T E S I S - Instituto Politécnico Nacional1 Determinación de la DL 50 de la boroxazolidonas de glicina 36 2 Determinación de la DL 50 de la boroxazolidonas de aspártico 38

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

“FARMACOCINÉTICA DE LAS BOROXAZOLIDONAS DE GLICINA, GLUTAMATO Y ASPARTATO Y SU RELACIÓN CON LA ACTIVIDAD

FARMACOLÓGICA CENTRAL”

T E S I S

Que para obtener el grado de

Doctor en Ciencias Quimicobiológicas

PRESENTA M. EN C. ALBERTO GARCÍA GONZÁLEZ

DIRECTORES

DR. EDUARDO RAMÍREZ SAN JUAN DR. GABRIEL MARCELÍN JIMÉNEZ

MÉXICO, D.F., DICIEMBRE DE 2010

1

2

3

4

5

Durante la realización de este proyecto se contó con el apoyo de

CONACYT (Beca escolar con registro No. 94745)

6

ÍNDICE

ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS i RESUMEN ii ABSTRACT iii 1. INTRODUCCIÓN 1 1.1. Farmacocinética 1 1.1.1. Absorción de los fármacos 5 1.1.2. Biodisponibilidad 6 1.1.3. Área bajo la curva 7 1.1.4. Concentración máxima 8 1.1.5. Tiempo en el que se alcanza la Cmáx 8 1.1.6. Distribución 8 1.1.7. Volumen de distribución 9 1.1.8. Biotransformación 10 1.1.9. Eliminación 11 1.2. Actividad biológica de compuestos del boro 13 1.2.1. Ácido bórico y sus sales 14 1.2.2. Derivados del ácido bórico 15 1.2.3. Organoboratos 17 1.2.4. Compuestos del boro en oncología 18 1.2.5. Boroxazolidonas 20 2. JUSTIFICACIÓN 22 3. HIPÓTESIS 23 4. OBJETIVOS 24 4.1. Objetivo general 24 4.2. Objetivos particulares 24 5. MATERIALES Y MÉTODOS 25 5.1. Material biológico 25 5.2. Toxicidad aguda DL50 25 5.3. Coordinación motora 27 5.4. Desarrollo y validación del método analítico para la cuantificación de las difenilboroxazolidonas en manchas de sangre seca (DBS) en ratas por UPLC MS/MS 28 5.4.1. Curvas de calibración y puntos control 29 5.5. Validación 30

7

5.6. Preparación y procesamiento de las muestras en manchas de sangre seca en rata 31 5.7. Farmacocinética 33 6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 34 7. RESULTADOS 36 7.1. Toxicidad aguda DL50 36 7.2. Coordinación motora 41 7.3. Desarrollo y validación del método analítico para la cuantificación de las difenilboroxazolidonas en manchas de sangre seca (DBS) en ratas por UPLC MS/MS 45 7.4. Validación 52 7.5. Farmacocinética 55 8. DISCUSIÓN 60 8.1. Toxicidad aguda DL50 60 8.2. Coordinación motora 62 8.3. Desarrollo y validación del método analítico para la cuantificación de las difenilboroxazolidonas en manchas de sangre seca (DBS) en ratas por UPLC MS/MS 68 8.4. Validación 81 8.5. Farmacocinética 82 9. CONCLUSIONES 86 10. PERSPECTIVAS 90 11. REFERENCIAS 91 12. ANEXOS 100

8

ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS

Figura Página

No.

1 Curso temporal de un fármaco después de la administración oral única 2

2 Parámetros farmacocinéticos que se pueden determinar después de una -

administración oral 4

3 Representación esquemática de la biodisponibilidad oral 7

4 Representación macromolecular del citocromo P-450 11

5 Aplicaciones químicas de compuestos organoboranos 13

6 Complejo de cinco miembros de ácido bórico con cis-dioles 14

7 Coordinación del boro en la Boromicina 16

8 Ácido 3-amino-4-carboxifenilbórico 18

9 Ácido para-carboxifenilbórico 19

10 DFBOZA de glicina 20

11 DFBOZA del ácido L-aspártico 21

12 DFBOZA del ácido L-glutámico 21

13 Adiestramiento de ratas en el Rotarod 28

14 Obtención de muestras de sangre a través de un corte en el extremo-

de la cola de la rata y manchas en las tarjetas Whatman 903 de algodón-

extrapuro 32

15 Efecto de la DFBOZA-gly (120 mg/kg sobre la coordinación motora-

en rata 42

9

16 Efecto de la DFBOZA-L-asp (210 mg/kg sobre la coordinación motora

en rata 43

17 Efecto de la DFBOZA-L-asp (210 mg/kg sobre la coordinación motora

en rata 44

18 Abundancia isotópica obtenida por ESI (+) de DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp-

Y DFBOZA-L-glu 48

19 Patrones de fragmentación obtenidos por ESI (+) de DFBOZA-gly, -

DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu 49

20 Curvas de calibración utilizadas para la cuantificación de DFBOZA-gly, -

DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu 51

21 Cromatográmas que muestran canales independientes obtenidos por –

UPLC-MS/MS 54

22 Perfiles farmacocinéticos obtenidos en DBS en ratas Wistar macho, donde-

Se grafica concentración sanguínea contra tiempo, después de una dosis única-

intragástrica 56

23 Gráfica de la valoración iónica de glicina 77

Tabla Página

No.

1 Determinación de la DL50 de la boroxazolidonas de glicina 36

2 Determinación de la DL50 de la boroxazolidonas de aspártico 38

10

3 Determinación de la DL50 de la boroxazolidonas de glutámico 39

4 Clasificación de las sustancias de acuerdo a su toxicidad aguda 40

5 Gradiente de elusión de la fase móvil utilizado en la separación de las-

difenilboroxazolidonas en estudio 45

6 Parámetros utilizados en el espectrómetro de masas por electrospray-

positivo y modo MRM para la cuantificación de DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp y-

DFBOZA-L-glu en DBS 47

7 Resultados de los parámetros obtenidos durante la validación del método-

analítico para la cuantificación de las difenilboroxazolidonas en manchas de-

sangre seca en rata por UPLC-MS/MS 53

8 Parámetros farmacocinéticos obtenidos después de la administración

intragástrica de una dosis única de DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu-

en ratas Wistar macho 57

11

RESUMEN

Un número cada vez mayor de compuestos que contienen boro presentan una

actividad biológica importante, de especial interés son los derivados de -

aminoácidos borínicos con actividad en el Sistema Nervioso Central. Un método

validado, sensible y específico por cromatografía de ultra alta resolución (UPLC)

acoplado a un detector de espectrometría de masas en tandem se utilizó para la

cuantificación de las difenilboroxazolidonas de glicina (DFBOZA-gly), del ácido L-

aspártico (DFBOZA-L-asp) y del ácido L-glutámico (DFBOZA-L-glu) en manchas de

sangre seca de rata.

Resultados: La señal obtenida más intensa corresponde a los compuestos con 11B.

El procedimiento de extracción fue la elusión liquida de una perforación de 3.2 mm

de manchas de sangre seca (DBS) con acetonitrilo:ácido fórmico 0.1 % acuoso

(80:20 v/v); los métodos ensayados resultaron ser lineales, exactos y precisos en

un rango de 0.3 a 50 µg/mL para DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu, y de 0.1 a 5

µg/mL para DFBOZA-gly. Los picos con un tiempo de corrida de 2.0 minutos

exhiben limpieza cromatográfica, y una relación señal-ruido para el limite de

cuantificación aproximadamente de 15:1. El método se utilizó para evaluar la

farmacocinética de las moléculas y correlacionarlas con la actividad en el Sistema

Nervioso Central.

12

Conclusiones: La técnica de manchas en sangre seca representa una gran ventaja

para la recolección de pequeños volúmenes de muestras, fácil procesamiento y

almacenaje. La detección por UPLC-MS/MS nos permite no sólo identificar el

patrón isotópico del boro en las difenilboroxazolidonas, sino también para

cuantificarlas con precisión y especificidad.

La farmacocinética de estas moléculas presentan un volumen de distribución

aparente alto, esto sugiere la preferencia de las difenilboroxazolidonas de

aminoácidos a los tejidos grasos como el sistema nervioso central.

13

ABSTRACT

A growing number of boron-containing compounds exhibit many important

biological activities; of particular interest are the alpha-aminoacid borinic

derivatives with activity in the Central Nervous System. A validated, sensitive, and

specific Ultra-performance liquid chromatography/Tandem mass spectrometric

technique for quantification of the diphenylboroxazolidones of glycine (DBPX-gly),

L-aspartate (DPBX-L-asp), and L-glutamate (DPBX-L-glu) in dried blood spots of rat

blood.

Results: The most intense signal corresponds to compounds with 11B. The

extraction procedure was liquid elution of 3.2 mm punched DBS with acetonitrile:

aqueous formic acid 0.1% (80:20 v/v); and assays proved to be linear, falling

accurately and precisely within the range of 0.3 - 50 µg/mL for DPBX-L-asp and

DPBX-L-glu, and 0.1 - 5 µg/mL for DBPX-gly. Chromatograms exhibit clean 2.0 min

running time peaks, and signal-to-noise ratios for the low quantification limit were

ca. 15:1. The technique was used to evaluate the pharmacokinetics of the

molecules and to correlate these with activity in the Central Nervous System.

Conclusion: Dried blood spots represent an advantage for the collection of small

volumes of samples, and also in terms of processing and storage. UPLC-MS/MS

allow us not only to identify the isotopic pattern of boron in

diphenylboroxazolidones, but also to quantify them with accuracy and specificity.

14

Pharmacokinetics of these molecules exhibit a high apparent volume of

distribution; it suggests a preference of DPBX-aa for fatty tissues like CNS.

15

1. INTRODUCCIÓN

1.1. FARMACOCINÉTICA

Para que un fármaco llegue al sitio receptor o de acción, a partir del lugar en que

fue depositado, se requiere que éste sea transportado a través del organismo. Las

características de éste transporte a través del organismo, pueden variar según las

propiedades fisicoquímicas del fármaco, de la fisiología de las distintas especies

que lo reciban y dentro de la misma especie, del estado fisiopatológico de dicho

organismo receptor. La evolución temporal de un fármaco en el organismo se

puede esquematizar en cuatro etapas, cuyo desarrollo in vivo es prácticamente

simultáneo: absorción, distribución, biotransformación y excreción (ADBE). Esa

evolución temporal del principio activo in vivo influye o está relacionada con la fase

farmacodinámica a nivel de biofase y por tanto, de la actividad biológica del

fármaco en cuanto a intensidad y duración del efecto. El proceso ADBE forma

parte de una disciplina científica denominada Farmacocinética (FC), la cual estudia

la evolución temporal de concentraciones y cantidades de fármaco y sus

metabolitos en fluidos, tejidos y excretas biológicas, así como la respuesta

farmacológica observada, que puede ser terapéutica o tóxica y construye modelos

matemáticos para interpretar los datos obtenidos (Rowland y Tozer, 1995;

Cárdenas Rodríguez y Cortés Arroyo, 2000).

La FC trata de describir en términos simples los fenómenos complejos que están

involucrados en la respuesta terapéutica (Levy y Bauer, 1986). Para que se

16

produzca una respuesta farmacológica, el fármaco debe alcanzar, en el sitio de

acción, una determinada concentración y mantenerla el tiempo suficiente. Si bien

la concentración alcanzada depende de la cantidad de fármaco administrado,

también depende del grado y la velocidad de su absorción, distribución, unión o

depósitos en los tejidos, biotransformación y excreción (Fig. 1).

Figura 1. Curso temporal de un fármaco después de la administración

oral única.

El hecho de administrar un fármaco en el organismo tiene como objetivo la

obtención de un efecto farmacológico. El efecto de un fármaco se ha asociado a la

concentración plasmática que éste alcance, por lo que se infiere que si hay una

excreción

pH = 5 - 7

heces

pH = 1 - 3

desintegración

desintegración

disolución

disolución

absorción

metabolismo

intestinal

absorción

metabolismo

hepático

efecto farmacológico

vaciamiento gástrico

tránsito intestinal

17

alteración en las concentraciones plasmáticas entonces habrá cambios en la

actividad del fármaco (Erill, 1992).

El estudio de los procesos de absorción, distribución y eliminación de fármacos,

permite estimar el curso del fármaco en el organismo. Para realizar la estimación,

la farmacocinética utiliza diferentes parámetros. Dentro de los parámetros más

relevantes tenemos a la concentración máxima (Cmáx), el tiempo requerido para

alcanzar esta concentración (Tmáx), biodisponibilidad (F), el área bajo la curva

(ABC), el tiempo de vida media (t1/2), el volumen de distribución (Vd) y la

depuración (Cl).

Después de una administración por vía oral los parámetros que se pueden

determinar son la Cmáx, Tmáx, y el ABC mientras que los parámetros restantes se

puede calcular después de una administración intravascular (i.v.) (Cadwallader,

1983) (Fig. 2).

18

Figura 2. Parámetros farmacocinéticos que se pueden determinar

después de una administración oral (modificado de Goodman y Gilman

2007).

El ABC calculada matemáticamente, depende de la cantidad de fármaco absorbido

y nos permite tener una estimación de la biodisponibilidad, la cual es un indicador

del grado y la velocidad con la que un fármaco alcanza la circulación sistémica

(Cadwallader, 1983). Por otro lado, tanto la Cmáx como la Tmáx nos dan una idea

acerca de la velocidad de absorción, así como la posibilidad de alcanzar

concentraciones terapéuticas o tóxicas. Mientras que el t1/2 da una estimación de la

duración del efecto farmacológico y se puede definir como el tiempo que se

requiere para que una concentración dada del fármaco disminuya en un 50 %. El

Vd se refiere al volumen hipotético en el cual se distribuye un fármaco y la Cl se

0

20

40

60

ABC

Tmáx

Cmáx

Cpp

Tiempo

t1/2

Ke

19

refiere a la capacidad que tiene el cuerpo para eliminar un fármaco (Gibaldi y

Perrier, 1975; Rowland y Tozer, 1989).

1.1.1. ABSORCIÓN DE LOS FARMACOS

La absorción consiste en el paso de un fármaco desde su lugar de administración

hasta circulación sistémica para después ejercer sus efectos. Es la verdadera

entrada del principio activo en el organismo. El ritmo y la eficiencia de la absorción

dependen de la vía de administración. En la vía i.v., la absorción es completa; es

decir la dosis total del fármaco alcanza el compartimiento central. Sin embargo, si

la administración se lleva a cabo por vía extravascular, la absorción puede ser

incompleta y por lo tanto sólo una fracción de la dosis administrada llegará a la

sangre.

La absorción puede ser modificada por una gran variedad de factores como por

ejemplo: el nivel de vascularización, el flujo sanguíneo, las propiedades

fisicoquímicas del fármaco, el área de absorción, vaciado gástrico, estado físico del

medicamento, etc., (Goodman y Gilman΄s, 2007; Tietze y Lakshmi, 1994;

Mayersohn, 1987;). Los factores que modifican la absorción de un fármaco pueden

también alterar su biodisponibilidad total y como consecuencia sus efectos

farmacológicos. Para que un fármaco se absorba es necesario que se encuentre en

solución, ya que es la única manera en que puede pasar hacia la sangre.

20

1.1.2. BIODISPONIBILIDAD

Se ha mencionado que la velocidad y la cantidad con que un fármaco llega a la

sangre, influyen en las etapas que conducen al efecto terapéutico. La cantidad

relativa de un fármaco inalterado administrado que alcanza la circulación general,

y la velocidad a la cual esto ocurre, se define como biodisponibilidad. Para

determinar la biodisponibilidad se comparan los niveles plasmáticos de un fármaco

después de haberlo administrado por una determinada vía (p. ej., oral) con los

niveles plasmáticos alcanzados tras su administración i.v., que permite que todo el

fármaco penetre rápidamente en la circulación. Los factores que influyen en la

biodisponibilidad de un fármaco son: metabolismo, solubilidad del fármaco,

inestabilidad química y tipo de formulación del medicamento, entre otros.

Otro aspecto importante relacionado al concepto de biodisponibilidad, es el de

Bioequivalencia: del cual se acepta que “la respuesta de los pacientes a un

medicamento puede ser variable. Esta variabilidad depende de factores tales como

la gravedad de la enfermedad y de la rapidez con que se metaboliza y excreta el

fármaco, así como de otros factores farmacocinéticos. Sin embargo, una fuente de

variación es la biodisponibilidad del fármaco en la forma farmacéutica utilizada, es

decir, la rapidez y la magnitud de su absorción” (Fig. 3).

21

Figura 3. Representación esquemática de la biodisponibilidad oral

(modificado de Rowland y Tozer, 1995).

1.1.3. AREA BAJO LA CURVA

El ABC es proporcional a la cantidad total de fármaco absorbida, esta en relación

con la biodisponibilidad, el ABC desde tiempo cero hasta infinito, representa la

cantidad de fármaco que llega a tejido sanguíneo. Cuando la aplicación del

medicamento es por vía intravenosa periférica (i.v.), el único parámetro

determinante de la biodisponibilidad es por tanto, el ABC, la cual representa un

100 % de biodisponibilidad, ya que se considera que la dosis aplicada, llega de

modo integro e instantáneo a circulación sistémica.

22

1.1.4. CONCENTRACION MÁXIMA

Este es un parámetro determinante de la biodisponibilidad de un fármaco

contenido en un medicamento, aplicado por vía extravascular (e.v.). Desde un

punto de vista cualitativo, este parámetro esta en función de la cantidad y de la

velocidad de absorción del principio activo. La Cmáx esta en función directa de la

cantidad de fármaco absorbida y en función inversa a su volumen aparente de

distribución.

1.1.5. TIEMPO EN EL QUE SE ALCANZA LA Cmáx

Este parámetro de la biodisponibilidad esta en función de: la velocidad de

absorción del principio activo; a mayor velocidad de absorción del fármaco, mas

tempranamente se presentara el denominado Tmáx, es decir, el tiempo en el cual la

concentración plasmática o sanguínea del fármaco fue la máxima. Así también esta

determinado por la velocidad de excreción del fármaco, la relación en este caso es

inversamente proporcional.

1.1.6. DISTRIBUCIÓN

Una vez que el fármaco se ha absorbido, el proceso de distribución es el

responsable del paso de fármacos de un lugar a otro del organismo, pudiendo

depender también de varios factores que limitan su velocidad. El proceso de

distribución es continuo hasta que se establece un equilibrio entre el fármaco libre

y el fármaco unido a proteínas ya sea en el espacio intravascular o extravascular

(Rowland y Tozer, 1989). Dentro de los factores que pueden determinar el patrón

23

de distribución de un fármaco está el flujo sanguíneo, ya que si un órgano recibe

una gran cantidad de flujo sanguíneo la distribución es muy rápida, mientras que

en los órganos que están poco perfundidos la distribución es lenta. Otro de los

factores son las propiedades fisicoquímicas del fármaco para atravesar las

membranas y la unión a proteínas (Gibaldi, 1991), limitando así su distribución a

los diferentes órganos. Se sabe que la distribución de un fármaco puede estar

limitada por la unión del fármaco a las proteínas plasmáticas, en particular a la

albúmina. La unión de los fármacos a las proteínas plasmáticas implica,

consecuencias farmacocinéticas importantes, ya que solamente el fármaco que se

encuentra en su forma libre puede dejar la circulación sanguínea, distribuirse en el

espacio extracelular y ejercer así sus efectos farmacológicos. La forma ligada

permanece en la sangre, no se metaboliza ni se elimina (Wepierre, 1987). Un

fármaco que se encuentra altamente unido a proteínas tiene un acceso restringido

a los sitios de acción y depuración, ya sea hepático o renal, de tal manera que se

puede retardar su metabolismo y consecuentemente su eliminación.

1.1.7. VOLUMEN DE DISTRIBUCIÓN

El volumen de distribución (Vd) es el volumen hipotético de líquido en el que se

dispersa un fármaco. Aunque el Vd carece de bases fisiológicas o físicas, resulta

útil para comparar la distribución de un fármaco con los volúmenes de los

compartimentos del organismo. El Vd es una constante de proporcionalidad que

relaciona la concentración en plasma o sanguínea y su cantidad en el organismo.

El Vd es un dato de la cinética de distribución del fármaco en el organismo, se

24

expresa como la relación entre la dosis de fármaco administrada y la concentración

del mismo medida en el plasma o sangre.

1.1.8. BIOTRANSFORMACIÓN

El metabolismo se refiere a la biotransformación química del fármaco,

generalmente se lleva a cabo hasta en dos fases: la fase I también conocida, como

reacciones no sintéticas, incluyen a las reacciones de oxidación/reducción,

hidrólisis, estas reacciones se llevan a cabo mediante enzimas que se encuentran

en el retículo endoplásmico o en los microsomas. Estas enzimas pertenecen al

grupo de las oxidasas de función mixta o al sistema citocromo P-450 (Fig. 4).

Convirtiendo al fármaco en moléculas más polares al adquirir grupos –OH, -NH2, u

otros (Kim y cols., 1998).

A las reacciones de conjugación o sintéticas también se le conoce como la fase

II, en este tipo de reacción al fármaco se le confiere polaridad con sustratos

endógenos como el ácido glucurónico, ácido acético o aminoácidos, entre otros, sin

embargo, sus metabolitos son mucho menos activos que los fármacos originales y

más polares por lo que se facilita su eliminación. La conjugación tiene lugar tanto

en los microsomas como en el citosol (Kim y cols., 1998).

25

Figura 4. Representación macromolecular del citocromo P-450 (tomada

de Shimada T., 1994).

1.1.9. ELIMINACIÓN

Los fármacos pueden ser eliminados del organismo por múltiples vías. Este

proceso se lleva a cabo por metabolismo y/o por excreción. Diferentes órganos son

26

los encargados de realizar la eliminación, entre los órganos más importantes

tenemos al hígado, el cual es el principal sitio para el metabolismo de la mayoría

de los fármacos (Rowland y Tozer, 1989). Sin embargo, algunos fármacos son

biotransformados por otros órganos como el riñón, el tracto gastrointestinal, los

pulmones, etc. Así, algunos fármacos se excretan en la bilis, otros como las

sustancias volátiles se excretan en la respiración, pero la mayoría se excreta a

través de los riñones. Cabe hacer mención que muy pocos fármacos se eliminan

sin cambio a través del riñón.

Algunos fármacos se extraen en forma deficiente por el hígado, esto significa que

sólo una pequeña cantidad de fármacos se extrae de la sangre en su paso a través

del hígado (Greenblatt, 1992). Por lo que podemos decir que si un fármaco es

eliminado predominantemente por vía renal, cualquier alteración en cuanto a la

capacidad del riñón para eliminar un fármaco, se traducirá en cambios

farmacocinéticos. Algunos factores que pueden influenciar la capacidad de

eliminación del riñón son la edad, la unión a proteínas, el grado de saturación de

los transportadores, interacción del fármaco en el sitio de depuración, el flujo renal

y el pH urinario entre otros. El proceso de eliminación es complejo al igual que

otros procesos como la absorción, la distribución y la biotransformación. Cuando se

presenta una aparente disminución del fármaco del organismo puede ser explicada

a través del parámetro de depuración o aclaramiento (Cl). El aclaramiento

sanguíneo puede ser considerado como el volumen de sangre que se limpia de

fármaco por unidad de tiempo.

27

1.2. ACTIVIDAD BIOLOGICA DE COMPUESTOS DEL BORO

Compuestos orgánicos que contienen boro se conocen desde hace un siglo, y

muchos aspectos de sus propiedades químicas desde hace ya algún tiempo. Con el

descubrimiento y el desarrollo de la hidroboración, dio como resultado los

compuestos organoboranos que son ampliamente usados como reactivos e

intermediarios en síntesis orgánica (Petasis 2007, Yang 2003).

Como resultado de su reactividad y sus características químicas, los compuestos

organoboranos tienen propiedades básicas que han hecho posible el

descubrimiento y el aumento en el número de reacciones que han sido utilizadas

ampliamente en muchas áreas de síntesis química y aplicaciones farmacéuticas

(Fig. 5).

Figura 5. Aplicaciones químicas de compuestos organoboranos (tomada

de Petasis, 2007).

28

La estructura electrónica del boro y su posición estratégica en la tabla periódica

junto al carbono hace que los compuestos del boro trivalente tengan un

comportamiento como moléculas electrofílicas con una estructura trigonal planar.

Las interacciones estas unidades con especies aniónicas o neutras permite la

rehibridazación de sp2 a sp3, obteniéndose especies de geometría tetraédrica.

Estos compuestos en los que el boro presenta coordinación tetraédrica constituida

por anillos de cinco miembros, son muy estables, ya que estos anillos están libres

de tensión (Cotton y Wilkinson, 1980) (Fig. 6).

Figura 6. Complejos de cinco miembros de ácido bórico con cis-dioles

(modificada de Baran, 1989).

1.2.1. ÁCIDO BÓRICO Y SUS SALES

El ácido bórico se utiliza desde hace más de 200 años en la práctica médica, tanto

para su uso interno (sedante, espasmolítico, diurético) como externo (antiséptico).

En la actualidad, el ácido bórico figura en numerosas Farmacopeas y Recetarios y

su consumo es realmente muy elevado (Petasis, 2007). Aunque ha sido

gradualmente desplazado por preparados terapéuticamente más activos, sigue

desempeñando todavía un papel relativamente importante en especialidades

29

medicinales de diversos tipos, ya sea en forma pura o en forma de algunas de sus

sales, ésteres o complejos.

En este sentido vale pena remarcar que las soluciones “buffer” de borato parecen

tener valiosas propiedades antibactericidas que pueden ser aprovechadas en la

conservación de gotas oftálmicas o nasales (Kliegel, 1980). El borato de

fenilmercurio, junto con el cloruro de benzalconio son considerados como los

mejores conservadores de gotas oftálmicas. También se utiliza ácido bórico o

bórax asociado con sustancias tales como el acetato de fenilmercurio, el

cloramfenicol o el sulfato de neomicina.

El bórax, Na2B4O7.10H2O, es una de las sales simples más comunes derivadas del

ácido bórico, se le utiliza como antiséptico y bactericida suave en inflamaciones e

infecciones de las mucosas. En mezclas con fenol, fenolato, mentol, timol, glicerina

y clorofila, dispensado en forma de atomizador o para aplicaciones tópicas parece

tener una actividad superior a 600.000 U.I. de penicilina (Kliegel, 1980).

1.2.2. DERIVADOS DEL ÁCIDO BÓRICO

Diversas sales del ácido bórico de alcaloides y de numerosas bases nitrogenadas

como el borato de colina se utilizan en desordenes hepáticos y como

antituberculoso, borato de procaína (anestésico local), borato de

hexametilentetramina (antiséptico renal), borato de neomicina (uso oftalmológico),

borato de dodecilguanidinio (fungicida). Los complejos de ácido bórico con ácido

láctico o trietanolamina han sido utilizados como anticonceptivos.

30

Uno de los compuestos más interesantes dentro de este grupo es, sin duda, el

antibiótico “Boromicina” (Hunt, 2003) (Fig. 7). El cual fue aislado de cultivos de

una especie de Streptomyces antibioticus, siendo el primer compuesto natural

conteniendo boro que pudo ser aislado y caracterizado estructuralmente. Su

hidrólisis produce D-valina, ácido bórico y un compuesto macrocíclico

polihidroxilado (Yang y cols., 2003). Vale la pena recordar que también han sido

descritos boratos derivados de diversos antibióticos (eritromicina,

dihidroestreptomicina, clorotetraciclina, etc. (Goldbach y Wimmer, 2007).

Figura 7. Coordinación del boro en Boromicina (tomada de Baran, 1989).

31

1.2.3. ORGANOBORATOS

Estos compuestos contienen, por lo menos, un sustituyente hidrocarbonado sobre

el átomo de boro, en los últimos años han adquirido un interés farmacológico

relevante. Algunos triarilboranos, generalmente estabilizados con ciertas bases de

Lewis (aminas) han demostrado ser potentes fungicidas y germicidas de amplio

espectro (Kliegel, 1980 y Petasis, 2007). La acción fungicida de muchos

organoboranos parece ser una cualidad muy general en ellos.

Otro interesante antiséptico y bactericida resultó ser el ácido fenil-bórico,

especialmente en iones Ag (I) o Cu (II). Este compuesto tiene también

propiedades sedantes y sinergiza notablemente la actividad de hipnóticos tales

como el hidrato de cloral y los barbitúricos, así como también la acción de la

morfina, la codeína y la procaína (Yang y cols., 2003). El éster cíclico del ácido p-

tolilbórico es un tranquilizante muy efectivo. Otro grupo de sustancias relacionadas

estructuralmente con las recién descritas, poseen actividad espasmolítica.

También se han sintetizado y ensayado como posibles sustancias antivirales y

antitumorales algunos derivados de ácidos aril-bóricos con estructura de teofilina.

Finalmente, cabe mencionar que algunos derivados organobóricos han demostrado

poseer propiedades de interés farmacológico, tales como el efecto diurético del

derivado de ácido alquil-bórico y que fue sintetizado siguiendo el esquema

estructural de los diuréticos de la serie de las tiazidas (Yang y cols., 2003), o la

acción anticoagulante del acido 3-amino-4-carboxi-fenilbórico (Fig. 8),

especialmente cuando se maneja en forma de un complejo de glucosa (Cao, 2002).

32

Figura 8. Ácido 3-amino-4-carboxifenilbórico (modificada de Yang y

cols., 2003).

1.2.4. COMPUESTOS DEL BORO EN ONCOLOGIA

El boro natural esta constituido por dos isótopos estables, el 10B (abundancia 20

%) y el 11B (abundancia 80 %). El 10B tiene una sección eficaz de captura

extremadamente elevada (ca. 3840 barn) para absorber neutrones térmicos,

sufriendo la siguiente reacción nuclear:

10B + n 7Li + α (E= 2.4 MeV)

En esta reacción tanto el 10B como los neutrones térmicos son inofensivos para los

tejidos pero su interacción libera una radiación de alta energía (Soloway y cols.,

1961). El tamaño de las dos partículas producidas (7Li + α) limita grandemente el

radio de acción de las mismas, por lo que prácticamente la radiación queda

circunscripta a la región celular en la que se encuentran los núcleos de 10B.

La elevada sección eficaz de captura del 10B para neutrones térmicos, que es casi

4000 veces mayor que la del Nitrógeno y unas 106 veces superior a la del Carbono

y el Oxigeno, hace que las posibles reacciones nucleares de neutrones térmicos

con estos tres átomos, que son siempre abundantes en toda la materia orgánica,

prácticamente carezcan de importancia frente a la captura de los proyectiles por

33

parte del 10B (Soloway y cols., 1998). De esta manera resultaría posible producir

una destrucción selectiva de tejido tumoral siempre que fuera posible enriquecer

esos tejidos en 10B (o simplemente con compuestos de boro).

Se han sintetizado y ensayado compuestos de boro de muy diverso tipo y

características, unas 200 especies preparadas y probadas para este fin. Entre los

compuestos ensayados podemos mencionar, a parte del ácido bórico y de ácidos

aril-bóricos, compuestos poliméricos y aductos diversos, así como sales derivadas

de los boranos (Soloway y cols., 1961).

También se han ensayado entre otros: derivados de aminoácidos, de pirimidinas,

de purinas, conteniendo boro; para alcanzar concentraciones más altas en el tejido

tumoral. Muchos de los sistemas mencionados han sido investigados,

esencialmente, en el tratamiento de tumores cerebrales (Soloway y cols., 1998).

Los dos compuestos más promisorios, al menos para el tratamiento de este tipo de

cáncer fueron la sal sódica del anión B10H102- [decahidro-closo-decaborato (2-)] así

como el ácido p-carboxifenilbórico (Fig. 9).

Figura 9. Ácido para-carboxifenilbórico (tomada de Baran, 1989).

34

1.2.5. BOROZAXOLIDONAS

Las boroxazolidonas son complejos neutros que son sintetizados a partir de la

reacción de un -aminoácido con ácidos borínicos, estos compuestos disminuyen

su polaridad debido a que el -aminoácido aumenta considerablemente su carácter

lipofílico. Esta propiedad se puede utilizar para la purificación de -aminoácidos y

para el paso a través de membranas. La cadena heterocíclica le confiere una alta

liposolubilidad además de una estabilidad a pHs y temperaturas altos.

Por la importancia de la glicina (gly), del ácido L-glutámico (L-glu) y del ácido L-

aspártico (L-asp), como neurotransmisores, se sintetizaron las

difenilboroxazolidonas (DFBOZA) de gly (Fig. 10), L-asp (Fig. 11) y L-glu (Fig. 12).

La síntesis de estos compuestos con potencial actividad como, agonistas o

antagonistas semejantes a la glicina, ácido glutámico y del ácido aspártico capaces

de atravesar la barrera hematoencefálica, es de gran interés debido a los efectos

farmacológicos que producen.

Figura 10. DFBOZA de glicina (tomada de Trujillo, 1999).

35

Figura 11. DFBOZA del ácido L-aspártico (tomada de Trujillo, 1999).

Figura 12. DFBOZA del ácido L-glutámico (tomada de Trujillo, 1999).

36

2. JUSTIFICACIÓN

Las moléculas que contienen enlaces B-N en su estructura, poseen una amplia

actividad biológica: insecticida, fungicida, herbicida, agente antibacterial (Jabbour

y cols; 2004, Dembitsky y cols; 2003, Morin 1994), y antineoplásica (Adams y cols;

1999, Teicher y cols, 1999). Las difenilboroxazolidonas son compuestos

aminoborados utilizados como agentes quimioterapéuticos en el tratamiento del

cáncer (Soloway y cols; 1998), además han demostrado actividad apoptótica in

vitro (Velasco, B., y cols., 2007) y se ha encontrado que tienen efectos a nivel del

SNC, por lo anterior es importante describir el comportamiento farmacocinético de

estos compuestos en un modelo animal.

37

3. HIPÓTESIS

Si al administrar por vía intragástrica las difenilboroxazolidonas y éstas atraviesan

la barrera hematoencefálica, entonces se espera encontrar una relación entre el

curso temporal de las concentraciones del fármaco en sangre total y la actividad

farmacológica en el SNC.

38

4. OBJETIVOS

4.1. OBJETIVO GENERAL

Determinar la farmacocinética de las difenilboroxazolidonas de Gly, L-asp y L-glu

administradas por vía intragástrica en ratas, estableciendo una relación con la

actividad en SNC.

4.2. OBJETIVOS PARTICULARES

Determinar la DL50 de las DFBOZA de Gly, L-asp y L-glu en ratas macho, por vía

intragástrica (i.g.).

Evaluar la coordinación motora en ratas macho utilizando un rodillo giratorio,

después de la administración i.g. de las DFBOZA de Gly, L-asp y L-glu.

Desarrollar y validar un método bioanalítico por cromatografía de líquidos de ultra

alta resolución (UPLC) acoplado a un detector de espectrometría de masas en

tandem para la cuantificación de las DFBOZA de Gly, L-asp y L-glu en sangre de

rata.

Estimar los parámetros farmacocinéticos de las DFBOZA de Gly, L-asp y L-glu en

ratas macho, después de una administración i.g.

39

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1. MATERIAL BIOLÓGICO

En todos los ensayos se utilizaron ratas Wistar macho de 250 a 300 g de peso. Se

siguió la Norma Oficial Mexicana para el cuidado y uso de animales para

laboratorio (NOM-062-ZOO-1999), así como también el protocolo de todas las

normas que exige el comité de bioética internacional y universal.

Los animales se alojaron en un local bajo temperatura regulada de 22 ± 2 oC,

humedad relativa de 50 ± 10 % y ciclos de luz/obscuridad de 12 horas cada uno.

5.2. TOXICIDAD AGUDA DL50

Se determinó la dosis letal50 (DL50) de los diferentes compuestos por el método de

Lorke (1981), en dos etapas.

PRIMERA ETAPA

Los animales se distribuyeron aleatoreamente formando 3 lotes experimentales de

cada compuesto, con 3 animales cada uno:

Log10

Lote 1: DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu 1000 mg/kg 3



Los compuestos se suspendieron en aceite de oliva comercial extravirgen y se

administraron por vía intragástrica con el uso de una cánula, se privó a los

40

animales de alimento por 12 h (aproximadamente) antes de iniciar el estudio;

después de la administración del compuesto se verificó y cuantificó mortalidad

durante 15 días, así como se observaron posibles cambios fisiológicos y/o

conductuales durante las 6 primeras horas después de la administración de los

compuestos, tales como: sedación, tremor, convulsión, etc.

SEGUNDA ETAPA

Los animales se distribuyeron aleatoreamente formando los siguientes lotes

experimentales de cada compuesto, con 3 animales cada uno, de acuerdo a los

resultados obtenidos en la etapa anterior:

Log10


Lote 2: DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu 562.4 mg/kg 2.75

Lote 4: DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu 316.3 mg/kg 2.5

Lote 5: DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu 178 mg/kg 2.25



Los compuestos se suspendieron en aceite de oliva comercial extrapuro y se

administró por vía intragástrica con el uso de una cánula, siguiendo el protocolo de

la primera etapa; la DL50 se determino calculando la media geométrica de la Dosis

mínima letal y la Dosis mínima subletal encontrada.

41

5.3. COORDINACIÓN MOTORA

Algunas alteraciones mínimas neurobiológicas como la sedación y los cambios en la

función motora pueden determinarse utilizando la prueba del rodillo giratorio

(Rotarod). Se usó un Rotarod (Ugo Basile, modelo 7750) para ratas, éste aparato

consiste en una plataforma y una barra giratoria de 7 cm. de diámetro. La barra

con una longitud de 50 cm se divide en 4 secciones iguales en las cuales se

evaluaron 4 ratas simultáneamente.

Se utilizaron ratas Wistar macho de 250 a 300 g de peso, éstas se colocaron en la

plataforma y se les adiestro 3 días previos al ensayo (Fig. 13). Se utilizó 1 grupo

experimental aleatorizado (n=10) de acuerdo a la mitad de la DL50 encontrada

para cada boroxazolidona ensayada. La administración fue por vía intragástrica y

se evaluó la actividad a 0 h (pre-dosis), y a las 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0,

6.0, 8.0, 10.0, 12.0 y 24 horas después de los diferentes tratamientos. El Rotarod

se aceleró a 16 rpm y se mantuvo por un período de 5 min. Se registró el número

de ocasiones en las cuales los animales fueron derribados de la plataforma.

42

Figura 13. Adiestramiento de ratas en el Rotarod.

5.4. DESARROLLO Y VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA

CUANTIFICACIÓN DE LAS DIFENILBOROXAZOLIDONAS EN MANCHAS DE

SANGRE SECA (DBS) EN RATAS POR UPLC MS/MS.

DESARROLLO

Para el desarrollo del método analítico se utilizó un UPLC (AcquityTM, Waters Co.,

Milford MA, USA) acoplado a un espectrómetro de masas/masas (Quattro Premier

XE, Waters Micromass, Manchester, UK).

El método analítico para la cuantificación de las boroxazolidonas se desarrolló

utilizando las correspondientes DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu con

una pureza de 99.1%, éstas se sintetizaron en el Laboratorio de Bioquímica

43

Experimental de la Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional,

el acetonitrilo y el metanol grado HPLC fueron adquiridos de JT Baker (Xalostoc,

Edo. de México), mientras que el formiato de amonio y el ácido fórmico (99.8 %)

se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania). El agua calidad HPLC se

obtuvo a través de un sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Las tarjetas de

algodón extrapuro libre de aditivos Whatman 903 fueron donadas gentilmente por

el Laboratorio de Tamiz Neonatal del Hospital General de México.

5.4.1. CURVAS DE CALIBRACIÓN Y PUNTOS CONTROL

Las soluciones madres de las DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu con

una concentración de (10 mg/mL) se prepararon en forma individual en ácido

fórmico al 0.1 % en metanol (v/v). Las soluciones de trabajo para el intervalo de

calibración fueron preparadas diez veces mas concentradas (3, 100, 200, 300, 400

y 500 µg/mL) en metanol:ácido fórmico 0.1 % en agua HPLC pH=3.9 (80:20 v/v),

además se preparo la solución de trabajo correspondiente al estándar interno

DFBOZA-gly (0.5 µg/mL) en acetonitrilo:ácido fórmico 0.1 % en agua HPLC (80:20

v/v), se mantuvieron en refrigeración a 4 ˚C, y protegidas de la luz blanca.

Curvas de calibración independientes (0.3, 10, 20, 30, 40 y 50 µg/mL) fueron

preparadas por adición de 900 µL de sangre total heparinizada de rata, libre de las

boroxazolidonas y 100 µL de las soluciones de trabajo correspondientes. Los

puntos control de calidad en los niveles bajo, medio y alto (1, 25 y 35 µg/mL

44

respectivamente), fueron preparados de la misma manera para evaluar la

exactitud y precisión de la técnica empleada.

Para la cuantificación de la DFBOZA-gly se prepararon soluciones de trabajo diez

veces más concentradas para el intervalo de calibración (1, 10, 20, 30, 40 y 50

µg/mL) y una solución de DFBOZA-L-asp (2 µg/mL) correspondiente al estándar

interno, se prepararon de forma idéntica a las anteriores. La curva de calibración

(0.1, 1, 2, 3, 4 y 5 µg/mL) y los puntos control de calidad (0.3, 2.5 y 3.5 µg/mL),

fueron preparada como se describió anteriormente en sangre total heparinizada de

rata.

5.5. VALIDACIÓN

El método analítico para la cuantificación de las boroxazolidonas en DBS se

desarrolló y posteriormente se validó cubriendo los parámetros de desempeño

analítico como: linealidad del método (empleando tres curvas de calibración

independientes durante 3 días consecutivos), repetibilidad (6 series de puntos

control de calidad) y reproducibilidad (6 series de puntos control durante 3 días

consecutivos), limite de cuantificación de: DFBOZA-gly (0.1 µg/mL), DFBOZA-L-asp

y DFBOZA-L-glu (0.3 µg/mL para ambas); 5 puntos para cada una de las

boroxazolidonas ensayadas, limite de detección de DFBOZA-gly (0.05 µg/mL),

DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu (0.15 µg/mL para ambas); 3 puntos para cada

boroxazolidona ensayada, y estabilidad de la muestra: sobre la mesa de trabajo,

45

en el automuestreador y a largo plazo (4 series de puntos control para cada

experiencia).

En esta etapa se siguieron los criterios de aceptación establecidos en la guía FDA

“Validación de métodos bioanalíticos”, los cuales son:

1.- Para las curvas de calibración se les realizó una regresión lineal determinando:

coeficiente de correlación (r) > 0.99, coeficiente de determinación (r2) > 0.98,

pendiente (m) ≠ 0 y la ordenada al origen (b).

2.- C. V. (coeficiente de variación) entre pendientes ≤ 15 %.

3.- Limite de cuantificación (primer calibrador): C. V. ≤ 20 % con respecto al valor

nominal y con relación señal/ruido > 10.

4.- A partir del segundo hasta el último calibrador: C. V. ≤ 15 % con respecto al

valor nominal.

5.- Límite de detección: relación señal/ruido > 3.

6.- Puntos Control de Calidad para cubrir los requisitos de precisión y exactitud

establecidos, C. V. ≤ 15 % con respecto al valor nominal.

5.6. PREPARACIÓN Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS EN MANCHAS

DE SANGRE SECA EN RATA

Una alícuota de 40 µL de sangre (una gota para el blanco, curva de calibración y

puntos control de calidad) fue colocada con una pipeta calibrada en la tarjeta

Whatman 903 en lugares independientes, las muestras de concentración

46

desconocida se obtuvieron por un corte longitudinal de la cola de la rata (aprox. 2

mm del extremo de la cola), se colectó la segunda gota extraída en la tarjeta (Fig.

14).

Figura 14. Obtención de muestras de sangre a través de un corte en el

extremo de la cola de la rata y manchas en las tarjetas Whatman 903 de

algodón extrapuro.

Las muestras se secaron en posición horizontal, protegidas de la luz durante al

menos 4 horas a temperatura ambiente. Una vez secas, las tarjetas se cubrieron

47

con una capa de papel y se empaquetaron en bolsas de plástico con cierre de

cremallera y bolsas desecantes, y se almacenaron entre 4 – 6 ˚C hasta su análisis.

Después de que las tarjetas se secaron, una perforación de 3.2 mm (Wallac 1296-

071, DBS Perforadora, Perkin Elmer, USA) fue realizada en el centro de cada

mancha de sangre seca (DBS) y se colocó en un tubo para microcentrífuga de 1.5

mL, se les adicionó 150 µL de la solución del estándar interno; los tubos se

cerraron herméticamente y se colocaron en un baño ultrasónico a 37 ˚C durante

15 minutos. Posteriormente las muestras se centrifugaron a 13,500 rpm durante 5

minutos a 20 ˚C. El sobrenadante se transfirió a un vial de vidrio y se inyecto 10

µL al sistema UPLC.


Los perfiles farmacocinéticos de cada boroxazolidona fueron evaluados en grupos

distintos con 8 ratas Wistar machos con un peso entre 250 g – 300 g. Los animales

se mantuvieron en un local bajo temperatura regulada de 22 ± 2 oC, humedad

relativa de 50 ± 10 % y ciclos de luz/obscuridad de 12 horas cada uno, con libre

acceso al alimento y el agua. Doce horas antes de la administración de las

boroxazolidonas, las ratas se mantuvieron en ayuno. Por la mañana, las

boroxazolidonas se suspendieron en aceite de oliva comercial extrapuro (DFBOZA-

gly, 120 mg/kg para DFBOZA-L-asp, 210 mg/kg y 160 mg/kg para DFBOZA-L-glu)

y se administró con la ayuda de una cánula vía intragástrica, cada rata recibió la

48

mitad de dosis correspondiente a la DL50 para cada boroxazolidona, previamente

determinada por el método de Lorke.

Las ratas fueron inmovilizadas en jaulas individuales de acrílico en cada toma de

muestra, y se les realizó un pequeño corte en el extremo de la cola para la

obtención de sangre capilar. Se colectaron muestras bajo el siguiente esquema

temporal 0 h (pre-dosis), 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0 y 24

horas.

6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Parámetros farmacocinéticos

Los parámetros farmacocinéticos se calcularon con una dosis única extravascular,

utilizando un modelo no compartamental en sangre por medio del Software

WinNonlinTM V5.2 (Pharsight Co, Mountain View, CA, USA). Los parámetros

calculados fueron: el área bajo la curva de la concentración sanguínea versus

tiempo, desde el tiempo cero hasta las 24 horas (ABC0-t), área bajo la curva de la

concentración sanguínea versus tiempo, desde el tiempo cero hasta el infinito

(ABC0-∞), la depuración aparente del compuesto en la sangre después de la

administración intragástrica (Clapp), el volumen de distribución aparente (Vdapp), y

tiempo media de residencia (MRT).

La concentración máxima del compuesto en sangre (Cmáx) y el tiempo para

alcanzar dicha concentración después de la administración i.g. (Tmáx) fueron

obtenidos experimentalmente mediante la observación de los perfiles cinéticos de

cada animal.

49

La vida media de eliminación (t1/2) se determinó con una regresión lineal mínimos

cuadrados del logaritmo natural de la parte final del perfil farmacocinético (fase de

eliminación) y con la pendiente negativa de la curva, que es la constante de

eliminación (ke); t1/2 = (ln 2)/ke.

50

7. RESULTADOS

7.1. TOXICIDAD AGUDA

En la tabla 1, 2 y 3 se presentan los resultados obtenidos de los experimentos de

toxicidad aguda de las boroxazolidonas ensayadas; se obtuvo una DL50 para

boroxazolidona de glicina de 240 mg/kg, para la boroxazolidona de aspártico (420

mg/kg) y para la de glutámico de 320 mg/kg respectivamente.

Tabla 1. Determinación de la DL50 de la boroxazolidona de glicina.

No. DE ANIMALES DOSIS (mg/kg) MUERTOS VIVOS

3 1000 3 0

3 562.3 3 0

3 316.3 3 0

3 178 0 3

3 100 0 3

Cálculo de la media geométrica (DL50)

Dosis mínima letal = 316.3 mg/kg

Dosis mínima subletal = 178 mg/kg

DL50 = (316.3 mg/kg x 178 mg/kg) 1/2

51

La DL50 obtenida fue de 237.2 mg/kg, sin embargo para una mejor dosificación de

los animales se emplearon números enteros (por ejemplo: 240 mg/kg) de las dosis

letales obtenidas para cada DFBOZA.

Los signos que se observaron en las ratas, posterior a la administración de la

DFBOZA-gly fueron los siguientes: a dosis de 1000 mg/kg y 562.3 mg/kg después

de 60 minutos se manifestó la presencia de chasquidos, piloerección, cola de

Straub, movimientos involuntarios, aumento de la actividad motora, espasmos,

sacudida de perro mojado y temblor. El período entre la administración de la

DFBOZA-gly y muerte fue de 2 a 4 h, en este periodo se observaron convulsiones

de tipo tónico-clónicas. También se observó y cuantificó mortalidad hasta las 72

horas después de la administración del compuesto. En las dosis ensayadas de

316.3, 178 y 100 mg/kg se observaron: movimientos involuntarios, chasquidos,

sacudidas de perro mojado, piloerección y cola de Straub; no se presentó

convulsiones en el periodo observado.

Para la DFBOZA-L-asp (tabla 2) a dosis de 1000 mg/kg y 562.3 mg/kg se observó

piloerección, temblor y convulsiones. El temblor y las convulsiones tónico-clónicas

se presentaron con un tiempo de latencia de 4 a 6 h después de la administración

del compuesto. Cuantificándose mortalidad hasta las 48 horas después del

tratamiento (tabla 2). En las siguientes dosis evaluadas no se observó ningún

signo aparente por la administración del compuesto.

52

Tabla 2. Determinación de la DL50 de la boroxazolidona de aspártico.


3 1000 3 0

3 562.3 3 0

3 316.3 0 3

3 178 0 3

3 100 0 3



Dosis mínima subletal = 316.3 mg/kg

DL50 = (562.3 mg/kg x 316.3 mg/kg) 1/2

DL50 = 420 mg/kg

Así mismo en la administración de la DFBOZA-L-glu (tabla 3), se miró piloerección,

movimientos involuntarios, espasmos, sacudida de perro mojado, temblor y

convulsiones tónico-clónicas, evidenciando mortalidad hasta las 72 horas después

53

de la administración del compuesto. En las dosis restantes ensayadas no se

manifestó alguna alteración, ni convulsiones.

Tabla 3. Determinación de la DL50 de la boroxazolidona de glutámico.


3 1000 3 0

3 562.3 3 0

3 316.3 2 3

3 178 0 3

3 100 0 3



Dosis subletal = 316.3 mg/kg

Dosis mínima subletal = 178 mg/kg

DL50 = (562.3 mg/kg x 316.3 mg/kg x 178 mg/kg) 1/3

DL50 = 320 mg/kg

54

El valor de las dosis obtenidas de las difenilboroxazolidonas evalúa a las sustancias

como moderamente tóxicas (Lorke, 1983); mirar tabla 4.

Tabla 4. Clasificación de las sustancias de acuerdo a su toxicidad aguda

(Lorke, 1983).

CLASE DL50 (mg/kg)

Extremadamente tóxica 10

Tóxica 10 - 100

Moderamente tóxica 100 - 1000

Ligeramente tóxica 1000

55

7.2. COORDINACIÓN MOTORA El efecto de la DFBOZA de glicina se manifestó después de su administración i.g. a

dosis de 120 mg/kg sobre la coordinación motora en ratas, a las cuales se les

contabilizó el número de caídas del rodillo giratorio que presentaron en los

diferentes tiempos experimentados (figura 15). La alteración de la coordinación

motora en los animales es clara de las 1.5 a las 12 horas; el tiempo en el cual se

presentó el mayor número de caídas fue a las 2.0 horas (14 ocasiones en las que

el animal perdió el control motor en la plataforma giratoria) comparado con los

otros tiempos experimentales.

Se encontró una diferencia estadísticamente significativa (p 0.05) en el número de

caídas de las ratas del rodillo giratorio a las 2.0, 3.0, y 4.0 con respecto al resto de

los tiempos ensayados [0 (pre-dosis), 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0 y 24

horas].

Durante la evaluación temporal del efecto de la administración i.g. de la DFBOZA-

gly en el número de caídas de la plataforma giratoria de los animales, podemos

apreciar que durante el periodo comprendido de las 6 hasta las 12 horas los

animales siguieron manifestando anomalías en la coordinación motora

derribándose entre 7 y 11 ocasiones del rodillo giratorio.

56

Tiem po (h)

0 5 10 15 20 25

N o

. d

e c

aíd

as

0

2

4

6

8

10

12

14

16

aa

a

a

a

a

a

a

a

b

b

c

Figura 15. Efecto de la DFBOZA-gly (120 mg/kg) sobre la coordinación

motora en rata a los tiempos: 0 (pre-dosis), 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0,

4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0 y 24 horas. Letras diferentes indican diferencia

estadísticamente significativa con una P<0.05 (prueba de Friedman, S-

N-K).

Las ratas tratadas con DFBOZA-L-asp después de una unidosis (210 mg/kg)

administrada por vía i.g., presentaron una notable deficiencia en la coordinación

motora a partir de las 4 a las 10 horas del intervalo de tiempo evaluado en el

rodillo giratorio (figura 16). La mayor incidencia en el número de caídas (entre 5 y

11 ocasiones) de los animales del rodillo giratorio se observó entre las 6 y 8 h del

periodo experimentado, con una diferencia significativa (P 0.05). Así mismo los

resultados muestran diferencias estadísticamente significativas (P 0.05) a las 4 y

57

10 h en el número de caídas, comparado con el resto de la evaluación temporal de

los animales en el rodillo giratorio.

Tiem po (h)

0 5 10 15 20 25

No

. d

e c

aíd

as

0

2

4

6

8

10

12

a

a

de

aa

a

a

c

b

Figura 16. Efecto de la DFBOZA-L-asp (210 mg/kg) sobre la coordinación




N-K).

En la figura 17, se muestra el efecto de la DFBOZA-L-glu sobre la actividad motora

en ratas evaluada con el ensayo de rodillo giratorio. En los animales tratados con

una dosis única vía i.g. de DFBOZA-L-glu (160 mg/kg) se apreció una anómala

coordinación motora, interpretada por el número de caídas percibidas de los

animales experimentados. Las caídas de los animales se acentuaron de las 1.5 a

las 6 horas después de la administración del compuesto. Es evidente el trastorno

58

en la actividad motora de los animales a las 3 h llegando hasta 12 ocasiones en las

cuales las ratas fueron derribadas del rodillo. Diferencias estadísticamente

significativas fueron encontradas a las 2.0, 3.0 y 4.0 horas (P 0.05,

respectivamente) con respecto a los tiempos en estudio: 0 (pre-dosis), 0.25, 0.5,

1.0, 1.5, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0 y 24 horas, donde no se encontró diferencia

significativa en el número de caídas de la plataforma giratoria de los animales

ensayados.

Tiem po (h)

0 5 10 15 20 25

No

. d

e c

aíd

as

0

2

4

6

8

10

12

14

a

aa

a

a

a

b

c

a

b

Figura 17. Efecto de la DFBOZA-L-glu (160 mg/kg) sobre la coordinación




N-K).

59




El desarrollo del método analítico se realizó utilizando un UPLC acoplado a un

espectrómetro de masas/masas. Los resultados cromatográficos óptimos que se

obtuvieron durante el desarrollo del método fueron los siguientes:

1.- Columna BEH Fenilo (100 x 2.1 mm de longitud y 1.7 µm de tamaño de

partícula, Acquity UPLC, Waters, Irlanda).

2.- Flujo cromatográfico constante de 0.25 mL/min.

3.- La composición requerida de la fase móvil se muestra en la siguiente tabla:

Tabla 5. Gradiente de elusión de la fase móvil utilizado en la separación

de las difenilboroxazolidonas en estudio.

Tiempo

(min)

Flujo

(mL/min)

% de A % de B Curva

Inicial 0.25 50 50 Inicial

1.0 0.25 100 0 7

1.5 0.25 50 50 11

2.0 0.25 50 50 7

Donde: A es acetonitrilo 100 % y B es formiato de amonio 2 mM a pH=3.3.

60

4.- La temperatura del automuestreador fue de 15 ˚C.

5.- La temperatura de la columna cromatográfica fue de 40 ˚C.

Con las condiciones antes descritas los tiempos de retención para la DFBOZA-gly,

DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu fueron: 1.36, 1.24 y 1.30 minutos,

respectivamente.

La optimización de los parámetros del detector de espectrometría de masas (tabla

6) se relizó por ionización en electrospray modo positivo ESI (+), utilizando una

solución de una concentración de 1,000 ng/mL para cada una de las

boroxazolidonas en estudio, las cuales se prepararon en metanol:ácido fórmico 0.1

% en agua HPLC pH=3.9 (80:20 v/v), los compuestos se determinaron por el

modo de adquisición MRM (monitoreo de múltiples reacciones), empleando las

siguientes transiciones iónicas; m/z1+ 240.15 >162.00 Th para DFBOZA-gly; m/z1+

298.20 >160.00 Th para DFBOZA-L-asp, y m/z1+ 312.20 >163.00 Th para

DFBOZA-L-glu.

61

Tabla 6. Parámetros utilizados en el espectrómetro de masas por

electrospray positivo y modo MRM para la cuantificación de: DFBOZA-

gly, DFBOZA-L-asp, y DFBOZA-L-glu en DBS.

Parámetros ESI (+) Valores Analizador Valores

Energía del capilar 3.0 kV L y H MR 1 14.0

Energía de cono 25.0 V Energía del ión 1 0.2

Energía del extractor 3.0 V Entrada 2.0

Radio frecuencia 0.1 V Colisión 8 gly/ 10 asp/ 50 glu

Temperatura de la fuente 120 °C Salida 2.0

Temperatura de desolvatación 400 °C L y H MR 2 13.5

Flujo de gas del cono 50 L/h Energía del ión 2 0.7

Flujo de gas de desolvatación 900 L/h Fotomultiplicador 650

Presión del gas de colisión 10 psi Argón Dwell 0.2 segundos

Donde:

L y H MR: resolución de masas altas y bajas respectivamente

La energía de colisión es expresada en electrón-volts

gly:DFBOZA-gly; asp:DFBOZA-L-asp; glu:DFBOZA-L-glu.

La figura 18, muestra la ionización del ión molecular para las tres

difenilboroxazolidonas evaluadas, así como su abundancia isotópica donde

podemos observar que los compuestos más abundantes corresponden al 11B,

aunque también se nota la abundancia isotópica del 10B (aproximadamente 20 %).

62

Figura 18. Abundancia isotópica obtenida por ESI (+) de: A) DFBOZA-gly,

B) DFBOZA-L-asp y C) DFBOZA-L-glu.

63

La fragmentación de las tres moléculas y el modo de adquisición MRM aumentaron la sensibilidad y la selectividad del

método analítico, aunque las boroxazolidonas evaluadas no son endógenas. Los fragmentos utilizados para la

cuantificación de las difenilboroxazolidonas se muestran en la figura 19, los cuales fueron los más estables y abundantes

comparada con la ionización química a presión atmosférica (APCI), datos no mostrados.

Figura 19. Patrones de fragmentación obtenidos por ESI (+) de: A) DFBOZA-gly, B) DFBOZA-L-asp y C)

DFBOZA-L-glu.

64

La cuantificación se realizó utilizando una curva de calibración de 6 puntos, por

medio de una ecuación lineal de concentraciones de DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp, y

DFBOZA-L-glu versus la relación de áreas de DFBOZA-gly/DFBOZA-L-asp, DFBOZA-

L-asp/DFBOZA-gly y DFBOZA-L-glu/DFBOZA-gly, por la concentración del estándar

interno empleado respectivamente, utilizando un modelo ponderado 1/x (figura

20).

A)

65

B)

C)

Figura 20. Curvas de calibración utilizadas para la cuantificación de: A)

DFBOZA-gly, B) DFBOZA-L-asp y C) DFBOZA-L-glu en DBS en rata,

formato de salida de datos transformados del espectrómetro de masas.

66

7.4. VALIDACIÓN

Los resultados de la validación se muestran en la tabla 7, donde se observa que el

método analítico resultó ser lineal, preciso y exacto en cada nivel de

concentración. La estabilidad de las muestras se demostró desde el momento del

muestreo hasta su cuantificación, siendo estable durante 5 horas en la mesa de

trabajo, hasta 8 horas en el automuestreador y al menos 6 días entre 4 – 6 ˚C.

Durante el proceso de validación y toma de muestras se observó que las tres

DFBOZA evaluadas fueron inestables a la exposición a la luz blanca, por lo que el

muestreo y extracción de las muestras se realizo bajo luz roja. En la evaluación del

ensayo de acarreo se demostró que no hubo contaminación en la perforación e

inyección de las muestras blancos (blancos de reactivos, blancos de sangre y

muestras pre-dosis) después de la perforación e inyección de muestras con

concentraciones altas, correspondientes a puntos control de calidad altos o

concentraciones máximas obtenidas durante la farmacocinética de las

difenilboroxazolidonas en rata (figura 21). Todos los parámetros evaluados durante

la validación del método analítico para la cuantificación de las

difenilboroxazolidonas cumplen con los criterios de aceptación previamente

establecidos.

67

Tabla 7. Resultados de los parámetros obtenidos durante la validación

del método analítico para la cuantificación de las difenilboroxazolidonas

en manchas de sangre seca en rata por UPLC-MS/MS.

Los valores son presentados en porcentaje de recobro (% C.V.) para los puntos

controles de calidad con niveles: bajo, medio y alto.

Parámetros de la

validación DFBOZA-gly DFBOZA -L-asp DFBOZA -L-glu

Linealidad

y=a+bx

(0.1 – 5 g/mL)

y= 0.004+0.0895*x

r=0.9998

(0.3 – 50 g/mL)

y= 0.0007+0.0042*x

r=0.9993

(0.3 – 50 g/mL)

y= 0.003+0.0022*x

r=0.9985

Reproducibilidad

(3 días)

exactitud/precisión

Recobro (%C.V.)

n=18

95.75 (5.20)

95.05 (3.03)

91.78 (2.72)

97.36 (12.06)

99.55 (7.77)

103.57 (5.66)

99.17 (6.39)

99.02 (4.95)

99.63 (4.42)

Repetibilidad

exactitud/precisión

n= 6 / nivel

94.59 (6.83)

93.57 (2.87)

92.79 (2.13)

96.78 (6.29)

104.56 (5.96)

104.94 (5.66)

101.95 (6.14)

98.29 (4.02)

98.96 (3.19)

Límite de

cuantificación

Relación señal/ruido

98.90 (8.43)

14 : 1

101.61 (9.47)

17 : 1

103.56 (5.88)

16 : 1

Estabilidad sobre la

mesa

(5 h)

99.07 (5.43)

95.52 (4.66)

92.34 (2.72)

94.30 (0.66)

91.17 (0.67)

108.20 (3.57)

97.80 (1.83)

98.73 (1.08)

100.05 (2.95)

Estabilidad en

automuestreador

(8 h)

94.90 (6.54)

95.18 (3.63)

92.79 (2.02)

103.70 (7.06)

108.77 (2.06)

106.28 (3.24)

97.30 (3.76)

99.02 (3.69)

100.67 (2.69)

Estabilidad a largo

plazo

(6 días)

97.73 (5.10)

96.89 (2.79)

92.62 (2.58)

98.00 (5.60)

103.25 (7.59)

107.01 (2.64)

101.21 (7.92)

101.40 (3.14)

103.84 (3.43) Límite de detección

Relación señal/ruido

0.05 g/mL

5 : 1

0.1 g/mL

6 : 1

0.1 g/mL

8 :1

68

En la figura 21, se muestran los cromatográmas correspondientes a los blancos de sangre (muestras pre-dosis) de rata en

DBS obtenidos durante el ensayo de farmacocinética.

Figura 21. Cromatográmas que muestran canales independientes obtenidos por UPLC-MS/MS; 1) blanco de

sangre, 2) límite de cuantificación y 3) concentración máxima sanguínea obtenida en DBS en rata Wistar.

A) DFBOZA-gly, B) DFBOZA-L-asp y C) DFBOZA-L-glu.


Los cursos temporales de las concentraciones sanguíneas de las boroxazolidonas

de glicina, del ácido L-aspártico y del ácido L-glutámico después de una

administración única i.g. (120 mg/kg, 210 mg/kg y 160 mg/kg, respectivamente)

en ratas se muestran en la figura 23. Después de su administración se observó

que el área bajo la curva (ABC) en los grupos tratados con las

difenilboroxazolidonas de glicina y del ácido L-glutámico es menor en comparación

con el área bajo la curva de los animales que recibieron DFBOZA-L-asp.

La concentración sanguínea máxima obtenida (Cmáx) se encuentra disminuida en

más de un orden de magnitud en las ratas administradas con DFBOZA-gly y

DFBOZA-L-glu comparada con las ratas suministradas con DFBOZA-L-asp. También

podemos percibir que el tiempo en el que se alcanzó la concentración sanguínea

máxima (Tmáx) aumentó significativamente en las ratas con DFBOZA-L-asp

cotejado con las ratas tratadas con las boroxazolidonas de glicina y del ácido L-

glutámico (figura 22).

70

Figura 22. Perfiles farmacocinéticos obtenidos en DBS en ratas Wistar

macho, donde se grafica concentración sanguínea contra tiempo,

después de una dosis única intragástrica. A) DFBOZA-gly (120 mg/kg),

B) DFBOZA-L-asp (210 mg/kg) y C) DFBOZA-L-glu (160 mg/kg). Los

datos están expresados en promedios ± el error estándar (n=8).

71

Los parámetros farmacocinéticos obtenidos de las difenilboroxazolidonas de glicina,

del ácido L-aspártico y del ácido L-glutámico se pueden apreciar en la tabla 8.

Tabla 8.- Parámetros farmacocinéticos obtenidos después de la

administración intragástrica de una dosis única de DFBOZA-gly, DFBOZA-

L-asp y DFBOZA-L-glu en ratas Wistar macho (n=8).

Donde: Cmáx, concentración máxima sanguínea; Tmáx, tiempo en que se alcanza

Cmáx; ABC0-t, área bajo la curva del tiempo cero hasta la última toma de muestra;

ABC0-∞, área bajo la curva desde tiempo cero extrapolada hasta el infinito; t½, vida

media de eliminación; Vdapp, volumen aparente de distribución; MRT, tiempo

medio de residencia; Cl, depuración. Los valores muestran medias ± error

estándar.

Parámetros farmacocinéticos

DFBOZA-gly

(120 mg/kg) DFBOZA-L-asp

(210 mg/kg) DFBOZA-L-glu

(160 mg/kg)

Cmáx ( g/mL)

Tmáx

(h)

ABC0-t

( g*h/mL)

ABC0-∞

( g*h/mL)

t1/2

(h)

Vdapp

(L)

MRT

(h)

Cl

(L/min)

0.23 ± 0.01

2.31 ± 0.28

3.59 ± 0.07

11.80 ± 1.39

49.71 ± 8.27

191.78 ± 13.30

10.46 ± 0.12

3.09 ± 0.38

14.05 ± 1.03

6.25 ± 0.25

154.81 ± 4.28

165.76 ± 4.86

5.5 ± 0.17

2.72 ± 0.09

8.38 ± 0.17

0.35 ± 0.01

0.69 ± 0.11

2.53 ± 0.55

5.27 ± 0.48

6.96 ± 0.69

8.49 ± 2.17

91.22 ± 15.64

7.53 ± 0.71

6.88 ± 0.86

72

Posterior a la administración i.g. de una dosis única de la DFBOZA-gly (120

mg/kg), DFBOZA-L-asp (210 mg/kg) y DFBOZA-L-glu (160 mg/kg) en rata, se

encontraron los siguientes parámetros: Cmáx para la DFBOZA-L-asp (14.05 ± 1.03

µg/mL) y para los animales tratados con DFBOZA-gly y DFBOZA-L-glu (0.23 ± 0.01

µg/mL y 0.69 ± 0.11 µg/mL, respectivamente). Referidos al Tmáx se observó una

relación aproximada de 3:1 veces en el valor encontrado para la DFBOZA-L-asp

(6.25 ± 0.25 h) con respecto a los lotes administrados con DFBOZA-gly (2.31 ±

0.28 h) y a la DFBOZA-L-glu (2.53 ± 0.55 h).

De los valores calculados tenemos el ABC0-t y el ABC0-∞ las cuales resultaron ser

superiores para la DFBOZA-L-asp (154.81 ± 4.28 g*h/mL y 165.76 ± 4.86

g*h/mL) con respecto a los valores obtenidos en los perfiles farmacocinéticos de

las otras boroxazolidonas en estudio (tabla 8), manifestando una alteración en la

disposición de las moléculas en los animales.

El tiempo de vida media (t1/2) y el Vdapp calculado para la DFBOZA-gly (49.71 ±

8.27 h y 191.78 ± 13.30 L, respectivamente) fue mayúsculo cotejado con los

estimados para los animales tratados con las difenilboroxazolidonas del ácido L-

aspártico y del ácido L-glutámico; indicando una modificación en la fracción

biodisponible de la difenilboroxazolidona de glicina en circulación sistémica.

73

Por otro lado, en cuanto al MRT calculado para las boroxazolidonas

experimentadas (tabla 8), se contempla una disminución severa en la depuración

en los animales tratados con la DFBOZA-L-asp con respecto a la depuración de los

lotes administrados con la DFBOZA-gly y la DFBOZA-L-glu (tabla 8).

74

8. DISCUSION

8.1. Toxicidad aguda

La determinación de la toxicidad aguda es la primera etapa en la investigación

toxicologica y farmacológica de nuevas sustancias (Lorke, 1983). Un parámetro

indicativo de la toxicidad aguda de una sustancia es la DL50 (Marquardt, 1999) así

como los posibles efectos biológicos que se producen durante la evaluación de

dicha toxicidad. Por tal motivo, resultó interesante evaluar la toxicidad de las

difenilboroxazolidonas de glicina, del ácido L-aspártico y del ácido L-glutámico en

ratas por administración i.g. siguiendo el desarrollo experimental propuesto por

Lorke con la finalidad de obtener la DL50 con un menor número de animales, así

como un intervalo de dosis más específico en las que las boroxazolidonas

empleadas ejercieran una actividad biológica notable.

Al realizar el ensayo con la DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu en ratas

se observó; que en la etapa preliminar todas las boroxazolidonas evaluadas

provocaron la muerte de los animales a dosis de 1000 mg/kg (tabla 1, 2 y 3),

además presentándose piloerección, espasmos y convulsiones tónico-clónicas en

los animales; evidenciando la acción sobre el sistema nervioso central, ya que la

producción de convulsiones se da cuando una sustancia llega al SNC y genera la

actividad desordenada, sincrónica, excesiva e incontrolada de las neuronas

(Goodman y Gilman, 2007; Guyton, 2001).

75

En los lotes administrados con dosis de 10 y 100 mg/kg no se observó efecto

biológico importante, únicamente piloerección. En la siguiente etapa del estudio, se

ensayaron dosis equidistantes logarítmicamente de las difenilboroxazolidonas

experimentadas en los intervalos entre 100 y 1000 mg/kg, manifestándose en los

animales: movimientos involuntarios, piloerección, temblor y convulsiones tónico-

clónicas durante las siguientes 2 horas hasta el término del periodo observado (6

h). Después del tratamiento se encontraron animales muertos hasta las 72 horas a

dosis de 316.3 mg/kg para la DFBOZA-gly y DFBOZA-L-glu respectivamente.

Con los resultados de las dosis específicas utilizadas se cálculo la DL50 para cada

boroxazolidona en ratas macho con administración única por via i.g. arrojando los

siguientes valores: DFBOZA-gly=240 mg/kg, DFBOZA-L-asp=420 mg/kg y

DFBOZA-L-asp=320 mg/kg.

Nuestros resultados de las dosis letales encontradas, difieren de las encontradas

en la literatura en donde se obtuvieron las siguientes DL50: 105 mg/kg para

DFBOZA-gly, 638.8 mg/kg para DFBOZA-L-asp y 461.8 mg/kg para DFBOZA-L-glu

en ratones hembras por vía i.g. de la cepa NMR-1 y CF-1 respectivamente. Cabe

mencionar que el resultado del índice de toxicidad (DL50) de un compuesto esta

influenciado significativamente por diferentes variables como son: especie animal,

cepa, edad, sexo, dieta, vía de administración, entre otras (Doull, 1981), por tal

76

motivo no puede ser considerada como una constante biológica (Zbiden y Flury-

Roversi, 1981; Lorke, 1983; Casarett y Doull΄s, 1996).

De acuerdo a los resultados obtenidos y a la clasificación de toxicidad de

substancias realizada por la Organización Mundial de la Salud, las aseveraciones a

las que se puede llegar siguiendo el ensayo propuesto por Lorke son que la

boroxazolidona de glicina, del ácido L-aspártico y del ácido L-glutámico se

consideran como substancias moderadamente toxicas y con un índice de toxicidad

de 3 respectivamente (Ariëns, 1978; Hodge y Sterner, 1949).

8.2. COORDINACIÓN MOTORA

Las actividades motoras se organizan jerárquicamente en el sistema nervioso

central. La medula espinal, el cerebro medio, el cerebelo, los ganglios basales y la

corteza cerebral, cada uno posee funciones motoras características. Cada nivel

contribuye a una calidad específica de organización y respuesta motora a la

actividad motora total. Los daños a los centros motores o a las trayectorias pueden

provocar trastornos o pérdida de la función motora, por una parte o pérdida de la

inhibición o de la modulación de las actividades del sistema nervioso central

residual por otra (Katzung, 2002; Estévez-González A. y cols., 2000).

Los ganglios basales se consideran centrales en el control motor, aunque también

intervienen en la conducta no motora, incluidas la cognición y la emoción

77

(Lawrence A.D., 2000). Existen tres componentes principales del sistema motor

implicados en la producción del movimiento voluntario: las vías corticospinales

(piramidales) que pasan a través de las pirámides bulbares y conectan la corteza

cerebral con los centros motores inferiores del tronco del encéfalo y la medula

espinal; los ganglios basales (núcleo caudado, putamen, globo pálido, sustancia

negra y el núcleo subtalámico, que forman el sistema extrapiramidal), un grupo de

estructuras interrelacionadas y situadas profundamente en ambos hemisferios

cerebrales, cuyas eferencias son dirigidas proximálmente a través del tálamo a la

corteza cerebral; y el cerebelo que constituye el centro de la coordinación motora

(Guyton y Hall, 2001, Young A.B., 1998).

Como se menciono anteriormente, la actividad motora es una variable que

involucra directamente el funcionamiento del SNC y por tal motivo resultó

interesante evaluar la actividad biológica que causan las difenilboroxazolidonas de

glicina, del ácido-L-aspártico y del ácido-L-glutámico a nivel central en las ratas, la

cual se evaluó utilizando un rodillo giratorio (previo adiestramiento de los

animales) y se cuantificó el numero de caídas en los diferentes lotes tratados por

un periodo de 5 minutos durante una cinética temporal de 24 horas.

En los lotes tratados con las difenilboroxazolidonas ensayadas fue clara la

incoordinación motora de los animales al evaluar el número de caídas de las ratas

de la plataforma giratoria. En el lote administrado con DFBOZA-gly fue marcado el

78

trastorno en la actividad motora cuantificándose el numero máximo de caídas de

los animales hasta en 14 ocasiones a las 2 horas después del tratamiento,

infiriendo el tiempo en el que se alcanza la actividad biológica máxima, el efecto

motor anormal se observó hasta las 12 horas con una diferencia significativa

estadísticamente; esto nos da una estimación de la permanencia del compuesto en

el organismo de la rata la cual produce una efecto biológico.

Los ganglios basales tienen a su cargo la ejecución automática de un plan motor

aprendido en la preparación para el movimiento. A medida que se aprende una

habilidad motora, los ganglios basales toman una función de ejecutar de modo

automático la destreza aprendida. Cuando están alterados o dañados los ganglios

basales, el individuo debe regresar a un mecanismo cortical más lento, menos

automático y preciso para la conducta motora (Leiguard R.C., 2000).

La afectación en la actividad motora de los animales tratados con las

difenilboroxazolidonas en este caso con la DFBOZA-gly puede ser atribuida a la

interacción con los receptores glicinérgicos, ya que en investigaciones donde se

causo la mutación de los receptores glicinérgicos, reduciendo la sensibilidad de

éstos se provocó numerosas alteraciones en el control motor. Estos desordenes

fueron caracterizados por una contracción muscular intensa (hipertonía) y

normalmente asociada a espasticidad muscular. En humanos la mutación de los

receptores de glicina, provoca rigidez muscular severa la cual se inicia por un

79

estimulo abrupto que puede ser ocasionado por varias causas, incluyendo la luz y

el sonido. La contracción muscular que se genera impide la ambulación y causa

inestabilidad postural (Bowery N.G., y Smart T.G., 2006).

Sin embargo la incoordinación motora provocada por la DFBOZA-gly en los

animales tratados, pudiera estar también relacionada con receptores ionotrópicos

entre los cuales se encuentra principalmente NMDA (localizado abundantemente

en los ganglios basales) e incluso involucrando de forma importante al

neurotransmisor dopamina (Vezina P., y Kim J.H., 1998). Esto debido a que la

dopamina sintetizada en la sustancia negra, a través de los receptores D1 del

estriado se utiliza para mantener un patrón de comportamiento motor, así como

mediante los receptores D2 que se utiliza para suprimir los movimientos

inapropiados y permite el cambio rápido a nuevos comportamientos motores

(Young A.B., 1998).

En cuanto a las difenilboroxazolidonas del ácido-L-aspártico y del ácido-L-glutámico

se observa el comportamiento motor anómalo, evaluado por el número de caídas

de los animales del rodillo giratorio. Para la DFBOZA-L-asp, el tiempo en el que se

observó el efecto biológico máximo fue entre 6 y 8 horas, disminuyendo el número

de caídas de los animales a lo largo del tiempo evaluado. En el lote administrado

con la difenilboroxazolidona del ácido-L-glutámico la incidencia máxima en el

80

número de caídas de los animales de la barra giratoria fue notable a las 3 horas

(12 ocasiones) disminuyendo conforme la evolución del tiempo.

Los neurotransmisores mas usados por las neuronas son de la clase de

compuestos llamados aminoácidos, los de tipo excitador son el ácido aspártico y el

ácido glutámico y son los mas abundantes aminoácidos libres en el cerebro del

mamífero (Tallan, Moore y Stein, 1954). La neurotransmisión mediada por estos

aminoácidos ocurre vía receptores ionotrópicos y metabotrópicos, los cuales están

acoplados a canales iónicos y proteínas G respectivamente. Los aminoácidos

excitatorios han sido implicados en numerosos procesos fisiológicos y de

comportamiento, así como se piensan que son la base del aprendizaje y la

memoria. Es conocido que los sistemas que usan glutamato como neurotransmisor

en los ganglios basales contribuyen de manera importante en la generación de la

actividad motora, aunque los receptores ionotrópicos de glutamato (NMDA, AMPA

y Kainato) han sido más estudiados, los receptores metabotrópicos también

contribuyen de manera importante en la actividad motora.

Por lo anterior y debido a la alteración en la coordinación motora de las ratas

evaluadas podemos inferir que la DFBOZA-L-asp, al igual que la DFBOZA-L-

glutámico están actuando sobre el receptor ionotrópico NMDA, ya que se produce

una estimulación motora excesiva de forma general en el SNC, lo cual se observó

en la dosis utilizadas para evaluar la toxicidad aguda de los compuestos, la cual

81

provocó convulsiones. Aunque con certeza no sabemos sobre que clase de

receptores estén actuando específicamente puede ser que estén actuando sobre el

receptor ionotrópico NMDA o en los receptores metabotrópicos glutamatérgicos

(mGluR΄s), ya que estudios funcionales han sugerido que el grupo II mGluR΄s los

cuales incluyen a los subtipos mGluR2 y mGluR3, ambos están negativamente

acoplados a la adenilato ciclasa, son abundantes en los ganglios basales, región

involucrada críticamente en la actividad motora (Jeffrey C. Watkins y David E.

Jane., 2006).

Se ha demostrado que la DFBOZA-L-glu efectivamente interacciona con receptores

de glutamatérgicos, tal como se encontró en el experimento donde se administró

DFBOZA-L-glu directamente en el globo pálido de rata, estructura neuronal que

posee gran cantidad de receptores de glutamato, la DFBOZA-L-glu fue capaz de

aumentar la actividad neuronal en el globo pálido, aumentando la frecuencia de

disparo de 13 de 16 neuronas en un 242 ± 48 % del valor basal (Araujo A. J.,

2004).

82




DESARROLLO CROMATOGRÁFICO

En el desarrollo de las condiciones cromatográficas de las difenilboroxazolidonas de

aminoácidos se buscó una alta sensibilidad del método, una resolución adecuada

de los picos cromatográficos y eficiencia en el tiempo de detección, es por eso que

todos los componentes y constituyentes que integraron el método cromatográfico

debieron tener como objetivo estas condiciones.

La selección de la fase móvil (FM) en cromatografías convencionales es en base a

la compatibilidad que tenga esta con los analitos a cuantificar o separar sin que

estos sufran algún tipo de reacción al ponerse en contacto con ella. Sin embargo

para la detección que fue utilizada en la cuantificación de las

difenilboroxazolidonas fue necesario que la FM modificara las propiedades químicas

de los compuestos en cuanto a su ionización sin perder de vista su coeficiente de

reparto entre la columna y la fase móvil. Otra característica es que todos los

componentes que la constituyan deben ser volátiles. La FM debe ayudar a la

columna en la obtención de una adecuada resolución, aun siendo detección por

espectrometría de masas, ya que si los picos no son óptimamente resueltos puede

existir aumento o supresión iónica por parte de interferencias provenientes de la

matriz biológica hacia las diferentes difenilboroxazolidonas cuantificadas.

83

Para lograr una adecuada selectividad y evitar interferencia iónica fue necesario

usar un gradiente cromatográfico el cual permitió una óptima cuantificación. Este

gradiente puede ser generado a través de diferentes curvas, en este caso se

emplearon curvas cóncavas, las cuales tienen como característica que al inicio de

la inyección de la muestra, el cambio en la proporción de la fase móvil es lento

aumentando su velocidad con respecto al tiempo de inyección, las curvas utilizadas

en este trabajo fueron la 7 y 11, siendo la once más lenta al inicio con respecto de

la siete. Los estándares de las DFBOZA de Gly, L-asp y L-glu fueron disueltos

totalmente en una solución de metanol más ácido fórmico al 0.1 % con un pH de

3.9, con objeto de estabilizar las soluciones de trabajo (la estabilidad reportada por

Strang, 1989, de las difenilboroxazolidonas es a pH ácido de 2 a 5). Las

difenilboroxazolidonas de aminoácidos aquí estudiadas también son solubles en

ACN utilizando éste para la fase móvil la cual también contiene formiato de amonio

2 mM a pH 3.3. A pesar de que las soluciones de trabajo de los compuestos

estudiados fueron preparados en metanol (MeOH), este en espectrometría de

masas se tiene que usar con reservas cuando no se conoce el metabolismo de los

analitos a cuantificar (como por ejemplo las difenilboroxazolidonas de

aminoácidos), ya que con el voltaje utilizado y la temperatura puede favorecer la

reconversión entre el analito y su metabolito hidrolizado dentro del instrumento de

detección así como la presurización del sistema. La ionización molecular de las

difenilboroxazolidonas a través de la fase móvil es necesaria cuando se trata de un

84

método analítico con detección por electrospray. El pH utilizado para la

cuantificación de estas se estableció considerando el pka1 de los aminoácidos que

es de 2.4, 2.0 y 2.1 respectivamente para Gly, Asp y Glu. A este pH los

compuestos se encuentran ionizados y listos para viajar a través de la diferencia

de potencial dentro del detector de masas. Este pH es necesario mantenerlo

durante toda la corrida cromatográfica, por lo cual el uso de un buffer que lo

amortigüe es necesario, esta es la razón del uso del formiato de amonio 2 mM.

Otro de los integrantes de suma importancia en la cromatografía es la columna,

existen una infinidad de columnas cromatográficas en el mercado pero debido a

sus características únicas, la utilizada para la separación de las

difenilboroxazolidonas de aminoácidos en este estudio fue una columna con un

ligando C6-fenilo; el cual forma una fase estacionaria reversa especial para la

separación de compuestos con anillos aromáticos como es el caso de las

difenilboroxazolidonas, además tiene otras bondades que soportan las condiciones

que se requieren de presión y flujo en un sistema UPLC/MS-MS como son: tamaño

de partícula de 1.7 m que permite soportar flujos de fase móvil bajos (máximo

0.6 mL/min) a altas presiones hasta 15000 psi, lo cual permite un gasto de

disolventes mínimo comparado con otros sistemas que tienen gastos de hasta 2

mL/min, siendo este flujo tres veces más alto que el usado en la detección de las

difenilboroxazolidonas de aminoácidos ensayadas. Esto contribuye ecológicamente

ya que el uso de disolventes se reduce considerablemente, así como el costo del

85

método, ya que los tiempos de inyección usados en este método analítico fueron

de 2 min. Este tiempo tan corto de respuesta lo permite la dimensión de la

columna fenilo la cual fue de 2.1 x 100 mm. Las dimensiones y tamaño de

partícula de la columna así como el ligando dan como resultado una alta resolución

de los picos cromatográficos de las difenilboroxazolidonas de aminoácidos en

estudio. Cabe mencionar que esta columna soporta rangos de pH de 1 a 12

unidades, así como 4000 inyecciones y temperaturas de hasta 65 oC. El C. V. en

los tiempos de retención que esta reportado para esta columna es < 2.31 %, así

como un acarreo insignificante. Estas características nos permitieron tener

variaciones mínimas cromatográficas así como una alta selectividad y eficiencia en

la separación de picos debido a que se uso solo una columna durante todas las

etapas que involucraron esta tesis (desarrollo, validación y farmacocinética)

soportando el pH usado que fue de 3.9, la temperatura de 40 oC y el flujo de 0.25

mL/min.

La temperatura de la columna cromatográfica debe apoyar al sistema UPLC con el

control de la presión generada en el equipo y esto lo hace disminuyendo la

viscosidad de la fase móvil ya que esta propiedad de los líquidos es dependiente

de manera directamente proporcional a la temperatura. Al controlar la temperatura

de la columna se controla la cuantificación de los compuestos ya que ayuda a

mantener la resolución y geometría de los picos cromatográficos. Al optimizar la

temperatura se cuido de no exceder la máxima soportada por la columna y sobre

86

todo que las difenilboroxazolidonas no sufrieran alguna alteración molecular

descomponiendo su estructura y por ende interfiriendo en la detección del sus

iones moleculares y fragmentos esperados después de su paso por el detector de

masas. El camino más sencillo y rápido era el uso de la columna cromatográfica a

temperatura ambiente ya que no se contaba con información suficiente de

estabilidad de las difenilboroxazolidonas a temperaturas mayores a las ambientales

en el disolvente empleado en la técnica de extracción, sin embargo este método ni

siquiera fue considerado al realizar la optimización de este parámetro, ya que

durante una corrida cromatográfica la temperatura ambiente sufre oscilaciones y

estas oscilaciones se incrementan entre días, teniendo como consecuencia posibles

cambios en los tiempos de retención de los analitos y sus estándares internos, lo

cual generaría una deficiencia en la integración de los picos así como le restaría

robustez a la selectividad del método analítico. Por lo tanto tomando en

consideración lo anterior la temperatura óptima de la columna en la cuantificación

de las difenilboroxazolidonas de los aminoácidos estudiados fue de 40 oC.

El flujo cromatográfico debe generar una presión mínima de 7000 psi para trabajar

en condiciones de ultra alta resolución. Debe de ayudar a la columna

cromatográfica en la obtención de picos simétricos y finos, ya que flujos y

presiones bajas pueden producir asimetría en los picos y ensanchamiento,

obteniendo como resultado pérdida en la altura de los mismos. La altura de los

picos es muy importante ya que recordemos que durante la etapa de validación de

87

un método analítico por cromatografía, uno de los parámetros a evaluar es el

límite de detección y cuantificación, los cuales tienen como criterio de aceptación

un parámetro que relaciona la respuesta de señal/ruido y esto esta en función de

la altura del pico de las tres difenilboroxazolidonas analizadas y del ruido en la

línea base generado. La estabilidad del ruido de la línea base cromatográfica

puede ser afectado por fluctuaciones en el flujo, por lo cual este debe ser

constante y homogéneo, estas características las obtenemos con un flujo isocrático

como es nuestro caso, ya que si generamos un gradiente de flujo este puede

interferir en la estabilidad de la línea base debido al cambio de velocidad en los

pistones de la bomba cromatográfica, así como disminución de la vida útil de la

columna debido al constante cambio de presión generado dentro de esta (la

presión es directamente proporcional al flujo cromatográfico). Además de lo

anterior los picos geométricamente homogéneos son perfectamente cuantificables

sin el riesgo de sub y/o supra estimarlos con la consecuencia de obtener

concentraciones falsas. Es por eso es que cuando se desarrollo el método analítico

para la cuantificación de las DFBOZA de Gly, L-asp y L-glu se realizó con un flujo

de 0.25 mL/min el cual generó una presión de 7600 psi aproximadamente con

anchos de pico menores a 0.4 de min, sin coleo y perfectamente integrables para

su cuantificación.

Para la optimización de la temperatura del automuestreador se tomo en

consideración la estabilidad de las tres diferentes difenilboroxazolidonas en la

88

mezcla de extracción ACN:ácido fórmico 0.1 % 80:20 v/v, así como el tiempo

probable calculado en el cual las muestras de la validación y la farmacocinética

quedarían almacenadas en al automuestreador antes de ser inyectadas. Al realizar

esta optimización se cuido que la mezcla que contenía a los compuestos no se

evaporara, por lo que fue necesario probar temperaturas por debajo de 20 oC que

es el punto de evaporación del ACN y del ácido fórmico, sin embargo como al

mezclar los componentes de la fase móvil estos forman una mezcla azeotrópica y

esta puede tener diferente punto de evaporación ya sea por arriba o por debajo a

20 oC se optimizo a 15 oC. Otro de los aspectos que fue cuidado para establecer

esta temperatura fue que durante todo en tiempo que estuvieran las muestras

dentro del automuestreador no existiera precipitación, ya que como son

compuestos relativamente nuevos, no se tenía información sobre una posible re-

cristalización en esas condiciones de pH, disolventes y temperatura. Ahora

sabemos que si las difenilboroxazolidonas de Gly, L-asp y L-glu se protegen de la

luz, y se almacenan a la temperatura y mezcla de extracción antes descritas, son

estables por lo menos 8 horas en el automuestreador.

DETECCIÓN

Se seleccionó la espectrometría de masas como método de detección ya que

proporciona alta sensibilidad (desde 25 pg/mL), especificidad, precisión y

reducción en los tiempos durante el desarrollo analítico de nuevos compuestos en

diferentes matrices biológicas (Duncan., 2006).

89

El detector de espectrometría de masas utilizado en este trabajo nos permitió

seleccionar el tipo de ionización más adecuada para la detección de las

difenilboroxazolidonas en estudio, entre la ionización por electrospray (ESI) y la

ionización química a presión atmosférica (APCI). La ionización ESI es suave

(Duncan, 2006) comparada con la APCI, ya que la primera ioniza a través de un

cambio de pH en el medio mientras que la última ioniza con una descarga eléctrica

de corona, la cual puede incluso fragmentar a la molécula de interés antes de

entrar a la celda de colisión. Las difenilboroxazolidonas de Gly, L-asp y L-glu son

moléculas anfipáticas debido a que tienen más de un grupo funcional ionizable.

Dependiendo del pH en donde se encuentren estas pueden estar ionizadas positiva

o negativamente, es por esto que se decidió trabajar con la ionización por ESI ya

que el pH proporcionado por la fase móvil de 3.3 favorece la polarización de los

compuestos sin necesidad de someterlos a una descarga eléctrica. Aunado a lo

anterior durante la optimización por detección MS se obtuvieron mejores

resultados con respecto a la abundancia y estabilidad de los picos por electrospray

comparado con APCI (datos no mostrados).

El tipo de ionización ESI puede ser usado en modo positivo o negativo

dependiendo de la carga de los iones en estudio. En nuestro caso las moléculas

fueron cargadas positivamente por lo cual el modo de ionización fue positivo (+).

La ionización de las DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu presumiblemente

90

se realiza en el sitio del carboxilo alfa ( -COOH) de los aminoácidos siendo el pKa1

de estos es 2.35, 1.99 y 2.1 respectivamente. Al observar la gráfica de valoración

de Gly (fig. 23), se puede apreciar que a valores de pH por debajo de su pKa1 los

dos grupos ionizables de éste aminoácido se encuentran protonados,

predominando la forma catiónica (+H3NCH2COOH). A pH por debajo de su punto

isoeléctrico, pero mayores a su pKa1 la forma predominante es (H3N+CH2COO-) de

zwitterion, mientras que cuando el pH del medio y el pKa1 son iguales existe un

equilibrio entre las dos formas (Voet., 1999).

Este razonamiento puede extrapolarse al comportamiento de la

difenilboroxazolidona de Gly, sin perder de vista que el heteroátomo de boro y el

enlace covalente coordinado que se forma con el grupo amino del aminoácido

puede modificar el pKa de los compuestos estudiados.

Si el pka1 de la Gly (2.35) es mucho menor al de un ácido monocarboxílico como

es el ácido acético (CH3COOH) el cual tiene un pka de 4.76 y esta gran diferencia

esta dada por la influencia electrostática de la carga positiva del grupo amino

(Voet., 1999), entonces podemos inferir que en las difenilboroxazolidonas al estar

comprometido éste grupo en un enlace covalente coordinado con el boro, esta

influencia disminuye, por lo cual el pka de los compuestos en estudio puede ser

mayor al de los aminoácidos. Entonces por los resultados en la ionización

molecular obtenidos, presumiblemente los valores de pka de las

91

difenilboroxazolidonas de los aminoácidos de Gly, L-asp y L-glu son mayores por lo

menos a 3.3 ya que a este pH son ionizadas en forma positiva.

Figura 23. Gráfica de la valoración iónica de glicina (Modificado de Voet,

1999).

El monitoreo de reacción múltiple (MRM) fue el método de adquisición empleado

en la cuantificación de las difenilboroxazolidonas. Este método fue útil en la

92

confirmación de las transiciones obtenidas durante la optimización de los picos

espectrométricos (picos MS) de los compuestos de interés. El método MRM fue

diseñado para garantizar que las transiciones encontradas fueran confiables para la

cuantificación de las muestras. Además de la confirmación de las transiciones,

corrobora que el voltaje del cono así como la energía de colisión fueron los

adecuados para su obtención. En este método se realiza la optimización del

“dwell”, el cual se optimizo por medio del número de puntos que se requieren para

la adquisición de los picos MS. Estos picos deben estar constituidos por al menos

de 15 puntos para no perder sensibilidad de la señal generada durante la

adquisición de los mismos y por ende perdida de sensibilidad en del método de

detección y como máximo 25 puntos para obtener picos simétricos y bien

definidos. El dwell usado en este trabajo fue de 0.2 seg con el cual los picos MS de

las difenilboroxazolidonas de aminoácidos fueron integrados por 20 y 22 puntos.

Los parámetros optimizados en el detector de masas tuvieron como objetivo

generar picos MS abundantes y estables. Siguiendo este objetivo los voltajes que

se establecieron para los parámetros: energía del capilar, energía de cono, energía

del extractor y radio frecuencia, se usaron en la selectividad de la relación m/z+1

de los iones moleculares de las diferentes boroxazolidonas analizadas,

facilitándoles su viaje dentro del detector MS a través de la generación de campos

electromagnéticos en el “T-wave” y primer cuadrupolo, seleccionando así solo los

iones con relación m/z+1 240.15, 298.20 y 312.20 Th (Cooks R.G., y cols., 1991)

93

respectivamente para las difenilboroxazolidonas de Gly, L-asp y L-glu. Las

temperaturas de la fuente y de desolvatación así como su flujo de gas fueron

empleados para la óptima evaporación de la fase móvil, la cual al irse evaporando

forma gotas que contienen iones cargados positivamente, al evaporarse

completamente la fase móvil, el cúmulo de iones cargados sufren una fisión por la

repulsión generada de cargas iguales, a esta explosión se le llama de Coulomb la

cual deja libres a los iones moleculares para facilitar su entrada al detector MS

(Gaskell., 1997). El flujo de gas de cono fue empleado para repeler los iones que

no cumplan con las relaciones m/z+ antes mencionadas evitando así la entrada de

interferencias al espectrómetro. Al no permitir que otros iones se introdujeran al

instrumento, se aumento la selectividad del método y se prolongo la limpieza del

cono de entrada. La resolución de masas altas y bajas 1 así como la energía del

ión 1, fueron optimizadas para obtener anchos de pico MS de 1 uma como máximo

en los iones moleculares de las difenilboroxazolidonas. La presión del gas de

colisión y los electrón-volts de colisión fueron optimizados para la obtención de las

relaciones m/z+1 de los iones producto de 162.0, 160.0 y 163.0 Th, para las

boroxazolidonas de Gly, L-asp y L-glu respectivamente. Se observa que todas las

DFBOZA aquí estudiadas durante la fragmentación, pierden el grupo fenilo y la

cadena lateral del aminoácido correspondiente (fig. 19). Cabe señalar que la

energía de colisión necesaria para romper la cadena lateral de los aminoácidos fue

proporcional al tamaño de esta, es decir las energías de colisión obtenidas fueron:

8, 10 y 50 electrón-volts para Gly, L-asp y L-glu respectivamente, lo que coincide,

94

ya que la menor energía se uso en la fragmentación de DFBOZA-gly la cual carece

de cadena lateral, mientras que la mayor energía fue usada en la fragmentación

de DFBOZA-L-glu, la cual tiene la cadena lateral más grande. Las energías de

entrada y salida de la celda de colisión se optimizaron para incrementar aún más la

alta sensibilidad en la detección ya que a esta celda solo le permitió la entrada a

las relaciones m/z+ de los iones moleculares, mientras que la salida permitió solo el

paso hacia el segundo cuadrupolo de los iones con relaciones m/z+

correspondientes a los fragmentos. La resolución de masas altas y bajas 2 así

como la energía del ión 2, fueron optimizadas para generar anchos de pico MS de

1 uma como máximo en los iones producto de las difenilboroxazolidonas. El

fotomultiplicador se empleó para aumentar la señal electromagnética dada por los

fragmentos espectrométricos de los compuestos aquí mostrados.

Al realizar el análisis de los picos espectrométricos de los iones moleculares de las

DFBOZA de los aminoácidos Gly, L-asp y L-glu (fig. 18), se observo que la

abundancia isotópica obtenida para el 10B y el 11B coincide con lo reportado por

Soloway y cols., 1998, ya que mencionan que la abundancia isotópica que se

encuentra naturalmente de ellos es de 19.7 % y 80.3 % respectivamente. Este

hallazgo confirma que las condiciones espectrométricas establecidas para la

cuantificación de las difenilboroxazolidonas de los tres aminoácidos aquí

presentados fueron adecuadas y confiables.

95

8.4. VALIDACIÓN

El método analítico fue diseñado para la cuantificación de las

difenilboroxazolidonas en sangre de rata, éste fue sensible, reproducible, confiable,

exacto, preciso, estable y selectivo.

En estudios pre-clínicos, la validación de los métodos que se emplean para la

cuantificación los compuestos en estudio es poco usual. Sin embargo, debido a la

importancia clínica que tienen las boroxazolidonas nos dimos a la tarea de realizar

esta etapa previa a la cuantificación de las muestras.

Durante el análisis de muestras biológicas es común intercalar puntos de

concentración conocida (puntos control, PC) como controles de calidad durante

una corrida cromatográfica (Swartz y cols., 2003), estos puntos deben cubrir todo

el intervalo de cuantificación por lo cual en este estudio se usaron tres niveles:

bajo (PC1), medio (PC2) y alto (PC3).

La selectividad del método se estableció eligiendo adecuadamente la columna

cromatográfica, la cual es específica para la retención de compuestos aromáticos.

El gradiente de la fase móvil nos permitió la separación de posibles interferencias

endógenas con los analitos. La espectrometría de masa es un técnica analítica de

alta selectividad ya que identifica compuestos con respecto a su relación m/z+.

De acuerdo a los resultados obtenidos el porcentaje de recobro de las

difenilboroxazolidonas ensayadas fue de: 94.19 % para DFBOZA-gly con un C. V.

96

de 2.25 %, 100.16 % para DFBOZA-L-asp con un C. V. de 3.14 % y 99.28 % para

DFBOZA-L-glu con un C. V. de 0.31 %.


Manchas en sangre seca (DBS)

DBS, represento una técnica de muestreo más práctica y menos agresiva que nos

permitió obtener un volumen de muestra suficiente, sobre todo en especies

pequeñas como la rata. El formato de la tarjeta es una manera fácil de

almacenamiento de una gran cantidad de muestras que en muchas ocasiones

poseen una mayor estabilidad a temperatura ambiente en comparación con fluidos

biológicos frescos. Además de esto, DBS evitó la cateterización de los animales

durante largos periodos de muestreo en la farmacocinética. Por otra parte, los

procedimientos de extracción de muestras perforadas fueron automatizados por lo

que el método fue de alta eficiencia. Durante el acoplamiento del análisis DBS con

MS/MS es muy importante el uso de tarjetas de algodón extrapuro y libre de

aditivos que puedan interferir con la ionización del analito. Es importante utilizar

sangre heparinizada ya que la heparina no ha demostrado supresión iónica y no

así el EDTA. Se tomaron cuidados rigurosos durante el procesamiento de las

muestras así como se puso atención especial en el volumen depositado en las

tarjetas y la manipulación de las mismas, para minimizar la variabilidad en el

análisis cuantitativo de las boroxazolidonas en DBS (Li W., y Tse FLS., 2010).

97

En general, se acepta que existe una relación entre los niveles sanguíneos o

plasmáticos de un fármaco y la intensidad y duración de la respuesta

farmacológica observada (subterapéutica, terapéutica o tóxica), como resultado de

su administración a un organismo. Una relación directa de lo anterior, se basa en

dos principios, los cuales en conjunto dan validez a los estudios de

biodisponibilidad y farmacocinética lineal (Cárdenas-Rodríguez H.L., 2000).

A) La concentración plasmática del fármaco esta directamente relacionada con

la concentración en cualquier parte del organismo.

B) La intensidad de la acción farmacológica está relacionada directamente a la

concentración del fármaco en la biofase.

En condiciones fisiológicas normales, esto se cumple a través del equilibrio

dinámico establecido por la difusión reversible del fármaco entre sangre y tejidos

(Pallasch T.J., 1988).

La evolución temporal de concentraciones y cantidades de las

difenilboroxazolidonas de glicina, del ácido-L-aspártico y del ácido-L-glutámico fue

monitoreada en las ratas después de la administración única por vía i.g. donde uno

de los primeros resultados que saltan a la vista fue la diferencia marcada y amplia

entre los diferentes Cmáx entre DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu, análogos que

98

difieren solo en un grupo metileno en la cadena lateral carboxílica. El Cmáx obtenido

en las ratas tratadas con DFBOZA-gly y con DFBOZA-L-glu es mucho menor al que

presenta el grupo tratado con DFBOZA-L-asp, esto puede ser debido a una

disminución en la absorción de estas moléculas ya que el tiempo en que se alcanza

la concentración máxima sanguínea denota que la absorción ocurre

preferentemente en el estomago, en caso contrario el grupo tratado con la

DFBOZA-L-asp denota que el tiempo en que alcanza circulación sistémica se ve

aumentado (tmáx=6.25 ± 0.25 h) alrededor de 3 veces más que el tmáx

correspondientes a las otras difenilboroxazolidonas, infiriendo que la absorción

preferentemente se esta llevando a cabo en la superficie del intestino lo cual

puede explicar el valor alto de la concentración máxima sanguínea obtenida y el

ABC tan diferente con respecto a las demás boroxazolidonas en estudio. Sin

embargo se sugiere que este tipo de moléculas presentan una farmacocinética no

lineal; debido a los cambios notables en los parámetros farmacocinéticos obtenidos

como la eliminación, el volumen de distribución y semivida en función de la dosis o

concentración), esto por lo regular depende de la saturación de la unión a

proteínas, del metabolismo por el hígado o de la depuración (Goodman y Gilman,

2007).

Por otro lado el pico de concentración máxima sanguínea monitoreado en la

farmacocinética de las difenilboroxazolidonas ensayadas se correlaciona con la

actividad biológica máxima obtenida en el SNC en las ratas. El tiempo (tmáx) en el

99

que se presentó la concentración máxima sanguínea de las difenilboroxazolidonas

corresponde al tiempo donde se encontró el mayor número de caídas de los

animales del rodillo giratorio tras la administración de las boroxazolidonas, por lo

que el tmáx y Cmáx obtenidos experimentalmente corresponden a la actividad

máxima en el SNC evaluada con la actividad motora.

Ha sido bien establecido que el volumen de distribución aparente es un parámetro

que se correlaciona con la liposolubilidad de las moléculas. Un indicador de la

liposolubilidad es el logaritmo de la distribución de una molécula entre n-octanol y

agua (Log P), y se ha reportado en previas investigaciones el Log PDFBOZA-gly 1.48,

Log PDFBOZA-L-asp 0.98 y Log PDFBOZA-L-glu 1.16. Una alta liposolubilidad se asocio a

una mayor toxicidad de las difenilboroxazolidonas a nivel central.

El resultado obtenido fue una relación entre Vdapp y la toxicidad; un volumen de

distribución alto y Log P mayor se correlaciona con la DL50 inferior, que

corresponde a la DFBOZA-gly la cual resultó ser más tóxica. Los perfiles

farmacocinéticos de concentración sanguínea contra tiempo de las tres

boroxazolidonas se muestran en la figura 22 las cuales se pueden enlazar con las

cinéticas temporales de la evaluación de la coordinación motora en ratas.

100

9. CONCLUSIONES

La DL50 encontrada en ratas Wistar macho en unidosis por via i.g. de las

difenilboroxazolidonas son: DFBOZA-gly=120 mg/kg, DFBOZA-L-asp=210 mg/kg y

DFBOZA-L-asp=160 mg/kg, de acuerdo a estas dosis y al valor del índice de

toxicidad (3) presentado; se les considera como sustancias con toxicidad

moderada.

El efecto sobre la actividad motora y las convulsiones generadas provocadas por la

administración de la DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu indica que estas

boroxazolidonas tienen acción sobre SNC.

La incoordinación motora producida por las difenilboroxazolidonas de gly, L-asp y

L-glu durante la cinética temporal conducen a sugerir que podrían estar actuando

en los ganglios basales en el SNC.

Los mejores resultados en la ionización de las difenilboroxazolidonas se obtuvieron

por electrospray (ESI) con respecto a la ionización química a presión atmosférica

(APCI).

La máxima intensidad y estabilidad de las boroxazolidonas ensayadas se presentó

en modo positivo.

101

La DFBOZA-gly exhibió la señal más intensa durante la ionización por ESI (+).

La mayor abundancia isotópica de las difenilboroxazolidonas de gly, L-asp y L-glu

corresponde al 11B.

La fragmentación de las DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp y DFBOZA-L-glu y el método

de adquisición de datos (MRM) aumentaron la sensibilidad y la selectividad del

método bioanalítico.

El patrón fragmentación de las difenilboroxazolidonas de gly, L-asp y L-glu sugiere

la pérdida del fragmento correspondiente al grupo fenilo en todas las

boroxazolidonas cuantificadas.

La columna cromatográfica C6-fenilo la cual tiene una fase estacionaria reversa

especial brindo una óptima separación, identificación y cuantificación de las

difenilboroxazolidonas.

La farmacocinética de las difenilboroxazolidonas de glicina, del ácido L-aspártico y

del ácido L-glutámico después de una administración única i.g. (120 mg/kg, 210

mg/kg y 160 mg/kg, respectivamente) en ratas, sugieren que presentan una

farmacocinética no lineal.

102

Los valores más altos de los parámetros farmacocinéticos calculados: Cmáx, Tmáx, y

el ABC correspondieron a la DFBOZA-L-asp, los cual indica una mayor absorción y

una mayor biodisponibilidad en el organismo.

La DFBOZA-gly fue la molécula que presentó un Vdapp muy elevado, lo cual denota

su alta liposolubilidad y sugiere que pudiera encontrarse en concentraciones altas

en el tejido extravascular.

El valor enorme de la t1/2 de la boroxazolidona de glicina implica el tiempo

prolongado de permanencia del compuesto en el organismo de la rata.

La farmacocinética de las difenilboroxazolidonas guarda una correlación directa

con el efecto biológico central en ratas.

Los compuestos que contienen boro en su estructura química constituyen un

campo creciente de la química médica con un amplio potencial en la terapéutica.

En particular, el estudio de las difenilboroxazolidonas de α-aminoácidos puede ser

una estrategia muy importante para aumentar la liposolubilidad de los

aminoácidos, y por lo tanto su biodisponibilidad en ciertos tejidos y órganos, en los

cuales juegan un papel muy importante (vías metabólicas del endotelio,

transmisión neuronal, cotransportadores epiteliales, etc.)

103

Las técnicas analíticas actuales demuestran la idoneidad para el monitoreo en DBS

de las difenilboroxazolidonas de α-aminoácidos en las farmacocinéticas preclínicas.

Esto también nos brindo la posibilidad de correlacionar las concentraciones en

sangre con el curso temporal de los efectos en el SNC.

La técnica UPLC MS/MS es una herramienta analítica muy sensible y específica que

permitió la medición de las DFBOZA de α-L-aa en cantidad de muestra limitada,

una situación común durante los estudios preclínicos en especies pequeñas como

las ratas.

104

10. PERSPECTIVAS

DBS representa una revolucionaria técnica analítica para la toma de muestra,

gestión y almacenamiento muestras biológicas. Sus aplicaciones abarcan no sólo

los ensayos preclínicos con animales pequeños, si no también en las tomas de

muestras pediátricas, e incluso los adultos en protocolos de largos periodos de

muestreo. Sin embargo, se deben generar más investigaciones sobre nuevos

materiales de soporte de las tarjetas, moléculas volátiles y la automatización de la

extracción. Actualmente el uso de DBS para fines cuantitativos se limita a

moléculas con altas concentraciones en sangre.

En lo que concierne a la farmacocinética de las DFBOZA-gly, DFBOZA-L-asp y

DFBOZA-L-glu, será necesario hacer un mapeo en el SNC, para dilucidar la posible

distribución de dichas moléculas. El efecto sobre la actividad motora en ratas de

las difenilboroxazolidonas sugieren los ganglios básales como área de destino.

105

11. REFERENCIAS

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114

12. ANEXOS

Identificación espectrofotométrica de la DFBOZA-gly, donde se muestran dos

máximos de absorbencia a los 237.8 y 260 nm.

Espectro UV de la difenilboroxazolidona de glicina.

115

Identificación de la DFBOZA-gly, en el espectrofotómetro de IR.

Espectro de IR de la difenilboroxazolidona de glicina.

116

Identificación espectrofotométrica de la DFBOZA-L-asp, donde se muestra un

máximo de absorbencia a los 259 nm.

Espectro UV de la difenilboroxazolidona del ácido L-aspártico.

117

Identificación de la DFBOZA-L-asp, en el espectrofotómetro de IR.

Espectro de IR de la difenilboroxazolidona del ácido L-aspártico.

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T E S I S - Instituto Politécnico Nacional1 Determinación de la DL 50 de la boroxazolidonas de glicina 36 2 Determinación de la DL 50 de la boroxazolidonas de aspártico 38