Terjemahan UTS Biotech

7/17/2019 Terjemahan UTS Biotech

http://slidepdf.com/reader/full/terjemahan-uts-biotech 1/6

Angela Violita

Pemurnian L-asparaginase dari Bakteri Erwina carotovora

Dan Efek dari Turunan Dihidropirimidin dalam Beberapa Parameter Kinetiknya

L-asparaginase menunjukkan aktivitas antileukemia dan secara umum diatur dalam tubuh yang

dikombinasikan dengan obat antikanker lain seperti turunan pirimidin Dalam penelitian ini! L-asparaginase

dimurnikan dari bakteri Erwinia carotovora dan efek dari turunan dihidropirimidin "#-amino-$-metil-%-fenil-&-

tiokso! #!&!'!%-tetrahidropirimidin-(-asam karboksilat metil ester) dipelajari parameter kinetik K m dan V max dari

en*im menggunakan L-asparaginase sebagai substrat En*im memiliki aktivitas optimum pada p+ ,$ dan suhu

'( .! baik dengan ada/tidaknya turunan pirimidin dan konsentrasi jenuh substrat pada $ mg/ml 0ntuk reaksi

en*imatik! baik dengan ada/tidaknya turunan dihidropirimidin "#-' mg/ml)! nilai K m 1 2#%! (&$! %3! dan (&&

4! dan nilai V max 1 33(! 33'(! 33&2 dan 33&# mg/ml/min 5ilai kinetik menunjukkan bah6a aktivitas en*im

meningkat dengan keberadaan turunan dihidropirimidin

Kata kunci: Erwinia carotovora! aktivitas L-asparaginase! turunan dihidropirimidin

L-asparaginase turunan pirimidin telah lama dianggap sebagai komponen yang penting dalam

penanganan leukemia limfoblastik akut pada anak-anak Efek antileukemia tersebut

berhubungan dengan ketidakmampuan sel blast untuk mensintesis asparagin dari asam

aspartate 7el tumor limfatik membutuhkan jumlah asparagin yang besar untuk tumbuh

dengan cepat "sel tumor ganas) 8leh karena itu! pera6atan antileukemia dengan L-

asparaginase bertujuan untuk menghilangkan kadar asparagin dalam darah 7ecara umum!

pera6atan leukemia melibatkan kombinasi kemoterapi dengan beberapa obat antikanker yang

berbeda

L-asparaginase didapatkan dari bakteri E. coli dan Erwinia carotovora yang memiliki

sifat antilimfoma dan karakterikstik dari L-asparaginase E. coli telah dilaporkan sebelumnya

Pirimidin! bagian dari asam nukleat! juga menunjukkan aktivitas antivirus! antibakteri! dan

antikanker! tergantung dari posisi dan tipe substituen yang terikat pada cincin pirimidin

Konjugasi L-asparaginase dengan obat-obatan antikanker seperti turunan dihidropirimidin

mempengaruhi afinitas pada substrat L-asparagin 5amun! karakteristik dan efek dari turunan

dihidropirimidin terhadap aktvitas L-asparaginase dari E. carotovora belum dipelajari lebih

lanjut

Dalam penelitian ini! telah dilakukan pemurnian L-asparaginase dari E. carotovora

dan efek dari turunan dihidropirimidin "#-amino-$-metil-%-fenil-&-tiokso! #!&!'!%-

tetrahidropirimidin-(-asam karboksilat metil ester) telah dipelajari berdasarkan aktivitas

en*im dengan menentukan parameter kinetik K m dan V max pada p+ dan suhu yang berbeda-

beda



Angela Violita

Bahan dan Metode

7emua bahan kimia diperoleh dari 7 D 9ine-.hem Ltd! 4umbai! :ndia dan digunakan

tanpa proses pemurnian lebih lanjut kecuali dinyatakan lain

Isolasi, ekstraksi dan pemurnian L-asparaginase dari bakteri

Erwinia carotova "4T..! #%&,) diperoleh dari :nstitute of 4icrobial Technology!

.handigarh! :ndia digunakan sebagai sumber L-asparaginase Bakteri ditumbuhkan dalam

nutrient broth "+i4edia 4v 3,,) yang mengandung ekstrak daging sapi "'3 g)! 5a.l "(3 g)

dan pepton "(3 g) dalam #333 ml akuades 4edia disterilisasi pada #( Lbs selama #( menit

pada suhu #&# . menggunakan autoklaf

7ebanyak # ose kultur bakteri pada media miring dipindahkan ke dalam #33 ml media

"5B) steril secara aseptis 4edia diinkubasi pada suhu &( .! secara terus-menerus selama 2

hari p+ media diukur setiap hari dan jika berubah! dikembalikan pada p+ $; dengan

penambahan basa "3# 5 5a8+) tetes demi tetes 7etelah pertumbuhan kultur bakteri

optimum! nutrient broth disaring menggunakan kertas saring "<hatman 5o #) dan filtrat

disentrifugasi dalam keadaan dingin dengan kecepatan #(!333 rpm selama #( menit! untuk

menghilangkan sel bakteri 7etelah itu! supernatan yang jernih dikumpulkan dan ditambahkan

amonium sulfat dengan konsentrasi yang berbeda-beda! yaitu (3! $3! ,3! dan #33= "b/v)

Endapan dingin dari konsentrasi amonium sulfat yang berbeda-beda dikumpulkan dengan

sentrifugasi dingin pada kecepatan &3!333 rpm selama #( menit dan menempatkan media

dalam lemari pendingin selama semalam 7etelah itu disentrifugasi kembali dengan

kecepatan &3!333 rpm selama #( menit pada suhu % . dan en*im diperoleh dalam bentuk

pellet Pellet dilarutkan dalam &( ml buffer Tris-+.l "3# 4! p+ ,$) dan didialisis dengan

buffer Tris-+.l "33# 4! p+ ,$) selama %, jam En*im yang didialisis "dihilangkan

garamnya) dikumpulkan dan dikromatografi dengan kromatografi pertukaran anion "anion-

exchange)

Kromatografi pertukaran anion DEAE-selulosa

Kromatografi kolom "&>%3 cm) dikemas dalam DE?E-selulosa dan disetimbangkan

dengan 3# 4 buffer Tris-+.l yang mengandung & m4 4g.l& "p+ ,$) En*im yang telah

diperoleh dari dialisis "&( ml) dimasukkan ke atas kolom dan dieluasi dengan #3 L gradien

linier buffer Tris-+.l yang mengandung 5a.l "3-# 4) pada suhu kamar Laju alir dari kolom



Angela Violita

diatur menjadi # ml/min 9raksi dikumpulkan dan diamati terus-menerus untuk menentukan

isi dari protein pada eluen "&,3 nm 0@/vis 7chimad*u) 7ebanyak #( ml fraksi dikumpulkan

dan diuji protein dan aktivitas en*imnya

enentun protein

9raksi yang dielusi dari kolom pertukaran anion DE?E-selulosa "diamati pada &,3

nm) digunakan untuk penentuan kuantitatif protein menggunakan serum albumin bovine

sebagai standar dan isi protein ditemukan sebanyak 3# mg/ml Kemurnian dicek dengan

menerapkan #3 = 7D7-P?AE dan didapat massa molekul sebesar ''( kD

!intetis turunan dihidropirimidin

Turunan dihidropirimidin #-amino-$-metil-%-fenil-&-tiokso! #!&!'!%-

tetrahidropirimidin-(-asam karboksilat metil ester disintesis berdasarkan metode yang telah

dijelaskan sebelumnya 7ecara ringkas! campuran turunan ben*aldehid "3# mole! #3$ g)

dengan sebagai substituen! &-.l! %-.l! ester asetoasetat "33# mole! #'3 g) dn

thiosemicarba*ide "33# mole! #3$ g) dalam etil alkohol absolut "#( ml) dan sejumlah katalis

piperidin direfluks selama % jam .ampuran reaksi didinginkan dan dituang di atas es Bagian

yang memadat dipisahkan dan disaring dalam tekanan yang lebh rendah! dikeringkan dan

rekristalisasi dari metanol "tl 1 &#, .! rendemen 1 ,(=! mol formula 1 . #%+#$ 5'8&7)+asil mempunyai karakteristik sebagai #-amino-$-metil-%-fenil-&-tiokso! #!&!'!%-

tetrahidropirimidin-(-asam karboksilat metil ester! atas dasar karakteristik spektrum



Angela Violita

Karakteristik spektrum

engu"ian akti#itas en$im

L-asparaginase mengkatalis hidrolisis dari L-asparagin menjadi L-asam aspartat dan

amoniak 8rganisme uji ditumbuhkan dalam nutrient broth yang mengandung L-asparagin

dan indikator p+ fenol hipoklorida 7elama inkubasi pada suhu &( .! amoniak yang

dilepaskan bereaksi dengan fenol hipoklorida menghasilkan 6arna biru! yang

mengindikasikan terbentuknya L-asparaginase 7atu unit L-asparaginase didefinisikan

sebagai jumlah en*im yang dibebaskan # um amoniak/menit dalam kondisi uji

?ktivitas L-asparaginase ditentukan dalam buffer Tris-+.l "rentang p+ ,3-;&) dan

pada suhu (-(( . Larutan L-asparagin "$ mg/ml)! substrat untuk L-asparaginase disiapkan

dalam akua bidestilasi .ampuran reaksi disiapkan dengan mengambil #3 ml dari masing-

masing en*im! asparagin! larutan kromogen "3&(= phenol red)! buffer Tris-+.l dan volumeditambah hingga ( ml dengan akuades .ampuran reaksi diinkubasi paada suhu '( . selama



Angela Violita

#( menit dan setelah itu tambahkan #3 ml 3$$ 5 +&78% Tingkat pelepasan amoniak

ditentukan dari kurva standar amonium sulfat pada absorbansi ($3 nm

enentuan parameter kinetik K m dan V max

5ilai K m dan V max ditentukan dalam ada/tidaknya turunan dihidropirimidin dengan

meningkatkan volume aparagin "#3 menjadi #33 ml) Dalam campuran reaksi! volume en*im

yang telah dimurnikan! kromogen! +&78%! akuades dan turunan dihidropirimidin "# mg/ml)

sebanyak #3 ml dan ditambahkan buffr Tris-+.l hingga volume (3 ml 5ilai K m dan V max

ditentukan dalam ada/tidaknya turunan dihidropirimidin "#-' mg/ml) menggunakan

Line6eaver-Burk double-reciprocal plot

%asil dan embahasan

L-asparaginase! en*im terapeutik penting! telah diisolasi dari beberapa sumber

5amun! hanya asparaginase dari E. coli dan E. carotovora yang menunjukkan aktivitas

sebagai antitumor Dalam penelitian ini! en*im dimurnikan dari E. carotovora menggunakan

dialisis dan kromatografi pertukaran anion ?ktivitas en*im ditentukan dengan menentukan

L-asparagin sebagai substrat dan didapatkan hasil sebesar 3'# mg/ml/min "tabel #)

Pengaruh dari p+ dan suhu aktivitas en*im telah dipelajari dalam keadaan ada/tidaknya

turunan dihidropirimidin ?ktivitas en*im ditentukan dalam rentang p+ ,3-;& denganinterval 3& dan pada suhu antara (-(( . dengan interval #3 . p+ optimal dari L-

asparaginase adalah ,$ "tabel &) En*im aktif antara suhu (-(( . dan suhu optimalnya

adalah '( . "tabel ')

+asil membuktikan bah6a dalam ada/tidaknya "#-' mg/ml) turunan dihidropirimidin

dalam media reaksi! nilai Km 2#%! (&$! %3 dan '&& 4! dimana nilai @ma> dihitung sebesar

33(! 33'(! 33&2 dan 33&# mg/ml/min Penurunan nilai Km dengan peningkatan

konsentrasi turunan dihidropirimidin mengindikasikan bah6a L-asparaginase mempunyai

afinitas lebih tinggi terhadap substrat "L-asparagin) dalam keberadaan tuunan

dihidropirimidin Penurunan nilai @m> diamati setelah penambahan turunan dihidropirimidin

mengindikasikan perubahan pada keadaan "microenvironment ) dari en*im

Penurunan nilai Km mungkin dikatikan dengan kenyataannya bah6a turunan

dihidropirimidin mungkin terikat pada salah satu monomer L-asparaginase! en*im oligomer

yang tergantung pada keberadaan K C! sehingga mempengaruhi konformasinya secara

menguntungkan dengan menaikkan aktivitasnya 7tereokimia antara gugus aril dan cincin



Angela Violita

dihidropirimidin ditemukan menjadi salah satu faktor yang mempunyai efek nyata dalam

aktivitas hidrolitik 7elain itu! dalam konformasi ikatan en*im-turunan dihidropirimidin

cincin aril yang tersubstitusi " 1 &-.l! %-.l) mungkin diposisikan di aksial atau tegak lurus

pada cincin dihidropirimidin dengan %-aril tersubstitusi ! sehingga mengadopsi pedoman

syn-periplanar "relatif terhadap .%-+)

Documents

Terjemahan UTS Biotech