-
T細胞リンパ腫の治療を目指したHDAC8選択的阻害薬の創製
中部公立３大学 新技術説明会
2011年1月27日東京
鈴木 孝禎
名古屋市立大学大学院薬学研究科科学技術振興機構 さきがけ（兼任）
-
研究背景１ーヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC)ー
ヒストンのアセチル化されたリシン残基を脱アセチル化する反応を触媒し、がん抑制遺伝子をはじめ多くの遺伝子発現を制御。
HDAC には、11種類のアイソフォームがある。
HDAC8の詳細な機能は不明。
HDAC8がT細胞性腫瘍や神経芽細胞腫の増殖に関与。Leukemia.
2008, 22, 1026–1134.Clin. Cancer. Res.
2009, 15, 91–99.
HDAC8HDAC8選択的阻害薬選択的阻害薬1)HDAC8の機能を調べる生物学的ツール2)抗がん剤
-
研究背景２ー T細胞悪性リンパ腫ー
■ T細胞急性リンパ性白血病（T-ALL）・ 小児に多い。成人での発症率は10万人に1人。・ 発症原因は不明。・
成人T-ALLの長期生存率は30~40%。
■ 皮膚T細胞腫（CTCL）・ 年間10万人に1人がCTCLと診断。・
他の悪性リンパ腫に比べ、化学療法に対する反応性が乏しい。
■ 成人T細胞腫（ATLL）・ ヒトリンパ向性ウイルス1型（HTLV-1）によって引き起こされる。・
日本では120万人、世界では2,000万人のHTLV-1感染者。・
化学療法の寛解率は16~41%。生存期間中央値は3~13ヶ月。
予後は極めて不良
有効な治療薬が求められている
-
Click ChemistryCu(I)-catalyzed Azide Alkyne Cycloaddition
(CuAAC)
特徴特徴アジドとアルキンの反応特異性が高い。官能基や溶媒による影響を受けにくく、副生成物が生じない。室温条件下で定量的に反応が進行。銅に対するリガンドの添加で反応速度が飛躍的に向上。CuAACに用いる代表的なリガンドtris‐(benzyltriazolylmethyl)amine
(TBTA)
Cu(I)の配位子として働く。Cu(I)の酸化を防ぎ、CuAAC反応を加速する。
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2002
, 41, 2596–2599.
Org. Lett. 2004, 6, 2853–2855.
-
Alkyne, Azide-unitの分子設計
Drug Design
HN
NH
OH
O
O
vorinostat(Representative HDAC Inhibitor)
Zinc-Binding Group(ZBG)
Linker
Cap
HDAC8 Selective InhibitorCandidates
NN
NCap
ZBG
NH
OOH S
O
HN OH
NH
O
SO
HN
NH2
H2N
A1 A4
A5 A8
HN
OOH
HN
OOH
HN
O
HN
O
NH2 NH2
A2 A3
A6 A7
Alkyne-unit (A):8種類
N3N3
MeO
O
N3 N3 N3
B1: n=1 B4: n=4B2: n=2 B5: n=5B3: n=3
B6 B7: m-B8: p-
B9: m-B10: p-
B11: 1-B12: 2-
B13 B14 B15
N3N3
N3
n
Azide-unit (B):15種類
ZBG
NCap N NClick ChemistryCu(I)
-
CuAACによるTriazole Libraryの構築
CuSO4・5H2O, 10 mol%Sodium Ascorbate, 50 mol%
TBTA, 10 mol%DMSO/H2O, rt, 1-3 days
NH
OOH
SO
HN OH
NH
O
SO
HN
NH2
H2N
A1 A2
A5 A6
HN
OOH
HN
OOH
HN
O
HN
O
NH2 NH2
A3 A4
A7 A8
Alkyne-unit (A):8種類
N3N3
MeO
O
N3 N3 N3
B1: n=1 B4: n=4B2: n=2 B5: n=5B3: n=3
B6 B7: m-B8: p-
B9: m-B10: p-
B11: 1-B12: 2-
B13 B14 B15
N3N3
N3
n
Azide-unit (B):15種類
HDAC HDAC FluorometricFluorometric AssayAssay
TLC & LCMS TLC & LCMS AnalysisAnalysis
No Isolation & Purification
-
DEVELOPER
360 nm 460 nm
Fluorophore NH
CH3Fluorophore NH3+ + -O CH3
OO
Detect!!
HDAC阻害活性評価法
HDAC Activity Assay / Drug Discovery Kit , Fluorescent AK-500
(BIOMOLTM)
⎛ ⎞⎜ ⎟⎝ ⎠Sampleの蛍光強度 - Blankの蛍光強度
HDAC阻害活性（％）＝ 1- 100Controlの蛍光強度-Blankの蛍光強度
x
HDACによって脱アセチル化された基質からでる蛍光を検出することで、ＨＤＡＣの活性を測定することができる。
HDAC
-
0
20
40
60
80
100
120
PC
I-340
51
C10
C20
C30
C40
C50
C60
C70
C80
C90
C10
0
C11
0
C12
0
Enz
yme
Act
ivity
(%)
0.3 μM
HDAC8阻害活性評価 (1)
-
0
20
40
60
80
100
120P
CI-3
4051
C10
C20
C30
C40
C50
C60
C70
C80
C90
C10
0
C11
0
C12
0
Enz
yme
Act
ivity
(%)
0.3 μM
HDACs阻害活性評価 (1)
No Inhibition
-
トリアゾールC31, C32の合成
-
HDAC阻害活性評価 (2)
HDACs class IIa class IIb(nuclear extract) HDAC1 HDAC2 HDAC8
HDAC4 HDAC6
vorinostat
0.17 0.27 0.78 1.5 >10 0.21
PCI-34051
>100 >100 >100 0.31 >100 9.3
C31
37 41 65 0.35 30 7.9
C32
23 >100 76 0.18 >100 5.2
Compound class IIC50(μM)
a
aValues are means of at least three experiments.
-
HDAC8阻害剤によるコヒーシンのアセチル化
Control
PCI-34058
Ac H3K9
(2 M) (50 M)(10 M)
C31 C32
(2 M) (50 M)(10 M) (2 M) (50 M)(10 M) (2 M) (50 M)(10 M)
vorinostat
AcSMC3
SMC3
-
癌細胞増殖抑制試験
PCI-34051 C31 C32Jurkat 11 11 11
MOLT4F 79 68 95HH >100 42 79
Hut78 25 56 81MT2 15 10 19MT4 25 31 30Rajii >100 >100
>100
Ramos 99 31 >100U266 >100 42 >100K562 >100 32
>100
Solid Tumor HeLa 70 87 70PB-O 97 >100 >100PB-N >100 82
>100
Healthy PB
GI50 (μM)aCell Line
T Cell
B Cell
aValues are means of at least three experiments.
C31, C32はT細胞性腫瘍選択的に抗腫瘍活性を示した。C31, C32は正常細胞 (PB-O, N)
には影響がみられない。
T細胞性腫瘍治療薬としての有効性が示された。
-
C32の結合様式
ヒドロキサム酸は亜鉛イオンに二座配位し、His142とTyr306と水素結合を形成している。
Phe152などにより構成されるHDAC8特有の疎水性の高いポケットにCap部位が配向。
ヒドロキサム酸の重要性ヒドロキサム酸の重要性
HDAC8HDAC8選択性に重要選択性に重要
MacroModel 8.1, Glide 3.5 (HDAC8, PDB: 1VKG)
-
HN
OOHN
N N
C32
HN
OOHN
N NR
Lead Optimization
Cap moiety C32 derivatives
N3RHN
OOH
Azide-unit (B)
Click ChemistryCu(I)
A2
N3X
N3R
B16: 2-MeB17: 3-MeB18: 4-MeB19: 2-OMeB20: 3-OMeB21: 4-OMeB22:
2-ClB23: 3-ClB24: 4-Cl
B25: 2-FB26: 3-FB27: 4-FB28: 2-CF3B29: 3-CF3B30: 4-CF3B31:
2-NO2B32: 3-NO2B33: 4-NO2
B34: 1-NaphtylB35: 2-NaphtylB36: 3-IndolylB37: 3-thienylB38:
2-pyridinyl
B39: 4-methylthiazolylB40: 4-morpholinylB41: cyclopentylB42:
cyclohexylB43: 1-adamantyl
RN3
B44: X=SCH2B45: X=COCH2B46: X=CHCH (trans)
Azide Design & Synthesis
C32のCap部位の最適化
-
0
20
40
60
80
100
C32
C12
1C
122
C12
3C
124
C12
5C
126
C12
7C
128
C12
9C
130
C13
1C
132
C13
3C
134
C13
5C
136
C13
7C
138
C13
9C
140
C14
1C
142
C14
3C
144
C14
5C
146
C14
7C
148
C14
9C
150
C15
1
Enz
yme
Act
ivity
(%)
0.3 μM
-
HDACs阻害活性評価 (2)
0
20
40
60
80
100 C
32C
121
C12
2C
123
C12
4C
125
C12
6C
127
C12
8C
129
C13
0C
131
C13
2C
133
C13
4C
135
C13
6C
137
C13
8C
139
C14
0C
141
C14
2C
143
C14
4C
145
C14
6C
147
C14
8C
149
C15
0C
151
Enz
yme
Act
ivity
(%)
0.3 μM
-
C32誘導体の合成
S N3
O
HN
OHNN
NX
mCPBA(1.0 or 2.0 eq)
CH2Cl2
A2CuSO4・5H2O
Sodium ascorbate
TBTAMeOH/H2O
B47: X=SO, 66%B48: X=SO2, 97%
C149: X=S, 94%C152: X=SO, 70%C153: X=SO2, 54%
X N3
A2, CuSO4・5H2O, Sodium ascorbate, TBTA, MeOH/H2O
B44
C142C142の合成の合成
C149C149およびその酸化体およびその酸化体C152, C153C152, C153の合成の合成
-
HDACs class IIa class IIb(nuclear extaract) HDAC1 HDAC2 HDAC8
HDAC4 HDAC6
C32
23 >100 76 0.18 >100 5.2
C142
44 >100 >100 0.10 >100 1.1
C149
54 38 >100 0.070 44 2.4
C152
>100 92 >100 0.10 86 2.4
C153
>100 88 >100 0.13 25 1.5
class IIC50(μM)a
Compound
HDAC阻害活性評価 (2)
aValues are means of at least three experiments.
-
HDAC8阻害剤の腫瘍細胞増殖阻害活性
PCI-34051GI50 (μM)
C32GI50 (μM)
C149GI50 (μM)
T-ALL Jurkat 10.6 11.4 7.6MOLT4F 79.4 95 53.8
T-cell lines CTCL HH >100 79 22.9Hut78 24.7 81.2 40.1
ATLL MT2 15.1 19 10.6MT4 24.8 30.1 15.4
Healthy PB 96.6 >100 >100
-
HDAC8選択的阻害薬まとめ
効率的に新規HDAC8選択的阻害薬を見出した。リード化合物探索におけるClick Chemistryの有用性を示した。
-
想定される用途
HDAC8の機能を調べるための生物試験用試薬。T細胞性腫瘍治療薬。神経芽細胞腫治療薬。
想定される業界・試薬市場規模：数千万円/年cf) TSA
(HDAC阻害薬）の市場規模：２千万円/年・製薬市場規模：数十億円/年
-
本技術に関する知的財産権
・発明の名称：ヒドロキサム酸誘導体及びそれを用いたHDAC8阻害剤
・出願番号 ：特願 2010–044283
・出願人 ：名古屋市立大学
・発明者 ：宮田直樹、鈴木孝禎、太田庸介、上田龍三、飯田真介、李政樹
-
お問い合わせ先
名古屋市立大学
学術課 林 泰司
片山 恵美子
ＴＥＬ ０５２－８５３ － ８０４１
ＦＡＸ ０５２－８４１ － ０２６１
e-mail kikaku2＠adm.nagoya-cu.ac.jp
