Upload
muty-dianda
View
200
Download
9
Embed Size (px)
Citation preview
L/O/G/OL/O/G/O
TEKNIK BIOLOGI MOLEKULER EKSPRESI KLONING DAN
ALEL SPESIFIK OLIGONUKLEOTIDA
Oleh :
KELOMPOK 5
1. Annisa Fajriani
2. Fitria Febrianti
3. Muti Dianda Sari
4. Rike Tri Kumala Dewi
5. Ruqayyah Jamaludin
Pendahuluan
Biologi Molekuler
Interaksi berbagai sistem dalam sel, termasuk interaksi DNA, RNA, dan
sintesis protein
Next…
Mendiagnosis Penyakit
Mendeteksi Patogen
Konseling Genetik
Terapi Gen 4
1
2
3
Perkembangan analisis DNA molekuler dan genetik dalam bidang medis
Next…
Strategi dan Teknik Analisis Molekuler
Kloning Ekspresi
Hibridisasi Asam Nukleat
Amplifikasi DNA dengan PCR
KLONING EKSPRESI
Isolasi DNA target1
Penyisipan DNA targetke dalam vektor rekombinan
Introduksi vektor rekombinan yangmembawa sisipan ke dalam sel inang
2
3
Mempelajari fungsi protein
Tahap Pengklonan
Contoh Studi KasusKloning Ekspresi
Konversi androgen ke esterogen oleh enzim sitokrom P-450 aromatase (P-450arom)
Dalam jurnal
“Cloning and Tissue Spesific Expression of Cytochrome P-450 Aromatase CDNA in
Japanese Eel (Anguilla japonica)”
Metode…
Ovary ikan mature & Bagian otak ikan betina immature
Isolasi fragmen cDNAP-450arom
Ekstraksi, Screening & Purifikasi RNA total
Dilakukan kloning & subkloning, identifikasi
dengan seleksi biru putih
Cek ukuran insert klon, sequencing rekombinan yang
terbentuk
Amplifikasi cDNA dengan PCR
3 primer yang digunakan oligonukleotida :
1. 5’-GG(A/T)AT(C/T)GG(C/G)AC(A/T)GC(C/G)AGTAA-3’2. 5’-CTGTGGATGGGGATCGGC(A/T)-3’3. 5’-TCATCATCACCATGGCGATG-3’
Analisis sekuen dan
RT-PCR
Next…
Hasil penelitian menunjukkan…
Eel P-450arom mRNA dominan berada di jaringan otak dan Pituary. Berdasarkan hasil tersebut dapat dikatakan bahwa ekspresi kloning dapat dilakukan untuk mengidentifikasi apakah fragmen cDNA yang ingin diketahui ekspresinya berada pada jaringan yang sedang diidentifikasi atau tidak.
HIBRIDISASI ASAM NUKLEAT
Tahapan dalam analisis DNA rekombian yang memanfaatkan komplementer interaksi asam nukleat yang sedemikian penting untuk sintetis DNA dan Ra
Pemakaian oligonuleotida spesifik alel
Menggunakan DNA/ RNA “probe” radioaktif
Next…
Oligonukleotida Spesifik Alel (ASO)
Salah satu variasi dalam teknik hibridisasi asam nukleat
Southern Blotting
Southern Blotting
Proses perpindahan fragmen DNA yang terpisah secara elektroforesis dari gel ke membran.
Edward M. Southern
Prinsip kapilaritas, dimana bufer yang merupakan fase gerak akan membawa fragmen DNA dari gel ke membran. Karena
muatan DNA negatif sedangkan muatan membran positif maka fragmen DNA akan menempel (blot) pada membran. Membran
yang digunakan membran nitroselulosa.
Contoh Studi Kasus dengan menggunakan Alel Spesifik Oligonukleotida (ASO)
Silsilah disamping merupakan silsilah parental penderita Cystic Fibrosis Allele yang terjadi karena ada delesi pada 3 basa nukleotida (AGA) alel urutan 508.
Next…
Sesuai Hukum Mendel ada segregasi diantara gen-gen tersebut sehingga memunculkan sifat yang bervariasi
Genotipe homozigot dominan
Genotipe homozigot resesif
Genotipe heterozigot
Next…
Dalam kasus Cystic Fibrosis tersebut 1. genotipe homozigot dominan memunculkan
fenotipe normal, 2. genotipe homozigot resesif memunculkan fenotipe
Cystic Fibrosis, 3. genotipe heterozigot memunculkan fenotipe
normal namun membawa gen Cystic Fibrosis (carier)
Next…
Dalam silsilah tersebut, sepasang parental memiliki tiga keturunan, 2 diantaranya normal dan 1 diantaranya mengalami cystic fibrosis. Untuk mengidentifikasi apakah kedua anak tersebut membawa gen cystric fibrosis (carrier), maka dilakukan analisis menggunakan southern blot dengan ASO sebagai probenya.
1. Genom DNA utuh2. Digesti DNA dengan
enzim retriksi enzim endonuklease
3. Elektroforesis dengan Gel Agarose
4. Transfer dari gel ke membran nitroselulase
5. Hibridisasi dengan probe ASO radioaktif autoradiogram membran
Metode Southern Blot menggunakan Membran Nitroselulosa
Hasil analisis…
Didapatkan hasil bahwa kedua parental genotipnya heterozigot, dilihat pada kedua kromosom baik yang normal maupun yang
delesi berpendar. Satu anak mengalami CF, dilihat pada kromosom yang mengalami delesi berpendar.Satu anak normal homozigot, dilihat pada kromosom normal berpendar sedangkan kromosom delesi tidak berpendar.Satu anak normal heterozigot, dilihat pada kedua kromosom baik normal ataupun yang terdelesi berpendar.
Ket : = Menderita Cystic Fibrosis
L/O/G/OL/O/G/O
Thank You!www.themegallery.com