Obţinerea enzimelor de uz industrial

Surse de obţinere a proteinelor/enzimelorProteinele, cu referire specială la enzime, pot fi extrase din orice tip de

organism. În schimb, sursele folosite pentru obţinerea de enzime industriale/comerciale sunt destul de restânse din punct de vedere numeric, dar foarte diverse din punct de vedere al naturii lor: de la microorganism la plante şi chiar până la veninul de şarpe.

Din cele aproximativ 100 de enzime utilizate industrial, peste jumătate sunt obţinute din fungi şi drojdii, o treime din bacterii, iar restul se împarte între surse animale (8%) şi vegetale (4%).

Sursele microbiene sunt, în prezent, preferate deoarece:- sunt, în general, surse ieftine;- conţinutul în enzime este controlabil şi previzibil;- se folosesc materii prime ca şi compoziţie constantă şi uşor de procurat;- ţesuturile vegetale şi animale conţin mai multe componente cu potenţial dăunător decât microorganismele, şi anume compuşi fenolici (din plante), inhibitori enzimatici endogeni, proteaze.

În practică, cea mai mare parte a enzimelor microbiene provine dintr-un număr foarte limitat de genuri, cum ar fi Aspergillus sp., Bacillus sp., Kluyveromyces (mai este denumit şi Saccharomyces).

Cele mai multe tulpini utilizate au fost fie utilizate de industria alimentară mulţi ani, fie au fost obţinute prin mutaţii şi selecţie.

Producerea enzimelor industriale trebuie să ţină cont de costuri, eficienţă şi siguranţă/securitate. De aceea, se preferă tulpini înalt producătoare care produc enzime constitutive, pe care le secretă în mediul de creştere (enzime extracelulare). Dacă enzima nu este produsă în mod constitutiv, atunci inducţia trebuie să fie rapidă şi necostisitoare.

În unele cazuri, sunt necesare enzime intracelulare, ceea ce presupune, ca primă etapă, eliberarea acestora din matricea celulară.

Diagrama obţinerii enzimelor

Celule vegetaleOrgane animale

Fermentaţie microbiană Latex

Enzime Enzimeintracelulare extracelulare

Separare lichid/solid

Dezagregarea celulelor

Separare lichid/solid

depozit supernatant

deşeuri Îndepărtareacizi nucleici

Purificare

Concentrare

Stabilizare

PRODUS

Peretele celular bacterian

Peretele celular este o structură unică ce înconjoară membrana celulară. Deşi nu este prezent în cazul tuturor speciilor bacteriene (ex. lipseşte în cazul unor bacterii patogene cum sunt micoplasmele), acesta este un component celular foarte important.

Funcţiile peretelui celular (PC)- menţinerea formei caracteristice a celulei: peretele rigid compensează flexibilitatea membranei fosfolipidice şi menţine/determină forma caracteristică a celulei diferită de cea sferică (deoarece protoplaştii sunt invariabil de formă sferică este un argument în ceea ce priveşte rolul PC în determinarea formei celulei);- conferă rezistenţă mecanică celulei;- contracarează efectele presiunii osmotice: rezistenţa PC este responsabilă de evitarea acumulării de apă în interiorul celulei în condiţiile în care osmolaritatea intracelulară este mult mai mare decât osmolaritatea extracelulară; (în interiorul celulei bacteriene există o mare concentraţie de soluţii ce crează o presiune considerabilă asupra membranei, pe când în interiorul celulei, această concentraţie este redusă; conform legilor fundamentale ale fizicii, apa ar trebui să pătrundă în interiorul celulei pentru a echilibra presiunea osmotică din interiorul şi exteriorul celulei).- asigură situsuri de legare a bacteriofagilor: de ex. acizii teichoici ataşaţi de suprafaţa externă a PC fixează viruşi ce infectează bacteria;- asigură platforma rigidă pentru flageli, fibrili şi pili;- în multe cazuri, PC c conţine compuşi ce contribuie la virulenţa organismului;

- Pc este situsul de acţiune al antibioticelor: cele mai notabile antibiotice ce acţionează la acest nivel sunt cele din familia β-lactamazelor, cum este penicilina ce interferă în mecanismul de sinteză al PC.

Compoziţia PCReprezintă unul dintre cei mai importanţi factori în analiza şi

diferenţierea speciilor bacteriene.Există două tipuri de bază ale structurii PC bacterian: celulele Gram

pozitive (G+) şi Gram negative (G-), denumite astfel după bacteriologul danez ce a pus la punct procedura de colorare diferenţiată a celulelor bacteriene în funcţie de compoziţia PC. Astfel, prin colorare cu cristal violet, unele celule bacteriene se colorează în roşu (G+), iar alte celule, nu (G-).

Celulele G+ şi G- au în comun în structura PC un component, ce se întâlneşte numai în cazul bacteriilor, şi anume peptidoglicanul sau mureina.

Peptidoglicanul este un polimer compus din secvenţe de N-acetilglucozamină (NAG) şi acid N-acetil-muramic (NAM), ce alternează în structura polimerică. NAM se găseşte numai în structura PC al bacteriilor.

Lanţul polimeric alcătuit din cele două glucide este reticulat prin intermediul punţilor de aminoacizi. Astfel un lanţ lateral de 4 aminoacizi (0 tetrapeptidă) este ataşată de fiecare subunitate NAM. Punţile de reticulare sunt cel mai ades, compuse din: L-alanină, D-alanină, acid D-glutamic şi acid diamino-pimelic (DPA).

Lanţul format din NAG, NAM şi aminoacizi alcătuieşte o singură unitate de peptidoglican, care se poate lega de alte unităţi prin legături covalente, pentru a se forma polimerul. Acestuia i se conferă rezistenţă prin reticulări între aminoacidul din poziţia 3 a tetrapeptidei (acidul D-glutamic) dintr-o unitate şi aminoacidul din poziţia 4 (DPA) a glicanului următor. Gradul de reticulare determină gradul de rigiditate al polimerului.

În cazul unor bacterii G+, peptida poate fi compusă din glicină, serină, treonină.

Peptidoglicanul acoperă întreaga suprafaţă a celulei bacteriene, iar prin structura sa conferă celulei bacteriene rezistenţă şi rigiditate Pc.

Lizozimul, o enzimă hidrolitică, degradează peretele celular prin scindarea legăturilor β 1-4 ce leagă subunităţile NAM şi NAG. Penicilina scindează punţile tetrapeptidice ataşate de resturile de NAM.

PC al celulelor G+- PC al unei celule G+ este format dintr-un singur strat, având o grosime de 20-80 nm;- peptidoglicanul reprezintă 50% din greutatea celulei şi 60-90% din greutatea peretelui celular;- peptidoglicanul prezintă interpunţi peptidice;- prezenţa peptidoglicanului, ca un component major al PC, determină sensibilitatea la acţiunea lizozimului şi a penicilinei (inclusiv a derivaţilor);- conţine, de obicei, cantităţi mari de acizi teichoici încărcaţi negativ, ceea ce conferă suprafeţei bacteriene o sarcină electrică negativă şi pare a fi important în menţinerea rezistenţei PC;- acizii teichoici sunt polimeri formaţi din glicerol şi ribitol, legaţi prin grupări fosfat, şi care sunt fixaţi fie de peptidoglican, fie de lipidele membranei plasmatice (acizi lipoteichoici)- dacă peptidoglicanul este diferat, celulele G+ îşi pierd PC şi devin protoplaşti, ce pot fi menţinuţi în soluţii izotonice pentru a supravieţui;

- celulele G+ sunt caracterizate de coloraţia violetă ce se obţine în prezenţa colorantului primar Gram (cristal violet), în prezenţa unui mordant (iodură);- exemple de bacterii G+: Staphylococcus aureus şi Streptococcus cremovis (utilizat în industria laptelui).

PC al celulelor G-- are o structură mai complexă decât cea a celulelor G+;- este alcătuit din 2 arii (regiuni) separate: spaţiul periplasmatic şi stratul lipopolizaharidic;- spaţiul periplasmatic separă membrana citoplasmatică şi este un spaţiu deaschis ce conţine periplasmă compusă din enzime digestive, proteine de transport, osmoprotectori.- urmează un strat subţire de peptidoglican (2-3 nm grosime), reprezentând 5-20% din greutatea uscată a celulei;- peptidoglicanul din celulele G- conţine mai puţine reticulări şi nici o punte peptidică;- prin legături covalente se leagă de peptidoglican aşa numitele lipoproteine Braun, care prezintă o ancoră hidrofobică prin care se ataşează de membrana externă; în acest mod se realizează legarea puternică a peptidoglicanului de membrana externă;- stratul de peptidoglican este acoperit de membrana externă ce conţine diferite proteine, ca şi lipopolizaharide (LPS);- LPS este un complex de molecule ce conţine atât lipide, cât şi carbohidraţi, fiind alcătuit din 3 părţi: lipidele A, miezul polizaharidic şi lanţuri laterale “O” (antigene O)- lipidele A: derivat a două unităţi NAG de care sunt ataşaţi câte 3 acizi graşi şi care este inclusă în LPS;- de lipidele A se ataşează miezul polizaharidic, compus din 10 resturi glucidice, cele mai multe cu structuri deosebite de cele uzuale;- structura LPS se termină prin lanţurile laterale “O” (O-Side Chain), ce reprezintă scurte lanţuri polizaharidice ce variază în compoziţie, expuse la mediul exterior, cu rol în apărare imună.- LPS reprezintă încărcare negativă şi contribuie la sarcina electrică negativă totală a celulei G-;-LPS este toxic şi este un antigen ce poate produce un răspuns imun inflamatoriu (endotoxină);- membrana externă conţine un număr de proteine numite porine ce au rol în permeabilitatea relativă faţă de moleculele mici;- datorită faptului că PC al bacteriilor G- are un conţinut mare de lipide şi mic de peptidoglican, decolorarea, ce are loc după colorarea cu cristal violet, conduce la pierderea celei mai mari părţi din colorant.

Diferenţele între PC ai celulelor G+ şi G-

Proprietate G+ G-Grosimea PcNr. StraturiConţinut peptidoglicanAcizi teichoiciConţinut lipoproteineConţinut proteineConţinut lipopolizaharideSensibilitate la penicilinăSensibilitate la lizozim

20-80 nm1

>50%+

0-3%0%0%++

10 nm2

10-20%-

58%9%13%

- (nu la fel) - (nu la fel)

Peretele celular vegetal

Funcţii- previne spargerea celulelor datorită presiunii turgor;- asigură suport mecanic;- previne pierderea apei din celulă;- asigură protecţie mecanică faţă de insecte şi patogeni;- activităţile fiziologice şi biochimice din PC c contribuie la comunicarea celulă-celulă.

Pc vegetal este constituit din 3 tipuri de straturi:- lamela mijlocie- peretele primar- peretele secundar

Compoziţia PCPrincipalii componenţi ai PC sunt polizaharidele, alcătuite din

aproximativ 11 tipuri de monozaharide, inclusiv glucoza şi galactoza. Pe lângă polizaharide, se întâlnesc în compoziţia PC şi proteine, precum şi lignină.

Acidul pectic este un polimer alcătuit din aproximativ 100 molecule de acid galacturonic. Este hidrofil şi solubil în apă, fiind componentul major al lamelei mijlocii, dar fiind regăsit şi în peretele primar. Formează săruri şi punţi de săruri în prezenţa Ca2+ şi Mg2+, ce se prezintă sub formă de geluri.

Pectina este un polimer alcătuit din aproximativ 200 molecule de acid galacturonic, în care multe din grupările carboxil sunt metilate. Este mai puţin hidratată decât acidul pectic, dar este solubil în apă fierbinte. La fel ca şi acidul pectic este componentă majoră a lamelei mijlocii, dar poate fi găsită şi în structura peretelui primar.

Celuloza este un polimer al glucozei ce conţine între 1000-10.000 resturi de D-glucoză legate β 1-4. Acest polizaharid este componentul structural esenţial al pereţilor celulari primari şi secundari ai plantelor. În celuloză, fiecare rest de glucoză este rotit cu 1800 faţă de restul de glucoză vecin, de-a lungul axei lanţului, care are o structură complet extinsă, ca o panglică.

Polimerii de celuloză (60-70 lanţuri adiacente) se asociază unul cu celălalt prin legături de hidrogen intercatenare şi interacţii Van der Waals pentru a forma microfibrile cristaline înalt organizate. Buchete de asemenea microfibrile se agregă pentru a forma fibre insolubile, rezistente, caracteristice pereţilor primari şi secundari ai plantelor superioare.

Fibrele de celuloză conţin peste 500.000 molecule de celuloză (5000 resturi de glucoză/moleculă celuloză), ceea ce corespunde la aproximativ 2,5 miliarde legături de hidrogen. Chiar dacă tăria unei legături de hidrogen este 1/10 din cea a unei legături covalente, cumularea energiei de legare a 2,5 miliarde de astfel de legături este deosebit de mare. Astfel, legăturile de hidrogen inter- şi intracatenare conferă fibrelor de celuloză o duritate excepţională şi le face insolubile în apă, deoarece apa nu este capabilă să rupă aceste legături de hidrogen şi să solvateze macromoleculele, producând doar o imbibiţie a acestui polizaharid.

Amidonul este tot un polimer al glucozei, în care resturile de glucoză sunt legate α 1-4. Prezenţa legăturilor α 1-4 favorizează adoptarea unei conformaţii helicoidale neregulate, sub formă de helix de stânga. Astfel, amidonul formează structuri globulare.

Amidonul este un amestec de glucani: α-amiloza )polimer liniar al glucozei) şi amilopectina 8polimer alcătuit din 106 resturi de glucoză α 1-4, dar la fiecare 24-30 resturi de glucoză există puncte de ramificare la nivelul cărora există legături α 1-6.

La plante, amidonul nu se găseşte în PC, ci depozitat sub formă de granule, de obicei, în cloroplaste.

Hemicelulozele sunt polioze macromoleculare din PC, care însoţesc celuloza şi pectinele. Reprezintă un grup hetorogen de polizaharide ramificate, care se leagă strâns, dar necovalent la microfibrilele de celuloză şi între ele. Hemicelulozele sunt alcătuite dintr-o varietate de glucide, cum ar fi glucoza, manoza, galactoza, arabinoza, xiloza, ramnoza, fucoza şi rareori

acidul glucuronic. Catena principală lineară este alcătuită din acelaşi tip de monozaharid legat β 1-4, de la care pornesc lanţuri laterale alcătuite din alte zaharuri. Gradul de policondensare al acestor polioze este mult mai mic decât cel al celulozei.

Hemicelulozele sunt abundente în peretele primar, dar se găsesc şi în cel secundar. Lignina este un polimer fenolic, care conferă rezistenţă PC.

Proteinele structurale din compoziţia PC sunt de obicei glicoproteine, ce conţin lanţuri de carbohidraţi la nivelul unor aminoacizi. Catena principală polipeptidică este bogată în aminoacizi de tipul hidroxiprolinei, prolinei, glicinei şi lizinei. Aceasta din urmă conferă catenei peptidice sarcini electrice pozitive, datorită cărora se stabilesc interacţii electrostatice cu sarcinile negative ale acizilor pectici. Se mai pot forma şi legături de hidrogen între lanţurile de aminoacizi şi carbohidraţii din peretele celular.

Un alt tip de proteină din structura PC este extensina, ce poate forma legături covalente cu alte proteine de acelaşi fel prin resturile de tirozină.

În concluzie, compoziţia PC vegetal este astfel distribuită:- lamela mijlocie: compusă în principal din acid pectic şi alţi compuşi pectici; se întâlnesc şi proteine;- peretele primar: polizaharide pectice (30%), hemiceluloză (25%), celuloză (15-30%) ş proteine (glicoproteine) (20%);- peretele secundar: compus în principal din celuloză şi lignină, dar se mai găsesc şi hemiceluloză şi proteine.