach Peak1, 5 und 7-11:

Proteinelution, 6: Marker, 12-15 Fraktionen nach Proteinelution . . . 108

3.63 Spektrum des Peaks bei 0,37 CV. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108

3.64 ATR-Spektrum des Peaks bei 0,37 CV . . . . . . . . . . . . . . . . . 109


3.65 Die Struktur von MFPCP bei 1,27 A . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

4.1 Schematische Darstellung eines Energietransfers von PCP auf LHC . 118

4.2 Darestellung von LHC und PCP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

4.3 Aminosäure im äuÿeren Bereich des Proteins mit zwei möglichen Po-

sitionen im Raum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

4.4 DGDG 625 und DGDG 615 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

Abkürzungsverzeichnis 153

Abkürzungsverzeichnis

Angström Angström (1 A = 0,1 nm)

Abb. Abbildung

APS Ammoniumperoxodisulfat

AS Aminosäure

BSA Rinderserumalbumin

cm−1 Wellenzahl (Anzahl der Wellen pro cm)

CV colum volumen = Säulenvolumen

Da Dalton

FTIR Fourier-Transformations-Infrarot

IR Infrarot

PEG Polyethylenglykol

PMSF 6 Phenylmethylsulfonyl�uorid

red reduziert

rpm Umdrehung pro Minute

SDS-Page Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese

sym symmetrische

Tab. Tabelle

TEMED N, N, N' , N' - Tetramethylethylendiamin

v/v Volumen pro Volumen

w/v Gewicht pro Volumen

z. B. zum Beispiel

154

Lebenslauf

Name: Silke Johanning

Geburtsdatum: 08.11.1974

Geburtsort: Remscheid

Schulausbildung:

1981 - 1985 Grundschule Remscheid

1985 - 1994 Leibniz-Gymnasium Remscheid

Abschluss: Abitur

Note: 2,5

Ausbildung:

1994 - 1996 Rheinischen Akademie e.V. Köln

Ausbildung zur BTA

Abschluÿ: staatlich geprüfte Biologisch-

technische Assistentin

Hoschulausbildung:

1996 Ruhr-Universität Bochum

Fachrichtung Biochemie

1999 Wechsel zur Fachrichtung Biologie

2005 Abschluÿ des Studienfachs Biologie

Abchluÿ: Diplom

Note: gut

ab 2005 Ruhr-Universität Bochum

Doktorarbeit am Lehrstuhl für Biophysik

155

Publikationen:

Verö�entlichungen:

� S. Wörmke, S. Mackowski, A. Schaller, T.H.P. Brotsudarmo, S. Johanning,

H. Scheer, C. Bräuchle �Single Molecule Fluorescence of Native and Refolded

Peridinin�Chlorophyll�Protein Complexes� J Fluoresc, 2008, 18, 611-617

Posterbeiträge:

� S. Johanning, E. Schuhmacher, F.P. Sharples, R. G. Hiller, E. Hofmann �Struc-

ture Analysis of Light Harvesting complexes from the Dino�agellate Amphidini-

um carterae�23rd European Crystallographic Meeting 2006, Leuven, Belgien)

� S. Johanning, E. Schuhmacher, F.P. Sharples, R. G. Hiller, E. Hofmann �Struc-

ture Analysis of Light Harvesting complexes from the Dino�agellate Amphi-

dinium carterae�14th Internatinal Congress on Photosynthesis 2007,Glasgow,

GB

� S. Johanning, T. Schulte, E. Schuhmacher, E. Hofmann �C6: Struktur und

Funktion der Lichtsammelproteine von Dinofalgellaten (1)� SFB480 Tagung

2006, Wolfsburg

� T.Schulte S. Johanning, E. Schuhmacher, E. Hofmann �C6: Struktur und Funk-

tion der Lichtsammelproteine von Dinofalgellaten (2)� SFB480 Tagung 2006,

Wolfsburg

156

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei all denen bedanken, die durch ihre Unterstüt-

zung den Erfolg dieser Arbeit erst möglich gemacht haben:

Professor Dr. Eckhard Hofmann für die Vergabe des Themas, seinem Engagement

bei der Betreuung meiner Arbeit und der Unterstützung bei fachlichen Problemen,

spezieller Dank auch für die �Wunscherfüllung�, die Anscha�ung des wunderbaren

Fluidizers

Prof. Dr. Matthias Rögner, für die Kore�erenz meiner Arbeit und die Bereitstellung

der French Press

Prof. Dr. Klaus Gerwert dafür, das ich die Arbeit am Lehrstuhl für Biophysik durch-

führen konnte

Alexander Wolf vom BMZ in Dortmund für die Kooperation bei den Biacore Versu-

chen

dem DFG für die �nanzielle Unterstüzung durch den SFB 480

Roger Hiller in Australien für den Austausch und die Diskussionen

dem gesamten Lehrstuhl für Biophysik für das angenehme Arbeitsklima

hier besonders Jörn Güldenhaupt für die e�ektive Zusammenarbeit bei den ATR

Experimenten

Eva für die Unterstützung bei den Anzuchten der Dino�agellaten und bei den Auf-

reinigungen

dem Lehrstuhl für Molekularbiologie für die unkomplizierte und kurzfristige Un-

terstützung durch die Nutzung der Zentrifugen, besonders der UZ und der French

Press wenn die normal verwendeten Geräte aus�elen

hier besonders auch meinen Dank an Meriyem für die Gespräche über Frust und

157

Lust der Dissertation

dem Lehrstuhl für die Biologie der P�anzen für die Dauerleihgabe des Extruders

und Hilfe beim Ausfall unseres Autoklaven

dem Lehrstuhl für Biochemie für die Nutzung des Fluidizers bis der Lehrstuhleigene

vorhanden war

allen Freunden die ich zum Teil am Lehrstuhl fand für die unzähligen Gespräche, die

Aufmunterungen, den Glauben an mich und ihre ehrliche Kritik, eure wunderbare

Freundschaft war mein Rückrat in dieser Zeit und meine Dankbarkeit �ndet keine

wirklichen Worte.

Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbstständig verfasst und bei keiner anderen

Fakultät eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel

verwendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation

um fünf in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare.

Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten

und in keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.

Bochum, den 15.4.2009

(Unterschrift)

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