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Strukturbasiertes
phage display
Martin-Luther-UniversitätHalle-Wittenberg
Institut für Biotechnologie
Arbeitsgruppe Proteintechnologie
Ulrike FiedlerGerald BöhmRainer RudolphCarola Reimann
Phage display und panning
löslichesProtein
eluierter Phage
Selektionsprozess
Light chain
Heavy chainIntra-chain-disufide bonds
Inter-chain disulfide bond
Active site
Active site
VK VKVH VH
CK CKCH1
CH3
CH2
CH1
CH3
CH2
Structure of Antibody Molecules
Complete antibody
IgG molecule Catalytic antibody
Application of Antibodies
Diagnostics
Therapy
Monitoring
Purification
tumour diagnosisELISA
cancer
detection and quantificationof bacteria, toxins, viruses, pesticides
affinity chromatographybioremediation
Antibodies
Affinity
Specificity
Size
Immunogenicity
Low stability
Advantages Disadvantages
Phagenspezies für das phage display
filamentöse Phagen lytische Phagen
periplasmatisch zytoplasmatisch
Plasmamembran
äußere Membran
Expression in der E. coli-Zelle
Verwendung von single-chain FvAntikörpern beim phage display
VKVH
Anwendungen des phage display-Systems
Display natürlicher Peptide: Epitop-Mapping von Antikörpern
Herstellung von Immunogenen
Display von Random-Peptiden: Epitop-Mapping von Antikörpern
Identifizierung von Peptid-Liganden
Mapping der Substratbindungsstelle
von Proteasen und Kinasen
Display von Proteinen und Isolierung von hoch-affinen Antikörpern
Protein-Domänen: cDNA Expressions-Screening
directed Evolution
Cytochrome b562TendamistatZ-Domäne vomProtein A
Cys2His2-Zink-Finger
Scaffolds für das phage display
Zn
Ziel des Projektes
Design eines stabilen Proteins mit Bindungseigenschaften
Anforderungen an das Scaffold-Protein:
- kleines Protein
- hohe Stabilität
- geringe Immunogenität
Das Augenlinsenprotein Gamma-Kristallin -
ein scaffold für das phage display?
sehr stabiles Protein
kleines Protein
kaum immunogen
Kristallstruktur vorhanden
174 Aminosäuren
2 Domänen
4 -Faltblätter mit jeweils 4 -Strängen (greek-keay)
Eigenschaften des Gamma-Kristallins
Gamma-Kristallin als scaffold:
stabiles Protein ohne Bindungseigenschaften
Solvent Accessibility
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Acc
essi
bili
ty (
% o
f m
ax.)
Residues 1-85 (N-terminal domain)
2
4
6
15
1719
36
38
“Inside”
“Outside”
(Glu
) 7
(Ph
e) 5
(Ile) 3
(Th
r) 4
(Ly
s)
2
(Gly
) 1
(Ty
r) 6
(Tyr) 1
6
(Cy
s) 1
8
(Se
r) 1
9
(Glu
) 1
7
(Cy
s)
15
(His
) 1
4
Sequence Variability
(As
p)
38
(Se
r) 39
(Va
l) 37
(Se
r) 34
(Ile) 3
5
(Arg
) 3
6
Mutagenese im -Faltblatt
Ser 19
MutagenisiertePositionen:
Lys 2Thr 4Tyr 6Cys 15Glu 17Ser 19Arg 36Asp 38
Anzahl der möglichenVarianten:208 = 2.6 E+10
Ort der Mutagenense
Oberfläche des Gamma-Kristallins: 9122 Å2
Mutagenisierter Bereich: 560 Å2 = 6,1%
Konstruktion einer kombinatorischenGamma-Kristallin-Bank
Design der Oligonukleotide
Assemblierung
Klonierung
Expression and Selektion
X X X
X X
X X
X
XXX XXX XX
X
Assemblierung der Oligonukleotide
X X X X XX X
XXX
Assemblierung an der Festphase
SA-coated paramagnetic bead XXX
Kodon-NutzungN/N/N - 64 Kodone für eine Aminosäure
CAT/N/N - kein Stop-Kodon, kein Cystein,
keine aromatischen Aminosäuren
N/N/K (T or G) - 32 Kodone für eine Aminosäure
Tripletts - 20 Kodone für eine randomisierte Amiosäure
Ergebnisse und Probleme
Herstellung der Bank Größe der Bank
Qualität der eingesetzten Oligo’s
Expression der mutierten Proteinen
Etablierung des phage
display-Systems (scFv)
Bildung des Fusionsproteins Display auf dem Phagen
Gamma-Kristallin-WT-Protein 3 Stabilität der mutierten Proteine
Panning Selektion geeigneter Targets und
panning-Bedingungen
Target Molecules
Haptens oxazolone, abscisic acid, biotin, digoxigenin, testosterone
Proteins BSA, Il4-receptor CEA (carcinoembryonic antigen) tetanus toxoid SH2-domain EGF-receptor
Glycoproteins EGP 2 (epithelial glycoprotein)
Erste Zielmoleküle
Haptene: OxazoloneBiotin
Proteine: BSALysozymCD 44 (Oberflächenprotein bei Krebszellen)
Enzymatische GlucosidaseAktivitäten:
Weiterführende Arbeiten
Gamma-Kristallin-Bänke unter Verwendung
von Triplett-Oligonukleotiden
Display einzelner Gamma-Kristallin-Domänen oder
Gamma-Kristallin-Cystein-Mutanten auf dem Phagen
Untersuchung der Wechselwirkungen mit dem BIACORE
Stabilitätsuntersuchungen
Ausblick
weitere Mutagenesen: loop-Region,
Region zwischen N- und
C-terminaler Domäne
random - DNA-shuffling
Fusion der isolierten Kristallin-Mutanten
mit dem VP1-Molekül (Targeting Modul)
Panning: an lebenden Zellen
(zellspezifische Targeting-Module)