Embed Size (px)
Citation preview
Sveučilište u Zagrebu
Prirodoslovno-matematički fakultet
Biološki odsjek
Boris Kuzman
Povezanost funkcionalnog polimorfizma gena za GluR7 podjedinicu ionotropnog glutamatnog
receptora (GRIK3) i razvoja ovisnosti o alkoholu
Diplomski rad
Zagreb, 2013. godina
Ovaj rad, izrađen na Institutu Ruđer Bošković, Zagreb, u Laboratoriju za
molekularnu neurofarmakologiju pod vodstvom dr. sc. Dubravke Švob Štrac,
znanstvene suradnice IRB, predan je na ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-
matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja zvanja magistra
eksperimentalne biologije.
Zahvaljujem svojoj mentorici, dr.sc. Dubravki Švob Štrac, koja me primila na
institut i usmjerila me k ovom projektu te je svojim znanstvenim i stručnim savjetima
oblikovala ideju i pomogla mi u izradi ovog diplomskog rada. Želim zahvaliti i svim
ostalim djelatnicima Insitituta Ruđer Bošković na razumijevanju, susretljivosti i vrlo
ugodnoj radnoj atmosferi.
Posebno se želim zahvaliti svojim roditeljima i sestri koji su me tokom čitavog
mog školovanja podupirali i poticali moju težnju k ostvarivanju sve viših i viših ciljeva.
Veliko hvala obitelji Fabijanić na bezuvjetnoj podršci i svemu što su učinili za
mene.
Hvala Andrei.
Zahvaljujem svim prijateljima i kolegama na nesebičnom razumijevanju, te što
su mi vrijeme provedeno na fakultetu uljepšali svojim prisustvom.
Hvala Maji jer zbog nje posljednje dvije godine smatram najljepšim dijelom
svoga života.
TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA
Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Diplomski rad
POVEZANOST FUNKCIONALNOG POLIMORFIZMA GENA ZA GLUR7 PODJEDINICU IONOTROPNOG GLUTAMATNOG RECEPTORA (GRIK3) I
RAZVOJA OVISNOSTI O ALKOHOLU
Boris Kuzman Rooseveltov trg 6, 10 000 Zagreb
Postoje brojni dokazi o uključenosti glutamata u akutne i kronične učinke alkohola, te pojavu ovisnosti i sindroma ustezanja, a glutamatni sustav predstavlja potencijalni cilj u liječenju alkoholizma. Nedavna istraživanja uputila su na povezanost alkoholizma i gena koji kodiraju podjedinice ionotropnih glutamatnih receptora. Cilj istraživanja bio je utvrditi postoji li u ispitanika hrvatskog podrijetla povezanost funkcionalnog polimorfizma Ser310Ala (rs6691840) smještenog u genu GRIK3, koji kodira za GluR7 podjedinicu glutamatnih kainatnih receptora, s rizikom razvoja ovisnosti o alkoholu. U tu svrhu u istraživanje je uključeno 275 ispitanika ovisnih o alkoholu, te 208 zdravih dobrovoljaca. U sklopu istraživanja željeli smo istražiti i moguće razlike u raspodjeli GRIK3 genotipova i alela između skupina ispitanika različitog spola i pušačkog statusa, te u ispitanika ovisnih o alkoholu podijeljenih s obzirom na suicidalno i agresivno ponašanje, početak zlouporabe alkohola, kao i na tip alkoholizma prema Cloningerovoj klasifikaciji. Rezultati pokazuju manju učestalost homozigotnog CC genotipa u ispitanika koji su počeli zloupotrebljavati alkohol prije 25. godine života, u odnosu na alkoholičare s kasnijim početkom zlouporabe alkohola. Daljnja istraživanja potrebna su daljnja istraživanja kako bi se razjasnila uloga gena GRIK3 u alkoholizmu. (58 stranica, 20 slika, 15 tablica, 131 literaturnih navoda, jezik izvornika: hrvatski) Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici Ključne riječi: alkoholizam; glutamatni kainatni receptor; gen GRIK3, polimorfizam; rs6691840 Voditelj: Dr. sc. Dubravka Švob Štrac, znanstvena suradnica IRB Suvoditelj: Doc. dr. sc. Domagoj Đikić, PMF Ocjenitelj: Doc. dr. sc. Domagoj Đikić, PMF Dr. sc. Dubravka Švob Štrac, znanstvena suradnica IRB Doc. dr.sc. Inga Marijanović, PMF Rad prihvaćen: 28.11.2013.
BASIC DOCUMENTATION CARD
University of Zagreb Faculty of Science Division of Biology Graduation thesis
SER310ALA FUNCTIONAL POLYMORPHISM IN THE GLUR7 IONOTROPIC GLUTAMATE RECEPTOR SUBUNIT GENE (GRIK3) AND DEVELOPMENT OF
ALCOHOL DEPENDENCE
Boris Kuzman Rooseveltov trg 6, 10 000 Zagreb
There is accumulating data suggesting an involvement of glutamate in the acute and chronic effects of alcohol, including dependence and withdrawal, and glutamatergic system is emerging as potential target for alcoholism treatment. Recent studies have suggested an association of ionotropic glutamate receptor genes with alcohol dependence. The aim of this study was to examine the association of Ser310Ala functional polymorphism (rs6691840) in the GluR7 glutamate kainate receptor subunit gene (GRIK3) with the development of alcoholism. The study included 275 alcohol-dependent patients and 208 healthy subjects. Possible differences in the frequency of GRIK3 genotypes and alleles between subjects of different gender and smoking status, as well as between alcohol-dependent patients stratified according to aggressive and suicidal behavior, age of drinking onset, and type of alcoholism according to Cloninger’s classification were also studied. The results demonstrated lower frequency of homozygous CC genotype in patients who started abusing alcohol before 25. years of age in relation to alcohol-dependent subjects with the late onset of alcohol abuse. Further studies are needed to elucidate the role of GRIK3 gene in the development of alcohol dependence.
(58 pages, 20 figures, 15 tables, 131 references, original in Croatian) Thesis deposited in Central biological library Keywords: alcoholism; glutamate kainate receptor; GRIK3 gene, polymorphism, rs6691840 Supervisor: Dubravka Švob Štrac, PhD, Research Associate, IRB Co-supervisor: Dr. Domagoj Đikić, Asst. Prof., Faculty of Science, University of Zagreb Reviewers: Dr. Domagoj Đikić, Asst. Prof., Faculty of Science, University of Zagreb Dubravka Švob Štrac, PhD, Research Associate, IRB Dr. Inga Marijanović, Asst. Prof., Faculty of Science, University of Zagreb Thesis accepted: 28.11.2013
Popis kratica
ABI – Applied Biosystems
ACD – dekstroza citratne kiseline (acid citrate dextrose)
ADH – alkohol-dehidrogenaza
ALDH – aldehid-dehidrogenaza
AMPA - α-amino-3-hidroksi-5-metil-ioksizol-4-propionična kiselina
ANOVA – jednostruka analiza varijance (one-way analysis of variance)
ASPD - antisocijalni poremećaj ličnosti (eng. antisocial personality disorder)
DA – dopamin
DNA – deoksiribonukleinska kiselina
DSM-III(IV) - Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 3rd. Edition (4th. Edition)
EDTA – etilen-diamin-tetraoctena kiselina
FRET – energetski transfer tipa Förster (Förster-type energy transfer)
GABA - γ-amino-maslačna kiselina
5–HT – serotonin
HRSD - Hamilton Rating Scale for Depression
MGB – ligand manjeg utora DNA (minor groove binder)
NAC – nucleus accumbens
NCBI – National Center for Biotechnology Information
NFQ – nefluorescencijski prigušivač (nonfluorescent quencher)
NMDA – N-metil-D-aspartat
PCR – lančana reakcija polimerazom (polymerase chain reaction)
PTSP - posttraumatski stresni poremećaj
PŽS – periferni živčani sustav
RCLB – pufer za lizu eritrocita (red cell lysis buffer)
RPM – okretaj u minuti (rotation per minute)
RT-PCR – lančana reakcija polimerazom u stvarnom vremenu (real time polymerase chain
reaction)
SCID – strukturirani klinički intervju (Structured Clinical Interview)
SDS – natrij-dodecil sulfat
SE pufer – natrij-EDTA pufer
SNP – polimorfizam jednog nukleotida (eng. single nucleotide polymorphism)
SŽS – središnji živčani sustav
TE pufer – tris-EDTA pufer
VTA – ventralno tegmentalno područje
WHO – Svjetska zdravstvena organizacija (World Health Organisation)
Sadržaj
1. Uvod .................................................................................................................................. 1
1.1. Alkoholizam ................................................................................................................ 1
1.2. Genetska komponenta alkoholizma ............................................................................ 3
1.3. Djelovanje alkohola na središnji živčani sustav ........................................................... 5
1.4. Glutamat i glutamatni receptori ................................................................................... 6
1.5. Ionotropni glutamatni receptori i alkohol ...................................................................... 9
1.6. Polimorfizam GRIK3 gena i alkoholizam ....................................................................13
2. Cilj istraživanja .................................................................................................................15
3. Materijali i metode ............................................................................................................16
3.1. Ispitanici .....................................................................................................................16
3.2. Izolacija DNA iz krvi ...................................................................................................18
3.3. Određivanje genotipova .............................................................................................20
3.4. Statistička obrada podataka .......................................................................................26
4. Rezultati ...........................................................................................................................27
4.1. Informacije o ispitanicima ...........................................................................................27
4.2. Rezultati genotipiziranja .............................................................................................28
4.2.1. Rezultati raspodjele ispitanika prema spolu .........................................................29
4.2.2. Rezultati raspodjele ispitanika prema pušačkom statusu .....................................31
4.2.3. Rezultati raspodjele ispitanika ovisnih o alkoholu ................................................34
5. Rasprava ..........................................................................................................................40
6. Zaključak ..........................................................................................................................44
Literatura ..............................................................................................................................46
1. Uvod
1.1. Alkoholizam
Alkoholizam predstavlja naviku ili ovisnost o unošenju prekomjernih količina
alkoholnih pića. Karakterizira ga prinudna i nekontrolirana primjena alkohola koja
dovodi do štetnih utjecaja na zdravlje pojedinca. Iz tog razloga, Svjetska zdravstvena
organizacija (eng. World Health Organisation, WHO) 1952. godine definirala je
alkoholizam kao bolest, a ovisnika o alkoholu kao bolesnika kod kojeg se zbog
prekomjerne i dugotrajne primjene alkoholnih pića pojavljuje psihička i fizička
ovisnost, zdravstveni problemi i narušava se socijalni i ekonomski status. Magnus
Huss je 1849. godine skovao termin alkoholizam, a kasnije je zamijenjen u medicini
80-ih godina prošlog stoljeća, prema tadašnjim DSM III (eng. Diagnostic and Statistic
Manual of Mental Disorders) kriterijima, izrazima „ovisnost o alkoholu“ i „zloupotreba
alkohola“ (American Psychiatric Association, 1987). WHO procjenjuje da na svijetu
trenutno postoji oko 140 milijuna alkoholičara (Gro Harlem Brundtland, 2001), dok se
u europskoj populaciji alkoholizam javlja s učestalošću između 2% i 12% (WHO
global status report on alcohol, 2011).
Alkoholizam se prije svega očituje kroz snažnu želju za pićem i gubitak
kontrole nad konzumacijom alkohola, rezultirajući povećanom tolerancijom na
alkohol, simptomima ustezanja, te nemogućnošću osobe da kontrolira kompulzivno
opijanje usprkos svijesti o štetnosti po njegovo zdravlje (American Psychiatric
Association, 1994). Posljedice alkoholizma (Slika 1.) su brojni medicinski i
psihijatrijski poremećaji (Caan and Belleroche, 2002). Ciroza jetre, pankreatitis,
epilepsija, alkoholna demencija, povećan rizik od nastanka kardiovaskularnih bolesti,
poremećaji u prehrani, seksualna disfunkcija, rak, brojna oštećenja središnjeg
živčanog sustava (SŽS) i perifernog živčanog sustava (PŽS), neki su od potencijalnih
medicinskih problema, a u konačnici alkoholizam može dovesti i do smrti (Testino,
2008).
1
Slika 1. Dugoročni utjecaj alkohola na pojedinca (preuzeto i prilagođeno prema web stranici: http://www.ias.org.uk/Alcohol-knowledge-centre/Health-impacts/Factsheets/Alcohols-impact-on-the-
body.aspx)
Među psihijatrijskim poremećajima najčešće se pojavljuju anksioznost i
depresija (Wetterling and Junghanns, 2000). Žene ovisne o alkoholu, osim
anksioznosti i depresije, najčešće podliježu dodatnim psihijatrijskim dijagnozama kao
što su napadi panike, bulimija, posttraumatski stresni poremećaj (PTSP) ili granični
poremećaj ličnosti, dok muškarci ovisni o alkoholu često pokazuju simptome
narcisoidnog ili antisocijalnog poremećaja ličnosti, bipolarnog poremećaja,
shizofrenije, impulzivnog ponašanja, manjka koncentracije, te hiperaktivnosti (Karoll,
2002). Pokazano je da su žene osjetljivije na fizičke i mentalne učinke alkohola u
usporedbi s muškarcima, ponajviše zbog metaboličkih i hormonalnih čimbenika
(Walter i sur., 2003).
2
Društveni problemi koji proizlaze iz alkoholizma također su ozbiljni.
Zloupotreba alkohola povezana je s povećanim rizikom kriminalnih radnji, uključujući
zlostavljanje djece, obiteljsko nasilje, silovanje, pljačku i napade (Isralowitz, 2004).
Alkoholizam je često povezan i s gubitkom zaposlenja, što dovodi do financijskih
problema (Langdana, 2009). Ponašanje alkoholičara i oslabljeno rasuđivanje u
pijanom stanju mogu imati duboki utjecaj na osobe koje ga okružuju, dovesti do
izolacije od obitelji i prijatelja, izazvati probleme u braku i razvod, te doprinijeti nasilju
u obitelji ili zapostavljanju djece što može imati dugotrajne posljedice na njihov
emocionalni razvoj (Schade, 2006).
U rizične čimbenike za razvoj alkoholizma spadaju društveno i obiteljsko
okruženje, stres, mentalno zdravlje, genetska predispozicija, dob, spol i etnička
skupina. Također je utvrđeno da su osobe s nižom razinom serotonina sklonije
alkoholizmu te da ovisnost o alkoholu ovisi i o razini aktivnosti enzima alkohol-
dehidrogenaze (ADH) i aldehid-dehidrogenaze (ALDH) (Schleifer, 2007). Ozbiljnija
trauma u djetinjstvu ili manjak potpore obitelji i vršnjaka također su povezani s
povećanim rizikom od nastanka bolesti (Enoch, 2006).
Poznato je da nakon dugotrajne zloupotrebe alkohola dolazi do razvoja
tolerancije i fizičke ovisnosti što rezultira sindromom ustezanja nakon prekida
primjene alkohola. No, točni biološki mehanizmi nastanka alkoholizma nisu
razjašnjeni.
1.2. Genetska komponenta alkoholizma
Poznato je da na rizik nastanka alkoholizma utječe složeno međudjelovanje
genetskih i okolišnih čimbenika (Bierut i sur., 2010). Pojedina istraživanja su
pokazala da se ovisnost općenito nasljeđuje u 40-70% slučajeva, dok u slučaju
ovisnosti o alkoholu ovaj postotak iznosi oko 50% (Goldman i sur., 2005). Možemo
zaključiti da genetska podloga i okolišni čimbenici imaju podjednak utjecaj na razvoj
alkoholizma. No, taj odnos varira među različitim populacijama svijeta. Naime,
poznato je da između različitih populacija u svijetu postoje genetske razlike koje
utječu na rizik nastanka ovisnosti o alkoholu (Radel and Goldman, 2001).
3
Na primjer, ljudi afričkog porijekla i neka indijanska plemena u Americi
posjeduju određene varijante gena za enzim ADH koje uzrokuju bržu razgradnju
alkohola i samim time brže nakupljanje toksičnih nusprodukata metabolizma
(acetaldehid). U takvih osoba javljaju se teži simptomi opijanja i potreban je duži
oporavak, čime se smanjuje rizik od razvoja alkoholizma (Radel i Goldman, 2001).
Kod azijskih populacija, određena varijacija enzima ALDH, uzrokuje sporiju
razgradnju toksičnih produkata i samim time produženo vrijeme oporavka od opijanja
(Thomasson i sur., 1991). Naravno, ovi genetski čimbenici ne objašnjavaju u
potpunosti razlike u stopama ovisnosti o alkoholu među različitim populacijama.
Slika 2. Lista gena uključenih u ovisnost o alkoholu i alkohol-povezanim fenotipovima (slika preuzeta iz
Kalsi i sur., 2009)
Nepostojanje klasičnog obrasca naslijeđivanja alkoholizma upućuje na
uključenost brojnih gena (Slika 2.) i njihovu interakciju s okolišem (McGue, 1999). Za
razliku od drugih supstanci koje izazivaju ovisnost i imaju vrlo specifično djelovanje,
4
alkohol široko djeluje na cijeli mozak. Tako alkohol djeluje na različite strukture
smještene u staničnim membranama, koje su uključene u unutarstanični prijenos
signala, poput receptora za neurotransmitere i neurohormone, te ionske kanaliće. To
otežava identifikaciju gena koji utječu na rizik razvoja ovisnosti o alkoholu. Smatra se
da je za sklonost razvoja alkoholizma vjerojatno odgovorno mnoštvo gena koji su dio
mnogih neurotransmitorskih sustava i puteva prijenosa signala.
Osim već prije poznatih gena uključenih u metabolizam alkohola, s ovisnošću
o alkoholu povezuju se sve više i geni dopaminskog, glutamatnog, opioidnog,
kolinskog, serotoninskog, te neurotransmitorskog sustava γ-amino-maslačne kiseline
(GABA) (Kalsi i sur., 2009; Kimura i Higuchi, 2011; Köhnke, 2008; Oroszi i Goldman,
2004), te se genotipiziranjem velikog broja polimorfizama jednog nukleotida (eng.
single nucleotide polymorphism, SNP) kroz genom otkriva šira slika povezanosti
gena s alkoholizmom.
1.3. Djelovanje alkohola na središnji živčani sustav
Primijenjen akutno, alkohol izaziva anksiolitične, sedativno-hipnotične,
ataksične, antikonvulzivne i anestetične učinke, te uzrokuje i slabljenje kognitivnih
funkcija, dok produljeno izlaganje alkoholu rezultira u razvoju ovisnosti i tolerancije na
njegove učinke (Davies, 2003). Postoje brojni dokazi o uključenosti GABA-ergičnog i
glutamateričnog sustava u akutne i kronične učinke alkohola, uključujući pojavu
ovisnosti i sindroma ustezanja, te se smatra da alkohol mijenja ravnotežu između
GABA-e, glavnog inhibicijskog neurotransmitora i glutamata, glavnog ekscitacijskog
neurotransmitora u mozgu (Dodd i sur., 2000; Kumar i sur., 2009). Pokazano je da
alkohol u središnjem živčanom sustavu povećava promet dopamina (DA) i
noradrenalina, smanjuje neurotransmisiju acetilkolina, te povećava produkciju beta-
endorfina u hipotalamusu i funkciju glicinskih receptora, inhibira aktivnost N-metil-D-
aspartat (NMDA) i drugih glutamatnih receptora, a potencira djelovanje GABA-e.
DA mezolimbički put nagrade u mozgu važan je općenito u razvoju ovisnosti,
pa tako i u ovisnosti o alkoholu (Slika 3.). Ovaj put “nagrade“ uključuje moždane
regije kao što su ventralno tegmentalno područje (VTA) srednjeg mozga, nucleus
5
accumbens (NAC), limbički sustav, orbitofrontalni korteks, amigdalu, hipokampus i
medijalni prefrontalni korteks.
Slika 3. Sagitalna sekcija mozga glodavca koja pokazuje neuroanatomske interakcije između
glutamatnog i mezolimbičkog dopaminskog sustava (slika preuzeta iz Gass and Olive, 2008.)
Sredstva ovisnosti povećavaju količinu sinaptičnog dopamina u putu nagrade,
što je popraćeno kompleksnim promjenama u mnogim neurotransmiterima uključujući
GABA-u, glutamat serotonin (5-HT), opioidne peptide i kanabinoide.
Postoji snažna ekscitatorna glutamatergična invervacija mezolimbičkog dopaminskog
puta (Slika 3.), koja predstavlja anatomsku osnovu dopamin-glutamatnih interakcija
u reguliranju učinaka sredstava ovisnosti kao i sinaptičke plastičnosti (Pulvirenti i
Diana, 2001; Tzschentke i Schmidt, 2003; Lapish i sur., 2006). Istraživanja su
pokazala da akutna primjena alkohola pobuđuje DA neurone izravno, ali i neizravno
smanjujući aktivnost GABAnergičnih neurona u VTA, te utječe i na ekscitaciju
posredovanu NMDA receptorima. Kronična izloženost alkoholu povećava osnovnu
aktivnost GABA neurona i izaziva toleranciju na inhibiciju GABA-ergičnog sustava
alkoholom (Enoch, 2008).
1.4. Glutamat i glutamatni receptori
Glutamat je kao važna signalna molekula prepoznat tek prije tri desetljeća. To
je aminokiselina - osnovna građevna jedinica proteina, koji se izgrađuju u svim 6
tjelesnim stanicama, pa tako i neuronima. Iz tog razloga se glutamat u mozgu nalazi
u visokim koncentracijama. Osamdesetih godina prošlog stoljeća znanstvenici su
otkrili specifične glutamatne receptore koji su vezali otpušteni glutamat susjednih
stanica i izazivali ekscitaciju postsinaptičkog neurona. Istraživanja su pokazala da je
glutamat, često nazivan glutaminska kiselina, najobilniji neurotransmiter u živčanom
sustavu kralježnjaka (Meldrum, 2000). Zbog uloge u sinaptičkoj plastičnosti glutamat
je uključen u kognitivne funkcije kao što su učenje i pamćenje (McEntee i Crook,
1993).
Slika 4. Glutamatergična sinapsa (slika preuzeta i prilagođena prema Gass i Olive, 2008)
Glutamat je jedna od ne-esencijalnih aminokiselina što znači da ga stanica
može sintetizirati pomoću drugih molekula, primarno α-ketoglutarata i glutamina. U
kontrastu s drugim stanicama, neuronima je glutamat, osim za metaboličku aktivnost,
potreban i za prijenos signala. Zbog toga se glutamat kao neurotransmiter skladišti u
7
sinaptičkim vezikulama. Prolaskom signala i promjenom membranskog potencijala
neurona vezikule se spajaju sa sinaptičkom membranom, a glutamat se otpušta u
sinaptičku pukotinu i veže se na postsinaptičke glutamatne receptore (Slika 4.).
Glutamatni receptori su uz glutamat primarne molekule uključene u
ekscitacijski prijenos signala (Nakanishi i Masu, 1994). Detektiraju otpuštanje
glutamata iz susjedne stanice, te prevode ekscitacijski signal i prenose ga dalje u
unutrašnjost postsinaptičke stanice. U sisavaca ih dijelimo na metabotropne i
ionotropne glutamatne receptore s obzirom na mehanizam aktivacije (Palmada i
Centelles, 1998).
Metabotropni glutamatni receptori posredno aktiviraju ionske kanale u
membrani kroz kaskadu reakcija koje uključuju G proteine. Ionotropni glutamatni
receptori pak izravno formiraju ionski kanalić. Dijelimo ih na NMDA, α-amino-3-
hidroksi-5-metil-ioksizol-4-propionična kiselina (AMPA) i kainatne receptore s
obzirom na građu podjedinica, te mehanizam djelovanja (Slika 5.). Ime su dobili po
spojevima koji se specifično vežu za njih.
Slika 5. Shematski prikaz podtipova ionotropnih glutamatnih receptora i njihovih podjedinica (slika
preuzeta i prilagođena s web stranice: http://pubs.niaaa.nih.gov/publications/arh21-2/120.pdf)
NMDA, osim glutamata, zahtijeva sekundarni depolarizirajući stimulus i
uključena je u funkcije koje aktivira više konvergentnih signala, npr. učenje i
pamćenje. AMPA i kainatni receptori su prilagođeni brzom prosljeđivanju signala, jer 8
ih izravno aktivira glutamat i zbog toga predstavljaju primarne medijatore
ekscitacijskog podražaja.
1.5. Ionotropni glutamatni receptori i alkohol
Sve veći broj literature upućuje na važnu ulogu glutamatnog sustava u
posredovanju učinka alkohola na ponašanje i patofiziologiju alkoholizma.
Predklinička istraživanja pokazuju da je glutamatna signalizacija uključena u
intoksikaciju etanolom i put nagrade, te da podliježe prilagodbama uzrokovanim
kroničnim izlaganjem alkoholu što može doprinijeti sindromu ustezanja, žudnjom i
prinudnom potražnjom koja karakterizira zloupotrebu alkohola i alkoholizam. Postoji
mnoštvo potencijalnih terapijskih ciljeva alkoholizma među kojima je i glutamatni
sustav (Spanagel i Vengeliene, 2013).
Progresivna priroda alkoholizma ukazuje da su u njega uključeni i mehanizmi
plastičnosti u mozgu koji bivaju oštećeni kroz tijek bolesti. Glutamatom-posredovana
neuroplastičnost povezivana je s razvojem alkoholizma, od socijalnog druženja uz
alkohol do kronične zlouporabe, uključujući Pavlovljevo kondicioniranje, stvaranje
alkoholom uvjetovanih navika, osjetljivost na učinke alkohola i pojavu simptoma
ustezanja (Krystal i sur., 2003). Lijekovi koji djeluju putem glutamatnog sustava mogli
bi imati nekoliko uloga u liječenju alkoholizma, poput smanjenja primjene alkohola,
potiskivanja simptoma sindroma ustezanja, te smanjenja neuroplastičnosti povezane
s intoksikacijom i ustezanjem (Krystal i sur., 2003). Prema tome, lijekovi koji se
koncentriraju na glutamatni sustav mogli bi smanjiti napredovanje poremećaja
vezanih uz alkoholizam i liječiti ih ovisno o njihovoj fazi. Jedan od postojećih lijekova
koji su istraživani vezano za liječenje alkoholizma je akamprosat koji je umjereno
učinkovit u smanjivanju zlouporabe alkohola, smanjivanju želje za alkoholom, te
produživanju apstinencije (Bouza i sur., 2004; Mann i sur., 2004; Boothby i Doering,
2005; Mason, 2005). Topamirat blokira GluR5 podjedinicu AMPA receptora (Gryder i
Rogawski, 2003; Kaminski i sur., 2004) što ga povezuje s olakšanjem simptoma
ustezanja i smanjenjem konzumacije alkohola (Komanduri, 2003; Rubio i sur., 2004;
Anderson i Oliver, 2003), gabapentin primarno pomaže ublažavanju simptoma
ustezanja (Myrick i sur., 1998; Bonnet i sur., 1999; Rustembegovic i sur., 2004; Voris 9
i sur., 2003), dok memantin djeluje kao pomoć pri detoksikaciji i ublažavanju
simptoma ustezanja (Krupitsky i sur., 2007).
Postoje dokazi o neuroadaptaciji uzrokovanoj kroničnim izlaganjem alkoholu
koja rezultira hiperglutamatergičnim stanjem, okarakteriziranim povišenom razinom
ekstracelularnog glutamata i promjenama u glutamatnim receptorima i prijenosnicima
(Krystal i sur., 2003; Tsai i Coyle, 1998) (Slika 6.).
Slika 6. Neuroadaptacija glutamatnih receptora uzrokovana kroničnim izlaganjem alkoholu (prilagođeno prema Holmes i sur., 2013)
Studije koje su koristile magnetnu rezonancu pokazale su da je razina
glutamata u hipokampusu i anteriornom cingulatnom korteksu povišena tijekom
ranog ustezanja, ali se vraća u normalnu 3 dana nakon ustezanja (Hermann i sur.,
2012; Mason i sur., 2006; Mon i sur., 2012). To ukazuje da do povišene razine
10
glutamata može doći tijekom ranog kondicioniranog ustezanja, što je potvrđeno i na
životinjama (Rossetti and Carboni, 1995).
Akutno izlaganje alkoholu inhibira funkciju NMDA receptora. Način na koji se
to događa nije u potpunosti shvaćen, ali može se pretpostaviti da zbog izravnog
vezanja alkohola ili radi djelovanja na propusnost i fosforilaciju receptora (Lovinger i
sur., 1989; Woodward, 2000). Glodavci, kronično izloženi alkoholu, također su
pokazali promjene u ekspresiji NMDA receptora u različitim regijama mozga. Rano
tijekom apstinencije dolazi do povećanja broja NMDA receptora koji se često brzo
normalizira unutar nekoliko dana od posljednje izloženosti alkoholu. (Gass i Olive,
2008; Kroener i sur., 2012; Kumari i Ticku, 1998; Ron, 2004). Unatoč tome,
smanjena ekspresija NMDA receptora i njihova sinaptička funkcija, s povezanim
promjenama ponašanja također je pronađena nakon kronične primjene alkohola
(Abrahao i sur., 2013; Holmes i sur., 2012; Meinhardt i sur., 2013).
Funkcija ionotropnih AMPA i kainatnih receptora je također osjetljiva na
alkohol, ali u manjem obujmu (Costa i sur., 2000; Dildy-Mayfield i Harris, 1992;
Lovinger i sur., 1989; Möykkynen i sur., 2003). U glodavaca, kronična izloženost
alkoholu povećava AMPA-posredovane signale u bazolateralnoj amigdali i VTA, te
povećava ekspresiju i sinaptički lokalizaciju GluA1 i GluA2 podjedinica u nucleus-u
accumbens-u i kortikalnim i dorzalnim striatalnim tkivima i kulturama (Ary i sur., 2012;
Chandler i sur., 1999; Chen i sur., 1999; Christian i sur., 2012; Heikkinen i sur., 2009;
Läck i sur., 2007; Neasta i sur., 2010; Stuber i sur., 2008; Wang i sur., 2012).
Općenito, alkohol inhibira funkcije svih ionotropnih glutamatnih receptora, ali
uloga kainatnih receptora u ovisnosti o alkoholu nije toliko dobro istražena poput
NMDA i AMPA receptora. Tek posljednjih godina pristupačnost visoko selektivnih
agonista i antagonista omogućila je istraživanje kainatnih receptora u prirodnom
okruženju. Neka od tih istraživanja pokazala su da u prisutnosti male koncentracije
etanola (5-10 mM), kainatni receptori bivaju inhibirani u neuronima hipokampusa, što
smanjuje njihov ekscitatorni učinak, posljedično smanjujući GABAergičnu transmisiju
i povećavajući ekscitaciju piramidalnih neurona. Suprotno, veće koncentracije
alkohola smanjuju inhibicijski učinak kainatnih receptora na GABAergičnu transmisiju
(Crowder i sur., 2002), inhibiraju sinaptičke signale posredovane kainatnim
receptorima u hipokampalnim CA3 piramidalnim neuronima (Weiner i sur., 1999) i 11
moduliraju funkciju drugih neuralnih proteina, uključujući GABA-A i NMDA receptore
(Carta i sur., 2003). Pretpostavlja se da je krajnji rezultat kombiniranog utjecaja
alkohola na sve ove puteve neuralna depresija (Little, 1999). Tijekom ustezanja, više
nema blokade kainatnih receptora kroničnim izlaganjem alkoholu pa smanjeni broj ili
oštećena funkcija GABA-A receptora ne mogu kompenzirati obilne glutamatergične
ekscitacije (Heinz i sur., 2003). Dok su prijašnje studije pokazale značajan akutni
učinak alkohola na ekspresiju kainatnih receptora i njihovu funkciju (Carta i sur.,
2003, Dildy-Mayfield i Harris, 1992), kronično izlaganje i visoka doze alkohola mogu
dovesti do povišenog broja kako i kainatnih, tako i NMDA receptora, posebice u
hipokampalnoj regiji što zatim uzrokuje jaču GABAergičnu transmisiju i neuralnu
depresiju. Ustezanje pridonosi visokoj ekspresiji kainatnih receptora, a to, osim
izravnih učinaka kronične primjene alkohola na GABA receptore, može pojačati nisku
GABAergičnu transmisiju. Ovo može pridonijeti pojavi i jačini sindroma ustezanja
potpomažući okidanje u hipokampalnim neuronima. Dokazano je da akutno izlaganje
alkoholu inhibira kainatne receptore u amigdali i hipokampusu, te da kod kroničnog
izlaganja dolazi do povišene funkcije kainatnih receptora u amigdali, što je povezano
s povećanom aksioznosti tijekom ustezanja (Carta i sur., 2003; Läck i sur., 2008;
Weiner i sur., 1999). Promatrano zajedno sa studijom u kojoj je pokazano da kainatni
receptori u amigdali moduliraju anksiozno ponašanje (Mozhui i sur., 2010), podaci
potencijalno pokazuju da inhibicija kainatnih receptora može biti strategija
ublažavanja ustezanja. U nekim dijelovima mozga inhibicija kainatnih receptora
utječe na stvaranje neuralnih veza tijekom razvoja mozga i anksiolitički utjecaj
etanola. Npr. takvi kainatni receptori se nalaze u piramidalnim stanicama CA3 regije
hipokampusa (Weiner i sur., 1999), te stanicama bazolateralnog dijela amigdale
(Läck i sur., 2008). Također, u centralnoj amigdali kainatni receptori prepoznati su
kao odgovorna komponenta u sustavu kondicioniranog nagrađivanja alkoholom (Zhu
i sur., 2007).
Unatoč činjenici da preostaju još mnoge studije, istraživanja glutamatnog
sustava kao cilja novih lijekova protiv alkoholizma za sada puno obećavaju.
12
1.6. Polimorfizam GRIK3 gena i alkoholizam
SNP je varijacija sekvence deoksiribonukleinske kiseline (DNA) pri kojoj se
jedan nukleotid —A, T, C ili G— u genomu razlikuje unutar biološke vrste ili sparenih
kromosoma u ljudi. SNP predstavlja najčešći oblik varijacije (90%) u odsječku DNA.
Ukoliko se manje zastupljen alel nalazi u najmanje 1% ispitivane populacije,
promjena u jednom nukleotidu može se nazvati SNP-om. Učestalost SNP-ova u
genomu je otprilike 1 na 1000 parova baza. Otkriveno je i pohranjeno preko 3
milijuna SNP-ova u bazama podataka dostupnim javnosti. U genomu čovjeka najviše
pažnje pobuđuje 50 000 - 250 000 koji utječu na funkciju ili ekspresiju gena. SNP-ovi
predstavljaju potencijalno veliko područje u otkrivanju genetskih razlika između
pojedinaca koje bi mogle biti odgovorne za različitu sklonost obolijevanja od pojedinih
bolesti (Shastry, 2002).
Određena istraživanja ukazala su na povezanost alkoholizma i Ser310Ala
polimorfizma (rs6691840) u genu GRIK3 koji kodira za podjedinicu glutamatnog
kainatnog receptora (Preuss i sur., 2006). Ta konkretna podjedinica zove se GluR7 i
nalazi se na kromosomu 1 u području 1p34-p33 (Slika 7.), blizu regije koja se
povezuje s alkoholizmom i fenotipovima vezanim uz alkoholizam (Reich i sur., 1998;
Foroud i sur., 2000; Dick i sur., 2002).
Slika 7. Kromosom 1 u ljudi s označenom lokacijom polimorfizma rs6691840 (preuzeto s web stranice
: http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=GRIK3)
In vitro GluR7 podjedinica formira funkcionalni homomerni receptorski kanal s
niskom osjetljivosti na glutamat (Schiffer i sur., 1997). Gen GRIK3 sadrži egzonsku
varijaciju nukleotida timin/guanin koja kodira za serin ili alanin na položaju 310 u N-
terminalnoj izvanstaničnoj domeni receptora (Nutt i sur., 1994), koja utječe na
desenzibilizaciju receptora (Krupp i sur., 1998) i sudjeluje u vezanju liganda (Stern-
Bach i sur., 1994; Armstrong i sur., 1998). Polimorfizam rs6691840 također je
13
povezivan s pojavom delirium tremens-a kod alkoholičara, ali ne i s epileptičnim
napadima izazvanim ustezanjem alkohola (Preuss i sur., 2006).
14
2. Cilj istraživanja
Cilj istraživanja bio je utvrditi postoji li u ispitanika hrvatskog podrijetla povezanost
funkcionalnog polimorfizma Ser310Ala (rs6691840), smještenog u genu GRIK3, koji
kodira za GluR7 podjedinicu glutamatnih kainatnih receptora, s rizikom razvoja
ovisnosti o alkoholu. U tu svrhu u istraživanje je uključeno 275 ispitanika ovisnih o
alkoholu, te 208 zdravih dobrovoljaca. U okviru istraživanja željeli smo istražili i
moguće razlike u raspodjeli GRIK3 genotipova i alela između skupina ispitanika
različitog spola i pušačkog statusa, te ispitanika ovisnih o alkoholu podijeljenih s
obzirom na suicidalno i agresivno ponašanje, početak zlouporabe alkohola, kao i na
tip alkoholizma prema Cloningerovoj klasifikaciji. Dobiveni rezultati trebali bi
pridonijeti boljem razumijevanju genetskih čimbenika uključenih u razvoj ovisnosti o
alkoholu. Naime, nove spoznaje genetske podloge ovisnosti o alkoholu mogle bi
pomoći u utvrđivanju osoba s visokim rizikom razvoja alkoholizma, što bi pridonijelo
prevenciji i ublažavanju posljedica ovog kompleksnog poremećaja. Dakako, time bi
se stekao i bolji uvid u ulogu ključnih okolišnih čimbenika u razvoju alkoholizma, a
bolje shvaćanje fizioloških mehanizama u podlozi ovisnosti o alkoholu pridonijelo bi
boljim pristupima liječenju.
15
3. Materijali i metode
3.1. Ispitanici
Istraživanje je obuhvatilo 275 osoba (221 muškaraca i 54 žena) ovisnih o alkoholu
i 208 zdravih osoba (181 muškarca i 27 žena), hrvatskog podrijetla (Tablica 1).
Tablica 1. Informacije o ispitanicima
Osobe koje su sudjelovale u ispitivanju bili su bijelci koji su potjecali iz iste
geografske regije Republike Hrvatske, odnosno iz Zagrebačke županije. Svi ispitanici
su pristali dati uzorak krvi i sudjelovati u istraživanju, što su i potvrdili svojim
pismenim informativnim pristankom. Kliničke i demografske osobine ispitanika iz
kontrolne skupine i u skupini ovisnika o alkoholu navedene su u Tablicama 2 i 3.
Osobe ovisne o alkoholu primljene su na liječenje u Psihijatrijsku bolnicu
Vrapče zbog sindroma ustezanja koji se javlja nakon prekida konzumiranja alkohola i
povezan je s alkoholizmom. Simptomi ustezanja bili su ne-psihotičnog tipa, čiji je
intenzitet dosegao najveću razinu oko tjedan dana prije prijema u bolnicu. Mnogo
ispitanika prilikom prijema u bolnicu bilo je akutno intoksificirano alkoholom. Iz tog
razloga, intervju i uzimanje uzoraka krvi primjenjivali su se najmanje 12 sati nakon
prijema na bolnički odjel, tj. kada su ispitanici bili trijezni, te prije nego što primili
terapiju psihoaktivnim lijekovima. Ispitanici su bili strukturirano klinički intervjuirani
(Structured Clinical Interview; SCID), a dijagnoza ovisnosti o alkoholu postavljena je
prema DSM-IV (eng. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th.
Edition) dijagnostičkim kriterijima Američke Psihijatrijske Udruge (eng. American
Psychiatric Association, 1994).
Uz primjenu SCID-a i psihijatrijskog intervjua, simptomi agresije tijekom života
procjenjivani su primjenom Brown-Goodwinove skale (eng. Brown–Goodwin Scale)
(Brown i sur., 1979). Primjenjivani upitnik prilagođen iz Brown-Goodwinove skale i
preveden na hrvatski jezik sastojao se od sedam bihevioralnih kategorija (Brown i
Muškarci Žene Ukupno Dob
Kontrola 181 (87,02%) 27 (12,98%) 208 (100%) 39,82 ± 0,85 Alkoholičari 221 (80,36%) 54 (19,64%) 275 (100%) 50,79 ± 0,57
16
sur., 1979) : problemi s disciplinom u vojsci; problemi s disciplinom na poslu; napadi
na druge osobe; uništavanje imovine (vlasništva, nekretnine); uhićenje radi
napadačkog ponašanja; uhićenje radi drugih zločina; zločini koji nisu rezultirali
uhićenjem. Te kategorije procijenjivane su skalom od 0 do 4 (0, bez problema; 1,
jedan problematični događaj; 2, dva ili malo problematičnih događaja; 3, tri ili
nekoliko, odnosno česti problematični događaji; 4, četiri ili više, odnosno brojni
problematični događaji). Ukupni maksimalni zbroj bodova bio je 28, a prema
Buydens-Branchey i sur., 1989, granični zbroj od 8 bodova označen je kao agresivno
ponašanje.
Ispitanici ovisni o alkoholu razvrstani su u suicidalne (koji su pokušali
samoubojstvo tijekom života) i ne-suicidalne (koji nikada nisu pokušali izvršiti
samoubojstvo). Pokušaj suicida procijenjivan je primjenom dvaju mjerila: primjenom
pitanja 4 stavke 3 Hamiltonove ocjenske ljestvice za depresiju (eng. Hamilton Rating
Scale for Depression, HRSD 17-item scale) (Hamilton, 1960) i primjenom
strukturiranog psihijatrijskog intervjua, s pitanjem koje se odnosi na pokušaj
samoubojstva tijekom života.
Tablica 2. Informacije o ispitanicima ovisnim o alkoholu
Muškarci Žene Ukupno Ovisnost o pušenju * 127 33 160
Bez ovisnosti o pušenju * 89 19 108
Rani početak konzumiranja alkohola 84 13 97
Kasni početak konzumiranja alkohola 137 41 178
Prisutnost agresivnog ponašanja 71 4 75 Odsutnost agresivnog ponašanja 150 50 200
Alkoholizam tipa I * 188 51 239 Alkoholizam tipa II * 33 2 35
Pokušaj samoubojstva tijekom života * 34 15 49 Bez pokušaja samoubojstva tijekom života * 184 39 223
* nedostaju podaci za pojedine ispitanike
Osobe ovisne o alkoholu također su grupirane prema dobi u kojoj su započele
zlorabiti alkohol, na osobe s kasnijim početkom nakon 25. godine života i na osobe s
ranim početkom zlouporabe alkohola odnosno prije 25. godine starosti. Prema
Cloningeru, osobe ovisne o alkoholu s kombinacijom ranog početka zlouporabe
alkohola i s prisutnim agresivnim ponašanjem imaju osobine alkoholizma podtipa 2, 17
dok ispitanici s kasnim početkom zlouporabe alkohola i bez agresije odgovaraju
osobama s alkoholizmom podtipa 1.
Ispitanici kontrolne skupine sakupljani su u periodu između 2005. i 2009.
godine u Kliničkom Bolničkom Centru Zagreb. Sve osobe kontrolne skupine ispunile
su upitnik o navikama pušenja i konzumacije alkohola, te o svojoj povijesti bolesti.
Kriteriji za uključivanje u istraživanje bili su: da su bez trenutnih i prijašnjih
psihijatrijskih poremećaja, da osobe trenutno ne primaju nikakvu medicinsku terapiju,
da nisu pokušale samoubojstvo, da nisu zloupotrebljavale alkohol ili sredstva
ovisnosti, da u njihovim obiteljima nije bilo psihijatrijskih poremećaja (što je utvrđeno
odgovorima sudionika o mentalnom zdravlju njihovih roditelja, baka i djedova, braće i
sestara, te djece,) da nisu u srodstvu s drugim ispitanicima, te da pripadaju nativnoj
etničkoj grupi, odnosno da predstavljaju najmanje treću generaciju koja živi u ovoj
regiji. Osobe kontrolne skupine također su grupirane prema pušačkom statusu u
pušače i nepušače, kao i osobe ovisne o alkoholu.
Tablica 3. Informacije o kontrolnim ispitanicima
Muškarci Žene Ukupno
Ovisnost o pušenju 59 10 69
Bez ovisnosti o pušenju 122 17 139
Istraživanje je provedeno u skladu s Helsinškom deklaracijom, te je odobreno od
strane Etičkog povjerenstva Psihijatrijske bolnice Vrapče i Etičkog povjerenstva
Kliničkog Bolničkog Centra Zagreb.
3.2. Izolacija DNA iz krvi
Uzorci krvi (8 ml) osobama kontrolne skupine kao i osobama ovisnim o
alkoholu izvađeni su u plastične šprice sa 2 ml ACD (engl. acid citrate dextrose)
antikoagulansa. Uzorci krvi su se pohranjivali u plastičnim epruvetama u zamrzivaču
na - 20°C. Izolacija genomske DNA iz leukocita periferne krvi napravljena je
primjenom metode isoljavanja (Miller i sur., 1988). U tu svrhu bile su potrebne
slijedeće kemikalije:
18
Pufer za lizu eritrocita (eng.Red cell lysis buffer, RCLB) 5 M NaCl
10 mM Tris, 5 mM MgCl2, 10 mM NaCl, pH=7.6
Natrij-EDTA pufer (eng. Sodium EDTA, SE-buffer) Proteinaza K (20 mg/kg)
75 mM NaCl, 25 mM Na2EDTA, pH=8.0
Natrij dodecil sulfat (SDS), 10 %, pH=7.2 Etanol, 96 % i 70%
Tris-EDTA pufer (eng. TE buffer) Izopropanol
10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH=8.0
Epruvete sa smrznutim uzorcima krvi izvana se dobro obrišu etanolom. Nakon
odmrzavanja uzorci krvi miješaju se na valjkastoj miješalici oko 20 minuta. 300 µl krvi
odvoji se u sterilnu Eppendorf mikroepruvetu od 1.5 ml, doda se 900 µl hladnog
pufera za lizu eritrocita (eng. red cell lysis buffer, RCLB), dobro promiješa na vorteks
miješalici i ostavi 10 minuta stajati na ledu. Nakon toga slijedi postupak centifugiranja
(2 minute, 13 400 x g, 4 °C) pri čemu lizirani eritrociti ostanu u supernatantu, dok se
netaknuti leukociti istalože. Mikropipetom se supernatant odvoji i baci. Talog se
pročišćava tako da se navedeni postupak resuspendiranja u puferu za lizu eritrocita i
centrifugiranja ponovi još 3 puta. Na dovoljno pročišćeni talog doda se 300 µl natrij-
EDTA pufera (eng. sodium EDTA, SE-buffer), 30 µl 10 % SDS-a, lagano promiješa te
doda 1.5 µl proteinaze K. Nakon laganog miješanja, slijedi inkubacija uzoraka 1.5 do
2 h na 56 °C uz miješanje (700 rpm) (u termomikseru), pri čemu se liziraju leukociti i
membrana jezgre. Nakon inkubacije i hlađenja uzoraka na sobnu temperaturu, doda
se 160 µl 5 mM NaCl i sve se promiješa na vorteks miješalici 10 s. Slijedi
centrifugiranje (5 minuta, 13 400 x g, 20 °C), nakon kojeg se DNA nalazi u
supernatantu, a ostali dijelovi stanične strukture u talogu. Supernatant se prelije u
novu sterilnu mikroepruvetu od 1.5 µl i doda se 800 µl hladnog izopropanola. Pri
laganom miješanju dolazi do zgušnjavanja DNA, te ona postaje vidljiva u obliku
19
netopivog spleta. Slijedi centrifugiranje (2 minute, 12 000 x g, 20 °C), nakon čega se
odlije supernatant, a na talog se doda 250 µl 75% etanola. Nakon još jednog
centifugiranja (2 minute, 12 000 x g, 20 °C) supernatant se odlije, a talog se suši na
zraku 15-30 minuta. Na talog se zatim dodaje 100 µl Tris-EDTA pufera (eng. TE
buffer), te se ostavi oko sat vremena na 37 °C uz trešnju (u termomikseru) kako bi se
DNA dobro otopila. Nakon toga uzorci DNA se pohranjuju u hladnjak na 4 °C.
3.3. Određivanje genotipova
Prisutnost baze A ili C na mjestu polimorfizma rs6691840 smještenog u genu
GRIK3 na kromosomu 1p34-p33, a koji kodiraju za GluR7 podjedinicu kainatnih
glutamatnih receptora (Tablica 4.) utvrđivana je pomoću uređaja «ABI Prism 7000
Sequencing Detection System apparatus» (ABI, Foster City, SAD) prema protokolu
koji predlaže Applied Biosystems (TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol,
2006).
Tablica 4. Informacije o markeru
Broj SNP-a (NCBI baza podataka)
Broj SNP-a (Celera baza
podataka) Smještaj SNP-a
na kromosomu 1 Promjena
nukleotida u SNPu
rs6691840 hCV25956068 1p34-p33 A/C
U tu svrhu primjenjivana je tzv. alelna diskriminacija polimorfizama u slučaju
SNP-ova uz pomoć tzv. 5' nukleazne reakcije (eng. 5' nuclease assay). Primjenom
flourogenih proba ova metoda (Slika 8.) kombinira umnažanje specifičnih odsječaka
DNA lančanom reakcijom polimeraze (eng. polymerase chain reaction, PCR) i
detekciju u jednom jedinom koraku.
20
Slika 8. Prikaz principa alelne diskriminacije SNP-ova 5' nukleaznom reakcijom (slika preuzeta
iz TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol, 2006)
U ovoj metodi, kao što su to prvi opisali (Holland i sur., 1991), hibridizacijska
proba uključena u lančanu reakciju polimeraze cijepa se 5’ nukleaznom aktivnošću
Taq DNA polimeraze samo u slučaju kada se umnaža ciljana sekvenca probe.
Korištenjem flourogene probe, koju su prvi sintetizirali (Lee i sur., 1993), cijepanje
probe može se utvrditi bez naknadne obrade rezultata PCR-a. Flourogena proba
sastoji se od oligonukleotida označenih s fluorescencijskom obilježavajućom bojom
(eng. reporter) i prigušujućom bojom (eng. quencher), koji se nalaze na suprotnim
stranama probe. U intaktnoj probi, blizina prigušujuće boje smanjuje fluorescencijski
signal koji daje obilježavajuća boja, kao rezultat energetskog transfera Förster-tipa
(eng. Förster-type enery transfer, FRET) (Förster, 1948; Lakowicz, 2007). Cijepanje
flourogene probe tijekom lančane reakcije polimerazom oslobađa obilježavajuću boju
i uzrokuje povećanje u intenzitetu njezine fluorescencije. «ABI Prism 7000
Sequencing Detection System» mjeri pojačanje u fluorescenciji tijekom ciklusa
lančane reakcije polimerazom, detektirajući akumulaciju PCR produkata u realnom 21
vremenu (eng. real-time PCR, RT-PCR) izravno u PCR reakcijskim jažicama. Za
sustav u kojem postoje 2 alela, probe specifične za svaki alel obilježene su različitim
fluorescentnim obilježavajućim bojama. Nepodudaranje između probe i ciljne
sekvence značajno smanjuje efikasnost hibridizacije i cijepanja probe. Prema tome,
značajno povećanje u FAM ili VIC fluorescentnim signalima upućuje na
homozigotnost za FAM ili VIC specifične alele, dok povećanje u oba signala upućuje
na heterozigotnost.
Za određivanje genotipa u slučaju jedne promijenjene baze (SNP) u ovom
istraživanju korišteni su predizajnirani Taqman uzorci (TaqMan® SNP Genotyping
Assays Protocol, 2006). Svaki takav uzorak sadrži kombinaciju dvaju početnica za
umnažanje ciljane polimorfne sekvence i dvaju Taqman liganda manjeg utora DNA
(eng. minor groove binder, MGB) proba za razlikovanje između dvaju alela. Svaka od
Taqman MGB proba sastoji se od obilježavajuće VIC boje na 5' kraju probe za alel 1 i
obilježavajuće FAM boje na 5' kraju probe za alel 2. MGB na 3' kraju svake probe je
modifikacija koja povećava temperaturu mekšanja (Afonina i sur., 1997) (Tm) za
danu dužinu proba (Afonina i sur., 1997; Kutyavin i sur., 1997) koja dozvoljava dizajn
kraćih proba. Kraće probe rezultiraju većim razlikama u vrijednostima temperatura
mekšanja između odgovarajućih i neodgovarajućih proba, proizvodeći jasnu alelnu
diskriminaciju. Čak i nepodudarnost u samo 1 nukleotidu između probe i ciljane
sekvence smanjuje efikasnost hibridizacije probe, što zauzvrat smanjuje količinu
obilježavajuće boje koja se odcjepljuje od stišavajuće probe. Također, AmpliTaq Gold
DNA polimeraza vjerojatnije zamjenjuje neodgovarajuću probu bez cijepanja. Svaki
od tih čimbenika smanjuje proizvodnju nespecifičnih fluorescencijskih signala. Na 3'
kraju svake probe nalazi se i neflourescencijski prigušivač (eng. nonflourescent
quencher, NFQ).
Sam postupak genotipizacije prikazan je na slici 9., a započinje odmrzavanjem
uzoraka genomske DNA i pripremom odgovarajućih razrjeđenja u destiliranoj vodi,
kako bi u konačnici u PCR reakciji bilo između 1-20 ng DNA. Nakon toga, u jažice
reakcijske pločice (eng. 96-well reaction plate) odpipetira se po 4.5 µl tako
pripremljenih uzoraka DNA. Zatim se u jažice odpipetira po 5.5 µl reakcijske
mješavine u kojoj se nalazi po 5 µl TaqMan glavne univerzalne mješavine i 0.5 µl 40
x Taqman mješavine za genotipizaciju ciljanog SNP-a (Tablica 5).
22
Nakon zatvaranja reakcijske pločice i centrifugiranja 1-2 minute na oko 5000
rpm, određivanje genotipova provodi se primjenom uređaja «ABI Prism 7000
Sequencing Detection System apparatus».
Uvjeti lančane reakcije polimerazom navedeni su u Tablici 6.
Tablica 5. Kemikalije potrebne za genotipizaciju SNP-ova
Sastojci reakcije Volumen u
jažici Konačna
koncentracija
TaqMan glavna univerzalna mješavina 5 µl 1 x 40 x Taqman mješavina za genotipizaciju
ciljanog SNP-a 0.5 µl 1 x
Genomska DNA razrijeđena u dH2O1 4.5 µl /
Ukupni reakcijski volumen 10 µl 1 1-20 ng genomske DNA
23
Slika 9. Prikaz postupka genotipizacije SNP-ova (slika preuzeta iz TaqMan® SNP Genotyping
Assays Protocol, 2006)
Tablica 6. Uvjeti PCR reakcije
Vrijeme i temperatura pojedine faze reakcije
Početni korak Denaturacija Vezanje/Produžavanje
40 ciklusa
10 min 95°C 15 sec 92°C 1 min 60°C
24
Tijekom lančane reakcije polimerazom odvijaju se slijedeći koraci:
1. Svaka Taqman MGB proba veže se specifično za svoju komplementarnu
sekvencu između mjesta za «forward» i «reverse» početnice.
2. Kada je oligonukleotidna proba intaktna, blizina obilježavajuće (eng. reporter)
boje prigušivačkoj boji rezultira u prigušivanju fluorescencije obilježavajuće
boje primarno putem energetskog transfera Förster-tipa (FRET) (Förster,
1948; Lakowicz, 2007)
3. AmpliTaq Gold DNA polimeraza produžava početnice vezane uz kalup DNA.
4. AmpliTaq Gold DNA polimeraza cijepa samo one probe koje su hibridizirale s
metom.
5. Cijepanjem se odvaja obilježavajuća od prigušujuće boje što rezultira u
pojačanoj fluorescenciji obilježavajuće boje.
6. Pojačanje fluorescencijskog signala događa se kada su pocijepane probe koje
su hibridizirale sa komplementarnom sekvencom. Fluorescencijski signal
nastao umnažanjem lančanom reakcijom polimeraze ukazuje na alele prisutne
u uzorku (Tablica 7. i Slike 10.).
Tablica 7. Korelacija između fluorescencijskih signala i sekvenca u uzorku
Značajan porast u ... Upućuje na...
Fluorescenciji samo VIC-boje Homozigotnost za alel 1
Fluorescenciji samo FAM-boje Homozigotnost za alel 2
Fluorescenciji i VIC- i FAM-boje Alel 1- alel 2 heterozigotnost
25
Slika 10. Primjer prikaza rezultata genotipizacije SNP-ova (slika preuzeta i prilagođena prema
TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol, 2006)
3.4. Statistička obrada podataka
Za statističku obradu podataka korišten je računalni program «GraphPad
Prism version 4.00 for Windows» (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Skupine uključene u istraživanje uspoređivane su prema dobi primjenom jednostruke
analize varijance (eng. One-way analysis of variance, ANOVA) i Newman-Keuls
testa. Značajnost odstupanja raspodjele genotipova i alela od očekivane (Hardy-
Weinbergova ravnoteža) određena je pomoću χ2-testa. Razlike u raspodjeli
genotipova i alela u osoba ovisnih o alkoholu i zdravih osoba, kao i između
podskupina ovisnika o alkoholu, također su određivane pomoću χ2 test-a. Statistički
značajnim smatrane su one razlike kod kojih je vjerojatnost p bila manja od 0.05.
26
4. Rezultati
4.1. Informacije o ispitanicima
Analizirano je ukupno 275 uzoraka osoba ovisnih o alkoholu, od čega 221
muškaraca i 54 žena, te 208 zdravih kontrolnih ispitanika, od čega 181 muškarca i 27
žena. Kontrolni ispitanici podijeljeni su prema pušačkom statusu, dok su ispitanici
ovisni o alkoholu osim prema ovisnosti o pušenju podijeljeni i u dodatne podskupine
na osnovu dobi početka zlouporabe alkohola, prisustva agresivnog ponašanja, tipa
alkoholizma prema Cloningerovog klasifikaciji (Cloninger i sur., 1988) i pokušaja
samoubojstva. Osnovne informacije o ispitanicima prikazane su u tablici 8.
Tablica 8. Informacije o ispitanicima
Muškarci Žene Ukupno KONTROLA 181 (87.02%) 27 (12.98%) 208 (100%)
Starost 39.40 ± 0.89 42.59 ± 2.59 39.81 ± 0.84 Ovisnost o pušenju 59 10 69
Bez ovisnosti o pušenju 122 17 139
ALKOHOLIČARI 221 (80.36%) 54 (19.64%) 275 (100%) Starost 50.27 ± 0.62** 52.90 ± 1.42*** 50.79 ± 0.57 ****
Ovisnost o pušenju * 127 33 160 Bez ovisnosti o pušenju * 89 19 108
Rani početak zlouporabe alkohola 84 13 97
Kasni početak zlouporabe alkohola 137 41 178
Prisutnost agresivnog ponašanja 71 4 75 Odsutnost agresivnog ponašanja 150 50 200
Alkoholizam tipa I * 188 51 239 Alkoholizam tipa II * 33 2 35
Pokušaj samoubojstva tijekom života * 34 15 49 Bez pokušaja samoubojstva tijekom života * 184 39 223
* nedostaju podaci za pojedine ispitanike **p < 0.0001; ***p < 0.0003; ****p< 0.0001 u odnosu na kontrolu
Grupa ispitanika ovisnih o alkoholu bila je statistički značajno starija od
kontrolne grupe (p<0,0001; Student’t-test). Jednostruka analiza varijance (One-way
analysis of variance, ANOVA; p<0,0001), pokazala je da su i muškarci (p<0,0001,
Student’ t-test ) i žene (p<0,0003, Student’ t-test) u skupini ovisnika o alkoholu bili
značajno stariji od zdravih pripadajućih kontrolnih ispitanika. Iako su u obje skupine
27
većinu sačinjavali muškarci (ovisnici 80,36%, kontrole 87,02%), raspodjela po spolu
nije se značajno razlikovala između kontrolne skupine i skupine osoba ovisnih o
alkoholu (p= 0.0525, χ2-test). Također, postojala je i značajna razlika u frekvenciji
pušača i nepušača između alkoholičara i zdravih ispitanika (p<0,0001, χ2-test),
odnosno u skupini kontrolnih ispitanika postojao je manji broj pušača nego u skupini
ispitanika ovisnih o alkoholu. Unutar grupe ovisnika o alkoholu, većina ispitanika
započela je sa zlouporabom alkohola nakon 25. godine života (61,99%). Nadalje,
osobe ovisne o alkoholu uglavnom nisu pokazivale agresivno ponašanje (72,73%) i
nisu nikada pokušale samoubojstvo (81,99%).
4.2. Rezultati genotipiziranja
U uzorcima DNA svih ispitanika genotipiziran je SNP rs6691840
(hCV25956068) koji je smješten u GRIK3 genu na kromosomu 1p34-33 (Slika 11.).
Učestalost opaženih genotipova i u skupini ovisnika o alkoholu i u kontrolnoj
skupini bile su u skladu s Hardy-Weinberg ravnotežom (Tablica 9.).
Slika 11. Primjer prikaza amplifikacijskih krivulja (izvorna slika)
28
Tablica 9. Dobivene i očekivane vrijednosti za genotipove polimorfizma rs6691840
Genotipovi AA AC CC Kontrola
p=0,198195 Dobiveno 105 80 23 Očekivano 101,08 87,84 19,08
Alkoholičari p=0,217810
Dobiveno 123 127 27 Očekivano 126,45 120,07 28,48
*ukoliko je p<0,05 rezultat nije u skladu sa HW ravnotežom
4.2.1. Rezultati raspodjele ispitanika prema spolu
Tablica 10. prikazuje učestalost uočenih genotipova i alela za polimorfizam
rs6691840 u kontrolnoj skupini i skupini ispitanika ovisnih o alkoholu koji su
prethodno grupirani po spolu.
Tablica 10. Brojnost i frekvencije genotipova i alela za SNP rs6691840 po spolu u skupini kontrolnih ispitanika i ispitanika ovisnih o alkoholu
Kontrola
AA AC CC A C
Muškarci 91 (50,28%)
71 (39,23%)
19 (10,50%)
253 (69,89%)
109 (30,11%)
Žene 14 (41,85%)
9 (33,33%)
4 (14,81%)
37 (68,52%)
17 (31,48%)
Ukupno 105 (50,48%)
80 (58,46%)
23 (11,06%)
290 (69,71%)
126 (30,29%)
Alkoholičari AA AC CC A C
Muškarci 99 (44,80%)
105 (47,51%)
17 (7,69%)
303 (68,55%)
139 (31,45%)
Žene 24 (44,44%)
22 (40,74%)
8 (14,81%)
70 (64,81%)
38 (35,19%)
Ukupno 123 (44,73%)
127 (46,18%)
25 (9,09%)
373 (67,81%)
177 (32,18%)
Za polimorfizam rs6691840 učestalost nosioca genotipa AA naspram nosioca
alela C, te nosioca genotipa CC u odnosu na nosioce alela A, unutar kontrolne grupe
i grupe alkoholičara, također prethodno podijeljenih prema spolu, prikazuje tablica
11.
29
Tablica 11. Brojnost i frekvencije nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela C i nosioca
genotipa CC u odnosu na nosioce alela A po spolu u skupini kontrolnih ispitanika i ispitanika ovisnika
o alkoholu
Kontrola AA C CC A
Muškarci 91 (50.28%)
90 (49.72%)
19 (10.50%)
162 (89.50%)
Žene 14 (51.85%)
13 (48.15%)
4 (14.81%)
23 (85.19%)
Ukupno 105 (50.48%)
103 (49.52%)
23 (11.06%)
185 (88.94%)
Alkoholičari AA C CC A
Muškarci 99 (44.80%)
122 (55.20%)
17 (7.69%)
204 (92.31%)
Žene 24 (44.44%)
30 (55.56%)
8 (14.81%)
46 (85.19%)
Ukupno 123 (44.37%)
152 (55.27%)
25 (9.09%)
250 (90.91%)
Razlike u raspodjeli genotipova i alela s obzirom na spol nisu pronađene (Slika
12.), ni unutar kontrolne skupine (pgenotipovi=0,7335; paleli=0,9629, χ2-test), ni u skupini
ovisnika o alkoholu (pgenotipovi=0,2401; paleli=0,4561,χ2-test ).
Slika 12. Raspodjela genotipova (gore) i alela (dolje) po spolu u skupini kontrolnih ispitanika i
ispitanika ovisnih o alkoholu
muški ženski0
25
50
75
100
125
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u s
poj
edin
im g
enot
ipom
AAACCC
muški ženski0
25
50
75
100
125
broj
kon
trol
nih
osob
as
poje
dini
m g
enot
ipom
AA
ACCC
muški ženski0
50
100
150
200
broj
kon
trol
nih
osob
as
poje
dini
m a
lelo
m
AC
muški ženski0
50
100
150
200
250
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
us
poje
dini
m a
lelim
a
AC
30
muški ženski0
25
50
75
100br
oj k
ontr
olni
h no
sioc
age
notip
a A
A n
aspr
am C
AAC
muški ženski0
50
100
150
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u n
osio
ca g
enot
ipa
AA
nas
pram
C AAC
muški ženski0
50
100
150
200
broj
kon
trol
nih
nosi
oca
geno
tipa
CC
nas
pram
A
CCA
muški ženski0
50
100
150
200
250
broj
oso
ba o
v isn
i h o
al k
oho l
u n
osio
ca g
enot
i pa
CC
nas
p ram
A CCA
Slika 13. Raspodjela nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela C, odnosno nosioca genotipa
CC u odnosu na nosioce alela A po spolu u skupini kontrolnih ispitanika i ispitanika ovisnih o alkoholu
Razlike u raspodjeli nosioca alela AA, odnosno CC ni u grupi ovisnika o
alkoholu (pAA=0,9628; pCC=0,1027, χ2-test), ni u kontrolnoj skupini (pAA=0,8786;
pCC=0,5046, χ2-test, nisu pronađene (Slika 13.). Iz tog razloga u daljnjim analizama
ispitanici nisu bili dijeljeni u odnosu na spol. Obrađeni podaci genotipizacije nisu
ukazali na postojanje statistički značajne razlike u raspodjeli pojedinih genotipova,
alela i nosioca alela CC odnosno AA polimorfizma rs6691840 između ispitanika
ovisnih o alkoholu i zdravih osoba (pgenotipovi=0,2301; paleli=0,4821; pAA=0,2098;
pCC=0,4743, χ2-test).
4.2.2. Rezultati raspodjele ispitanika prema pušačkom statusu
Brojnost i frekvencije genotipova i alela za polimorfizam rs6691840 kod
zdravih ispitanika i ispitanika ovisnih o alkoholu, podijeljenih prema pušačkom
statusu, navedeni su u tablicama 12.
31
Tablica 12. Brojnost i frekvencije genotipova i alela za SNP rs6691840 kod pušača i nepušača unutar skupina alkoholičara i kontrolnih ispitanika
Kontrola
AA AC CC A C
pušači 39 (56,52%)
24 (34,78%)
6 (8,69%)
102 (73,91%)
36 (26,09%)
nepušači 66 (47,48%)
56 (40,29%)
17 (12,23%)
188 (67,63%)
90 (32,37%)
Alkoholičari AA AC CC A C
pušači 78 (48,75%)
70 (43,75%)
12 (7,50%)
226 (70,63%)
94 (29,38%)
nepušači 44 (40,74%)
52 (48,15%)
12 (11,11%)
140 (64,81%)
76 (35,19%)
Tablica 13. prikazuje podatke o učestalosti nosioca genotipa AA naspram
nosioca alela C, te nosioca genotipa CC u odnosu na nosioce alela A, unutar
kontrolne grupe i grupe alkoholičara podijeljenih prema pušačkom statusu.
Tablica 13. Brojnost i frekvencije nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela C i nosioca genotipa
CC u odnosu na nosioce alela A kod pušača i nepušača u kontrolnoj grupi i grupi alkoholičara
Kontrola AA C CC A
pušači 39 (56,52%)
30 (43,48%)
6 (8,70%)
63 (91,30%)
nepušači 66 (47,48%)
73 (52,52%)
17 (12,23%)
122 (87,77%)
Alkoholičari AA C CC A
pušači 78 (48,75%)
82 (51,25%)
12 (7,50%)
148 (92,50%)
nepušači 44 (40,74%)
64 (59,26%)
12 (11,11%)
96 (88,89%)
Među podacima nije nađena statistički značajna razlika u raspodjeli određenih
genotipova i alela između kontrolne skupine ispitanika (pgenotipovi=0,4425;
paleli=0,1889, χ2-test) i ispitanika ovisnih o alkoholu (pgenotipovi=0,3462; paleli=0,1563,
χ2-test) kada ih usporedimo kao pušače i nepušače (Slika 14.)
32
pušači nepušači0
25
50
75
100br
oj k
ontr
olni
h os
oba
s po
jedi
nim
gen
otip
om
AA
ACCC
pušači nepušači0
25
50
75
100
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u s
poj
edin
im g
enot
ipom
AAACCC
pušači nepušači0
50
100
150
broj
kon
trol
nih
osob
as
poje
dini
m a
lelo
m
AC
pušači nepušači0
50
100
150
200
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
us
poje
dini
m a
lelim
a
AC
Slika 14. Raspodjela genotipova (gore) i alela (dolje) između pušača i nepušača u skupini kontrolnih
ispitanika i ispitanika ovisnih o alkoholu
pušači nepušači0
25
50
75
100
broj
kon
trol
nih
nosi
oca
gen
otip
a A
A n
aspr
am C
AAC
pušači nepušači0
25
50
75
100
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u n
osio
ca g
enot
ipa
AA
nas
pram
C AAC
pušači nepušači0
50
100
150
broj
kon
trol
nih
nosi
oca
geno
tipa
CC
nas
pram
A
CCA
pušači nepušači0
50
100
150
200
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u n
osio
ca g
enot
ipa
CC
nas
pram
A CCA
Slika 15. Raspodjela nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela C, odnosno nosioca genotipa CC u odnosu na nosioce alela A između pušača i nepušača u skupini kontrolnih ispitanika i ispitanika
ovisnih o alkoholu
33
S obzirom na pušački status, između kontrolne skupine (pAA=0,2195;
pCC=0,4441, χ2-test) i skupine alkoholičara (pAA=0,1966; pCC=0,3099, χ2-test),
statistički značajna razlika nije pronađena ni kod raspodjele nosioca alela AA
odnosno CC (Slika 15.).
4.2.3. Rezultati raspodjele ispitanika ovisnih o alkoholu
Ovisnici o alkoholu nadalje su razvrstani u podskupine s obzirom na rani,
odnosno kasni početak zlouporabe alkohola (prije ili nakon 25. godine), prema
prisutnosti agresivnog i suicidalnog ponašanja, te s obzirom na tip alkoholizma prema
Cloningerovoj klasifikaciji. Brojnost i frekvencije genotipova i alela svake od pojedinih
podskupina ispitanika ovisnih o alkoholu navedene su u tablici 14.
Tablica 14. Brojnost i frekvencije genotipova i alela za SNP rs6691840 u različitim podskupinama
ispitanika ovisnih o alkoholu
Alkoholičari
AA AC CC A C
Rani početak zlouporabe alkohola 42 (42,86%)
52 (53,06%)
4 (4,08%)
136 (69,39%)
60 (30,61%)
Kasni početak zlouporabe alkohola 81 (45,76%)
75 (42,37%)
21 (11,87%)
237 (66,95%)
117 (33,05%)
Prisutnost agresivnog ponašanja 35 (47,30%)
31 (41,89%)
8 (10,81%)
101 (68,24%)
47 (31,76%)
Odsutnosti agresivnog ponašanja 87 (43,50%)
96 (48,00%)
17 (8,50%)
270 (67,50%)
130 (32,50%)
Pokušaj suicida tijekom života 21 (42,96%)
22 (44,90%)
6 (12,24%)
64 (65,31%)
34 (34,69%)
Bez pokušaja samoubojstva tijekom života
101 (44,89%)
105 (46,67%)
19 (8,44%)
307 (68,22%)
143 (31,78%)
Alkoholizam tip I 107 (44,77%)
108 (45,19%)
24 (10,04%)
322 (67,36%)
156 (32,54%)
Alkoholizam tip II 16 (45,71%)
18 (51,43%)
1 (2,86%)
50 (71,43%)
20 (28,57%)
U tablici 15. prikazana je učestalost nosioca genotipova AA u odnosu na
nosioce alela C, te nosioce genotipa CC u odnosu na nosioce alela A, za svaku
podskupinu alkoholičara.
34
Tablica 15. Brojnost i frekvencije nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela C i nosioca genotipa CC u odnosu na nosioce alela A u različitim podskupinama ispitanika ovisnih o alkoholu
Alkoholičari AA C CC A
Rani početak zlouporabe alkohola 42 (42,86%)
56 (57,14%)
4 (4,08%)*
94 (95,92%)
Kasni početak zlouporabe alkohola 81 (45,76%)
96 (54,24%)
21 (11,86%)
156 (88,14%)
Prisutnost agresivnog ponašanja 35 (47,30%)
39 (52,70%)
8 (10,81%)
66 (89,19%)
Odsutnosti agresivnog ponašanja 87 (43,50%)
113 (56,50%)
17 (8,50%)
183 (91,50%)
Pokušaj suicida tijekom života 21 (42,86%)
28 (57,14%)
6 (12,24%)
43 (87,76%)
Bez pokušaja samoubojstva tijekom života 101 (44,89%)
124 (55,11%)
19 (8,44%)
206 (91,56%)
Alkoholizam tip I 107 (44,74%)
132 (55,23%)
24 (10,04%)
215 (89,96%)
Alkoholizam tipa II 16 (45,71%)
19 (54,29%)
1 (2,86%)
34 (97,14%)
* frekvencija nosioca genotipa CC je značajno različita (p=0,0344, χ2-test ) između skupine alkoholičara s ranim početkom zlouporabe alkohola i alkoholičara s kasnim početkom zlouporabe alkohola
35
Raspodjela genotipova, alela i nosioca homozigotnih genotipova AA, tj. CC s
obzirom na prisutnost agresije u ispitanika ovisnih o alkoholu prikazana je na slici 16.,
a obrada podataka nije pokazala nikakvu statistički značajnu razliku
(pgenotipovi=0,6294; paleli=0,7942; pAA=0,5039; pCC=0,5778 , χ2-test).
bez agresije s agresijom0
25
50
75
100
bro
j oso
ba
ovi
snih
o a
lko
ho
lu s
po
jed
inim
gen
oti
po
m
AAACCC
bez agresije s agresijom0
50
100
150
200
bro
j os
ob
a o
vis
nih
o a
lko
ho
lus
po
jed
inim
ale
lima
AC
s agresijom bez agresije0
50
100
150
bro
j os
ob
a o
vis
nih
o a
lko
ho
lu n
osi
oca
gen
oti
pa
AA
nas
pra
m C AA
C
s agresijom bez agresije0
50
100
150
200
bro
j os
ob
a o
vis
nih
o a
lko
ho
lu n
osi
oca
gen
oti
pa
CC
nas
pra
m A CC
A
Slika 16. Raspodjela genotipova (lijevo gore), alela (desno gore) i nosioca genotipa AA u
odnosu na nosioce alela C, odnosno nosioca genotipa CC u odnosu na nosioce alela A (dolje) prema
prisutnosti agresije u skupini ispitanika ovisnih o alkoholu
36
Na slici 17. prikazano je da statistički značajna razlika u raspodjeli genotipova,
alela i nosioca homozigotnih genotipova AA, odnosno CC nije pronađena između
osoba podijeljenih s obzirom na pokušaj suicida unutar skupine ispitanika ovisnih o
alkoholu (pgenotipovi=0,7139; paleli=0,5546; pAA=0,7564; pCC=0,4138, χ2-test ).
suicid bez suicida0
25
50
75
100
125
150
broj
oso
ba
ovis
nih
o a
lko
holu
s p
oje
din
im g
eno
tipo
m
AAACCC
suicid bez suicida0
50
100
150
200
250
broj
oso
ba
ovis
nih
o a
lko
holu
s po
jed
inim
ale
lima
AC
suicid bez suicida0
25
50
75
100
125AAC
broj
oso
ba
ovis
nih
o a
lko
holu
nos
ioca
gen
otip
a A
A n
aspr
am C
suicid bez suicida0
50
100
150
200
250
broj
oso
ba
ovis
nih
o a
lko
holu
nos
ioca
gen
otip
a C
C n
aspr
am A CC
A
Slika 17. Raspodjela genotipova (lijevo gore), alela (desno gore) i nosioca genotipa AA u odnosu na
nosioce alela C, odnosno nosioca genotipa CC u odnosu na nosioce alela A (dolje) s obzirom na pokušaj suicida u skupini ispitanika ovisnih o alkoholu
37
S obzirom na Cloningerovu podjelu prema tipu alkoholizma, kod ispitanika
ovisnih o alkoholu također nije pronađena statistički značajna razlika u raspodjeli
genotipova, alela i nosioca genotipa AA i CC (pgenotipovi=0,3694; paleli=0,4964;
pAA=0,9164; pCC=0,1680, χ2-test). To je grafički prikazano na slici 18.
tip 1 tip 20
25
50
75
100
125
150
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u s
poj
edin
im g
enot
ipom
AAACCC
tip 1 tip 20
50
100
150
200
250
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
us
poje
dini
m a
lelim
a
AC
tip 1 tip 20
25
50
75
100
125
150
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u n
osio
ca g
enot
ipa
AA
nas
pram
C AAC
tip 1 tip 20
50
100
150
200
250
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u n
osio
ca C
C n
aspr
am A
CCA
Slika 18. Raspodjela genotipova (lijevo gore), alela (desno gore) i nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela C, odnosno nosioca genotipa CC u odnosu na nosioce alela A (dolje) s obzirom na tip
alkoholizma prema Cloningeru u skupini ispitanika ovisnih o alkoholu
Između ispitanika ovisnih o alkoholu s ranim početkom zlouporabe alkohola i
alkoholičara s kasnim početkom zlouporabe alkohola, obrađeni podaci raspodjele
genotipova, alela i nosioca genotipa AA pokazali su da ne postoji statistički značajna
razlika (pgenotipovi=0,0651; paleli=0,5210; pAA=0,2164; χ2-test). Međutim, analiza
podataka kod nosioca genotipa CC otkrila je da postoji statistički značajna razlika u
frekvenciji homozigotnog CC genotipa (pCC=0,0344, χ2-test). Ispitanici ovisni o
alkoholu koji su počeli zlorabiti alkohol nakon 25. godine imaju značajno veću
frekvenciju CC genotipa, u odnosu na alkoholičare s ranim početkom zlouporabe
alkohola. Grafički je to prikazano na slici 19. i 20.
38
rani početak kasni početak0
25
50
75
100
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
o hol
u s
po j
edin
i m g
enot
ipom
AAACCC
rani početak kasni početak0
50
100
150
200
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
us
poje
dini
m a
lelim
a
AC
rani početak kasni početak0
102030405060708090
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u n
osio
ca g
enot
ipa
AA
nas
pram
C AAC
rani početak kasni početak0
50
100
150
200
broj
oso
ba o
visn
ih o
alk
ohol
u n
osio
ca g
enot
ipa
CC
nas
pram
A CCA
* *
Slika 19. Raspodjela genotipova (lijevo gore), alela (desno gore) i nosioca genotipa AA u odnosu na
nosioce alela A, odnosno nosioca genotipa CC (p=0,0344; χ2-test) u odnosu na nosioce alela A (dolje) prema početku zlouporabe alkohola u skupini ispitanika ovisnih o alkoholu
Rani početak
CC 4,12%A 95,88%
Kasni početak
CC 11.80%A 88.20%
Slika 20. Prikaz nosioca genotipa CC i nosioca alela A kod alkoholičara koji su ranije počeli zlorabiti alkohol (<25 godine života) naspram nosioca genotipa CC i nosioca alela A koji su alkohol počeli zlorabiti kasnije (>25 godine života). Prikazana razlika statistički je značajna (p=0,0344, χ2-test).
39
5. Rasprava
Glutamatni NMDA receptori danas se smatraju jednim od glavnih molekularnih
ciljeva alkohola u mozgu (Gass and Olive, 2008), te se većina istraživanja fokusirala
na ulogu glutamatnih NMDA receptora u djelovanju alkohola, za koji je pokazano da
djeluje inhibicijski na funkciju NMDA receptora u mozgu. Međutim iako se do sada
malo znalo o prilagodbama kainatnih receptora nakon kronične primjene alkohola,
posljednih godina kainatni receptori također su se pokazali kao značajni ciljevi
djelovanja alkohola u SŽS (Carta et al., 2003). Izloženost etanolu od 1-5 dana
selektivno je smanjila osjetljivost kainatnih receptora na male koncentracije kainata
(Dildy-Mayfield i Harris, 1992). Nadalje, uočen je povišeni broj ovih receptora u
hipokampalnoj regiji kod kronične primjene alkohola. Moguće je da povećanje broja
receptora kasnije uzrokuje inhibiciju GABAergičnih interneurona u hipokampusu
tijekom sindroma ustezanja (Carta i sur., 2002). To čini kainatne receptore glavnim
čimbenikom u okidanju hipokampalnih neurona, koje se smatra važnim
patofiziološkim čimbenikom odgovornim za napade uzrokovane ustezanjem i delirium
tremens (Dietrich i sur., 1997).
Nedavna istraživanja uputila su na povezanost alkoholizma i gena za
glutamatne receptore (Gass i Olive, 2008). Ta povezanost podržana je studijom koja
je mapirala 1p regiju kromosoma 1 (Lappalainen i sur., 2004). Naime, nekoliko studija
utvrdilo je povezanost alkoholizma i polimorfizama u genima GRIK1 i GRIK3, koji
kodiraju GluR5 i GluR7 podjedinice glutamatnih kainatnih receptora (Preuss i sur.,
2006; Kranzler i sur., 2009), potrebnih za formiranje funkcionalnih kanalića kainatnih
receptora.
Prijašnja elektrofiziološka istraživanja oba alela funkcionalnog polimorfizma
Ser310Ala gena GRIK3 u HEK 293 stanicama nisu pokazala da zamjena serina 310
s alaninom utječe na odgovor receptora na glutamat (Schiffer i sur., 2000). Međutim,
daljnja istraživanja ekspresije i karakterizacije posljedica potvrdila su funkcionalnu
značajnost polimorfizma. Prvo, uočena je niža ekspresija kainatnih receptora kod
nosioca T-alela (Ser310), pri čemu je u sedam od devet uzoraka ljudskog moždanog
tkiva pronađena smanjena ekspresija alela za 1,4 - 4,7 puta. Drugo, dok je ekspresija
alela Ser310 u okcipitalnom režnju korteksa, mezencefalonu, bazalnim ganglijima 40
malog mozga i talamusu bila značajno niža, u prednjem mozgu ekspresija alela je
bila dva puta veća.
Pojedina istraživanja pokazala su povezanost alkoholizma, posebice delirium
tremens-a tijekom ustezanja i Ser310Ala funkcionalnog polimorfizma u genu GRIK3
(Preuss i sur., 2006). Stoga smo u našem istraživanju željeli istražiti moguću
povezanost ovog genetskog biljega s razvojem ovisnosti o alkoholu u ispitanika
hrvatskog porijekla. Naime, pojedine studije nisu potvrdile navedene rezultate
(Samochowiec i sur., 2006; Grzywacz i sur., 2013), što bi se između ostalog moglo
objasniti i različitim podrijetlom ispitanika, s obzirom da se utjecaj genetičkih i
okolišnih čimbenika rizika može razlikovati između pojedinih populacija. Tako na
primjer uobičajeni okolišni čimbenici rizika, poput razine izlaganja alkoholu i
prosječne konzumacije alkohola, koji variraju između različitih zemalja, potencijalno
odražavaju smanjeni, odnosno povećani značaj genetičkih čimbenika u razvoju
ovisnosti o alkoholu. Stoga, iako su dosadašnja istraživanja počela rasvjetljavati
ulogu gena glutamatnih kainatnih receptora u razvoju ovisnosti o alkoholu, potrebne
su daljnje studije koje bi uključile različite etničke skupine, podtipove alkoholizma,
kao i brojne druge čimbenike. Premda je naš uzorak ispitanika velikim dijelom
sadržavao alkoholičare primljene na liječenje upravo zbog posljedica ustezanja
alkohola, u našem istraživanju nismo utvrdili povezanost Ser310Ala funkcionalnog
polimorfizma u genu GRIK3 i alkoholizma. Uz etničke razlike, naši rezultati se mogu
objasniti veličinom uzorka, odabirom ispitanika, genetskom strukturom populacije, ali
ne i razlikama u spolu, jer nisu utvrđene razlike u raspodjeli genotipova i alela za
polimorfizam rs6691840 između muškaraca i žena.
U našem istraživanju također smo željeli utvditi postoje li razlike u
frekvencijama genotipova i alela za rs6691840 polimorfizam u GRIK3 genu u
skupinama zdravih ispitanika i osoba ovisnih o alkoholu podijeljenih s obzirom na
pušački status. Naime, utvrđeno je da se alkoholizam i pušenje vrlo često javljaju u
kombinaciji, te da ovisnost o alkoholu i nikotinu dijele zajedničke genetske čimbenike
rizika (Bierut et al., 2004). Veliki broj radova pokazao je da su alkoholičari češće i
pušači za razliku od kontrolnih ispitanika, čemu u prilog idu i rezultati našeg
istraživanja koji pokazuju značajno veći broj pušača u skupini ispitanika ovisnih o
alkoholu u odnosu na kontrolnu skupinu (p<0,0001; χ2-test). Naime, u skupini
41
ovisnika o alkoholu 150 od 275 ispitanika puši, dok je u kontrolnoj skupini od ukupno
208 ispitanika pušača samo njih 69. To je dosljedno radovima koji pokazuju da
ovisnici o alkoholu imaju viši rizik pušenja naspram zdravih ispitanika (Schlaepfer et
al., 2008). Rezulti našeg istraživanja nisu ukazali na razlike u raspodjeli genotipova i
alela za Ser310Ala funkcionalni polimorfizam između pušača i nepušača niti u
kontrolnoj skupini niti u skupini alkoholičara.
GRIK3 gen povezuje se s poremećajima raspoloženja i ponašanja, često
kormobidnih s razvojem alkoholizma, poput bipolarnog poremećaja (Cherlyn i sur.,
2010), depresije (Schiffer i Heinemann, 2007, Sequeira i sur., 2009), anksioznosti
(Luciano i sur., 2010), te opsesivno–kompulzivnog poremećaja (Millet i sur., 2003),
dok mu određene studije daju važnost pri procesu oblikovanja ličnosti (Minelli i sur.,
2009). alkoholizam učestalo se povezuju s povećanim rizikom suicidalnog ponašanja,
a visoke stope pokušaja samoubojstva utvrđene su u osoba ovisnih o alkoholu
(Modesto-Lowe i sur., 2006, Flensborg-Madsen i sur. 2009). Stoga smo u našem
istraživanju osobe ovisne o alkoholu podjelili s obzirom na pokušaj samoubojstva
tijekom života. Iako sve više dokaza povezuje glutamatni sustav sa samoubojstvom
(Bernstein i sur., 2013; Sequeira i sur., 2009; Freed i sur., 1993), te ukazuje da
genetički čimbenici doprinose riziku pokušaja suicida (Tsai i sur., 2011), u našem
istraživanju nismo utvrdili povezanost rs6691840 polimorfizma sa suicidalnim
pokušajem alkoholičara.
Agresivnost osoba ovisnih o alkoholu još je jedan čimbenika koji je proučavan
u novijim istraživanjima (Kachadourian i sur., 2012; Klostermann i sur., 2009;
Träskman-Bendz i Westling, 2005). Stoga smo i mi u našem istraživanju željeli
utvrditi postoji li povezanost Ser310Ala funkcionalnog polimorfizma i agresivnog
ponašanja. Naši rezultati su pokazali da ne postoje razlike u frekvencijama
genotipova i alela ovog polimorfizma GRIK3 gena između alkoholičara sa i bez
agresije.
Upravo zbog velike heterogenosti između osoba ovisnih o alkoholu, pojavile
su se brojne dodatne klasifikacije, koje pokušavaju preciznije definirati specifične
podtipove (endofenotipove) alkoholizma (Leggio i sur., 2008). Cloningerova
klasifikacija (Cloninger i sur., 1988) razlikuje tip I alkoholizma s relativno kasnim
početkom, neurotičnim simptomima i minimalnim kriminalitetom, od alkoholizma tipa 42
II s relativno ranim početkom zlouporabe alkohola (u ranim dvadesetim godinama),
povišenom razinom antisocijalnog ponašanja i delikvencije koja često počinje tijekom
adolescencije. Umjereno nasljedan tip I alkoholizma, značajno je utjecan okolišnim
čimbenicima za razliku od tipa II alkoholizma, koji se smatra snažno nasljednim i na
kojeg okolišni čimbenici imaju ograničen utjecaj (Cloninger i sur., 1988). U našem
istraživanju statistički značajna razlika pronađena je u frekvenciji homozigotnog CC
genotipa (p=0,0465, χ2-test) između ispitanika ovisnih o alkoholu s ranim početkom
zlouporabe alkohola i alkoholičara s kasnim početkom zlorabljanja alkohola. Pokazali
smo da ispitanici ovisni o alkoholu koji su počeli zlorabiti alkohol nakon 25. godine
života imaju značajno veću frekvenciju CC genotipa, u odnosu na alkoholičare s
ranim početkom zlouporabe alkohola. Rani početak zlouporabe alkohola često je
ozbiljniji, s povišenim rizikom vraćanja ovisnosti, kao i pojave komorbidnih
poremećaja poput antisocijalnog poremećaja ličnosti (eng. antisocial personality
disorder, ASPD) i poremećaja ponašanja (eng.conduct disorder) (Dick i sur., 2006;
McGue i sur., 2001), te je mnogo češći u osoba s alkoholizmom tipa II prema
Cloningerovoj klasifikaciji.
Bez obzira na relativno mali broj ispitanika, koji je nedostatak i ograničenje ovog
istraživanja, naši rezultati su ukazali na moguću povezanost GRIK3 gena s
alkoholizmom. Ovakva istraživanja koja uključuju različite etničke skupine mogla bi
biti korisna u utvrđivanju genetskih varijacija glutamatnih kainatnih receptora i
funkcionalnih promjena GRIK3 gena povezanih s alkoholizmom. Naime, genetski
polimorfizmi GRIK3 gena mogli bi objasniti individualne razlike u gustoći i afinitetu
kainatnih receptora s obzirom da je utvrđeno da nosioci Ser310 alela imaju smanjenu
ekspresiju ovog receptora u određenim moždanim regijama. Stoga, iako su
dosadašnja istraživanja počela rasvjetljavati ulogu gena GRIK3 u razvoju ovisnosti o
alkoholu, potrebna su dodatna istraživanja koja će uključiti različite populacije i
obuhvatiti još više ispitivanih parametara, i to na većem broju ispitanika.
43
6. Zaključak
• Iako smo u sklopu istraživanja povezanosti funkcionalnog polimorfizma
Ser310Ala, smještenog u genu GRIK3, s rizikom razvoja alkoholizma u
ispitanika hrvatskog podrijetla, težili da sve uključene skupine ispitanika budu
prilagođene po dobi i spolu, skupina ispitanika ovisnih o alkoholu bila je
značajno starija od kontrolne skupine, pri čemu su i muškarci i žene ovisni o
alkoholu bili značajno stariji od zdravih muškaraca i žena. Međutim, premda su
u obje skupine većinu ispitanika sačinjavali muškarci, raspodjela po spolu nije
se značajno razlikovala između kontrolne skupine i skupine osoba ovisnih o
alkoholu.
• U skladu s literaturnim podacima, značajna razlika u učestalosti pušača i
nepušača utvrđena je između alkoholičara i zdravih ispitanika, odnosno u
skupini zdravih ispitanika postojao je manji broj pušača nego u skupini
alkoholičara.
• Učestalost opaženih genotipova polimorfizma Ser310Ala i u skupini ovisnika o
alkoholu i u kontrolnoj skupini bila je u skladu s Hardy-Weinberg-ovom
ravnotežom.
• U istraživanju povezanosti polimorfizma rs6691840 gena GRIK3 s rizikom
razvoja ovisnosti o alkoholu, nisu utvrđene značajne razlike u raspodjeli
genotipova i alela između ispitanika ovisnih o alkoholu i zdravih kontrolnih
ispitanika.
• Također, nisu utvrđene značajne razlike u učestalosti genotipova i alela
polimorfizma rs6691840 u odnosu na spol, niti u skupini zdravih osoba, niti u
skupini ovisnika o alkoholu, te stoga u naknadnim usporedbama ispitanici nisu
razlikovani po spolu.
• Rezultati istraživanja nisu pokazali razlike u raspodjeli varijanti polimorfizma
Ser310Ala gena GRIK3 između pušača i nepušača, u skupini ispitanika
ovisnih o alkoholu, kao ni u kontrolnoj skupini.
44
• Analiza genotipova i alela polimorfizma rs6691840 u skupini ovisnika o
alkoholu podijeljenih prema prisustvu agresivnog, kao i suicidalnog ponašanja,
nije utvrdila značajne razlike između ispitivanih skupina.
• Značajne razlike u raspodjeli genotipova i alela biljega rs6691840 nisu
utvrđene unutar skupine alkoholičara s kombinacijom ranog početka
zlouporabe alkohola i agresivnog ponašanja, što odgovara alkoholizmu tipa II
prema Cloningerovoj klasifikaciji, u odnosu na ovisnike o alkoholu s
kombinacijom kasnog početka zlorabljenja alkohola i bez agresije (alkoholizam
tipa I prema Cloningeru).
• Međutim, usporedbom osoba ovisnih o alkoholu samo prema početku
zlouporabe alkohola utvrđeno je da postoji statistički značajna razlika u
frekvenciji homozigotnog CC genotipa između alkoholičara s ranim i kasnim
početkom zlouporabe alkohola. Naime, rezultati su pokazali da ispitanici ovisni
o alkoholu koji su počeli zlorabiti alkohol nakon 25. godine života imaju
značajno veću frekvenciju CC genotipa, u odnosu na alkoholičare s ranim
početkom konzumacije alkohola (prije 25. godine života).
• S obzirom da rani početak alkoholizma često odražava veću težinu bolesti, viši
rizik ponovnog povratka ovisnosti, kao i pojave komorbidnih poremećaja poput
antisocijalnog poremećaja ličnosti i poremećaja ponašanja, a niža ekspresija
kainatnih receptora pronađena je u mnogim moždanim regijama nosioca T-
alela (Ser310), dobiveni rezultati mogli bi doprinijeti razjašnjavanju uloge gena
GRIK3 u ovisnosti o alkoholu. Naravno, u tu svrhu potrebna su daljnja i
opsežnija istraživanja.
45
Literatura
Abrahao, K.P., Ariwodola, O.J., Butler, T.R., Rau, A.R., Skelly, M.J., Carter, E.,
Alexander, N.P., McCool, B.A., Souza-Formigoni, M.L.O., Weiner, J.L., 2013.
Locomotor sensitization to ethanol impairs NMDA receptor-dependent
synaptic plasticity in the nucleus accumbens and increases ethanol self-
administration. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 33, 4834–4842.
Afonina, I., Zivarts, M., Kutyavin, I., Lukhtanov, E., Gamper, H., Meyer, R.B., 1997.
Efficient priming of PCR with short oligonucleotides conjugated to a minor
groove binder. Nucleic Acids Res. 25, 2657–2660.
American Psychiatric Association (1994): Diagnostic and Statistical Manual of Mental
Disorders. 4th ed. American Psychiatric Press, Washington
Anderson, N., Oliver, M.N., 2003. Oral topiramate effective for alcoholism. J. Fam.
Pract. 52, 682–683, 687.
Armstrong, N., Sun, Y., Chen, G.Q., Gouaux, E., 1998. Structure of a glutamate-
receptor ligand-binding core in complex with kainate. Nature 395, 913–917.
Ary, A.W., Cozzoli, D.K., Finn, D.A., Crabbe, J.C., Dehoff, M.H., Worley, P.F.,
Szumlinski, K.K., 2012. Ethanol up-regulates nucleus accumbens neuronal
activity dependent pentraxin (Narp): implications for alcohol-induced
behavioral plasticity. Alcohol Fayettev. N 46, 377–387.
Bernstein, H.G., Tausch, A., Wagner, R., Steiner, J., Seeleke, P., Walter, M.,
Dobrowolny, H., Bogerts, B., 2013. Disruption of Glutamate-Glutamine-GABA
Cycle Significantly Impacts on Suicidal Behaviour: Survey of the Literature and
Own Findings on Glutamine Synthetase. CNS Neurol. Disord. Drug Targets.
Bierut, L.J., Agrawal, A., Bucholz, K.K., Doheny, K.F., Laurie, C., Pugh, E., Fisher, S.,
Fox, L., Howells, W., Bertelsen, S., Hinrichs, A.L., Almasy, L., Breslau, N.,
Culverhouse, R.C., Dick, D.M., Edenberg, H.J., Foroud, T., Grucza, R.A.,
Hatsukami, D., Hesselbrock, V., Johnson, E.O., Kramer, J., Krueger, R.F.,
Kuperman, S., Lynskey, M., Mann, K., Neuman, R.J., Nöthen, M.M.,
Nurnberger, J.I., Jr, Porjesz, B., Ridinger, M., Saccone, N.L., Saccone, S.F.,
Schuckit, M.A., Tischfield, J.A., Wang, J.C., Rietschel, M., Goate, A.M., Rice,
J.P., Gene, Environment Association Studies Consortium, 2010. A genome-
46
wide association study of alcohol dependence. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
107, 5082–5087.
Bierut, L.J., Rice, J.P., Goate, A., Hinrichs, A.L., Saccone, N.L., Foroud, T.,
Edenberg, H.J., Cloninger, C.R., Begleiter, H., Conneally, P.M., Crowe, R.R.,
Hesselbrock, V., Li, T.-K., Nurnberger, J.I., Jr, Porjesz, B., Schuckit, M.A.,
Reich, T., 2004. A genomic scan for habitual smoking in families of alcoholics:
common and specific genetic factors in substance dependence. Am. J. Med.
Genet. A. 124A, 19–27.
Bonnet, U., Banger, M., Leweke, F.M., Maschke, M., Kowalski, T., Gastpar, M., 1999.
Treatment of alcohol withdrawal syndrome with gabapentin.
Pharmacopsychiatry 32, 107–109.
Boothby, L.A., Doering, P.L., 2005. Acamprosate for the treatment of alcohol
dependence. Clin. Ther. 27, 695–714.
Bouza, C., Angeles, M., Magro, A., Muñoz, A., Amate, J.M., 2004. Efficacy and safety
of naltrexone and acamprosate in the treatment of alcohol dependence: a
systematic review. Addict. Abingdon Engl. 99, 811–828.
Brown, G.L., Goodwin, F.K., Ballenger, J.C., Goyer, P.F., Major, L.F., 1979.
Aggression in humans correlates with cerebrospinal fluid amine metabolites.
Psychiatry Res. 1, 131–139.
Buydens-Branchey, L., Branchey, M.H., Noumair, D., 1989. Age of alcoholism onset.
I. Relationship to psychopathology. Arch. Gen. Psychiatry 46, 225–230.
Caan, W., Belleroche, J.D., 2002. Drink, Drugs and Dependence: From Science to
Clinical Practice. Routledge.
Carta, M., Ariwodola, O.J., Weiner, J.L., Valenzuela, C.F., 2003. Alcohol potently
inhibits the kainate receptor-dependent excitatory drive of hippocampal
interneurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 6813–6818.
Carta, M., Olivera, D.S., Dettmer, T.S., Valenzuela, C.F., 2002. Ethanol withdrawal
upregulates kainate receptors in cultured rat hippocampal neurons. Neurosci.
Lett. 327, 128–132.
Chandler, L.J., Norwood, D., Sutton, G., 1999. Chronic ethanol upregulates NMDA
and AMPA, but not kainate receptor subunit proteins in rat primary cortical
cultures. Alcohol. Clin. Exp. Res. 23, 363–370.
47
Chen, F., Jarrott, B., Lawrence, A.J., 1999. Up-regulation of cortical AMPA receptor
binding in the fawn-hooded rat following ethanol withdrawal. Eur. J.
Pharmacol. 384, 139–146.
Cherlyn, S.Y.T., Woon, P.S., Liu, J.J., Ong, W.Y., Tsai, G.C., Sim, K., 2010. Genetic
association studies of glutamate, GABA and related genes in schizophrenia
and bipolar disorder: a decade of advance. Neurosci. Biobehav. Rev. 34, 958–
977.
Christian, D.T., Alexander, N.J., Diaz, M.R., Robinson, S., McCool, B.A., 2012.
Chronic intermittent ethanol and withdrawal differentially modulate basolateral
amygdala AMPA-type glutamate receptor function and trafficking.
Neuropharmacology 62, 2430–2439.
Cloninger, C.R., Sigvardsson, S., Gilligan, S.B., von Knorring, A.L., Reich, T.,
Bohman, M., 1988. Genetic heterogeneity and the classification of alcoholism.
Adv. Alcohol Subst. Abuse 7, 3–16.
Costa, E.T., Soto, E.E., Cardoso, R.A., Olivera, D.S., Valenzuela, C.F., 2000. Acute
effects of ethanol on kainate receptors in cultured hippocampal neurons.
Alcohol. Clin. Exp. Res. 24, 220–225.
Crowder, T.L., Ariwodola, O.J., Weiner, J.L., 2002. Ethanol antagonizes kainate
receptor-mediated inhibition of evoked GABA(A) inhibitory postsynaptic
currents in the rat hippocampal CA1 region. J. Pharmacol. Exp. Ther. 303,
937–944.
Davies, M., 2003. The role of GABAA receptors in mediating the effects of alcohol in
the central nervous system. J. Psychiatry Neurosci. JPN 28, 263–274.
Dick, D.M., Bierut, L., Hinrichs, A., Fox, L., Bucholz, K.K., Kramer, J., Kuperman, S.,
Hesselbrock, V., Schuckit, M., Almasy, L., Tischfield, J., Porjesz, B., Begleiter,
H., Nurnberger, J., Jr, Xuei, X., Edenberg, H.J., Foroud, T., 2006. The role of
GABRA2 in risk for conduct disorder and alcohol and drug dependence across
developmental stages. Behav. Genet. 36, 577–590.
Dick, D.M., Nurnberger, J., Jr, Edenberg, H.J., Goate, A., Crowe, R., Rice, J.,
Bucholz, K.K., Kramer, J., Schuckit, M.A., Smith, T.L., Porjesz, B., Begleiter,
H., Hesselbrock, V., Foroud, T., 2002. Suggestive linkage on chromosome 1
for a quantitative alcohol-related phenotype. Alcohol. Clin. Exp. Res. 26,
1453–1460.
48
Dietrich, D., Beck, H., Kral, T., Clusmann, H., Elger, C.E., Schramm, J., 1997.
Metabotropic glutamate receptors modulate synaptic transmission in the
perforant path: pharmacology and localization of two distinct receptors. Brain
Res. 767, 220–227.
Dildy-Mayfield, J.E., Harris, R.A., 1992. Acute and chronic ethanol exposure alters
the function of hippocampal kainate receptors expressed in Xenopus oocytes.
J. Neurochem. 58, 1569–1572.
Dodd, P.R., Beckmann, A.M., Davidson, M.S., Wilce, P.A., 2000. Glutamate-
mediated transmission, alcohol, and alcoholism. Neurochem. Int. 37, 509–533.
Enoch, M.-A., 2006. Genetic and environmental influences on the development of
alcoholism: resilience vs. risk. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1094, 193–201.
Enoch, M.-A., 2008. The role of GABA(A) receptors in the development of
alcoholism. Pharmacol. Biochem. Behav. 90, 95–104.
Foroud, T., Edenberg, H.J., Goate, A., Rice, J., Flury, L., Koller, D.L., Bierut, L.J.,
Conneally, P.M., Nurnberger, J.I., Bucholz, K.K., Li, T.K., Hesselbrock, V.,
Crowe, R., Schuckit, M., Porjesz, B., Begleiter, H., Reich, T., 2000. Alcoholism
susceptibility loci: confirmation studies in a replicate sample and further
mapping. Alcohol. Clin. Exp. Res. 24, 933–945.
Förster, T., 1948. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.
Phys. 437, 55–75.
Freed, W.J., Dillon-Carter, O., Kleinman, J.E., 1993. Properties of [3H]AMPA binding
in postmortem human brain from psychotic subjects and controls: increases in
caudate nucleus associated with suicide. Exp. Neurol. 121, 48–56.
Gass, J.T., Olive, M.F., 2008. Glutamatergic substrates of drug addiction and
alcoholism. Biochem. Pharmacol. 75, 218–265.
Goldman, D., Oroszi, G., Ducci, F., 2005. The genetics of addictions: uncovering the
genes. Nat. Rev. Genet. 6, 521–532.
Gro Harlem Brundtland (2001): WHO European Ministerial Conference on Young
People and Alcohol. World Health Organisation
Gryder, D.S., Rogawski, M.A., 2003. Selective antagonism of GluR5 kainate-
receptor-mediated synaptic currents by topiramate in rat basolateral amygdala
neurons. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 23, 7069–7074.
49
Grzywacz, A., Małecka, I., Suchanecka, A., Bieńkowski, P., Samochowiec, J., 2013.
Family-based and case-control study of glutamate receptor GRIK3 Ser310Ala
polymorphism in alcohol dependence. Eur. Addict. Res. 19, 55–59.
Hamilton, M., 1960. A rating scale for depression. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry
23, 56–62.
Heikkinen, A.E., Möykkynen, T.P., Korpi, E.R., 2009. Long-lasting modulation of
glutamatergic transmission in VTA dopamine neurons after a single dose of
benzodiazepine agonists. Neuropsychopharmacol. Off. Publ. Am. Coll.
Neuropsychopharmacol. 34, 290–298.
Heinz, A., Schäfer, M., Higley, J.D., Krystal, J.H., Goldman, D., 2003. Neurobiological
correlates of the disposition and maintenance of alcoholism.
Pharmacopsychiatry 36 Suppl 3, S255–258.
Hermann, D., Weber-Fahr, W., Sartorius, A., Hoerst, M., Frischknecht, U., Tunc-
Skarka, N., Perreau-Lenz, S., Hansson, A.C., Krumm, B., Kiefer, F., Spanagel,
R., Mann, K., Ende, G., Sommer, W.H., 2012. Translational magnetic
resonance spectroscopy reveals excessive central glutamate levels during
alcohol withdrawal in humans and rats. Biol. Psychiatry 71, 1015–1021.
Holland, P.M., Abramson, R.D., Watson, R., Gelfand, D.H., 1991. Detection of
specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5’----3’ exonuclease
activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
88, 7276–7280.
Holmes, A., Fitzgerald, P.J., MacPherson, K.P., DeBrouse, L., Colacicco, G., Flynn,
S.M., Masneuf, S., Pleil, K.E., Li, C., Marcinkiewcz, C.A., Kash, T.L., Gunduz-
Cinar, O., Camp, M., 2012. Chronic alcohol remodels prefrontal neurons and
disrupts NMDAR-mediated fear extinction encoding. Nat. Neurosci. 15, 1359–
1361.
Holmes, A., Spanagel, R., Krystal, J.H., 2013. Glutamatergic targets for new alcohol
medications. Psychopharmacology (Berl.) 229, 539–554.
Isralowitz, R., 2004. Drug Use: A Reference Handbook. ABC-CLIO.
Kachadourian, L.K., Homish, G.G., Quigley, B.M., Leonard, K.E., 2012. Alcohol
expectancies, alcohol use, and hostility as longitudinal predictors of alcohol-
related aggression. Psychol. Addict. Behav. J. Soc. Psychol. Addict. Behav.
26, 414–422.
50
Kalsi, G., Prescott, C.A., Kendler, K.S., Riley, B.P., 2009. Unraveling the molecular
mechanisms of alcohol dependence. Trends Genet. TIG 25, 49–55.
Kaminski, R.M., Banerjee, M., Rogawski, M.A., 2004. Topiramate selectively protects
against seizures induced by ATPA, a GluR5 kainate receptor agonist.
Neuropharmacology 46, 1097–1104.
Karoll, B.R., 2002. Women and Alcohol-Use Disorders A Review of Important
Knowledge and Its Implications for Social Work Practitioners. J. Soc. Work 2,
337–356.
Kimura, M., Higuchi, S., 2011. Genetics of alcohol dependence. Psychiatry Clin.
Neurosci. 65, 213–225.
Klostermann, K., Mignone, T., Chen, R., 2009. Subtypes of alcohol and intimate
partner violence: a latent class analysis. Violence Vict. 24, 563–576.
Köhnke, M.D., 2008. Approach to the genetics of alcoholism: a review based on
pathophysiology. Biochem. Pharmacol. 75, 160–177.
Komanduri, R., 2003. Two cases of alcohol craving curbed by topiramate. J. Clin.
Psychiatry 64, 612.
Kranzler, H.R., Gelernter, J., Anton, R.F., Arias, A.J., Herman, A., Zhao, H., Burian,
L., Covault, J., 2009. Association of markers in the 3’ region of the GluR5
kainate receptor subunit gene to alcohol dependence. Alcohol. Clin. Exp. Res.
33, 925–930.
Kroener, S., Mulholland, P.J., New, N.N., Gass, J.T., Becker, H.C., Chandler, L.J.,
2012. Chronic alcohol exposure alters behavioral and synaptic plasticity of the
rodent prefrontal cortex. PloS One 7, e37541.
Krupitsky, E.M., Rudenko, A.A., Burakov, A.M., Slavina, T.Y., Grinenko, A.A.,
Pittman, B., Gueorguieva, R., Petrakis, I.L., Zvartau, E.E., Krystal, J.H., 2007.
Antiglutamatergic strategies for ethanol detoxification: comparison with
placebo and diazepam. Alcohol. Clin. Exp. Res. 31, 604–611.
Krupp, J.J., Vissel, B., Heinemann, S.F., Westbrook, G.L., 1998. N-terminal domains
in the NR2 subunit control desensitization of NMDA receptors. Neuron 20,
317–327.
Krystal, J.H., Petrakis, I.L., Mason, G., Trevisan, L., D’Souza, D.C., 2003. N-methyl-
D-aspartate glutamate receptors and alcoholism: reward, dependence,
treatment, and vulnerability. Pharmacol. Ther. 99, 79–94.
51
Kumar, S., Porcu, P., Werner, D.F., Matthews, D.B., Diaz-Granados, J.L., Helfand,
R.S., Morrow, A.L., 2009. The role of GABA(A) receptors in the acute and
chronic effects of ethanol: a decade of progress. Psychopharmacology (Berl.)
205, 529–564.
Kumari, M., Ticku, M.K., 1998. Ethanol and regulation of the NMDA receptor subunits
in fetal cortical neurons. J. Neurochem. 70, 1467–1473.
Kutyavin, I.V., Lukhtanov, E.A., Gamper, H.B., Meyer, R.B., 1997. Oligonucleotides
with conjugated dihydropyrroloindole tripeptides: base composition and
backbone effects on hybridization. Nucleic Acids Res. 25, 3718–3723.
Läck, A.K., Ariwodola, O.J., Chappell, A.M., Weiner, J.L., McCool, B.A., 2008.
Ethanol inhibition of kainate receptor-mediated excitatory neurotransmission in
the rat basolateral nucleus of the amygdala. Neuropharmacology 55, 661–
668.
Läck, A.K., Diaz, M.R., Chappell, A., DuBois, D.W., McCool, B.A., 2007. Chronic
ethanol and withdrawal differentially modulate pre- and postsynaptic function
at glutamatergic synapses in rat basolateral amygdala. J. Neurophysiol. 98,
3185–3196.
Lakowicz, J.R., 2007. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Springer.
Langdana, F.K., 2009. Macroeconomic policy demystifying monetary and fiscal
policy. Springer, New York.
Lapish, C.C., Seamans, J.K., Chandler, L.J., 2006. Glutamate-dopamine
cotransmission and reward processing in addiction. Alcohol. Clin. Exp. Res.
30, 1451–1465.
Lappalainen, J., Kranzler, H.R., Petrakis, I., Somberg, L.K., Page, G., Krystal, J.H.,
Gelernter, J., 2004. Confirmation and fine mapping of the chromosome 1
alcohol dependence risk locus. Mol. Psychiatry 9, 312–319.
Lee, L.G., Connell, C.R., Bloch, W., 1993. Allelic discrimination by nick-translation
PCR with fluorogenic probes. Nucleic Acids Res. 21, 3761–3766.
Leggio, L., Kenna, G.A., Swift, R.M., 2008. New developments for the
pharmacological treatment of alcohol withdrawal syndrome. A focus on non-
benzodiazepine GABAergic medications. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol.
Psychiatry 32, 1106–1117.
52
Little, H.J., 1999. The contribution of electrophysiology to knowledge of the acute and
chronic effects of ethanol. Pharmacol. Ther. 84, 333–353.
Lovinger, D.M., White, G., Weight, F.F., 1989. Ethanol inhibits NMDA-activated ion
current in hippocampal neurons. Science 243, 1721–1724.
Luciano, M., Houlihan, L.M., Harris, S.E., Gow, A.J., Hayward, C., Starr, J.M., Deary,
I.J., 2010. Association of existing and new candidate genes for anxiety,
depression and personality traits in older people. Behav. Genet. 40, 518–532.
Mann, K., Lehert, P., Morgan, M.Y., 2004. The efficacy of acamprosate in the
maintenance of abstinence in alcohol-dependent individuals: results of a meta-
analysis. Alcohol. Clin. Exp. Res. 28, 51–63.
Mason, B.J., 2005. Acamprosate in the treatment of alcohol dependence. Expert
Opin. Pharmacother. 6, 2103–2115.
Mason, G.F., Petrakis, I.L., de Graaf, R.A., Gueorguieva, R., Guidone, E., Coric, V.,
Epperson, C.N., Rothman, D.L., Krystal, J.H., 2006. Cortical gamma-
aminobutyric acid levels and the recovery from ethanol dependence:
preliminary evidence of modification by cigarette smoking. Biol. Psychiatry 59,
85–93.
McEntee, W.J., Crook, T.H., 1993. Glutamate: its role in learning, memory, and the
aging brain. Psychopharmacology (Berl.) 111, 391–401.
McGue, M., 1999. Phenotyping alcoholism. Alcohol. Clin. Exp. Res. 23, 757–758.
McGue, M., Iacono, W.G., Legrand, L.N., Malone, S., Elkins, I., 2001. Origins and
consequences of age at first drink. I. Associations with substance-use
disorders, disinhibitory behavior and psychopathology, and P3 amplitude.
Alcohol. Clin. Exp. Res. 25, 1156–1165.
Meinhardt, M.W., Hansson, A.C., Perreau-Lenz, S., Bauder-Wenz, C., Stählin, O.,
Heilig, M., Harper, C., Drescher, K.U., Spanagel, R., Sommer, W.H., 2013.
Rescue of infralimbic mGluR2 deficit restores control over drug-seeking
behavior in alcohol dependence. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 33, 2794–
2806.
Meldrum, B.S., 2000. Glutamate as a neurotransmitter in the brain: review of
physiology and pathology. J. Nutr. 130, 1007S–15S.
Miller, S.A., Dykes, D.D., Polesky, H.F., 1988. A simple salting out procedure for
extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 16, 1215.
53
Millet, B., Chabane, N., Delorme, R., Leboyer, M., Leroy, S., Poirier, M.-F., Bourdel,
M.-C., Mouren-Simeoni, M.-C., Rouillon, F., Loo, H., Krebs, M.-O., 2003.
Association between the dopamine receptor D4 (DRD4) gene and obsessive-
compulsive disorder. Am. J. Med. Genet. Part B Neuropsychiatr. Genet. Off.
Publ. Int. Soc. Psychiatr. Genet. 116B, 55–59.
Minelli, A., Scassellati, C., Bonvicini, C., Perez, J., Gennarelli, M., 2009. An
association of GRIK3 Ser310Ala functional polymorphism with personality
traits. Neuropsychobiology 59, 28–33.
Modesto-Lowe, V., Brooks, D., Ghani, M., 2006. Alcohol dependence and suicidal
behavior: from research to clinical challenges. Harv. Rev. Psychiatry 14, 241–
248.
Mon, A., Durazzo, T.C., Meyerhoff, D.J., 2012. Glutamate, GABA, and other cortical
metabolite concentrations during early abstinence from alcohol and their
associations with neurocognitive changes. Drug Alcohol Depend. 125, 27–36.
Möykkynen, T., Korpi, E.R., Lovinger, D.M., 2003. Ethanol inhibits alpha-amino-3-
hydyroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptor function in
central nervous system neurons by stabilizing desensitization. J. Pharmacol.
Exp. Ther. 306, 546–555.
Mozhui, K., Karlsson, R.-M., Kash, T.L., Ihne, J., Norcross, M., Patel, S., Farrell,
M.R., Hill, E.E., Graybeal, C., Martin, K.P., Camp, M., Fitzgerald, P.J.,
Ciobanu, D.C., Sprengel, R., Mishina, M., Wellman, C.L., Winder, D.G.,
Williams, R.W., Holmes, A., 2010. Strain differences in stress responsivity are
associated with divergent amygdala gene expression and glutamate-mediated
neuronal excitability. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 30, 5357–5367.
Myrick, H., Malcolm, R., Brady, K.T., 1998. Gabapentin treatment of alcohol
withdrawal. Am. J. Psychiatry 155, 1632.
Nakanishi, S., Masu, M., 1994. Molecular diversity and functions of glutamate
receptors. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 23, 319–348.
Neasta, J., Ben Hamida, S., Yowell, Q., Carnicella, S., Ron, D., 2010. Role for
mammalian target of rapamycin complex 1 signaling in neuroadaptations
underlying alcohol-related disorders. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107,
20093–20098.
54
Nutt, S.L., Hoo, K.H., Rampersad, V., Deverill, R.M., Elliott, C.E., Fletcher, E.J.,
Adams, S.L., Korczak, B., Foldes, R.L., Kamboj, R.K., 1994. Molecular
characterization of the human EAA5 (GluR7) receptor: a high-affinity kainate
receptor with novel potential RNA editing sites. Receptors Channels 2, 315–
326.
Oroszi, G., Goldman, D., 2004. Alcoholism: genes and mechanisms.
Pharmacogenomics 5, 1037–1048.
Palmada, M., Centelles, J.J., 1998. Excitatory amino acid neurotransmission.
Pathways for metabolism, storage and reuptake of glutamate in brain. Front.
Biosci. J. Virtual Libr. 3, d701–718.
Preuss, U.W., Zill, P., Koller, G., Bondy, B., Hesselbrock, V., Soyka, M., 2006.
Ionotropic glutamate receptor gene GRIK3 SER310ALA functional
polymorphism is related to delirium tremens in alcoholics. Pharmacogenomics
J. 6, 34–41.
Pulvirenti, L., Diana, M., 2001. Drug dependence as a disorder of neural plasticity:
focus on dopamine and glutamate. Rev. Neurosci. 12, 141–158.
Radel, M., Goldman, D., 2001. Pharmacogenetics of alcohol response and
alcoholism: the interplay of genes and environmental factors in thresholds for
alcoholism. Drug Metab. Dispos. Biol. Fate Chem. 29, 489–494.
Reich, T., Edenberg, H.J., Goate, A., Williams, J.T., Rice, J.P., Van Eerdewegh, P.,
Foroud, T., Hesselbrock, V., Schuckit, M.A., Bucholz, K., Porjesz, B., Li, T.K.,
Conneally, P.M., Nurnberger, J.I., Jr, Tischfield, J.A., Crowe, R.R., Cloninger,
C.R., Wu, W., Shears, S., Carr, K., Crose, C., Willig, C., Begleiter, H., 1998.
Genome-wide search for genes affecting the risk for alcohol dependence. Am.
J. Med. Genet. 81, 207–215.
Ron, D., 2004. Signaling cascades regulating NMDA receptor sensitivity to ethanol.
Neurosci. Rev. J. Bringing Neurobiol. Neurol. Psychiatry 10, 325–336.
Rossetti, Z.L., Carboni, S., 1995. Ethanol withdrawal is associated with increased
extracellular glutamate in the rat striatum. Eur. J. Pharmacol. 283, 177–183.
Rubio, G., Ponce, G., Jiménez-Arriero, M.A., Palomo, T., Manzanares, J., Ferre, F.,
2004. Effects of topiramate in the treatment of alcohol dependence.
Pharmacopsychiatry 37, 37–40.
55
Rustembegovic, A., Sofic, E., Tahirović, I., Kundurović, Z., 2004. A study of
gabapentin in the treatment of tonic-clonic seizures of alcohol withdrawal
syndrome. Med. Arh. 58, 5–6.
Samochowiec, J., Grzywacz, A., Kucharska-Mazur, J., Samochowiec, A., Horodnicki,
J., Pelka-Wysiecka, J., Syrek, S., 2006. Family-based and case-control
association studies of glutamate receptor GRIK3 Ser310Ala polymorphism in
Polish patients and families with alcohol dependence. Neurosci. Lett. 396,
159–162.
Schade, J., 2006. The Complete Encyclopedia of Medicine & Health. Foreign Media
Group.
Schiffer, H.H., Heinemann, S.F., 2007. Association of the human kainate receptor
GluR7 gene (GRIK3) with recurrent major depressive disorder. Am. J. Med.
Genet. Part B Neuropsychiatr. Genet. Off. Publ. Int. Soc. Psychiatr. Genet.
144B, 20–26.
Schiffer, H.H., Swanson, G.T., Heinemann, S.F., 1997. Rat GluR7 and a carboxy-
terminal splice variant, GluR7b, are functional kainate receptor subunits with a
low sensitivity to glutamate. Neuron 19, 1141–1146.
Schiffer, H.H., Swanson, G.T., Masliah, E., Heinemann, S.F., 2000. Unequal
expression of allelic kainate receptor GluR7 mRNAs in human brains. J.
Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 20, 9025–9033.
Schlaepfer, I.R., Hoft, N.R., Ehringer, M.A., 2008. The genetic components of alcohol
and nicotine co-addiction: from genes to behavior. Curr. Drug Abuse Rev. 1,
124–134.
Schleifer, S.J., 2007. Chapter 26 - Psychoneuroimmunologic Aspects of Alcohol and
Substance Abuse, in: Ader, R. (Ed.), Psychoneuroimmunology (Fourth
Edition). Academic Press, Burlington, pp. 549–561.
Sequeira, A., Mamdani, F., Ernst, C., Vawter, M.P., Bunney, W.E., Lebel, V., Rehal,
S., Klempan, T., Gratton, A., Benkelfat, C., Rouleau, G.A., Mechawar, N.,
Turecki, G., 2009. Global brain gene expression analysis links glutamatergic
and GABAergic alterations to suicide and major depression. PloS One 4,
e6585.
Shastry, B.S., 2002. SNP alleles in human disease and evolution. J. Hum. Genet. 47,
561–566.
56
Spanagel, R., Vengeliene, V., 2013. New pharmacological treatment strategies for
relapse prevention. Curr. Top. Behav. Neurosci. 13, 583–609.
Stern-Bach, Y., Bettler, B., Hartley, M., Sheppard, P.O., O’Hara, P.J., Heinemann,
S.F., 1994. Agonist selectivity of glutamate receptors is specified by two
domains structurally related to bacterial amino acid-binding proteins. Neuron
13, 1345–1357.
Stuber, G.D., Hopf, F.W., Hahn, J., Cho, S.L., Guillory, A., Bonci, A., 2008. Voluntary
ethanol intake enhances excitatory synaptic strength in the ventral tegmental
area. Alcohol. Clin. Exp. Res. 32, 1714–1720.
TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol (2006): Applied Biosystems, 1-50
Testino, G., 2008. Alcoholic diseases in hepato-gastroenterology: a point of view.
Hepatogastroenterology. 55, 371–377.
Thomasson, H.R., Edenberg, H.J., Crabb, D.W., Mai, X.L., Jerome, R.E., Li, T.K.,
Wang, S.P., Lin, Y.T., Lu, R.B., Yin, S.J., 1991. Alcohol and aldehyde
dehydrogenase genotypes and alcoholism in Chinese men. Am. J. Hum.
Genet. 48, 677–681.
Träskman-Bendz, L., Westling, S., 2005. The psychobiology of aggressive behaviour.
Adv. Health Econ. Health Serv. Res. 16, 3–14.
Tsai, G., Coyle, J.T., 1998. The role of glutamatergic neurotransmission in the
pathophysiology of alcoholism. Annu. Rev. Med. 49, 173–184.
Tsai, S.-J., Hong, C.-J., Liou, Y.-J., 2011. Recent molecular genetic studies and
methodological issues in suicide research. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol.
Psychiatry 35, 809–817.
Tzschentke, T.M., Schmidt, W.J., 2003. Glutamatergic mechanisms in addiction. Mol.
Psychiatry 8, 373–382.
Voris, J., Smith, N.L., Rao, S.M., Thorne, D.L., Flowers, Q.J., 2003. Gabapentin for
the treatment of ethanol withdrawal. Subst. Abuse Off. Publ. Assoc. Med.
Educ. Res. Subst. Abuse 24, 129–132.
Walter, H., Gutierrez, K., Ramskogler, K., Hertling, I., Dvorak, A., Lesch, O.M., 2003.
Gender-specific differences in alcoholism: implications for treatment. Arch.
Womens Ment. Health 6, 253–258.
Wang, J., Ben Hamida, S., Darcq, E., Zhu, W., Gibb, S.L., Lanfranco, M.F.,
Carnicella, S., Ron, D., 2012. Ethanol-mediated facilitation of AMPA receptor 57
function in the dorsomedial striatum: implications for alcohol drinking behavior.
J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 32, 15124–15132.
Weiner, J.L., Dunwiddie, T.V., Valenzuela, C.F., 1999. Ethanol inhibition of
synaptically evoked kainate responses in rat hippocampal CA3 pyramidal
neurons. Mol. Pharmacol. 56, 85–90.
Wetterling, T., Junghanns, K., 2000. Psychopathology of alcoholics during withdrawal
and early abstinence. Eur. Psychiatry J. Assoc. Eur. Psychiatr. 15, 483–488.
Woodward, J.J., 2000. Ethanol and NMDA receptor signaling. Crit. Rev. Neurobiol.
14, 69–89.
World Health Organisation (2011): Global status report on alcohol, Geneva,
Switzerland.
Zhu, W., Bie, B., Pan, Z.Z., 2007. Involvement of non-NMDA glutamate receptors in
central amygdala in synaptic actions of ethanol and ethanol-induced reward
behavior. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 27, 289–298.
58
![MILOVANOVI] MIROSLAV, DIPL. IN@. TEHNOLOGIJE book/Aerozagadjenje - Sveska3.pdfrafinisani metanola dva pufer rezervoara od 300 m3, kao i rezervoar od 11 000 m3. Rafinisani metanol je](https://img.pdfslide.net/doc/110x75/5e2cc5b056bfc93ba622e202/milovanovi-miroslav-dipl-in-bookaerozagadjenje-sveska3pdf-rafinisani-metanola.jpg)
