Biomater. Res. (2013) 17(4) : 187-193

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Biomaterials

Research

C The Korean Society for Biomaterials

산화비소가 내포된 표적지향형 겔-리피드 나노캡슐의 제조 및

암세포 증식 억제 효율 분석

Targeted Gel-Lipid Nanocapsule for Intracellular Delivery ofAnticancer Arsenic Trioxide

이상민*

Sang-Min Lee*

가톨릭대학교 화학과

Department of Chemistry, The Catholic University of Korea, 43 Jibong-ro, Wonmi-gu, Bucheon-si, Gyeonggi-do 420-743, Korea(Received October 11, 2013 / Revised November 14, 2013 / Accepted November 15, 2013)

Nanoscale drug delivery platforms have been demonstrated to exhibit the high therapeutic potential for cancer treat-ments by reducing the toxic side effects often associated with conventional small-molecule chemotherapy. However,limited successes have been achieved due to the lack of both targeting ability to particular cancer cells and specifictriggers that can release the encapsulated drug under predefined condition. This article reports the formation of nanos-cale gel-lipid capsule (GLC) for the delivery of arsenic trioxide anticancer agent. On the platform, the surface-anchoredpolymer chains form the cross-linked gel networks with alkyne-modified telechelic bis(oxyethylene)diamine linkers,which can trigger the release of encapsulated drug under acidic condition. The alkyne functionality also allows for theligation of azide-modified folic acid as a targeting ligand via highly specific CuI-catalyzed [2+3] cycloaddition. Theresulting folate-conjugated platform showed enhanced drug efficacy through folate receptor-mediated endocytosis pro-cess in KB nasopharyngeal cancer cells. With both targeting capability and acid-triggered drug-release property, GLCsconstitute a versatile delivery platform for anticancer agents.

Key words: nanoparticle, targeted therapy, anticancer agents, triggered release

서 론

물 전달 물질은 질병이 있는 세포 조직에 약물을 선택

적으로 전달 및 방출하는 물질로써, 약물의 대사/분해 및

신장에 의한 여과 작용을 방지하여 약물의 생물학적 반감기를

높이고 정상 세포 조직에 대한 부작용을 낮춤으로써 암과 같

은 난치성 질환의 치료 효율을 높이는 기능을 수행한다.1) 특히

수십 나노미터 크기의 약물 전달체 입자는 암세포 조직에 형

성된 혈관 내피 세포의 증가된 투과성으로 인하여 암세포 조

직에 더욱 용이하게 흡수되어(Enhanced Permeability and

Retention, EPR) 질병 조직에 대한 높은 선택성을 보임에 따

라 최근 더욱 주목 받고 있다.2) 대표적인 약물 전달 물질로서

인지질 이중막으로 구성된 리포좀은 표면에 생체 친화성 고분

자인 Poly(Ethylene Glycol)의 접합을 통하여 옵소닌 작용을 피

하고 혈중 순환 시간을 증가시킴으로써 항암 치료제가 암세포

조직에 도달할 수 있는 확률을 높이는 역할을 수행한다.3) 이와

같은 특성을 지닌 스텔스 리포좀은(Stealth Liposome)4) 내부에

항암 치료제인 독소루비신과 같은 친양쪽성(amphiphilic) 분자

를 안정적으로 내포할 수 있으며5) 이러한 구조를 바탕으로 형

성된 DOXILTM (Janssen Products, LP)은 1995년 상용화되어

난소암과 AIDS-관련된 카포시 육종(kaposi's sarcoma) 등의 임

상 치료에 사용되고 있다.6) 그러나 이러한 PEG을 이용한 스텔

스 리포좀 기술은 cisplatin과 같은 다른 구조의 항암 치료제에

적용하였을 때 치료제의 혈중 반감기는 증가된 반면, 급격히

감소된 치료 효율로 인하여 비소세포 폐암(non-small cell lung

cancer) 및 두경부 편평세포암(squamous cancer of head

and neck)에 대한 임상 실험이 중단되었다.7,8) 이러한 문제점

은 스텔스 리포좀에서 관찰된 매우 낮은 약물 방출 효율에서

기인된 것으로 판명되어9) 오늘날 약물 전달 물질에 있어서 효

과적인 약물 방출 시스템의 중요성이 다시 강조되고 있다.10)

최근 또 하나의 항암 치료제로써 산화비소(arsenic trioxide,

As2O3)의 생화학적 항암 작용이 새롭게 발표되었다.11,12) 산화

비소는 2000년에 상용화되어(TrisenoxTM; Teva Pharmaceutical

Industries Ltd.) 암세포 조직의 신생 혈관 생성을 억제하고

(anti-angiogenesis) 암세포의 자발적인 세포사멸(apoptosis)을 유

도하여 현재 급성-전골수구-백혈병(acute promyelocytic leukemia,

APL)에 대한 효과적인 치료제로 사용되고 있다.11) 이러한 산화

비소의 항암 작용은 전립선 및 난소의 암세포 조직에도 효과*책임연락저자: smlee120@catholic.ac.kr

약

188 이상민

Biomaterials Research 2013

적인 세포 독성을 나타내어12) 그 이용 범위가 더욱 확장되고

있으나 그에 따른 말초신경염(peripheral neuropathy), 간부전

(liver failure) 및 심장독성(cardiac toxicity)과 같은 부작용 또

한 함께 보고되고 있다.13) 이러한 점을 개선하기 위하여 산화

비소의 제형을 나노입자의 형태로 바꿈으로써 암세포 조직의

EPR 효과를 이용하여 치료 효과를 높이기 위한 연구가 진행되

고 있다.14,15) 특히 친양쪽성(amphipathic) 성질을 지닌 단분자

형태의 산화비소는 쉽게 인지질 막을 투과하여, 리피드 입자

내부에 함유되어 있는 고농도의 2가 금속 양이온(MII)과 난용

성 착화합물(MIIHAsO3)을 형성할 수 있어서 이를 통하여 산화

비소 착화합물이 안정적으로 담지된 리피드 나노입자의 합성이

가능하다.16)

이에 본 연구에서는 산화비소를 담지한 리피드 나노입자의

표면에 고분자를 가교하여 얻은 나노 크기의 겔-리피드 캡슐

(Gel-Lipid Capsule, GLC)을 약물 전달체로 이용하여 증가된

약물 방출 효과 및 암세포에 대한 세포 증식 억제 작용을 관

찰하였다. GLC 입자의 표면에 형성된 고분자 겔 네트워크는

약산성 환경에서 고분자의 구조 변화로 인한 수축 현상이 발

생하여 내부 인지질 막의 정돈된 구조를 교란함으로써 이를 통

한 증가된 약물 방출 효과를 확인하였다. 또한 고분자 네트워

크에 존재하는 alkyne 작용기를 통하여 암세포-표적-지향성 리

간드로 잘 알려진 folic acid17) (FA)의 접합이 가능하여 대상

수용체인 folate receptor (FR)를 과발현하는 암세포에서 더욱

효과적인 세포 증식 억제 효과가 관찰되었다. 이러한 특성을

바탕으로 산화비소가 담지된 약물 전달체로써 FA 접합된 표적

지향적 GLC (f-GLC) 입자의 특성 및 효과를 고찰하고자 한다.

재료 및 방법

시약 및 재료

1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)와 1,2-

dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)] (sodium salt)

(DOPG)는 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA)에서 구매

하였다. 고체상 합성을 위한 O-bis-(aminoethyl)ethylene glycol

trityl resin과 O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium

hexafluorophosphate (HBTU)는 EMD Biosciences (San Diego,

CA, USA)에서 구매하였다. 그 외 Folic Acid와 As2O3를 포함

한 모든 시약은 Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI,

USA)에서 구매하였다. Tert-butyl acrylate은 질소 분위기에서

CaH2와 함께 교반한 후, 감압 증류법으로 정제하였으며, 그

외 모든 시약은 연구용 등급으로 추가 정제 없이 사용하였다.

Cholesterol-말단 치환된 poly(acrylic acid)와 azido-PEG-folate

는 기존 연구에서 소개된 방법을 이용하여 합성하였다.17,18)

Alkyne-치환된(ethylene glycol)-diamine linker는 CS-Bio CS136

peptide synthesizer (Menlo Park, CA, USA)를 이용한 고체

상 합성법으로 합성하였다.

약제가 포함된 f-GLC의 합성 및 분석

니켈-산화비소가 포함된 lipid particle은 기존 연구에서 소개

된 방법을 이용하여 합성하였다.16) 간단히 기술하면, DPPC

(108.29 µmol), DOPG (6.91 µmol), cholesterol (76.8 µmol)

이 용해된 chloroform 5 mL를 감압하여 용매를 제거한 후, 이

를 300 mM [Ni(CH3COO)2] 수용액 5 mL에 분산시켜 multi-

lamellar vesicle을 형성한다. 이를 50oC에서 LIPEX extruder

(Northern Lipids Inc., Burnaby, BC, Canada)를 사용하여

90 nm 크기의 unilamellar vesicle로 재형성한 후, Sephadex

G-50 (50 mL) 겔여과-크로마토그래피(gel filtration chromato-

graphy, GFC)를 이용하여 입자 외부에 남아 있는 과량의

[Ni(CH3COO)2]를 제거한다. 이러한 입자 용액에 5 mL의 산화

비소(As2O3)를 첨가한 후 50oC에서 3 시간 동안 교반하여

NiIIHAsO3 약제가 포함된 lipid particle을 얻는다.

약제가 포함된 Gel-lipid capsule (GLC) 입자는 기존 연구

에서 소개된 방법을 응용하여 합성하였다.17) 간단히 기술하면,

NiIIHAsO3 약제가 포함된 lipid particle 용액에 10 mol%의

Cholesterol-말단 치환된 poly(acrylic acid) (Mn = 3.7 kDa)를

첨가한 후, 37oC에서 24 시간 교반한다. 그 후, lipid 입자의

표면에 고정된 poly(acrylic acid) 사슬을 1-(3-dimethylamino-

propyl)-3-ethylcarbodiimide methiodide (EDC·MeI)를 이용하

여 alkyne-치환된(ethylene glycol)-diamine linker로 교차결합

하여 GLC 입자를 합성한다. 얻어진 GLC 입자는 Sephadex

G-50 GFC 컬럼으로 세척한 후, 다음에 기술된 방법을 통하여

folic acid (FA) 표적 리간드를 장착한다(Figure 1A).

FA 표적 리간드는 GLC 입자 표면의 alkyne 작용기에

azido-PEG-folate가 CuI-촉매된 [2+3] cycloaddition 반응

(‘click chemistry’)을 통하여 접합되었다(Figure 1A).18) 간략히

서술하면, GLC가 포함된 용액(1 mL, 2.5 mM)에 azido-PEG

folate ligand (lipid에 대하여 1 mol%), CuSO4·5H2O (2 mM),

그리고 sodium ascorbate (8 µmol)을 첨가한 후 상온에서 12

시간 교반한다. 얻어진 f-GLC 입자는 Sephadex G-50 GFC

컬럼으로 세척한다.

f-GLC 입자의 약물 방출 속도 분석

f-GLC 입자 용액(1 mM, 2 mL)을 투석막 튜브(MWCO 10

kDa, Spectrum Laboratories, Inc., USA)에 넣은 후, 20 mM

acetate (pH 4.0, 150 mM NaCl), MES (pH 5.5, 150 mM

NaCl), 또는 HEPES (pH 7.4, 150 mM NaCl) 완충용액에서

투석한다. 투석은 37oC에서 진행하며, 투석막 튜브 내부에 남

아 있는 f-GLC 입자 용액을 시간 별로 채취하여, 입자 내부에

존재하는 NiII/P과 AsIII/P 몰 비율의 시간에 따른 변화율을

inductively coupled plasma-optical emission spectrometer

(ICP-OES)를 통하여 관찰하였다. 생리 활성적인 수용액 상에서

존재하는 AsIII 이온은 주로 아비산(arsenous acid, H3AsO3)의

형태로 존재하므로16) 본 실험에서 ICP-OES를 통하여 관찰된

비소 원소는 아비산으로 간주하였다.

산화비소가 내포된 표적지향형 겔-리피드 나노캡슐의 제조 및 암세포 증식 억제 효율 분석 189

Vol. 17, No. 4

세포 배양

L-glutamine과 phenol red가 포함된 Folate-free Roswell

Park Memorial Institute (RPMI)-1640 세포 배양액과 EDTA가

포함된 trypsin (0.25%) 용액은 Invitrogen (San Diego, CA,

USA)에서 구매하였고, Penicillin-Streptomycin과 phosphate-

buffered saline (PBS, 1X without calcium and magnesium)

용액은 Mediatech (Manassas, VA, USA)에서 구매하였다.

Human epithelial nasopharyngeal carcinoma KB 세포는

10% (v/v) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)과 0.5%

(v/v) Penicillin-Streptomycin이 포함된 folate-free RPMI-1640

배양액을 사용하여 37oC, 5% CO2 환경에서 배양하였다.

공초점 레이저 주사 현미경(Confocal laser-scanning

microscope, CLSM) 분석

현미경 덮개유리(glass coverslip)를 넣은 12-well plate에 대

상 세포주를 25,000 cells/mL의 농도로 37oC, 5% CO2 조건

에서 24 시간 동안 배양하여 덮개유리에 세포를 부착한다. 그

후, 배양액을 calcein을 함유한 GLC, f-GLC, 혹은 f-GLC +

free FA (2 mM)를 포함한 배양액으로 교체하여 세포를 37oC,

5% CO2 조건에서 4 시간 동안 약제에 노출한 다음, PBS로

세척 후(4 × 2 mL), 4% paraformaldehyde 용액에 5 분간 넣

어 세포를 고정시킨다. CLSM 사진은 Carl Zeiss LSM 510

META 현미경을 이용하여 488 nm excitation 파장으로 관찰하

였다.

f-GLC를 통하여 세포에 유입된 산화비소의 정량 분석

KB 세포를 6-well plate에(500,000 cells/well) 담아 37oC,

5% CO2 조건에서 24 시간 동안 배양한다. 그 후, 배양액을

산화비소(10 µM)을 함유한 GLC, f-GLC, 혹은 f-GLC + free

FA (2 mM)를 포함한 배양액으로 교체하여 세포를 37oC, 5%

CO2 조건에서 4 시간 동안 약제에 노출한 다음, PBS로 세척

후 0.05% trypsin/EDTA로 세포를 탈착시켜 다시 PBS로 세척

한다. 원심분리로 얻은 세포 펠렛을 진한 질산으로 용해시킨 후

비소의 양을 inductively coupled plasma mass spectroscopy

(ICP-MS, X Series II, Thermo Electron)을 이용하여 측정하였

다. 세포의 수는 Guava Easy-Cyte Mini flow cytometer를

이용한 Guave ViaCount Assay (Merck Millipore, USA)를

통하여 측정하였다.19)

f-GLC에 함유된 산화비소 약리 활성 평가

세포 증식 억제 실험을 위하여 대상 세포주를 30,000~

60,000 cells/mL의 농도로 48-well plate (0.2 mL/well)에 담아

37oC, 5% CO2 조건에서 24 시간 동안 배양하여 세포를

seeding하였다. 그 후, 배양액을 GLC, f-GLC, 혹은 f-GLC +

free FA (2 mM)를 포함한 배양액으로 교체하여 세포를 37oC,

5% CO2 조건에서 2 시간 동안 약제에 노출한 다음, PBS로

세척 후 약제가 없는 배양액에서 46 시간 추가 배양하였다.

대상 세포에 대한 약물의 활성은 MTS 방법을 통하여 약제를

포함하지 않은 배양액에서 같은 시간 배양된 대조군과 비교하

Figure 1. (A) Schematic illustration of folate-targeted gel-lipid capsule (f-GLC). (B) Hydrodynamic diameter (DH) profile change of GLC before andafter the folate conjugation. Both f-GLC and non-targeted GLC show similar particle size distributions at pH 7.4 and 25oC. TEM images of (C)GLCs and (D) f-GLCs. Sample was negatively stained with 4% uranyl acetate.

190 이상민

Biomaterials Research 2013

여 상대적으로 평가하였다. 또한 세포주를 GLC가 포함된 배양

액에 48 시간 동안 지속적으로 배양한 후 동일한 방법으로 약

물 활성을 비교하였다.

결과 및 고찰

Lipid 입자의 표면에 고정된 poly(acrylic acid)의 가교반응을

통하여 형성된 GLC 입자는 동적광산란법(dynamic light

scattering, DLS) 분석을 통하여 관찰하였을 때, pH 7.4에서

112 ± 15 nm의 수력학적 직경(hydrodynamic diameter, DH)을

나타내어 같은 조건에서 87 ± 10 nm의 크기를 지닌 lipid 입

자에 비해 크기가 약 17% 증가하였다. 이러한 결과는 lipid

입자의 표면에서 가교화된 고분자 겔 층에 의해 입자 크기가

증가한 것으로, 선행 연구의 관찰 결과와 잘 일치하였다.17) 형

성된 GLC 입자의 겔 네트워크 표면에는 alkyne 작용기가 존

재하여(Figure 1A) CuI-촉매된 [2+3] cycloaddition 반응20)

(‘click chemistry’)을 통하여 azide로 변형된 folic acid (FA)

표적 리간드를 접합할 수 있었다. 효과적인 표적지향성을 위하

여 리피드에 대하여 1 mol% 미만의 FA 표적 리간드를 접합하

였으며21) 따라서 형성된 FA-표적지향성 GLC (f-GLC)는 DLS

관찰 결과, FA 접합 반응 전의 GLC와 유사한 크기를 나타내

었다(Figure 1B). 또한 투과전자현미경(TEM) 분석을 통하여

DLS 관찰 결과와 매우 유사한 크기의 GLC 및 f-GLC 입자

모형을 가시적으로 확인할 수 있었으며(Figures 1C and 1D),

lipid 입자에서는 관찰되지 않던 표면 층이 GLC 및 f-GLC 입

자에서 관찰되어 lipid 입자의 표면에 가교화된 고분자 겔 네

트워크가 캡슐 형태로 형성되었음을 확인할 수 있었다.

Figure 1A에서 나타낸 화학적 구조에서 보이는 바와 같이,

f-GLC 입자의 표면에 위치한 고분자 겔 층에는 가교반응에 참

여하지 않고 남아 있는 carboxylic acid 작용기가 존재하기 때

문에 용액의 pH에 따라 고분자의 수소화/탈수소화 반응이 작

용하며, 이에 따른 수용액 용매와의 친화성 변화에 의해 팽윤

/수축 작용이 발생한다.22,23) 이러한 특성은 낮은 pH 조건에서

시간에 따른 DLS 분석을 통하여 확인할 수 있었다. Figure

2A의 결과와 같이 37oC, pH 5.0 조건에서 GLC 입자는 표

면 겔 층의 수축 작용에 의해 크기가 97 ± 14 nm로 작아졌으

며, 동일 조건에서 시간이 경과함에 따라 89 ± 11 nm (1시

간), 74 ± 8 nm (4 시간)로 더욱 수축하는 현상을 보였다. 이

러한 약 산성 조건에서 관찰된 GLC 입자의 수축 현상은 약제

를 내포하고 있는 인지질막의 정렬된 구조를 파괴함으로써 약

물 방출을 촉진할 수 있으며24) 이에 따라 약 산성 조건을 지

니는 고형종양에 대한 f-GLC 입자의 선택적인 약물 전달 및

방출을 통한 효과적인 항암치료를 기대할 수 있다.25)

f-GLC 입자 내부에 형성되어 있는 난용성 NiIIHAsO3 착화

합물은 산성 조건에서 NiII 양이온과 아비산(arsenous acid,

H3AsO3)으로 해리되어 수용액 상에서 증가된 용해도를 보이므

로, 앞서 관찰된 f-GLC 입자의 수축 작용과 함께 산성 조건에

서 우수한 약물 방출 효과를 기대할 수 있다. 이를 위하여 f-

GLC 입자 내부에 포함되어 있는 산화비소 및 니켈의 pH에

따른 방출 효과를 37oC에서 분석하였다. 우선 pH 7.4에서 매

우 낮은 방출 효율(< 20%)을 보이던 f-GLC 입자는 pH가 낮

아짐에 따라 산화비소 및 니켈의 증가된 방출량을 보였으며,

24 시간 후 pH 5.5 와 4.0에서 산화비소의 경우 각각 2.15

및 5.22 배, 그리고 니켈의 경우 7.91 및 21.6 배 향상된

약물 방출 효율을 보여(Figure 2B) 산성 조건에서 더욱 향상된

약물 방출 성질을 나타내었다. 니켈은 세포 내 아스코르브산과

glutathione을 소모하여 그 활성을 낮추기 때문에26) 항암 작용

을 나타내는 산화비소와 함께 사용되는 경우, 세포사멸을 촉진

하는 것으로 관찰되어 산화비소와 니켈의 높은 방출 효율은 항

암 약리 활성을 더욱 높일 것으로 판단된다.

f-GLC 입자의 겔 층 표면에 부착되어 있는 folic acid (FA)

의 표적 리간드 작용을 알아 보기 위하여 folate receptor

(FR)를 과발현하는 KB 비인두암종 세포주를 대상으로 공초점

레이저 주사 현미경(Confocal Laser Scanning Microscope)

분석을 실시하였다.27) 이를 위하여 고농도에서 자가형광억제 현

상을 나타내는 calcein 형광색소를 내부에 담지한 f-GLC 및

Figure 2. (A) Time-dependent hydrodynamic diameter (DH) change of f-GLCs as measured by dynamic light scattering (DLS) after the incubationat pH 5.0 and 37oC. The initial mean DH of f-GLCs (97 ± 14 nm) decreases to 89 ± 11 nm and 74 ± 8 nm after 1 h and 4 h incubation, respec-tively. (B) Cumulative amount of cargos released from f-GLCs at various pHs after 24 h incubation at 37oC.

산화비소가 내포된 표적지향형 겔-리피드 나노캡슐의 제조 및 암세포 증식 억제 효율 분석 191

Vol. 17, No. 4

GLC 입자를 합성하여 실험에 이용하였다. 고농도로 담지된

calcein 형광 색소는 GLC 입자 내부에서는 형광이 억제되는

반면 세포 내부의 endosome과 같은 산성 환경에서는 GLC의

향상된 방출 효과에 의해 calcein 형광색소가 방출되고 형광이

회복되어 현미경을 통하여 검출 가능해진다.17)

KB 세포주를 calcein을 함유한 f-GLC, 2 mM의 FA 자유

리간드를 포함한 f-GLC 대조군, 그리고 FA 표적 리간드가 부

착되지 않은 GLC 대조군을 포함한 배양액에서 4 시간 동안

배양한 후 공초점 레이저 주사 현미경으로 calcein의 형광 방

출 파장(514 nm)을 관찰하였다. FA 표적 리간드가 부착되지

않은 GLC (Figure 3C) 대조군 보다 f-GLC (Figure 3A)를 포

함한 배양액에서 더욱 높은 세포 내 형광이 관찰되어 FR를 매

개로 한 세포 내 유입작용을 통하여 더 많은 양의 f-GLC 입

자가 세포 내부로 섭취되었음을 알 수 있었다. 이러한 세포 내

유입작용은 f-GLC와 FA 자유 리간드가 함께 존재하는 대조군

의 경우, 자유 리간드의 경쟁 작용에 따라 세포 내부로 섭취되

는 양이 급격히 감소하였다(Figure 3B). 이러한 결과는 FA 표

적 리간드를 부착한 리포좀의 공초점 레이저 주사 현미경 분

석 결과를 보고한 선행 연구와 일치하였으며,28) 이를 통하여 f-

GLC를 이용한 향상된 세포 내 약물 전달 효율을 관찰할 수

있다.

FR를 매개로한 세포 내 유입작용을 통하여 섭취된 실제 약

물의 양을 측정하기 위하여 FR를 과발현하는 KB 세포를 산화

비소 약제가 담지된 f-GLC, 2 mM의 FA 자유 리간드를 포함

한 f-GLC 대조군, 그리고 FA 표적 리간드가 부착되지 않은

GLC 대조군을 각각 포함한 배양액에서 4 시간 동안 배양한

후, 세포 내부에 유입된 산화비소의 양을 유도 결합 플라즈마

질량 분석기(ICP-MS)를 이용하여 관찰하였다. Figure 4A에서

보이는 바와 같이 f-GLC를 통하여 섭취된 산화비소의 양이 FA

표적 리간드가 부착되지 않은 GLC 대조군에 비해 약 5 배

증가하였다. 또한 f-GLC를 통하여 섭취된 산화비소의 양은 FA

자유 리간드가 배양액에 함께 존재하는 경우, 자유 리간드의

경쟁 작용에 따라 세포 내부로 섭취되는 양이 매우 감소하는

것이 관찰되었고 이는 공초점 레이저 주사 현미경 관찰 결과

와 매우 일치하였다. 이를 통하여 f-GLC의 표면에 장착된 FA

표적 리간드를 통한 향상된 약물 섭취를 확인하였다.

이와 같이 확인된 f-GLC의 향상된 약물 전달 효율성을 바탕

으로 세포 증식 억제를 위한 약물 활성 평가를 동일한 KB 세

포주를 이용하여 진행하였다. 우선 항암치료에 있어서의 생리

적 환경을 모사하기 위하여, 세포를 산화비소 약제가 담지된 f-

Figure 3. Confocal laser-scanning fluorescent microscopy images showing cellular uptake of f-GLCs. Images of FR-positive KB cells were obtainedafter 4 h exposure to f-GLCs (A) in folate-free medium or in the presence of free folic acid (2 mM, B), and non-targeted GLCs (C).

Figure 4. (A) Cellular AsIII uptake of folate-conjugated GLC (f-GLC), f-GLC in the presence of 2 mM free folic acid (FA), and non-targeted GLC. KBcells were incubated with each of the drug formulations at 37oC for 4 h before analyses. (B) Cytotoxicity profiles for drug-loaded GLC for-mulations against FR-positive tumor cells. KB human epithelial nasopharyngeal carcinoma cells were exposed to f-GLC (■), f-GLC with 2 mMfree FA (Control-I, ▲), and non-targeted GLC (Control-II, ●) for 2 h, followed by a 46 h post-incubation in drug-free media before MTS analyses.As a comparison, KB cells were continuously incubated with GLC for 48 h (Control-III, ◆).

192 이상민

Biomaterials Research 2013

GLC, 2 mM의 FA 자유 리간드를 포함한 f-GLC(대조군-I), 그

리고 FA 표적 리간드가 부착되지 않은 GLC(대조군-II)을 각각

포함하는 배양액에 2 시간 배양한 후, 약제가 포함되지 않은

배양액에서 46 시간 추가 배양하였다. 또한 추가적인 대조군

으로서 동일한 세포주를 FA 표적 리간드가 부착되지 않은

GLC(대조군-III)가 포함된 배양액에서 48 시간 동안 지속적으로

배양한 후 GLC 내부에 담지된 산화비소의 약물 활성을 MTS

에세이를 이용하여 관찰하였다.

우선 FA 표적 리간드가 부착되지 않은 GLC(대조군-II)의 경

우, 2 시간 동안 노출된 세포는 상대적으로 짧은 약물 노출

시간으로 인하여 크지 않은 세포 독성을 나타내었다(50%의 세

포에 대하여 독성을 나타내는 약물 농도인 IC50가 100 µM 이

상의 값을 보였다). 반면 세포가 동일한 GLC에 48 시간 지속

적으로 노출된 대조군-III의 경우 증가된 약물 노출 시간으로

인하여 향상된 세포 독성을 나타내었다(IC50 = 17.3 µM,

Figure 4B). 이러한 산화비소의 약물 활성은 FA 표적 리간드가

부착된 f-GLC의 경우 더욱 증가하였다. f-GLC에 2 시간 노출

된 세포의 경우 IC50값이 6.7 µM을 나타내어 FA 표적 리간드

가 부착되지 않은 GLC (48 h) 대조군-III에 비해서도 더욱 향

상된 약리 활성을 보였다.

f-GLC의 FA 표적 리간드에 의한 향상된 약리 활성은 FA

자유 리간드가 배양액에 함께 존재하는 경우, 자유 리간드의

경쟁 작용에 따라 세포 독성이 감소하였다. 대조군-I에서 볼 수

있는 바와 같이 FA 자유 리간드는 f-GLC의 IC50값을 100

µM 이상으로 증가시켜 f-GLC의 향상된 약리 활성이 실제로

FR를 매개로 한 세포 내 유입작용에 의한 결과임을 알 수 있

다. 이러한 결과는 앞서 관찰된 공초점 레이저 주사 현미경 실

험 및 산화비소 약제의 세포 유입량 관찰 결과와 매우 일치하

여 FA를 이용한 표적 지향형 치료제로서의 f-GLC의 높은 응

용성을 확인할 수 있었다.

결 론

본 연구에서는 산화비소를 내포한 lipid 주형 입자의 표면에

고분자 겔 네트워크를 지니고 있는 나노캡슐(GLC)의 암세포 증

식 억제 효율을 분석하였다. 합성된 GLC 입자는 고분자 겔

네트워크의 가역적인 팽윤/수축 작용에 의해 약산성 환경에서

니켈과 산화비소의 방출을 효과적으로 증가시켜 GLC 입자를

통한 항암치료제의 선택적인 방출이 가능함을 보였다. 또한 표

적 치료를 위하여 azide 변형된 엽산(FA)을 이용할 경우, CuI-

촉매된 [2+3] cycloaddition 반응(‘click chemistry’)을 통하여

GLC 입자의 표면에 FA 표적 리간드를 접합할 수 있었다. 이

와 같이 형성된 f-GLC를 통하여, 엽산 수용체를 발현하는 암

세포는 f-GLC에 내포된 산화비소 항암 치료제를 높은 효율로

섭취하게 되어 더욱 향상된 암세포 증식 억제 효과가 나타났

다. 이러한 연구 결과를 통하여 암세포의 생리적 환경에 따라

높은 약물 방출 효과를 보이는 기능성 겔 나노입자가 다양한

표적 치료제를 위한 플랫폼으로 활용될 것으로 기대된다.

감사의 글

본 논문은 2013년도 교육과학기술부의 재원으로 한국연구재

단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업(No. 2013R1A1A-

1012953) 및 2012년도 가톨릭대학교 교비연구비의 지원으로

작성되었으며 이에 감사 드립니다.

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