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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

Programa de Pós-Graduação em Fisiologia Vegetal

TESE

Cultivo in vitro de Pyrus sp.,

cultivares Carrick, Cascatense e Ya-Li.

ILDA MARICLEI DE CASTRO DA SILVA

Pelotas, 2013

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ILDA MARICLEI DE CASTRO DA SILVA

Cultivo in vitro de Pyrus sp.,

cultivares Carrick, Cascatense e Ya-Li.

Orientador: Prof. Dr. José Antonio Peters

Co-orientadores: Dr. Leonardo Ferreira Dutra

Prof. Dr. Valmor João Bianchi

Profa. Dra. Eugenia Jacira Bolacel Braga

Pelotas, 2013

Tese apresentada à Universidade Federal de Pelotas, sob a orientação do Prof. Dr. José Antonio Peters, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Fisiologia Vegetal, para a obtenção do título de Doutor em Fisiologia Vegetal.

Dados de catalogação na fonte: Ubirajara Buddin Cruz - CRB 10/901 Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel

S586c Silva, Ilda Mariclei de Castro da

Cultivo in vitro de Pyrus sp., cultivares Carrick, Cascatense e Ya-Li / lda Mariclei de Castro da Silva. – 85f. ; il. – Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação em Fisiologia Ve-getal. Universidade Federal de Pelotas. Instituto de Biologia. Pelotas, 2013. – Orientador José Antonio Peters; co-orientador Leonardo Ferreira Dutra, Valmor João Bianchi e Eugenia Jacira Bolacel Braga.

1.Fisiologia vegetal. 2.Pereiras. 3. Micropropagação.

4.Reguladores de crescimento. 5.Radiação gama. 6.Mutação. I.Peters, José Antonio. II.Dutra, Leonardo Ferreira. III.Bianchi, Valmor João. IV.Braga, Eugenia Jacira Bolacel. V.Título.

CDD: 634.13

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ILDA MARICLEI DE CASTRO DA SILVA

Banca examinadora:

Prof. Dr. José Antonio Peters – Orientador

Dr. Paulo Celso de Mello Farias – Universidade Federal de Pelotas

Dra. Daiane Peixoto Vargas – Embrapa Clima Temperado

Dra. Ilisandra Zanandrea – Universidade Federal de Pelotas

“...Tenha fé em Deus

Tenha fé na vida

Tente outra vez!...

...Queira!

Basta ser sincero e desejar profundo

Você será capaz de sacudir o mundo

Tente outra vez!...

...Tente

E não diga que a vitória está perdida

Se é de batalhas que se vive a vida

Tente outra vez!...” Raul Seixas

Tente Outra vez

A Deus,

Aos meus avós Marcos (In Memoriam) e Ilda, A meu sobrinho Lorenzo

Ofereço

A meus pais Nelson e Maria José Com carinho,

Dedico

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AGRADECIMENTOS

A Deus, por tudo! Por iluminar meu caminho, dar forças e coragem para lutar

todos os dias.

À Universidade Federal de Pelotas, em particular, ao Programa de Pós-

Graduação em Fisiologia Vegetal, pela oportunidade de realizar o curso.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),

pela concessão da bolsa de estudos.

À Embrapa Clima Temperado, pela possibilidade de realização do projeto,

disponibilização do material vegetal e recursos para a realização dos experimentos.

Ao Centro de Oncologia do Departamento de Radiologia da Faculdade de

Medicina da Universidade Federal de Pelotas, pela irradiação do material vegetal.

Ao Professor Dr. José Antonio Peters, pela orientação, ensinamentos e

disposição, e acima de tudo, pelo apoio e carinho, sendo sempre um „paizão‟.

Ao Professor Dr. Valmor João Bianchi, pela co-orientação, ensinamentos,

sugestões e amizade.

À Professora Dra. Eugenia Jacira Bolacel Braga, pela co-orientação,

sugestões, incentivo e simpatia.

Ao Dr. Leonardo Ferreira Dutra, pela co-orientação, carinho, incentivo e

confiança.

Ao Professor Dr. Willian Barros, pelo apoio estatístico.

A minha amiga, colega de curso e de trabalho, Cristina, pela amizade, parceria,

convivência, conversas, ajuda e „indiadas‟.

A minha amiga Aline, pela grande amizade, conversas, risadas, ajuda, estudos,

momentos que ficarão para sempre guardados.

A minha amiga Janieli, que, mesmo não estando junto, está sempre presente

em meu coração e nas lembranças dos bons momentos durante o mestrado.

Aos estagiários Mara Cintia Winhelmann e Maurício Flores, pela preciosa ajuda

durante a realização dos experimentos.

Às colegas Alítcia e Elisia, pelos momentos de distração, risadas, „papos

cabeça‟ e estudos.

Aos colegas do Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas, no período

desses seis anos, pela convivência e amizades criadas.

Ao pessoal do Laboratório de Cultura de Tecidos da Embrapa, em especial

Nino, Osmi, Falcão, Daiane e Fernanda Thiel.

Ao Pesquisador da Embrapa Clima Temperado José Francisco Pereira, pela

atenção, simpatia, sugestões e auxílio.

Ao Professor Mário Ariel Posada, pela motivação em seguir em frente e buscar,

em Pelotas, os cursos de mestrado e doutorado.

À amiga Cristina Larré, pelo auxílio, troca de ideias e estímulo.

À amiga Claudia Lima, pelo incentivo e conversas.

À secretária do curso, Sandra Sacco da Silva, pela simpatia e disposição de

sempre.

A minha família, meu porto seguro, pra onde eu sei que posso voltar sempre e

terei amor, carinho e incentivo, em especial minha vó Ilda, pelas „rezas‟ e chás,

carinho e ensinamentos; e meus pais, Nelson e Maria José, por terem sempre uma

palavra de apoio, incentivo, coragem; pelo amor imensurável, confiança, orgulho e

por acreditarem em mim.

A minha irmã Juliana, pelo amor, cumplicidade, amizade e incentivo; meu

cunhado, Jiuliano pelo carinho, estímulo e por ser um „irmão‟; e meu sobrinho

Lorenzo, por trazer muita alegria a minha vida.

À amiga e irmã de coração, Sandra, pelo estímulo, força e amizade em todas

as horas.

À amiga Gizele, pela presença constante, tornando meus dias menos solitários,

dividindo despesas, angústias e alegrias.

A minha amiga e comadre Tais, pela amizade e por ter me presenteado com

um afilhado tão mimoso como o João Victor.

A todos, citados aqui ou não, de perto ou de longe, que, de alguma forma,

colaboraram e apoiaram a conclusão desta etapa.

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RESUMO

SILVA, I. M. de C. da. Cultivo in vitro de Pyrus sp., cultivares Carrick,

Cascatense e Ya-Li. 2013. 85f. Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação

em Fisiologia Vegetal. Universidade Federal de Pelotas/UFPel, Pelotas/RS.

No Brasil, entre as frutas de clima temperado, a pera (Pyrus sp.) é a terceira mais

consumida, porém, a maior parte é importada (95%), pois seu cultivo ainda é

pequeno. A falta de cultivares adaptadas às condições edafoclimáticas das regiões

potencialmente produtoras são os principais obstáculos à sua produção sustentável,

em vista que estas cultivares necessitam estar aptas a produzir em quantidade e

qualidade e com regularidade para suprir a demanda do mercado interno. Técnicas

de indução de mutação, como o uso de radiação gama, têm se mostrado eficientes

na produção de variabilidade genética e, por isso, muito utilizadas em programas de

melhoramento de várias espécies de plantas. Em pereira, devido a pouca

variabilidade genética, ciclos longos e alogamia, características estas que dificultam

a obtenção de novas cultivares através do melhoramento convencional, a utilização

da radiação gama pode suprir estas dificuldades. Esta técnica, acoplada à cultura de

tecidos é uma alternativa que permite o desenvolvimento de cultivares específicas,

em um curto espaço de tempo, em larga escala e com alta qualidade sanitária.

Porém, para viabilizar a utilização da propagação in vitro se faz necessária a

obtenção de protocolos de propagação. Neste contexto, o trabalho teve como

objetivo otimizar o cultivo in vitro de três cultivares de pereira (Pyrus sp.): Carrick,

Ya-Li e Cascatense (cultivar lançada recentemente pelo Programa de Melhoramento

Genético da Embrapa Clima Temperado), visando potencializar sua produção e a

indução de mutações, almejando selecionar novos genótipos com características de

interesse, a partir dos genótipos originais. O estudo foi conduzido em experimentos

que buscaram multiplicar in vitro as cultivares acima citadas, bem como irradiar e, a

partir disso, micropropagar a cv. Ya-Li. Para a realização dos experimentos foram

utilizados segmentos nodais (1,0 cm) contendo de duas a três gemas axilares.

Visando a obtenção de um protocolo eficiente de multiplicação in vitro, os explantes

foram inoculados em diferentes meios de cultivo e concentrações de sais, BAP e

sacarose. Para verificar os efeitos de diferentes doses de radiação gama (0, 10, 20,

30 e 40 Gy) durante a micropropagação, foram realizados experimentos de

multiplicação e enraizamento in vitro e aclimatização. Os resultados obtidos

evidenciaram que a multiplicação in vitro da cultivar Carrick pode ser potencializada

com o uso do meio MS Himédia comercial, com suplementação de 1,2 mg L-1 de

BAP e 30 g L-1 de sacarose, enquanto que o meio mais adequado para a

multiplicação in vitro da cultivar Ya-Li é o MS, com 1,2 mg L-1 de BAP e 45 g L-1 de

sacarose. Para a „Cascatense‟, o MS Himédia, suplementado de 0,8 mg L-1 de BAP

e 30 g L-1 de sacarose foi o que apresentou melhores respostas. Em relação ao uso

de irradiação, a radiação gama induziu alterações morfofisiológicas nos explantes da

cultivar Ya-Li, durante a micropropagação, sendo que estas podem ser devido a

variações epigenéticas e/ou genéticas (herdáveis). Desta forma, baseando-se nos

resultados do presente estudo, devido à obtenção de altas taxas de multiplicação in

vitro a partir da otimização dos protocolos, verifica-se que é possível multiplicar as

três cultivares em larga escala, bem como obter possíveis mutantes da cv. Ya-Li via

irradiação com raios gama. Porém, para determinar se as alterações

morfofisiológicas encontradas são positivas ou negativas e se transmitem pela

progênie, ainda se fazem necessárias pesquisas futuras nos materiais obtidos.

Palavras-chave: Pereiras. Micropropagação. Reguladores de crescimento.

Radiação gama. Mutação.

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ABSTRACT

SILVA, I. M. de C. da. In vitro Cultivation of Pyrus sp., cultivars Carrick,

Cascatense and Ya-Li. 2013. 85f. Thesis (Doctorate) – Plant Physiology Post

Graduation Program. Federal University of Pelotas/UFPel, Pelotas/RS.

In Brazil, among the temperate climate fruit, the pear (Pyrus sp.) is the third more

commonly consumed although most of it is imported (95%) as its cultivation is still in

small-scale. The lack of cultivars adapted to the soil and climate conditions of

potentially productive regions is the main obstacle for its sustainable production, as

these cultivars need to be apt to produce in regularly, with a considerable quality and

amount to supply the demand of the of the internal market. Mutation induction

techniques, such as the use of gamma radiation, have been quite efficient in the

production of genetic variability and, thus, are very used in improvement programs of

several species of plants. In pear trees, due to the little genetic variability, long cycles

and cross-pollination, characteristics which make it more difficult to obtain new

cultivars through the conventional improvement, the usage of the gamma radiation

may fulfill these difficulties. This technique, along the tissue culture is an alternative

which enables the development of specific cultivars, in a short term, in large scale

and with a high health quality. However, to help the usage of in vitro propagation it is

necessary to obtain propagation protocols. In this context, the present work aimed to

optimize the in vitro and ex vitro cultivation of three pear cultivars (Pyrus sp.): Carrick,

Ya-Li and Cascatense (a cultivar recently launched by the Genetic Improvement

Program from Embrapa Temperate Climate), in order to foster its production and the

mutations induction, aiming to select new genotypes with interest characteristics,

from the original genotypes. The study was conducted in experiments which focused

on multiplying in vitro the cultivar mentioned above, as well as radiate and, from this,

micropropagation the cv. Ya-Li. For the carrying out of the experiments, nodal

segments were used (1,0 cm) with two to three axilliary gems. To reach an efficient

protocol of multiplication in vitro, the explants were inoculated in different cultivation

means and salt concentrations, BAP and sucrose. To check the effects of different

dosage of gamma radiation (0, 10, 20, 30 and 40 Gy) during the micropropagation,

were carried experiments out of multiplication and rooting in vitro and

aclimmatization. The results obtained showed that the multiplication in vitro of the

cultivar Carrick can be fostered by using MS commercial Himédia, with

supplementation of 1,2 mg L-1 of BAP and 30 g L-1 of sucrose, while the most

appropriate mean for the multiplication in vitro of the cultivar Ya-Li is the MS, with 1,2

mg L-1 of BAP and 45 g L-1 of sucrose. For the „Cascatense‟, the MS Himédia,

supplemented by 0,8 mg L-1 of BAP and 30 g L-1 of sucrose presented the best

responses. Concerning the use of irradiation, the gamma radiation led to

morphological changes in the explants of the cultivar Ya-Li, during the

micropropagation, being that these might be due to epigenetic and/or genetic

(inheritable) changes. Thus, based on the results of this study, due to obtaining high

rates of in vitro multiplication from the optimization of protocols, it appears that is

possible to multiply the three cultivars on a large scale, as well as possible to obtain

mutants of cv. Ya-Li via gamma radiation. However, to determine whether the

morphological changes found are positive or negative and is transmitted by the

progeny, although future research is needed in the materials obtained.

Key words: Pear trees. Micropropagation. Plant growth regulators. Gamma

radiation. Mutation.

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LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 1

Figura 1 Número de brotações por explante (A), comprimento das brotações (B), número de gemas axilares por brotação (C), massa fresca e massa seca das brotações (g) (D e E), respectivamente, de pereira, cvs. Ya-Li e Carrick, submetidos a diferentes meios de cultivo e concentrações de sais...................................................................................

27

Figura 2 Número de brotações por explante (A), comprimento das

brotações (B), número de gemas axilares por brotação (C), massa fresca e massa seca das brotações (g) (D e E), respectivamente, de pereira, cvs. Ya-Li e Carrick, submetidos a diferentes concentrações de BAP (mg L-1)....

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Figura 3 Número de brotações por explante (A), comprimento das

brotações (B), número de gemas axilares por brotação (C), massa fresca e massa seca das brotações (g) (D e E), respectivamente, de pereira, cvs. Ya-Li e Carrick, submetidos a diferentes concentrações de sacarose (g L-

1)............................................................................................

31

Figura 4 Número de brotações por explante (A), comprimento das

brotações (B), número de gemas axilares por brotação (C), massa fresca e massa seca das brotações (g) (D e E), respectivamente, de pereira, cvs. Ya-Li e Carrick, submetidos a diferentes concentrações de BAP (mg L-1)....

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Figura 5 Brotações de Pyrus sp., cvs. Ya-Li e Carrick, obtidas após

serem submetidas a diferentes meios de cultivo e concentrações de sais (A e B), concentrações de BAP (C, D, E e F) e concentrações de sacarose (G e H), respectivamente....................................................................

35

CAPÍTULO 2

Figura 1 Número de brotações por explante (A), comprimento das brotações (B), número de gemas axilares por brotação (C), massa fresca e seca das brotações (g) (D e E), respectivamente, de pereira, cv. Cascatense, submetidos a diferentes meios de cultivo e concentrações de sais........

50

Figura 2 Número de brotações por explante (A), comprimento das

brotações (B), número de gemas axilares por brotação (C), massa fresca e seca das brotações (g) (D e E), respectivamente, de pereira, cv. Cascatense, submetidos a diferentes concentrações de BAP (mg L-1)........................

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Figura 3 Número de brotações por explante (A), comprimento das

brotações (B), número de gemas axilares por brotação (C), massa fresca e seca das brotações (g) (D e E), respectivamente, de pereira, cv. Cascatense, submetidos a diferentes concentrações de sacarose (g L-1)....................

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Figura 4 Brotações de Pyrus sp., cv. Cascatense, obtidas após

serem submetidas a diferentes meios de cultivo e concentrações de sais (A), concentrações de BAP (B) e concentrações de sacarose (C)............................................

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CAPÍTULO 3

Figura 1 Percentagem de explantes sobreviventes (A) e regenerantes (B), número de brotações por explante (C), número de gemas axilares por brotação (D) e comprimento das brotações (E) de pereira, cv. Ya-Li, submetidos a diferentes doses de radiação gama......................................

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Figura 2 Percentagem de enraizamento (A), número de raízes por

planta (B), comprimento da maior raiz (cm) (C e D), percentagem de calos formados e de plantas sobreviventes após aclimatização (%) (E e F), em pereira, cv. Ya-Li, submetidos a diferentes doses de radiação gama.....................................................................................

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Figura 3 Plantas irradiadas de Pyrus sp., cv. Ya-Li, após avaliações

de regeneração/multiplicação in vitro [com aspecto normal (A) e presença de caules espessos (B)], após enraizamento in vitro [com uso de ágar como substrato (C) e com vermiculita (D)] e no período de aclimatização [em bandejas com tampas (E), em bandejas de polipropileno (F), em potes plásticos de 3 L após transplantadas(G) e em potes plásticos de 3 L antes de ir para o campo]...........

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SUMÁRIO

RESUMO................................................................................................... 07 ABSTRACT............................................................................................... 09 INTRODUÇÃO GERAL............................................................................. 14 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................... 18 CAPÍTULO 1 – Multiplicação in vitro de Pyrus sp., cvs. Ya-Li e Carrick

INTRODUÇÃO........................................................................................ 22 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................... 23 RESULTADOS....................................................................................... 25 DISCUSSÃO.......................................................................................... 36 CONCLUSÕES...................................................................................... 40 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................... 40 CAPÍTULO 2 – Multiplicação in vitro de pereira, cv. Cascatense INTRODUÇÃO........................................................................................ 45 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................... 47 RESULTADOS....................................................................................... 49 DISCUSSÃO.......................................................................................... 55 CONCLUSÕES...................................................................................... 59 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................... 60 CAPÍTULO 3 – Radiosensibilidade em micropropagação de Pyrus sp., cv. Ya-Li: efeitos morfofisiológicos

INTRODUÇÃO........................................................................................ 64 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................... 66 RESULTADOS....................................................................................... 68 DISCUSSÃO.......................................................................................... 72 CONCLUSÕES...................................................................................... 78 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................... 78 CONSIDERAÇÕES FINAIS...................................................................... 84

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INTRODUÇÃO GERAL

A pereira pertence à família Rosaceae, subfamília Pomoideae, gênero Pyrus

e compreende mais de 20 espécies, todas nativas da Ásia e da Europa. As espécies

mais importantes são: Pyrus communis L.; P. pyrifolia (Burm) Nak., P. ussuriensis

Max, P. bretschneideri Rehd, P. betaluefolia Bge., P. pashia P. Don., P. nivalis Jacq.

e P. calleryana Dcne (PERAZOLLO, 2006).

Devido à grande aceitação no consumo in natura, a produção de pera é

realizada em todo o mundo, o que a torna de grande importância nos mercados

internacionais (FACHINELLO et al., 2011). Segundo os dados de produção de pera

no ano de 2011, o Brasil produz 20 532 toneladas de peras por ano (IBGE, 2013).

Porém, esta quantidade não é suficiente para atender o mercado interno, pois

importa mais de 90% da pera de alta qualidade que consome (aproximadamente

140 mil toneladas) (NAKASU et al, 2007; FACHINELLO et al., 2011), apesar do

grande mercado interno para seus frutos (PETRI, 2008). Tal situação tem

posicionado o Brasil como o segundo maior importador de pera no mercado mundial

(JUNQUEIRA; PEETZ, 2003; NAKASU, 2003; PETRI, 2008; GUTIERREZ, 2009).

Entre as frutíferas de clima temperado, a pera é a terceira mais consumida,

entretanto é a que apresenta menor expressão em termos de produção e área

cultivada (FACHINELLO; FRANCESCATTO, 2009). Dada esta situação, o plantio da

pereira, no Brasil, é de fundamental importância, sendo uma alternativa de

diversificação econômica importante (JUNQUEIRA; PEETZ, 2003; NAKASU et al.,

2007).

No entanto, problemas relacionados com o vigor das plantas, tipo de porta-

enxerto, abortamento floral, insuficiência de frio hibernal, falta de cultivares

adaptadas às condições edafoclimáticas nacional, propriedades físicas, químicas e

biológicas do solo, dentre outros, impedem a expansão da cultura no País

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(FACHINELLO et al., 2011). Dessa forma, o principal entrave para o bom

desenvolvimento da cultura é a limitação de cultivares adaptadas às diferentes

regiões potencialmente produtoras e também a falta de pesquisas em relação à

definição de portaenxertos (BIANCHI et al., 2002; TOMAZ et al., 2009) e de

cultivares copa utilizadas como pé franco, bem como à adaptação destes a solos

mais ácidos, como os do Rio Grande do Sul.

Para tanto, os estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina apresentam-se

como regiões favoráveis à produção da pereira, uma vez que se aproveita toda a

infra-estrutura de processamento e armazenagem já instaladas para a cultura da

macieira (RIBEIRO et al., 1991), além de apresentarem condições climáticas

adequadas (JUNQUEIRA; PEETZ, 2003). Isso faz com que esta região tenha

84,65% da área total nacional cultivada com peras (IBGE, 2009), porém essa área

de cultivo ainda é pequena para atender a demanda do mercado interno, devido à

baixa produtividade e qualidade inferior das frutas produzidas (WREGE et al., 2006).

Segundo Oliveira et al. (2004), a implantação de pomares com mudas de qualidade

é uma etapa decisiva para o sucesso do sistema produtivo, pois a muda de

qualidade potencializa o nível de reposta a toda tecnologia empregada no pomar,

sendo um componente decisivo na redução de custos e para a produção de frutas

com qualidade e alta produtividade.

Neste contexto, a micropropagação, ou propagação in vitro, tem sido

recomendada como uma alternativa viável para a propagação de mudas de grande

interesse econômico, devido à rapidez da propagação em larga escala, manutenção

das características genéticas (COUTO, 2003) e produção de material vegetal com

melhor qualidade sanitária, em relação àquele obtido por técnicas convencionais

como estaquia e mergulhia de cepa (BIANCHI et al., 2003).

A micropropagação é dividida em fases, que vão desde o estabelecimento da

cultura in vitro, passando pela multiplicação in vitro, enraizamento in vitro ou ex vitro

e aclimatização. A multiplicação visa produzir o maior número possível de plantas,

no menor espaço de tempo, sendo que para obter altas taxas de multiplicação dos

explantes é necessário o ajuste do protocolo para cada espécie/cultivar em estudo

(SCHUCH; ERIG, 2005). Dentre os fatores mais importantes que influenciam a taxa

de multiplicação destacam-se o tipo de meio de cultura utilizado, bem como a

concentração de citocinina e carboidratos adicionados ao meio (SILVEIRA et al.,

2001). Durante o enraizamento de várias espécies frutíferas lenhosas, o uso de

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auxinas e substratos adequados são necessários para um bom processo de

rizogênese (RADMANN et al., 2002; TIBOLA et al., 2004). Neste sentido, o sucesso

do enraizamento dos explantes é pré-requisito para qualquer protocolo de

micropropagação, pois é importante para facilitar o estabelecimento da muda no solo

(PATI et al., 2006). Além disso, é imprescindível para sua aclimatização, uma vez

que o material micropropagado passa de uma condição heterotrófica e/ou

mixotrófica para autotrófica (BANDEIRA et al., 2007).

Sendo assim, diante do exposto acima, o sistema de micropropagação é um

método de reprodução assexuada importante, que pode ser usado para a produção

de plantas clonais, mas também forma a base para a introdução de variação

genética por transformação genética ou mutagênese (PÉREZ-TORNERO et al.,

2010), pois permite a multiplicação e/ou melhoramento de cultivares específicas e de

interesse econômico, como a pereira.

A radiação gama é considerada um dos principais indutores de mutações e de

aberrações cromossômicas estruturais, e as mudanças morfofisiológicas que

beneficiam a espécie em questão é uma das principais utilidades desta técnica no

melhoramento genético (HUNG; JOHNSON, 2008). Estudos sobre os efeitos das

radiações ionizantes em plantas são conduzidos mediante a irradiação de sementes,

explantes, plântulas e plantas, em diversos estádios de desenvolvimento (FU et al.,

2008; HUNG; JOHNSON, 2008). O melhoramento genético através do uso de

mutações induzidas em diversas culturas tem provado ser um método eficaz na

melhoria da qualidade, produtividade e resistência a estresses bióticos e abióticos

(NICHTERLAIN et al., 2000; BIBI et al., 2009). Dessa forma, técnicas de indução de

mutação têm sido muito utilizadas em programas de melhoramento de várias

espécies de plantas, como a pereira, em vista que o melhoramento genético

convencional não supre estas carências (JOSEPH et al., 2004). Em geral, as

espécies frutíferas são perenes, de longo ciclo vegetativo, de porte relativamente

grande e com alto nível de heterozigosidade, o que dificulta e aumenta o tempo

necessário para um programa de melhoramento genético através do método de

hibridização (CABONI et al., 2000).

Neste contexto, a produção de mudas sadias, a introdução de novas espécies

e o melhoramento genético contribuem para o aumento da eficiência do sistema

produtivo. Dessa forma, a Embrapa Clima Temperado, em parceria com a UFPel,

17

têm investido em pesquisas com a finalidade de melhorar os sistemas de produção

de pereira, realizando pesquisas com as cultivares „Carrick‟, „Cascatense‟ e „Ya-Li‟.

A cultivar Carrick é oriunda do cruzamento entre as cultivares Seckel x

Garber, obtida nos EUA. A planta é grande, vigorosa e produtiva. A plena floração

ocorre, em geral, na segunda semana de setembro. A fruta é de tamanho médio a

grande, de formato oblongo-piriforme e de epiderme bronzeada com manchas

avermelhadas. A polpa é branco-amarelada, medianamente macia, moderadamente

suculenta, doce, com pouca acidez, leve aroma e adstringente. A colheita ocorre em

fins de janeiro (NAKASU; FAORO, 2003; NAKASU et al., 2007).

A cultivar Cascatense foi criada pelo Programa de Melhoramento Genético da

Embrapa Clima Temperado, resultante do cruzamento de „Packham‟s Triumph‟ x „Le

Conte‟, realizado em 1968, selecionada em 1982 como Pirus 9 e lançada como

cultivar em 1992. „Packham‟s Triumph‟ é de origem australiana, resultante do

cruzamento entre „Uvedale St. Germain‟ (Bell) x „William‟s Bom Chrétien‟. „Le Conte‟

é americana, obtida do cruzamento entre pêra chinesa (arenosa) e européia

(manteigosa). A planta é de vigor médio a semi-vigorosa e semi-aberta. Floresce na

segunda quinzena de agosto, apresentando brotações mais precoces e uniformes,

enquanto que a fruta é piriforme e de tamanho médio. A epiderme é fina, de

coloração amarelo-esverdeada a amarela, com pouco de russeting na área

peduncular, de aparência regular. A polpa é branca, de textura parcialmente

manteigosa, suculenta, moderadamente aromática e de bom sabor com 12° Brix a

14° Brix. Além disso, sua exigência em frio hibernal situa-se ao redor de 400 h

(temperatura ≤ 7,2 °C) (NAKASU; LEITE, 1992; NAKASU; FAORO, 2003; NAKASU

et al., 2007).

Já a cultivar Ya-Li é oriental. A planta é de tamanho médio a grande, vigorosa,

aberta e levemente pendente. A floração é precoce, com antese ocorrendo na

primeira semana de setembro. Está entre as três principais variedades de pereiras

plantadas no Estado. É muito produtiva, apresentando frutas de tamanho médio a

grande, ovalado-piriforme, com epiderme amarelo-esverdeado-clara e lenticelas

grandes, de coloração marrom, principalmente junto ao pedicelo. A qualidade da

fruta melhora com atraso na colheita, a qual apresenta bom potencial de

armazenamento. A polpa é branca, crocante, pouco áspera e suculenta, doce.

Amadurece de março a abril. Tem necessidade de frio moderada (NAKASU;

FAORO, 2003; NAKASU et al., 2007).

18

Assim, esses atributos tornam as três cultivares alvo de pesquisas mais

detalhadas, pois são de grande interesse econômico. Contudo, apresentam alguns

problemas que dificultam uma melhor produção e qualidade das frutas, sendo

necessárias, desta forma, maiores pesquisas que visem introduzir novos genótipos

e/ou melhorar os atuais. Estes problemas estão relacionados ao fato de ambas

cultivares serem suscetíveis a entomosporiose, sendo que a Ya-Li também é

suscetível à sarna; a cv. Carrick apresenta frutas com qualidade média; as frutas

da „Cascatense‟ apresentam qualidade semelhante à Carrick, além de ser uma

cultivar lançada recentemente e ainda não existirem muitos trabalhos desenvolvidos.

E, por fim, as frutas da „Ya-Li‟ são de qualidade fraca a regular, com pouco teor de

açúcar, delicadas e exigem cuidados especiais na colheita e as plantas demoram a

entrar em produção (NAKASU; FAORO, 2003; FIORAVANÇO et al., 2007; NAKASU

et al., 2007).

Considerando o exposto acima, o objetivo deste trabalho foi otimizar o cultivo

in vitro de três cultivares de pereira (Pyrus sp.): Carrick, Cascatense e Ya-Li, visando

potencializar sua produção e a indução de mutações, almejando selecionar novos

genótipos com características de interesse, a partir dos genótipos originais.

Referências bibliográficas

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20

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22

CAPÍTULO 1 – Multiplicação in vitro de Pyrus sp., cvs. Ya-Li e Carrick.

1 Introdução

A cultura da pereira (Pyrus sp.) tem grande potencial de expansão na Região

Sul do Brasil, devido à existência de condições favoráveis de clima e solo

adequados para seu desenvolvimento (WREGE et al., 2006). Esta região apresenta

uma área aproximada de 1180 hectares plantados de pera, com produção em torno

de 12.464 toneladas de frutos, equivalendo a 84,65% da área total cultivada (IBGE,

2009). No entanto, seu cultivo ainda é pequeno para atender a demanda do

mercado interno, pois a maior parte da fruta consumida no País é importada (mais

de 90%) (FACHINELLO; FRANCESCATTO, 2009; MUNIZ, et al., 2012).

Dentre os fatores que contribuem para a estagnação dos plantios e pela

pequena área cultivada com pereira pode ser citado a falta de cultivares adaptadas

(NAKASU; FAORO, 2003), gerando, assim, baixa produtividade e qualidade inferior

das frutas (WREGE et al., 2006).

Neste contexto, a implantação de pomares com mudas de qualidade é uma

etapa decisiva para o sucesso do sistema produtivo, pois a muda de qualidade

potencializa o nível de reposta a toda tecnologia empregada no pomar, sendo um

componente decisivo na redução de custos e para a produção de frutas com

qualidade e alta produtividade (OLIVEIRA et al., 2004).

Assim, visando à produção de mudas com alta qualidade fitossanitária,

técnicas de propagação in vitro apresentam-se como uma alternativa viável e

eficiente, pois possibilita a multiplicação do material vegetal e sua obtenção em larga

escala, num curto período de tempo e durante o ano todo (BOTELHO et al., 2005;

MACHADO et al., 2006; CARVALHO et al., 2011).

Entretanto, para que a taxa de reprodutibilidade vegetal seja elevada, é

necessário ajustar alguns fatores que interferem no desenvolvimento de brotações in

23

vitro, como o tipo de meio de cultura, seguido do suplemento de reguladores de

crescimento, concentração de sacarose, iluminação, tipo de explante, entre outros

(SILVEIRA et al., 2001; ZHANG et al., 2003; CAMPOS et al., 2007), sendo

necessário encontrar as condições mais adequadas para cada genótipo que se

pretende propagar (MACHADO et al., 2013).

Em relação aos meios de cultura, diversas formulações de meios básicos têm

sido utilizadas no cultivo in vitro, como o meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962),

com suas modificações e diluições, o qual tem sido utilizado com sucesso para

diversas espécies (CENTOFANTE et al., 2009), e o meio WPM (LLOYD; MCCOWN,

1980), amplamente utilizado para a micropropagação de espécies lenhosas

(PASQUAL, 2001), QL (QUOIRIN; LEPOIVRE, 1977), entre outros.

A concentração adequada de sacarose no meio de cultivo é de grande

importância, pois a mesma serve como fonte de esqueletos de carbono, fornecendo

energia para a planta (PATI et al., 2006; VILLA et al., 2009).

As citocininas são reguladores de crescimento que desempenham um papel

fundamental na morfogênese in vitro, estimulando a divisão celular, assim como a

indução e a proliferação de brotações adventícias (PEREZ-TORNERO; BURGOS,

2000; DZAZIO et al., 2002), sendo a 6-benzilaminopurina (BAP) a mais utilizada na

multiplicação in vitro de pereiras, numa ampla faixa de concentração que varia de

0,5 a 2,0 mg L-1, de acordo com a espécie ou cultivar (DANTAS et al., 2002).

Desta forma, o trabalho teve como objetivo avaliar o efeito dos diferentes

meios de cultivo, concentrações de sacarose e BAP na multiplicação in vitro das cvs.

Ya-Li e Carrick, almejando estabelecer as condições adequadas para otimizar sua

propagação.

2 Material e Métodos

Os explantes utilizados para o desenvolvimento do trabalho foram

provenientes de brotações de pereira, cvs. Ya-Li e Carrick, pré-estabelecidas e

multiplicadas in vitro, durante 40 dias, em meio de cultivo MS pronto Himédia® (meio

comercial com formulação igual ao MS), acrescido de 0,8 mg L-1 de BAP, 30 g L-1 de

sacarose e 7 g L-1 de ágar, sendo o pH ajustado para 5,8 (Comunicação Pessoal).

Os estudos foram conduzidos em quatro experimentos sequenciais, conforme

descrito abaixo, sendo que o terceiro e quarto experimentos foram realizados

concomitantemente. Cada experimento foi repetido duas vezes. Para a realização

24

dos experimentos, como explante inicial, foram utilizados segmentos nodais de

aproximadamente 1,0 cm contendo de duas a três gemas axilares. As gemas

axilares presentes nos segmentos nodais, bem como o comprimento destes foram

incluídos nas avaliações realizadas. Gemas e brotações incipientes, menores que

três milímetros, não foram consideradas por serem muito pequenas e de difícil

manuseio.

Experimento 1 – Efeito de diferentes meios de cultivo e concentrações de sais

Os explantes iniciais foram cultivados em cinco meios diferentes: MS

completo e MS modificado (¾ da concentração normal de NH4NO3 e KNO3,

identificado nos resultados como MS¾), MS Himédia, WPM e QL; todos contendo

0,8 mg L-1 de BAP, 100 mg L-1 de mio-inositol, 30 g L- 1 de sacarose, 7 g L-1 de ágar

e pH 5,8. Os meios MS completo, MS¾ e QL foram preparados com EDTA-Férrico,

enquanto o MS Himédia e WPM com EDTA-Ferroso, conforme formulação original

do meio MS.

Os frascos foram mantidos em câmara de crescimento com temperatura de

23±2ºC, fotoperíodo de 16 horas e 48 μmol m-2 s-1 de fluxo de fótons por 40 dias.

Após este período, avaliou-se o número de brotações por explante, o comprimento

das brotações (cm), o número de gemas axilares por brotação, massa fresca e

massa seca das brotações (g), sendo a secagem do material realizada em estufa de

ventilação forçada a ±50 ºC até massa constante.

Experimento 2 – Influência das concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP)

O meio de cultura usado foi o que apresentou melhores resultados após a

realização do primeiro experimento (MS Himédia para Carrick e MS para Ya-Li),

suplementado com diferentes concentrações de BAP (0; 0,4; 0,8; 1,2 e 1,6 mg L-1),

30 g L-1 de sacarose, 7 g L-1 de ágar e pH 5,8. As condições de cultivo e as variáveis

analisadas foram as mesmas do experimento anterior.

Experimento 3 – Efeito de diferentes concentrações de sacarose

O meio de cultivo e a concentração de BAP utilizados foram os que

apresentaram melhores resultados após a realização do primeiro e segundo

experimentos (MS + 1,2 mg L-1 de BAP para Ya-Li e MS Himédia + 1,2 mg L-1 de

BAP para Carrick), variando-se a concentração de sacarose (0, 15, 30, 45 e 60 g L-

25

1), com 7 g L-1 de ágar e pH 5,8. As condições de cultivo e as variáveis analisadas

foram as mesmas dos experimentos anteriores.

Experimento 4 – Efeito do aumento das concentrações de BAP

Quando o segundo experimento foi avaliado observou-se, em alguns

parâmetros, respostas crescentes até a última concentração de citocinina testada.

Em vista disso, com a finalidade de verificar o efeito do aumento das concentrações

de BAP na proliferação in vitro das cultivares em estudo, os explantes iniciais foram

inoculados em meios de cultura contendo concentrações maiores de BAP (0; 1; 2; 3

e 4 mg L-1). A composição básica do meio, bem como as condições de cultivo e as

variáveis analisadas foram as mesmas do segundo experimento.

Delineamento experimental e análise estatística

O delineamento experimental adotado para todos os experimentos foi

inteiramente casualizado, com nove repetições por tratamento, representadas, cada

uma, por um frasco contendo cinco explantes. Para as avaliações de massa fresca

e massa seca das brotações foram selecionadas, ao acaso, três plantas de cinco

repetições, totalizando quinze plantas por tratamento.

Os experimentos seguiram um arranjo bifatorial (2x5), composto por dois

níveis do fator cultivar (Ya-Li e Carrick) em todos os experimentos e cinco níveis dos

fatores: meio de cultura (MS, MS¾, MS Himédia, WPM e QL) para o primeiro

experimento, concentração de BAP (0; 0,4; 0,8; 1,2 e 1,6 mg L-1) para o segundo

experimento, concentração de sacarose (0, 15, 30, 45 e 60 g L-1) para o terceiro

experimento e concentração de BAP (0; 1; 2; 3 e 4 mg L-1) para o quarto

experimento.

Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias

comparadas pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade de erro, ou

analisadas por regressão polinomial, utilizando o software WINSTAT 1.0

(MACHADO; CONCEIÇÃO, 2007).

3 Resultados

Segundo a análise de variância e/ou regressão polinomial, observou-se

diferença significativa entre os tratamentos e interação entre os fatores para todas

as variáveis analisadas, nos quatro experimentos.

26

Experimento 1 – Efeito de diferentes meios de cultivo e concentrações de sais

Nas cultivares CarricK e Ya-Li, o maior número de brotações por explante

(6,67 e 2,75), respectivamente, foi obtido com o uso do meio de cultivo WPM,

porém, na „Ya-Li‟, este não diferiu estatisticamente do meio MS¾, com 2,48

brotações formadas (Fig. 1A).

Em relação ao comprimento das brotações, os maiores valores foram obtidos

com a utilização dos meios Himédia (1,89 cm) na cv. Carrick e MS (1,44 cm) na „Ya-

Li‟. Este último não diferiu significativamente dos meios MS ¾ (1,39 cm) e Himédia

(1,31 cm) (Fig. 1B).

No que se refere ao número de gemas axilares por brotação, não foi possível

ser realizada a avaliação dos meios WPM e QL, pois em ambas cultivares, houve

entufamento das brotações, ocasionado pela redução no comprimento das mesmas,

dificultando seu manuseio. Desta forma, para a cv. Carrick não foi verificada

diferença estatística entre os meios analisados, com uma média de 12,79 gemas

formadas, enquanto que para „Ya-Li‟, os meios MS e MS¾, foram os que

apresentaram os melhores resultados, propiciando a obtenção de 13,65 e 13,62

gemas, consecutivamente (Fig. 1C).

Os resultados obtidos para massa fresca e massa seca (Fig. 1D e 1E)

mostraram que, na cultivar Ya-Li, ocorreu maior incremento de massa fresca com o

meio MS¾ (0,19 g), e maior acúmulo de massa seca com os meios MS (0,026 g),

MS¾ (0,031 g) e Himédia (0,026 g), os quais não diferiram entre si. Já para a cv.

Carrick, os maiores valores de massa fresca (0,39 g) e seca (0,058 g) foram obtidos

com o uso de Himédia.

Analisando todas as variáveis avaliadas, verificou-se que, para a cultivar Ya-

Li, o meio de cultivo MS foi o que propiciou a obtenção de respostas mais uniformes,

com formação de 2,09 brotações por explante, com comprimento médio de 1,44 cm,

13,65 gemas axilares por brotação, 0,15 g de massa fresca e 0,026 g de massa

seca. Na cv. Carrick, o meio Himédia foi o mais responsivo, obtendo-se 4,16

brotações por explante, com 1,89 cm de comprimento, 12,64 gemas axilares por

brotação, 0,39 g de massa fresca e 0,058 g de massa seca.

27

Bab Aa

Bab

Ba

Ab

AbAb

Ab

Aa

Ac

0

1

2

3

4

5

6

7

MS MS3/4 HIMÉDIA WPM QL

Nb

rota

çõ

s/e

xp

lan

te**

YA-LI CARRICK

Aa AaBa

Ab

Aab

AbAab

Aa

AcAc

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

MS MS3/4 HIMÉDIA WPM QL

Co

mp

r. b

rota

çõ

es (

cm

)**

Aa Aa

Ab

AaBa Aa

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

MS MS3/4 HIMÉDIA

Ng

em

as/b

rota

ção

*

Bab

Ba

Bab

Bbc

Ac

AbAb

Aa

Aab

Ac

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

MS MS3/4 HIMÉDIA WPM QL

Massa F

resca (

g)*

*

BaBa

Ba

Bab

Ab

AcAbc

AaAab

Ad

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

MS MS3/4 HIMÉDIA WPM QL

Massa S

eca (

g)*

*

Figura 1 – Número de brotações por explante (A), comprimento das brotações (B), número de gemas axilares por brotação (C), massa fresca e massa seca das brotações (g) (D e E), respectivamente, de pereira, cvs. Ya-Li e Carrick, submetidos a diferentes meios de cultivo e concentrações de sais. **,* Significativo pelo teste F a 1% e 5% de probabilidade de erro, respectivamente. Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas para cultivares e minúsculas para meios de cultivo, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade do erro.

Meios de cultivo

Meios de cultivo

A B

C D

E

28

Experimento 2 – Influência das concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP)

Em ambas cultivares, para as variáveis número e comprimento de brotações

por explante e número de gemas axilares por brotação, verificou-se uma tendência

quadrática, com ponto de máxima, para a cultivar Ya-Li, nas concentrações 1,56,

0,97 e 1,1 mg L-1 de BAP, com a formação de 3,28 brotações, de aproximadamente

1,65 cm de comprimento e 16,03 gemas axilares por brotação, respectivamente. Em

contrapartida, na cultivar Carrick, a adição de 1,36, 1,38 e 1,16 mg L-1 de BAP ao

meio de cultivo, ocasionou a formação de 4,29 brotações, de aproximadamente

1,97 cm de comprimento e 14,99 gemas axilares por brotação, consecutivamente

(Fig. 2A, 2B e 2C).

Nas cultivares em estudo, observou-se um incremento na massa fresca com o

aumento de BAP, sendo que, para a „Ya-Li‟, pela estimativa da equação de

regressão, a resposta foi positiva até 1,56 mg L-1, com obtenção de 0,17 g. Já para

„Carrick‟, os maiores valores foram obtidos na concentração mais elevada (1,6 mg L-

1), apresentando uma média 0,33 g (Fig. 2D).

Em relação à massa seca, verificou-se uma resposta linear crescente, com o

acúmulo de 0,022 e 0,049 g na concentração de 1,6 mg L-1 da citocinina testada,

para as cvs. Ya-Li e Carrick, respectivamente (Fig. 2E).

Embora os resultados obtidos para todas estas variáveis, em ambas

cultivares, sejam estimados conforme a equação de regressão, os valores absolutos

encontrados mostram que a concentração de 1,2 mg L-1 de BAP foi a que

desencadeou as melhores e mais uniformes respostas, pois apresentou a formação

de 3,02 brotações, com 1,71 cm de comprimento, 15,78 gemas axilares por

brotação, 0,19 g de massa fresca e 0,026 g de massa seca, para „Ya-Li‟. Para a cv.

Carrick, obteve-se 3,99 brotações por explante, com 1,92 cm de comprimento cada,

14,4 gemas axilares por brotação e incremento de 0,3 g de massa fresca e 0,045 g

de massa fresca.

29

y Ya-li = -0,897x2 + 2,798x + 1,102 R² = 0,98** (O)

y Carrick = -1,75x2 + 4,77x + 1,04R² = 0,985** (X)

0

1

2

3

4

5

6N

bro

taçõ

es/e

xp

lan

te**

y Ya-li = -0,522x2 + 1,013x + 1,156 R² = 0,805** (O)

y Carrick = -0,442x2 + 1,224x + 1,126 R² = 0,92** (X)

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

2,4

2,6

Co

mp

r. b

rota

çõ

es (

cm

)**

y Ya-li = -5,821x2 + 12,89x + 8,895 R² = 0,996** (O)

y Carrick = -6,321x2 + 14,67x + 6,481 R² = 0,955** (X)

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

Ng

em

as/b

rota

ção

**

y Ya-li = -0,053x2 + 0,165x + 0,042 R² = 0,901* (O)

y Carrick = 0,155x + 0,106 R² = 0,929** (X)

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 0,4 0,8 1,2 1,6

Massa F

resca (

g)*

*

Concentrações de BAP (mg L-1)y Ya-li = 0,007x + 0,013 R² = 0,76** (O)

y Carrick = 0,019x + 0,020 R² = 0,936** (X)

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0 0,4 0,8 1,2 1,6

Massa S

eca (

g)*

*

Concentrações de BAP (mg L-1)

Figura 2 – Número de brotações por explante (A), comprimento das brotações (B),

número de gemas axilares por brotação (C), massa fresca e massa seca das brotações (g) (D e E), respectivamente, de pereira, cvs. Ya-Li e Carrick, submetidos a diferentes concentrações de BAP (mg L-1). **,* Significativo pelo teste F a 1% e 5% de probabilidade de erro, respectivamente.

A B

C D

E

30

Experimento 3 – Efeito de diferentes concentrações de sacarose

Quanto às diferentes concentrações de sacarose adicionadas aos meios de

cultivo verificou-se uma tendência quadrática para todas as variáveis analisadas,

nas duas cultivares, exceto no que diz respeito à massa seca da pereira Ya-Li, na

qual houve uma resposta linear crescente, com maiores valores obtidos na

concentração de 60 g L-1, apresentando um acúmulo de 0,062 g (Fig. 3E).

Segundo a equação de regressão, maiores valores para número de brotações

por explante (5,67) (Fig. 3A), comprimento das brotações (1,33 cm) (Fig. 3B), gemas

axilares por brotação (17,59) (Fig. 3C) e massa fresca (0,312 g) (Fig. 3D) foram

obtidos nas concentrações de 53,61; 33,33; 40,4 e 55 g L-1 de sacarose,

respectivamente, na cultivar Ya-Li. Em contrapartida, para a cultivar Carrick, o ponto

de máxima inferiu as maiores médias de brotações por explante (6,06) (Fig. 3A),

comprimento das brotações (1,76 cm) (Fig. 3B), gemas axilares por brotação (13,38)

(Fig. 3C), massa fresca (0,367 g) (Fig. 3D) e massa seca (0,056 g) (Fig. 3E) quando

utilizadas 38,09; 31,25; 32,67; 36,96 e 45,4 g L-1 deste carboidrato,

consecutivamente.

Ainda que as avaliações estimadas segundo a tendência quadrática tenham

propiciado respostas diversas, fazendo-se uma análise dos resultados obtidos com

os valores absolutos, pode-se inferir que, para a cv. Ya-Li, a concentração de 45 g L-

1 de sacarose corrobora para a obtenção das melhores e mais uniformes respostas,

pois nela ocorreu a formação de 6,11 brotações, com comprimento médio de 1,35

cm, 15,63 gemas axilares e incremento 0,36 g de massa fresca e 0,06 g massa

seca; enquanto que, para a cv. Carrick, os maiores valores de número de brotações

(5,84), comprimento de brotações (1,88 cm), gemas axilares por brotação (13,29),

massa fresca (0,37 g) e massa seca (0,055 g) foram observados na concentração de

30 g L-1 deste açúcar.

31

y Ya-li = -0,001x2 + 0,193x + 0,500 R² = 0,883** (O)

y Carrick = -0,0034x2 + 0,259x + 1,128 R² = 0,986** (X)

0

1

2

3

4

5

6

7

8N

bro

taçõ

es/e

xp

lan

te**

y Ya-li = -0,0003x2 + 0,020x + 1,005 R² = 0,963** (O)

y Carrick= -0,0008x2 + 0,050x + 0,980 R² = 0,949** (X)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Co

mp

r. b

rota

çõ

es (

cm

)**

y Ya-li = -0,010x2 + 0,808x + 1,269 R² = 0,929** (O)

y Carrick = -0,006x2 + 0,392x + 6,982 R² = 0,848** (X)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

Ng

em

as/b

rota

ção

**

y Ya-li = -0,0001x2 + 0,011x - 0,01 R² = 0,897** (O)

y Carrick = -0,00023x2 + 0,017x + 0,053 R² = 0,887** (X)

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0,55

0 15 30 45 60

Massa F

resca (

g)*

*

Concentrações de sacarose (g L-1)y Ya-li = 0,001x + 0,002

R² = 0,96** (O)

y Carrick= -3E-05x2 + 0,002x + 0,001 R² = 0,971** (X)

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0 15 30 45 60

Massa S

eca (

g)*

*

Concentrações de sacarose (g L-1)

Figura 3 – Número de brotações por explante (A), comprimento das brotações (B),

número de gemas axilares por brotação (C), massa fresca e massa seca das brotações (g) (D e E), respectivamente, de pereira, cvs. Ya-Li e Carrick, submetidos a diferentes concentrações de sacarose (g L-1). ** Significativo pelo teste F a 1% de probabilidade de erro.

A B

C D

E

32

Experimento 4 – Efeito do aumento das concentrações de BAP

Mediante os resultados obtidos no segundo experimento, realizou-se esta

avaliação complementar, com a finalidade de verificar as respostas observadas com

o incremento das concentrações de BAP.

Pela equação de regressão, nas cvs. Ya-Li e Carrick, os maiores valores

estimados para número (5,7 e 4,45) (Fig. 4A) e comprimento das brotações (1,49 e

2,17 cm) (Fig. 4B) e massa seca (0,044 e 0,073 g) (Fig. 4E) foram observados nas

concentrações de 2,25 e 1,73 mg L-1; 1,33 e 2,5 mg L-1 e 5,5 e 2,55 mg L-1 de BAP,

respectivamente.

No que se refere às variáveis número de gemas axilares por brotação e

massa fresca, na cv. Carrick, observou-se uma resposta quadrática, com pontos de

máxima nas concentrações de 2,19 e 2,86 mg L-1 de BAP, com 15,59 gemas

formadas (Fig. 4C) e incremento de 0,463 g de massa fresca (Fig. 4D),

consecutivamente.

Entretanto, para a cultivar Ya-Li, ocorreu um efeito linear crescente à massa

fresca com a adição de BAP ao meio de cultivo, obtendo-se valores máximos de

0,291 g quando se utilizou 3 mg L-1 deste regulador de crescimento (Fig. 4D). O

número de gemas axilares da „Ya-Li‟ não foi avaliado nas concentrações de 2 e 3 mg

L-1 de BAP, em vista que houve dificuldade na sua contagem, sendo que nas

concentrações inferiores (0 e 1 mg L-1) verificou-se a formação de 9,35 e 14,61

gemas, respectivamente.

Embora as respostas encontradas sejam estimadas conforme a equação de

regressão, em ambas cultivares, os valores absolutos obtidos para a cv. Ya-Li são

diversos, não permitindo identificar uma concentração em que as respostas sejam

uniformes. Já para a cv. Carrick a concentração de 2 mg L-1 desencadeou bons

resultados, com a formação de 4,27 brotações, com 2,04 cm de comprimento, 14,14

gemas axilares por brotação, 0,458 g de massa fresca e 0,075 g de massa seca.

Porém, fazendo-se uma avaliação conjunta dos resultados obtidos e das

observações visuais (Fig. 5E e 5F), é possível verificar que concentrações de 2 e 3

mg L-1 de BAP são danosas às cultivares em estudo, pois na „Ya-Li‟, ocorreu

entufamento das brotações, ocasionada pela grande proliferação de brotações, as

quais apresentaram redução e variação no comprimento (Fig. 5E). Em contrapartida,

para „Carrick‟ houve diferenças no comprimento das brotações formadas na

concentração de 2 mg L-1 e formação de brotações vitrificadas com o uso de 3 mg L-

33

1 deste fitoregulador (Fig. 5F). Neste contexto, nas cultivares em estudo, o uso de

1,2 mg L-1 de BAP é adequado, em vista que, no segundo experimento apresentou-

se favorável à proliferação de brotações, levando à obtenção dos melhores

resultados, e neste experimento a concentração de 1 mg L-1 deste regulador de

crescimento propiciou respostas positivas e crescentes.

34

y Ya-li = -0,905x2 + 4,081x + 1,101 R² = 0,984** (O)

y Carrick = -0,867x2 + 3,429x + 1,059 R² = 0,989** (X)

0

1

2

3

4

5

6

7

8N

bro

taçõ

es/e

xp

lan

te**

y Ya-li = -0,145x2 + 0,387x + 1,232 R² = 0,819** (O)

y Carrick = -0,182x2 + 0,912x + 1,027 R² = 0,981** (X)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Co

mp

r. b

rota

çõ

es (

cm

)**

y Carrick = -2,465x2 + 10,79x + 3,788 R² = 0,951**

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Ng

em

as/b

rota

ção

**

y Ya-li = 0,075x + 0,072 R² = 0,98** (O)

y Carrick = -0,051x2 + 0,292x + 0,045 R² = 0,978** (X)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 1 2 3

Massa F

resca (

g)*

*

Concentrações de BAP (mg L-1)y Ya-li= -0,001x2 + 0,011x + 0,014

R² = 0,971** (O)

y Carrick= -0,009x2 + 0,046x + 0,014 R² = 0,974** (X)

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,1

0 1 2 3

Massa S

eca (

g)*

*

Concentrações de BAP (mg L-1)

Figura 4 – Número de brotações por explante (A), comprimento das brotações (B), número de gemas axilares por brotação (C), massa fresca e massa seca das brotações (g) (D e E), respectivamente, de pereira, cvs. Ya-Li e Carrick, submetidos a diferentes concentrações de BAP (mg L-1). ** Significativo pelo teste F a 1% de probabilidade de erro.

A B

C D

E

35

Figura 5 – Brotações de Pyrus sp., cvs. Ya-Li e Carrick, obtidas após serem submetidas a diferentes meios de cultivo e concentrações de sais (A e B), concentrações de BAP (C, D, E e F) e concentrações de sacarose (G e H), respectivamente.

36

4 Discussão

A partir da cultura de tecidos é possível a obtenção de plantas geneticamente

idênticas à planta matriz, livre de pragas e doenças e em número elevado

(CARVALHO et al., 2006). Contudo, essa alta produção de mudas está relacionada

ao sucesso da etapa de multiplicação in vitro, a qual é influenciada por diversos

fatores, dentre eles a composição do meio de cultivo, a utilização de citocininas

como reguladores de crescimento e condições ambientais a que os tecidos são

submetidos (SOTIROPOULOS et al., 2006).

Convém ressaltar, que é necessário otimizar as condições de cultivo para

cada espécie e/ou cultivar que se pretende propagar (ROGALSKI et al., 2003), em

vista que cada genótipo responde de forma diferenciada aos tratamentos testados,

podendo ocorrer diferenças no padrão de desenvolvimento das brotações

(BORGHEZAN et al., 2003; CAMPOS et al., 2007), como observado neste trabalho,

em que as cultivares Ya-Li e Carrick apresentaram variação na morfogênese in vitro

(Fig. 5). Assim, existe uma série de estudos para determinadas cultivares de pereira,

mas muitas vezes estes resultados não podem ser transferidos para genótipos

individuais, porque estes podem diferir muito em suas necessidades nutricionais,

energéticas e hormonais, durante o cultivo in vitro (REED et al., 2013a)

Considerando o exposto acima e visando obter um protocolo apropriado de

propagação do material vegetal em estudo, em que o objetivo é conseguir altas

taxas de multiplicação in vitro, os parâmetros de crescimento avaliados

considerados mais importantes são o número e comprimento das brotações e o

número de gemas axilares por brotação. Esses, em conjunto, vão determinar uma

maior ou menor eficiência do processo de multiplicação e propiciar que, a partir do

protocolo criado, as brotações obtidas tenham comprimento e qualidade adequados

para o sucesso das fases de enraizamento e aclimatização.

Em relação à composição do meio de cultura, segundo Torres et al. (2001),

os principais componentes são água, sais inorgânicos, carboidratos, vitaminas e

reguladores de crescimento, em vista que os explantes estão em ambiente

heterotrófico e/ou mixotrófico e requerem meio nutritivo para suplementar suas

necessidades exógenas, em termos de elementos essenciais, constituintes

orgânicos e energia.

Neste sentido, muitos experimentos com diluições nas concentrações de

macro e micronutrientes têm sido realizados. As grandes diferenças nos

37

macronutrientes para os meios MS, WPM e QL são nas concentrações dos sais

nitrato de amônio e nitrato de potássio e a concentração total de íons (BELL et al.,

2009). E, embora o WPM tenha gerado resultados positivos em alguns parâmetros

avaliados (ex: número de brotações, em ambas cultivares; e no incremento de

massa fresca e seca na cultivar Ya-Li) (Fig. 5A e 5B) e seja muito utilizado na

multiplicação de brotações de várias espécies lenhosas, em razão da sua menor

força iônica total em relação a outros meios empregados no cultivo in vitro

(PASQUAL, 2001; JHA; GHOSH, 2006; RADMANN et al., 2009), o MS (tanto na

forma comercial como a preparada no laboratório) e suas diluições foram os que, no

geral, desencadearam a obtenção das melhores respostas (Fig. 5A e 5B). Com o

uso de WPM houve um acréscimo no número de brotações, porém estas tiveram um

comprimento inadequado, levando ao entufamento das mesmas (principalmente na

cultivar Ya-Li), o que torna difícil o manuseio e separação dos explantes, bem como

sua utilização nas etapas posteriores de micropropagação. Esta redução no

comprimento das brotações e, consequentemente, impossibilidade de obtenção de

altas taxas de multiplicação também pode ser visualizada no meio QL (Fig. 5A e 5B),

o qual apresenta força iônica total menor que o WPM.

De acordo com Reed et al. (2013b), as espécies e cultivares de pereira são

cultivadas em vários meios de cultura conhecidos, entretanto o MS é o mais

comumente usado devido à qualidade superior das brotações formadas. O melhor

crescimento de células e tecidos de plantas em meio MS tem sido atribuído, em

grande parte, à alta concentração de amônio e nitrato. E, além do nitrogênio, o

potássio encontra-se também em dosagens altas (FADEL et al., 2010). Estes

macronutrientes estão envolvidos em muitos processos metabólicos da planta,

relacionados ao crescimento e vigor vegetal, sendo que o nitrogênio é constituinte

de aminoácidos, amidas, proteínas, ácidos nucléicos, nucleotídeos, coenzimas e

outros (XU et al., 2012) e o potássio é requerido como cofator de mais de 40

enzimas, além de ser o principal cátion no estabelecimento do turgor celular e

manutenção da eletroneutralidade celular (WANG; WU, 2013).

Outro aspecto a ser considerado, em relação aos resultados obtidos durante a

multiplicação das duas cultivares, nos diferentes meios de cultivo, é no que se refere

às diferenças no desenvolvimento das brotações observadas entre Himédia e MS,

uma vez que ambos são preparados com as mesmas concentrações de sais. Esta

resposta pode estar relacionada ao fato do meio Himédia ter sido preparado com

38

Ferro na forma ferrosa – reduzida, enquanto o MS na forma de EDTA-Férrico –

oxidada. Ambos são absorvidos normalmente pelas plantas, porém algumas (a

maioria) absorvem melhor o Ferro como Fe2+ (forma mais solúvel), e outras como

Fe3+-quelato (SCHMIDT, 2003). Além disso, o Himédia é comercial e já vem pronto,

enquanto que o MS é preparado em laboratório, assim, a qualidade dos sais

minerais, bem como possíveis alterações na quantidade destes, podem variar entre

eles.

No que se refere ao uso de citocininas no meio de cultivo (Fig. 5C à 5F),

verificou-se que ambas cultivares necessitam de adição exógena deste regulador de

crescimento, pois nos explantes em que não houve suplemento de BAP observou-se

ausência de multiplicação. Isso ocorreu devido às citocininas serem indispensáveis

nesta fase, uma vez que promovem a superação da dominância apical e induzem a

proliferação de gemas axilares, favorecendo, assim, a emissão de novas brotações

(SOUZA; JUNGHANS, 2006; GRIMALDI et al., 2008).

Em contrapartida, o excesso de citocinina é tóxico e caracteriza-se,

principalmente, pela formação de tufos de brotações e alterações no seu

comprimento, encurtamento dos entrenós, engrossamento exagerado dos caules e

hiperidricidade generalizada (GEORGE et al., 2008), sendo que essas

características foram observadas nas concentrações mais altas de BAP (2 e 3 mg L-

1) (Fig. 5E e 5F). Brotações hiperídricas (como as formadas na concentração de 3

mg L-1, na cv. Carrick) (Fig. 5F), apresentam caules espessos, entrenós curtos, com

aparência túrgida, hipolignificados, contendo água nos espaços intercelulares e

sobre sua superfície; as folhas são malformadas, com alterações na filotaxia,

frequentemente alongadas, esfaceláveis e encarquilhadas ou curvadas; múltiplas

brotações evidenciando mau funcionamento dos meristemas primários, que podem

degenerar rapidamente por necrose simultânea dos ápices meristemáticos

(GASPAR et al., 2000). Assim, o uso de brotações formadas nessas condições é

indesejável, em vista que geram sérios problemas para os cultivos subsequentes e

demais etapas da micropropagação, comprometendo o desenvolvimento das

culturas (RAMAGE; WILLIAMS, 2004). Diante do exposto, almejando obter uma taxa

média satisfatória de brotações em que sejam priorizadas qualidade e

homogeneidade, levando à produção de mudas em larga escala, a concentração de

BAP que desencadeou os melhores resultados, para as duas cultivares, foi a de 1,2

mg L-1 (Fig. 5C e 5D).

39

Em relação ao uso de carboidratos, a adição de sacarose ao meio de cultura

pode atuar como substrato para a respiração celular, fornecendo energia também

para o processo de rizogênese (PIO et al., 2002). Neste sentido, diversas pesquisas

são realizadas buscando adequar uma concentração em que exista eficiência no uso

desta para cada espécie/cultivar, pois a redução de sacarose no meio de cultivo tem

sido testada em busca de melhorar a capacidade fotossintética dos tecidos

cultivados in vitro e reduzir perdas atribuídas à contaminação microbiana. No

entanto, muitos autores são contrários à ideia de redução de sacarose durante as

etapas da micropropagação e afirmam que os mecanismos pelos quais a

concentração de carboidrato influencia na aclimatização ainda não são muito claros

(ARAÚJO et al., 2007). Em contrapartida, o seu excesso pode ser prejudicial, pois

inibe a síntese de clorofila e, portanto, reduz a capacidade fotossintética das culturas

(HAZARIKA, 2006).

Assim, estudos de multiplicação de pereiras são realizados com o uso de

diferentes concentrações de sacarose no meio de cultivo, como com os porta-

enxertos de Pyrus betulaefolia (HASSANEN; GABR et al., 2012) e Pyrus communis

'Pyrodwarf' (RUZIC et al., 2011), nos quais utiliza-se 20 g L-1, enquanto que em

Pyrus sp (REED et al., 2013b), Pyrus calleryana D-6 (MORAES et al., 2004), Pyrus

pyrofolia „Século XX‟ e „Housui‟ e Pyrus communis ‘Red Bartlet‟ (DANTAS et al.,

2002) usa-se 30 g L-1 (concentração de sacarose normalmente utilizada no cultivo in

vitro). E, neste trabalho, os melhores resultados obtidos foram com o uso de 30 g L-1

de sacarose para „Carrick‟ e 45 g L-1 para Ya-Li‟ (Fig. 5G e 5H), onde foram

verificadas as maiores taxas de multiplicação das brotações, mostrando que a

concentração apropriada é dependente do genótipo.

Durante a realização dos experimentos (os quais foram realizados em

sequência, sendo que o terceiro e o quarto foram realizados concomitantemente), foi

possível aferir um aumento no número das brotações, em ambas cultivares, entre o

segundo e terceiro experimentos (Fig. 2A e 3A), já que no segundo experimento os

valores estavam condizentes com os encontrados no primeiro (Fig. 1A). As

cultivares Ya-Li e Carrick, que produziam 3 e 3,9 brotações por explante, passaram

a produzir 4,8 e 5,8, respectivamente, sendo que isso se manteve no quarto

experimento (Fig. 4A). Esse fato pode estar relacionado ao estado fisiológico do

explante e juvenilidade do tecido após os subcultivos, bem como às condições de

luminosidade, pois ocorre diminuição na intensidade de fluxo de fótons conforme as

40

lâmpadas vão sendo utilizadas na sala de crescimento. A luz é um fator importante

para o desenvolvimento das plantas, podendo influenciar a taxa de multiplicação in

vitro (RADMANN et al., 2001), regulando os processos fotossintéticos e a

fotomorfogênese (KOZAI et al., 1997). Poucos trabalhos têm sido realizados com o

objetivo de verificar os efeitos da qualidade de luz ou, mesmo, de diferentes níveis

de irradiância no crescimento e no desenvolvimento de espécies cultivadas in vitro

(BRAGA et al., 2009). No entanto, Zanandrea et al. (2009), estudando a influência

de diferentes densidades de fluxo de fótons no cultivo in vitro de macieira, obteve as

melhores respostas com o uso de 14 mmol m-2 s-1, o que é considerado baixo,

comparado aos 48 μmol m-2 s-1 comumente utilizados na sala de crescimento.

Assim, isso justifica a possibilidade de que, uma redução na luminosidade possa ter

causado o aumento no número das brotações verificado no presente estudo.

5 Conclusões

De acordo com os resultados obtidos neste trabalho, pode-se concluir que:

– O meio mais apropriado para a multiplicação in vitro das cultivares é o MS, tanto

na forma comercial como o preparado em laboratório, mesmo quando utilizando

ferro na forma férrica ou ferrosa;

– Ambas cultivares necessitam de suplementação de citocinina exógena para a

proliferação de brotações (1,2 mg L-1 de BAP);

– As cultivares em estudo respondem diferentemente quanto à concentração de

sacarose utilizada no processo de multiplicação in vitro, sendo a cultivar Ya-Li mais

exigente (45 g L-1) que a cv. Carrick (30 g L-1).

6 Referências bibliográficas

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41

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45

CAPÍTULO 2 – Multiplicação in vitro de pereira, cv. Cascatense

1 Introdução

Por ser uma fruta de grande aceitação para o consumo in natura, a produção

de pera (Pyrus sp.) é realizada em todo o mundo, o que a torna de grande

importância nos mercados internacionais (FAO, 2011). No Brasil, entre as frutas de

clima temperado, é a terceira mais consumida, embora seja a fruta fresca importada

em maior quantidade, aproximadamente 140.000 ton., o que representa mais de

90% do total consumido, devido a uma menor expressão em termos de produção e

área cultivada (NAKASU; FAORO, 2003; NAKASU et al., 2007; FACHINELLO;

FRANCESCATTO, 2009; FACHINELLO et al., 2011). Segundo Nakasu; Faoro

(2003) e Tomaz et al. (2009), o principal entrave para o bom desenvolvimento e

expansão da cultura é a falta de cultivares adaptadas às condições edafoclimáticas

das regiões potencialmente produtoras.

Os estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina, além da capacidade de

aproveitamento das estruturas de pós-colheita, conservação e canais de

comercialização utilizados na cadeia produtiva da maçã, são os que apresentam

condições climáticas favoráveis à produção da pereira (JUNQUEIRA; PEETZ, 2003).

Entretanto, em muitos locais e em determinados anos, a quantidade de horas de frio

hibernal é insuficiente para que ocorra uma boa e uniforme brotação e floração,

gerando, com isso, baixa produtividade e qualidade das frutas. Assim, cultivares

recomendadas para essas regiões devem apresentar média a baixa exigência em

frio (FAORO, 2002; SATO; ASSUMPÇÃO, 2003).

Neste contexto, o Programa de Melhoramento Genético da Embrapa Clima

Temperado lançou a cv. Cascatense, resultante do cruzamento de „Packham‟s

Triumph‟ x „Le Conte‟, realizado em 1968, selecionada em 1982 como Pirus 9 e

lançada como cultivar em 1992. A planta é de vigor médio a semi-vigorosa, semi-

46

aberta e altamente produtiva, apresentando brotações mais precoces e uniformes,

enquanto que a fruta é piriforme e de tamanho médio. Além disso, sua exigência em

frio hibernal situa-se ao redor de 400 h (temperatura ≤ 7,2 °C) (NAKASU et al., 2007;

NAKASU; FAORO, 2003; NAKASU; LEITE, 1992).

A propagação do material vegetal, almejando à produção de mudas com

qualidade e uniformidade pode ser realizada através da micropropagação ou

propagação in vitro, em vista de ser um método biotecnológico que se constitui na

produção de um elevado número de plantas, num curto espaço de tempo, ocupando

uma área física bastante reduzida, sendo realizado durante o ano todo e com alta

qualidade sanitária (SERAFINI, et al. 2001; CARVALHO et al., 2011).

Protocolos de micropropagação vêm sendo desenvolvidos para que as

condições de cultivo in vitro sejam otimizadas, possibilitando a obtenção de taxas

elevadas de multiplicação, e consequentemente, qualidade nas mudas formadas

(ROGALSKI et al., 2003; GUERRA; NODARI, 2006). Para que ocorra um adequado

crescimento e desenvolvimento das plantas durante a fase de multiplicação do

material vegetal, é necessário o controle da morfogênese, a qual é influenciada por

vários fatores como espécie, cultivar, tipo de explante, componentes do meio

nutritivo, reguladores de crescimento adicionados ao meio e ambiente de cultivo

(CARVALHO et al., 2006).

Os meios de cultivo são compostos por sais minerais (macro e

micronutrientes), carboidratos, vitaminas e reguladores de crescimento, podendo ser

líquidos ou semi-sólidos (solidificados com ágar ou outro geleificante) (GUERRA;

NODARI, 2006). Existem diversos meios de cultura, variando as concentrações de

sais e vitaminas de acordo com as necessidades da espécie ou cultivar, porém os

mais utilizados são o clássico MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) e suas

modificações e diluições; assim como o WPM [Wood Plant Medium (LLOYD;

MCCOWN, 1980)] e o QL (QUOIRIN; LEPOIVRE, 1977), cujas formulações são

consideradas mais fracas.

A concentração da fonte de carbono utilizada no meio é outro fator importante

durante a multiplicação dos explantes, pois os carboidratos fornecem energia e

contribuem para o equilíbrio do potencial osmótico do meio de cultura (PATI et al.,

2006). Em geral, a sacarose é utilizada preferencialmente, porque é o carboidrato

predominante na seiva do floema da grande maioria das plantas e também a mais

barata (LEITE et al., 2000).

47

Em relação aos reguladores de crescimento, a aplicação de uma fonte de

citocinina no meio de multiplicação é indispensável para a superação da dominância

apical do explante e induzir a proliferação de gemas axilares. Dentre as citocininas,

a 6-benzilaminopurina (BAP) é a mais utilizada, sendo considerada um fitorregulador

responsável pela divisão celular e crescimento da parte aérea, além de se destacar

das demais por ter um menor custo (PEREZ-TORNERO; BURGOS, 2000).

Diante do exposto, buscou-se neste trabalho verificar a influência dos

diferentes meios de cultivo, concentrações de sacarose e BAP na multiplicação in

vitro da cv. Cascatense, visando obter um protocolo eficiente para potencializar sua

propagação/reprodutibilidade.

2 Material e Métodos

Os explantes utilizados para o desenvolvimento do trabalho foram

provenientes de brotações de pereira, cv. Cascatense, pré-estabelecidas e

multiplicadas in vitro, durante 40 dias, em meio de cultivo MS pronto Himédia® (meio

comercial com formulação igual ao MS), acrescido de 0,8 mg L-1 de BAP), 30 g L-1

de sacarose e 7 g L-1 de ágar, sendo o pH ajustado para 5,8.

Os estudos foram conduzidos em três experimentos sequenciais, conforme

descrito abaixo, sendo que cada experimento foi repetido duas vezes. Para a

realização dos experimentos, como explante inicial, foram utilizados segmentos

nodais de aproximadamente 1,0 cm contendo de duas a três gemas axilares. As

gemas axilares presentes nos segmentos nodais, bem como o comprimento destes

foram incluídos nas avaliações realizadas. Gemas e brotações incipientes, menores

que três milímetros, não foram consideradas por serem muito pequenas e de difícil

manuseio.

Experimento 1 – Influência de diferentes meios de cultivo e concentrações de

sais

Os explantes iniciais foram cultivados em cinco meios diferentes: MS

completo e MS modificado (¾ da concentração normal de NH4NO3 e KNO3,

identificado nos resultados como MS¾), MS Himédia, WPM e QL; todos contendo

0,8 mg L-1 de BAP, 100 mg L-1 de mio-inositol, 30 g L- 1 de sacarose, 7 g L-1 de ágar

e pH 5,8. Os meios MS completo, MS¾ e QL foram preparados com EDTA-Férrico,

48

enquanto o MS Himédia e WPM com EDTA-Ferroso, conforme formulação original

do meio MS.

Os frascos foram mantidos em câmara de crescimento com temperatura de

23±2ºC, fotoperíodo de 16 horas e 48 μmol m-2 s-1 de fluxo de fótons por 40 dias.

Após este período, avaliou-se o número de brotações por explante, o comprimento

das brotações (cm), o número de gemas axilares por brotação, massa fresca e

massa seca das brotações (g), sendo a secagem do material realizada em estufa de

ventilação forçada a ±50 ºC até massa constante.

Experimento 2 – Efeito das concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP)

O meio de cultura usado foi o que apresentou melhores resultados após a

realização do primeiro experimento (MS Himédia), suplementado com diferentes

concentrações de BAP (0; 0,4; 0,8; 1,2 e 1,6 mg L-1), 30 g L-1 de sacarose, 7 g L-1 de

ágar e pH 5,8. As condições de cultivo e as variáveis analisadas foram as mesmas

do experimento anterior.

Experimento 3 – Efeito de diferentes concentrações de sacarose

O meio de cultivo e a concentração de BAP utilizados foram os que

apresentaram melhores resultados após a realização do primeiro e segundo

experimentos (MS Himédia e 0,8 mg L-1 de BAP), variando-se a concentração de

sacarose (0, 15, 30, 45 e 60 g L-1), com 7 g L-1 de ágar e pH 5,8. As condições de

cultivo e as variáveis analisadas foram as mesmas dos experimentos anteriores.

Delineamento experimental e análise estatística

O delineamento experimental adotado para todos os experimentos foi

inteiramente casualizado, com nove repetições por tratamento, representadas, cada

uma, por um frasco contendo cinco explantes. Para as avaliações de massa fresca e

massa seca das brotações foram selecionadas, ao acaso, três plantas de cinco

repetições, totalizando quinze plantas por tratamento.

Os experimentos foram compostos por apenas um fator de tratamento, com

cinco níveis: meio de cultura (MS, MS¾, MS Himédia, WPM e QL) para o primeiro

experimento, concentração de BAP (0; 0,4; 0,8; 1,2 e 1,6 mg L-1) para o segundo

experimento e concentração de sacarose (0, 15, 30, 45 e 60 g L-1) para o terceiro

experimento.

49

Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias

comparadas pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade de erro, ou

analisadas por regressão polinomial, utilizando o software WINSTAT 1.0

(MACHADO; CONCEIÇÃO, 2007).

3 Resultados

Segundo a análise de variância e/ou regressão polinomial, observou-se

diferenças significativas entre os tratamentos para todas as variáveis analisadas,

nos três experimentos.

Experimento 1 – Influência de diferentes meios de cultivo e concentrações de

sais

O maior número de brotações por explante (6,18) foi observado no meio WPM

(Fig. 1A). Em contrapartida, os maiores valores para comprimento (2,5 cm), massa

fresca (0,39 g), massa seca (0,06 g) e número de gemas axilares por brotação

(13,17) foi obtido no meio Himédia (Fig. 1B, C, D e E), o qual não diferiu

estatisticamente dos meios MS (12,1) e MS¾ (11,83) para esta última variável. O

meio de cultivo QL não pode ser avaliado quanto ao número de gemas axilares por

brotação devido ao entufamento das brotações ocasionada pela redução no número

e comprimento das mesmas, não permitindo sua contagem.

50

ABBC

AB

A

C

0

1

2

3

4

5

6

7

MS MS3/4 HIMÉDIA WPM QL

Nb

rota

çõ

es/e

xp

lan

te**

C

BC

A

AB

D

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

MS MS3/4 HIMÉDIA WPM QL

Massa S

eca (

g)*

*

C

B

A

B

C

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

MS MS3/4 HIMÉDIA WPM QL

Massa F

resca (

g)*

*

Figura 1 – Número de brotações por explante (A), comprimento das brotações (B), número de gemas axilares por brotação (C), massa fresca e seca das brotações (g) (D e E), respectivamente, de pereira, cv. Cascatense, submetidos a diferentes meios de cultivo e concentrações de sais. ** Significativo pelo teste F a 1% de probabilidade de erro. Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade de erro.

BB

A

CC

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

MS MS3/4 HIMÉDIA WPM QL

Co

mp

r. b

rota

çõ

es(c

m)*

*

A AA

B

0

2

4

6

8

10

12

14

16

MS MS3/4 HIMÉDIA WPM

Ng

em

as/b

rota

ção

** C D

E

A B

Meios de cultivo

Meios de cultivo

51

Experimento 2 – Efeito das concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP)

A adição de BAP ao meio de cultivo resultou em uma resposta quadrática

para as variáveis número de brotações por explante, comprimento, massa fresca e

massa seca das brotações.

Para as variáveis número de brotações por explante e comprimento das

brotações, embora o ponto de máxima tenha ocorrido nas concentrações de 1,02 e

1,26 mg L-1 de BAP, com 4,95 brotações formadas e 2,28 cm de comprimento,

respectivamente, o maior número de brotações por explante (5,2) foi obtido na

concentração de 0,8 mg L-1 (Fig. 2A), enquanto que o maior comprimento das

mesmas foi verificado quando o meio foi suplementado com 1,6 mg L-1 desta

citocinina (2,35 cm), sendo que este resultado não é tão superior ao encontrado

quando utilizada a concentração de 0,8 mg L-1 de BAP (2,09 cm) (Fig. 2B).

Em relação à massa fresca e massa seca, pela estimativa da equação de

regressão, os maiores valores (0,4 e 0,06 g) ocorreram nas concentrações de 1,28 e

1,18 mg L-1 de BAP, consecutivamente (Fig. 2D e 2E). Porém, para massa seca

verificou-se que a partir de 0,8 mg L-1 de BAP já era obtido esse valor (0,06 g), não

variando nas concentrações mais elevadas.

No que se refere ao número de gemas axilares por brotação (Fig.2C), houve

uma resposta linear crescente, com maiores valores obtidos na concentração de 1,6

mg L-1, apresentando uma média 16,68 gemas formadas.

52

y = -3,943x2 + 8,053x + 0,841R² = 0,958**

0

1

2

3

4

5

6

7N

bro

taçõ

es/e

xp

lan

te**

y = 5,806x + 8,180R² = 0,808**

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Ng

em

as/b

rota

ção

**

y = -0,202x2 + 0,519x + 0,072R² = 0,995**

00,05

0,10,15

0,20,25

0,30,35

0,40,45

0,50,55

0,6

0 0,4 0,8 1,2 1,6

Massa F

resca (

g)*

*

Concentrações de BAP (mg L-1)y = -0,031x2 + 0,073x + 0,018R² = 0,97**

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,1

0 0,4 0,8 1,2 1,6

Massa S

eca (

g)*

*

Concentrações de BAP (mg L-1)

Figura 2 – Número de brotações por explante (A), comprimento das brotações (B),

número de gemas axilares por brotação (C), massa fresca e seca das brotações (g) (D e E), respectivamente, de pereira, cv. Cascatense, submetidos a diferentes concentrações de BAP (mg L-1). ** Significativo pelo teste F a 1% de probabilidade de erro.

y = -0,665x2 + 1,678x + 1,222R² = 0,753**

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

2,4

2,6

2,8

3

Co

mp

r. b

rota

çõ

es (

cm

)** A B

C D

E

53

Experimento 3 – Efeito de diferentes concentrações de sacarose

Quando adicionada sacarose ao meio de cultivo, verificou-se uma tendência

quadrática para todas as variáveis analisadas. Os maiores valores estimados para

número de brotações por explante (4,95) e comprimento das brotações (2,06 cm)

ocorreram nas concentrações de 32,13 e 29 g L-1 de sacarose, respectivamente.

Entretanto, em valores numéricos, observou-se que o uso de 30 g L-1 deste

carboidrato induziu as melhores respostas, com a formação de 5,1 brotações (Fig.

3A) de 2,2 cm de comprimento cada (Fig. 3B).

Segundo a equação de regressão, maiores valores para número de gemas

axilares por brotação (13,8) (Fig. 3C) e massa fresca (0,368 g) (Fig. 3D) foram

obtidos nas concentrações de 29,03 e 33,93 g L-1 de sacarose, consecutivamente.

Porém, estes valores não são tão superiores quando utilizada a concentração de 30

g L-1 de sacarose, com 13,52 gemas axilares formadas e obtenção de 0,36 g massa

fresca.

Com relação à massa seca, embora o ponto de máxima tenha inferido que a

concentração ideal seja 36,83 g L-1 de sacarose, com obtenção de 0,048 g (Fig. 3E),

verificou-se, em valores absolutos, que as médias foram maiores quando

suplementados 30 e 45 g L-1 deste açúcar ao meio de cultivo (0,05 g).

54

y = -3,53E-05x2 + 0,0026x - 0,0001 R² = 0,939**

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0 15 30 45 60

Massa S

eca (

g)*

*

Concentrações de sacarose (g L-1)

y = -0,001x2 + 0,058x + 1,218R² = 0,982**

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

2,4

2,6

2,8

3

Co

mp

r. b

rota

çò

es (

cm

)**

y = -0,00446x2 + 0,259x + 10,048R² = 0,962**

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Ng

em

as/b

rota

ção

**y = -0,00347x2 + 0,223x + 1,374

R² = 0,911**

0

1

2

3

4

5

6

7

8N

bro

taçò

es/e

xp

lan

te**

Figura 3 – Número de brotações por explante (A), comprimento das brotações (B), número de gemas axilares por brotação (C), massa fresca e seca das brotações (g) (D e E), respectivamente, de pereira, cv. Cascatense, submetidos a diferentes concentrações de sacarose (g L-1). ** Significativo pelo teste F a 1% de probabilidade de erro.

y = -0,00028x2 + 0,019x + 0,046R² = 0,988**

00,05

0,10,15

0,20,25

0,30,35

0,40,45

0,50,55

0,6

0 15 30 45 60

Massa F

resca (

g)*

*

Concentrações de sacarose (g L-1)

A B

C D

E

55

4 Discussão

As taxas de crescimento e desenvolvimento de plantas cultivadas in vitro são

geneticamente determinadas, embora sejam limitadas pelo microambiente físico e

químico dos recipientes de cultivo, como excesso de nutrientes e alta concentração

de reguladores de crescimento, que podem comprometer a formação das plantas

(CASANOVA et al., 2008). Dessa forma, as quantidades fornecidas e o balanço de

nutrientes e reguladores de crescimento, bem como de carboidratos, são fatores

determinantes para o sucesso da multiplicação do material vegetal in vitro (ZHANG

et al., 2003; MORAES et al., 2004), como visualizado neste trabalho, a partir dos

resultados obtidos nos experimentos.

Conforme Guerra e Nodari (2006), a constituição de cada meio de cultivo

deve ser baseada nas exigências das plantas quanto aos nutrientes minerais para

atender necessidades específicas, em vista que os minerais exercem importante

papel não apenas no crescimento, mas também na regulação da morfogênese. Seu

fornecimento, absorção, transporte e metabolismo parecem variar entre os estágios

de desenvolvimento dos órgãos, iniciação dos meristemas e durante o crescimento

(RAMAGE; WILLIAMS, 2002). Baseado nisso, analisando-se a influência de

diferentes meios de cultivo e concentrações de sais durante a multiplicação da

cultivar em estudo (Fig. 4A), verificou-se que, em geral, os melhores resultados

foram obtidos em MS Himédia. Por se tratar de um meio pronto, comercial, essa

resposta positiva pode ser devido à qualidade dos sais minerais utilizados e/ou a

alterações na quantidade dos reagentes quando as soluções são preparadas no

laboratório.

56

Figura 4 – Brotações de Pyrus sp., cv. Cascatense, obtidas após serem submetidas a diferentes meios de cultivo e concentrações de sais (A), concentrações de BAP (B) e concentrações de sacarose (C).

57

Outro aspecto a ser considerado é que, tanto o MS Himédia como o WPM

foram preparados com Ferro na forma reduzida e mais solúvel, enquanto o MS

completo, MS¾ e QL, na forma de EDTA-Férrico – oxidada. Segundo Schmidt

(2003), o ferro é considerado um micronutriente essencial para o crescimento e

desenvolvimentos das plantas, estando envolvido em diversos processos, como na

respiração mitocondrial e fotossíntese, sendo que a forma absorvida pela maioria

das plantas é Fe2+ (forma mais solúvel), embora possa também ser absorvido como

Fe3+-quelato. Sendo assim, isto também pode explicar o aumento no número de

brotações por explante quando utilizado o WPM, no qual, em contrapartida,

observou-se menor comprimento das brotações. O aumento exacerbado no número

de brotações promove uma competição por sais e vitaminas presentes no meio de

cultivo, o que pode acarretar em redução do crescimento (OLIVEIRA et al., 2001).

Com o uso do meio nutritivo QL observou-se redução em todos os parâmetros

analisados, além da impossibilidade de avaliar o número de gemas por brotação, o

que pode estar relacionado ao fato deste apresentar apenas 25% da concentração

de nitrogênio (NH4NO3) em comparação ao MS, mostrando que composições muito

diluídas deste macronutriente não são favoráveis à multiplicação da cultivar

Cascatense. O nitrogênio é um dos principais nutrientes essenciais e ativos, sendo

absorvido, principalmente, na forma de nitrato (NO3-) e amônio (NH4

+) e é

constituinte de várias biomoléculas essenciais, como aminoácidos, ácidos nucléicos,

proteínas, enzimas e outros. Em razão disso, possui diferentes efeitos no

crescimento, no vigor do vegetal e na produção de biomassa (XU et al., 2012).

Neste contexto, analisando os diferentes meios de cultivo e concentrações de

sais utilizadas em diversos trabalhos, apesar de o WPM ter sido desenvolvido para o

cultivo de brotações de plantas lenhosas (BRUM, 2001), e apresente resultados

positivos na micropropagação de espécies como o mirtilo (SILVA et al., 2006) e em

Prunus sp. (RADMANN et al., 2009), e, embora as espécies e cultivares de pera

sejam cultivadas em vários meios de cultura conhecidos, segundo Reed et al.

(2013), o MS é o mais comumente usado. Assim, na ausência de MS pronto

Himédia, esse seria recomendado para a cv. Cascatense, mesmo com diluições na

concentração de NH4NO3 e KNO3, como pode ser visualizado na Fig. 4A.

Os resultados obtidos em relação à utilização de citocininas no meio de

cultivo (Fig. 4B) demonstraram que estas são indispensáveis na fase de

multiplicação in vitro, pois são responsáveis pela divisão celular, quebra da

58

dominância apical e indução da proliferação de gemas axilares (MOK et al., 2000).

Estes resultados são similares aos verificados por Moraes et al. (2004) em Pyrus

calleryana D-6, bem como Radmann et al. (2011), em Prunus sp., portaenxerto

„Flordaguard‟, os quais constataram que a ausência de BAP não estimula a emissão

de novos brotos, evidenciando assim uma dependência pela adição de citocinina

externa para a indução de brotações.

De acordo com o observado neste trabalho, a concentração adequada de

BAP para a multiplicação in vitro de „Cascatense‟ foi 0,8 mg L-1, pois, analisando

todas as variáveis, foi a que desencadeou melhores resultados, uma vez que é

importante obter brotações com comprimento adequado, visando facilitar seu

manuseio, separação e posterior utilização no enraizamento. Neste sentido, de

acordo com Dantas et al. (2002), para que a multiplicação in vitro seja considerada

eficiente, é necessário obter uma taxa média satisfatória de brotações em que sejam

priorizadas qualidade e homogeneidade, pois isso vai contribuir para o sucesso da

fase de enraizamento e, por conseguinte, para a produção de mudas.

Enquanto o uso de citocinina estimula maior produção de parte aérea, o

excesso é tóxico e compromete o desenvolvimento das culturas, podendo levar à

hiperidricidade (RAMAGE; WILLIAMS, 2004), que, segundo Santos-Serejo et al.

(2006), é um evento que pode ocorrer na cultura de tecidos, gerando anormalidades

fisiológicas e morfológicas no tecido vegetal, afetando os processos de fotossíntese

e trocas gasosas da planta. Os explantes vitrificados caracterizam-se por

apresentarem folhas translúcidas, túrgidas, rígidas, com aspecto encharcado e

facilmente quebráveis, apresentando brotações mal formadas e alongadas

(HAZARIKA, 2006), o que pode ser verificado no presente estudo, quando utilizada a

concentração mais elevada de BAP (1,6 mg L-1) (Fig. 4B).

No que tange ao uso de carboidratos, é clara sua função como fonte de

energia para a produção de novos metabólitos, além de atuar como substrato para o

processo de respiração celular (BORTOLINI, 2006; PIO et al., 2002). A concentração

destes no meio de cultivo é um dos parâmetros que reflete no

crescimento/desenvolvimento das brotações e pode apresentar correlação com a

habilidade das plantas ao enraizamento (BORTOLINI, 2006), uma vez que, para a

formação de raízes, a auxina requer fonte de carbono para a biossíntese de ácidos

nucléicos e proteínas. Assim, há necessidade de energia e carbono para a formação

das raízes (NORBERTO et al., 2001). A adição de carboidratos no meio de cultivo

59

também pode contribuir para o equilíbrio do potencial osmótico do meio, modificando

o potencial hídrico e, assim, regulando a absorção de água e nutrientes pelo

explante (LÉDO et al., 2007). Além disso, seu excesso pode ser prejudicial, pois

inibe a síntese de clorofila e, portanto, reduz a capacidade fotossintética das culturas

(HAZARIKA, 2006).

Diante do exposto, e conforme os resultados obtidos em relação ao efeito das

diferentes concentrações de sacarose durante a multiplicação in vitro da pereira

„Cascatense‟, verificou-se que a concentração de 30 g L-1 foi a mais efetiva, pois

desencadeou as melhores respostas, em vista que concentrações inferiores e

superiores acarretaram em redução no crescimento e desenvolvimento das

brotações, como pode ser visualizado na Fig. 4C. Embora a concentração de 3% de

sacarose seja a comumente suplementada in vitro na maioria das espécies, avaliar a

concentração adequada para cada espécie/cultivar é de suma importância devido a

sua função regulatória em muitos processos vitais da planta. Ainda, segundo De

Riek et al. (1997), 75% a 85% do aumento da biomassa se devem à incorporação de

carbono pela adição de sacarose ao meio de cultivo.

O sucesso na obtenção de um protocolo apropriado de propagação de

plantas em larga escala está intimamente relacionado às altas taxas de multiplicação

dos explantes. Assim, os parâmetros avaliados no decorrer dos experimentos

servem como ferramentas úteis para a verificação dessas taxas. Contudo, as

variáveis mais importantes são número e comprimento das brotações, bem como o

número de gemas axilares por brotação, pois estas, em conjunto, vão determinar

uma maior ou menor eficiência do processo de multiplicação. Além disso, conforme

preconizado por Radmann et al. (2009), o crescimento das brotações formadas

durante a fase de multiplicação é uma variável determinante na qualidade do

material destinado à fase de enraizamento.

5 Conclusões

Nas condições que o trabalho foi conduzido, pode-se concluir que o protocolo

mais eficiente para a multiplicação in vitro da cultivar em estudo é constituído pelo

MS Himédia comercial, com suplementação de 0,8 mg L-1 de BAP e 30 g L-1 de

sacarose.

60

6 Referências bibliográficas

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64

CAPÍTULO 3 – Radiosensibilidade em micropropagação de Pyrus sp., cv.

Ya-Li: efeitos morfofisiológicos

1 Introdução

Na fruticultura moderna buscam-se, cada vez mais, tecnologias que

possibilitem a produção de frutas de alta qualidade, com menor investimento e alto

retorno econômico. Isso se deve ao nível crescente das exigências do mercado,

cada vez mais competitivo (SOUZA, 2010). O Brasil é o segundo maior produtor

mundial de frutas, entretanto possui uma pequena participação no mercado

internacional. A exportação de frutas de clima temperado está aos poucos ganhando

espaço no mercado, e nos últimos anos, a quantidade de frutas exportadas, como a

maçã, ameixa, pêssego e morango aumentaram (REETZ et al., 2007). Entre as

frutas de clima temperado, a pera (Pyrus sp.) é a terceira mais consumida, porém, a

maior parte é importada (95%), pois seu cultivo ainda é pequeno (NAKASU et al.,

2007; FACHINELLO; FRANCESCATTO, 2009). A falta de cultivares adaptadas,

aptas a produzir com regularidade, em quantidade e qualidade, é um dos maiores

obstáculos à sua produção sustentável (NAKASU; FAORO, 2003; NAKASU, 2003).

Técnicas de indução de mutação têm se mostrado eficientes na produção de

variabilidade genética e, por isso, muito utilizadas em programas de melhoramento

de várias espécies de plantas, como a pereira, em vista que o melhoramento

genético convencional não supre estas carências, devido a pouca variabilidade

genética, ciclos longos e alogamia (JOSEPH et al., 2004; DE BONDT et al., 1996).

Com o uso de radiações ionizantes já foram obtidos vários mutantes com

características de interesse como maior produtividade, precocidade, menor porte,

maior resistência às doenças e pragas em diferentes espécies (KLEINHANS, 2009),

sendo que mais de 2500 variedades mutantes melhoradas já foram liberadas para o

cultivo comercial, demonstrando o valor econômico da mutação induzida para o

65

melhoramento das mesmas (PATADE; SUPRASANNA, 2008). Dessa forma, o

número de cultivares derivados de mutação induzida aumenta constantemente,

existindo catalogados no banco da FAO com cerca de 50 cultivares de fruteiras

pertencentes a mais de 20 diferentes espécies (FAO, 2009).

Segundo Predieri e Zimmermann (2001), a irradiação com raios gama é a via

mais utilizada para induzir mutação em plantas, pois possui dosimetria precisa, alta

e uniforme penetrabilidade nos tecidos e células, podendo ser realizada em várias

fases de desenvolvimento da planta. Neste contexto, esta técnica, acoplada à

cultura de tecidos, é uma alternativa promissora que permite a multiplicação e/ou

melhoramento de cultivares específicas e de interesse econômico, como a pereira

(MORAES et al., 2004).

O cultivo in vitro destaca-se também pela produção de plantas em larga

escala e com alta qualidade sanitária (BELL; REED, 2002; SILVA et al., 2006;

SOUZA et al., 2006; ZANANDREA et al., 2006). Entretanto, o sucesso desta prática

depende do crescimento e desenvolvimento adequado dos explantes durante as

fases de indução e multiplicação das brotações, aliados à capacidade de

enraizamento das brotações e das plantas obtidas resistirem à aclimatização

(HAZAKIRA, 2006).

Nas etapas de indução, multiplicação e enraizamento in vitro das brotações,

vários fatores podem influenciar, sendo os principais a composição do meio de

cultivo, como os tipos e concentrações de reguladores de crescimento utilizados

(principalmente citocininas e auxinas) e as condições ambientais às quais os tecidos

foram submetidos (SOTIROPOULOS et al., 2006; ZANANDREA et al., 2006). Além

desses fatores, o uso de radiações ionizantes também pode acarretar variações,

sejam elas epigenéticas ou genéticas, como observado por Silva (2009), Silva

(2013) e Hung e Johnson (2008).

Conforme Bandeira et al. (2012), o processo de aclimatização é considerado

um dos gargalos do cultivo in vitro, principalmente em espécies lenhosas, devido à

alta taxa de mortalidade das plantas, ocasionada, muitas vezes, por um sistema

radicular deficiente. Sendo assim, visando a formação de raízes com qualidade,

muitos autores apontam para a necessidade de inclusão de uma auxina na fase de

indução do enraizamento em espécies frutíferas, promovendo acréscimo na taxa de

sobrevivência das plantas após a transferência para as condições ex vitro

(RADMANN et al., 2002; ROGALSKI, et al., 2003; BARBOSA et al., 2008). Convém

66

ressaltar, ainda, que durante o processo de rizogênese in vitro, o uso de substratos

inertes embebidos no meio nutritivo, como a vermiculita, tem demonstrado

vantagens em relação ao ágar, pois além da propriedade de melhorar a aeração do

substrato e favorecer o desenvolvimento das raízes adventícias, são mais

econômicos (TIBOLA et al., 2004).

Diante do exposto, o presente trabalho tem como objetivo verificar os efeitos

de diferentes doses de radiação gama (60Co) durante a micropropagação de pereira,

cv. Ya-Li, almejando selecionar novos genótipos com características de interesse, a

partir dos genótipos originais, os quais serão utilizados em futuros programas de

melhoramento da espécie.

2 Material e Métodos

Os explantes utilizados para o desenvolvimento do trabalho foram

provenientes de brotações de pereira, cv. Ya-Li, pré-estabelecidas e multiplicadas in

vitro em meio de cultivo MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), suplementado com 0,8

mg L-1 de BAP (6-benzilaminopurina), 100 mg L-1 de mio-inositol, 30 g L-1 de

sacarose, pH 5,8 e 7,0 g L-1 de ágar.

Para a irradiação do material vegetal, segmentos nodais de aproximadamente

1,0 cm, contendo de duas a três gemas axilares, foram inoculados em placas de

Petri com 20 mL de meio MS, acrescido de 7,0 g L-1 de ágar, sem reguladores de

crescimento e expostos a diferentes doses de radiação gama (0, 10, 20, 30 e 40

Gy), sendo esta obtida de uma fonte de 60Co com taxa de rendimento de 0,8211

Gy/min para um campo de30x30 cm e uma distância foco-objeto irradiado de 80 cm,

pertencente ao Centro de Irradiação da Faculdade de Medicina da Universidade

Federal de Pelotas.

Durante as fases de indução e multiplicação das brotações irradiadas e não

irradiadas, os explantes foram cultivados em meio MS contendo 0,8 mg L-1 de BAP,

100 mg L-1 de mio-inositol, 30 g L-1 de sacarose, pH 5,8 e 7 g L-1 de ágar e mantidos

em câmara de crescimento com temperatura de 23±2ºC, fotoperíodo de 16 horas e

48 μmol m-2 s-1 de densidade de fluxo de fótons. Após 45 dias (período de indução

das brotações), avaliou-se a percentagem de explantes sobreviventes e

regenerantes (%), o número de brotações por explante, o comprimento das

brotações (cm) e o número de gemas axilares por brotação.

67

As brotações obtidas na fase de multiplicação, desenvolvidas a partir dos

explantes inicialmente irradiados e não irradiados, com aproximadamente 2,0 cm de

comprimento, foram utilizadas para o enraizamento in vitro. Suas bases foram

excisadas em bisel e inoculadas em meio MS [com ½ da concentração dos macro e

micronutrientes (com exceção do Fe e vitaminas)], acrescido de 30 g L-1 de

sacarose, 100 mg L-1 de mio-inositol e 0,8 mg L-1 de AIB (ácido indolil-butírico), com

pH ajustado para 5,8 e utilizando-se dois tipos de substrato [vermiculita de grânulos

médios (3 g frasco-1) ou ágar (7 g L-1)]. Os frascos foram mantidos em câmara de

crescimento sob as mesmas condições de cultivo anteriormente descritas. Após 30

dias, foram analisados percentagem de enraizamento (%), número de raízes por

planta, comprimento da maior raiz (cm) e percentagem de calos formados (%).

Todas as brotações enraizadas foram transferidas para bandejas plásticas

com tampa, contendo vermiculita, permanecendo em estufa de vidro com

temperatura controlada (18±2ºC) por 30 dias. Após uma semana da transferência

para estufa, as tampas das bandejas começaram a ser abertas progressivamente.

Decorrido o período de aclimatização, foi avaliada a percentagem de plantas

sobreviventes (%), as quais foram transplantadas para bandejas alveoladas de

polipropileno contendo substrato Carolina®, onde foram mantidas por mais 60 dias e,

em seguida, transferidas para potes plásticos com capacidade de 3 L, onde

permaneceram por 60 dias. Posteriormente, foram levadas para o campo, para

posterior avaliação dos melhoristas da cultura (pesquisadores da Embrapa).

O experimento de indução das brotações in vitro foi conduzido com

delineamento experimental inteiramente casualizado, contendo apenas um fator de

tratamento composto por cinco doses de radiação, com nove repetições por

tratamento, representadas, cada uma, por um frasco contendo cinco explantes.

Para o experimento de enraizamento in vitro foi utilizado o delineamento

experimental inteiramente casualizado, seguindo um arranjo bifatorial 5x2 (cinco

doses de radiação e dois tipos de substrato), com cinco repetições por tratamento,

sendo cada repetição representada por um frasco contendo cinco explantes.

Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias

comparadas pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade de erro, ou

analisadas por regressão polinomial, utilizando o software WINSTAT 1.0

(MACHADO; CONCEIÇÃO, 2007). Porém, em relação à percentagem de plantas

sobreviventes após a aclimatização foi realizada apenas uma análise descritiva.

68

3 Resultados

Observou-se diferença significativa entre os tratamentos para todas as

variáveis analisadas durante a fase de indução de brotações in vitro. Com base nos

resultados obtidos, verificou-se que o incremento das doses de irradiação afetou

negativamente todas as variáveis analisadas, como pode ser observado na Fig. 1. A

dose de 40 Gy determinou uma redução de 53,33% nos parâmetros percentagem de

explantes sobreviventes e regenerantes, sendo que para as variáveis número de

brotações por explante, número de gemas axilares por brotação e comprimento das

brotações (cm) este decréscimo foi de 47,1; 51,37 e 80,55%, respectivamente, em

relação ao controle.

Porém, comparando-se a dose de 10 Gy com o tratamento não irradiado,

ambos os tratamentos apresentaram uma média de 80% de explantes regenerantes,

enquanto que nas demais variáveis a resposta foi semelhante, com redução de

apenas 6,67; 2,32; 9,65 e 16,67% para percentagem de explantes sobreviventes,

número de brotações por explante, número de gemas axilares por brotação e

comprimento das brotações (cm), respectivamente.

69

y = -0,933x + 81,33R² = 0,844**

0

20

40

60

80

100

% r

eg

en

era

nte

s**

y = -0,217x + 17,15R² = 0,99**

6

8

10

12

14

16

18

0 10 20 30 40

Ng

em

as/b

rota

ção

**

Gyy = -0,029x + 1,45

R² = 0,994**

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0 10 20 30 40

Co

mp

rim

en

to b

rota

çõe

s (c

m)*

*

Gy

Figura 1 – Percentagem de explantes sobreviventes (A) e regenerantes (B), número

de brotações por explante (C), número de gemas axilares por brotação (D) e comprimento das brotações (E) de pereira, cv. Ya-Li, submetidos a diferentes doses de radiação gama. ** Significativo pelo teste F a 1% de probabilidade de erro.

y = -0,034x + 2,69R² = 0,94**

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Nb

rota

çõ

es/e

xp

lan

te**

y = -1,29x + 102,67R² = 0,941**

0

20

40

60

80

100%

so

bre

viv

en

tes**

A B

C D

E

70

Na Fig. 2 são apresentados os resultados obtidos nos experimentos de

enraizamento in vitro e aclimatização. Para as variáveis percentagem de

enraizamento e comprimento da maior raiz não ocorreu interação entre os fatores.

Em relação ao parâmetro percentagem de enraizamento, verificou-se efeito somente

para o fator tipo de substrato utilizado (Fig. 2A), onde o meio contendo vermiculita

induziu o enraizamento de 98,4% dos explantes.

No que se refere ao comprimento da maior raiz (Fig. 2C e 2D), houve efeito

isolado para os fatores em estudo, obtendo-se, quanto ao tipo de substrato utilizado,

melhor resultado em meio geleificado com ágar, onde as raízes apresentaram cerca

de 1,86 cm. Entretanto, para o fator doses de irradiação, apenas as raízes expostas

à dose de 10 Gy mostraram menor comprimento (0,7 cm), significando uma redução

de 50% quando comparado ao controle.

Com relação às variáveis número de raízes por planta e percentagem de

calos formados, obteve-se interação entre os fatores, sendo que o maior número de

raízes foi obtido em brotações irradiadas com 10 Gy, cultivados tanto em meio com

vermiculita (13,64) como em meio com ágar (14,04) (Fig. 2B).

A presença de calos foi verificada em todos os tratamentos em que utilizou-se

ágar, sendo que o material irradiado diferiu significativamente em relação ao não

irradiado, apresentando maior percentagem de calos formados e que este tipo de

substrato é mais responsivo ao aparecimento de calos quando comparado à

vermiculita. Em contrapartida, em meio com vermiculita as doses mais elevadas (20,

30 e 40 Gy) diferiram significativamente da dose de 10 Gy e do controle, o qual não

apresentou formação dos mesmos (Fig. 2E).

Após o período de aclimatização, comparando-se os diferentes tratamentos,

pode-se observar que as brotações expostas às doses mais altas de irradiação (30 e

40 Gy), foram as que apresentaram maior percentagem de sobrevivência

(aproximadamente 90%), determinando um aumento de 20% em relação ao controle

(Fig. 2F).

71

Bb

Aa

Ba Bb

ABa

ABaAa

ABaABa

Ba

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Nra

ízes/p

lan

ta*

ÁGAR VERMICULITA

a

b

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

ÁGAR VERMICULITA

Co

mp

. m

aio

r ra

iz (

cm

)**

Substrato utilizado

A

B

ABAB

AB

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

Co

mp

. m

aio

r ra

iz (

cm

)*

Ba

AaAa

Aa Aa

Cb

Bb

AbAb

Ab

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40

% c

alo

s f

orm

ad

os**

Gy

ÁGAR VERMICULITA

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40

% p

lan

tas s

ob

rev

iven

tes

Gy

Figura 2 – Percentagem de enraizamento (A), número de raízes por planta (B),

comprimento da maior raiz (cm) (C e D), percentagem de calos formados e de plantas sobreviventes após aclimatização (%) (E e F), em pereira, cv. Ya-Li, submetidos a diferentes doses de radiação gama. **,* Significativo pelo teste F a 1% e 5% de probabilidade de erro, respectivamente. Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas para doses de radiação e minúsculas para substrato utilizado, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade de erro.

b

a

80

85

90

95

100E

nra

izam

en

to (

%)*

A B

C D

E F

72

4 Discussão

A utilização de irradiação gama em tecidos vegetais tem como alvo principal

as modificações das moléculas de DNA, sendo que a energia transferida das

radiações resulta em ionização no interior da célula, acentuando as chances de

obtenção de mutações de interesse (RODRIGUES; ANDO, 2003; FU et al., 2008).

Porém, segundo Patade e Suprasanna (2008), a dose ideal de radiação gama

que promova mutações sem a ocorrência de perdas no rendimento do organismo

irradiado é tecido-específica, variando a radiosensibilidade com a espécie, a cultivar,

as condições fisiológicas da planta e com a manipulação do material irradiado antes

e depois do tratamento. Portanto, diferentes tecidos respondem de forma própria,

sendo necessária a realização de testes de radiosensibilidade para determinar a

dose ideal (GAZZANEO et al., 2007). Neste contexto, este trabalho foi desenvolvido

baseando-se em estudo prévio realizado por Silva (2009), a qual, trabalhando com a

mesma cultivar, obteve polimorfismos entre os clones de pereira irradiados

(avaliados a partir de marcadores RAPD).

Conforme preconizado por Lu et al. (2007), o nível crítico de radiação gama

nos quais mutações são induzidas devem estar dentro da tolerância para a

regeneração de brotações (Fig. 3A). Doses elevadas podem gerar alta frequência de

mutações, mas baixa taxa de regeneração de culturas in vitro (AMJAD; AMJUN,

2007), o que pode ser evidenciado neste trabalho, durante a fase de indução das

brotações, pois o aumento das doses de radiação ocasionou um decréscimo

significativo nas variáveis relacionadas.

73

Figura 3 – Plantas irradiadas de Pyrus sp., cv. Ya-Li, após avaliações de

regeneração/multiplicação in vitro [com aspecto normal (A) e presença de caules espessos (B)], após enraizamento in vitro [com uso de ágar como substrato (C) e com vermiculita (D)] e no período de aclimatização [em bandejas com tampas (E), em bandejas de polipropileno (F), em potes plásticos de 3 L após transplantadas(G) e em potes plásticos de 3 L antes de ir para o campo].

74

O parâmetro mais afetado pelas doses mais altas de irradiação foi o

comprimento das brotações, dado este que corrobara com os encontrados por

diversos autores, tais como Coimbra et al. (2005), Hung e Johnson (2008),

Berenschot et al. (2008), Silva (2009) e Kleinhans (2009), confirmando que altas

doses de radiação gama podem produzir efeitos deletérios, tais como a diminuição

no crescimento (WATANABE et al., 2000), sendo que, neste trabalho também foram

constatadas alterações fenotípicas nos caules (mais espessos) das brotações

obtidas de explantes irradiados com doses mais altas (Fig. 3B). Diversos fatores

podem estar relacionados a esta redução no comprimento das brotações, ligados a

variações epigenéticas ou genéticas, dentre os quais podem ser citados alterações

de poucas bases até inserções e deleções de grandes fragmentos de DNA, como

também inibição de sua síntese, mudanças fenotípicas ou outros danos fisiológicos

ocorridos após os tratamentos mutagênicos (KLEINHANS, 2009; TABASUM et al.,

2011), uma vez que a radiação interfere nos processos de divisão celular,

culminando em crescimento alterado e variabilidade morfológica (AMJAD; AMJUN,

2007).

Por outro lado, em relação às doses de radiação testadas, observou-se que a

dose inferior (10 Gy) praticamente não apresentou diferenças em relação ao controle

nos parâmetros em estudo durante a fase de indução das brotações, sendo

verificados efeitos positivos também durante o enraizamento in vitro, no que se

refere ao número de raízes por planta. Com base nos dados obtidos nestas

avaliações e em estudos anteriores, como os realizados por Silva (2009), em

pereira, Scheer da Silva et al. (2012), em arroz e Silva (2013) em amoreira-preta, é

possível afirmar que a radiação gama possui efeito estimulatório quando ministrada

em baixas doses, em diversos parâmetros morfológicos e fisiológicos de crescimento

vegetal. Isto pode estar relacionado ao fato de que, em condições apropriadas de

sensibilidade e sob o efeito de determinadas doses de radiação ionizante, pode-se

romper o delicado equilíbrio hormonal e metabólico que regula o processo do

desenvolvimento vegetal levando muitas vezes a respostas do tipo estimulatórias

(BERENSCHOT et al., 2008). No entanto, os mecanismos pelos quais as plantas

reconhecem e respondem às doses a que foram expostas de radiação ainda não

são compreendidos (PRISTOV, 2013).

Estudos realizados têm demonstrado que o efeito da radiação depende do

estádio de desenvolvimento das plantas e das variáveis analisadas, ocorrendo

75

inclusive recuperação de alguns parâmetros que inicialmente apresentavam

alteração (HUNG; JOHNSON, 2008). Isto foi verificado neste trabalho, pois durante a

multiplicação das brotações, a partir do terceiro subcultivo houve um aumento no

número de brotações e de gemas axilares, nas brotações oriundas de explantes

irradiados com as doses mais elevadas (20, 30 e 40 Gy) (dados não mostrados).

Esse fato pode estar relacionado à ação das peroxidases, das enzimas reparadoras

e das catalases, as quais desempenham um papel fundamental na recuperação das

células e na decomposição de produtos da radiação (RODRIGUES; ANDO; 2003),

em vista que o alvo da radiação são as moléculas de água do organismo e estas,

quando irradiadas, sofrem radiólise, fenômeno ao qual se segue um rearranjo

eletrônico e a possibilidade de produção de radicais livres (SELVI et al., 2008).

No que se refere ao processo de enraizamento in vitro, embora o maior

número de raízes formadas tenha ocorrido na dose de 10 Gy, em ambos substratos

utilizados, verificou-se a presença das mesmas nos demais tratamentos, o que é de

grande valia, pois quando se aumenta a quantidade de raízes formadas in vitro,

aumenta-se também a área de contato raiz/substrato, refletindo em maior absorção

dos nutrientes (VILLA et al., 2008). Estes resultados, aliados à alta percentagem de

enraizamento obtida comprovam os relatos feitos por muitos autores, ou seja, da

importância da utilização de auxina no meio de cultura para induzir a formação e a

iniciação de raízes adventícias em determinadas espécies. Entretanto, é necessário

o uso de uma concentração adequada de auxina para obtenção de um sistema

radicular funcional e uniforme (SANTOS-SEREJO et al., 2006; COSTA et al., 2008;

SCHMILDT et al., 2010).

Verificou-se que a maior percentagem de enraizamento foi obtida quando

utilizada vermiculita como substrato. Segundo Vieira et al. (2007), o uso desses

substratos aerados possibilita ganhos substanciais na qualidade das raízes

formadas, por promoverem a formação de raízes ramificadas com presença

abundante de pelos absorventes, maior aeração do meio e menor transmissão de

luz, favorecendo, assim, o enraizamento e desenvolvimento das raízes adventícias

in vitro.

As raízes desenvolvidas em vermiculita emitiram pelos absorventes, porém o

comprimento médio da maior raiz foi menor, quando comparadas às cultivadas em

ágar (Fig. 3C e 3D). Hoffmann et al. (2001), em trabalhos realizados com macieira,

também constataram a formação de raízes mais curtas e com maior densidade de

76

pelos radiculares nos meios com vermiculita. De acordo com Tibola et al. (2004),

raízes mais curtas ou na forma de primórdios radiculares aceleram o pegamento da

planta e evitam o enovelamento. Além disso, estas são mais desejáveis, pois

facilitam a lavagem e retirada do meio de cultura aderido, bem como a introdução da

planta no substrato.

Nos meios semi-sólidos, o ágar, um polissacarídeo extraído de algas

marinhas, é o agente geleificante tradicionalmente usado e, em contrapartida, o

ingrediente mais caro do meio. Apesar de ser o mais utilizado, as raízes formadas

normalmente não possuem pelos radiculares devidamente desenvolvidos, pela falta

de oxigênio (LEITE, 1995), além de suas raízes serem mais fibrosas e quebradiças.

Observou-se, em todos os tratamentos, com exceção do material não

irradiado em meio contendo vermiculita, a ocorrência de calos na base dos

explantes. Segundo Carvalho et al. (2011) e Guerra e Nodari (2006), calos são

grupo ou massa de células em crescimento desordenado, as quais podem

apresentar certo grau de diferenciação e, em geral, têm forma e tamanho variado,

paredes celulares com diferentes graus de espessamento e se originam da

proliferação desordenada a partir de tecidos ou órgãos cultivados in vitro. Em razão

disso, sua presença pode afetar negativamente a rizogênese (GEORGE et al.,

2008), porém isto não foi evidenciado.

O que pode explicar esta produção de calos é a exposição do material vegetal

às doses de radiação, pois a radiação gama interfere nos processos de divisão

celular, ocasionando um crescimento alterado e variabilidade morfológica (AMJAD;

AMJUN, 2007), como já enfatizado.

Dessa maneira, isso pode ter ocorrido devido ao um desbalanço hormonal,

pois, segundo George e Sherrington (1984), a morfogênese in vitro é regulada pela

interação e balanço entre os reguladores de crescimento acrescidos ao meio de

cultura, principalmente citocininas e auxinas. As citocininas caracterizam-se por

promoverem a quebra da dominância apical, aumentando a taxa de multiplicação

por meio de brotações laterais relacionadas à atividade promovida nos meristemas

(BRUM et al., 2002; TOMBOLATO; COSTA, 1998). Porém, em concentrações

elevadas, podem incrementar a ação da citocinina-oxidase, impedir a atuação da

citocinina sobre a divisão celular e, consequentemente, a indução de brotações

(BARRUETO CID, 2000; SOUZA et al., 2006), sendo que em vários sistemas de

cultivo in vitro têm sido descritas anormalidades anatômicas e ultraestruturais,

77

alterações metabólicas, nanismo, teratologia, albinismo e hiperidricidade,

decorrentes da exposição excessiva à citocininas (RAMAGE; WILLIAMS, 2004). As

auxinas promovem divisão, alongamento e diferenciação celular, além de serem

responsáveis pela dominância apical (CARVALHO et al., 2011). Altas concentrações

de auxinas induzem maior divisão celular e, por conseguinte, maior formação de

calo (RADMANN et al., 2002; SILVA, 2004), além de anular parte do efeito inibitório

que a citocinina promove sobre o crescimento das novas brotações (HWANG et al.,

2012).

Outro fator importante a ser considerado é que um dos possíveis efeitos

indiretos da radiação sobre a indução de variabilidade genética e epigenética está

relacionado à indução na formação de EROS, devido aos danos celulares, e estas

EROS podem causar danos no DNA ou alterar o padrão de expressão de muitos

genes e, consequentemente, em caracteres fenotípicos. Ou seja, há um efeito direto

e um indireto que pode levar à variabilidade pela mutação ou por variação

epigenética.

A aclimatização das plantas foi bem sucedida (Fig. 3E, 3F, 3G e 3H). Este

fato provavelmente está relacionado com a boa qualidade da parte aérea e do

sistema radicular, formado durante o enraizamento in vitro. Segundo Rogalski et al.

(2003) a adição de auxina no meio de enraizamento tem sido eficiente, em espécies

frutíferas lenhosas, promovendo acréscimo na sobrevivência de plantas na fase de

aclimatização.

Além disso, houve também influência das doses de radiação em relação à

percentagem de sobrevivência das plantas, em que maiores taxas de aclimatização

ocorreram nas doses mais elevadas (30 e 40 Gy), assim como verificado por Hung e

Johnson (2008), com Wasabia japonica, em que as plantas também apresentaram

incremento de 20% na sobrevivência, no tratamento de 40 Gy. Neste sentido,

conforme Amjad e Amjun (2007), doses elevadas de radiação podem gerar alta

frequência de mutações. E, em muitos casos, uma mutação pontual pode corrigir ou

melhorar alguns caracteres, permitindo a seleção de constituições genéticas

superiores (MARTINS et al., 2005), como já verificado em diversos trabalhos com

fruteiras, nos quais a mutagênese foi usada para introduzir muitas características

úteis que afetam o tamanho das plantas, tempo de florescimento, maturação de

frutos, coloração de frutos, auto-incompatibilidade, auto-raleio, resistência aos

agentes patogênicos, mudança na qualidade dos frutos, aumento no conteúdo de

78

ácido ascórbico, redução na acidez, maior consistência dos frutos e o aumento da

vida de prateleira (VISSER et al., 1971; LACEY, 1975; DECOURTYE, 1982;

BROERTJES; VAN HARTEN, 1988; MASUDA et al., 1997; VAN HARTEN, 1998;

BASARAN; KEPENEK, 2011).

5 Conclusões

Nas condições em que foi desenvolvido o trabalho pode-se concluir que:

– Altas doses de irradiação interferem em alguns parâmetros de crescimento na fase

de indução das brotações;

– Baixas doses de irradiação não afetam as variáveis estudadas durante a fase de

indução das brotações, bem como tendem a estimular um melhor enraizamento das

mesmas, juntamente com o uso de vermiculita;

– A vermiculita substitui com vantagens o ágar como substrato, no enraizamento in

vitro da cv. Ya-Li;

– As doses de irradiação utilizadas não afetam negativamente o processo de

aclimatização.

4 Referências bibliográficas

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CONSIDERAÇÕES FINAIS

No decorrer das pesquisas realizadas, foi possível verificar que as cultivares

estudadas (Carrick, Cascatense e Ya-Li) respondem diferentemente quanto às

condições de cultivo testadas. A „Ya-Li‟ foi a cultivar que apresentou melhor

desempenho, tanto in vitro como ex vitro, o que possibilitou, assim, seu estudo mais

detalhado. Porém, os resultados obtidos nos experimentos de multiplicação in vitro

permitiram a obtenção de altas taxas de multiplicação do material vegetal,

possibilitando, desta forma, que as três cultivares sejam propagadas em larga

escala. Neste sentido, esta fase, acoplada às demais etapas do processo de

micropropagação potencializa sua produção, originando, assim, mudas com

qualidade. A multiplicação in vitro das cultivares pode ser potencializada com o uso

do meio MS Himédia comercial, com suplementação de 1,2 mg L-1 de BAP e 30 g L-1

de sacarose para „Carrick‟; MS com 1,2 mg L-1 de BAP e 45 g L-1 de sacarose para

„Ya-Li‟ e MS Himédia, suplementado de 0,8 mg L-1 de BAP e 30 g L-1 de sacarose

para „Cascatense‟.

Em relação aos experimentos que envolveram a irradiação do material

vegetal, embora o uso de doses mais elevadas de irradiação (40Gy) possam

interferir em alguns parâmetros de crescimento inicial (ex.: comprimento das

brotações), as doses testadas não acarretam efeitos severos na micropropagação

da cv. Ya-Li, sendo, por vezes, até estimulatórias, como no caso das doses mais

baixas (10Gy). Esta dose permite que as plantas irradiadas se assemelhem ao

material não irradiado em relação à responsividade em alguns parâmetros da fase

de indução das brotações e tende a estimular um melhor enraizamento das

mesmas, juntamente com o uso de vermiculita. Desta maneira, foi possível a

obtenção de mudas de material irradiado que servirão para estudos posteriores na

tentativa de obter genótipos com características de interesse, a partir de acréscimos

na variabilidade genética, em vista que há cerca de 750 plantas de „Ya-Li‟ no campo

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da Embrapa Clima Temperado (controle + 46 diferentes plantas irradiadas), sendo

que as folhas já foram coletadas e acondicionadas em ultra-freezer, para serem

realizadas as análises moleculares e há continuidade do trabalho pelos melhoristas

da cultura.

Durante o primeiro ano de doutorado também foram realizados experimentos

de regeneração in vitro das três cultivares, variando-se as concentrações de TDZ

(Thidiazuron) (0, 1, 2, 3 e 4 mg L-1) e ANA (ácido naftaleno acético) (0,0; 0,2; e 0,3

mg L-1), no qual utilizou-se folhas inteiras ou seccionadas, com o lado adaxial ou

abaxial em contato com o meio de cultivo, com ou sem pecíolo, diferentes dias de

cultivo no claro e/ou no escuro, além de um período de 2h em meio líquido contendo

2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético) (0,5 mg L-1). Os resultados obtidos foram

incipientes, o que tornou difícil descrevê-los, porém melhores taxas de regeneração

in vitro foram encontradas na „Ya-Li‟ (33,33%), com o uso de meio de indução MS,

suplementado com 1 mg L-1 de TDZ e 0,1 mg L-1 de ANA, cultivados durante 40 dias

no escuro, utilizando-se folhas inteiras, escarificadas no limbo e na nervura central,

sem pecíolo, com a face abaxial em contato com o meio. Após este período de

escuro os explantes permaneceram 30 dias em fotoperíodo de 16 horas e 48 μmol

m-2 s-1 de fluxo de fótons, em meio MS + 1 mg L-1 de TDZ.

Devido à falta de pesquisas em relação ao efeito do pH em plantas

autoenraizadas de pereira (pé franco), no terceiro ano de doutorado foi realizado um

experimento com diferentes pHs (4,5; 5,5; 6,5 e 7,5), em plantas oriundas de

sementes da cv. Ya-Li, as quais foram cultivadas em hidroponia, durante 60 dias. A

partir disso, foram realizadas avaliações de parâmetros de crescimento, conteúdo de

macro e micronutrientes, carboidratos e atividades das enzimas antioxidantes. De

acordo com os resultados obtidos, foram verificadas diferenças no crescimento

inicial das plantas, comprovando a variabilidade genética existente entre plantas

obtidas de sementes e que o pH pode influenciar no crescimento e desenvolvimento

destas. Dentre os pHs utilizados, os pHs 4,5 e 5,5 determinaram melhores respostas

quando todos os parâmetros foram analisados. Os dados não foram adicionados a

este trabalho, porém este estudo preliminar servirá de base para experimentos

posteriores, buscando selecionar plantas que sejam mais adaptadas a pHs mais

baixos.