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CHROMATOGRAPHIE : généralités et principe
Historique : -première chromatographie en 1906 par Tswett (séparation des pigments végétaux et isolation de la chlorophylle)
-Prix Nobel de Chimie en 1952 pour Martin et Synge (CPG)
Méthode d’analyse qui sépare les constituants d’un mélange par entrainement au moyen d’une phase mobile (éluant) le long d’une phase stationnaire (gel).
Nature physique des phases : -gaz (molécule volatile) ⇒ Chromatographie Phase Gazeuse -liquide (molécule soluble) ⇒ Chromatographie Liquide
ADSORPTIONPARTAGE
Phase stationnaire = gel
Phase mobile = éluant
Les supports de chromatographie
Gel de silice : bille de petite taille (3µM)porosité faible (petite molécule)pression élevée
Polymère naturel : hydrophile système macro-poreux (surface d’échange) copolymère (+ rigide) dextran, séphadex, sépharose
Polystyrène : + stable chimiquement et physiquement nouveau support : MiniBead, Resource
Les 2 familles de chromatographie
2-chromatographie d’adsorption :- chromatographie échangeuse d’ions- chromatographie d’affinité- chromatographie hydrophobe
1-chromatographie de partage - (ou chromatographie d’exclusion)
Principe de la chromatographie de partage
La technique repose sur la capacité différente des molécules àpénétrer dans les pores de la phase stationnaire.Elles sont éluées dans l’ordre décroissant de leur poids moléculaire.Une chromatographie d’exclusion se déroule en 3 étapes :
-Equilibration-Déposer l’échantillon sur la phase stationnaire-Eluer
= gel filtration, chromatographie d’exclusion,tamissage moléculaire, perméation de gel
Domaine de fractionnement:
Courbe de calibration:
Encombrement stérique (Rayon de Stockes)
⇒ poids moléculaire apparent⇒ Log PMVolume d’élutionexpérimental
Superdex peptide
Superdex 75
Superdex 200
Superdex 30 prep grade
Superdex 200 prep grade
Superdex 75 prep grade
Type de colonne: 103 104102
Echantillon:250µl
Echantillon:1000µl
Limite de la technique : -faible résolution (4-5 pics)-volume d’échantillon faible (1% du volume de gel)-influence du débit (diffusion)-échantillon dilué en sortie de colonne
Débit:0.25 ml/min
Débit:1 ml/min
Echantillon:25µl
Principe de la chromatographie d’adsorption
L SS
L S
L
L
L
L
S+
S
S
S
5 ETAPES : -Equilibration, -Accrochage de la molécule d'intérêt, -Elimination des molécules contaminantes, -Elution, -Régénération
Chaque soluté est soumis à une force de rétention par laphase stationnaire et à une force d’entrainement parl’éluant. On aboutit à une migration différentielle descomposants et en fonction des caractéristiques physicochimiques mises en jeu :-solubilité (polaire/apolaire) pour la chromatographie phasereverse-point isoélectrique pour la chromatographie échangeused’ions-interaction spécifique pour la chromatographie d’affinité
1-La chromatographie échangeuse d’ions
2 4 6 8Protéine= polyion
Cation exchanger :-SP- (sulfopropyl) = fort-CM- (carboxymethyl) = faible
Na+Elution
Anion exchanger :-Q+ = fort-DEAE+ =faible
Cl-Elution
Paramètres d’optimisation:
-force de l’élution et la nature du contre-ion
-volume de gradient et la pente (≠ finesse des pics)
-pH du tampon de fixation
NaCl NaBr
2-La chromatographie d’affinité
Spécificité de groupe :-protéine glycosylée = lectine sépharose-DNA binding protein= héparine sépharose-Enzyme à cofacteur NADP = 2’5’ ADP sépharose-Immunoglobuline = Protein A/G Sepharose-Etiquette polyhistidine= Chelation de métaux
Haute spécificité : immobilisation du ligand
Différentes possibilités pour éluer
1 seul profil d’élution Echantillon concentré Facteur de purification élevé Coût élevé
Capto Q = 2 Euros/mlButyl-sépharose = 2 Euros/mlNi-sépharose = 9 Euros/mlProteinA-sépharose = 61 Euros/ml Anti-cmyc agarose =345 Euros/ml
1- changement de tampon2- pH extreme ou agent chaotrope ⇒ dénaturation3-4 Elution spécifique par compétition ⇒ dessalage
3-La chromatographie hydrophobe
Salting-in Salting-out = précipitation
Conditions thermodynamiques plus favorables pour l’eau
Support hydrophobe
Faiblement substitué (10-50 µMol/ml gel)Interaction faible : élution par [sel]Proteine >20 kDa =HIC
Fortement substitué (500-1000 µMol/ml gel)Interaction forte : élution par hydrophobicité au moyende solvant organique = risque DENATURATIONPeptide-Petite protéine = RPC
Sulfate d’ammonium (NH4)2SO4 -forte saturation (4M)-coût relativement faible-non dénaturant
Paramètre d’optimisation:
-choix du support : + le bras est long, + hydrophobe est la colonne HIC = Butyl-Octyl-Phenyl
RPC = C4-C8-C18
-Pour la RPC : choix de l’ion d’appariement (TFA, PFPA, HFBA, Triéthylamine)
+ -R’’
R’Echantillon Ion
d’appariement
+ + -R
R
Complexe Hydrophobe
-Conditions initiales (pH, force ionique, T°)-Conditions chromatographiques (volume et pente du gradient)
Efficacité (pic fin et symétrique)
Résolution
Sélectivité (séparation entre 2 pics)
Succès d’une chromatographie de partage ou d’adsorption:
Bonne sélectivité Mauvaise sélectivité
ADSORPTION
-taille des particules
-homogénéité (monodisperse)
-tampon
-gradient (longueur, pente)
+HIC-RPC: choix du support
-volume négligeable car accrochage
-capacité de fixation (overload!)
PARTAGE
-volume (ne pas dépasser 1% du gel)
-domaine de fractionnement
-tampon indifférent
-concentration indifférente
Sélectivité :
Efficacité :
Limites des différentes chromatographies :
Capture : isoler, concentrer et stabiliser Intermediate Purification : éliminer grosses impuretés Polishing: haut degré de pureté
Capture
Intermediate Purification
Polishing
Comment mettre au point une stratégie de purification?
⇒Démarche CIPP en 3 étapes :
Aptitudes des différentes chromatographies pour la CIPP
Techniques Resolution Rendement Capacité Capture IntermP PolishIEX
HIC
RPC
Affinity - ()
Gelfiltration
Capture
Intermediate Purification
Polishing
Chromatographie`Echangeuse d’ions
ChromatographieHydrophobe
Combinaison « logique »
Règle générale: 1- associer des chromatographies avec des sélectivités complémentaires 2- minimiser les étapes intermédiaires (dialyse, concentration)
Capture :
IntermediairePurification :
Polishing : Gel Filtration ou Chromatographie phase reverse
ChromatographieD’affinité
Chromatographie`Echangeuse d’ions
ChromatographieHydrophobe
Gel Filtration ou Chromatographie phase reverse
Gel Filtration ou Chromatographie phase reverse
Autres considérations = l’échantillon biologique
Propriétés de la protéine point isoélectrique, poids moléculaire ligand spécifique
Origine *milieu de culture très dilué*localisation cellulaire cytosoluble/membranaire *subcellulaire enrichissement
Nature des contaminants polysaccharide, lipides, Acides Nucléiques protéine majoritaire
2-Taille des pores du support
30 µM15 µM
5 µM
Considérations « chromatographiques »
1-Rendement
3-Débit
90 µM
3 µM
Exemple 1: Purification d’une protéine recombinante étiquetée
purification «orientée», solubilité, immunodétection,
Tag Matrice Conditions d’élution
Poly-His Ni2+, Co2+ Imidazol, pH acideGlutathione S transférase Glutathione agarose Glutathion réduitMaltose Binding domain Amylose agarose MaltoseCalmodulin Binding domain Calmodulin Agarose EGTAStrep-tag Streptavidin-sépharose Biotin
BSA (8 µg)
M25 (8 µg)
PM
Exemple 2: Purification d’une phospholipase recombinante
SDS-PAGE 15%
protéine sécrétée dans le milieu de culture de cellules d’insecte(Baculovirus)
Purification en 3 étapes de chromatographie:
-capture=Héparine-sépharose
-intermediaire =Colonne Echangeuse de cations (SP)
-polishing= Phase reverse (C18) en HPLC
Exple 3: Purification d’une métalloprotéine protéine membranaire dans les cellules épithéliales de rein (lapin)
Purification en 1 seule étape de chromatographie:
-extraction des membranes par action d’un détergeant
-purification par affinité (anticorps monoclonal greffé)