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TECNOLOGÍA DE DNARECOMBINANTE

Ignacio Zarante, MD, MSc.

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Manipulación del DNARotura de DNA en sitios específicos(Enzimas de restricción)Hibridación del DNA con sondas

específicasClonación del DNA

Secuenciación de DNAAplicaciones clínicas

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Rotura del DNAEnzimas de restricción =Endonucleasas de restricción =Restrictasas

VER FIGURA GENETIC IT

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RESTRICTION FRAGMENTS

LENGTH POLYMORPHISMRFLPTécnica que evalua los diferentespatrones de restricción que seobtienen con diferentesendonucleasasVER GENETIC ITUsos en forense: Identificación deindividuos o paternidades

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CLONACIÓN DEL DNA

VECTORESPlásmidoFagoCósmido YAC

REACCIÓN EN CADENA DE LAPOLIMERASA (PCR)

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VECTORVECTOR

Cápsula yCápsula yProteínasProteínasviralesvirales

GenesGenesestructurales,estructurales,

de replicación,de replicación,etc.etc.

Vector Vector DNA o RNADNA o RNA

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INSERCIÓNINSERCIÓN

Material GenéticoMaterial Genéticodel vector del vector

Corte con enzimasCorte con enzimasde restricciónde restricción

Gen a clonar Gen a clonar

Material GenéticoMaterial GenéticoTransformadoTransformado

Gen de resistenciaGen de resistenciaa ATBa ATB

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TRANSFECCIÓNTRANSFECCIÓN

Gen a clonar Gen a clonar Infección deInfección decélula blancocélula blanco

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TRANSFECCIÓNTRANSFECCIÓN

Gen a clonar Gen a clonar Infección deInfección decélula blancocélula blanco

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TRANSFECCIÓNTRANSFECCIÓN

Gen a clonar Gen a clonar Infección deInfección decélula blancocélula blanco

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TRANSFECCIÓNTRANSFECCIÓN

Gen a clonar Gen a clonar Infección deInfección decélula blancocélula blanco

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TRANSFECCIÓNTRANSFECCIÓN

Gen a clonar Gen a clonar Infección deInfección decélula blancocélula blanco

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TRANSFECCIÓNTRANSFECCIÓN

Gen a clonar Gen a clonar Infección deInfección decélula blancocélula blanco

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TRANSFECCIÓNTRANSFECCIÓN

Gen a clonar Gen a clonar Infección deInfección decélula blancocélula blanco

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TRANSFECCIÓNTRANSFECCIÓN

Gen a clonar Gen a clonar Infección deInfección decélula blancocélula blanco

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CLONACIÓNCLONACIÓN

Células en cultivoCélulas en cultivoEjemplo: E.Ejemplo: E. ColiColi

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VECTORESPlásmido

DNA circular que se replica en la bacteria.Inicio de replicación y sitio de restricción(100 kB)

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BIBLIOTECAS GENÓMICASColección de fragmentos clonadosligados a vectores y almacenados encélulas húesped

Pueden ser de DNA complementario(cDNA) = DNA producido por

trancriptasas reversas provenientede RNA (No contiene INTRONES)

REACCIÓN EN CADENA DE

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REACCIÓN EN CADENA DE

LA POLIMERASA (PCR)

•dnTPs (A, C, G y T)•TAQ polimerasa•Primers•DNA completo

REACCIÓN EN CADENA DE

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REACCIÓN EN CADENA DE

LA POLIMERASA (PCR)

Denaturación 95º CAnillamiento 60.5º CPolimerización 72º C

VER GENETIC IT

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ANÁLISIS DE DNAHIBRIDACIÓN con Southern blotting

Mst II B globinaNormal2 fragmentos

B globina

Anormal1 fragmento

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ANÁLISIS DE DNAHIBRIDACIÓN con Southern blotting

Marcador dePeso molecular

Sano

AnemiaFalciformePortador

DNA digerido con Mst II

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ANÁLISIS DE DNAHIBRIDACIÓN con Southern blotting

Electroforesis de DNA

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ANÁLISIS DE DNAHIBRIDACIÓN con Southern blotting

Se transfiere a Nitrocelulosa

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ANÁLISIS DE DNAHIBRIDACIÓN con Southern blotting

Se adiciona sonda de B globinaMarcada radioactivamente

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ANÁLISIS DE DNAHIBRIDACIÓN con Southern blotting

Hibridación con la sondaRadio marcada

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ANÁLISIS DE DNAHIBRIDACIÓN con Southern blotting

REVELADO

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SECUENCIACIÓNTécnica que demuestra lasecuencia de pares de basesde un segmento de DNAdeterminadoMétodo químico (Maxam

Gilbert)Método enzimático (Sanger)

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SECUENCIACIÓN

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SECUENCIACIÓN

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APLICACIONES CLÍNICASDiagnósticoEnfermedades unigénicasPatologías infecciosasSuceptibilidad a enfermedades

IdentificaciónPaternidades

Individuos NNTerapia génica

TERAPIA GÉNICATERAPIA GÉNICA

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TERAPIA GÉNICATERAPIA GÉNICASNC: Cancer

Sistema Respiratorio:Fibrosis quística, cancer,alfa 1 antitripsina

Organos Sólidos: Hígado.Ejem: Hipercolesterolemía

Tejido hematopoyético:Cancer y defectos inmunológicos

Musculo: Distrofia muscular

Sistema circulatorio: Aterosclerosis

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TERAPIA GÉNICATERAPIA GÉNICATRANSFERENCIA GENICA

In vivo Ex vivo

VECTORESVIRALES

METODOSNO VIRALES

Adenovirus, Herpes,

Poxvirus, Retrovirus

Liposomas, DNA desnudo,

Electroporación, bombardeo

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FIN