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T G C A
Sequenziamento enzimatico del DNA (Sanger)
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’ 3’
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
3’ 5’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’ 3’
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
3’ 5’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’ 3’
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
3’ 5’
TTACGTAACGTCA5’ 3’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’ 3’
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
3’ 5’
TTACGTAACGTCA5’ 3’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’ 3’
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
3’ 5’
TTACGTAACGTCA5’ 3’
dATP dCTP dGTP dTTP + DNA Polimerasi
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’ 3’
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
3’ 5’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT5’ 3’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’ 3’
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
3’ 5’
TTACGTAACGTCA5’ 3’
dA dC dG dT + DNA PolimerasiddATP ddCTP ddGTP ddTTP
dATP dCTP dGTP dTTP + DNA Polimerasi
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAATTACGTAACGTCAG 14
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAATTACGTAACGTCAGA
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAATTACGTAACGTCAGAA
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAATTACGTAACGTCAGAAC
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAATTACGTAACGTCAGAACG
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAATTACGTAACGTCAGAACGT
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAATTACGTAACGTCAGAACGTC
15
16
17
18
19
20
Laser
Elettroforesi
Fluorimetro
-
+
Laser
Elettroforesi
Fluorimetro
-
+
Lettura
ACGT
G
Laser
Elettroforesi
Fluorimetro
-
Lettura
ACGT
GAAC
+
Elettroferogramma
T G C A
Sequenziamento enzimatico del DNA (Sanger)
Metodi di marcatura degli acidi nucleici
Traccianti utilizzati
Nucleotidi marcati con isotopi radioattivi
Traccianti utilizzati
Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive
Traccianti utilizzati
Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive
- Fluorocromi (marcatura diretta)- Enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina)- Digossigenina (riconosciuta da anticorpi specifici marcati con fluorocromi o enzimi)- Biotina (riconosciuta da avidina marcata con fluorocromi o enzimi)
Traccianti utilizzati
Fluorocromi
Strategie di marcatura
Marcatura delle estremità mediante polinucleotide chinasi
Strategie di marcatura
Sintesi di DNA mediante random priming
Strategie di marcaturaNick Translation
DNAsi I
E. Coli Pol IAttività esonucleasica 5’-3’ + nucleotidi marcatiAttività polimerasica 5’-3’
5’ 3’
3’ 5’
5’
3’
3’
5’
3’ 5’
5’ 3’
5’
3’
3’
5’
3’ 5’
5’ 3’
Strategie di marcaturaPCR
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’5’
Vantaggi: elevata attività specifica, necessarie poche molecole di stampo
Strategie di marcatura
Sintesi di RNA antisenso mediante RNA polimerasi
Strategie di marcatura
Sintesi di cDNA mediante transcrittasi inversa
Tecniche di rivelazione degli acidi nucleici basate su ibridazione dopo separazione elettroforetica
mediante gel di agarosio. Il Southern blot analizza il DNA, il Northern blot l’RNA.
Strategia generale
Dot blot
1
2
3
4
A B C D
Altra forma di ibridazione su membrana: il dot blot (sia con campioni di RNA che di DNA)
Preparazione dei campioni prima della corsa elettroforetica
1. Nel southern blot il DNA (sia genomico che plasmidico) viene digerito con enzimi di restrizione.
2. Nel northern l’RNA deve essere denaturato. Si può usare RNA totale o RNA messaggero purificato (PolyA+)
Cella elettroforetica per gel di agarosio
M
1
2
3
4
5
6
789
10
E6 E4
+
mRNA
DNA satellite
18S
28S
7S
-RNA to
taleDNA
genomico
Trasferimento capillare da gel di agarosio
Trasferimento elettrico da gel di agarosio
Membrana dopo trasferimento
Marcatura della sonda tramite random priming
SOUTHERN BLOT
RFLP= restriction fragment length polymorphism
Individuazione diretta di mutazioni patogene tramite identificazione di RFLP
In rari casi la mutazione patogena può abolire o creare un sito di restrizione
I polimorfismi delle VNTR (Variable number of Tandem Repeat)
-DNA genomico viene digerito con enzimi ben conservati che Fiancheggiano uno specifico locus VNTR.-Lo schema di RFLP non dipende da RSP, bensì da numero di volte un cui una unità è ripetuta in tandem-sonda: sequenza unica del locus
DNA FINGERPRINT (impronta digitale del DNA)
-Se il locus VNTR fa parte di una famiglia di DNA ripetitivo, si può usare come sonda una unità ripetuta, al posto di una sequnica del locus
-Si produce uno schema polimorfico complesso che permettedi discriminare tra due individui qualsiasi che non siano gemelliidentici
