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1
Ta de fusión de oligonucleótidos (tm)
tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)
tm = 81.5 + 16.6 (log10[K+]) + 0.41 (%[G + C]) – (675/n)
T
T
% G + C
%¿Qué es la PCR?
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR:polymerase chain reaction) es una técnica deamplificación de secuencias de DNA in vitro
5’ ….AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG.... 3’3’ ….TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC.... 5’
5’ ….AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG.... 3’
3’ ….TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC.... 5’AATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG.... 3’5’ AGGTCG
GCTATC 5’3’ ….TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAA 5’ ….AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG.... 3’
3’ ….TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC.... 5’
5’ ….AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG.... 3’
3’ ….TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC.... 5’
5’ AGGTCG
GCTATC 5’
5’ AGGTCG
GCTATC 5’
AATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG.... 3’
AATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG.... 3’
3’ ….TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAA
3’ ….TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAA
5’ ….AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG.... 3’
3’ ….TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC.... 5’AATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG.... 3’5’ AGGTCG
GCTATC 5’3’ ….TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAA
PCR
DesnaturalizaciónUnión de oligosExtensión
DesnaturalizaciónUnión de oligosExtensión
1er ciclo
2ndo ciclo
2
La PCR según Mullis
Desnaturalización (100oC)
Unión cebadores
Polimerización (37oC)
Eritrocitos sanos Eritrocitos falciformes
IndividuosSanos
Glu
Individuoscon anemia
Val
Diagnóstico de un tipo de anemia falciforme
110 p.b. 110 p.b.
5’ …CGACTCCTGAG.... 3’3’ …GCTGAGGACTC.... 5’
DdeI
Sano5’ …CGACTCCTGTG.... 3’3’ …GCTGAGGACAC.... 5’
DdeI
Enfermo
DNA polimerasa termoestableThermus aquaticus: Taq polimerasa
Comparación entre Klenow yTaq polimerasaSaiki et al. Science. (1988) 239: 487
3
Termoestabilidad de la TaqN-terminal:13 Pro
Fragmento completo:• 17 nuevos aminoácidos - hidrófobos - aromáticos• 4 Lys 4 Arg
Interfase (hélices G,Q,R):• Asn524 Trp428• Asp819 Phe724• Arg858 Leu763• Arg909 Tyr811
NÚCLEO HIDROFÓBICO MAYOR EN TAQ
Actividad exonucleasa: unión de NMP aKlenow TaqHebra 2: Asp355 Phe309
Glu357 Desaparecido Thr358 Desaparecido
Hélice C: Asp424 Leu356Leu345Val307
Actividad correctora de pruebas (KlenTaq)
Pasos en la PCR
KLENOW
• Desnaturalización100oC
• Unión cebadores ypolimerización37oC
Taq POLIMERASA
• Desnaturalización95oC
• Unión cebadores(45-55oC) Tm
• Polimerización72oC
Elementos de la PCR
• DNA Molde• Cebadores (oligonucleótidos)• DNA polimerasa termoestable• Desoxinucleótidos trifosfatos• Tampón de reacción
• pH• Cationes divalentes• Cationes monovalentes
Optimización de la PCR
Rendimiento extracción DNA en tejidos humanos
Fuente de DNA
Cantidad de partida
Rendimiento
Sangre
30 µl
0.5 - 1 µg
Suspensionescelulares
5 105 células
2 - 5 µg
Células bucales
Lavado bucal
0.1 - 1 µg
Semen
30 µl
5 - 10 µg
Raíz de pelo
1 raíz
10 - 200 ng
Bloque de tejido
50 mg
0.1 - 10 µg
4
Diseño de cebadores
• LONGITUD: 18-25 nucleótidos complementarios
• COMPOSICIÓN: G+C entre 40% y 60%
• DIMERIZACIÓN: No deben unirse entre si
• CONCENTRACIÓN: 0.1-0.5 µM de cada cebador
Ta de fusión de oligonucleótidos (tm)
tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)
tm = 81.5 + 16.6 (log10[K+]) + 0.41 (%[G + C]) – (675/n)
T
T
% G + C
%
3’ AGGTCGAATTCGATGGTTT---------5’
TCCAGCTTAAGCTACCAAA5´ 3´
3’ ACGTCTAATACGATGGCTT---------5’
TCCAGCTTAAGCTACCAAA5´ 3´
tm = 52oC
tm = 36oC
Grado de homología y tm
• 100 % homología
• 75 % homología
Nuevas DNA polimerasas termoestables
0
2
4
6
8
10
12
14
0 10 20 30 40 50 60Número de ciclos
Lo
g d
e N
f
Nf = número final de moléculasNo = número inicial de moléculasY= eficiencian= no de ciclos
Eficiencia de la amplificación en la PCR
Log
Nf
Número de ciclos (n)
Nf = No (1+Y)n EjemploNf = 1012
No = 3 x 105 (1µg DNA)Y = 0,7n = 28.8
Otros componentes de la reacción
5
Optimización de la técnica
• ↓ No ciclos
• ↑ [molde]
• Cambiar polimerasa
Reducir el error↑ Fidelidad
• Cambiar cebadores
• ↑ T hibridación
• Cambiar [Mg2+]
• Cambiar polimerasa
Eliminar P no deseados↑ Especifidad
RecomendacionesRazón
• ↑ t extensión
• Cambiar polimerasa
• Cambiar [Mg2+]
• ↓ t desnaturalización
• ↑ [molde]
↓ errores↑ Fidelidad
• ↑ No ciclos
• ↑ [molde]
• ↓ T hibridación
• Cambiar polimerasa
• ↑ t extensión
↑ Moléculas↑ Rendimiento
RecomendacionesRazón
Aplicaciones• Clonaje de genes• Diagnóstico• Evolución molecular• Cuantificación de mRNAs• Secuenciación• Localización de AN in situ• Forense• Otras
Ventajas de la PCR en clonación
• A partir de RNA total y en un solo paso (RT-PCR) pueden obtenerse cDNAs específicos
• No es necesario el empleo de librerías paraobtener fragmentos genómicos definidos
Alineamiento de pectin esterasas
FP1
FP2
RP2 RP1
6
1a PCR
2a PCR
PCR anidado (Nested PCR)
FP1 FP2 RP1RP2
FP1+RP1
FP2+RP2
FP2 RP1
Deteccion de mutaciones: SSCP
...CAA...
...GTT...
N-Ras Normal (A)
P32
P32
...CTTA...
...GAAT...
N-Ras Mutado (B)
P32
P32
...CAA... ...GTT... ...CTTA... ...GAAT...
Desnaturalización
CAA
GTT
CTA
GAT
(A) (A/B) (B)
Evolución molecular. DNA shuffling
1
2
3
4DNAsa I
PCR sin oligos
PCR con oligos
Mutaciones útiles Mutaciones nuevas
Posición TEM-1 (MIC 0.02)
ST-1 (MIC 320)
ST-2 (MIC 640)
ST-4 (MIC 10)
14 A V A A 42 A A G A 92 G G S G 104 E K K K 182 M T T T 238 G S S S 241 R R H R
DNA shuffling: β-lactamasa
• TEM-1: β-lactamasa• ST-1: descendiente de TEM-1 tras 3 ciclos de
mutagénesis/recombinación/selección• ST-2: descendiente de ST-1 por retrocruzamientos• ST-4: construcción diseñada resultante
[Cefotoxima] (µg/mL)0.02 320 640 10
Posición ST-1 ST-2 ST-4TEM-1