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SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS E FIGURA.................................................................................. 3
1. REVISÃO DE LITERATURA.................................................................................... 4
RESUMO ......................................................................................................................... 5
ABSTRACT ..................................................................................................................... 6
INTRODUÇÃO................................................................................................................ 7
AFLATOXINAS ........................................................................................................... 8
AS AFLATOXINAS E A PSICULTURA....................................................................... 9
OCRATOXINA NA PSICULTURA ............................................................................ 11
CONSIDERAÇÕES FINAIS......................................................................................... 12
REFERÊNCIAS............................................................................................................. 14
2. OBJETIVOS .............................................................................................................. 17
3. ARTIGO PARA PUBLICAÇÃO .............................................................................. 18
RESUMO .................................................................................................................... 19
ABSTRACT: ............................................................................................................... 20
INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 21
MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................... 23
AMOSTRAS ................................................................................................................... 23
ANÁLISE MICOTOXICOLÓGICA ....................................................................................... 24
ANÁLISE ESTATÍSTICA................................................................................................... 24
RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................... 25
CONCLUSÃO................................................................................................................ 30
2
REFERÊNCIAS............................................................................................................. 31
APÊNDICE 1 – QUADRO DETALHADO DAS AMOSTRAS DE RAÇÃO
COMERCIAL PARA PEIXES EM PROPRIEDADES PISCÍCOLAS DA REGIÃO
NORTE E OESTE DO ESTADO DO PARANÁ, COLHIDAS NO PERÍODO DE
SETEMBRO DE 2003 A JULHO DE 2004................................................................... 35
ANEXO 2 - TÉCNICA DE EXTRAÇÃO DE MICOTOXINAS PARA A
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (SOARES E RODRIGUES-
AMAYA, 1989)............................................................................................................... 38
ANEXO 3 – MATERIAIS UTILIZADOS NA TÉCNICA DE CROMATOGRAFIA
EM CAMADA DELGADA (CCD)................................................................................ 40
ANEXO 4 – LEGISLAÇÃO SOBRE MICOTOXINAS EM ALIMENTOS E
MATÉRIAS PRIMAS. .................................................................................................. 42
3
LISTA DE TABELAS E FIGURA Tabela 1 - Amplitude e média de concentração em µg/kg de aflatoxinas e ocratoxina A em
ração comercial para peixes nas regiões Norte e Oeste do Estado do Paraná,
(2003/2004).......................................................................................................................... 26
Tabela 2 - Presença de aflatoxinas e/ou ocratoxina A em relação às estações do ano e o
tempo de estocagem em ração comercial para peixes das regiões Norte e Oeste do Estado
doParaná(2003/2004)............................................................................................................27
Tabela 3 – Presença de aflatoxinas/ocratoxina A em relação entre o tipo de processamento
de fabricação de ração comercial para peixes nas regiões Norte e Oeste do Estado do
Paraná , 2003/2004................................................................................................................29
Figura 1 – Classificação climática por região no Estado do Paraná....................................28
4
1. REVISÃO DE LITERATURA
5
RESUMO
MICOTOXINAS EM RAÇÕES DESTINADAS À PISCICULTURA COMERCIAL
Micotoxinas são metabólitos secundários dos fungos que provocam intoxicações em
variadas espécies animais, inclusive nos peixes. As aflatoxinas têm grande importância na
criação comercial de peixes, pois podem interferir no crescimento, desenvolvimento e
reprodução desses animais. A exposição prolongada de peixes as aflatoxinas levam a
alterações vasculares e necróticas em fígado, guelras, cérebro, coração e rins. As
ocratoxinas podem causar nos peixes redução no ganho de peso, degeneração e necrose do
tecido renal e hepático dos peixes. Com o aumento da demanda do consumo de carne de
peixe há necessidade de verificar a ocorrência de micotoxinas em rações para peixes e seus
efeitos sobre os mesmos, bem como os danos que possam acarretar ao ser humano ao
consumir carne contaminada com resíduos de micotoxinas. O Brasil é apontado como país
que pode despontar na produção mundial de peixes de água doce, devido ao clima
adequado e mananciais de água abundantes. Mesmo com a implementação de boas práticas
de fabricação e da adição de medicamentos capazes de neutralizar as micotoxinas e de
produtos que retardam o crescimento fungico, ainda haverá a necessidade de monitorar a
qualidade das rações.
Palavras chave: aflatoxinas, ocratoxina A, peixes.
6
ABSTRACT MICOTOXINS IN FOOD DESTINED TO THE COMMERCIAL FISH FARMING Mycotoxins are secondary metabolites produced by fungi. It’s cause of intoxications in
varied species of animals, and the fishs. The aflatoxins have great importance in the
commercial creation of fish, because they can interfere in the growth, development and
reproduction of those animals. Several vascular alterations and necrotic are observed in
liver, grill, brain, heart and kidneys when the animals are exposed for long periods of
aflatoxins ingestion. The ocratoxin A cause in the fish reduction in the weight earnings,
degeneration and necrosis in renal and hepatic tissue. With the increase of the demand of
the consumption of fish meat there is need to verify the mycotoxins occurrence in food for
fish and your effects on the same ones, as well as the damages that can cart the human
being when consuming contaminate meat with mycotoxins residues. Brazil is pointed as
country that can blunt in the world production of fish of fresh water, the appropriate climate
and springs of water abundant. Even with the implement of good production practices and
of the addition of medicines capable to neutralize the mycotoxins and of products that delay
the growth of fungi, there will still be the need to monitor the toxicological quality of the
food.
Key words : aflatoxin, ocratoxin A, fish.
7
INTRODUÇÃO
Micotoxinas são metabólitos secundários de fungos toxigênicos e causam efeitos
nocivos a várias espécies animais (OSWEILER, 1996).
Há tempos as micotoxinas causam problemas aos animais e também à saúde
humana. As antigas civilizações romana e grega sofreram com epidemias geradas por uma
variedade de micotoxinas, como os alcalóides de ergot, produzidos pelo fungo Claviceps
purpurea. Na idade média, na Europa, milhares de pessoas foram contaminadas durante os
períodos de guerra e fome. Os indivíduos contaminados por substâncias tóxicas, as
micotoxinas, apresentavam necrose da pele, perda dos dedos dos pés e mãos, inflamação
pós-isquêmica do tecido, ocasionando gangrena e em casos extremos até morte
(QUEVEDO, 2001).
As micotoxicoses causam um grave problema em saúde pública mundial. Além das
perdas nas áreas de agricultura e de produção animal, gera ainda uma conta de milhões de
dólares gastos em problemas relacionados à saúde humana (VASANTHI e BHAT, 1998).
Tanto nos seres humanos quantos nos animais, as micotoxicoses são caracterizadas
por serem não contagiosas, não transmissíveis. Usualmente os sintomas cessam quando
remove-se os alimentos contaminados da dieta dos animais (PERAICA et al., 1999)
Os fatores que contribuem para a presença e produção de micotoxinas em alimentos
e matérias primas de rações incluem armazenamento e condições ambientais, e
freqüentemente muitos desses fatores estão além do controle humano (HUSSEIN et al.,
2001). A infecção fúngica e a contaminação desses produtos por micotoxinas na pré-
colheita podem iniciar-se no plantio e ir até momentos antes da colheita e no pós-colheita
durante o armazenamento(LAZZARI, 1999).
Embora mais de 300 micotoxinas tenham sido detectadas quimicamente, o impacto
médico-veterinário e biológico, sobre a sanidade animal ainda não foi totalmente definido
(OSWEILLER, 1996; GIMENO, 1999; HUSSEIN et al., 2001). As principais micotoxinas
de interesse em saúde humana e animal são as aflatoxinas, ocratoxinas, tricotecenos,
vomitoxina, zearalenona e os alcalóides de ergot.
8
AFLATOXINAS
Dentre as micotoxinas mais estudadas está a aflatoxina. A história das aflatoxinas
iniciou-se em 1960, com um grave acidente econômico na Inglaterra. Mais de 400.000
perus de 4 a 6 semanas de idade morreram de uma doença até então desconhecida que, por
não apresentar causa aparente, foi denominada doença X dos perus. Apesar de não
apresentar causa aparente, notou-se que o desaparecimento dos sintomas ocorria com a
mudança das rações ofertadas aos animais (SCUSSEL, 1988).
Constituiu-se de um grupo de toxinas reproduzidas pelos fungos Aspergillus flavus e
Aspergillus parasiticus. São formadas quando se interrompe a redução dos grupos
cetônicos na biossíntese dos ácidos graxos, realizados pelos mofos (GIMENO, 1999).
Subdividen-se em B1, B2, G1 e G2, conforme fluorescência azul (B, blue) ou verde (G,
green) sob luz ultravioleta. A aflatoxina B1 é a mais estudada por apresentar maior
toxicidade e por ser cancerígena.
O teor de umidade, a temperatura e a umidade relativa do ar são fatores
determinantes para a produção de aflatoxinas. No milho, este fenômeno ocorre a partir de
um teor de umidade de 17,5% a 18,5%. A temperatura ótima para sua produção máxima
está entre 25,0 a 27,0 ºC. Sob essas condições a produção inicia-se em 24 horas e continua
até atingir a quantidade máxima em 10 a 12 dias (LAZZARI, 1997). No Brasil, o Ministério
da Agricultura e do Abastecimento regulamentou que em qualquer matéria prima ou ração
para consumo animal o nível máximo permitido de aflatoxinas é de 50 µg/Kg, ou seja, 50
ppb (BRASIL, 1988).
As micotoxinas causam diversos efeitos, agudos ou crônicos, em humanos e
animais, especialmente em monogástricos. Ruminantes são menos susceptíveis que
monogástricos devido a microbiota ruminal, que é capaz de degradar as micotoxinas. Os
efeitos dependem da espécie e susceptibilidade animal, da dose e do tempo de exposição
(HUSSEIN e BRASEL, 2001).Em mamíferos acomete principalmente o fígado, podendo
também estar associada a hemorragias e alterações neurológicas, como espasmos. A ação
tóxica das aflatoxinas está na capacidade de ligar-se à guanina do ácido desoxirribonucléico
9
(DNA), inibindo sinal para a formação do ácido ribonucléico mensageiro (RNAm)
(OSWEILER, 1996).
AS AFLATOXINAS E A PSICULTURA A piscicultura é um tipo de exploração animal que vem se tornando cada vez mais
importante como fonte de proteínas para o consumo humano. Isso pode ser facilmente
demonstrado ao se analisar a produção mundial de peixes, calculada para o ano de 1996 em
cerca de 14 milhões de toneladas. O Brasil se insere no contexto internacional como um dos
países com grande potencial para piscicultura, pois além de possuir um vasto território, suas
condições climáticas favorecem o implemento de cultivos de peixes de água doce
(PAVANELLI, 2002).
As aflatoxinas têm grande importância na criação comercial de peixes, pois podem
interferir no crescimento, desenvolvimento e reprodução desses animais (CONROY, 2000;
GRIZZLE, et al., 2002; MUKHERJEE, et al., 2001a). Bailey et al. (1989) analisando os
resultados obtidos no experimento com embriões de truta arco íris como modelo de estudo
de carcinogênese, associou o modo de ação da aflatoxina B1 obtido nos peixes semelhantes
ao dos mamíferos e aves.
Mukherjee et al. (2001a) verificaram que as alterações histológicas, observadas em
seu estudo utilizando Carpas da Índia (Labeo rohita), são dependentes de doses de
micotoxina. Observaram-se diversas alterações vasculares e necróticas em fígado, guelras,
cérebro, coração e rins quando se administrou aflatoxina pela via intraperitoneal. Nesse
estudo a concentração de aflatoxina inoculada foi de 1,25 e 5,00 mg/kg de peso vivo, em
dose única, e as alterações observadas por um período de até 90 dias.
Grizzle et al. (2002) avaliou os efeitos em Tilápias do Nilo (O. mossambicus) a
diversas concentrações e aflatoxina B1. Os peixes foram alimentados com rações contendo
0 (zero), 0,25, 2,5, 10 e 100 mg de aflatoxina por Kg de ração, durante 8 semanas. Esse
estudo constatou que uma dieta contendo 2,5 mg/Kg e 10 mg/Kg levava os animais a uma
redução do ganho de peso, queda do hematócrito e lesões degenerativas em fígado. Já
dietas contendo 100 mg/Kg causavam perda de peso severa, necrose hepática e morte em
10
até 60% dos animais avaliados. Esse estudo indica que os efeitos da intoxicação aguda e
subcrônica pó aflatoxina B1 em Tilápias do Nilo dependem da dose de toxina ingerida.
Em outro estudo envolvendo Tilápias do Nilo (O. mossambicus), Conroy (2000)
administrou ração comercial para peixes naturalmente contaminadas por aflatoxina, com
concentrações variando de 0 (zero) até 16 ppb. As lesões observadas após um período de 55
a 135 dias de uso da ração foram de queda do hematócrito, hipocromasia, poiquilocitose e
microcitose com presença de eritroblastos,. Alterações histopatológicas como atrofia e
necrose pancreática, atrofia de vilosidades intestinais, lipidose ou necrose hepática também
foram observadas já a partir dos 55 dias pós administração da ração aos animais.
Sobre a importância da monitoração da qualidade das rações para peixe, no que
tange as aflatoxinas, Plakas et al (1991) administrando 250 µg de aflatoxina B1 marcada
com carbono 14 (AfB1-C14) por kg de peso corpóreo em Cat Fish (Ictalurus punctatus),
observou que após 4 horas da ingestão, encontrava-se uma concentração de até 40 µg/kg na
musculatura do animal. Reforçando a possibilidade de uma contaminação humana por
aflatoxinas através do consumo de peixes contaminados, Hussain e Wilson (1993)
trabalhando com “Walleye fish” (Stzostedion vitrium vitrium), constatou que animais
alimentados com rações com 20 ppb das aflatoxinas B1, G1 e G2 apresentavam esta toxina
nos músculos, assim podendo acarretar riscos à saúde humana.
Nos peixes, o órgão de maior sensibilidade a aflatoxina é o fígado (CONROY,
2000; MURJANI, 2002; GRIZZLE, 2002; MUKHERJEE et al., 2001a). Com o auxílio de
microscopia eletrônica, observa-se que há acúmulo de fluido intercelular e intracelular,
ribossomos livres em abundância, diminuição do tamanho do núcleo além de formato
irregular e distribuição irregular da cromatina nuclear são os achados mais importantes nas
células hepáticas afetadas pela aflatoxicose crônica (MURJANI, 2002).
Os sinais observados nos peixes Tilápias do Nilo (O. mossambicus) e Carpa da
Índia (Labeo rohita) são de caquexia e uma intensa despigmentação das escamas, devido as
lesões hepáticas (CONROY, 2000; MUKHERJEE et al. 2001a; MUKHERJEE et al.
2001b). Os efeitos de imunossupressão também são relatados em embriões de Truta arco-
íris (Oncorhynchus mykiss) expostos a concentrações de 0,5 mg/litro/30 minutos, em que
11
observaram uma disfunção no sistema imune dos animais devido a um decréscimo da
proliferação de leucócitos e da produção de imunoglobulinas (OTTINGER et al., 2000).
OCRATOXINA NA PSICULTURA
Outra micotoxina já estudada em peixes é a ocratoxina. Manning et al. (2003)
administrando 1 a 2 mg/kg de ocratoxina na dieta durante 8 semanas de tratamento para
juvenis de Cat fish (Ictalurus punctatus) observaram uma significante redução no ganho de
peso, grandes centros de melanomacrófagos no tecido hepático, no rim posterior e no
pâncreas.
O mecanismo de ação tóxica da Ocratoxina é experimentalmente atribuído à
inibição competitiva de enzimas da cadeia respiratória celular como a ATPase, succinato
desidrogenase e da citocromo C oxidase. Outro mecanismo de ação é a interrupção da
síntese protéica através da ação competitiva do fenillalonil-tRNA sintetase (HUSSEIN et al,
2001). A determinação da intoxicação aguda de Ocratoxina A em truta arco íris
(Oncorhynchus Mykiss) de 180 dias de vida, resultou em uma DL50 de 4,67 mg/kg injetadas
intraperitonealmente. Ao exame histopatológico observou-se degeneração e necrose do
tecido renal e hepático (DOSTER et al, 1976).
12
CONSIDERAÇÕES FINAIS
As micotoxinas representam um sério risco de contaminação em alimentos e rações
em várias partes do mundo, atingindo todas as espécies animais, bovinos, suínos, aves,
peixes, e também o ser humano.
Na última década a piscicultura desenvolveu-se rapidamente, por produzir uma
carne que possui proteína de alto valor biológico, com reduzido colesterol (PAVANELLI,
2002). Para atender o mercado consumidor, com um alimento altamente saudável,
incrementou-se a criação de peixes, e com eles a fabricação de rações específicas para os
mesmos.
Além da contaminação da matéria prima das rações por fungos no campo e,
conseqüentemente, com a produção de micotoxinas, temos também problemas no
armazenamento indevido nos criatórios e nos distribuidores de ração, associado ao fator de
que as aflatoxinas, que contaminam os grãos de milho, não são afetadas pela moagem e
pela peletização, pois são termoestáveis, e não são inativas pelo processamento térmico
(LAZZARI, 1997).
Estudos envolvendo a pesquisa de micotoxinas em rações para peixes são raros no
Brasil. Desta forma, torna-se necessário um estudo que determine a ocorrência de
micotoxinas em rações de peixes, bem como sua relação com as diferentes estações
climáticas do ano. Assim será possível contribuir para se estabelecer medidas preventivas
de contaminação, visando impedir a queda de produção na piscicultura brasileira.
Com as diversas injúrias ocasionadas por micotoxinas ao organismo dos peixes
pode ser possível estabelecer uma correlação entre um baixo aproveitamento dos alimentos,
um retardo no desenvolvimento corporal e de ganho de peso insatisfatório. Pavanelli et al
(2002) comentam que a má nutrição possibilita que doenças de etiologias virais, bacterianas
e parasitárias se instalem nos criatórios, acarretando prejuízos aos criadores.
Dessa forma, entende-se que a contaminação de rações com aflatoxinas nos dias
atuais são muito raras em países desenvolvidos, pelo considerável cuidado com a qualidade
do óleo proveniente de grãos que entram nas formulações de rações (MURJANI, 2002).
Porém, em países em desenvolvimento, é grande problema, pois seu sistema de
13
armazenamento é deficitário e seu ambiente, com grande umidade e elevadas temperaturas,
favorecem o crescimento de fungos e conseqüente produção de micotoxinas
(MUKHERJEE et al., 2001b).
14
REFERÊNCIAS BAILEY, G.S., NUNEZ, O., HENDRICKS, J.D., ARBOGAST, D.N., FONG, A.T., LEE, B.C. Promotion of aflatoxin B1 hepatocarcinogenesis in rainbow trout by 17 beta-estradiol. Aquatic toxicology. v.15, n.4, p.289-301, 1989
BRASIL. Ministério da Agricultura. Portaria MA/SNAD/SFA No. 07, de 09/11/88 -
publicada no Diário Oficial da União de 09 de novembro de 1988 - Seção I,
página,21.968, 1988: Regulamenta que para qualquer matéria prima a ser utilizada
diretamente ou como ingrediente para rações destinadas ao consumo animal: aflatoxinas
nível máximo de 50 µg/kg.
CONROY, G. Algunas alteraciones patológicas detectadas en tilápias cultivadas,
alimentadas con dos dietas comerciales. In: ENCONTRO LATINO-AMERICANO DE
PATOLOGISTAS DE ORGANISMOS AQUÁTICOS, 2., 2000, Florianópolis. Resumos...
Florianópolis: UFSC, 2000. p. 211.
DOSTER, R.C., SINNHUBER, R.O., WALES, J.H. Determination of ochratoxin A and B
in rain bout trout (Oncorhynchus mykiss). Food Cosmetic Toxicology. n.10, p. 85-92,
1976
GIMENO, A. Revision genérica del problema de los hongos y de las micotoxinas en la
alimentación animal. Disponível em:
<http://www.mycotoxin.com/mycotoxin/alberto/gimeno1999.htm> Acesso em 22 de maio
de 2003
GRIZZLE, J. M.; TUAN, N. A.; LOVELL, R. T.; MANNING, B. B.; ROTTINGHAUS,
G.E. Growth and hepatic lesions of Nile Tilápia (Oreochromis niloticus) fed diets
containing aflatoxin B1. Aquaculture. v. 212, p.311-319, 2002
15
HUSSAIN, M.; WILSON, T. Effect of aflatoxin contaminaded feed on morbidity and
residues in Walle fish. Veterinary and Human Toxicology. Ames, v.35, n.5, p. 396-398,
1993
HUSSEIN, H.S.; BRASEL, J.M. Toxicity, metabolism, and impact of mycotoxins on
humans an animals – Review. Toxicology, v. 167, p. 101-134, 2001
Instituto Agronômico do Estado do Paraná. Cartas climáticas do Estado do Paraná
1994. Londrina, IAPAR, 1994. 49 p. ilust. (IAPAR, Documento, 18).
LAZZARI, F.A. Controle de micotoxinas no armazenamento de grãos e subprodutos. In:
SIMPÓSIO SOBRE MICOTOXINAS EM GRÃOS, 223, 1999, São Paulo. Anais... São
Paulo: Fundação Cargil, 1999, p. 81-106
LAZZARI, F.A. Umidade, fungos e micotoxinas na qualidade de sementes, grãos e
rações. 2.ed. Curitiba: Paranaset – Gráfica e editora Ltda, 1997
MANNING, B.B., ULBOA. R.M., MENGHE. K.L., ROBINSON. E. H.,
ROTTINGHAUS. G.E. Ocratoxin A fed to channel catfish (Ictalurus punctatus) causes
reduced growth and lesions of hepatopancreatic tissue. Aquaculture, v. 219, p. 739-750,
2003
MUKHERJEE, S.C.; SAHOO, P.K. Immunosuppressive effects of aflatoxin B1 in Indian
major carp (Labeo rohita). Comparative Immunology Microbiology & Infectious
Diseases. v. 24, n. 3, p. 143-149, 2001a.
MUKHERJEE, S.C.; SAHOO, P.K.; NAYAK, S.K.; DEY, S. Acut and subchronic
toxicity of aflatoxin B1 to rohu, Labeo rohita (Hamilton). Indian Journal of
Experimental Biology, New Delhi, v.39; n.5, p. 453-458, 2001b.
16
MURJANI, G. Chronics aflatoxicosis in fish and its relevance to human health.
Disponível em: <http://www.shaping-the-future.de/pdf_www/95_paper.pdf+1…> Acesso
em: 30 jun. 2002
OSWEILER, G. D. Toxicologia veterinária. Porto Alegre: Artes Médicas, 1996. p.446-
450.
OTTINGER, C. A. KATTARI, S.L. Long term immune dysfunction in rainbow trout
(Oncorhynchus mykiss) exposed embryos to aflatoxin B1. Fish and Shellfish
Immunology. Gloucester Point, v.10, n.1, p.161-106, 2000
PAVANELLI, G. C.; EIRAS, J. C.; TAKEMOTO, R. M. Doenças de peixes. Profilaxia,
diagnóstico e tratamento. 2.ed. Maringá: Editora da Universidade Estadual de Maringá,
2002.
PERAICA, M., RADIC, B., LUCIC, A., PAVLOVIC, M. Toxic effects of mycotoxins in
humans. Bull. Word Health Org. n.77, p. 754-763, 1999
PLAKAS, S.M., LOVELAND, P.M., BAILEY, G.S., WILSON, G.L. Tissue disposition
and excretion of C14- labellad aflatoxin B1 after oral administration in Chanel cat fish.
Food Chemistry and Toxicology. V.29, n12, p. 805-808, 1991
QUEVEDO, A. Fantasma tóxico. Disponível em :
http://www.aviculturaindustrial.com.br/dinamica.asp?tipotabela=cet&id=237&categoria=n
utrição.Acesso em: 18/12/2001
SCUSSEL, M. Micotoxinas em alimentos. Florianópolis : Insular, 1998. 144p.
VASANTHI. S., BAHAT. R.V. Micotoxins in food – ocurrence , health & economic
significance & food control measures. Ind. Med. Res. 108, p. 212-224, 1998
17
2. OBJETIVOS
Objetivo geral
Determinar a ocorrência de aflatoxinas B1, B2, G1, G2 e de ocratoxina A nas rações
comerciais para peixes utilizadas em propriedades de piscicultura da região Norte e Oeste
do Estado do Paraná.
Objetivos Específicos
• Verificar as possíveis contaminações por aflatoxinas e ocratoxina A e seus níveis de
concentração
• Avaliar a possibilidade de variação sazonal da contaminação por aflatoxinas
• Avaliar a ocorrência de aflatoxinas e ocratoxina A e o tipo de processo de
fabricação de rações comerciais para peixes.
• Avaliar a ocorrência de aflatoxinas e ocratoxina A e o tempo de estocagem de
rações comerciais para peixes.
18
3. ARTIGO PARA PUBLICAÇÃO
19
RESUMO
MICOTOXINAS EM RAÇÕES DESTINADAS À PISCICULTURA COMERCIAL
O objetivo desse estudo foi determinar a ocorrência de aflatoxinas B1, B2, G1, G2 e
de ocratoxina nas rações comerciais para peixes utilizadas em propriedades de piscicultura
da região Norte e Oeste do Estado do Paraná. Foram colhidas 100 amostras de ração
comercial para peixes em propriedades piscícolas da região Norte e Oeste do Estado do
Paraná. No momento da colheita as amostras foram classificadas conforme o
processamento de fabricação (farelada, extrusada, ou peletizada), o tempo de estocagem
(até 30 dias e acima de 31 dias) e a estação do ano. As amostras foram analisadas
utilizando-se o método de Cromatografia em Camada Delgada (CCD). A ocorrência de
aflatoxinas e/ou ocratoxina A foi de 21%. Observou-se aflatoxina/ocratoxina A em maior e
menor freqüência na primavera com 45,45% das amostras positivas e no verão com 5,26%,
respectivamente (p = 0,008). Não houve diferença significativa em relação ao tempo de
estocagem e a presença de aflatoxina e/ou ocratoxina A (p = 0,7). Em relação ao tipo de
processamento de fabricação, observou-se que das dezessete amostras peletizadas, 47,05%
(8/17) foram positivas. Já para amostras fareladas a ocorrência foi de 27,27% (3/11) e nas
amostras extrusadas de 13,88% (10/72) (p = 0,009). As médias das concentrações de
aflatoxinas estiveram entre 8,34 e 10,37 µg/kg, não ultrapassando o limite que preconizado
pela legislação brasileira de 50 µg/kg. Entretanto destacaram-se amostras contaminadas
com AfB2 e AfG1 cuja concentração variaram entre 16,22 a 16,76 µg/kg. Já para as rações
contaminadas por ocratoxina A pode-se observar níveis que atingiram até 175,8 µg/kg.
Palavras-chave: Aflatoxinas, ocratoxina A, ração, peixe.
20
ABSTRACT
MYCOTOXINS IN FEEDS DESTINED TO COMMERCIAL PISCICULTURE IN
BRAZIL
The objective of this study was to determine the occurrence of aflatoxins B1, B2, G1 and
G2 and ochratoxin in commercial feeds used in fish farms from North and West regions of
Paraná State, Brazil. A total of 100 samples were taken from the farms and classified
acording to the manufacturing process (crumble, stripping or pelleted), storage time (up to
30 days and over 31 days) and the season the sample was colected. All samples were
analysed by thin layer chromatographic. The total occurrence of aflatoxin and ochratoxin
was of 21%. The mycotoxins were most found in the samples collected in springtime
(45.45%) and least found in the samples taken in the summer (5.26%) (p=0.008). There
was no significant difference regarding storage time and the presence of mycotoxins. From
the 17 pelleted samples, 47.05 (8/17) were positive. The occurrence in bran samples was
27.27% (3/11) and in the stripping samples was 13.88% (10/72). The average level of
aflatoxins were between 8.34 and 10.37 µg/Kg, not surpassing the limits allowed in the
Brazilian legislation (50µg/Kg).
Key words: aflatoxins, fish, ocratoxin A, feeds
21
INTRODUÇÃO
Micotoxinas são os contaminantes comuns no alimento animal causando grandes
prejuízos na indústria do pescado, especialmente da aqüicultura (JANTRAROTAI;
LOVELL, 1990).
As aflatoxina têm grande importância na criação comercial de peixes, pois podem
interferir no crescimento, desenvolvimento e reprodução desses animais (CONROY, 2000;
GRIZZLE, et al., 2002; MUKHERJEE, et al., 2001b). Bailey et al. (1989) analisaram os
resultados obtidos no experimento com embriões de truta arco íris como modelo de estudo
de carcinogênese, e verificaram que a ação carcinogênica da aflatoxina B1 é semelhante à
dos mamíferos e aves.
A contaminação de rações com aflatoxinas nos dias atuais são muito raras em países
desenvolvidos, pelo considerável cuidado com óleo de grãos que entram nas formulações
de rações (MURJANI, 2002). Porém, em países em desenvolvimento, é grande problema,
pois seu sistema de armazenamento é deficitário e seu ambiente, com grande umidade e
elevadas temperaturas, favorecem o crescimento de fungos e conseqüente produção de
micotoxinas (MUKHERJEE, et al., 2001b).
Hussain e Wilson (1993) citam que animais alimentados com rações com 20 ppb
das aflatoxinas B1, G1 e G2 apresentavam esta toxina nos músculos, assim podendo
acarretar danos à saúde humana.
A Ocratoxina A é produzida como um metabólito secundário do metabolismo do
Aspergillus ochraceus (HESSELTINE et al., 1976). O mecanismo de ação tóxica da
Ocratoxina é experimentalmente atribuído à inibição competitiva de enzimas da cadeia
respiratória celular como a ATPase e o succinato desidrogenase, e da citocromo C oxidase
(HUSSEIN e BRASEL, 2001). Hussein e Brasel (2001) cita ainda que a ocratoxina tem
como outro mecanismo de ação a interrupção da síntese protéica através da ação
competitiva do fenillalonil-tRNA sintetase.
22
Com contaminação das rações fornecidas aos peixes por micotoxinas poderemos ter
três fatores importantes: as alterações em ganho de peso, as alterações do crescimento e a
possibilidade de contaminação dos produtos provenientes destes peixes que serão
fornecidos ao ser humano (PLAKAS et al., 1991). Estes problemas teriam grande
repercussão econômica e de saúde pública justificando pesquisas para a avaliação do nível
de contaminação nos alimentos fornecidos aos peixes e também a verificação dos efeitos
nestes animais (LOVELL,1984).
Estudos envolvendo a pesquisa de micotoxinas em rações para peixes são raros no
Brasil. Desta forma, objetivou-se determinar a ocorrência de micotoxinas em rações de
peixes, sua associação com as estações climáticas do ano, os tipos de ração e o tempo de
estocagem, além de determinar a concentração de micotoxinas na ração.
23
MATERIAL E MÉTODOS
Amostras
A colheita das amostras foi realizada no período de setembro de 2003 até julho de
2004. Foram colhidas 100 amostras de ração comercial para peixes em 12 propriedades
produtoras de peixe das regiões Norte e Oeste do Estado do Paraná atendidas por uma
cooperativa de fornecimento de insumos agrícolas. As propriedades foram relacionadas
através de sorteio. No momento da colheita as amostras foram avaliadas e classificadas
conforme o processamento de fabricação (farelada, extrusada, ou peletizada) e o tempo de
estocagem na propriedade conforme controle das notas fiscais dos produtores(até 30 dias e
acima de 31 dias).
As amostras encontravam-se em embalagens comerciais de fábrica, contendo de 30
a 40 Kg ou recipientes (tambores de latão, caixa de madeira, plástico ou amianto) mantidas
estocadas nas propriedades conforme as condições fornecidas por cada produtor . A
amostragem foi realizada pelo processo de quarteamento, divisão do conteúdo em 3
camadas (superfície, meio e fundo da embalagem) e retirou-se aproximadamente 2 kg de
cada uma das camadas. Foi realizada a homogeneização deste material e novamente
retirou-se uma amostra final de 500g, que foi encaminhada para o Laboratório de
Toxicologia e Plantas Tóxicas da Universidade Estadual de Londrina. Após a colheita, as
amostras foram acondicionadas em sacos plásticos, vedadas e mantidas congeladas a -18º
C, até o processamento e análise.
24
Análise micotoxicológica
As amostras foram analisadas utilizando-se a metodologia de Cromatografia em
Camada Delgada (CCD) descrita por Soares e Rodriguez-Amaya (1989) e adaptada por
Gimeno (1979).
Os padrões utilizados para a técnica de CCD foram AfB1, AfB2, AfG1, AfG2 e
Ocratoxina A (Sigma Inc. - EUA), nas concentrações de 2,55, 2,62, 2,45, 4,55 e 143,05
µg/mL respectivamente, preparados conforme metodologia da Association of Official
Analytical Chemists (AOAC) também adaptada por Gimeno (1979)
Os limites de detecção do método foram 2 e 5 µg/Kg e os limites de determinação
foram de 4 e 10 µg/Kg para aflatoxina e ocratoxina, respectivamente. A confirmação para a
presença de aflatoxinas foi realizada pela prova de reação química com o ácido
trifluoroacético, conforme metodologia descrita por Gimeno (1979).
Análise estatística
A ocorrência de micotoxinas nas amostras e sua associação a sazonalidade, ao tipo
de processamento industrial ao tempo de estocagem na propriedade, foi verificada pelo
cálculo do qui-quadrado (χ²), utilizando o programa Epi Info 6.04b (DEAN et al., 1994).
Ficou estabelecido 5% como nível de significância.
25
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A ocorrência de aflatoxinas e/ou ocratoxina A em 100 amostras de rações
comerciais para peixes das regiões Norte e Oeste do Estado do Paraná foi de 21% pelo
método de Cromatografia em Camada Delgada (CCD). A freqüência de aflatoxinas nas
amostras positivas foi 61,90% (13/21) e a de ocratoxina A foi 19,04% (4/21). Observaram-
se contaminação mista em 19,04% (4/21).
O resultado observado nesse estudo foi maior que os de Pontes Netto et al (2002),
que analisaram os variados tipos de matérias primas e rações para animais e obtiveram
36,3% das amostras positivas para aflatoxinas e 6,1% das amostras positivas para
ocratoxinas.
As médias das concentrações de aflatoxinas estiveram entre 8,34 e 10,37 µg/Kg e
não ultrapassaram o que preconiza a legislação brasileira para rações animais (50 µg/Kg).
Entretanto, destacaram-se amostras contaminadas com AfG1, que atingiram níveis de até
26,49 µg/kg, e amostras em associação de AfB2 e AfG1 que variaram entre 16,22 a 16,76
µg/kg. Conroy (2000) relata que níveis de 16 ppb de aflatoxinas totais, equivalente a 16
µg/kg, podem causar necrose pancreática, necrose hepática e atrofia das vilosidades
intestinais em peixes expostos a tais concentrações de aflatoxina.
Para as rações contaminadas por ocratoxina A observaram-se níveis de até 175,8
µg/kg. Sabe-se que doses de 4,67 mg/kg de ocratoxina A injetadas intraperitonealmente
podem causar intoxicação aguda em truta arco íris (Oncorhynchus mykiss) (DOSTER et al,
1976). Manning et al. (2003) relataram que doses de 1 a 2 mg/kg de ocratoxina na dieta
podem causar alterações no fígado, rim e pâncreas. O efeito de baixas doses de ocratoxinas
em peixes que ingerem rações contaminadas por um longo período de tempo não é
conhecido.
Não há limites legais de ocratoxina A estabelecidos pela legislação brasileira, porém
em outros países como o Uruguai, são estabelecidos níveis de até 50 µg/kg em alimentos
destinados ao consumo animal. As concentrações de Ocratoxina A encontradas nesse
estudo atingiram níveis até três vezes acima do preconizado por outros países.
26
Neste estudo observaram-se 4 amostras com a associação de aflatoxinas e
ocratoxinas, isso permite sugerir um possível sinergismo tóxico entre as micotoxinas,
podendo elevar os efeitos tóxicos das aflatoxinas quando da sua co-ocorrência em rações
para peixes. As amplitudes e médias de concentrações de AfB1, AfB2, AfG1, AfG2 e
Ocratoxina A são apresentadas na tabela 1.
Tabela 1 – Amplitude e média de concentração em µg/kg de aflatoxinas e ocratoxina A em
ração comercial para peixes nas regiões Norte e Oeste do Estado do Paraná, 2003/2004.
Micotoxina Número de ocorrência
nas amostras
Amplitude de concentração (µg/kg) Menor Maior
média (µg/kg)
AfB1 6 8,16 8,60* 8,38
AfB2 3 8,00 8,38 8,38
AfG1 4 7,84 26,49 10,37
AfG2 1 8,35 8,35 8,35
OTA 4 28,8 175,8 58,11
Af = aflatoxina
OTA = Ocratoxina
A análise entre as estações climáticas e o tempo de estocagem das rações nas
propriedades quanto à presença de micotoxinas aflatoxinas e ocratoxina A, revelou uma
maior ocorrência na primavera, onde 10/22 (45,45%) das amostras foram positivas para a
presença de aflatoxina e/ou ocratoxina A. A menor ocorrência foi observada no verão, em
que 1/19 (5,26%) foram positivas. Nas estações de outono e inverno a ocorrência foi de
5/34 (14,71%) e de 5/25 (20,00%), respectivamente (Tabela 2). À análise estatística
verificou-se que há diferença significativa (p = 0,008) entre as estações climáticas. A
primavera e o verão são estações do ano de altas temperaturas e umidade relativa do ar
ótima para a proliferação de fungos (LAZZARI, 1999). Entretanto, a baixa ocorrência
observada no verão pode ser justificada pelo alto consumo de ração pelos peixes nesse
27
período; por serem animais pecilotérmicos, seu metabolismo fica mais acelerado devido o
aumento de temperatura da água, havendo assim a renovação constante de estoque por parte
do produtor. Observou-se que 24,08 (13/54) das rações tinham até 30 dias de estocagem e
17,38% (8/46) tinham mais de 30 dias de estocagem. Após a análise estatística constatou-se
que não há diferença estatisticamente significativa (p = 0,7072) entre os grupos (Tabela 2).
Desta forma, pode-se sugerir que o tempo de estocagem das rações não interfere com a
produção de micotoxinas. Porém, deve-se considerar que as condições apropriadas de
armazenamento e o consumo são indispensáveis para a boa conservação da ração e podem
interferir nos resultados.
Tabela 2 – Presença de aflatoxinas e/ou ocratoxina A em relação às estações do ano e o
tempo de estocagem em ração comercial para peixes das regiões Norte e Oeste do Estado
do Paraná (2003/2004).
Estação climática
Total de amostras
positivas com até 30 dias de
estocagem
% Total de amostras positivas
com maisde 30 dias de estocagem
% Amostras positivas para
aflatoxinas e/ou
ocratoxina A
% Total de amostras
Primavera 5/54 9,26 5/46 10,87 10/22 45,45 22 Verão - - 1/46 2,17 1/19 5,26 19
Outono 4/54 7,41 1/46 2,17 5/34 14,71 34 Inverno 4/25 7,41 1/46 2,17 5/25 20,00 25 Total 13/54 24,08 8/46 17,38 21 21,00 100
Qui-quadrado = 1.39 Qui-quadrado = 11.59 p = 0.7072 p = 0.0089
Sabe-se que as regiões Norte e Oeste do estado do Paraná são classificadas como
sendo regiões de clima subtropical, em que a temperatura média no mês mais quente é
acima de 22oC, geadas são pouco freqüentes e há tendência de concentração das chuvas nos
meses de verão, contudo sem estação seca definida (IAPAR, 1994) (Figura 1). Este fato
reforça o resultado obtido neste estudo, pois a produção máxima de micotoxinas ocorre em
temperaturas de 25 a 27º C (LAZZARI, 1999).
28
Fonte: Instituto Agronômico do Paraná – IAPAR – Cartas climáticas (1994) Figura 1 – Classificação climática por região no Estado do Paraná. Cfa - Clima subtropical;. Cfb - Clima temperado propriamente dito. Estas diferenças nas ocorrências de aflatoxinas e ocratoxinas encontradas bem como
suas amplitude de concentração e suas relações com as estações climáticas podem ser
explicadas pelas diferentes origens de matérias primas para fabricação de ração que
possuem clima diferente do local de consumo do produto; bem como das diferenças
climáticas de uma safra de grãos para outra que entram na composição das rações, como
por exemplo, o milho (CANÇADO, 2003).
Não obstante, é provável que o número de amostras negativas bem como das
concentrações baixas de micotoxinas, possam ser justificadas pela diluição das toxinas nas
matérias primas contaminadas com as matérias primas não contaminadas (SCUSSEL,
1998). Há também a falta de informação do tempo de estocagem das mesmas antes da
utilização nas rações. Para confirmação do real fator predisponente, deve-se proceder o
rastreamento desde o campo, para cada matéria prima (HASHIMOTO, et al., 2003).
Em relação ao tipo de processamento de fabricação observou-se que 47,05% (8/17)
das amostras peletizadas foram positivas (p = 0,009). Já para amostras fareladas a
ocorrência foi de 27,27% (3/11) e nas amostras extrusadas de 13,88% (10/72) (Tabela 3).
29
No processo de peletização os ingredientes não passam por um tratamento térmico
igual aos extrusores. No processo de peletização aplica-se vapor à 90-100ºC seguidos de
compactação e secagem enquanto que no processo de extrusão as matérias primas passam
por altas temperaturas entre 115-140ºC seguidos de extrusão. O processo de extrusão é
beneficamente utilizado no tratamento térmico dos ingredientes para desnaturar enzimas
indesejáveis, inativar fatores antinutricionais e reduzir sensivelmente a população
microbiana presente (CAZZANIGA et al, 2001).
Tabela 3 – Presença de aflatoxinas/ocratoxina A em relação entre o tipo de processamento
de fabricação de ração comercial para peixes nas regiões Norte e Oeste do Estado do
Paraná , 2003/2004.
Tipo de processamento de fabricação
Amostras positivas para aflatoxina e/ou ocratoxina A (%)
Amostras negativas para aflatoxina e/ou ocratoxina A (%)
Total de amostras
Extrusada 10 (13,88) 62 (86,12) 72
Farelada 3 (27,27) 8 (72.73) 11
Peletizada 8 (47,05) 9 (52,95) 17
Total 21 79 100
p = 0.009 Qui-quadrado = 9.41
Mesmo com o avanço das boas práticas de fabricação e da adoção de adição de
conservantes, estabilizantes, adsorventes de micotoxinas e antifúngicos na ração pelos
fabricantes, ainda se encontram concentrações razoáveis de contaminação em rações
comerciais para peixes.
Há a necessidade de monitoramento da qualidade das rações comerciais para peixes,
devido ao aumento do consumo de carne de peixe. Portanto, faz-se necessário mais estudos
que possam examinar a relação da ocorrência de micotoxinas em rações para peixes e seus
efeitos sobre os mesmos, bem como os danos que possam acarretar ao ser humano ao
consumir carne contaminada com resíduos de micotoxinas.
30
CONCLUSÃO
Há ocorrência de aflatoxinas e ocratoxina A em 21 % das rações comerciais para
peixes nas regiões Norte e Oeste do Estado do Paraná. A concentração de aflatoxinas
encontradas nas rações manteve-se dentro do que preconiza a legislação brasileira para
rações para animais (50 µg/kg) (BRASIL, 1988), entretanto a presença concomitante
das Aflatoxinas e da Ocratoxina A nas amostras pode sugerir que possa ocorrer um
quadro de micotoxicose potencializado devido às ações de seus efeitos.
Maior taxa de positividade para aflatoxinas e ocratoxina A foram encontradas
durante a primavera. Concomitantemente o tempo de estocagem das rações nas
propriedades, maior ou menor que um mês, não foi fator predisponente para a presença
de micotoxinas para o presente estudo.
Com relação aos processamentos industriais, as rações peletizadas apresentaram a
maior ocorrência de micotoxinas.
31
REFERÊNCIAS BAILEY, G.S., NUNEZ, O., HENDRICKS, J.D., ARBOGAST, D.N., FONG, A.T., LEE, B.C. Promotion of aflatoxin B1 hepatocarcinogenesis in rainbow trout by 17 beta-estradiol. Aquatic toxilogy. V.15, n.4, p.289-301, 1989
BRASIL. Ministério da Agricultura. Portaria MA/SNAD/SFA No. 07, de 09/11/88 -
publicada no Diário Oficial da União de 09 de novembro de 1988 - Seção I, página,
21.968, 1988: Regulamenta que para qualquer matéria prima a ser utilizada diretamente ou
como ingrediente para rações destinadas ao consumo animal: aflatoxinas nível máximo de
50 µg/kg.
CANÇADO, R.A., FREITAS, R.J.S. 2003. Milho: teor de umidade x atividade de água –
uma relação no milho (Zea mays Linné) entre o teor de umidade e o teor de atividade de
água. Disponível em http://www.biotecnologia.com.br/bio29/milho.asp > Acessado em
22/12/04
CAZZANIGA, D., BASILICO, J.C., GONZÁLEZ, R. J., TORES, R. L., GREEF, D. M.
Mycotoxins inactivation by extrusion cooking of corn flour. Letter in Applied
Microbiology. Oxford, v. 33, n. 2, p. 144-147, 2001
CONROY, G. Algunas alteraciones patológicas detectadas en tilápias cultivadas,
alimentadas con dos dietas comerciales. In: ENCONTRO LATINO-AMERICANO DE
PATOLOGISTAS DE ORGANISMOS AQUÁTICOS, 2., 2000, Florianópolis. Resumos...
Florianópolis: UFSC, 2000. p. 211.
32
DOSTER, R.C., SINNHUBER, R.O., WALES, J.H. Determination of ochratoxin A and B
in rain bout trout (Oncorhynchus mykiss). Food Cosmetic Toxycologic. n.10, p. 85-92
DEAN AG, DEAN JA, COULOMBIER D, et al. Epi Info™, Version 6.04b, a word processing, database, and statistics program for public health on IBM-compatible microcomputers. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention, July 1994. GIMENO, A. Thin Layer Chromatographic Determination of Aflatoxins, Ocratoxins, Sterigmatocystin, Zearalenone, Citrin, T-2 Toxin, Diacetoxyscirpenol, Penicillic Acid, Patulin and Penitrem A. Association of Official Analytical Chemists. n.3, v. 62, p. 579-585, 1979.
GRIZZLE, J. M.; TUAN, N. A.; LOVELL, R. T.; MANNING, B. B.; ROTTINGHAUS,
G.E. Growth and hepatic lesions of Nile Tilápia (Oreochromis niloticus) fed diets
containing aflatoxin B1. Aquaculture. 212, p.311-319, 2002.
HASHIMOTO, E. H., SANTOS, M. A., ONO, E. Y. S., HAYASHI, C. BRACARENSE,
A.P.F.R.L., HIROOKA, E. Y. Bromatology and fumonisin and aflatoxin contamination in
aquaculture feed of the region of Londrina, State of Paraná, Brazil. Semina: Ciêcias
Agrárias. v.24, n. 1, p. 123-132, 2003
HESSELTINE, C. W., VANDERGRAFT, E. E., SMITH, M.L., SHOTWELL, O.L.
Aspergilli as ochratoxin producers. Mycologia, 64, p. 539-559, 1976
HUSSAIN, M.; WILSON, T. Effect of aflatoxin contaminaded feed on morbidity and
residues in Walle fish. Veterinary and Human Toxicology. Ames, v.35, n.5, p. 396-398,
1993
33
HUSSEIN, H.S.; BRASEL, J.M. Toxicity, metabolism, and impact of mycotoxins on
humans an animals – Review. Toxicology, v. 167, p. 101-134, 2001
Instituto Agronômico do Estado do Paraná. Cartas climáticas do Estado do Paraná 1994. Londrina, IAPAR, 1994. 49 p. ilust. (IAPAR, Documento, 18). JANTRAROTAI, W and LOVELL, R. T. Subchronic toxicity of dietary aflatoxin B1 to channel catfish. Journal Aquatic Animal Health. v2, p. 248-254, 1990
LAZZARI, F.A. Controle de micotoxinas no armazenamento de grãos e subprodutos. In:
SIMPÓSIO SOBRE MICOTOXINAS EM GRÃOS, 223, 1999, São Paulo. Anais... São
Paulo: Fundação Cargil, 1999, p. 81-106
LOVELL, R. T. Microbiol toxins in fish feeds. Aquaculture Magazine, 10 p. 34-36, 1984
MANNING, B.B., ULBOA. R.M., MENGHE. K.L., ROBINSON. E. H.,
ROTTINGHAUS. G.E. Ocratoxin A fed to channel catfish (Ictalurus punctatus) causes
reduced growth and lesions of hepatopancreatic tissue. Aquaculture, v. 219, p. 739-750,
2003
MUKHERJEE, S.C.; SAHOO, P.K. Immunosuppressive effects of aflatoxin B1 in Indian
major carp (Labeo rohita). Comparative Immunology Microbiology & Infectious
Diseases. v. 24, n. 3, p. 143-149, 2001a.
MUKHERJEE, S.C.; SAHOO, P.K.; NAYAK, S.K.; DEY, S. Acut and subchronic
toxicity of aflatoxin B1 to rohu, Labeo rohita (Hamilton). Indian Journal of
Experimental Biology, New Delhi, v.39; n.5, p. 453-458, 2001b.
34
MURJANI, G. Chronics aflatoxicosis in fish and its relevance to human health.
Disponível em: <http://www.shaping-the-future.de/pdf_www/95_paper.pdf+1…> Acesso
em: 30 jun. 2002
PLAKAS, S.M., LOVELAND, P.M., BAILEY, G.S., WILSON, G.L. Tissue disposition
and excretion of C14- labellad aflatoxin B1 after oral administration in Chanel cat fish.
Food Chem. Toxic. V.29, n12, p. 805-808, 1991
PONTES NETTO, D., ZANLUCHI, A. T., YANAKA, E. K, SASSAHARA, M.,
OLIVEIRA, A M. Micotoxinas em alimentação animal no período de maio de 1997 a
março de 2001 no Laboratório de Toxicologia Veterinária da Universidade Estadual de
Londrina - Londrina - PR. Semina: Ciências Agrárias . v.23, n.01, p.63 - 69, 2002.
SCUSSEL, M. Micotoxinas em alimentos. Florianópolis : Insular, 1998. 144p.
SOARES, L. M. V., RODRIGUEZ – AMAYA, D. B. Survey of aflatoxin A, zearalenona,
and Sterigmatocystin in some brazilian foods by using multi-toxin then-layer
chromatographic method. J. Assoc. Off. Anu. Chem., 72, p.22 – 26, 1989
35
APÊNDICE 1 – Quadro detalhado das amostras de ração comercial para peixes em propriedades piscícolas da região Norte e Oeste do Estado do Paraná, colhidas no período de setembro de 2003 a julho de 2004.
amostra
Estação climática da
colheita Procedência
Tipo de processamento
comercial Estocagem
(dias) Aflatoxina
(µg/kg) Ocratoxina
(µg/kg) 1 inverno Londrina extrusada 20 neg neg 2 inverno Londrina extrusada 20 AfB1*= 8,6 117,24 3 inverno Londrina farelada 60 AfB1*= 8,6 175,8 4 inverno Bandeirantes extrusada 6 negativo negativo
5 inverno Rancho Alegre farelada 13 negativo
negativo
6 primavera Astorga peletizada 120 AfB1*= 8,6 negativo 7 primavera Londrina extrusada 70 negativo negativo 8 primavera Cambara extrusada 10 negativo negativo 9 primavera Cambara extrusada 60 negativo negativo
10 primavera Cambara extrusada 90 negativo 117,24 11 primavera Cambara extrusada 14 negativo negativo 12 primavera Assai extrusada 12 negativo negativo 13 primavera Assai extrusada 12 AfG1*= 7,84 negativo 14 primavera Assai extrusada 10 AfG1*= 7,84 negativo
15 primavera Assai extrusada
12 AfG1*= 7,84 AfB2*=8,38
negativo
16 primavera Assai peletizada 12 AfB2*=8,38 negativo 17 primavera Assai peletizada 70 negativo negativo 18 primavera Arapongas peletizada 60 AfB2*=8,384 negativo 19 primavera Arapongas peletizada 60 AfB1*=8,16 negativo 20 primavera Arapongas extrusada 14 negativo negativo 21 primavera Guaira peletizada 150 negativo negativo 22 primavera Guaira peletizada 150 negativo negativo 23 primavera Guaira farelada 150 AfB1*=8,16 negativo 24 primavera Guaira extrusada 10 AfB1*=8,16 negativo 25 primavera Guaira extrusada 90 negativo negativo 26 primavera Guaira farelada 30 negativo negativo 27 primavera Guaira farelada 30 negativo negativo 28 verao Londrina extrusada 60 negativo negativo 29 verao Londrina extrusada 60 negativo negativo 30 verao Londrina extrusada 60 negativo negativo 31 verao Londrina extrusada 45 negativo negativo 32 verao Londrina extrusada 40 negativo negativo 33 verao Londrina extrusada 40 negativo negativo 34 verao Londrina farelada 3 negativo negativo
36
Continuação Anexo 1.
amostra
Estação climática da
colheita Procedência
Tipo de processamento
comercial Estocagem
(dias) Aflatoxina
(µg/kg) Ocratoxina
(µg/kg) 35 verao Londrina extrusada 50 negativo negativo 36 verao Londrina extrusada 23 negativo negativo 37 verao Londrina extrusada 90 negativo negativo 38 verao Londrina extrusada 90 negativo negativo 39 verao Londrina extrusada 98 negativo negativo 40 verao Londrina extrusada 60 negativo negativo 41 verao Londrina extrusada 60 negativo negativo 42 verao Londrina extrusada 60 negativo negativo 43 verao Londrina extrusada 60 negativo negativo 44 verao Londrina extrusada 45 negativo negativo 45 verao Londrina extrusada 40 AfG2*=8,35 negativo 46 verao Londrina extrusada 40 negativo negativo 47 outono Maringá extrusada 50 negativo negativo 48 outono Maringá extrusada 30 negativo negativo 49 outono Maringá extrusada 12 negativo negativo 50 outono Maringá extrusada 6 negativo negativo 51 outono Maringá extrusada 2 negativo negativo 52 outono Maringá extrusada 18 negativo negativo 53 outono Maringá extrusada 1 negativo negativo 54 outono Maringá extrusada 13 negativo negativo 55 outono Maringá extrusada 20 negativo negativo 56 outono Maringá extrusada 8 negativo negativo 57 outono Guaira extrusada 7 negativo negativo 58 outono Guaira extrusada 50 negativo negativo 59 outono Guaira extrusada 11 negativo negativo 60 outono Guaira extrusada 26 negativo negativo 61 outono Guaira peletizada 90 negativo negativo 62 outono Guaira extrusada 17 negativo negativo 63 outono Guaira farelada 51 negativo negativo 64 outono Guaira farelada 24 AfB1*=8,16 negativo 65 outono Guaira farelada 18 negativo negativo 66 outono Guaira extrusada 14 negativo negativo 67 outono Guaira extrusada 6 negativo negativo
68 outono Guaira peletizada 22 AfB2*=8,384 AfG1*=8,38
negativo
69 outono Guaira extrusada 30 negativo negativo 70 outono Guaira peletizada 43 negativo negativo 71 outono Arapongas extrusada 28 negativo negativo
37
Continuação Anexo 1.
amostra
Estação climática da
colheita Procedência
Tipo de processamento
comercial Estocagem
(dias) Aflatoxina
(µg/kg) Ocratoxina
(µg/kg) 72 outono Bandeirantes peletizada 7 negativo negativo
73 outono Cornélio Procópio
extrusada 15
negativo
negativo
74 outono Goioere extrusada 18 negativo negativo
75 outono Goioere
peletizada 27 AfB2*=8,38 AfG1*=8,38
negativo
76 outono Goioere peletizada 27 negativo negativo 77 outono Goioere peletizada 29 negativo negativo 78 outono Goioere peletizada 14 negativo negativo 79 outono Goioere peletizada 14 AfG1*=8,38 negativo 80 outono Goioere extrusada 77 negativo negativo 81 inverno Cambara extrusada 60 negativo negativo 82 inverno Andirá extrusada 42 negativo negativo 83 inverno Andirá extrusada 33 negativo negativo 84 inverno Andirá extrusada 21 negativo negativo 85 inverno Andirá extrusada 18 negativo negativo 86 inverno Guaira extrusada 18 negativo negativo 87 inverno Guaira extrusada 90 negativo negativo 88 inverno Guaira extrusada 60 negativo negativo 89 inverno Guaira extrusada 70 negativo negativo 90 inverno Guaira extrusada 21 negativo negativo 91 inverno Londrina extrusada 6 negativo negativo 92 inverno Londrina peletizada 102 negativo negativo 93 inverno Londrina extrusada 38 negativo negativo 94 inverno Londrina farelada 120 negativo negativo 95 inverno Londrina extrusada 50 negativo negativo 96 inverno Londrina extrusada 22 negativo 28,8 97 inverno Londrina extrusada 9 AfG1*=26,49 28,8 98 inverno Londrina extrusada 18 negativo negativo 99 inverno Londrina extrusada 24 negativo 57,6
100 inverno Londrina farelada 51 negativo negativo
*AfB1 = Aflatoxina B1 *AfB2 = Aflatoxina B2 *AfG1 = Aflatoxina G1 *AfG2 = Aflatoxina G2
38
ANEXO 2 - Técnica de extração de micotoxinas para a Cromatografia em Camada Delgada (SOARES E RODRIGUES-AMAYA, 1989)
Cinqüenta gramas (50g) da amostra são pesadas e processadas em liquidificador
com 270 mL de metanol (PA) e 30 mL de clorato de potássio (KCL) a 4%, durante 5
minutos. Em seguida a mistura é filtrada, transferindo-se 150 mL desta para um erlenmeyer
de 500 mL. Adicionam-se 150 mL de clarificante (solução de sulfato de amônia –
(NH4)2SO4 – a 30%), 50g de terra de diatomácea (celite) e homogeneíza-se a mistura, que é
novamente filtrada.Transferem-se 150 mL do filtrado para um funil do de separação de 500
mL, juntamente com 150 mL de água destilada. Adicionam-se 10 mL de clorofórmio (PA),
agitando-se manualmente por três minutos. Após a separação das fases, recolhem-se 5mL
da fase inferior (micotoxina+clorofórmio) em um tubo de ensaio, posteriormente protegido
com papel laminado. Adicionam-se mais 10 mL de clorofórmio (PA), agitando-se
manualmente por mais três minutos e retirando-se mais 5 mL da fase inferior, que são
adicionados aos 5 mL da primeira partição, totalizando 10 mL de amostra de amostra. O
extrato é evaporado em banho-maria a 80ºC e guardado em freezer ou congelador até a
revelação em placa de cílica gel comercial sobre suporte de alumínio.
Para a revelação, o extrato é ressuspendido com 200 µL de clorofórmio (PA), e após
30 segundo em banho ultra-sônico, distribuído em uma placa de sílica gel, em dois pontos
de 5 µL. Sobre um destes pontos sobrepõe-se mais 3 µL dos padrões de aflatoxina que
também são distribuídos em pontos de 2, 4 e 6 µL, assim como os outro padrão de
ocratoxina.
A placa de sílica gel é colocada em uma cuba para cromatografia previamente
saturada com solução de tolueno: acetato de etila: clorofórmio: ácido fórmico (35 +
25+25+10 mL), sendo removida após 12 cm de desenvolvimento e seca em temperatura
ambiente(GIMENO, 1979). A leitura é realizada observando-se a placa sob luz ultravioleta
( onda longa de 365 nm para aflatoxina e ocratoxina; curta de 256 nm para Zearalenona
39
após pulverização com cloreto de alumínio a 20%), e comparando-se a fluorescência da
amostra em relação à fluorescência dos padrões.
A confirmação para aflatoxina é feita com TFA (ácido trifluoracetato): divide-se a
placa verticalmente e em cada lado, um ponto de amostra e outro de padrão. Em um dos
lados sobrepõem-se 1µL de TFA aos pontos de amostra e padrão. a placa é aquecida por 10
minutos a 35 - 40ºC, depois desenvolvida em clorofórmio-acetona. Leitura em UV longa. A
aflatoxina aparecerá com Rf bem próximo ao “spot”.
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ANEXO 3 – Materiais utilizados na técnica de Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
a) Equipamentos e acessórios:
• Lâmpada UV de 365 nm (onda longa), marca UVP, modelo UVLS-28
• Liquidificador, Black&Decker, modelo PowerProTM
• “Banho-maria”, temperatura controlada, aço inox, marca Fisatom, modelo 550
• Pipeta de 200 mL, marca Gilson, modelo Pipetman F &n bsp
• Balança analítica CA Bell, cap. 310 g, mínimo 1mg, reprodutibilidade 1mg
• Lavadora Ultrasonic Cleaner computadorizada
b) Vidraria
• Erlenmeyer graduado 250 mL
• Erlenmeyer graduado 500 mL
• Proveta, graduada, com bico, base sextavada
• Proveta, graduada, com bico, base sextavada
• Proveta, graduada, com bico, base sextavada, 500 mL
• Funil analítico, plástico, 12 cm diâmetro
• Funil de separação, bola, rolha de vidro, torneira de polietileno, 500 mL
• Microsseringa 10µL
• Cuba cromatográfica para placas de 20 x 20 cm, vidro,
• Pulverizador para placas cromatográficas
c) Reagentes e soluções:
• Metanol (PA)
• Solução de cloreto de potássio (kcl) 4% em água destilada
41
• Solução de sulfato de amônia (NH4)2SO4 a 30% em água destilada
• Celite
• Clorofórmio (PA)
• Tolueno (PA)
• Acetato de etila (PA)
• Ácido fórmico (PA)
• Solução de acido sulfúrico (1:3) em água destilada
• Solução de cloreto de alumínio (20g de AlCl3. 6H2O em 100 mL de etanol 74%
42
ANEXO 4 – Legislação sobre Micotoxinas em alimentos e matérias primas.( www.micotoxinas.com.br)
BRASIL
Alimentos para consumo humano
Ministério da Saúde: Resolução RDC no 274, da ANVISA, de 15 de outubro de 2002,
publicada no Diário Oficial da União, de 16/10/2002:
Amendoim (com casca, descascado, cru ou tostado) pasta de amendoim (pasta de
amendoim ou manteiga de amendoim):
Aflatoxinas B1+B2+G1+G2 = 20 µg/kg (ppb)
Milho em grão (inteiro, partido, amassado, moído, farinhas e sêmolas):
Aflatoxinas B1+B2+G1+G2 = 20 µg/kg (ppb)
Leite fluido: Aflatoxina M1 = 0,5 µg/L (ppb)
Leite em pó: Aflatoxina M1 = 5,0 µg/L (ppb)
Ministério da Agricultura. Portaria MAARA No.183 de 21 de março de 1996, publicada no
Diário Oficial da União de 25 de março de 1996, Seção I, página 4929:
Aflatoxinas B1+B2+G1+G2 = 20 µg/kg µg/kg
OBS. Esta Portaria internalizou as normas do MERCOSUL GMC/RES. No. 56/94
Alimentos para consumo animal: matérias primas e rações
Ministério da Agricultura. Portaria MA/SNAD/SFA No. 07, de 09/11/88 - publicada no
Diário Oficial da União de 09 de novembro de 1988 - Seção I, página 21.968, 1988:
Para qualquer matéria prima a ser utilizada diretamente ou como ingrediente para rações
destinadas ao consumo animal:
Aflatoxinas(máximo) =50 µg/kg
OBS.: O MA não especifica quais metabólitos mas, depreende-se que seja a somatória de
B1+B2+G1+G2. O limite é valido para toda e qualquer produto, seja para alimentação
43
direta ou como ingrediente para rações.
A Portaria citada especifica quais os produtos nela enquadrados.
MERCOSUL
Legislação comum a todos integrantes
GMC / RES. No.56/94
Leite fluido: AFM1 = 0,5 µg/l (ppb)
Leite em pó: AFM1 = 5,0 µg/kg (ppb)
Milho em grão: AFs B1,B2,G1,G2 = 20 µg/kg
Farelo de milho: AFs B1,B2,G1,G2 = 20 µg/kg
Amendoim em casca e descascado, cru ou torrado: AFs B1,B2,G1,G2 = 20 µg/kg
Pastas, cremes e manteiga de amendoim: AFs B1,B2,G1,G2 = 20 µg/kg
ARGENTINA
Alimentos infantis: AFB1 = zero
Amendoim, milho e subprodutos: B1 = 5 ppb; B1B2G1G2 = 20 µg/kg
Farelo de soja = B1 = 30 µg/kg
Leite fluido e em pó: M1 = 0,05 µg/kg
Produtos lácteos: M1 = 0,5 µg/kg
URUGUAI
Aflatoxinas B1,B2,G1,G2:
Alimentos e especiarias = 20 µg/kg
Produtos de soja, amendoim, frutas secas = 30 pbb
Cacau em grão = 10 ppb;
Alimentos infantis, industrializados = 3 µg/kg
Leite e produtos lácteos: Aflatoxina M1 = 0,5 µg/kg
Milho e cevada: Zearalenona = 200 µg/kg
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Sucos de frutas: Patulina = 50 µg/kg
Arroz, cevada, café e milho: Ocratoxina A = 50 µg/kg
ESTADOS UNIDOS
Alimentos: B1,B2,G1,G2 = 20 µg/kg
Alimentos prontos de trigo: Deoxinivalenol = 1000 µg/kg
Laticínios: M1 = 0,5 µg/kg
![CARBOIDRASES EM RAÇÕES PARA FRANGOS DE CORTElivros01.livrosgratis.com.br/cp121370.pdf · C268c Carboidrases em rações para frangos de corte [manuscrito] / Diogo de Moraes Cardoso](https://img.pdfslide.net/doc/110x75/60860c7b372933149e21eca8/carboidrases-em-raes-para-frangos-de-c268c-carboidrases-em-raes-para-frangos.jpg)
