Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã

hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người Việt Nam

Lê Hồng Thu

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn ThS chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn: PGS. TS. Võ Thị Thương Lan

Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Tổng quan về G protein; họ tachykinin ở động vật có vú; thụ thể họ tachykinin

và thụ thể neurokinin-1; ứng dụng của thụ thể neurokinin-1 trong điều trị bệnh; vector

biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1. Trình bày nguyên liệu và phương pháp

nghiên cứu: Tách RNA tổng số; phản ứng phiên mã ngược; phản ứng PCR (Polymerase

Chain Reaction); Tinh sạch DAN bằng phương pháp thôi gel; nối ghép các đoạn DNA

vào vector; kỹ thuật biến nạp; sàng lọc khuẩn lạc; tách plasmid kĩ thuật cắt sử dụng

enzyme giới hạn; ký thuật điện di; phân tích trình tự cDnA của cDNA-NK1. Đưa ra kết

quả và thảo luận: Tách dòng gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ phổi người; thiết kế

vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.

Keywords: Sinh học thực nghiệm; Gen mã hóa; Người Việt Nam; Thụ thể

neurokinin-1; Cấu trúc protein

Content MỞ ĐẦU

Thụ thể neurokinin – 1 thuộc nhóm các thụ thể xuyên màng liên kết với G protein. Khi thụ thể

này tương tác với cấu tử gắn đặc hiệu SP sẽ dẫn truyền cảm giác đau đớn từ vùng thần kinh

ngoại vi về trung ương thần kinh, gây ra trạng thái lo âu và các triệu chứng giống trầm cảm, mặt

khác chúng cũng có tác dụng gây kích thích co cơ trơn và điều hòa các phản ứng miễn dịch của

cơ thể.

Trên cơ sở những nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của thụ thể neurokinin-1, các hãng dược

phẩm đã cố gắng tìm ra các chất đối vận với thụ thể neurokinin-1 nhằm sản xuất thuốc giảm đau

cho các bệnh nhân bị chứng đau nửa đầu, thuốc chống trầm cảm, thuốc chống nôn cho các bệnh

nhân ung thư, … Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu về thụ thể này ở người Việt Nam còn rất

ít hoặc chưa được công bố. Chính vì vậy, với mục đích phân lập được đoạn cDNA hoàn chỉnh

mã hóa cho thụ thể này ở người Việt Nam và biểu hiện chúng trên hệ thống tế bào động vật để có

thể chủ động được nguồn gen và các hệ thống sàng lọc thuốc từ nguồn dược liệu Việt Nam,

chúng tôi đã tiến hành đề tài “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể

neurokinin-1 ở ngườiViệt Nam”. Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh

học; Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme - Protein và

Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống,Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN

1.1.1. G protein

G protein lần đầu tiên được phát hiện và mô tả bởi Alfred và Martin khi hai ông nghiên cứu tác

động của adrenaline đối với tế bào. Với công trình này, hai ông đã giành giải Nobel lý sinh – y

học năm 1994 [4].

G protein định vị ở mặt trong màng tế bào và được hoạt hóa nhờ thụ thể liên kết với G protein

(GPCRs) phân bố trên bề mặt màng tế bào.

1.1.2. Thụ thể liên kết với G protein

Họ thụ thể liên kết với G protein là những phân tử protein kích thước nhỏ (350-500 acid amine)

[45], được phân thành các phân họ khác nhau dựa theo độ tương đồng về trình tự acid amine,

chức năng và khả năng liên kết với các cấu tử. Đến nay đã người ta đã phát hiện ra 367 thụ thể

liên kết với G protein ở người, trong đó có khoảng 150 GPCRs được tìm thấy vẫn chưa biết chức

năng [52].

1.2 HỌ TACHYKININ Ở ĐỘNG VẬT CÓ VÚ

Tachykinin là một trong những họ neuropeptide lớn nhất được tìm thấy trong cơ thể của tất cả

các loài động vật. Có hơn 40 loại tachykinin đã được phân lập từ các nhóm động vật không

xương và có xương sống [15, 45].

Trong họ tachykinin, chất P (SP) được mô tả lần đầu tiên năm 1931 bởi Euler và Gaddum

khi hai ông nghiên cứu dịch chiết não và ruột ngựa trong cồn. Dịch chiết này có tác dụng kích

thích hiệu quả hoạt động của ruột và gây giảm huyết áp ở thỏ [21]. Tuy nhiên, rất nhiều thí

nghiệm nhằm phân lập và tinh sạch SP có hoạt tính từ các mẫu ruột ngựa đã không thành công.

Bốn mươi năm sau đó (năm 1970), Chang và Leeman mới tinh sạch được SP từ vùng dưới đồi

của bò [14] và đến năm 1973, Studer và cộng sự đã phân lập, tinh sạch SP, đồng thời giải trình tự

gene mã hóa cho SP từ ruột ngựa [50]. Năm 1983, Kangawa và Kimura đã phân lập được thêm

hai tachykinin có hoạt tính dược học khác với SP là neurokinin A (NKA) và neurokinin B

(NKB) từ vùng thần kinh trung ương và ngoại vi [31, 33]. Hiện nay, tachykinin trong mô động

vật có vú đã được xác định gồm có chất P (hay SP), neurokinin A (hay neuromedin L hoặc chất

K) và neurokinin B (hay neuromedin K). Riêng NKA được mở rộng thêm 2 dạng là neuropeptide

K và neuropeptide γ

1.3 THỤ THỂ HỌ TACHYKININ VÀ THỤ THỂ NEUROKININ-1

1.3.1. Giới thiệu chung về thụ thể họ tachykinin

Thụ thể của họ tachykinin (TACR) thuộc lớp A trong họ thụ thể liên kết với G protein (Hình 1).

Tương tự như thụ thể rhodopsin, TACR có cấu trúc gồm 7 vùng xuyên màng đặc trưng được nối

với nhau bởi các vòng phía ngoài và phía trong màng sinh chất (exoloop và cytoloop). Những

vòng ở phía ngoài màng tế bào của thụ thể liên kết với G protein có chức năng lựa chọn cấu tử

gắn đặc hiệu trong khi các vùng xuyên màng có chức năng quyết định hoạt tính của thụ thể.

Người ta phân loại TACR dựa vào sự sai khác trong các trình tự này [45].

1.4 ỨNG DỤNG CỦA THỤ THỂ NEUROKININ-1 TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH

Từ những hiểu biết về chức năng của thụ thể neurokinin 1 hứa hẹn đây sẽ là đích tác động hiệu

quả cho các phương pháp điều trị một số căn bệnh có liên quan. Do đó cũng không có gì ngạc

nhiên khi nhiều hãng dược phẩm lớn tập trung nghiên cứu về thụ thể tachykinin nhằm tìm ra các

chất đối vận của chúng để ứng dụng trong điều trị bệnh: làm thuốc giảm đau, chống lo âu, trầm

cảm, chữa các bệnh đường hô hấp,… Sự phát hiện ra các chất đối vận với thụ thể NK1 cũng là

một mắt xích quan trọng trong việc thay đổi hướng điều trị trong việc ngăn ngừa chứng buồn nôn

và sự nôn mửa do tác dụng của hóa trị liệu ung thư. Tuy đến nay các nghiên cứu về chất đối vận

với thụ thể tachykinin vẫn chưa đạt được kết quả như mong đợi và gặp rất nhiều khó khăn,

nhưng việc sử dụng thụ thể NK1 làm đích tác động của thuốc vẫn là một bài tóan hay và khó cho

nhiều nhà nghiên cứu. Trong đó các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào những phân tử không có

bản chất peptide có khả năng thấm xuyên qua màng tế bào thần kinh. Trong tương lai, chất này

hứa hẹn sẽ cho phép điều trị bệnh liên quan tới chứng nghiện rượu [13], …

1.5 VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1

Gen mã hóa cho thụ thể liên kết với G protein được dung hợp vào nhiều hệ vector và

nhiều dòng tế bào khác nhau. Người ta đã thử biểu hiện chúng trên cả tế bào nhân sơ và cả trên tế

bào nhân thực. Tuy nhiên, do thụ thể liên kết với G protein thường được biến đổi sau dịch mã

bằng cách gắn thêm carbonhydrate hoặc lipid hóa… nên việc biểu hiện trên hệ thống tế bào nhân

sơ thường không cho kết quả như mong muốn.

Theo các nghiên cứu đã công bố, NK1 được biểu hiện trong vector pCDNA [24],

pMAM-neo [24; 28], pVLl393 [32], pAHygCMV1 [49]… ở các chủng tế bào HEK293, COS-7,

CHO, … đều cho kết quả khả quan. Một nghiên cứu gần đây năm 2006 của Farahdiba và cộng sự

khi nghiên cứu truyền tin của thụ thể β-arrestin 1 đã tiến hành dung hợp gen mã hóa cho thụ thể

này với gen mã hóa cho NK1 và biểu hiện chúng trong hai hệ vector pCDNA3.1 và pEGFP-N1

cũng cho kết quả tốt. Đây là tiền đề cho chúng tôi lựa chọn và thiết kế vector biểu hiện pCDNA3

và pEGFP-N1 trong đề tài.

pCDNA3 và pEGFP-N1 là vector biểu hiện ở tế bào động vật với các đặc điểm được trình bày

trong phụ lục.

Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN LIỆU

Mẫu phổi tươi của người bị ung thư phổi được cung cấp bởi Viện Quân Y 103 (kí hiệu H211 lấy

ngày 25/1/2011).

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu

Tách RNA tổng số

Mẫu phổi tươi

Tổng hợp cDNA

Khuếch đại đoạn 3’-NK1 Khuếch đại đoạn 5’-NK1

Tách dòng đoạn 5’-NK1 Tách dòng đoạn 3’-NK1

Hình 5: Sơ đồ nghiên cứu tách dòng và thiết kế vector biểu hiện cDNA mã hóa cho

thụ thể neurokinin – 1 ở phổi người Việt Nam.

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 TỪ PHỔI NGƢỜI

3.1.1. Tổng hợp cDNA từ mẫu phổi người

RNA tổng số từ mẫu phổi tươi được tách chiết bằng kit AccuPrep® Viral RNA Extraction Kit

(Bioneer). Sau đó, cDNA được tổng hợp nhờ phản ứng phiên mã ngược sử dụng RNA tổng số và

mồi hexamer. Thành phần và điều kiện của phản ứng tổng hợp cDNA được trình bày trong Bảng

9.

Bảng 9: Thành phần và điều kiện phản ứng tổng hợp cDNA của gen neurokinin-1

Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện

RNA tổng số 13.0

Ủ 700 trong 5’ để biến tính Mồi hexamer (100 µM) 1.5

dNTPs (10 mM) 2.5

Đệm 5x 5.0 - Gắn mồi: 250 trong 10 phút

AMV RTase 3.0 - Kéo dài: 370 trong 90 phút

- Bất hoạt enzyme: 850

trong 5 phút

Tổng 25.0

Sản phẩm cDNA được bảo quản ở 4oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.1.2. Khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1

Đoạn cDNA mã hóa cho thụ thể NK1 sẽ được tách dòng thành hai đoạn: đoạn 5’-NK1 và

đoạn 3’-NK1. Hai đoạn này sau đó sẽ được nối với nhau để tạo nên cDNA hoàn chỉnh như sơ đồ

Hình 6.

Hình 6: Sơ đồ khuếch đại đoạn 5’ và 3’-NK1 của gen mã hóa cho neurokinin-1

Để khuếch đại đoạn 5’-NK1, chúng tôi sử dụng cDNA được tổng hợp từ phản ứng phiên

mã ngược để làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu NK1 F/ NK1 R1. Thành phần

và điều kiện của phản ứng được trình bày trong Bảng 10.

Bảng 10: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa

cho thụ thể neurokinin-1

Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện

H2O 10.4 - Thời gian biến tính đầu tiên:

94oC, 5 phút

- Lặp lại 45 chu kì:

+Biến tính: 940C, 30 giây

+Gắn mồi : 600C, 30 giây

+Tổng hợp: 720C, 150 giây

- Thời gian tổng hợp sau cùng:

Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5

dNTPs (2 mM) 1.0

NK1 F (2 µM) 0.5

NK1 R1 (2 µM) 0.5

Pfu polymerase 0.1

cDNA 1.0

Tổng 15.0

NK1 F

NK1 R

NK1 R1

NK1 F1

94 bp 76 bp

94 bp

Đoạn 5’–NK1 (788 bp)

CCCGG

G

76 bp CCCGG

G

Đoạn 3’- NK1 (728 bp)

720C, 10 phút

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose. Kết quả điện di cho một băng DNA có kích thước

xấp xỉ 800 bp (Hình 7). Đây là kích thước đúng với tính toán cho đoạn 5’-NK1.

Hình 7: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể

neurokinin-1. Giếng ĐC: đối chứng âm không có cDNA; Giếng 5’: sản phẩm PCR khuếch đại

đoạn 5’-NK1; Giếng M: thang chuẩn SY-500.

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) để

chuẩn bị cho phản ứng tách dòng đoạn 5’-NK1 của cDNA.

3.1.3. Khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1

Tương tự như đối với đoạn 5’-NK1, chúng tôi sử dụng cDNA làm khuôn cho phản ứng

PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R để khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể

neurokinin-1. Tuy nhiên, sản phẩm PCR gồm các băng DNA không đặc hiệu và không có băng

DNA với kích thước 728 bp như mong đợi (Hình 8).

Hình 8: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể

neurokinin-1. Giếng 3’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1; Giếng M: thang chuẩn SY-500.

Lặp lại phản ứng nhiều lần và thay đổi các điều kiện về nồng độ cDNA, nhiệt độ gắn mồi,…

chúng tôi vẫn không thu được băng mong muốn. Vì vậy, chúng tôi quyết định thực hiện phản

ứng phiên mã ngược với mồi oligoT để tổng hợp lại cDNA từ RNA tổng số. Thành phần và điều

kiện của phản ứng phiên mã ngược được thực hiện như trong Bảng 11, chỉ thay đổi mồi hexamer

bằng mồi oligoT. Sau đó, cDNA này được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại

đoạn 3’-NK1 bằng cặp mồi đặc hiệu NK1 F1/ NK1 R. Thành phần và điều kiện của phản ứng

được trình bày trong Bảng 11.

Bảng 11: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa

cho thụ thể neurokinin-1

Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện

H2O 10.4 - Thời gian biến tính đầu tiên:

94oC, 5 phút

- Lặp lại 45 chu kì:

+Biến tính: 940C, 30 giây

+Gắn mồi : 600C, 30 giây

+Tổng hợp: 720C, 150 giây

- Thời gian tổng hợp sau cùng:

720C, 10 phút

Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5

dNTPs (2 mM) 1.0

NK1 F1 (2 µM) 0.5

NK1 R (2 µM) 0.5

Pfu polymerase 0.1

cDNA 1.0

Tổng 15.0

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose (Hình 9). Kết quả cho thấy bên cạnh băng DNA

không đặc hiệu thì đã xuất hiện băng DNA có kích thước lớn hơn 700 bp phù hợp với kích thước

đoạn 3’–NK1. Sử dụng kit High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) chúng tôi tinh sạch

đoạn 3’-NK1.

Hình 9: Điện di sản phẩm PCR dùng khuôn cDNA tổng hợp từ mồi oligo T khuếch đại

đoạn 3’-NK1. Giếng 3’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1, Giếng M: thang chuẩn SY-

100.

3.1.4. Tách dòng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1

Sau khi đã tinh sạch, từng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 được đưa vào vector pJET1.2 bằng

phản ứng nối sử dụng kit Gene JETTM

PCR Cloning Kit (Fermentas). Thành phần của phản ứng

nối được trình bày trong Bảng 12.

Bảng 12: Thành phần phản ứng nối đoạn 5’-NK1 (hoặc 3’-NK1) của cDNA mã hóa cho thụ thể

neurokinin-1 vào vector pJET1.2

Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện

Đoạn 5’-NK1

(hoặc đoạn 3’NK1)

8.0

Hỗn hợp nối ủ ở 160Cqua đêm

Đệm 2x 10.0

pJET 1.2 (50 ng/µl) 1.0

T4 ligase (5 u/ µl) 1.0

Tổng 20.0

Sau đó, từng hỗn hợp nối được biến nạp vào dòng tế bào khả biến E.coli DH5α. Với mỗi đĩa môi

trường thạch chứa kháng sinh để sàng lọc các khuẩn lạc nhận plasmid tái tổ hợp, chúng tôi chọn

8 khuẩn lạc để kiểm tra đoạn chèn bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.

Để kiểm tra đoạn chèn 5’-NK1, chúng tôi sử dụng trực tiếp khuẩn lạc làm khuôn cho phản ứng

PCR với cặp mồi NK1 F/NK1 R1. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR được trình bày trong

Bảng 13.

Bảng 13: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 5’-NK1

của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1

Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện

H2O 10.0 - Thời gian biến tính đầu tiên:

94oC, 5 phút

- Lặp lại 40 chu kì:

+Biến tính: 940C, 30 giây

+Gắn mồi : 600C, 30 giây

+Tổng hợp: 720C, 150 giây

- Thời gian tổng hợp sau cùng:

720C, 10 phút

Đệm 10x 1.5

dNTPs (2 mM) 1.0

NK1 F (2 µM) 0.5

NK1 R1 (2 µM) 0.5

Taq DNA polymerase (1 u/µl) 0.5

Khuôn 1.0

Tổng 15.0

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose (Hình 10). Kết quả cho thấy 7 trong 8 khuẩn

lạc đều cho một băng DNA có kích thước phù hợp với đoạn 5’-NK1. Như vậy, chúng tôi đã tách

dòng được đoạn 5’ –NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1. Chúng tôi kí hiệu bảy

khuẩn lạc này lần lượt từ 5’-NK1-1 đến 5’-NK1-7.

788 bp

Hình 10: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc với cặp mồi NK1 F/ NK1 R1. Giếng 1-8

lần lượt là các khuẩn lạc được đánh số tương ứng; ĐC: đối chứng âm không có khuôn; M: thang

chuẩn SY-500.

Tương tự như sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn 5’–NK1, chúng tôi chọn 8 khuẩn lạc để kiểm

tra sự có mặt của đoạn 3’-NK1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R. Thành phần

và điều kiện của phản ứng được trình bày trong Bảng 14.

Bảng 14: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 3’-NK1

của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1

Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện

H2O 10.0 - Thời gian biến tính đầu tiên:

94oC, 5 phút

- Lặp lại 40 chu kì:

+Biến tính: 940C, 30 giây

+Gắn mồi : 600C, 30 giây

+Tổng hợp: 720C, 150 giây

- Thời gian tổng hợp sau cùng:

720C, 10 phút

Đệm 10x 1.5

dNTPs (2 mM) 1.0

NK1 F1 (2 µM) 0.5

NK1 R (2 µM) 0.5

Taq DNA polymerase (1 u/µl) 0.5

DNA khuôn 1.0

Tổng 15.0

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose (Hình 11). Kết quả cho thấy 5 trong 8 khuẩn lạc (số

2, 4, 6, 7, 8) đều cho một băng DNA có kích thước phù hợp với đoạn 3’-NK1. Như vậy, chúng

tôi đã tách dòng thành công đoạn 3’–NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1. Chúng

tôi kí hiệu năm khuẩn lạc này là 3’-NK1-1 đến 3’-NK1-5.

728 bp

Hình 11: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn chèn 3’-NK1 bằng cặp mồi

NK1 F1/ NK1 R. Giếng 1-8 lần lượt là các khuẩn lạc được đánh số tương ứng; ĐC: đối chứng

âm không có khuôn; M: thang chuẩn SY-500.

3.1.5. Tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1

Quá trình tách dòng cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 được trình bày trong

Hình 12.

Hình 12. Sơ đồ tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1.

Đầu tiên chúng tôi chọn khuẩn lạc 5’-NK1-2 và 3’-NK1-6 để tách chiết các plasmid tái tổ hợp

mang đoạn chèn tương ứng 5’-NK1 và 3’-NK1. Plasmid này được kí hiệu p5’-NK1-2 và p3’-

NK1-6. Sử dụng p5’-NK1-2 làm khuôn cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn 5’-NK1 với mồi

NK1 R1 đặc hiệu cho NK1 và mồi pJET R của vector pJET 1.2. Thành phần và điều kiện của

phản ứng được trình bày trong Bảng 15.

Bảng 15: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại 5’-NK1 trong vector tái tổ hợp

p5’-NK1-2 bằng cặp mồi NK1 R1/ pJET R

Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện

H2O 10.4 - Thời gian biến tính đầu tiên:

94oC, 5 phút

- Lặp lại 40 chu kì:

+Biến tính: 940C, 30 giây

+Gắn mồi : 600C, 30 giây

+Tổng hợp: 720C, 120 giây

- Thời gian tổng hợp sau cùng:

720C, 10 phút

Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5

dNTPs (2 mM) 1.0

NK1 R1 (2 µM) 0.5

pJET R (2 µM) 0.5

Pfu polymerase (1 u/µl) 0.1

p5’-NK1-2 1.0

Tổng 15.0

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose (Hình 13). Kết quả cho thấy chúng tôi đã khuếch

đại thành công đoạn 5’-NK1 bằng cặp mồi NK1 R1/pJET R.

Hình 13: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 bằng cặp mồi pJET R/ NK1 R. Giếng

1: sản phẩm PCR bằng cặp mồi pJET R/NK1 R; ĐC: mẫu đối chứng âm không có DNA khuôn;

M: thang chuẩn SY-100.

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) và được cắt bởi hai

enzyme XbaI/SmaI để chuẩn bị cho việc ghép nối với đoạn 3’-NK1. Tiếp theo, chúng tôi cũng

tiến hành cắt vector tái tổ hợp p3’-NK1-6 với hai enzyme XbaI/ SmaI. Thành phần phản ứng cắt

được trình bày trong Bảng 16.

Bảng 16: Thành phần cắt và điều kiện cho phản ứng cắt với hai enzyme XbaI/SmaI

Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện

H2O 42.0

Ủ 370C trong 2 giờ

Đệm Tango 10x 6.0

p3’-NK1-2 (hoặc sản phẩm

PCR đoạn 5’-NK1) 8.0

SmaI 2.0

XbaI 2.0

Các sản phẩm cắt với hai enzyme được điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 8% (Hình 14A).

Kết quả cho thấy phản ứng cắt được thực hiện hoàn toàn; các băng DNA được cắt có kích thước

theo đúng tính toán. Băng DNA có kích thước 700 bp của đoạn 5’-NK1 và băng DNA có kích

thước 3341 bp gồm plasmid pJET và đoạn 3’-NK1 được tinh sạch bằng kit của QIAquick Gel

Extraction (QIAGEN) rồi điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 8% (Hình 14B). Kết quả cho

thấy hai băng DNA đã tinh sạch đảm bảo cho phản ứng nối tiếp theo.

99

7

Hình 14: Điện di sản phẩm cắt trước và sau khi tinh sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction

(QIAGEN). A: sản phẩm cắt trước khi tinh sạch; B: sản phẩm cắt sau khi tinh sạch; 1: sản phẩm

PCR chứa đoạn 5’-NK1 sau khi cắt; 2: sản phẩm vector p3’-NK1-6 cắt; M: thang chuẩn-100;

M1: thang chuẩn 1 kb.

Đoạn 5’-NK1 và vector có chứa đoạn 3’-NK1 được nối với nhau theo thành phần trình bày trong

Bảng 17.

Bảng 17:Thành phần phản ứng nối đoạn 5’-NK1 vào vector pJET1.2-3’-NK1

Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện

Đệm 2x 10.0

Ủ 160C qua đêm

5’-NK1 5.0

p3’-NK1-6 4.0

T4 ligase 1.0

Tổng 20.0

Sau đó, hỗn hợp nối được biến nạp trực tiếp vào dòng vi khuẩn E.coli DH5α theo phương pháp

trình bày trong mục 2.2.2.6. Kết quả trên môi trường chọn lọc bổ sung kháng sinh có nhiều

khuẩn lạc. Chúng tôi chọn 13 khuẩn lạc để kiểm tra sự có mặt của đoạn cDNA hoàn chỉnh bằng

phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F/ NK1 R. Đây là hai mồi bắt cặp với trình tự ở đầu 5’ và đầu

3’ của cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1. Thành phần và điều kiện của phản ứng

PCR được trình bày trong Bảng 18.

Bảng 18: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc chứa đoạn cDNA hoàn

chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1

Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện

H2O 10.0 - Thời gian biến tính đầu tiên:

94oC, 5 phút

- Lặp lại 40 chu kì:

+Biến tính: 940C, 30 giây

+Gắn mồi : 600C, 30 giây

+Tổng hợp: 720C, 150 giây

- Thời gian tổng hợp sau cùng:

720C, 10 phút

Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5

dNTPs (2 mM) 1.0

NK1 F (2 µM) 0.5

NK1 R (2 µM) 0.5

Taq DNA polymerase (1u/ µl) 0.5

Khuôn 1.0

Tổng 15.0

Hình 15: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn cDNA NK1 hoàn chỉnh.

Giếng1-13 là các khuẩn lạc được đánh số tương ứng; ĐC: đối chứng âm không có DNA; M:

thang chuẩn 1 kb.

Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy chúng tôi đã thu được 10 trong số 13 khuẩn lạc mang

đoạn chèn có kích thước xấp xỉ 1338 bp như mong đợi. Các khuẩn lạc này được kí hiệu NK1-1

đến NK1-10.

3.1.6. Giải trình tự cDNA hòan chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1

Chúng tôi chọn khuẩn lạc NK1-3 để tách plasmid tái tổ hợp. Plasmid này được kí hiệu pNK1-3.

Plasmid pNK1-3 được giải trình tự hai chiều bằng mồi của vector pJET 1.2 F/ R. Kết quả được

trình bày trong Phụ lục.

Kết quả khi so sánh với trình tự nucleotide của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 được

tách dòng từ não người Việt Nam, chúng tôi không thấy bất kỳ sự sai khác nào. Cả hai trình tự

này đều có 5 nucleotide khác với trình tự trong ngân hàng dữ liệu (Mã số trên NCBI: M81797.1).

Điều này chứng tỏ rằng sự khác biệt giữa trình tự nucleotide trong gen mã hóa cho thụ thể

neurokinin-1 của người Việt Nam với trình tự nucleotide trong ngân hàng dữ liệu là do tính đa

hình của gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người.

Như vậy, từ kết quả giải trình tự cho thấy chúng tôi đã tách dòng thành công cDNA hoàn chỉnh

mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ mẫu phổi người Việt Nam.

3.2. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1

3.2.1. Thiết kế mồi

Để biểu hiện cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người, chúng tôi sử dụng hai vector biểu

hiện ở tế bào động vật là pCDNA3 và pEGFP-N1. Bước đầu tiên cần chuyển đoạn cDNA đã tách

dòng trong vector pJET1.2 sang hai hệ thống vector biểu hiện. Khi lựa chọn enzyme cắt giới hạn,

chúng tôi không thấy enzyme nào trong vị trí đa điểm của vector pEGFP-N1 và pCDNA3 thỏa

mãn điều kiện cắt văng ra đoạn cDNA hoàn chỉnh từ vector tái tổ hợp pJET1.2-NK1. Vì vậy,

chúng tôi đã thiết kế mồi NK1 F3/ NK1 R3 để chuyển cDNA-NK1 từ pNK1-3 sang vector biểu

hiện. Trình tự cặp mồi NK1 F3/ NK1 R3 được thiết kế dựa vào trình tự cDNA hoàn chỉnh tách

dòng từ phổi người Việt Nam. Trong đó ở đầu 5’ của mồi NK1 F3 được thiết kế mang trình tự

nhận biết cho enzyme cắt giới hạn HindIII và mồi NK1 F3 mang trình tự nhận biết cho enzyme

BamHI như Hình 16.

+ NK1 F3: 5’- - 3’

+ NK1 R3: 5’- - 3’

Hình 16: Sơ đồ thiết kế mồi NK1 F3/R3 để khuếch đại cDNA-NK1 từ vector pNK1-3.

Mặt khác, chúng tôi sử dụng mã mở đầu trong trình tự cDNA của NK1 thay vì mã mở đầu được

thiết kế sẵn trên vector biểu hiện nên trong quá trình thiết kế mồi chúng tôi phải chèn thêm trình

tự Kozak (ACCATGG) vào để làm tăng khả năng được phiên mã và dịch mã của gen trong tế

bào nhận.

Với hai mồi được thiết kế mới, chúng tôi khuếch đại cDNA từ pNK1-3. Thành phần và điều kiện

của phản ứng PCR được thể hiện trong Bảng 19.

ACCATGG

G T T AC A C GA GAGG A T C

Trình tự Kozak

AAT

Hind III

C CT AGG

AAGCTT

---5’-CTAGAAGATCGAAATGGATAACGTCCTCC----/-/-/--pNK1--/-/-/---CAATGTGCTCTCCTAGGGATCCTTA-3’--

------

ATTT

ATTT

AAGCTT

AAGCTT

ACCATGG

AC CA T GG

ATAACGTCCTCC

ATAA C GT C C TC C

GGATCC Bam HI

CTAGGAGAGCACATTG TAA GGATCC

Bảng 19: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại cDNA-NK1 từ pNK1-3 bằng cặp

mồi NK1 F3/ NK1 R3

Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện

H2O 10.4

- Thời gian biến tính đầu tiên: 94oC, 5 phút

- Lặp lại 4 chu kì:

+Biến tính: 940C, 30 giây

+Gắn mồi : 500C, 30 giây

+Tổng hợp: 720C, 150 giây

- Lặp lại 35 chu kỳ

+Biến tính: 940C, 30 giây

+Gắn mồi : 600C, 30 giây

+Tổng hợp: 720C, 150 giây

- Thời gian tổng hợp sau cùng:

720C, 10 phút

Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5

dNTPs (2 mM) 1.0

NK1 F3 (2 µM) 0.5

NK1 R3 (2 µM) 0.5

Pfu polymerase 0.1

pNK1-3 1.0

Tổng 15.0

Trong phản ứng PCR, do trình tự mồi thiết kế có một đoạn nucleotide tương đối dài không bắt

cặp được vào khuôn nên trong 4 chu kỳ đầu tiên, chúng tôi hạ thấp nhiệt độ gắn mồi để có thể

nhân đoạn gen mong muốn. Ở các chu kỳ tiếp theo, chúng tôi tăng nhiệt độ gắn mồi để đảm bảo

tính đặc hiệu của phản ứng. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy chúng tôi đã thu được băng

có kích thước xấp xỉ 1237 bp như trình bày trên Hình 17.

Hinh 17: Điên di san phâm PCR với khuôn là vector tai tô hơp pNK 1-3 và hai môi NK 1

F3/NK1 R3. Giếng 1: sản phẩm PCR khuếch đại cDNA NK1; M: thang chuẩn SY-500; ĐC: đôi

chưng âm không có khuôn DNA .

Như vậy cặp mồi mới thiết kế đã cho phép nhân đặc hiệu đoạn cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ

thể neurokinin-1. Đồng thời đoạn DNA mới được nhân bản có mang vị trí nhận biết của cặp

enzyme HindIII/ BamHI ở hai đầu 5’ và 3’. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit High Pure

Product purification kit (Roche) và được kí hiệu là eNK1 (expression NK1).

3.2.2. Tách dòng vector biểu hiện mang cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin -1

Chúng tôi tách chiết và tinh sạch hai loại plasmid pCDNA3 và pEGFP-N1. Hai plasmid

này và đoạn eNK1 được cắt lần lượt với enzyme HindIII. Sản phẩm cắt được điện di và tinh sạch

bằng kit High Pure Product purification kit (Roche). Sau đó, sản phẩm tinh sạch tiếp tục được cắt

với BamHI. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt với từng enzyme được trình bày trong Bảng

20 và Bảng 21.

Bảng 20: Thành phần và điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen NK1 bằng enzyme

HindIII

Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện

H2O 60.0

Ủ 370Ctrong 2 giờ

Đệm R 10x 15.0

eNK1(hoặc plasmid) 70.0

Hind III 5.0

Tổng 150.0

Bảng 21: Thành phần và điều kiện cho phản ứng với enzyme BamHI

Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện

H2O 33.0

Ủ 370Ctrong 2 giờ

Đệm 10x Bam HI 10.0

Sản phẩm đã cắt với HindIII 54.0

Bam HI 3.0

Tổng 100.0

Qua mỗi bước cắt sản phẩm đều được tinh sạch bằng High Pure Product Purification kit

(Roche) và được điện di kiểm tra. Kết qua cuôi cung đư ợc thể hiện trong Hình 18.

Hinh 18: Điên di san phâm căt vector pCDNA 3, pEGFP-N1 và eNK 1 với hai enzyme Hind III

và Bam HI. Giếng 1, 2, 3 lân lươt la vector pCDNA 3, pEGFP-N1 và eNK1 không căt ; 1’, 2’, 3’:

lân lươt la vector pCDNA 3, pEGFP-N1 và eNK1 sau khi căt ; M1: marker 1 kb; M2: thang chuẩn

SY-500.

Sau khi tinh sạch, eNK1 được đưa vào từng vector pCDNA 3 và pEGFP -N1 với thành

phần được trình bày trong Bang 22.

Bảng 22: Thành phần và điều kiện của phản ứng nối cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 vào

vector pCDNA3 và pEGFP-N1

Thành phần Thể tích(µl) Thành phần Thể tích (µl)

Đệm 10x 2.0 Đệm 10x 2.0

eNK1cắt 8.5 eNK1 cắt 10.0

Plasmid pCDNA3 cắt 8.5 Plasmid pEGFP-N1 cắt 7.0

T4 ligase 1.0 T4 ligase 1.0

Tổng 20.0 Tổng 20.0

Điều kiện: Ủ ở 16 0C qua đêm

Hai hôn hơp nôi đươc biên nap riêng bi ệt vao chung vi khuân E. coli DH5α theo phương

pháp s ốc nhiệt (Mục 2.2.2.6). Khuẩn lạc nhận plasmid pCDNA3 sẽ mọc trên môi trường có

kháng sinh ampicillin (50µg/ml). Khuẩn lạc nhận plasmid pEGFP-N1 sẽ mọc trên môi trường có

kháng sinh Kanamycin (50µg/ml). Trên cả hai loại môi trường, chúng tôi thu được nhiều khuẩn

lạc. Để sàng lọc khuẩn lạc mang cDNA hoàn ch ỉnh mã hóa cho NK1, chúng tôi chọn 14 khuẩn

lạc trên môi trường chứa kháng sinh ampicillin và 15 khuẩn lạc trên môi trường chứa kháng sinh

kanamycin làm khuôn cho phản ứng PCR với căp môi NK 1 F3/ NK1 R3. Thành phần và đi ều

kiện phan ưng đươc thê hiên trong Bang 23.

Bảng 23: Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR kiểm tra cDNA-NK1 trong các thể biến

nạp

Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện

H2O 10.0 - Thời gian biến tính đầu tiên:

94oC, 5 phút

- Lặp lại 40 chu kì:

+Biến tính: 940C, 30 giây

+Gắn mồi : 600C, 30 giây

+Tổng hợp: 720C, 135 giây

- Thời gian tổng hợp sau cùng:

720C, 10 phút

Đệm 10x 1.5

dNTPs (2 mM) 1.0

NK1 F3 (10 µM) 0.5

NK1 R3 (10 µM) 0.5

Taq DNA polymerase (1 u/ µl) 0.5

Khuôn 1.0

Tổng 15.0

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose (Hình 19 và Hình 20). Kết quả cho thấy với

các dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp pCDNA3, chúng tôi đã thu được 8 trong 15 khuẩn lạc

mang đoạn chèn cDNA-NK1 có kích thước như mong muốn (Hình 19).Với các dòng chứa vector

tái tổ hợp peGFP-N1, chúng tôi thu được 13 trong 15 khuẩn lạc chứa đoạn chèn cDNA-NK1 có

kích thước mong muốn (Hình 20).

Hinh 19: Điên di san phâm PCR kiêm tra khuân lac mang vector tai tô hơp pCDNA 3-NK1.

Giêng 1A-14A: các khuẩn lạc được đánh s ố tương ứng; giếng M: thang chuẩn SY-500.

Hinh 20: Điên di san phâm PCR kiêm tra khuân lac mang vector tai tô hơp pGFPN 1-NK1.

Giêng 1E-15E: các khuẩn lạc được đá nh số tương ứng; giếng M: thang chuẩn SY-500.

Như vậy chung tôi đa tach dong đư ợc hai vector tai tô hơp pCDNA 3-NK1 và pEGFPN 1-

NK1 mang cDNA hoàn chỉnh mã cho NK1. Dựa vào ảnh điện di, chúng tôi lựa chọn hai khuẩn

lạc 11A và 5E. Các vector tái tổ hợp của hai khuẩn lạc này được kí hiệu là pCDNA3-NK1-11 và

pEGFP-N1-NK1-5. Chúng tôi tách chiết hai loại plasmid tái tổ hợp để giải trình tự .

3.2.3. Giải trinh tự gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 trong vector biểu hiện

Để khẳng định sự có mặt của cDNA-NK1 trong các vector biểu hiện, hai vector biêu hiên

pCDNA3-NK1-11 và peGFP -N1-NK1-5 đươc giai trinh tư m ột chiêu t ừ đầu 5’ của đoạn chèn

NK1 băng môi cua vector .

Kêt qua giai trinh tư cDNA -NK1 trong hai hê thông vector biêu hiên t rên đêu cho th ấy

hơn 750 bp phía đầu 5’ của cDNA-NK1 không co bât ky sư sai khac nao so vơi trinh tư cDNA

gôc trong vector tách dòng pNK 1-3. Điêu đo chưng to răng chung tôi đa thanh công trong viêc

thiêt kê vector bi ểu hiện mang cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người Việt

Nam

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Với những kết quả thu được chúng tôi đưa ra những kết luận sau:

1. Tách dòng thành công cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin – 1 ở phổi người Việt

Nam. cDNA-NK1 có kích thước 1338 bp trong đó có 5 nucleotide (ở các vị trí 184, 333, 370,

641, 996) không giống với trình tự cDNA-NK1 trong ngân hang dữ liệu, chứng tỏ sự đa hình của

gen mã cho thụ thể NK1 ở người Việt Nam.

2. Thiết kế thành công vector biểu hiện pCDNA3 và pEGFP-N1 mang cDNA mã cho thụ thể

NK1 phân lập từ phổi của người Việt Nam.

.