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Tema 12: Genómica

Griffiths AJ et al., (2000)Klug WS y Cummings MR (2006)

Links to Animal Genomic Research web site and Database Resources

http://www.genome.iastate.edu/resources/other.html

Inma Martín-Burriel: minma@unizar.es

Contenidos

• Introducción• Genómica estructural

– Polimorfismos del DNA: tipos, metodología de estudio

– Aplicaciones de los polimorfismos• Genómica funcional

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Definiciones

• Genómica es el conjunto de ciencias y técnicas dedicadas al estudio integral del funcionamiento, el contenido, la evolución y el origen de los genomas. Es una de las áreas más vanguardistas de la Biología. La genómica usa conocimientos derivados de distintas ciencias como son: biología molecular, bioquímica, informática, estadística, matemáticas, física, etc.

• Genomics is a discipline in genetics concerning the study of the genomes of organisms. The field includes intensive efforts to determine the entire DNA sequence of organisms and fine-scale genetic mapping efforts. The field also includes studies of intragenomic phenomena such as heterosis, epistasis, pleiotropy and other interactions between loci and alleles within the genome.

Historia de la Genómica

• 1977: Secuenciación completa del genoma de 5.400 nt del virus ØX174 (Sanger et al.)

• Desarrollo de métodos de secuenciación: secuencia de genomas eucarióticos.

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1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert

Métodos de terminación de la cadena o método de Sanger

Pirosecuenciación

Secuenciación a gran escala (NGS)

GENÓMICA

Estructural Funcional

Comparativa

Compara genomas de diversas especies para elucidar las relaciones funcionales y evolutivas.

Desarrollo de organismos modelo de enfermedades

Secuenciadescubrimiento

genes, localización

Función de los genes

Regulación

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Genómica

• ESTRUCTURAL:– Caracterización de la

naturaleza física de genomas completos

• FUNCIONAL:– Caracterización del

proteoma y de los patrones globales de expresión génica

Caracterización molecular de genomas completos

DNA eucariótico

Genes funcionales de copia única

DNA de secuencia repetida DNA separador

Secuencias funcionales Secuencias sin funciónconocida

Secuencias funcionalesNo codificantes

Familias de genes codificantes(y pseudogenes asociados)

Familias de genes dispersos

Familias de genes en tándem

Repeticiones heterocromatinaDel centrómero

VNTR

Secuencias derivadasDe transposiciones

Transposones

Retrotransposones

Clasificación del DNA eucariota

Genómica estructuralCaracterización de la naturaleza física de genomas:

- Polimorfismos del DNA

- Cartografía

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Polimorfismo genético

• Polimorfismo bioquímico:– Detección de variación al nivel del

producto del gen: proteínas, enzimas

• Polimorfismos del DNA:– Variaciones presentes en la secuencia de

bases• Polimorfismos producidos por

mutaciones puntuales• Polimorfismos del número de

repeticiones en tándem

Polimorfismo: Variante genética que aparece en la población con una frecuencia > 1%

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/P/Polymorphisms.html

http://www.chinaphar.com/1671-4083/25/986.htm

http://www.systemsbiology.org/technology/data_generation/Microsatellite

VNTR Tamaño (Kb)

Unidad repetición

Método detección

Satélites 100-500 20 kb Centrifugación ClCsElec. campos pulsados

Minisatélites 0,1-20 20-40 pb Elec. Agarosa Southern

Microsatélites pb 1-4pb Elec. AcrilamidaSecuenciación

Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem

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• DNA microsatélite (STR): – Short Tandem Repeat– Pequeñas formaciones (generalmente < 150pb) de

repeticiones en tándem de secuencias muy simples (de 1 a 4 nucleótidos)

– Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número medio de alelos 10)

– Herencia mendeliana codominante

CA CA CA CA CA CA

CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA

Alelo 1

Alelo 2

Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem

• Visualización de los microsatélites

ACGT

Secuenciación:Genotipado:

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• Implicaciones de las secuencias microsatélites en patologías:– Expansión de microsatélites de trinucleótidos:

• Síndrome de X frágil (FMR-1) (CCG)n• Distrofia miotónica (DM) (CTG)n• Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n• Ataxia de Friedreich (FA)• Nueve formas de ataxia espinocerebelar

(SCA)–Expansión de tetranucleótidos: DM2–Expansión de pentanucleótidos: SCA10

Enfermedades humanas se han creado animales modelo

Secuencias de DNA dispersas

¿DNA basura? ¿DNA egoista?- ¿Regulación de la expresión?- ¿Puntos de recombinación?- Control de la segregación de cromosomas (centrómeros)- Estabilización de los cromosomas en la replicación (telómeros)

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ENCODE: Encyclopedia of DNA Elements:- Protein or non-coding RNA- Protein binding- Specific chromosome

structure

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• Variación de un nucleótido en una posición determinada.• Frecuencia:1/1000pb• También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)

Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales

1. Cambios de bases:a. Transiciones:

i. Purina Purina:

ii. Pirimidina Pirimidina:

b. Transversionesi. PurinaPirimidina:

ii. Pirimidina Purina

Alelo 1Alelo 2

TACGAGCTATACGGGCTA

A G Purinas

T C Pirimidinas

• SNP: Single Nucleotide Polymorphisms:– Polimorfismo muy frecuente (1/300 pb)– 10 a 30 millones de SNP en el genoma

humano– Dos posibles alternativas en cada individuo– Herencia es muy estable (baja tasa de

mutación 10-6 vs 10-3 de los microsatélites)– Fácil estandarización– Aplicaciones en la determinación de

enfermedades y en farmacogenética

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• Detección de los SNP:– RFLP:

• Southern Blot

• PCR + RFLP

– Secuenciación

– Minisecuenciación

– Sondas específicas

– SSCPs

– PCR en tiempo real…

• RFLPs– Detección mediante

enzimas de restricción:

• Southern Blot

• PCR+RFLP

– Normalmente determinados en exones

RFLPs-SNP

• Origen: mutaciones puntuales• Variabilidad: 2 alelos• Localización: exones, intrones, regiones reguladoras, DNA espaciador

Detección de mutaciones puntuales

RFLP:Alelo 1Alelo 2

TGGACGTCTTGGATGTCT

MCL1

Aat II

Alelo 1 Alelo 2Sonda

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Detección de mutaciones puntuales

Minisequencing

Marcador del DNA (genético)• Gen o secuencia de DNA cuya

localización en el genoma se conoce.

• Características:– Tienen que ser polimórficos (en la población).

– Si es un gen no interesa la función sino las variaciones en el DNA (que pueden reflejarse en diferencias funcionales) (ej. Grupo sanguíneo). HAY POCOS GENES MARCADORES.

– Las variaciones en un segmento de DNA se transmiten según las reglas Mendelianas de codominancia. HAY MUCHAS SECUENCIAS MARCADORES.

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Tipos de marcadores

• SNP (or Single nucleotide polymorphism)• RFLP (or Restriction fragment length polymorphism)• RAD markers (or Restriction site associated DNA markers)• AFLP (or Amplified fragment length polymorphism)• VNTR (or Variable number tandem repeat)• Microsatellite polymorphism, SSR (or Simple sequence repeat)• STR (or Short tandem repeat)• SSLP (or Simple sequence length polymorphism)• RAPD (or Random amplification of polymorphic DNA)• SFP (or Single feature polymorphism)• DArT (or Diversity Arrays Technology)

• Aplicaciones de los polimorfismos del DNA:–Diagnóstico genético– Identificación individual –Construcción de los mapas génicos–Ligamiento con fenotipos

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Diagnóstico genético indirecto:Análisis de marcadores genéticos

XGen alterado

Marcador polimórfico

Mutación puntualMicrosatéliteRFLPDeleciónInserción

Genotipo del marcador Genotipo del gen dañado

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Identificación individual:•Marcadores fenotípicos (HLA, Gr. Sanguíneos) •Análisis de marcadores microsatélites

•PCR, secuenciación• Fingerprinting (minisat.)

Detección mediante RFLP + Southern

Microsatélites Minisatélites

Control de filiaciónControl de libros genalógicos

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• Mapas del genoma:–Mapa genético

• Posiciones relativas de los genes entre si, sin anclaje físico

• Distancia entre marcadores determinada por la frecuencia de recombinación en la meiosis

–Mapa físico• Posición exacta de un gen• Distancia entre marcadores determinada por

nº de pb

Secuenciación de genomasConstrucción de librerías PCR en puente

Secuenciación por síntesis

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Análisis bioinformático (NGS)

- Preprocesado de las secuencias- Control de calidad- Alineamiento de secuencias: formación de contigs- Alineamiento con las referencias- Búsqueda de variantes

Ligamiento con fenotipos

• Ligamiento:– Identificación de regiones

del genoma con un nº de alelos compartidos en individuos afectados > al esperado (en familias)

– Análisis de 500 pols– Regiones candidatas y

acotamiento de la región– Alelos raros de alto riesgo

• Asociación:– Análisis de individuos

afectados no emparentados e identificación de alelos compartidos

– Facilidad para la obtención de muestras

– Necesidad de analizar miles de marcadores

– Alelos de acción modesta en enfermedades comunes

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Secuenciación del Exoma

- Alineamiento con secuencias de referencia- Eliminación de variantes comunes (dbSNP, HapMap8)

- Secuenciando 3 o 4 individuosmutación causante- Riesgo de falsos negativos

- Estudio de ligamiento + NGS (secuenciando familia e identificando los fragmentos cromosómicos heredados de los padres)

- Confirmación con pruebas bioquímicas y funcionales

Genómica funcional

• Los datos de la secuenciación a gran escala son el punto de partida de la genómica funcional

• Búsqueda de ORF en secuencias de DNA desconocidas

• Identificación de su función• Empleo de chips (microarrays) de

DNA para estudio de regulación génica

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Chips de DNA

• Muestras de DNA ordenadas, unidas a un chip de cristal del tamaño de un cubreobjetos

• En un chip puede haber miles de muestras (cDNA de genes conocidos)

• Los chips se exponen a muestras de mRNA marcados procedentes de distintos tejidos (distinta fase de desarrollo, tumoral vs normal, etc.)

• Se miden variaciones en la expresión de los tejidos

Algorithm overview, for paired-end RNA-Seq.

Lee S et al. Nucl. Acids Res. 2010;nar.gkq1015

© The Author(s) 2010. Published by Oxford University Press.

RNAseq

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Aplicaciones de la Genómica

• Conocimiento y comprensión de procesospatológicos

• Precisión de diagnóstico:– Clasificación más fina (cáncer de colon, piel)– “Farmacogenómica” respuesta individual a

tratamientos, elección de quimioterapia• Evaluación correcta del riesgo genético:

– Predicción de la agresividad tumoral• Prevención conocido el riesgo genético

– Comenzar planes de vigilancia en riesgo de cáncer, hipercolesterolemia, hemocromatosis,..

• Análisis de recién nacidos• Detección de portadores• Desarrollo de terapias:

– Terapia génica: reemplazar un gen alterado por el gen funcional

– Terapia basada en la genética: • Diseño de nuevas drogas• Tratamientos basados en las bases moleculares• Elección del tratamiento

• Identificación de genes con interés en producción.

Implicaciones del conocimiento del genoma

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Videos de genómica

http://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhMhttp://www.youtube.com/watch?v=ePFE7yg7LvM&feature=relatedhttp://www.youtube.com/watch?v=AhnTT6-Jgcg&feature=relatedExon Sequencinghttp://www.youtube.com/watch?v=ZY_vPbpPnrc&sns=em

Microarray: