Upload
others
View
7
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
SVEUČILIŠTE U ZAGREBU
FAKULTET KEMIJSKOG INŽENJERSTVA I TEHNOLOGIJE
SVEUČILIŠNI DIPLOMSKI STUDIJ
Mia Ivanković
DIPLOMSKI RAD
Zagreb, rujan 2012.
SVEUČILIŠTE U ZAGREBU
FAKULTET KEMIJSKOG INŽENJERSVA I TEHNOLOGIJE
SVEUČILIŠNI DIPLOMSKI STUDIJ
Mia Ivanković
RAZVOJ POTPUNO INTEGRIRANOG PROCESA
PROIZVODNJE HEKSANALA U MIKROKANALU
DIPLOMSKI RAD
Voditelj rada: dr. sc. Bruno Zelić, red. prof.
Članovi ispitnog povjerenstva:
dr. sc. Bruno Zelić, red. prof. (mentor)
dr .sc. Aleksandra Sander, red. prof.
dr. sc. Zvjezdana Findrik Blažević, docent
Zagreb, rujan 2012.
i
SAŽETAK
Heksanal je bitan sastavni dio grupe lako hlapivih komponenata poznatije kao green note.
Zbog svojih organoleptičkih svojstava heksanal je našao široku primjenu u prehrambenoj,
farmaceutskoj i kozmetičkoj industriji, a zbog baktericidnih i fungicidnih svojstava primjenjuje
se i u agronomiji. Uobičajeno se proizvodi fermentacijom s cijelim stanicama, ekstrakcijom iz
biljaka ili enzimski kataliziranim reakcijama. Glavni nedostatci ovih postupaka su mali prinosi,
formiranje neželjenih nusproizvoda i nastanak velike količine otpada pa je i više nego očita
potreba za razvojem i primjenom novih tehnologija u proizvodnji heksanala. Kao jedna od novih
tehnologija koje se koriste u proizvodnji heksanala sve se više nameću mikroreaktorski sustavi
koji omogućuju bolji prijenos tvari i energije, manju potrošnju kemikalija i energije te druge
prednosti u odnosu na konvencionalne reaktore.
U ovom radu provedena je biokatalitička oksidacija heksanola uz enzim alkohol
dehidrogenazu u mikroreaktoru volumena 6 μL. Alkohol dehidrogenaza je enzim koji se ubraja u
skupinu oksidoreduktaza kojima je zajednička karakteristika potreba za koenzimom. Kako je
cijena koenzima NAD+ izuzetno visoka, nužno je procesom regeneracije reducirani oblik
koenzima prevesti ponovno u oksidirani oblik. S tim ciljem razvijen je proces proizvodnje
heksanala s potpuno integriranom regeneracijom i recirkulacijom koenzima u dva međusobno
serijski povezana mikročipa. Ispitan je prijenos tvari između dvije faze paralelnog toka koji je
uspostavljen u mikrokanalima te je razvijen 2D matematički model strujanja. Postavljen je i
matematički model potpuno integriranog procesa proizvodnje heksanala s regeneracijom
koenzima u mikroreaktoru, te je provedena ocjena valjanosti modela na podatcima nezavisnih
pokusa. Pokazano je dobro slaganje matematičkog modela procesa i eksperimentalnih podataka,
a ovako razvijeni model pokazao se kao učinkovito sredstvo u daljnjem razvoju procesa.
Ključne riječi: ADH, heksanal, mikroreaktor, matematički model procesa, potpuno integrirani
proces
ii
SUMMARY
Hexanal is an essential part of the group of easily volatile components known as "green
notes". Because of its organoleptic properties hexanal has found wide application in food,
pharmaceutical and cosmetic industries, and due to its bactericidal and fungicidal properties is
applied in agriculture. Normally it is produced by fermentation with whole cells and enzyme-
catalyzed reactions or extracted from plants. The main disadvantages of these processes are low
yields, formation of undesired by-products and the formation of large amounts of waste, so the
need for development and application of new technologies in the production of hexanal is more
than obvious. As one of the new technologies used in the production of hexanal, microreactor
systems are increasingly being imposed as they allow better transfer of mass and energy, lower
consumption of chemicals and energy, and other advantages over conventional reactors.
In this work biocatalytic oxidation of hexanol with the enzyme alcohol dehydrogenase in
6 μL microreactor was carried out. Alcohol dehydrogenase is an enzyme that belongs to the
group of oxidoreductases, which share the characteristics of the need for coenzyme. As the price
of coenzyme NAD+ is extremely high, it is necessary to regenerate a reduced form of coenzyme
into the oxidized form. Therefore hexanal production process with fully integrated regeneration
and recirculation of coenzyme in two serially connected microchips was developed. Mass
transfer between the two phases established in microchannel was analysed and corresponding
mathematical model of 2D flow was developed. Additionaly, mathematical model of a fully
integrated hexanal production process with coenzyme regeneration in microreactor was
developed. Validation of the model was performed using data from independent experiments.
The good agreement between simulation and experimental results was observed.
Key words: ADH, hexanal, microreactor, mathematical model, fully integrated process
Sadržaj
iii
SADRŽAJ
1. UVOD ..................................................................................................................................... 1
2. TEORIJSKI DIO ................................................................................................................... 3
2.1. Heksanal ............................................................................................................................... 3
2.2. Enzimi .................................................................................................................................. 4
2.2.1. Oksidoreduktaze ............................................................................................................ 5
2.2.2. Alkohol dehidrogenaza (ADH) ...................................................................................... 5
2.2.3. Koenzim nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+) ............................................................ 6
2.3. Kinetika enzimskih reakcija ................................................................................................. 8
2.4. Mikroreaktori ..................................................................................................................... 10
2.4.1. Svojstva i primjena mikroreaktora .............................................................................. 10
2.4.2. Struktura mikroreaktora .............................................................................................. 11
2.5. Biokatalitička oksidacija heksanola uz enzim ADH .......................................................... 14
3. MATERIJALI I METODE ................................................................................................ 15
3.1. Materijali ............................................................................................................................ 15
3.1.1. Kemikalije .................................................................................................................... 15
3.1.2. Priprema otopina ......................................................................................................... 15
3.1.3. Aparatura..................................................................................................................... 16
3.2. Analitičke metode .............................................................................................................. 19
3.2.1. Mjerenje aktivnosti enzima ADH ................................................................................. 19
3.2.2. Mjerenje koncentracije NADH .................................................................................... 20
3.2.3. Mjerenje koncentracija heksanola i heksanala ........................................................... 20
3.2.4. Mjerenje koncentracije etanola ................................................................................... 21
3.3. Provedba pokusa u mikroreaktoru...................................................................................... 21
3.3.1. Provedba procesa oksidacije heksanola...................................................................... 21
3.3.2. Provedba procesa regeneracije koenzima NAD+ ........................................................ 22
3.3.3. Provedba procesa reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u
serijski povezanim mikroreaktorima ..................................................................................... 23
3.3.4. Provedba procesa potpuno integrirane proizvodnje heksanala .................................. 24
3.4. Obrada podataka ................................................................................................................. 25
Sadržaj
iv
4. REZULTATI I RASPRAVA .............................................................................................. 27
4.1. Tipovi strujanja u mikrokanalu .......................................................................................... 27
4.1.1. Određivanje veličine međufazne površine pri paralelnom i segmentiranom strujanju u
mikrokanalu ........................................................................................................................... 29
4.2. Prijenos tvari u mikrokanalu .............................................................................................. 30
4.2.1. Prijenos tvari u reakcijskom sustavu regeneracije koenzima ..................................... 30
4.2.2. Prijenos tvari u reakcijskom sustavu oksidacije heksanola ........................................ 35
4.3. Reakcija oksidacije heksanola ............................................................................................ 37
4.4. Reakcija regeneracije koenzima ......................................................................................... 38
4.5. Provedba procesa reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u serijski
povezanim mikroreaktorima ..................................................................................................... 39
4.6. Potpuno integrirani proces proizvodnje heksanala ............................................................. 40
5. ZAKLJUČAK ...................................................................................................................... 44
6. LITERATURA..................................................................................................................... 46
7. POPIS SIMBOLA................................................................................................................ 49
8. PRILOZI .............................................................................................................................. 51
8.1. Baždarni pravci .................................................................................................................. 51
8.2. Kromatogrami .................................................................................................................... 53
8.3. Jednodimenzijski matematički model difuzije u mikroreaktoru u programskom paketu
Scientist ..................................................................................................................................... 54
8.4. Dvodimenzijski matematički model difuzije u mikroreaktoru u programskom paketu
MATLAB .................................................................................................................................. 54
ŽIVOTOPIS
1. Uvod
1
1. UVOD
Green note spojevi su većinske komponente svježih, zelenih aroma povrća i voća poput
jabuka, višanja, kiwija, brusnica, jagoda i rajčica. Ove kemikalije se koriste u prehrambenoj
industriji kao dodatak za postizanje svježeg okusa u pićima i hrani. Procijenjena tržišna
vrijednost pred petnaestak godina im je bila otprilike 20 – 40 milijuna $ godišnje [Whitehead et
al. 1995]. Većinu tih spojeva čine aldehidi i alkoholi sa šest ugljikovih atoma. Jedan od takvih je
heksanal [Gargouri et al. 2004]. Heksanal se, osim u prehrambenoj industriji, koristi i u
farmaceutskoj i agrokemijskoj industriji zbog svojih organoleptičkih svojstava [Santiago- Gómez
et al. 2009]. Heksanal je spoj koji se nalazi u prirodi u lipoksigenazi biljaka koja služi kao
preteča za proizvodnju alkohola i estera koji su često korišteni u proizvodnji aroma [Hildebrand
1989].
Opisano je nekoliko procesa proizvodnje heksanala koji su temeljeni na fermentaciji,
ekstrakciji iz biljaka i enzimski kataliziranim reakcijama [Whitehead et al. 1995, Márczy et al.
2002, Brunerie & Koziet 1997]. Zbog male količine dobivenog proizvoda, formacije velike
količine sporednih produkata i otpada, tradicionalni spojevi kao što su aromatski alkoholi ili
alkilni aromati, nisu prihvatljivi reaktanti za proizvodnju heksanala [Yokoyama & Yamagata
2001]. Jedan od prihvatljivijih načina proizvodnje heksanala je enzimski katalizirana reakcija uz
koenzim NAD+. Upotreba koenzima NAD
+ u organskim sintezama ograničena je činjenicom da
je koenzim prilično skup reagens, koji se mora dodati u stehiometrijskom omjeru. Kako se
njegovo oksidacijsko stanje tijekom reakcije mijenja, potrebno ga je regenerirati in situ
uporabom druge redoks reakcije. Regeneracijom koenzima redukcijom acetaldehida, osim što se
postiže znatna ušteda na koenzimu, može se utjecati i na pomicanje reakcijske ravnoteže u
željenom smjeru.
U današnje vrijeme ulažu se veliki napori u razvoj novih proizvodnih tehnika i procesa.
Primjena mikroreaktora u provedbi kemijskih i biokemijskih reakcija bi mogla predstavljati novu
generaciju proizvodnih procesa, a biotransformacije u mikroreaktorima mogu činiti dobru
alternativu procesima klasične kemijske sinteze [Šalić et al. 2010]. Mikroreaktori su našli široku
primjenu u različitim područjima počevši od klasičnih kemijskih sinteza pa sve do
biotehnoloških procesa i zaštite okoliša. Mikroreaktori se sve više primjenjuju i u industrijskim
procesima zahvaljujući svojim prednostima poput velike brzine prijenosa tvari i topline te
1. Uvod
2
mogućnosti provedbe egzotermnih ili eksplozivnih reakcija koje zahtjevaju intenzivan nadzor i
provode se pod strožim uvjetima [Jensen 2001]. Velika brzina prijenosa tvari i topline u
mikroreaktoru posljedica je smanjene difuzijske udaljenosti unutar reaktora i velike međufazne
površine po jedinici volumena reaktora u odnosu na konvencionalne makroreaktore. Zbog ovih
prednosti mikroreaktorske tehnologije se sve vise primjenjuju u farmaceutskoj industriji i
industriji finih kemikalija [Geyer et al. 2006]. Jedno od bitnih područja istraživanja je i primjena
enzimatskih mikroreaktora. Enzimatski mikroreaktori se uobičajeno dijele na dvije vrste, oni koji
se koriste u biotransformacijama i oni koji se koriste za ispitivanje kinetike, odnosno interakcija
različitih supstrata i produkata u enzimski kataliziranim reakcijama [Urban et al. 2006].
2. Teorijski dio
3
2. TEORIJSKI DIO
2.1. Heksanal
Heksanal ili kapronaldehid je aldehid molekulske formule C6H12O. Ima specifičan miris,
topljiv je u alkoholu i ulju, ali slabo topljiv u vodi. Važan je element mirisa cvijeta i lista biljaka
kao što su jabuka, avokado i borovnica. Nastaje tijekom ciklusa linoleinske kiseline (LOX). U
tom ciklusu, linoleinska kiselina uz enzim lipoksigenazu, te uz prisutstvo kisika, kao kosupstrata
prelazi u 13-hidroperoksi-9,11-oktadekadiensku kiselinu (13-HPOD). U drugom koraku, ta se
kiselina uz hidroperoksid liazu raspada na 12-okso-9-dodekensku kiselinu i heksanal [Márczy et
al. 2002].
Heksanal je bitan sastavni dio grupe lako hlapivih komponenata poznatijih kao green-
note. Ove komponente su kemikalije koje se upotrebljavaju u prehrambenoj i kozmetičkoj
industriji zbog svojih organoleptičkih svojstava [Schade et al. 2003]. U današnje vrijeme postoji
povećano zanimanje da se kemijska proizvodnja green-note proizvoda zamijeni biološkom
prirodnom proizvodnjom. Potrošnja ovih proizvoda dobivenih prirodnim putem se procijenjuje
na 5- 10 tona godišnje [Muller et al. 1995].
Osim upotrebe u prehrambenoj i farmaceutskoj industriji heksanal se koristi i kao
fungicid i baktericid. Dokazano je da kada se pri uzgoju jabuka koristi kao fungicid istovremeno
djeluje i na poboljšanje okusa ploda [Song et al. 1996].
Prirodnim putem heksanal se proizvodi fermentacijama, ekstrakcijom iz biljaka ili
enzimski kataliziranim reakcijama. Prilikom upotrebe enzima koriste se pročišćeni enzimi,
ekstrakti stanica, te cijele stanice. Primjer upotrebe izoliranog enzima je alkohol dehidrogenaza
koja je katalizira oksidaciju heksanola kojeg je u prirodi puno više nego heksanala [Karra-
Chaabouni et al. 2002]. Uz enzimske ekstrakte, heksanal se proizvodi iz linoleinske kiseline, pa
se za njegovu pripravu koriste stanice raznih biljaka (metvica, jagoda, rajčica, karanfil) koje
sadrže enzime LOX ciklusa. Uz cijele stanice, aldehidi se proizvode mikrobiološkom
oksidacijom primarnih alkohola uz korištenje bakterija Acetobacter i Gluconobacter u
dvofaznom mediju [Vrsalović Presečki 2006] .
2. Teorijski dio
4
Kemijskim putem heksanal se proizvodi oksidacijom heksanola uz katalizator
oksoaminijevu sol [Yamaguchi et al. 1990] ili uz metalne katalizatore (mangan, cink, bakar,
željezo) uz prisutstvo vodikovog peroksida [Guangdong et al. 2005]. Isto tako kemijski se može
proizvesti redukcijom estera, etil heksanoata, uz litij aluminij hidrid ili heksan kiseline uz
katalizator Cr2O3/TiO2 [Vrsalović Presečki 2006].
2.2. Enzimi
Naziv enzim prvi je upotrijebio Kuhne (1878. godine), a potječe od grčke riječi en ziyme
koja znači u kvascu. Još od vremena prije starog Egipta datira prva uporaba enzima za ljudske
potrebe (kvasac u proizvodnji kruha). Danas postoji čitav niz izoliranih enzima tako da je 1989.
izoliran 2461 enzim dok je 1947. bilo tek 200 izoliranih enzima [Vrsalović Presečki 2006].
Enzimi su organske makromolekule proteinskog sastava. To su biološki katalizatori, koji
ubrzavaju kemijske reakcije, a da se pri tome ne troše i ne mijenjaju. Vrlo su aktivni jer vrlo
mala količina enzima ubrzava reakciju 1020
puta. Aktivnost enzima izražava se kao količina
pretvorenog supstrata u mikromolovima u jedinici vremena.
Djelovanje enzima započinje tvorbom kompleksa sa supstratom koji ima manju energiju
aktivacije nego aktivirani intermedijer supstrata bez enzima (slika 1). U tom je kompleksu enzim
vezan uz supstrat Van der Waalsovim i elektrostatskim silama, vodikovim vezama ili rijeđe,
kovalentnom vezom. Kompleksiranje mora biti brzo i reverzibilno, tako da se produkt odvaja od
enzima odmah nakon reakcije i oslobađa enzim za daljnje katalitičko djelovanje. Dok su neki
enzimi strogo specifični i djeluju samo na jedan supstrat, drugi su manje ili grupno specifični.
Specifičnost enzima se očituje i prema djelovima molekule koji su udaljeni od mjesta djelovanja
enzima [Schmid et al. 2001].
Slika 1. Mehanizam enzimatske reakcije
2. Teorijski dio
5
Prednosti enzima pred klasičnim kemijskim katalizatorima su: selektivno i specifično
djelovanje, blagi uvjeti provedbe reakcija (pH, tlak, temperatura), potrebne male količine,
biorazgradljivost, obnovljivost izvora, provedba kompleksnih reakcija u jednom stupnju. Glavni
nedostatci enzima su visoka cijene pročišćavanja i izolacije, teško i skupo odvajanje od
reakcijske smjese, inaktivacija temperaturom, kiselošću, bazičnošću, podložnost ihibiciji
supstratom ili produktom, nestabilnost izvan prirodnog okruženja.
Upotreba enzima seže od primjene u industriji detergenata, prehrambenoj, naftnoj,
tekstilnoj te do najvažnije, organske sinteze u svrhu proizvodnje vrlo kompleksnih lijekova.
Enzimi se djele u nekoliko skupina: oksidoreduktaze (enzimi koji kataliziraju biološke
oksidacije i redukcije), transferaze (enzimi koji kataliziraju prijenos skupina), hidrolaze (enzimi
koji kataliziraju hidrolitička cjepanja), liaze (enzimi koji kataliziraju reakcije eliminacije),
izomeraze (enzimi koji kataliziraju pregradnju unutar molekula), ligaze (enzimi koji kataliziraju
stvaranje veze uz istovremeno cijepanje ATP-a) [Louglin 2000].
2.2.1. Oksidoreduktaze
Oksidoreduktaze su enzimi koji kataliziraju redoks reakcije prijenosom vodikovog ili
kisikovog atoma ili elektrona od jednog supstrata do drugog [Vrsalović Presečki 2006]. Dijelimo
ih na dehidrogenaze, oksigenaze i oksidaze. Imaju veliku važnost u organskim sintezama zbog
velikog broja supstrata s kojima reagiraju kao i zbog posjedovanja enantio-, regio- i
stereoselektivnih svojstava [Sariaslani & Rosazza 1984]. Karakteristika oksidoreduktaza je da
prilikom kataliziranja reakcija, zahtijevaju prisutnost koenzima. Oksidoreduktaze se primjenjuju
za sintezu lijekova, steroida, polimera, oksidativnu razgradnju zagađivača, te za konstrukciju
biosenzora za različite analitičke i kliničke primjene [May 1999].
2.2.2. Alkohol dehidrogenaza (ADH)
Alkohol dehidrogenaza (ADH) je oksidoreduktaza koja je široko rasprostranjena u
prirodi. Može se pronaći u mnogim životinjama, biljkama i mikroorganizmima. Ima važnu ulogu
2. Teorijski dio
6
u širokom rasponu fizioloških procesa [Reid & Fewson 1994]. Poznato je da je ADH tetramer
sastavljen od podjedinica molekulske mase približno 35.000, koje su vrlo slične, no nisu
identične [Harris 1964].
Slika 2. Pojednostavljeni prikaz molekule enzima ADH
Općenito se alkohol dehidrogenaze dijele u tri skupine, srednjočlana Zn-ovisna ADH kao
ADH iz konjske jetre i ADH iz Saccharomyces cerevisiae, kratkolančana Zn-neovisna ADH kao
ADH iz Lactobacillus brevis i dugolančana Fe-ovisna ADH kao ADH IV iz S. cerevisiae
[Jornvall et al. 1987]. ADH katalizira reverzibilnu oksidaciju alkohola u odgovarajući aldehid ili
keton. U različitim ogranizmima otkrivene su ADH koje kataliziraju stereospecifičnu redukciju
karbonilnih grupa. Alkohol dehidrogenaza komercijalno se proizvodi za određivanje alkohola u
procesima i u ljudskom tijelu, odnosno tjelesnim tekućinama [Vrsalović Presečki 2006].
2.2.3. Koenzim nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+)
Osnovna zadaća koenzima je da djeluju kao transporteri kemijskih grupa od jednog do
drugog reaktanta. Nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+) uključen je u mnoge oksidacijske
procese katalizirane dehidrogenazama [Kane 2008]. Nikotinamidni prsten je redoks aktivan,
prima vodikov ion pri čemu se reducira u NADH. Reverzibilni transfer vodikovog iona iz
reduciranog supstrata u NAD+ i obrnuto je stereoselektivan i karakterističan za svaki pojedini
enzim [Bruiee & Benkovic 1965]. Nikotinamid koenzimi obično se ne vežu na enzime
2. Teorijski dio
7
kovalentnom vezom pa se lagano disociraju. Preskupi su da bi ih se koristilo kao reagense u
stehiometrijskom omjeru, stoga je potrebno pronaći način njihove regeneracije ukoliko enzim
zahtijeva prisutnost koenzima.
Slika 3. Struktura koenzima NAD(P)
Regeneracijom koenzima može se utjecati na pomicanje reakcijske ravnoteže.
Termodinamički nepovoljnu reakciju može se, spajanjem s reakcijom regeneracije koenzima,
pretvoriti u termodinamički povoljnu sprečavanjem akumulacije produkta koenzima koji bi
mogao inhibirati proces. U praksi se koristi reducirani oblik nikotinamid koenzima (NADH)
zbog niže cijene od njegovog oksidiranog oblika (NAD+). Postoje različite metode regeneracije
koenzima, ali sve moraju biti regioselektivne, kompatibilne s glavnom enzimskom reakcijom,
praktične, jeftine, te moraju regenerirati koenzim od 102 do 10
5 puta. Trenutno jedino enzimi
omogućavaju tako visoku selektivnost redukcije NAD+ u NADH i obrnuto. Proces regeneracije
enzimom može se provesti istim enzimom kao u glavnoj reakciji ili enzimom različitim od onog
koji se koristi u glavnoj reakciji. Druge metode koje se temelje na kemijskim, elektrokemijskim i
fotokemijskim strategijama nisu dovoljno selektivne [Yoon et al. 2005].
Za učinkovitu
regeneraciju koenzima nužno je da su potrebni enzimi, reagensi i oprema dostupni na tržištu,
jeftini i jednostavni za korištenje.
2. Teorijski dio
8
Slika 4. Mehanizam regeneracije koenzima drugim enzimom
Slika 5. Mehanizam elektrokemijske regeneracije koenzima
2.3. Kinetika enzimskih reakcija
Kinetički model reakcije je matematički izraz koji opisuje zavisnost brzine reakcije o
reakcijskim veličinama i parametrima [Gomzi 1998].
Brzina jednosupstratnih enzimskih reakcija opisuje se Michaelis-Menteničinom
kinetičkom jednadžbom [Dunn et al. 1992]. U navedenoj jednadžbi ovisnost početne brzine
reakcije o koncentraciji supstrata i enzima temelji se na mehanizmu prikazanom sljedećim
jednadžbama:
(1)
U prvom koraku dolazi do reverzibilne reakcije enzima (E) i supstrata (S) pri čemu
nastaje kompleks enzim-supstrat (ES). Taj kompleks se potom kemijski mijenja što rezultira
stvaranjem produkta (P) i njegovim odvajanjem od enzima. Jednadžba koja opisuje Michaelis-
Menteničinu kinetiku za jednosupstratne enzimske reakcije glasi (jednadžba 2):
S
S
m
Sm
cK
cVr
(2)
2. Teorijski dio
9
U navedenom izrazu cS označava koncentraciju supstrata, Vm maksimalnu brzinu reakcije,
KmS Michaelis-Menteničinu konstantu.
Dvosupstratna enzimska kinetika sačinjava glavninu svih enzimskih reakcija [Blanch &
Clark 1993], a drugi supstrat je najčešće koenzim. Michaelis-Menteničin kinetički model za
dvosupstratnu reakciju, prikazan je sljedećom jednadžbom (jednadžba 3):
2S
2S
m1S
1S
m
2S1Sm
cKcK
ccVr
(3)
U reakcijama biotransformacije vrlo često dolazi do inhibicije i deaktivacije enzima.
Inhibicija enzimski katalizirane reakcije javlja se kada se neki spoj, inhibitor, veže na aktivno
mjesto enzima te tako smanjuje brzinu reakcije. Inhibitor može biti supstrat ili produkt neke
kemijske reakcije. Tri su tipa reverzibilne inhibicije enzima: kompetitivna (jednadžba 4),
nekompetitivna (jednadžba 5) i antikompetitivna (jednadžba 6) [Laidler & Bunting 1973].
SP
i
PS
m
Sm
cK
c1K
cVr
(4)
P
i
PS
S
m
Sm
K
c1cK
cVr (5)
P
i
PS
S
m
Sm
K
c1cK
cVr (6)
Kod kompetitivne inhibicije, inhibitor se veže za aktivno mjesto na enzimu te se pritom
natječe sa supstratom za to mjesto. Inhibitor konkurira za aktivno mjesto i smanjuje na njemu
koncentraciju supstrata. To se očituje kao smanjenje brzine reakcije pri niskim koncentracijama
supstrata, a rezultat je povećanje vrijednosti Michaelis-Menteničine konstante. Kod
nekompetitivne inhibicije dolazi do ireverzibilnog vezanja inhibitora na mjesto različito od
aktivnog te se tako ometa vezanje supstrata na aktivno mjesto i inhibira brzina enzimske
reakcije. Antikompetitivna inhibicija je kombinacija dviju prethodno navedenih inhibicija.
Drugi razlog zbog kojeg može doći do smanjenja reakcijske brzine je deaktivacija
enzima. Uzrok smanjenja aktivnosti enzima se vrlo često ne može odrediti. Mogući razlozi
deakcivacije su temperatura, tlak, pH, brzina miješanja, denaturacija proteina, prisutnost ili
2. Teorijski dio
10
odsutnost neke komponente ili kombinacija navedenih faktora [Vrsalović Presečki 2006]. Brzina
deaktivacije enzima se najčešće opisuje kinetikom prvog (jednadžba 7) i drugog reda (jednadžba
8) [Laidler & Bunting 1973].
md
m Vkdt
dV (7)
2
md
m Vkdt
dV (8)
2.4. Mikroreaktori
2.4.1. Svojstva i primjena mikroreaktora
Mikroreaktori su reaktorski sustavi izvedeni u mikroskopskom mjerilu koji su, u cijelosti
ili barem djelomično, proizvedeni korištenjem metodologije mikrotehnologije i
mikroinženjerstva. Sastoje se od mikrokanala izrazito malih dimenzija, karakterističnih veličina
od 10 - 500 μm, urezanih u pločice od stakla, silikona, silicija, polimera, i različitih drugih
materijala (slika 6) [Šalić et al. 2010]. Glavna karakteristika tih sustava je smanjenje volumena
procesne opreme na red veličine od desetak nanolitara do jednog mililitra. Zahvaljujući svojim
mikroskopskim dimenzijama mikroreaktori se odlikuju brojnim prednostima u odnosu na
konvencionalne/klasične makroreaktore. Tako mikroreaktori zauzimaju manje prostora, za
provedbu reakcija potrebna je manja količina kemikalija i energije, a značajno se smanjuje i
vrijeme provedbe reakcije [Nassar et al. 2007].
Slika 6. Mikroreaktori
2. Teorijski dio
11
S druge strane volumen mikroreaktora je još uvijek prevelik da bi njegove dimenzije
utjecale na tijek odvijanja reakcije na molekularnoj razini, ali njegove male karakteristične
dimenzije rezultiraju intenzivnijim prijenosom tvari i energije, i unaprjeđenjem režima strujanja.
U mikroreaktorima je tok fluida obično laminaran, dok u klasičnim reaktorima može biti
laminaran i turbulentan. Kada su prijenos tvari i topline ograničavajući čimbenici, mikroreaktori
su pogodniji za provedbu ovakvih procesa zbog intenzivnijeg prijenosa tvari i topline. Za
mikroreaktore je karakterističan i izrazito velik omjer površine prema ukupnom volumenu.
Odnos površine prema volumenu raste sa smanjenjem promjera reaktora. Za mikroreaktore je
omjer površine prema volumenu u rasponu veličina od 103 – 10
5 m
2 m
-3, dok je ta vrijednost za
makroskopske reaktore oko 102 m
2 m
-3 [Matsushita et al. 2007]. Primjerice, prenošenjem procesa
iz reaktora volumena 1 dm3 u reaktor volumena 30 m
3 (nisu geometrijski slični sustavi), omjer
površine prema volumenu smanjuje se 30 puta. U slučaju prenošenja procesa u mikroreaktor
volumena 30 cm3, taj omjer raste 3000 puta [Wörz et al. 2001]. Razlika mikroreaktora i
makroreaktora je i u tome što stjenka mikroreaktora ima mnogo veći utjecaj na strujanje fluida
nego stjenka konvencionalnih reaktora.
Većina današnjih istraživanja vezanih uz primjenu mikrokanala usmjerena je prema
razvoju mikrosustava za provedbu i analizu procesa (eng. micro-total-analysis-systems, μ-TAS).
U idealnim uvjetima takvi sustavi istovremeno obavljaju pripremu uzorka, miješanje, reakciju,
separaciju, detekciju i obradu podataka. Smatra se da će se zbog mogućnosti dobrog ugađanja
protoka i male koncentracije potrebnih reaktanata takvi sustavi moći ugraditi na teško dostupna
mjesta (ljudsko tijelo, dijelovi postrojenja, dna oceana, vrhovi planina, pustinje, polovi,
svemirske letjelice i slično) te kontinuirano pratiti kemijske i biokemijske procese koji se tamo
odvijaju. Trenutno je najviše pozornosti usmjereno prema istraživanju i razvoju μ-TAS koji se
primjenjuju u analizi DNA i ključnih metabolita vezanih uz različite bolesti [Šalić et al. 2010].
2.4.2. Struktura mikroreaktora
Karakteristične dimenzije unutrašnjih struktura mikroreaktora uglavnom se nalaze u mili-
, mikro- ili nanopodručju s užim ili širim rasponom veličina pojedinih dijelova uređaja koji su
prikazani na slici 7.
2. Teorijski dio
12
Slika 7. Osnovne strukturne jedinice mikroreaktora
Mikrokanali (slika 7a) su osnovne građevne jedinice mikroreaktora, a u većini slučajeva
su paralelni i nalaze se u nizu jedan do drugoga. Omeđeni su spojnicama za dovod reaktanata i
odvod produkata. Mogu biti pravokutnog ili kružnog poprečnog presjeka, površine od nekoliko
μm2 do nekoliko mm
2. Mikrokanali se urezuju u pločice od različitih materijala (npr. metal,
plastika, keramika) različitim tehnologijama urezivanja, što ima za posljedicu različita svojstva
površine mikrokanala, koja bitno utječu na karakteristike strujanja fluida i provedbu procesa.
Svaki kanal može sadržavati manje komore, odnosno može se sastojati od još sitnijih
mikrostruktura koje oblikom podsjećaju na pore [Šalić et al. 2010].
Pojedini protočni kanal ili nekoliko povezanih kanala određene geometrije čini jedan
mikroelement (slika 7b). Tipične dimenzije mikroelementa su 15 mm : 2 mm : 45 mm (širina :
debljina : duljina). S obzirom na izvedbu elementa mikroreaktora, postoje oni s više
2. Teorijski dio
13
ulaznih/izlaznih procesnih tokova koji se spajaju/razdvajaju u zajedničke/odvojene tokove
pomoću tzv. „Y“ ili „T“ spojnica (slika 8).
Slika 8. Prikaz „T“ i „Y“ spojnica
Kombinacija mikroelementa, povezanih linija toka fluida i nosača čini jedan čip (slika
7c.) koji omogućuje lakše povezivanje s vanjskim pumpama i detektorima te spajanje više
elemenata serijski ili paralelno. Mikroreaktorski čipovi se međusobno povezuju paralelno ili
serijski, kako bi se povećala protočnost i produktivnost sustava, s obzirom na protok reaktanata,
produkata ili katalizatora. Takav način povezivanja najčešće se primjenjuje kod mikroreaktora
koji se koriste za provođenje reakcija u plinskoj fazi. Nijedna elementarna ćelija ne može
funkcionirati samostalno jer su joj za neovisan rad potrebni periferni uređaji kao što su
odgovarajuće pumpe ili senzori.
Naziv mikrouređaj odnosi se na element ugrađen u kućište, povezan odgovarajućim
spojnicama s vanjskim pumpama za dovod reaktanata, katalizatora ili povratni tok reakcijske
smjese (slika 7d). Mikrouređaj može biti sastavljen od nekoliko povezanih mikrouređaja, koji u
tom slučaju čine njegove osnovne komponente. Paralelno ili serijski povezani mikrouređaji,
odnosno različite mikroprocesne jedinice za pripremu reaktanata i katalizatora, provedbu
reakcije i separaciju produkata predstavljaju tzv. mikropostrojenje. Građa i veličina
mikropostrojenja ovisi o tipu reaktora koji ga čine i o vrsti reakcija koje se u njemu odvijaju te, u
općenitom slučaju, o tome jesu li reaktori laboratorijskog ili industrijskog mjerila.
2. Teorijski dio
14
2.5. Biokatalitička oksidacija heksanola uz enzim ADH
Biokatalitička oksidacija heksanola provodi se uz enzim alkohol dehidrogenazu pri čemu
kao produkt nastaje heksanal. Za provođenje ove reakcije potrebno je u stehiometrijskom omjeru
dodavati koenzim NAD+ u sustav. Reakcijom se koenzim NAD
+ reducira u NADH kojeg je
potrebno regenerirati natrag u NAD+. Regeneracija koenzima NAD
+ može se provesti reakcijom
redukcije acetaldehida uz koenzim NADH enzimom ADH. Reakcijski sustav prikazan je
kemijskim jednadžbama na slici 9.
Slika 9. Reakcijski sustav
U dvosupstratnoj reakciji regeneracije acetaldehid se reducira do etanola s koenzimom
NADH o kojem ovisi katalitičko djelovanje enzima alkohola dehidrogenaze. Ravnoteža ove
reakcije pomaknuta je ulijevo, pa se udesno pomiče dodavanjem NAD+ u suvišku, podešavanjem
povoljnog pH i dodatkom otopine semikarbazida za uklanjanje etanola.
3. Materijali i metode
15
3. MATERIJALI I METODE
U radu su provedeni pokusi oksidacije heksanola u mikroreaktoru, regeneracije koenzima
NAD+ u mikroreaktoru, reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u serijski
povezanim mikroreaktorima, te potpuno integrirani proces proizvodnje heksanala. Tijekom ovih
procesa određivane su koncentracija NADH i aktivnost enzima NADH spektrofotometrijski, te
koncentracije etanola, heksanola i heksanala plinskom kromatografijom.
3.1. Materijali
3.1.1. Kemikalije
U ovom radu korištene su sljedeće kemikalije: acetaldehid (Fluka, Švicarska), acetonitril
(J. T. Baker, Nizozemska), ADH (Sigma, Belgija), cikloheksanon (Carlo Erba Group,
Francuska), etanol (Carlo Erba Group, Francuska), glicin (Sigma, Belgija), HCl (Kemika,
Hrvatska), heksan (Merck, Njemačka), heksanal (Fluka, Švicarska), heksanol (Merck,
Njemačka), NAD+ (Jülich Fine Chemicals, Njemačka), NADH (Jülich Fine Chemicals,
Njemačka), pirofosfat (Kemika, Hrvatska).
3.1.2. Priprema otopina
Za pripremu glicin-pirofosfatnog pufera pH = 9 potrebno je otopiti 8,34 g Na4P2O7 10
H2O i 0,42 g glicina u 250 cm3 redestilirane vode te podesiti pH otopine dodatkom 1 mol/dm
3
otopine HCl.
1 mol/dm3 otopina HCl pripremljena je miješanjem 8,47 cm
3 36 % - tne HCl sa 100 cm
3
destilirane vode.
Otopina za određivanje baždarnog pravca za NADH c = 0,3 mmol/dm3 pripremljena je
otapanjem 1,49 mg NADH u 7 cm3 glicin-pirofosfatnog pufera.
3. Materijali i metode
16
Otopina za određivanje baždarnog pravca za etanol c = 25 mmol/dm3 pripremljena je
miješanjem 0,0146 cm3 etanola u 10 cm
3 glicin-pirofosfatnog pufera.
Otopina za određivanje baždarnog pravca za heksanol i heksanal pripremljena je
razrijeđivanjem standardnih otopina heksanola i heksanala 200 puta u heksanu, te miješanjem s
1%-tnom otopinom cikloheksanona u heksanu.
1 %-tni cikloheksanon pripravljen je miješanjem 1 cm3 cikloheksanona u 99 cm
3
destilirane vode.
Za određivanje aktivnosti enzima alkohol dehidrogenaze korištene su sljedeće otopine: 2
mmol/L otopina etanola (pripremljena je miješanjem 2,917 cm3 etanola s 250 cm
3 destilirane
vode), otopina NAD+ c = 25 mmol/dm
3 (0,89 g NAD
+ otopljeno u 50 cm
3 destilirane vode), 75
mmol/dm3 glicin-pirofosfatni pufer pH = 9, suspenzija enzima ADH γ = 0,2 mg/cm
3 (1 mg ADH
otopljen u 5 cm3 destilirane vode).
Sve otopine čuvane su u hladnjaku na + 4 ºC, a prije korištenja zagrijavane su u
termostatu na radnu temperaturu od 25 ºC.
3.1.3. Aparatura
3.1.3.1. Mikroreaktorski sustav
Mikroreaktorski sustav (slika 10) sastoji se od mikročipa s mikrokanalima od
borosilikatnog stakla (cijevni mikroreaktor, dužina : širina : visina = 330 : 250 : 50 μm s
unutarnjim volumenom 6 mm3). Srednja hrapavost mikrokanala je u području 0,8 – 2,5 μm
ovisno o načinu izrade. Mikroreaktor je opremljen s dva ulaza "Y"-oblika, za odvojeno uvođenje
različitih procesnih struja i dva izlaza istog oblika. Čipovi mikroreaktora smješteni su u nosač od
nehrđajućeg čelika, koji omogućuje spajanje bez gubitaka (Micronit Microfluidics BV,
Nizozemska). Dvije pumpe (PHD 4400, Harvard Apparatus, SAD) opremljene špricama od
nehrđajućeg čelika (8 cm3, Harvard Apparatus, SAD) korištene su za dovođenje procesnih struja.
Mikroreaktorski čipovi su spojeni na pumpe silicijskim cijevčicama (375 μm O.D., 150 μm I.D.,
Micronit Microfluidics BV, Nizozemska). Protok fluida u mikroreaktoru promatran je pomoću
3. Materijali i metode
17
mikroskopa povezanog na računalo (Motic B1-220A, binokularni Weltzar, Njemačka) na
uvećanjima od 40 x i 100 x (uvećanje okulara = 10 x; uvećanje objektiva = 4 x, 10 x).
Slika 10. Mikroreaktorski sustav: a) injekcijske pumpe, b) mikroreaktorski čip na nosaču
promatran mikroskopom, c) komponente računala)
3.1.3.2. Plinski kromatograf
Koncenentracije etanola, heksanola i heksanala određivane su plinskom kromatografijom
(GC-2014, Shimadzu, Japan) s plameno-ionizacijskim detektorom uz korištenje helija kao plina
nosioca (slika 11).
Slika 11. Plinski kromatograf
3. Materijali i metode
18
3.1.3.3. Spektrofotometar
Dvozračni spektrofotometar (UV-1601, Shimadzu, Japan) korišten je za mjerenje
aktivnosti enzima ADH i za određivanje koncentracije NADH (slika 12).
Slika 12. UV spektrofotometar
3.1.3.4. Centrifuga
Uzorci su centrifugirani na stojećoj, horizontalnoj centrifugi (Universal 320R, Hettich,
Njemačka) na 9000 min-1
kroz 3 minute (slika 13).
Slika 13. Centrifuga
3. Materijali i metode
19
3.1.3.5. Ostala aparatura
o homogenizator (Vibrofix VF1, IKA-Werke, Njemačka)
o filter (Chromafil Xtra PA 20/25, 0.2 μm, 25 mm, a 100, proizvođač, zemlja)
o vaga (EW, max. 1500 g, min. 0.5 g, Kern, zemlja))
o vaga (AUW 120, max. 120 g, min. 10 mg, Shimadzu, Japan)
3.2. Analitičke metode
3.2.1. Mjerenje aktivnosti enzima ADH
Aktivnost enzima ADH je određena spektrofotometrijskim testom koji se temelji na
reakciji oksidacije etanola u acetaldehid u glicin – pirofosfatnom puferu pH 9. Shematski se
reakcija može prikazati jednadžbom 9:
(9)
Spektrofotometrijski je mjerena promjena apsorbancije nastalog NADH pri λ = 340 nm
jer reducirani oblik nikotinamid adenin dinukleotida (NADH) apsorbira maksimalnu količinu
svjetla te valne duljine, dok njegova oksidirana forma (NAD+) u valnom području 300 – 400 nm
ne apsorbira svjetlo.
Iz promjene apsorbancije u vremenu ΔABS/Δt izračunata je volumna aktivnost enzima
ADH prema izrazu (jednadžba 10):
AV
=DABS
Dt×
Vu
Vr×e
340×d
× f (10)
gdje su: f – faktor razrjeđenja; Vr – volumen uzorka (cm3); Vu – ukupni volumen (cm
3);
ε340 – ekstincijski koeficijent (cm2 μm
-1), iznosi 6,22 cm
2 μm
-1 za λ = 340 nm; d – promjer kivete
(cm). Volumna aktivnost je izražena u međunarodnoj jedinici enzimske aktivnosti U po jedinici
volumena pri čemu je 1 U = 1 μmol/min, odnosno ona aktivnost enzima koja je potrebna da se
oksidira 1 μmol/dm3 supstrata u minuti.
3. Materijali i metode
20
Za test je bilo potrebno u kivetu od 3 cm3 odpipetirati 0,500 cm
3 etanola (cEtOH = 2
mol/dm3), 1,000 cm
3 NAD
+ (cNAD+ = 25 mmol/dm
3), 1,490 cm
3 pufera (75 mmol/dm
3 glicin-
pirofosfatni pufer pH = 9), 0,010 cm3 enzima (γADH = 0,2 mg/cm
3).
3.2.2. Mjerenje koncentracije NADH
1 cm3 uzorka iz mikroreaktora izmjerena je apsorbancija na spektrofotometru pri λ = 340
nm. Iz izmjerene apsorbancije izračunata je koncentracija NADH pomoću prethodno
konstruiranog baždarnog pravca (prilog 1). Baždarni pravac određen je mjerenjem apsorbancije
otopine različitih poznatih koncentracija NADH na istoj valnoj duljini.
3.2.3. Mjerenje koncentracija heksanola i heksanala
100 mm3 uzorka iz mikroreaktora pomiješano je sa 100 mm
3 1%-tne otopine
cikloheksanona u heksanu koji je korišten kao unutarnji standard. Smjesa je prvo mješana na
vorteksu 30 – 60 s kako bi se heksanol i heksanal ekstrahirali, a potom centrifugirana 3 min na
9000 rpm pri 4 °C. Nakon centrifugiranja odvojen je i profiltriran gornji organski sloj. Ovaj sloj
je analiziran na plinskom kromatografu s plameno- ionizacijskim detektorom, korištenjem helija
kao plina nosioca, na polarnoj koloni ZB- WAX (l = 30 m; ID = 0,53 mm; df = 1 μm).
Temperatura injektora iznosila je 280 °C, dok je temperatura detektora bila 240 °C. Kolona se
grijala 1 min na temperaturi 50 °C, zatim se zagrijavala na 180 °C brzinom od 10 °C/min, te se
grijala na konačnoj temperaturi od 180 °C 2 min. Vrijeme zadržavanja heksana bilo je 2,1 min,
heksanala 5,9 min, cikloheksanona 9,2 min, a heksanola 9,7 min (prilog 6). Koncentracije
heksanola i heksanala izračunate su pomoću prethodno priređenih baždarnih pravaca (prilog 3 i
prilog 4).
3. Materijali i metode
21
3.2.4. Mjerenje koncentracije etanola
Koncentracija etanola određivana je plinskom kromatografijom s plameno- ionizacijskim
detektorom, korištenjem plina helija kao plina nosioca, na polarnoj koloni ZB-WAX (l = 30 m;
ID = 0,53 mm; df = 1 μm). Temperatura injektora iznosila je 240 °C, kao i temperatura
detektora. Kolona se grijala 1 min na temperaturi 50 °C, zatim se zagrijavala na 125 °C kroz 6
minuta. Uzorci su pripremani miješanjem jednakog volumena uzorka i otopine 1%-tnog
acetonitrila, koji je služio kao unutarnji standard, na vorteksu tijekom jedne minute. Nakon
centrifugiranja (3 min, 9000 rpm, 4 °C) uzorci se injektiraju u plinski kromatograf. Vrijeme
zadržavanja etanola je 3,2 min, a vrijeme zadržavanja acetonitrila je 4,1 min (prilog 5).
Koncentracija etanola izračunata je pomoću prethodno priređenog baždarnog pravca (prilog 2).
3.3. Provedba pokusa u mikroreaktoru
3.3.1. Provedba procesa oksidacije heksanola
Tijekom provedbe procesa oksidacije heksanola korišten je stakleni mikroreaktor
volumena 6 mm3 s dva ulaza i dva izlaza “Y” oblika. Otopina heksanola u heksanu (c = 5,5
mmol dm-3
) kao jedna procesna struja i otopina koenzima NAD+ (c = 5,5 mmol dm
-3) kao druga
procesna struja uvođene su pomoću preciznih injekcijskih pumpi (PHD 4400, Harvard
Apparatus, SAD) u mikroreaktor pri protocima od 5-200 mm3 min
-1.
Za usporedbu različitih sustava proces je proveden u mikroreaktorima s glatkim i
hrapavim stjenkama, te pri omjerima organske i vodene faze 1:1 te 3:1.
Uzorci izlaznih procesnih struja za određivanje koncentracije heksanola i heksanala
prikupljani su u otopini 1 %-tnog cikloheksanona pri čemu je volumen 1 %-tnog cikloheksanona
bio duplo veći od volumena prikupljenog uzorka u kiveti. Prije analize na plinskom
kromatografu uzorci su centrifugirani te filtrirani (Filter Chromafil Xtra PA-20/25; 0,2 um, 25
mm, Macherey-Nagel GmbH CoKG, Njemačka). Aparatura za provedbu procesa oksidacije
heksanola shematski je prikazana na slici 14.
3. Materijali i metode
22
Slika 14. Shematski prikaz sustava za provedu procesa oksidacije heksanola
3.3.2. Provedba procesa regeneracije koenzima NAD+
Provedena su dva nezavisna pokusa s istom koncentracijom NADH, ali različitom
koncentracijom acetaldehida te su praćene konverzije pri različitim vremenima zadržavanja.
Korišten je mikroreaktor volumena 6 cm3, s dva ulaza „Y“-oblika i dva izlaza jednakog
oblika, pri čemu je jedan ulaz korišten za uvođenje procesne stuje acetaldehida i pufera, a drugi
za procesnu struju enzima, koenzima i pufera. Otopine su u mikroreaktor uvođene preciznim
injekcijskim pumpama uz konstantni protok (Harvard Apparatus PHD 4400 USA). Pokusi su
provedeni za različita vremena zadržavanja (0,9 – 9 s) pri čemu je protok dviju procesnih struja
uvijek bio jednak. Uzorci su prikupljani u ledu kako bi se zaustavila reakcija.
Koncentracija enzima ADH u oba pokusa je bila 0,2 mg/cm3, koncentracija NADH 5,5
mmol/dm3, a koncentracija acetaldehida u prvom pokusu je bila 5,5 mmol/dm
3, dok je u drugom
bila 44 mmol/dm3. Aparatura za provedbu procesa oksidacije heksanola shematski je prikazana
na slici 15.
Slika 15. Shematski prikaz sustava za provedbu procesa regeneracije koenzima NADH
3. Materijali i metode
23
3.3.3. Provedba procesa reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u
serijski povezanim mikroreaktorima
Na slici 16 prikazan je sustav serijski spojenih procesa oksidacije heksanola i
regeneracije koenzima. Reakcije su provođene u 75 mmol/dm3 glicin-pirofosfatnom puferu pH =
9 pri temperaturi 25 °C.
Korišteni su stakleni mikroreaktori volumena 6 cm3 s dva ulaza i dva izlaza “Y” oblika.
Otopina heksanola u heksanu (c = 5,5 mmol dm-3
) pri protoku 30 mm3 min
-1 kao jedna procesna
struja i otopina koenzima NAD+ (c = 5,5 mmol dm
-3) i enzima ADH (γ = 0,2 mg cm
-3), pri
protoku 10 mm3 min
-1 kao druga procesna struja uvođene su pomoću preciznih injekcijskih
pumpi (PHD 4400, Harvard Apparatus, SAD) u prvi mikroreaktor. Ulaz u drugi mikroreaktor
jedna procesna struja bila je otopina izreagiranog koenzima NAD+ iz prvog mikroreaktora pri
protoku od 10 mm3 min
-1, dok je druga procesna struja otopina acetaldehida (c = 2 mmol dm
-3)
pri protoku od 10 mm3 min
-1.
Uzorci izlazne procesne struje iz prvog mikroreaktora za određivanje koncentracije
heksanola i heksanala prikupljani su u otopini 1 %-tnog cikloheksanona pri čemu je volumen 1
%-tnog cikloheksanona bio duplo veći od volumena prikupljenog uzorka u kiveti. Uzorci
izlaznih procesnih struja iz drugog mikroreaktora za određivanje koncentracije etanola iz jedne
struje i za određivanje koncentracije NADH iz druge struje, prikupljani su u ledu kako bi se
zaustavila reakcija. Prije analize na plinskom kromatografu i spektrofotometru uzorci su
centrifugirani te filtrirani (Filter Chromafil Xtra PA-20/25; 0,2 μm, 25 mm, Macherey-Nagel
GmbH CoKG, Njemačka).
3. Materijali i metode
24
Slika 16. Shematski prikaz serijski spojenih sustava za za provedu oksidacije heksanola i
regeneraciju koenzima NADH
3.3.4. Provedba procesa potpuno integrirane proizvodnje heksanala
Za provedbu potpuno integriranog procesa proizvodnje heksanala korištena je aparatura
shematski prikazana na slici 17. Eksperiment je proveden na isti način kao i proces oksidacije
heksanola i reakcije regeneracije koenzima u serijski povezanim mikroreaktorima s tom razlikom
da je procesna struja koja sadrži vodenu otopinu enzima ADH i regeneriranog koenzima NAD+
pomoću protočne pumpe uvođena na ulaz prvog mikroreaktora protokom od 10 mm3 min
-1.
Uzorci izlazne procesne struje iz prvog mikroreaktora za određivanje koncentracije
heksanola i heksanala prikupljani su u otopini 1 %-tnog cikloheksanona pri čemu je volumen 1
%-tnog cikloheksanona bio duplo veći od volumena prikupljenog uzorka u kiveti. Uzorci izlazne
procesnih struja iz drugog mikroreaktora za određivanje koncentracije etanola prikupljani su u
ledu kako bi se zaustavila reakcija. Prije analize na plinskom kromatografu uzorci su
centrifugirani te filtrirani (Filter Chromafil Xtra PA-20/25; 0,2 μm, 25 mm, Macherey-Nagel
GmbH CoKG, Njemačka). Aktivnost enzima je praćena nakon 1, 4, 22 i 43 sata na svim izlaznim
procesnim strujama, te je praćena aktivnost po broju prolaza reaktanata kroz sustav, gdje se jedan
prolaz odnosi na potrošenu početnu količinu reaktanata u injekcijskim pumpama.
3. Materijali i metode
25
Slika 17. Shematski prikaz potpuno integriranog procesa proizvodnje heksanala
3.4. Obrada podataka
Za simulacije matematičkog modela procesa korišteni su računalni programi Scientist
(Micromath®) i MATLAB® (MathWork).
Scientist je računalni program razvijen za primjenu u različitim područjima znanosti i
inženjerstva. Omogućava:
rješavanje sustava jednadžbi matematičkih modela koji mogu biti sastavljeni od
nelinearnih jednadžbi, diferencijalnih jednadžbi te Laplace-ovih transformacija
jednostavan unos jednadžbi modela
jednostavno upravljanje podacima
statističku analizu podataka i njihov grafički prikaz
izračunavanje optimalnih parametara modela.
Algoritmi koje upotrebljava Macromath Scientist prilagođeni su iz različitih izvora. Za
rješavanje diferencijalnih jednadžbi koriste se četiri standardne metode (Eulerova, Runge-Kuta,
Runge-Kuta metoda kontrole pogrešaka i Bulirsch-Stoer metoda) te metoda razvijena za
rješavanje sustava jednadžbi (Episode).
3. Materijali i metode
26
MATLAB® je programski jezik za tehničke proračune. Ime je dobio od riječi MATrični
LABoratorij (eng. Matrix Laboratory), pošto mu je osnovni element za obradu podataka matrica
(niz). MATLAB® služi za rješavanje različitih matematičkih problema, te čitavog niza problema
vezanih uz digitalnu obradu signala, upravljanje, regulaciju i identifikaciju sustava. Koristi se za
matematička izračunavanja, modeliranje i simulaciju, analizu i obradu podataka, grafičko
prikazivanje rezultata i razvoj algoritma.
Programski paket MATLAB® ima više funkcija:
omogućuje lako dodavanje novih funkcija izgrađenih pomoću ugrađenih naredbi,
podaci u MATLAB®-u se tretiraju kao matrice, odnosno retci i stupci,
obična varijabla se također predstavlja kao matrica s dimenzijom [11],
sadrži sve naredbe i operacije iz linearne algebre (zbrajanje, množenje, traženje vlastitih
vrijednosti itd.), svi su podaci u obliku pomičnog zareza dvostruke preciznosti (eng.
double float) što osigurava zadovoljavajuću dinamiku i točnost za gotovo sve primjene,
pored realnih varijabli odnosno matrica, program podržava i kompleksne brojeve.
4. Rezultati i rasprava
27
4. REZULTATI I RASPRAVA
U ovom radu istraživani su tipovi strujanja u mikrokanalima različite hrapavosti za
različite omjere protoka organske i vodene faze. Određene su međufazne površine pri paralelnom
i segmentiranom strujanju. Određen je prijenos tvari za komponenete reakcijskog sustava
oksidacije heksanola i regeneracije koenzima. Provedeni su pokusi u kojima su analizirani
različiti procesni sustavi oksidacije heksanola u mikroreaktoru, sustavi s i bez regeneracije
koenzima, sustav s povratnim tokom regeneriranog enzima, a u svrhu određivanja najpovoljnije
procesne konfiguracije.
4.1. Tipovi strujanja u mikrokanalu
Ispitani su tipovi strujanja dvofaznog sustava kapljevina-kapljevina (organska-vodena
faza) u mikrokanalu. Praćena je promjena tipova strujanja pri protjecanju dvofaznog sustava kroz
mikrokanale hrapave površine i mikrokanale glatke površine, gdje se hrapavost površine odnosi
na mikrogeometrijsku nepravilnost površine koja nastaje tijekom postupaka obrade, te promjena
tipova strujanja kao funkcije omjera protoka organske i vodene faze. Na slici 18 prikazane su
fotografije hrapavog i glatkog mikrokanala.
a) b)
Slika 18. Fotografija a) hrapavog mikrokanala, b) glatkog mikrokanala
Različita hrapavost površine mikrokanala utječe na tipove strujanja. Na slici 19 prikazani
su tipovi strujanja u hrapavom i glatkom mikrokanalu pri omjeru protoka organske i vodene faze
30:10 mm3/min. Vidljivo je da je u mikrokanalu hrapave površine uspostavljeno segmentirano
4. Rezultati i rasprava
28
strujanje, dok je u mikrokanalu glatke površine uspostavljeno paralelno strujanje dviju faza.
Također, u mikrokanalu glatke površine ne dolazi do mješanja, a uspostavljena međufazna
površina je postojana od ulaza do izlaza iz mikrokanala.
a) b)
Slika 19. Tipovi strujanja za omjer protoka organske i vodene faze 30:10 mm3/min u
mikrokanalima: a) hrapave površine, b) glatke površine
Promatrajući tipove strujanja u mikrokanalima glatke površine pri različitim omjerima
protoka organske i vodene faze, vidljiva je nestabilnost paralelnog toka pri manjim protocima.
Na slici 20 prikazani su tipovi strujanja za omjere protoka organske i vodene faze 3:1 (slika 20a),
6:2 (slika 20b) i 30:10 (slika 20c) mm3/min. Vidljivo je da je tek pri omjeru protoka 30:10
mm3/min uspostavljen stabilan laminaran tok te su stoga svi daljnji pokusi u ovom radu
provedeni za ovaj omjer protoka organske i vodene faze.
a) b) c)
Slika 20. Profili strujanja za različite omjere protoka organske i vodene faze, a) 3:1
mm3/min; b) 6:2 mm
3/min; c) 30:10 mm
3/min
4. Rezultati i rasprava
29
4.1.1. Određivanje veličine međufazne površine pri paralelnom i segmentiranom
strujanju u mikrokanalu
Međufazna površina u dvofaznom sustavu pri paralelnom toku dviju kapljevina,
uspostavjena u mikrokanalu glatke površine, je jednaka umnošku širine i duljine mikrokanala
(jednadžba 11):
Apar = L W = 332 mm 50 μm (11)
i iznosi 1,66 10-5
m2.
Međufazna površina u dvofaznom sustavu pri segmentiranom toku dviju kapljevina,
uspostavljena u mikrokanalu hrapave površine, ovisi o ukupnom protoku u mikrokanalu. Ova
međufazna površina se određuje zbrajanjem međufazne površine odvojeno za svaki segment
zasebno, te je reda veličine 10-6
m (slika 21). Kontaktna površina sa strane vodene faze je veća
od kontaktne površine sa strane organske faze, zbog načina određivanja. Aproksimirana je ravna
kontaktna površina između segmenata, unatoč njihovoj zaobljenosti, te je stoga kontaktna
površina sa strane vodene faze porasla zbog smanjenja kontaktne površine organske faze.
0 50 100
0,00000
0,00001
0,00002
0,00003
vodena faza
organska faza
A [
m2]
q [mm3/min]
Slika 21. Ovisnost kontaktne površine vodene i organske faze o ukupnom protoku prilikom
strujanja u mikrokanalu hrapave površine
4. Rezultati i rasprava
30
S obzirom da je međufazna površina u mikrokanalu s glatkom površinom 10 puta veća od
međufazne površine mikrokanala s hrapavom površinom, moguće je očekivati veće reakcijske
brzine, te za mala vremena zadržavanja i povećanje konverzije.
4.2. Prijenos tvari u mikrokanalu
4.2.1. Prijenos tvari u reakcijskom sustavu regeneracije koenzima
Ukupna brzina reakcije određena je enzimskom aktivnošću i brzinom kojom se ostvaruje
veza enzim-supstrat. Zbog malih dimenzija mikrokanala, prijenos tvari i brzina difuzije ne
limitiraju ukupnu brzinu reakcije kao u klasičnim makroreaktorskim sustavima.
Utjecaj difuzije za reakciju regeneracije koenzima prethodno je eksperimentalno ispitivan
[Ferk & Ivanković 2011.]. Difuzijski koeficijent (D) za sve komponente koje sudjeluju u reakciji
regeneracije koenzima, a otopljene su u vodi procijenjen je prema Scheibelovoj empirijskoj
korelaciji (jednadžba 12):
2/38
/ 1/3
38.2 101 W
S W
W S S
VTD
V V
(12)
gdje je S ispitivana komponenta (ADH, NADH i etanol), a W otapalo (voda), T je temperatura
(K), VW i Vs su molarni volumeni pojedinih komponenata, a η viskoznost otapala (kg/ms).
Difuzijsko vrijeme (τD) pojedine komponente izračunato je prema jednadžbi 13:
2
/
( )D
S W
R
D
(13)
gdje R predstavlja polumjer mikrokanala. Dobiveni rezultati prikazani su u tablici 1.
Za NAD+ difuzijski koeficijent i difuzijsko vrijeme nisu određivani jer se molarni
volumen NAD+ ne razlikuje značajno od molarnog volumena NADH.
4. Rezultati i rasprava
31
Tablica 1. Procjenjene vrijednosti difuzijskog koeficijenta i difuzijskog vremena pri 25 °C za
sve komponente koje sudjeluju u reakciji regeneracije koenzima
Komponenta Vs
[cm3/mol]
DS/W 109
[ m2/s]
τD
[s]
ADH 335 0,560 30,55
NADH 305 0,551 27,89
Etanol 55,2 1,563 9,99
Acetaldehid 58,9 1,504 10,39
Dobiveni difuzijski koeficijenti korišteni su u postavljenom 2D matematičkom modelu
koji uključuje konvekciju u aksijalnom smjeru () i difuziju u aksijalnom i radijalnom smjeru (,
, slika 22).
Slika 22. Shema mikrokanala s pripadajućim dimenzijama
(2W = 220 µm, H = 50 µm i L = 332 mm)
Bilanca tvari za pojedine komponente (S) u mikrokanalu u stacionarnim uvjetima za
sustav u kojemu se ne odvija kemijska reakcija može se prikazati sljedećim izrazom (jednadžba
14):
2 2
/
2 2( ) S S W S Sc D c c
W
(14)
s pripadajućim rubnim uvjetima (jednadžbe 15):
4. Rezultati i rasprava
32
,(0, ) ; 0 1
(0, ) 0; 1 0
, 0 1 0
, 0 0
S i S
S
E
E
c c
c
c L
W
c L
W
(15)
Prvi član bilance tvari u mikrokanalu (jednadžba 15) predstavlja konvekciju, a drugi
difuziju. Iz prvog rubnog uvjeta (jednadžba 16) koji se odnosi na procesnu struju otopine s
otopljenom ispitivanom komponentom, slijedi da je koncentracija komponente na ulazu u
mikroreaktor, za interval od 0 do 1 (širina mikroreaktora) jednaka početnoj koncentraciji u
ulaznoj procesnoj struji. Za interval od -1 do 0 (širina mikroreaktora) iz rubnog uvjeta slijedi da
je koncentracija komponenti jednaka 0. Sljedeća dva rubna uvjeta podrazumijevaju da na cijelom
intervalu širine na izlazu iz mikroreaktora i na cijelom intervalu dužine na rubovima mikrokanala
nema promjene koncentracije.
cS u jednadžbama predstavljaju koncentracije otopljenih komponenti, DS/W predstavlja
difuzijske koeficijente različite komponente u vodi, ci označava ulaznu koncentraciju, vξ je
linearna brzina strujanja u smjeru .
Nakon što je postavljen matematički model procesa parcijalna diferencijalna jednadžba je
diskretizirana primjenom metode konačnih razlika. Dobivena linearna jednadžba (jednadžba 16)
riješena je u programskom paketu MATLAB
(Prilog 8.4).
, , , 1, , 1, , , , 1, , , 1 , , , , 1/
2 2
2 2( )
S i j S i j S i j S i j S i j S i j S i j S i jS Wc c c c c c c cD
W
(16)
Dobiveni rezultati simulacije matematičkog modela u mikroreaktoru za svaku pojedinu
komponentu reakcijskog sustava regeneracije koenzima prikazani su na slici 23.
4. Rezultati i rasprava
33
a) b)
c)
Slika 23. Rezultati simulacije matematičkog modela difuzije u vodenom dvofaznom sustavu u
mikroreaktoru za: a) ADH, b) NADH, c) etanol
S obzirom na kompleksnost rješavanja parcijalnih diferencijalnih jednadžbi, također je
ispitana mogućnost upotrebe jednostavnih numeričkih aproksimacija za opis difuzije pojedinih
komponenti u mikrokanalu. Kako bi predvidjeli i opisali događaje korištena je metoda dvofaznog
idealnog cijevnog reaktora [Ptičar, 2010] gdje je svaka od dvije faze u mikroreaktoru
matematički opisana kao idealni cijevni reaktor u stacionarnom stanju. Prijenos tvari između faza
odvija se difuzijom koja je opisana jednostavnim kvocijentom razlika koncentracija između dvije
točke i udaljenosti između njih.
Ako je na poziciji x1 koncentracija tvari c1, a na poziciji x2 koncentracija c2
koncentracijski gradijent opisan je izrazom (jednadžba 17):
12
12
xx
cc
x
c
(17)
4. Rezultati i rasprava
34
Model prijenosa tvari difuzijom između dvije vodene faze prikazan je jednadžbom 18
koja je riješena u programskom paketu Scientist (Prilog 8.3).
)(
)(
12
2
2
12
2
1
SSS
S
SSS
S
ccW
Dc
xv
ccW
Dc
xv
(18)
Na slici 24 prikazana je usporedba rezultata simulacija dobivenih rješavanjem
matematičkih modela procesa u programskim paketima Scientist (jednadžba 18) i MATLAB
(jednadžba 16) te je vidljivo da oba modela dobro opisuju eksperimentalne podatke. S obzirom
na jednostavnije i brže rješavanje matematičkog modela procesa koji je temeljen na dvofaznom
idealnom cijevnom reaktoru u ostatku rada korišten je samo ovaj model.
a)
0 2 4 6 8 10
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
V.A
. [U
/cm
3]
[s]
b)
0 2 4 6 8 10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
c [m
mo
l/d
m3]
[s]
4. Rezultati i rasprava
35
c)
0 2 4 6 8 10
0
1
2
3
4
5
c [m
mo
l/d
m3]
[s]
Slika 24. Usporedba eksperimentalnih rezultata i rezultata dobivenih simulacijom matematičkog
modela procesa difuzije u mikrokanalu za: a) ADH, b) NADH, c) etanol (●: eksperimentalni
rezultati; - - - model rješavan u Scientistu, ― model rješavan u MATLABu]
4.2.2. Prijenos tvari u reakcijskom sustavu oksidacije heksanola
Utjecaj prijenosa tvari u reakcijskom sustavu oksidacije heksanola eksperimentalno je
određivan u mikroreaktoru. S obzirom na netopivost heksanola i heksanala u vodi, za reakcijski
sustav oksidacije heksanola određivana je samo difuzija enzima i koenzima (c0,NADH = 7
mmol/dm3, γ0,ADH = 0,2 μg/cm
3). Difuzijski koeficijenti i difuzijska vremena jednaki su onima
procijenjenim u reakcijskom sustavu regeneracije koenzima.
Iako model za difuziju NADH u organsku fazu nije jednak modelu za difuziju u sustavu
voda-voda koji je korišten za difuziju u procesu regeneracije koenzima, zbog pojednostavljenja
računa i simulacija pretpostavljeno je da slijede isti trend. Dobiveni rezultati prikazani su na slici
25. Vidljivo je odstupanje od matematičkog modela pri višim vremenima zadržavanja zbog
pojednostavljenja modela.
4. Rezultati i rasprava
36
0 5 10 15 20
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
c [m
mo
l/d
m3]
[s]
Slika 25. Usporedba eksperimentalnih rezultata i rezultata dobivenih simulacijom matematičkog
modela procesa difuzije u mikrokanalu (metoda dvofaznog idealnog cijevnog reaktora) za
NADH
Kod pokusa u kojima je ispitivana difuzija enzima ADH uočena je njegova deaktivacija u
organskoj fazi te bi za opisivanje ovog sustava u matematički model procesa bilo potrebno
uključiti i koeficijent deaktivacije (slika 26).
0 2 4 6 8
0,00
0,04
5
10
15
20
25
30
V.A
. [U
/cm
3]
[s]
Slika 26. Eksperimentalni rezultati za ADH
4. Rezultati i rasprava
37
4.3. Reakcija oksidacije heksanola
Napravljeni su pokusi pri različitim vremenima zadržavanja u kojima je reakcija
oksidacije heksanola katalizirana enzimom ADH provedena uz prisustvo ekvimolarne količine
koenzima NAD+ (c0,heksanol = 5,5 mmol/dm
3, c0,NAD+ = 5,5 mmol/dm
3, γ0,ADH = 0,092 μg/cm
3) pri
omjeru protoka organske i vodene faze 1:1. Konverzija postignuta u mikroreaktorskom sustavu
za vrijeme zadržavanja = 36 s u mikroreaktoru s hrapavim stjenkama iznosila je 30 %, dok je u
mikroreaktoru s glatkim stjenkama iznosila 60 % (slika 27).
0 10 20 30 40
0
20
40
60
X [
%]
[s]
Slika 27. Ovisnost konverzije heksanola o vremenu zadržavanja za reaktor s hrapavim () i
glatkim () stjenkama pri istim početnim uvjetima
Također, proveden je pokus u mikroreaktoru s glatkim stjenkama pri čemu je omjer
protoka organske i vodene faze bio 3:1, te je pri vremenu zadržavanja = 36 s dobivena
konverzija od 20 % (slika 28).
4. Rezultati i rasprava
38
0 5 10 15 20 25 30 35 40
0
10
20
30
40
50
X [
%]
[s]
Slika 28. Ovisnost konverzije heksanola o vremenu zadržavanja za reaktor s glatkim stjenkama
pri omjeru protoka organske i vodene faze 3:1
Može se zaključiti da je konverzija za iste uvjete u mikroreaktoru s hrapavim stjenkama
manja od konverzije postignute u mikroreaktoru s glatkim stjenkama zbog manje međufazne
površine što je pokazano u poglavlju 4.1.1. Konverzija u mikroreaktoru s glatkim stjenkama
manja je u sustavu s omjerom faza 3:1 zbog deaktivacije enzima ADH organskom fazom.
Unatoč manjoj vrijednosti postignute konverzije sustav u kojemu je omjer protoka faza bio 3:1 je
bolji za provedbu integriranog procesa jer se faze u potpunosti razdvajaju na izlazu iz
mikroreaktora.
4.4. Reakcija regeneracije koenzima
Reakcija regeneracije koenzima (redukcija acetaldehida) provedena je u dva pokusa s
različitim početnim uvjetima. U pokusu 1 početne koncentracije komponenata reakcijske smjese
bile su c0,acetaldehid = 6,9 mmol/dm3, c0,NADH = 5,5 mmol/dm
3, γ0,ADH = 0,2 μg/cm
3. U pokusu 2
početne koncentracije komponenata reakcijske smjese bile su c0,acetaldehid = 44 mmol/dm3, c0,NADH =
5,5 mmol/dm3, γ0,ADH = 0,2 μg/cm
3.
4. Rezultati i rasprava
39
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
X [
%]
[s]
Slika 29. Ovisnost konverzije etanola o vremenu zadržavanja za pokus 1 () i pokus 2 () pri
različitim početnim uvjetima [—: model]
Postignuta konverzija u procesu regeneracije koenzima provedenom s ekvimolarnim
koncentracijama reaktanata iznosila je 80 %, dok je u pokusu sa suviškom acetaldehida (pokus 2)
konverzija iznosila 100 % (slika 29).
4.5. Provedba procesa reakcije oksidacije heksanola i reakcije regeneracije koenzima u
serijski povezanim mikroreaktorima
Na slici 30. prikazan je shematski prikaz reakcije oksidacije heksanola i reakcije
regeneracije koenzima u serijski povezanim mikroreaktorima s izlaznim koncentracijama i
postignutim konverzijama.
4. Rezultati i rasprava
40
Slika 30. Shematski prikaz serijski spojenog glavnog i regeneracijskog sustava sa završnim
koncentracijama i dobivenim konverzijama
Postignuta konverzija heksanola pri ukupnom protoku od 40 mm3/min u mikroreaktoru
za provedbu glavne reakcije iznosila je 17,22 %, dok je u mikroreaktoru za regeneraciju
ostvarena 100 %tna regeneracija koenzima NAD+ pri ukupnom protoku od 20 mm
3/min.
Vrijeme zadržavanja u mikroreaktoru za provedbu glavne reakcije za heksanol je τ = 12 s,
dok je za NAD+ τ = 36 s. Vremena zadržavanja u mikroreaktoru za provedbu regeneracije za
obje procesne struje τ = 36 s. Stoga je reakcija provođena tijekom četiri vremena zadržavanja
komponenti s većim vremenom zadržavanja, tj. reakcija je provođena 144 s.
4.6. Potpuno integrirani proces proizvodnje heksanala
Proces potpuno integrirane proizvodnje heksanala (slika 14) proveden je pod istim
početnim uvjetima kao i oksidacija heksanola i reakcije regeneracije koenzima u serijski
povezanim mikroreaktorima. Na slici 31 prikazane su koncentracije heksanola i heksanala na
izlaznoj procesnoj struji iz provog mikroreaktora i koncentracije etanola na izlaznoj procesnoj
struji iz drugog mikroreaktora u ovisnosti o vremenu, dok je na slici 32 prikazana ovisnost
konverzije heksanola o vremenu provođenja eksperimenta.
cNADH
= 0,66 mmol/dm3
cNADH
= 0 mmol/dm3
cEtOH
= 0,654 mmol/dm3
cNADH
= 0 mmol/dm3
cheksanol
= 3,21 mmol/dm3
cheksanal
= 0,66 mmol/dm3
Xheksanol = 17, 22 %
XNADH
= 100 %
4. Rezultati i rasprava
41
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
heksanol
heksanal
etanol
c [m
mo
l/dm
3]
t [h]
Slika 31. Ovisnost koncentracija heksanola, heksanala i etanola na izlazima o vremenu
0 10 20 30 40 50
0
5
10
15
20
X [
%]
t [h]
Slika 32. Ovisnost konverzije heksanola o vremenu
U procesu proizvodnje heksanala u potpuno integriranom sustavu postignuta je
maksimalna konverzija od 19,5 %. Sustav je bio stabilan unutar prva 4 h provedbe pokusa nakon
čega je došlo do postupnog pada konverzije uslijed deaktivacije enzima, što je također vidljivo iz
povećanja koncentracije heksanola nakon prva 4 h provedbe pokusa. Za postizanje boljih
rezultata potrebna je daljnja optimizacija sustava, prvenstveno u smislu povećanja stabilnosti
enzima u prisutnosti organskog otapala.
Praćena je i aktivnost enzima po prolazu što je prikazano na slici 33. S obzirom da su za
recirkulaciju potrebna dva klipa, od kojih se jedan neprestano prazni, a drugi puni, kraj prvog
4. Rezultati i rasprava
42
prolaza je kada se prvi klip u potpunosti isprazni, a drugi napuni. Tada oni zamijene svoje
funkcije i onaj koji se do tada punio, sada se počinje prazniti, i obrnuto. Vrijeme jednog prolaza
je 27 h.
0 10 20 30 40 50 60
0
10
20
V.A
. [U
/cm
3]
t [h]
Slika 33. Ovisnost aktivnosti enzima o vremenu trajanja procesa
Također, praćena je aktivnost enzima u vremenu (slika 34), tj. dio enzima koji je korišten
za reakciju, sačuvan je u zasebnoj kiveti. Dakle praćena je aktivnost enzima koji nije sudjelovao
u reakciji kako bi se vidjelo kada prestaje djelovanje enzima bez obzira na reakciju.
0 10 20 30 40 50 60 70
0
5
10
15
20
25
V.A
. [U
/cm
3]
t [h]
Slika 34. Dinamička promjena aktivnosti enzima na sobnoj temperaturi u nezavisnom
pokusu
4. Rezultati i rasprava
43
Prema slici 33 vidljivo je da je enzim prestao biti aktivan nakon drugog prolaza, što je u
našem slučaju bilo 54 h nakon početka procesa, dok je na slici 34 vidljivo da bi enzim trebao biti
aktivan 72 sata. Razlog što do opadanja aktivnosti enzima u procesu dolazi ranije je zbog
inhibicije organskih otapala (acetaldehida, heksana, heksanola i heksanala), te je moguće
zaključiti da proces zahtijeva daljnju optimizaciju.
5. Zaključak
44
5. ZAKLJUČAK
U ovom radu proveden je potpuno integriran proces proizvodnje heksanala s potpuno
integriranom regeneracijom i recirkulacijom koenzima u dva međusobno serijski povezana
mikročipa.
U mikrokanalu s hrapavom površinom ostvareno je segmentirano strujanje, dok je u
mikrokanalu s glatkom površinom uspostavljeno paralelno strujanje. Veća međufazna površina
postignuta je u mikrokanalu s glatkom površinom te je stoga i konverzija heksanola u ovakom
reaktoru veća. Također je uočeno da je pri omjeru protoka organske i vodene faze 30:10
mm3/min uspostavljen stabilan paralelan tok ovih faza. Stoga su svi daljnji pokusi
biotransformacije heksanola bili provođeni u mikrokanalu s glatkim stjenkama pri omjeru
protoka organske i vodene faze 30:10 mm3/min.
Analiziran je utjecaj difuzije komponenata reakcijske smjese na učinkovitost procesa u
svakom od serijski povezanih mikročipova, odnosno za reakciju oksidacije heksanola i reakciju
regeneracije koenzima. Za proces regeneracije koenzima NAD+ uočeno je da etanol izrazito
difundira iz jedne faze u drugu, za razliku od enzima i koenzima. Pokazano je da rezultati
simulacije matematičkog modela procesa dobro opisuju eksperimentalne podatke. U procesu
oksidacije heksanola uočena je izrazita difuzija NADH iz vodene u organsku fazu, kao i
postepena deaktivacija enzima djelovanjem organskog otapala.
Za sustav oksidacije heksanola u mikrokanalu s glatkim površinama pri omjeru protoka
organske i vodene faze 1:1 postignuta je konverzija od 60 % pri vremenu zadržavanja 36 s, dok
je pri istom vremenu zadržavanja uz omjer protoka organske i vodene faze 3:1 postignuta
konverzija od 20 %. Unatoč manjoj konverziji pri omjeru protoka organske i vodene faze 3:1, pri
tom omjeru protoka faza bolje je odvajanje faza na izlazu iz mikroreaktora te je ovaj omjer
protoka pogodniji za pri provedbi integriranog procesa proizvodnje heksanala. U sustavu
regeneracije koenzima postignuta je konverzija od 80 % pri vremenu zadržavanja od 9 s u
pokusu s ekvimolarnim koncentracijama reaktanata, dok je u pokusu sa suviškom acetaldehida
pri istom vremenu zadržavanja postignuta konverzija od 100 %. U procesu reakcije oksidacije
heksanola i regeneracije koenzima u serijski povezanim mikroreaktorima postignuta je
konverzija heksanola od 17,22 %, dok je u mikroreaktoru za regeneraciju ostvarena 100 %tna
regeneracija koenzima NAD+. U potpuno integriranom procesu proizvodnje heksanala postignuta
5. Zaključak
45
je maksimalna konverzija od 19,5 %. Sustav je bio stabilan prva 4 h provedbe pokusa nakon čega
dolazi do opadanja konverzije uslijed deaktivacije enzima.
Promatrani integrirani sustav može se koristiti kao proces za proizvodnju heksanola, ali je
nužna daljnja optimizacija procesnih uvjeta prvenstveno zbog nedovoljne stabilnosti korištenog
enzima. Kao sljedeći korak u daljnjem razvoju potpuno integriranog procesa proizvodnje
heksanala nužna je integracija ekstrakcije dobivenog heksanala i recirkulacija regeneriranog
heksanola.
6. Literatura
46
6. LITERATURA
1. Blanch H.W., Clark D.S., Biochemical Engineering, Marcel Dekker, New York, 1993,
str. 151-157
2. Bruiee T.C., Benkovic S.J., Biorganic Mechanisms, Benjamin, New York, 1965, str. 301
3. Brunerie P., Koziet Y., Process for producing natural cis-3-hexenol from unsaturated fatty
acids, US Patent 5,620,879, 1997
4. Doku G.N., Verboom W. , Reinhoudt D.N., van den Berg A., Tetrahedron 61 (2005) 2733
5. Dunn I.J., Heinzle E., Ingham J., Prenosil J.E., Biological Reaction Engineering, Wiley-
VCH, Weinheim, 1992, str. 25-31
6. Ehrfeld W., Hessel V., Löwe H., Microreactors: New Technology for Modern Chemistry.
Wiley-VCH, Weinheim, 2000, str. 1-34
7. Ferk E., Ivanković M., Regeneracija koenzima NAD+ u mikroreaktoru, kemijsko-
inženjerske vježbe, Zagreb, 2011.
8. Gargouri M., Akach N.B., Legoy M.D., Coupled hydroperoxide lyase and alcohol
dehydrogenase for selective synthesis of aldehyde or alcohol, Appl. Biochem.
Biotechnol. 119 (2004) 171-180
9. Geyer K., Codee J.D., Seeberger P.H., Microreactors as tools for synthetic chemist- the
chemists’ round bottomed flask of the 21st century?, Chem. Eur. J. 12 (2006) 8434-8442
10. Gomzi Z., Kemijski reaktori, HINUS, Zagreb, 1998, str. 36-55
11. Guangdong Z., Zhanlin X., Xiaohong G., Hong Z., Yanan L., Xueju L., Tiexin C.,
Wenxing L., Kaiji Z., Transition metal substitued tungstophosphoric compound catalyzed
oxidation of hexanol to hexanal with hydrogen peroxide, React. Kinet. Catal. Lett. 85
(2005) 57-64
12. Harris J.I., Structure and catalytic activity of alcohol dehydrogenase, Nature 203 (1964)
30-34
13. Hildebrand D.F., Lipoxygenases, Plant Physiol. 76 (1989) 249-253
14. Jensen K.F., Microreaction engineering- is small better?, Chem. Eng. Sci. 56 (2001) 293-
303
6. Literatura
47
15. Jornvall H., Persson B., Jeffery J., Characteristics of alcohol/polyol dehydrogenases, the
zinc- containing longchain alcohol dehydrogenases, Eur. J. Biochem. 167 (1987) 195-201
16. Kane C., Tzedakis T., AIChE Journal 54 (2008) 365
17. Karra- Chaabouni M., Pulvin S., Meziani A., Thomas D., Touraud D., Kunz W.,
Bioxidation of n-hexanol by alcohol oxidase and catalase in biphasic micelar systems
without solvent, Biotechnol. Bioeng. 81 (2003) 27-32
18. Laidler K.J., Bunting P.S., The chemical kinetics of enzyme action, Claredon Press,
Oxford, 1973, str. 93-97, 430-435
19. Louglin W.A., Biotransformation in organic synthesis, Bioresource Technol. 74 (2000)
49-62
20. Márczy J.S., Németh Á.S., Samu Z., Háger-Veress Á., Szajáni B., Production of hexanal
from hydrolized sunflower oil by lipoxygenase and hydroperoxid lyase enzymes,
Biotechnol. Lett. 24 (2002) 1673-1675
21. Matsushita Y., Ichimura T., Ohba N., Kumada S., Sakeda K., Suzuki T., Tanibata H.,
Murata T., Pure. Appl. Chem. 79 (2007) 1959
22. May S.W., Applications of oxidoreductase, Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 370-375
23. Muller B.L., Dean C., Whitehead I.M., The industrial use of plant enzymes for the
production of natural “green note” flavour compounds, Bioflavour 95, Dijon (France)
(1995) 339-344
24. Nassar R. Hu J., Palmer J., Dai W., Catal. Today 120 (2007) 121
25. Ptičar A., Numeričke aproksimacije modela enzimske oksidacije L-DOPA u
mikroreaktoru, diplomski rad, Sveučilište u Zagrebu, Zagreb, 2010
26. Reid M.F., Fewson C.A., Molecular characterization of microbial alcohol
dehydrogenases, Crit. Rev. Microbiol. 20 (1994) 13-56
27. Santiago- Gómez M.P., Thanh H.T., Coninck J.D., Cachon R., Kermasha S., Belin J.M.,
Gervais P., Hisson F., Modelling hexanal production in oxido-reducing conditions by the
yeast, Yarrowia lipolytica, Proc. Biochem. 44 (2009) 1013-1018
28. Sariaslani F.S., Rosazza J.P.N., Biocatalysis in natural products chemistry, Enzyme
Microb. Technol. 6 (1984) 242-253
29. Schade F., Thompson J.E., Legge R.L., Use of a plant-derived enzyme template for the
production of the green-note volatile hexanal, Biotechnol. Bioeng. 84 (2003) 265-273
6. Literatura
48
30. Schmid A., Dordick J.S., Hauer B., Kiener A., Wubbolts M., Witholt B., Industrial
biocatalysis today and tomorrow, Nature 409 (2001) 258-268
31. Song J., Leepipattwit R., Deng W., Beaudry R., Hexanal vapor acts as residueless
antifungal agent that enhances aroma biosynthesis in apple fruit, Acta Hort. 464 (1996)
219-224
32. Šalić A., Tušek A., Kurtanjek Ž., Zelić B., Kem. Ind. 59 (2010) 227-248
33. Šalić A., Tušek A., Kurtanjek Ž., Zelić B., Biotechnol. Bioproc. Eng. 16 (2011) 495-504
34. Urban P.L., Goodall D.M., Neil C., Bruce N.C., Enzymatic microreactors in chemical
analysis and kinetic studies, Biotechnol. Adv. 24 (2006) 42-57
35. Vrsalović Presečki A., Studij fumaraze i alkohol dehidrogenaze u biotransformacijama,
dizertacija, Sveučilište u Zagrebu, Zagreb, 2006
36. Whitehead I.M., Muller B.L., Dean C., Industrial use of soybean lipoxygenase forthe
production of natural green note flavor compounds, Cereal Foods World 40 (1995) 193-
197
37. Wörz O., Jäckel K.P., Richter T., Wolf A., Chem. Eng. Technol. 24 (2001) 138
38. Yamaguchi M., Miyazawa T., Takata T., Endo T., Application of redox system based on
nitroxides to organic synthesis, Pure Appl. Chem. 62 (1990) 217-222
39. Yokoyama T., Yamagata N., Hydrogenation of carboxylic acids to the corresponding
aldehydes, Appl. Catal. A. General 221 (2001) 227-239
40. Yoon S.K., Choban E.R., Kane C., Tzedakis T., Kenis P.J.A., J. Am. Chem. Soc. 127
(2005) 10466.
41. Yoshida J., Nagaki A., Iwasaki T., Suga S., Chem. Eng. Technol. 28 (2005) 259.
7. Popis simbola
49
7. POPIS SIMBOLA
Simboli
A - površina [m2]
ABS - aprosbancija [-]
c - množinska koncentracija [mol/dm3]
d - promjer kivete [cm]
D - difuzijski koeficijent [m2/s]
df - debljina filma [μm]
f - faktor razrjeđenja [-]
H - visina mikroreaktora [μm]
ID - unutarnji promjer kolone [mm]
Kd - deaktivacijska konstanta [min-1
]
Ki - inhibicijska konstanta [mmol/dm3]
Km - Michaelis-Menteničina konstanta [mmol/dm3]
l - duljina kolone [m]
L - duljina mikroreaktora [μm]
X - konverzija [%]
r - brzina reakcije [U/mg]
t - vrijeme [s]
T - temperatura [°C]
V - volumen [m3]
V.A. - volumna aktivnost [U/dm3]
Vm - maksimalna brzina reakcije [U/g]
W - širina mikroreaktora [μm]
7. Popis simbola
50
Grčki simboli
γ - masena koncentracija [mg/dm3]
ε - ekstinkcijski faktor [cm2/μm]
η - viskoznost [Pa s]
λ - valna duljina [nm]
τ - vrijeme zadržavanja [s]
Indeksi
P - produkt
r - uzorak
S - supstrat
u - ukupno
W - voda
8. Prilozi
51
8. PRILOZI
8.1. Baždarni pravci
0,0 0,1 0,2 0,3
0,0
0,5
1,0
1,5A
BS
cNADH
[mmol/dm3]
y = 5,0624x
R2 = 0,9998
Prilog 1. Baždarni pravac za određivanje koncentracije NADH
0 5 10 15 20 25
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
AB
S
cEtOH
[mmol/dm3]
y = 0,0054x
R2 = 0,9983
Prilog 2. Baždarni pravac za određivanje koncentracije etanola
8. Prilozi
52
0 1 2 3 4 5
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
AB
S
cheksanol
[mmol/dm3]
y = 0,0078x
R2 = 0,9915
Prilog 3. Baždarni pravac za određivanje koncentracije heksanola
0 1 2 3 4 5
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
AB
S
cheksanal
[mmol/dm3]
y = 0,0059x
R2 = 0,9958
Prilog 4. Baždarni pravac za određivanje koncentracije heksanala
8. Prilozi
53
8.2. Kromatogrami
Prilog 5. Tipični kromatogram za etanol
Prilog 6. Tipični kromatogram za heksanal
8. Prilozi
54
8.3. Jednodimenzijski matematički model difuzije u mikroreaktoru u programskom paketu
Scientist
// MicroMath Scientist Model File IndVars:z DepVars:ce1,ce2 Params:De,W v*ce1'=-(De/W^2)*(ce1-ce2) v*ce2'=(De/W^2)*(ce1-ce2) z=0 ce1=0 ce2=5 De=0.00156 W=0.125 v=213.33 ***
8.4. Dvodimenzijski matematički model difuzije u mikroreaktoru u programskom paketu
MATLAB
clear all clc close all % poèetni uvjeti % nadh-reg
k1=1328; k2=1; k3=0.00001512;
x=[1:50]; y=[1:9];
c(51,y)=0; c(1,1:5)=0; c(1,5:8)=7; i=[0:6]; c(2:3,7)=7; c(2:4,8)=7;
for x=1:50 for y=1:8 for i=0:50 if y>5 && x==2+i c(x,y)=7;
8. Prilozi
55
for y=8:-1:1 if y<5 && x==2+i c(x,y)=0;
for x=1:50 for y=1:7 for i=0:50 for z=2:50 c(4:50,8)=c(4:50,7); if y==5+i && x==z+i c(x,y)=c(x+1,y);
c(x,y)=(k3*k1*((c(x-1,y)+c(x+1,y))/k1^2+(c(x,y+1)+c(x,y-
1))/k2^2)+c(x-1,y))/(1+(2*k3)/k1+2*k1*k3/k2^2); fprintf('c1=%g\n',c(x,y)); for y=8:-1:2 for i=0:50 for z=1:50
c(4:50,1)=c(4:50,2); if y==5-i && x==z+i
c(x,y)=(k3*k1*((c(x-1,y)+c(x+1,y))/k1^2+(c(x,y+1)+c(x,y-
1))/k2^2)+c(x-1,y))/(1+(2*k3)/k1+2*k1*k3/k2^2);
fprintf('c2=%g\n',c(x,y)); end end end end end end end end end end end end end end end
ŽIVOTOPIS
Mia Ivanković je rođena 8. veljače 1989. godine u Koprivnici gdje je s izvrsnim
uspjehom završila Osnovnu školu i Prirodoslovno – matematičku gimnaziju. Školsku godinu
2000./2001. pohađala je na engleskom jeziku u Međunarodnoj osnovnoj školi u Ljubljani. 2007.
godine upisala je preddiplomski studij Kemijsko inženjerstvo na Fakultetu kemijskog
inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu. Demonstrator je na Zavodu za mehaničko i
toplinsko procesno inženjerstvo od 2009. godine te na Zavodu za reakcijsko inženjestvo i
katalizu od 2011. godine. 2009. godine sudjelovala je u pripremi provedbe znanstveno-
istraživačkog projekta EU FP6 - Javnozdravstveni utjecaj dugoročne izloženosti niskoj razini
mješavine elemenata na podložne skupine stanovništva (Public health impact of long-term, low-
level mixed element exposure in susceptible population strata (PHIME) www.phime.org).
Sudjelovala je na 6. susretu studenata i nastavnika Applied Biocatalysis s usmenim priopćenjem
„Laccase based oxidation of phenol in microreactor“ 2010. godine u Zagrebu, te na 7. susretu
studenata i nastavnika Applied Biocatalysis s usmenim priopćenjem „NAD+ coenzyme
regeneration in microchannel – kinetic parameters estimation and modelling“ 2011. godine u
Mariboru. Koautor je nagrađenog postera na 1st
European Congress of Applied Biotechnology u
Berlinu 2011. godine. Sudjelovala je na IX. Susretu mladih kemijskih inženjera s posterima
“Razvoj potpuno integriranog procesa proizvodnje heksanala u mikrokanalu” i “Nisko-
temperaturna razgradnja dušikovog monoksida na Au/Fe2O3 katalizatoru”. Dobitnica je
Dekanove nagrade u ak. god. 2009./2010. za zapaženi znanstveni rad. Preddiplomski studij je s
izvrsnim uspjehom završila 2010. godine i upisala diplomski studij Kemijsko procesno
inženjerstvo. Provela je pet mjeseci u 2012. godini na Katholieke Universiteit Leuven, u sklopu
programa razmjene studenata Erasmus. Aktivno se služi engleskim jezikom, a pasivno
njemačkim. Tokom studiranja završila je 3. stupanj francuskog jezika.