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Tecnologia Tecnologia do DNA recombinantedo DNA recombinante
BIOLOGIA MOLECULAR
1. DNA recombinante
2. Enzimas de restrição
3. Vetores de clonagem
- Plasmídios
- Bacteriófagos
- Cosmídeos
4. Etapas de clonagem molecular
5. Aplicações
1. DNA recombinante
2. Enzimas de restrição
3. Vetores de clonagem
- Plasmídios
- Bacteriófagos
- Cosmídeos
4. Etapas de clonagem molecular
5. Aplicações
Conteúdo
HISTÓRICO
Watson & CrickEstrutura do
química do DNA (1953)
Nature, 25 - Abr - 1953
Tecnologia DNA recombinante
Insulina recombinante(1978)
Ian Wilmutclonagem de mamífero
(1997)
HISTÓRICO
Prática clínicaTestes genéticos
(1995...)
PGHConhecer genoma H. sapiens
(1995-2003)
Transgenia(1995...)
O que é um DNA recombinante?
- É uma molécula de DNA formada
pela ligação de duas moléculas de
origens diferentes (Ex. DNA de
planta ligado a um plasmídio)
““A engenharia genética atua no nível A engenharia genética atua no nível
molecular, onde as diferenças molecular, onde as diferenças
entre espécies desaparecem”entre espécies desaparecem”
ENZIMAS DE RESTRIÇÃOENZIMAS DE RESTRIÇÃO
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
W. Alber H. Smith D. Nathans
• Uma enzima de restrição ou endonuclease de restrição é um tipo de nuclease que cliva fita dupla de DNA sempre que identificar uma seqüência particular de nucleotídios que seja o sítio de restrição da enzima;
Descritas em 1970,
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Função Natural: proteger o DNA bacteriano do DNA exógeno
Função Natural: proteger o DNA bacteriano do DNA exógeno
A enzima BamHI reconhece a seqüência dupla fita:
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
- reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos no DNA, atuando como verdadeiras tesouras moleculares
BamHI
• BamHI - Bacillus amyloliquefaciens H5’ G/GATCC 3’
• EcoRI - Escherichia coli R5’ G/AATTC 3’
• HaeIII - Haemophilus aegyptius5’ GG/CC 3’
• PstI - Providencia stuartii5’ CTGCA/G 3’
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Nomenclatura
370 C, 1 hora, com tampão
adequado
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
EcoRI
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Tipos de cortes:
- Produção de terminais coesivos (adesivos, protuberantes) - Produção de terminais abruptos (ou cegos)
NarI ~~~~~~ 181 ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC TGGTATACGC CACACTTTAT GGCGTGTCTA CGCATTCCTC TTTTATGGCG TAGTCCGCGG
241 ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT TAAGCGGTAA GTCCGACGCG TTGACAACCC TTCCCGCTAG CCACGCCCGG AGAAGCGATA
301 TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT ATGCGGTCGA CCGCTTTCCC CCTACACGAC GTTCCGCTAA TTCAACCCAT TGCGGTCCCA
HindIII PstI ~~~~~~~ ~~~~~~ 361 TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA GCTTGCATGC CTGCAGGTCG AAAGGGTCAG TGCTGCAACA TTTTGCTGCC GGTCACGGTT CGAACGTACG GACGTCCAGC
XbaI BamHI KpnI EcoRI ~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~ ~~~~~~~ 421 ACTCTAGAGG ATCCCCGGGT ACCGAGCTCG AATTCGTAAT CATGGTCATA GCTGTTTCCT TGAGATCTCC TAGGGGCCCA TGGCTCGAGC TTAAGCATTA GTACCAGTAT CGACAAAGGA
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
TIPOS DE VETORESTIPOS DE VETORES
TIPOS DE VETORES
VetoresVetores HospedeiroHospedeiross
Plasmídeos
Cosmídeos
Bactérias / levedurasclonagem
Bacteriófagos
UtilizaçãUtilizaçãoo
• Plasmídios são moléculas de DNA circular, fita dupla, extracromossomais, que ocorrem naturalmente em bactérias e algumas leveduras– pUC18– pBR322– pUP310
Ob.: Utilizados para clonar fragmentos de até 9 kb
VETORES PLASMIDIAIS
VETORES PLASMIDIAIS
pUS9744039 pb
rCanamicina
MT19
oriM
hsp60RBS
oriEHindIIIXbaI
Vetor de Expressão em Procarioto
pTarget5670 bp
rNeomicina
rAmpicilina
Intron
Poly A
Promotor CMV
Bam HI (1257)
Eco RI (1251)
Eco RI (1319)
HindIII (1326)
VETORES PLASMIDIAIS
Vetor de Expressão em Eucariotos
pUS9733984 bp
rCanamicina
oriM Promotor hsp60
RBS
oriE HindIIIXbaI
Vacina Vetorizada (rBCG)
pUS9744039 pb
rCanamicina
MT19
oriM
hsp60RBS
oriEHindIIIXbaI
pUS9773984 bp
rCanamicina
oriM Promotor pAN
RBS
oriE HindIIIXbaI
pUS20003759pb
Kan(R)
OriMp18kDa
oriC
XbaI
HindIII
Vetor de Expressão em Eucariotos
VETORES PLASMIDIAIS
- Vírus que infectam bactérias;
- Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a 25 kb
BACTERIÓFAGO
BACTERIÓFAGO
Ciclo Lítico
Ciclo Lisogênico
- São híbridos entre plasmídios e bacteriófagos;
- Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 35 kb;
COSMÍDEOS
Características essenciais
• Replicação autônoma
• Marcador de seleção (antibiótico)
• Sítio único de clonagem
VETORES DE CLONAGEM
• Necessitam de um promotor forte, de um RBS e de ATG
• Promotores induzíveis• Sinais de secreção• Fusão com proteínas carreadoras
VETORES DE EXPRESSÃO
CLONAGEM MOLECULARCLONAGEM MOLECULAR
• É o isolamento e a propagação em um organismo de moléculas idênticas de DNA
CLONAGEM MOLECULAR
CONSTRUÇÃO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE
1. Obtenção do DNA a ser clonado1. Obtenção do DNA a ser clonado
2. Preparação do vetor2. Preparação do vetor
3. Ligação do vetor com o “inserto”3. Ligação do vetor com o “inserto”
4. Transformação da bactéria4. Transformação da bactéria
5. Seleção dos clones recombinantes5. Seleção dos clones recombinantes
- Extração de DNA;- PCR- Digestão - Purificação
1.Obtenção do DNA a ser 1.Obtenção do DNA a ser clonadoclonado
1.Obtenção do DNA a ser 1.Obtenção do DNA a ser clonadoclonado94 0C por 5 min
94 0C por 1 min
55 0C por 1 min
72 0C por 1 min
72 0C por 5 min
4 0C
35 ciclos
PCR
Eletroforese em gel de agarose
Visualização do DNA em luz ultravioleta
• Digestão • Purificação
3.Preparação do vetor3.Preparação do vetor
Plasmídeo Circular
Plasmídeo linear
Digestão com
Enzimas de restrição
Extremidades coesivas
Fragmento de DNA - inserto
DNA plasmidial -
vetor
LIGASELIGASE
4. Ligação4. Ligação
CH
OQ
UE T
ÉR
MIC
O
5.Transformação da bactéria
5.Transformação da bactéria5.Transformação da bactéria
ELETR
OP
OR
AÇ
ÃO
5.Transformação da bactéria5.Transformação da bactéria
ELETR
OP
OR
AÇ
ÃO
6.Seleção dos clones recombinantes6.Seleção dos clones recombinantes
Construção do DNA Recombinante
Molécula de DNA de um plasmídeo circular
Clivagem com enzima de restrição
Molécula de DNA de um plasmídeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligação covalente pela DNA ligase
Molécula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserção em uma célula hospedeira
Extração de DNA de L. interrogansExtração de DNA de L. interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extração de DNA
PCR
94ºC – 5 min
94ºC – 1 min50ºC – 1 min72ºC – 1 min
72ºC – 7 min
30 cicloslipL32
768 pb
Primer RPrimer F
PCR Clonagem em
Vetores de expressão
Transformação E. coli
Seleção dos Clones recombinantes
768 pb
TriagemDigestão
Construção dos VetoresConstrução dos Vetores
lipL32 768 pb
Extração
Expressão de Proteínas RecombinantesExpressão de Proteínas Recombinantes
Purificação da Proteína
Cultura de Células
Transformação da E. coli
pAE2831 bp
rAmpicilina
6X His
f1 ori
oriE
Promotor T7
Bam HI (137)
Hin dIII (178)
Xba I (59)
Purificação de proteínas recombinantesPurificação de proteínas recombinantes
LigaçãoTransformação por
Eletroporação
E. Coli DH5
Extração de DNA plasmidial
pLysS
codon pluss
SI
DE3
Transformação por Choque Térmico
Cepas de E. coli para expressão de proteínas
pAE/LipL323547 bp
AmpR
LipL32
6x His
f1 ori
pUC ori
pT7
Bam H I (468)
Eco R I (887)
Hin d III (894)
Xba I (59)
Xho I (131)
E. coli (BL21)
SDS-PAGE
SDS-PAGE (Eletroforese de proteínas)
Expressão em diferentes cepas de E.coli
Expressão de Proteínas RecombinantesExpressão de Proteínas Recombinantes
1 2 3 4
30kDa
1. BENCHMARKTM Protein Ladder em kDa
2, 3 e 4. LipL32 purificada (eluições).
Gel de poliacrilamida 15%.
Purificação de Proteínas Recombinantes
Purificação de Proteínas Recombinantes
Akta Prime
APLICAÇÕESAPLICAÇÕES
VACINAS RECOMBINANTESVACINAS RECOMBINANTES
1. PCR
2. Clonagens
3. Multiplicação
Proteína Recombinante
4. Vacinação
lipL32768 bp
LipL32 0906
Primer RPRIMER F
Bam HI (342) Hin dIII (761)Xba I (4)
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
L. interrogans
pAE
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
Vetor Plasmidial
pTARGET
pUS973pUS974pUS977
E.coli (BL21) E.coli TOP10 E.coli TOP10
Vacina de DNA BCGr
lipL32
ANIMAIS TRANSGÊNICOSANIMAIS TRANSGÊNICOS
PLANTAS TRANSGÊNICASPLANTAS TRANSGÊNICAS