Koncept vrste

Pri rastlinah in živalih je vrsta definirana kot populacija osebkov, ki se med

seboj lahko križajo in imajo plodno potomstvo.

Pri mikroorganizmih, ki so haploidni organizmi in se lahko razmnožujejo

nespolno, koncept fertilnega potomstva ni uporaben.

Moderni koncept vrste temelji na genetskih razlikah. Pripadniki iste vrste so

tisti osebki, ki imajo 16S ali 18S rRNA sekvenco > 97 % podobno.

Taksonomija : filogenija

Taksonomija je klasificiranje in poimenovanje objektov. V mikrobiologiji

je taksonomija tradicionalno vezana na fenotispko analizo (npr. oblika,

molekulska sestava).

Filogenija je uvrščanje bioloških vrst v sistematske enote, ki so

zasnovane na sorodstvenih odnosih med vrstami. Filogenija v

mikrobiologiji je vezana na genetsko analizo.

nastanek zemlje

kemijska evolucija

era dinozavrov

milijarda let

- 4

0

-3

- 2

- 1

bakterijearheje evkarionti

moderni evkarionti

višji organizmi

kambrijska eksplozija

10

20

oksigena fotosinteza

endosimbioza

kisik (%)

1ozonski plašč

Evolucijski kronometer

Uporabni kronometri:

• citokromi

• železo-žveplovi proteini

• ribosomalna RNA

• ATPaza

• RecA

Kaj zahtevamo od dobrega kronometra:

• univerzalno zastopan

• funkcionalno homologen pri različnih

organizmih

• možnost naleganja sekvenc (primerjava

homolognih in heterolognih sekvenc)

• spremembe kronometra morajo odražati

evolucijsko oddaljenost

Sestava bakterijskega ribosoma

50S

30S

16S rRNA

23S rRNA + 5S rRNA

23S rRNA ~ 2900 nukleotidov

5S rRNA ~ 120 nukleotidov

16S rRNA ~ 1500 nukleotidov

Bakterijski ribosom

proteini

rRNA

30S50S

16S rRNA

Določanje 16S rRNA sekvence

mikroorganizem

izolirana DNA

16S rRNA gen

PCRpomnoževanje

DNA

Sekvenciranje 16S rRNAPCR pomnožka

Nastanek filogenetskega drevesa

1

2

3

ACGUUCGACU1

CCGUUCGUCU

E12 = 0.2

Evolucijska razdalja

2

UCGAUGGCCU

E23 = 0.4

E31 = 0.43

Primer evolucijskega drevesa: arheje

Karakteristične rRNA sekvence

Karakteristične sekvence so krajše 16S rRNA sekvence značilne za

skupino organizmov (npr. arheje, bakterije in evkarionte) oziroma

posamezne vrste mikroorganizmov znotraj skupine

karakteristična pozicija na 16S rRNA arheje bakterije evkarionti sekvenca (%) (%) (%)

AAACUCAAA 910 3 100 0

AAACUUAAAG 910 100 0 100

CUCCUG 1390 > 95 0 0

UCACACCG 1400 0 > 99 100

CCACACCG 1400 100 0 0

Bakterije

• enocelične

•praktično vse imajo celično steno iz peptidoglikana

• maščobne kisline vezane z esterskimi vezmi na glicerol, nimajo sterolov

• imajo eno vrsto RNA polimeraze, ki je sestavljena iz 4 polipeptidov

• protein se vedno začne z formilmetioninom

• imajo en kromosom

• nimajo organelov

Arheje

• enocelične

• celične stene iz pseudopeptidoglikana

• maščobne kisline vezane z eterskimi vezmi na glicerol, nimajo sterolov

• ieno vrsto RNA polimeraze, sestavljena iz 8 do 10 polipeptidov

• protein se vedno začne z metioninom

• imajo en kromosom

• nimajo organelov

Evkarionti

• enocelične in večcelične

• v koliko imajo celično steno je iz hitina ali celuloze

• maščobne kisline vezane z esterskimi vezmi na glicerol, imajo sterole

• 3 različne RNA polimeraze, podobna arhejski RNA polimerazi

• protein se vedno začne z metioninom

• imajo več kromosomov

• imajo organele

Tradicionalna identifikacija I

- morfologija

- barvanje po Gramu

- prehranske zahteve (npr. fototrof, kemoorganotrof, kemolitotrof)

- kemijska sestava celične stene

- kemijska sestava membran

- prisotnost vključkov in rezervnih snovi

- kemijska sestava kapsule

- pigmenti

- izraba različnih vrst ogljikovih, dušikovih in žveplovih spojin

- fermentacijski produkti

Tradicionalna identifikacija II

- poraba plinov (npr. O2, CH4, N2, H2S, H2, CO2, CO)

- zahteve glede temperature

- zahteve glede vodne aktivnosti

- zahteve glede pH

- občutljivost na antibiotike

- patogenost

- simbiontska razmerja

- imunološke karakteristike

- habitat

Molekularna identifikacija

• sekvenciranje DNA

• GC deleži

• hibridizacije DNA

• DNA polimorfizem

• PCR verižna reakcija s polimerazo

• FAME (fatty acid methyl ester)

• imunološke metode za identifikacijo

• metabolna identifikacija

Molekularna identifikacija: izolacija DNA

celična suspenzija DNA v raztopini

celice liziramo

odstranimocelični debri

centrifugiramo

DNA je v etanolu

dodamo etanol in kloroform

dodamo fenol

odstranimo proteine

Molekularna identifikacija: sekvenciranje DNA

C G A C T C G A T T C

G C T G

3’

5’

5’

3’

DNA, ki jo sekvenciramo

radioaktivno označen začetnik

-AG-AGCTAAG

-A-AGCTA-AGCTAA

-AGCT -AGCddGTP ddATP ddTTP ddCTP

7654321

G A T C

avtomatsko sekvenciranje s fluorescenčno označenimi dideoksi nukleotidi

Molekularna identifikacija: DNA polimorfizem

DNA različnost (polimorfizem) lahko pokažemo na več načinov:

• s kromosomsko DNA hibridizacijo

• z restrikcijsko analizo

• SNP (single nucleotide polymorphism)

• PCR

Molekularna identifikacija - hibridizacija DNA

vrsta A vrsta B vrsta C

T T T C C G A AA G C A A T G C T C G T T A C G

A G T T T C A AT C

GT T A C G

tarčna DNA in neznana DNA sta delno homologni in zato delno hibridizirata.

T C G T T A C G

tarčna DNA in neznanaDNA sta nehomologni in ne hibridizirata.

tarčna DNA in označena neznana DNA sta homologni in zato dobro hibridizirata.

Molekularna identifikacija - FISH z ribosomsko tarčo

mikroskopija

Vezava označene probe naribosome tarčnega organizma

A T T C G A C

Molekularna identifikacija - restrikcijska analiza

vrsta A vrsta BDNADNA

Restrikcijsko analizo lahko naredimo za celoten genom (RFLP

makrorestrikcijska analiza) ali pa za izbrani gen (npr. ribotipizacija).

Predhodno lahko željeni del DNA namnožimo s PCR in tako dobimo

AFLP profil.

PCR - polymerase chain reaction

Kvantitativni real-time PCR

3’5’

5’3’

R Q

3’5’

5’3’

3’5’

5’3’

3’5’

5’3’

polimerizacija

RQ

ločevanje fluorescenčne probe

QRpolimerizacija končana

QRcepitev fluorescenčne probe

S cepitvijo fluorescenčne

probe se sprosti quenching

fluorofora, kar omogoča

povečan kvantni prinos

fluorescence.

Molekularna identifikacija - FAME (Fatty Acid Methyl Esters)

V celicah je veliko različnih lipidov (> 100), ki so zastopani v različnih deležih

Za analizo lipide izoliramo, modificiramo do metilnih estrov, analiziramo s

plinsko kromatografijo. Kromatogrami lipidnih profilov dajejo značilne

vzorece, ki jih med seboj primerjamo.

Pri analizi uvrstimo lipide v več skupin:

- nasičene maščobne kisline

- nenasičene maščobne kisline

- ciklopropanske maščobne kisline

- razvejane maščobne kisline

- hidroksilne maščobne kisline

Imunološke metode za identifikacijo

Uporabljamo označeno protitelo, ki ga vežemo na mikrobni antigen. Specifično

vezavo protitelesa na antigen določimo z:

• imunofluorescenco

• radioimunskimi testi (RIA - radioimumunoassay)

• encimsko imunsko reakcijo (ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

• encimsko reakcijo kombinirano s fluorescenco (ELFA - Enzyme Linked

Fluorescence Assay)

• aglutinacijo

• imunomagnetnim ločevanjem (IMS - Immuno Magnetic Separation)

ELISA

Metabolna identifikacija

Uporaba metabolnega profila mikroorganizmov, ki temelji na uporabi

substratov, respiraciji ali fermentaciji:

• biolog

• kristal ID

• API

• mikro ID

Viri za taksonomijo in filogenijo bakterij

• Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology

Temelji na standardnih in molekularnih taksonomskih kriterijih in

zajema vse znane prokarionte, vsebuje veliko dihotomnih

klasifikacijskih ključev in drugih informacij, ki so koristne za

identifikacijo.

• The Prokaryotes

Temelji na filogeniji, vendar ima tudi klasično taksonomijo.