TES ELISA

TES ELISAELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) atau 'penetapan kadar imunosorben taut-enzim' merupakan uji serologis yang umum digunakan di berbagai laboratorium imunologiJENIS ELISA1. competitive assay yang menggunakan konjugat antigenenzim atau konjugat antobodienzim.2. non-competitive assay yang menggunakan dua antibodi. Pada ELISA non-competitive assay, antibodi kedua akan dikonjugasikan dengan enzim sebagai indikator.JENIS METODE TES ELISAINDIRECT ELISASANDWICH ELISAKOMPETITIF ELISAPROSEDUR INDIRECT ELISA1) Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.2) Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.3) Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.4) Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, 5) Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.6) Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.7) Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.8) Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya.

KELEBIHAN DAN KEKURANGAN INDIRECT ELISAEnzim bertindak sebagai amplifier, meski sedikit antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang.

PROSEDUR SANDWICH Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi penangkapSemua non spesifik binding sites pada permukaan diblokirSampel berisi antigen dimasukkan dalam platePlate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikatAntibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigenAntibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi primerPlate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuangDitambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimiaDiukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen

Kelebihan dan kekurangan sandwichKelebihan:kemampuannya menguji sampel yang tidak murni.mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Kerugian : Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasiPROSEDUR METODE KOMPETITIFAntibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennyaKomplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi antigenPlate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisiDitambahkan antibodi sekunder yang spesifik ubntuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini berpasangan dengan enzimSubstrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik/ fluoresensi. Kelebihan dan Kekurangan metode KompetitifDalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal,semakin lemah sinyal yang dihasilkan. Mekanisme kerja

Alat tes elisa