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Desarrollo de método de captura de proteínas
glutationiladas Tesina de Grado – Licenciatura en Bioquímica
Florencia Orrico
Orientador: Dr. Matías Möller Co-orientadora: Dra. Leonor Thomson
Laboratorios de Enzimología y Fisicoquímica Biológica Facultad de Ciencias, Universidad de la República
Montevideo, 2017
2
AGRADECIMIENTOS
A mis tutores, Matías y Leonor.
A todos mis compañeros de los laboratorios de Enzimología y Fisicoquímica Biológica.
A mis amigos de la facultad, y mis amigas de toda la vida.
A mi familia y a mi novio, Matías.
¡Gracias!
3
ÍNDICE
AGRADECIMIENTOS .......................................................................................................... 2
ÍNDICE DE ABREVIATURAS ................................................................................................ 6
1. RESUMEN .................................................................................................................. 8
2. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 9
2.1. Generalidades de glóbulos rojos ....................................................................... 9
2.1.1. Hemoglobina ............................................................................................ 10
2.2. Especies reactivas y estrés oxidativo ............................................................... 12
2.2.1. Superóxido ................................................................................................ 12
2.2.2. Peróxido de Hidrógeno ............................................................................. 14
2.2.3. Radical hidroxilo ....................................................................................... 15
2.2.4. Óxido nítrico y peroxinitrito ..................................................................... 15
2.3. Sistemas antioxidantes en glóbulos rojos ........................................................ 17
2.3.1. Antioxidantes enzimáticos ....................................................................... 17
2.3.1.1. Superóxido dismutasa ....................................................................... 17
2.3.1.2. Glutatión peroxidasa ......................................................................... 18
2.3.1.3. Peroxirredoxinas ............................................................................... 20
2.3.1.4. Catalasa ............................................................................................. 21
2.3.2. Antioxidantes no enzimáticos .................................................................. 23
2.3.2.1. Vitaminas ........................................................................................... 23
2.3.2.2. Glutatión ............................................................................................ 24
2.4. Daño molecular ................................................................................................ 25
2.5. Glutationilación de proteínas .......................................................................... 26
2.5.1. Glutationilación de hemoglobina ............................................................. 29
2.5.2. Glutatión S-transferasa ......................................................................... 30
2.6. Hipótesis .......................................................................................................... 32
3. OBJETIVOS .............................................................................................................. 34
3.1. Objetivo general............................................................................................... 34
4
3.2. Objetivos específicos ....................................................................................... 34
4. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................... 35
4.1. Reactivos y equipos ......................................................................................... 35
4.2. Obtención de muestras.................................................................................... 35
4.3. Purificación de hemoglobina ........................................................................... 36
4.4. Glutationilación de proteínas .......................................................................... 36
4.5. Determinación de GSH por mBrB .................................................................... 37
4.6. Control de calidad de proteínas ....................................................................... 38
4.6.1. Cuantificación de GST de E. granulosus ................................................... 38
4.6.2. Determinación de actividad enzimática de GST ....................................... 39
4.6.3. Electroforesis ............................................................................................ 39
4.7. Captura por IMAC-Sefarosa ............................................................................. 40
4.7.1. Análisis de eficiencia ................................................................................. 40
4.8. Captura por sefarosa activada con CNBr ......................................................... 41
4.8.1. Análisis de eficiencia ................................................................................. 41
4.9. Preparación de GST biotinilada de Schistosoma japonicum ........................... 42
4.9.1. Purificación de GST de S. japonicum ........................................................ 42
4.9.2. Biotinilación de GST .................................................................................. 43
4.10. Dot blot con GST biotinilada ........................................................................ 45
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................................... 46
5.1. Determinación de GSH por mBrB .................................................................... 46
5.2. Control de calidad de proteínas ....................................................................... 48
5.2.1. Cuantificación de glutatión S-transferasa ................................................ 48
5.2.2. Determinación de actividad enzimática de GST ....................................... 49
5.2.3. Electroforesis ............................................................................................ 50
5.3. Captura por IMAC-Sefarosa ............................................................................. 51
5.4. Captura por sefarosa activada con CNBr ......................................................... 56
5.5. Preparación de GST biotinilada de Schistosoma japonicum ........................... 58
5.5.1. Purificación de GST de S. japonicum ........................................................ 58
5
5.5.2. Biotinilación de GST .................................................................................. 59
5.6. Dot blot con GST biotinilada ............................................................................ 60
6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS ........................................................................... 62
7. ANEXO ..................................................................................................................... 64
8. BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................... 65
6
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
CDNB clorodinitrobenceno
DTPA ácido dietilentriaminopentaacético
DTT ditiotreitol
EDC 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
GPx glutatión peroxidasa
GR glutatión reductasa
Grx glutarredoxina
GSH glutatión
GSSG glutatión disulfuro
GST glutatión S-transferasa
H2O2 peróxido de hidrógeno
Hb-SG hemoglobina glutationilada
HO• radical hidroxilo
HSA albúmina sérica humana
HSA-SG albúmina sérica humana glutationilada
mBrB monobromobimano
metHb metahemoglobina
MPM marcador de peso molecular
NHS N-hidroxisuccinimida
•NO óxido nítrico
O2•- radical superóxido
7
oxiHb oxihemoglobina
Prx peroxirredoxina
ROS especies reactivas del oxígeno
SOD superóxido dismutasa
TR tiorredoxina reductasa
Trx tiorredoxina
βME β-mercaptoetanol
8
1. RESUMEN
La glutationilación es una modificación post-traduccional que se da en las proteínas
con tioles libres, principalmente como resultado del estrés oxidativo. Se ha observado
un aumento en los niveles de proteínas glutationiladas en varias condiciones
patológicas caracterizadas por desregulaciones redox (enfermedades cardiovasculares,
pulmonares, inflamatorias, neurodegenerativas y cáncer), y en particular durante el
proceso de envejecimiento. Resulta entonces relevante identificar las proteínas que
sufren esta modificación y establecer su rol en la patología. Sin embargo, hasta el
momento no existen métodos selectivos para capturar proteínas glutationiladas
intactas con un procedimiento simple y fácilmente accesible.
En el presente trabajo se buscó capturar y detectar proteínas glutationiladas por
medio de la enzima glutatión S-transferasa (GST), teniendo en cuenta que esta se
utiliza normalmente como módulo en proteínas de fusión recombinantes para facilitar
la purificación usando columnas con glutatión inmovilizado. Se realizaron ensayos de
captura de albúmina y hemoglobina glutationiladas con GST de Echinococcus
granulosus anclada a distintas resinas de sefarosa, obteniéndose en todos los casos
resultados negativos. Un ensayo alternativo se realizó en forma de dot blot,
empleándose como sonda de detección GST de Schistosoma japonicum biotinilada. Se
observó una señal positiva de la GST con la hemoglobina glutationilada, pero no con el
control. Si bien el objetivo inicial era muy ambicioso, se llegó a resultados preliminares
interesantes que podrían ser explorados en mayor profundidad en otra etapa.
9
2. INTRODUCCIÓN
El disparador de este proyecto fue un trabajo recientemente realizado por el grupo de
investigación, que involucró el análisis de proteínas glutationiladas del glóbulo rojo en
el marco del estudio de cambios redox a nivel de los sulfhidrilos intracelulares y su
correlación con las lesiones por almacenamiento en los concentrados de glóbulos rojos
para transfusión [1]. En dicho trabajo se utilizó a la enzima glutatión S-transferasa
(GST) de Echinococcus granulosus recombinante para aislar las proteínas
glutationiladas mediante cromatografía de afinidad “en batch”, y se logró capturar
mayoritariamente a la hemoglobina y en menor proporción a la albúmina sérica
humana (HSA). Dados estos resultados, se planteó validar este método con sus
controles pertinentes, teniendo en cuenta que no existen en la literatura métodos
selectivos para capturar proteínas glutationiladas intactas sin reducir los enlaces
disulfuro previamente.
2.1. Generalidades de glóbulos rojos
La sangre es un tejido conectivo líquido de vital importancia para el organismo. Está
encargada, entre otras cosas, del transporte de gases, nutrientes, productos de
desecho y hormonas, mantenimiento de la temperatura corporal, protección del
organismo y mantenimiento de la homeostasis. Está compuesta en un 55% por plasma
y en un 45% por diferentes tipos celulares.
Más del 99% de las células de la sangre está constituido por eritrocitos o glóbulos
rojos, células así llamadas por su color característico. Los glóbulos rojos primitivos son
generados en el saco vitelino durante las primeras semanas de gestación, y durante el
segundo trimestre pasa a ser el hígado el órgano encargado de su síntesis, en conjunto
con el bazo y los ganglios linfáticos. A partir del último mes de gestación y hasta los 5
años, la producción de glóbulos rojos ocurre en la médula ósea de casi todos los
huesos del organismo, a partir de células madre hematopoyéticas pluripotenciales.
Más allá de los 20 años, la mayor parte de los eritrocitos se genera en la médula de
huesos membranosos pero, incluso en estos huesos, la médula se vuelve cada vez
menos productiva con el paso de los años [2].
10
Figura 1: Glóbulos rojos vistos con microscopía electrónica de barrido. A. Imagen obtenida de [3]. B. Imagen obtenida de [4].
Los glóbulos rojos lucen como discos bicóncavos con hendiduras en la parte superior e
inferior y son sumamente flexibles (Figura 1). Su membrana celular elástica les permite
cambiar continuamente su forma para optimizar su paso por los capilares sanguíneos
durante la circulación.
A diferencia del resto de las células, los glóbulos rojos carecen de la mayor parte de los
organelos, en particular de núcleo celular y mitocondrias. Por esta razón, no tienen la
capacidad de sintetizar aminoácidos y ácidos grasos y presentan en general un
metabolismo limitado, suficiente para sobrevivir durante su tiempo de vida [5]. El
metabolismo presente está dado por enzimas citoplasmáticas capaces de degradar
glucosa y formar pequeñas cantidades de ATP. Además, estas enzimas se encargan de
mantener la flexibilidad de la membrana y el transporte de iones a través de ella, así
como de prevenir la oxidación de las proteínas presentes en el glóbulo [2].
La función principal de los eritrocitos es el transporte de hemoglobina, proteína
encargada de llevar el oxígeno (O2) desde los pulmones a los tejidos, así como de unir y
transportar dióxido de carbono (CO2). Los glóbulos rojos presentan además anhidrasa
carbónica, la enzima que cataliza la reacción reversible entre CO2 y agua para formar
ácido carbónico. La rapidez de esta reacción hace que el agua de la sangre pueda
transportar enormes cantidades de CO2 en forma de ión bicarbonato (HCO3-) desde los
tejidos a los pulmones, donde será reconvertido a CO2 y expulsado a la atmósfera [2].
2.1.1. Hemoglobina
La hemoglobina es la proteína mayoritaria de los eritrocitos, encontrándose en una
concentración extraordinariamente alta, 20 mM [6].
A B
11
La mayor parte del O2 es transportado en la sangre por la hemoglobina, llevándolo a
las células de tejidos aeróbicos y permitiendo una eficiente producción de energía y el
correcto funcionamiento de enzimas que catalizan transformaciones metabólicas
dependientes de O2 [7]. Además, juega un rol importante en el transporte de CO2 e
hidrogeniones, y por tanto en el control del pH de los fluidos corporales.
La hemoglobina humana es un tetrámero de dos pares de cadenas polipeptídicas
diferentes, con un peso molecular aproximado de 16 kDa cada una (Figura 2), que
experimentan una isomerización conformacional con la oxigenación. La hemoglobina,
por lo tanto, tiene dos estructuras estables diferentes, oxihemoglobina (oxiHb) y
desoxihemoglobina [6]. En el modelo propuesto por Monod, Wyman y Changeux, a los
dos estados energéticos presentados por la hemoglobina se les llama conformación
tensa (T) y relajada (R). Estas se diferencian por su afinidad por el ligando y la
interacción entre subunidades. La unión del O2 a la desoxihemoglobina en estado T
ocurre con baja afinidad, y logra desestabilizar esta conformación promoviendo su
cambio al estado R oxigenado de alta afinidad [8, 9].
Figura 2: Estructura de la hemoglobina A humana. Se observan, representadas en diagrama de cintas, las cuatro subunidades proteicas coloreadas con gradiente de colores y los cuatro grupos hemo en rojo. Imagen creada en Pymol Molecular Graphics System [10], con información obtenida de RCSB Protein Data Bank (código 5UFJ) [11].
La molécula de hemoglobina A (la principal hemoglobina en adultos) tiene dos cadenas
α y dos cadenas β. Cada una de ellas presenta un grupo hemo, lo cual le confiere a la
proteína la capacidad de unir O2. Este grupo hemo está formado por una parte
orgánica llamada protoporfirina y un átomo de hierro en estado ferroso (Fe2+). Es solo
en este estado que la hemoglobina puede unir O2 [12].
12
Cuando el hierro del hemo es oxidado al estado férrico (Fe3+) se obtiene
metahemoglobina (metHb), la cual no puede unir O2 y por tanto es funcionalmente
inerte con respecto al transporte del mismo. Esta oxidación puede ocurrir de manera
espontánea como resultado de la reacción con O2, a lo que se le llama autoxidación de
la hemoglobina (Figura 3) [13]. La enzima dependiente de NADH, la citocromo b5-
metahemoglobina reductasa (diaforasa I), es responsable de volver a reducir la
metahemoglobina en hemoglobina.
2.2. Especies reactivas y estrés oxidativo
Se conoce como estrés oxidativo al desbalance entre los niveles de especies
prooxidantes y antioxidantes a favor de las prooxidantes en células y tejidos [14]. Estas
especies prooxidantes se engloban bajo los términos de especies reactivas del oxígeno
(ROS) y especies reactivas del nitrógeno (RNS). Estas especies reactivas pueden ser
radicales libres, entendiendo por radical libre un átomo o molécula con un electrón
desapareado, u otras especies no radicalares altamente oxidantes [15].
La mayor parte de los efectos tóxicos del O2 pueden ser atribuidos a la formación de
especies reactivas, y los radicales derivados del O2 representan la clase más
importante de especies radicalarias generadas en los organismos vivos [15]. Las ROS
resultan típicamente de la excitación de O2 a la forma oxígeno singulete, o de la
transferencia de uno, dos o tres electrones para formar, respectivamente, radical
superóxido (O2•-), peróxido de hidrógeno (H2O2) o radical hidroxilo (HO•) [16]. Estas
pueden ser generadas de manera exógena o ser producidas intracelularmente. En
general, son producto del metabolismo aerobio celular normal y presentan efectos
beneficiosos a concentraciones bajas o moderadas, tomando parte en roles fisiológicos
como la defensa frente a agentes infecciosos y la participación en sistemas de
señalización celular [15]. Sin embargo, bajo condiciones patológicas pueden producirse
en tasas altas y pasar a tener efectos deletéreos para las células.
2.2.1. Superóxido
El anión superóxido, generado por procesos metabólicos o por activación del O2 por
irradiación física, es considerado la especie reactiva del O2 primaria. Este puede
interactuar con otras moléculas para generar ROS secundarias [15]. Parte de este O2•-
13
es producido deliberadamente por células fagocíticas activadas debido a acción
enzimática (principalmente gracias a las NADPH oxidasas), o también puede ser
producido por reacciones de autooxidación de moléculas como gliceraldheído, FMNH2,
FADH2, adrenalina, noradrenalina y dopamina, y compuestos con tioles como cisteína.
A pesar de esto, se estima que la mayor parte de la producción intracelular de O2•- en
células no fagocíticas deriva de la mitocondria. Esta ocurre sobre todo en dos puntos
discretos en la cadena de transporte de electrones, en el complejo I (NADH
deshidrogenasa) y en el complejo III (ubiquinona-citocromo c reductasa). El complejo
III es el principal sitio de producción de ROS en condiciones normales [17]. A medida
que se da el ciclo de oxidación-reducción de la ubiquinona dentro de la cadena
transportadora de electrones, existe la tendencia de que un electrón pase
directamente al O2 generando O2•-, en lugar de al siguiente transportador. De esta
forma, del total de O2 diario consumido por la mitocondria, un 1-2% es desviado hacia
la formación de ROS [18, 19].
Los glóbulos rojos, aunque no tienen mitocondrias, presentan una elevada tasa de
producción de ROS por la alta presión de O2 en la sangre arterial. La fuente principal de
ROS en eritrocitos es la hemoglobina, que puede generar O2•- durante el proceso de
autoxidación mencionado anteriormente. Debido a que la concentración de
hemoglobina oxigenada es 20 mM, incluso una pequeña tasa de autoxidación puede
generar niveles elevados de O2•- [20]. Se estima que alrededor de un 3% de la
hemoglobina sufre oxidación cada día [7].
Figura 3: Procesos de oxidación y reducción de la hemoglobina. Esquema adaptado de [21].
14
2.2.2. Peróxido de Hidrógeno
Una vez formado, el O2•- es capaz de reaccionar con otra molécula de O2
•- para formar
H2O2. Esta reacción puede ocurrir espontáneamente (k=1x105 M-1s-1) y a mucha mayor
velocidad en presencia de alguno de los integrantes de la familia de superóxido
dismutasas (SOD, k2x109 M-1s-1) (Figura 4) [22]. El H2O2 puede ser sintetizado a su vez
por varias otras enzimas in vivo, incluyendo la enzima monoaminooxidasa, localizada
en la membrana mitocondrial externa. Esta se encarga de catalizar la desaminación
oxidativa de aminas biogénicas, constituyendo una fuente importante de H2O2 [18].
Figura 4: Reacción de formación de H2O2 a partir de O2•-
, catalizada por SOD. Esquema adaptado de [12].
Otras enzimas involucradas en la producción, tanto directa como indirecta, de H2O2
son las NADPH oxidasas y la xantina oxidasa. Esta última constituye una de las formas
interconvertibles de la xantina oxidorreductasa, la cual es capaz de catalizar la
oxidación de hipoxantina y xantina durante el metabolismo de las purinas [23]. Bajo
condiciones relativamente fisiológicas (21% O2 y pH 7.0), la xantina oxidasa cataliza la
reducción de O2 a H2O2 y O2•- en una proporción 4:1 (H2O2:O2
•-) [24]. Tanto ésta como
las NADPH oxidasas son especialmente importantes en el entorno vascular; su
expresión y/o actividad se incrementa como consecuencia de factores de riesgo
cardiovasculares y constituyen fuentes de ROS que luego potenciarán la disfunción
endotelial [25].
El H2O2 es un precursor de radicales libres pero no es uno en sí mismo, por lo que es
generalmente poco reactivo, siendo un oxidante y reductor débil. Presenta una
estabilidad relativamente alta pero es rápidamente consumido por enzimas
antioxidantes, como peroxirredoxina (Prx), catalasa y glutatión peroxidasa (GPx) [7].
15
2.2.3. Radical hidroxilo
El radical hidroxilo es la especie derivada del O2 más reactiva. A diferencia del radical
O2•-, que presenta una menor reactividad y mayor selectividad y vida media, no existe
selectividad en las reacciones que involucran al radical HO•. Por esta razón, su vida
media es extremadamente corta [14].
Su formación se puede dar a partir de múltiples reacciones. Una de ellas es la reacción
de Fenton, en donde la transformación de H2O2 en HO• se cataliza por metales de
transición, generalmente el Fe2+. Las hemoproteínas, como la hemoglobina de glóbulos
rojos, pueden ser degradadas por exceso de H2O2 para liberar hemo y iones hierro, que
puede llevar a la generación de radical HO• y la oxidación de múltiples sustratos. La
radiación ultravioleta también es capaz de generar radical HO• a partir de H2O2,
causando la fisión del enlace O-O. Otras fuentes incluyen las radiaciones ionizantes, la
reacción entre ácido hipocloroso y O2•- y el ultrasonido [7].
Figura 5: Formación de radical HO•
catalizada por Fe. La reacción (a) corresponde a la reacción de Fenton y la (b) a la reacción de Haber-Weiss. Esquema adaptado de [26].
2.2.4. Óxido nítrico y peroxinitrito
El óxido nítrico (•NO) es una molécula pequeña e hidrofóbica, capaz de atravesar
membranas sin necesidad de canales o receptores [27-29]. Es sintetizado por tres tipos
de óxido nítrico sintasa (NOS): el •NO generado por la NOS endotelial (eNOS) en la
vasculatura es un mediador importante de la vasodilatación dependiente del endotelio
y está involucrado en la inhibición de la agregación plaquetaria, la expresión de
moléculas de adhesión, la regulación del crecimiento celular y la diferenciación de las
células vasculares. En condiciones de inflamación, es sintetizado también por la NOS
inducible (iNOS), una isoforma que se encuentra presente en muchos tipos celulares,
incluidas las células del endotelio vascular y las células inflamatorias. El tercer tipo es la
NOS neuronal (nNOS), que produce •NO en el tejido nervioso [30, 31]. Además, es
16
posible obtener •NO durante la combustión de tabaco y otros materiales orgánicos
[32].
Al tratarse de un híbrido entre nitrógeno y oxígeno molecular, el •NO es menos
reactivo que el O2. De todos modos, presenta un electrón desapareado que le permite
unirse fuertemente, por ejemplo, al hierro de grupos hemo. Esto permite que sea
removido al ingresar al interior de los glóbulos rojos, donde es convertido a nitrato por
su reacción con oxiHb (Figura 6, ecuación a) [30, 33, 34].
El •NO también se asocia a la desoxihemoglobina (Figura 6, ecuación b), un hecho
relevante en sangre venosa.
Figura 6: Reacciones entre el
•NO y la hemoglobina. La ecuación (a) corresponde a la formación de
nitrato como consecuencia de la reacción con oxiHb. La ecuación (b) muestra la asociación de •NO a la
forma desoxigenada de la hemoglobina.
La asociación del •NO en el complejo hierro-nitrosilo es reversible, lo que preserva al
vasodilatador. Sin embargo, las constantes de disociación son bastante bajas (1x10-3s-1
para el estado R y 1x10-5 s-1 para el estado T). Por otro lado, se ha sugerido un rol de la
hemoglobina como tranportador de •NO bajo la forma de S-nitrosohemoglobina [35].
Además, el •NO es capaz de reaccionar con radicales libres, siendo en particular un
buen blanco para el O2•-. La tasa de reacción entre ellos es alta (k=1x1010 M-1s-1) [36], y
ambos compuestos pueden ser simultáneamente producidos por los mismos tipos
celulares, favoreciendo la colisión bimolecular para dar peroxinitrito [37, 38].
El peroxinitrito es un prooxidante clave involucrado en múltiples mecanismos
patogénicos, que presenta una baja vida media y puede reaccionar directamente con
distintos compuestos biológicos como tioles, centros metálicos y CO2 [31, 39, 40]. Se
puede protonar para dar lugar a ácido peroxinitroso, una especie inestable que se
descompone espontáneamente para generar HO• y •NO2, o puede sufrir
reordenamiento molecular para generar nitrato [38].
17
Figura 6: Formación del anión peroxinitrito y su descomposición a HO•
y •NO2. Esquema adaptado de
[38].
Una importante fracción (alrededor de 40%) de peroxinitrito formado
intravascularmente puede difundir a los glóbulos rojos antes de reaccionar con
compuestos del plasma, ingresando a los mismos por medio de dos mecanismos
principales: uno consiste en el transporte de su forma aniónica por el intercambiador
HCO3-/Cl-, y el otro consiste en la difusión pasiva de su forma protonada. Una vez
dentro de los glóbulos rojos, una importante reacción del peroxinitrito será con oxiHb,
dando metHb como producto final [31, 34]. Se formará una pequeña proporción
(aprox 10%) de •NO2 y otros radicales como productos secundarios que pueden
promover el daño oxidativo y van a contribuir al proceso de envejecimiento de los
eritrocitos [31, 39].
2.3. Sistemas antioxidantes en glóbulos rojos
La exposición a especies reactivas provenientes de diferentes fuentes llevó a los
organismos a desarrollar una serie de mecanismos de defensa en orden de limitar los
niveles de oxidantes y el daño que estos generan. Estos incluyen mecanismos
preventivos, de reparación, defensas físicas y defensas antioxidantes. Las defensas
antioxidantes pueden consistir tanto en enzimas (SODs, catalasa y peroxidasas) como
en componentes de bajo peso molecular (vitamina E, vitamina C, glutatión, beta-
caroteno, etc.) [14].
2.3.1. Antioxidantes enzimáticos
2.3.1.1. Superóxido dismutasa
La SOD es una familia de enzimas que se encargan de proteger a las células del anión
O2•-. Esta familia incluye tres clases principales, con plegamientos proteicos diferentes
y diferentes metales catalíticos: Cu,ZnSOD, MnSOD/FeSOD y NiSOD [41].
18
Figura 7: Estructura de la Cu,ZnSOD 1 humana. Se observan, representadas en diagrama de cintas, las dos subunidades proteicas coloreadas con gradiente de colores, los átomos de Cu en rojo y los de Zn en amarillo (código 4OH2) [10, 11].
Debido a su falta de mitocondrias, la Cu,ZnSOD (Figura 7) localizada en el citoplasma
juega un rol muy importante en los eritrocitos. Esta reacciona con los radicales
superóxido, previniendo la formación de metHb [20]. La Cu,ZnSOD tiene un peso
molecular de 32 kDa y está formada por dos subunidades proteicas, cada una de las
cuales contiene un sitio activo con un átomo de cobre y uno de zinc [7]. Los iones
metálicos se encargan tanto de conectar elementos estructurales como de
proporcionar roles catalíticos.
Figura 8: Reacción de dismutación del O2•-
catalizada por SOD. El esquema de reacción muestra los cambios en el estado de oxidación del catión metálico de la enzima, donde M=Cu (n=1); Mn (n=2); Fe (n=2); Ni (n=2).
Las SOD protegen a las células del estrés oxidativo al catalizar la conversión de
radicales O2•- a O2 y H2O2 [41] (Figura 8). Al disminuir los niveles de O2
•-, la SOD puede
entonces inhibir la formación de otras especies reactivas como el peroxinitrito [14].
2.3.1.2. Glutatión peroxidasa
El H2O2 proveniente de la dismutación del O2•- y demás fuentes será removido
principalmente por tres sistemas enzimáticos. Uno de ellos se basa en la enzima GPx.
Esta es una selenoproteína tetramérica con cuatro subunidades idénticas de 22 kDa
19
(Figura 9), cada una conteniendo un átomo de selenio en forma de selenocisteína. Este
residuo se encuentra involucrado en la actividad catalítica de la enzima [42].
Figura 9: Estructura de la GPx1 humana. Se observan, representadas en diagrama de cintas, las cuatro subunidades proteicas coloreadas con gradiente de colores (código 2F8A) [10, 11].
La GPx1 es uno de los miembros más abundantes de la familia de enzimas GPx. Está
presente en todas las células y se encuentra tanto en el citosol como en la mitocondria
y, en algunos tipos celulares, en los peroxisomas. En el glóbulo rojo, donde la
concentración intracelular de la enzima es 7 µM [43], se le ha adjudicado un papel
importante en proteger a la hemoglobina del daño oxidativo [44].
La GPx remueve H2O2 acoplando su reducción a agua con la oxidación de glutatión
(GSH) (k=1.8x108 M-1s-1) (Figura 10A) [45]. Estas enzimas son específicas para GSH
como donador de electrones, pero pueden actuar en otros peróxidos aparte de H2O2.
Por lo tanto, pueden catalizar la reducción de hidroperóxidos de ácidos grasos o
colesterol. Estos peróxidos han de haber sido liberados previamente por la acción de
una lipasa, dado que la GPx no puede actuar sobre peróxidos de ácidos grasos
esterificados en lipoproteínas o membranas [7]. Una vez oxidado, el GSH es reducido
nuevamente por acción de la enzima glutatión reductasa (GR), utilizando el poder
reductor del NADPH [42] (Figura 10B).
20
Figura 10: Mecanismos enzimáticos de la GPx 1. A. Reducción de peróxido por GPx1. 1, formación de ácido selénico en el sitio activo de la GPx por reacción con peróxido; 2, reducción por GSH y formación del intermediario Se-SG; 3, reducción por segunda molécula de GSH, resultando en la formación de glutatión disulfuro (GSSG). La reacción neta se muestra en la parte inferior de la figura. B. Vías redox para mantener los cofactores necesarios para la actividad de GPx. El GSSG es reducido por GR, siendo esta reducida por NADPH. Ambos esquemas fueron adaptados de [44].
2.3.1.3. Peroxirredoxinas
Las Prx son una clase ampliamente extendida de proteínas antioxidantes y de
señalización. Estas peroxidasas contienen en su sitio catalítico una cisteína
peroxidática, que es oxidable a ácido sulfénico (Cys-OH) y rápidamente forma un
disulfuro con otra Cys (la cisteína resolutiva) durante el ciclo catalítico [19].
Las células de mamífero expresan seis isoformas de Prx, Prx I a VI, las cuales se
clasifican en tres subgrupos (2-Cys, 2-Cys atípica y 1-Cys) en base al número y posición
de los residuos de cisteína que participan en la catálisis [46]. La Prx II (Figura 11), en
particular, tiene un rol fundamental como enzima antioxidante en los glóbulos rojos.
Esta constituye la tercera proteína más abundante del glóbulo con una concentración
intracelular de 240 µM, es capaz de reaccionar extremadamente rápido con H2O2
(k=1.0x108 M-1s-1), y también es una muy eficiente reductora de peroxinitrito
(k=1.4x107 M-1s-1) [47].
A B
21
Figura 11: Estructura de Prx II humana. Se observan, representadas en diagrama de cintas, las diez subunidades proteicas coloreadas con gradiente de colores (código 1QMV) [10, 11].
Su capacidad de reducir hidroperóxidos está dada por el tiol reductor en su sitio activo.
El ciclo catalítico de la enzima involucra la reducción de Prx oxidada por tiorredoxina
(Trx) y el potencial reductor de NADPH vía NADPH-tiorredoxina reductasa (TR) [20]
(Figura 12).
Figura 12: Ciclo catalítico de las Prx 2. 1, ataque nucleofílico de la cisteína peroxidática (SP) al peróxido; 2, reacción del ácido sulfénico con la segunda cisteína, llamada resolutiva (SR); 3, reducción del enlace disulfuro; 4, regeneración de la Trx reducida; 5, oxidación del ácido sulfénico a ácido sulfínico. Esquema adaptado de [47].
2.3.1.4. Catalasa
La catalasa es otra enzima encargada de la remoción de H2O2, y relativamente
abundante en el citosol de los glóbulos rojos, donde la concentración es 3.4 µM [48].
22
Esta consiste en cuatro subunidades, cada una de las cuales contiene un grupo hemo
férrico en su sitio activo (Figura 13).
Figura 13: Estructura de catalasa humana. Se observan, representadas en diagrama de cintas, las cuatro subunidades proteicas coloreadas con gradiente de colores, y los cuatro grupos hemo en rojo representados con esferas (código 1DGF) [10, 11].
A diferencia de las peroxidasas, la catalasa cataliza directamente la descomposición de
dos moléculas de H2O2, en lugar de utilizarlo para oxidar otro sustrato [7]. Su
mecanismo de acción es similar al de la SOD, siendo una molécula de H2O2 reducida a
agua y la otra oxidada a O2 [20] (Figura 14). La catalasa es reciclada durante su ciclo
catalítico y es, por tanto, independiente de cualquier cofactor [49].
La tasa lenta de producción de H2O2 en los glóbulos rojos (vía hemoglobina y SOD)
hace que casi todo el H2O2 sea removido por GPx y Prx, enzimas con una alta velocidad
de reacción. Sin embargo, si se aumentan las concentraciones de H2O2, la catalasa
presentará una mayor contribución y se volverá más importante [7, 47].
Figura 14: Mecanismo de reacción de la catalasa. En primer lugar reacciona con una molécula de H2O2 y se da la formación del compuesto I (intermediario con un Fe de alta valencia). Una vez formado, el compuesto I reacciona rápidamente con una segunda molécula de H2O2 para generar O2 y agua. Esquema adaptado de [50].
23
2.3.2. Antioxidantes no enzimáticos
2.3.2.1. Vitaminas
Existe un amplio rango de constituyentes dietarios que presentan efectos
antioxidantes in vivo, encontrándose entre ellos las vitaminas A, E y C (Figura 15).
La vitamina C o ácido ascórbico es un antioxidante primario en el plasma. Este puede
ser oxidado por transferencia de dos electrones, dando lugar al producto
dehidroascorbato (DHA). Este puede ser reducido o reciclado a ascorbato, proceso que
se lleva a cabo en los glóbulos rojos y es dependiente de GSH. Esto permite reponer los
niveles de ascorbato en plasma, manteniendo la capacidad antioxidante, y además
puede proteger a los eritrocitos del estrés oxidativo transmembrana [51].
El ascorbato es capaz de atrapar virtualmente todos los radicales peroxilo en fase
acuosa antes de que puedan difundir hacia los lípidos de la membrana plasmática,
evitando la lipoperoxidación [52]. Protege además los lípidos de membrana de los
eritrocitos, y tiene un rol en la conservación de tocoferoles [20].
Figura 15: Fórmula química de vitaminas antioxidantes C, A y E. Figura realizada con ChemDraw Professional 15.0 [53].
En cuanto a la vitamina E, existen ocho sustancias en la naturaleza que presentan esta
actividad, de tipo tocoferoles y tocotrienoles. Todas estas formas son capaces de
actuar como antioxidantes, inhibiendo la peroxidación lipídica dado que son capaces
de reaccionar con radicales peroxilo lipídicos más rápido de lo que estos radicales
24
pueden reaccionar con cadenas de ácidos grasos adyacentes o proteínas de
membrana. Los tocoferoles pueden reaccionar también con oxígeno singulete y,
lentamente, con O2•- y radical HO• para proteger a las membranas de estas especies.
Durante estos procesos, el tocoferol es consumido y convertido a su forma radical.
Posteriormente podrá ser reciclado con la participación de ascorbato [7].
La vitamina A, por último, es también un potente atrapador de radicales libres. Los
carotenoides, sus precursores, tienen también efectos antioxidantes y pueden
desactivar el oxígeno singulete [20]. Si bien estas vitaminas antioxidantes liposolubles
resultaron una importante promesa en base a su actividad antioxidante e
inmunomoduladora in vitro, los resultados obtenidos en estudios epidemiológicos
sobre el uso de estos compuestos en ensayos clínicos no dio los resultados esperados
[54-57].
2.3.2.2. Glutatión
En todos los tipos celulares, el GSH (Figura 16) es el regulador no enzimático de la
homeostasis redox intracelular más importante. En particular, los glóbulos rojos
funcionan como transportadores biológicos de GSH al generarlo por síntesis de novo y
otorgan un sistema detoxificante en la circulación. La síntesis de GSH está limitada en
los eritrocitos por la disponibilidad de aminoácidos, en particular de Cys. Esta se lleva a
cabo por medio de dos reacciones sucesivas dependientes de ATP, catalizadas por γ-
glutamilcisteina sintetasa y GSH sintetasa [20].
El GSH es el tiol libre más abundante en las células eucariotas, siendo su concentración
intracelular de 1-10 mM [58-60]. La mayor parte del GSH en las células es utilizado por
tres miembros de la familia de la GPx [61] y por una de las Prx (Prx6). Estas enzimas
catalizan la reducción de H2O2 por GSH en H2O y glutatión disulfuro (GSSG). El GSSG
puede aumentar considerablemente durante el estrés oxidativo, por lo que el cociente
GSH/GSSG es representativo del estrés oxidativo en la célula. Normalmente, más del
90% del total de GSH se mantiene reducido debido a la síntesis de novo de GSH, a la
captación de GSH exógeno y a la reducción enzimática de GSSG por la GSH reductasa
[15, 19]. De este modo, el GSH participa en reacciones redox protegiendo a los grupos
SH de las proteínas de la oxidación y el cross-linking por medio de la oxidación
reversible de su tiol activo [20].
25
Figura 16: Fórmula química del GSH. A. Modelo tridimensional. B. Fórmula estructural.
Otros de los roles principales del GSH en la defensa en contra del estrés oxidativo
incluyen ser cofactor de enzimas detoxificantes como GST, participar en transporte de
aminoácidos a través de la membrana plasmática y atrapar radicales HO• y oxígeno
singulete directamente [15]. Además, está involucrado en el metabolismo del ácido
ascórbico y en la comunicación entre células, y puede formar complejos de
coordinación con iones cobre y disminuir su habilidad para generar radicales libres.
También tiene un rol en el plegamiento proteico y la degradación de proteínas con
enlaces disulfuro, por ejemplo en el caso de la insulina. El primer paso de su remoción
consiste en el corte de los enlaces disulfuro que une las cadenas peptídicas por medio
de la enzima glutatión-insulina transhidrogenasa, en presencia de GSH [7, 62].
2.4. Daño molecular
Si un radical se genera en una solución aeróbica de biomoléculas se dará la oxidación
de las mismas, generándose radicales peroxilo (ROO•) y alcoxilo (RO•) como
intermediarios de la reacción en cadena que proseguirá. Entre los productos finales
más abundantes se encontrarán peróxidos (ROOH y H2O2) y moléculas hidroxiladas
(ROH) o carboniladas (HR=O) [63]. En particular, la formación de carbonilos es la
modificación proteica más estudiada [17].
De este modo, los efectos de los radicales libres en las células llevan a modificaciones a
nivel de las principales estructuras celulares, incluida (i) la membrana celular,
alterando su fluidez al reaccionar con los lípidos que la conforman y el transporte de
membrana, al modificar las proteínas transportadoras de membrana, los canales
iónicos y receptores proteicos, entre otros, (ii) la señalización celular, a través de
A B
26
modificaciones en la síntesis de prostaglandinas y leucotrienos, por ejemplo, y (iii) el
ADN, induciendo cambios en la expresión génica y en la velocidad de división celular y
el aumento del riesgo de cáncer [63, 64]. Tal vez por su mayor proximidad a la fuente
de oxidación o por su limitada capacidad de reparación, el ADN mitocondrial parece
ser más sensible al estrés oxidativo que el nuclear [17]. Por todo esto, el estrés
oxidativo está implicado en una gran variedad de enfermedades y también en el
proceso de envejecimiento.
En el caso de los eritrocitos, el daño oxidativo comprometerá principalmente el
transporte de O2. Además de inhabilitar la unión a O2, la oxidación de la hemoglobina
causa la formación de disulfuros entre cadenas adyacentes de globina, distorsionando
la estructura primaria de la proteína. Otras proteínas afectadas en los glóbulos rojos
por las ROS son las que componen la parte del citoesqueleto de la membrana celular,
que incluyen a la espectrina, anquirina y actina. Las ROS pueden causar la oxidación de
las cadenas laterales de sus residuos aminoacídicos, el cross-linking entre proteínas y
oxidación del segmento central de la proteína, resultando en la fragmentación de la
misma y generación de otros productos proteicos oxidados [65].
2.5. Glutationilación de proteínas
El estrés oxidativo inducido por condiciones tanto fisiológicas como patológicas lleva a
un descenso en la relación GSH/GSSG. Como fue mencionado anteriormente, esta
proporción entre el GSH y su disulfuro oxidado contribuye al potencial redox de la
célula y, por tanto, a la homeostasis redox.
Las cisteínas proteicas presentan un grupo tiol libre normalmente reducido pero
pueden existir bajo ciertos estados oxidados, incluyendo la formación de disulfuros
mixtos con tioles de bajo peso molecular. Este es el caso de la glutationilación, en la
cual las cisteínas forman un enlace disulfuro con la cisteína del GSH [66]. Esta
modificación ha sido considerada como una respuesta adaptativa celular para proteger
a las proteínas de la pérdida de función permanente como consecuencia del estrés
oxidativo.
De acuerdo a lo establecido por Thomas y colaboradores [67], el mecanismo de la
glutationilación proteica podría seguir dos caminos distintos. El primero de ellos
involucra la modificación oxidativa de GSH a GSSG, que puede luego reaccionar con un
tiol proteico reducido en un intercambio tiol-disulfuro. En este caso, la formación del
27
disulfuro mixto ocurriría en respuesta a cambios en la proporción GSH/GSSG. Según
Gilbert [68], a pesar de que se cree que las interacciones específicas entre GSSG y las
proteínas desplazan el equilibrio del disulfuro mixto hacia la glutationilación proteica,
la constante de equilibrio (Kmix) para la mayor parte de las proteínas suele ser
alrededor de 1. Esto indica que es poco probable que ocurra la glutationilación
dependiente de GSSG en respuesta a cambios en la relación GSH/GSSG [69]. Una idea
similar fue propuesta por Dalle-Donne y colaboradores [70] a partir del estudio de la
glutationilación de actina. Según su trabajo, la concentración de GSSG requerida para
que ocurra el intercambio de tiol-disulfuro dentro de la célula es mucho mayor que
aquella presente en la célula.
El segundo mecanismo propuesto para la glutationilación de proteínas involucra la
activación inicial del tiol proteico, pudiéndose llevar a cabo por modificaciones
oxidativas o nitrosativas. Estas modificaciones pueden encontrarse estabilizadas o, de
lo contrario, pueden reaccionar con GSH para formar los disulfuros mixtos en cuestión
[71].
Figura 17: Vías de glutationilación proteica. (1) intercambio tiol-disulfuro entre tiol proteico y GSSG en respuesta a cambios en la relación GSH/GSSG; (2) activación del tiol proteico por modificaciones oxidativas (por ejemplo formación de ácido sulfénico) y (3) modificaciones nitrosativas previas a la reacción con GSH; (4) reacción de tioles proteicos con formas oxidadas o nitrosadas del GSH. Esquema adaptado de [72, 73].
No todas las ROS son oxidantes específicas de tioles proteicos, jugando un papel
importante tanto la vida media del oxidante como la velocidad de reacción. El H2O2, en
particular, es suficientemente estable y reactivo para causar oxidación de tioles. Lo
hace a partir de una reacción de sustitución nucleofílica; en primer lugar se desprotona
el tiol para obtener la nucleofilicidad necesaria, teniendo las cisteínas en entornos
28
básicos (por ejemplo rodeadas de residuos de arginina, lisina o histidina) tasas de
reacción más altas con H2O2. Como resultado de esta oxidación se formará ácido
sulfénico, el cual es altamente reactivo con el sulfhidrilo de GSH y puede facilitar la
glutationilación proteica [72].
Alternativamente, los disulfuros mixtos pueden formarse por la reacción de GSH con
tioles proteicos que han sido S-nitrosados por exposición a especies reactivas del
nitrógeno (RNS). La exposición de células a •NO y otras RNS puede llevar también a la
oxidación de GSH a GSSG y GSNO. La glutationilación mediada por •NO involucra GSNO
como reactivo intermediario y ocurre bajo condiciones reductoras sin que sea
necesaria la descomposición de GSNO o la formación de GSSG [69].
En cuanto a los sitios de glutationilación, no hay evidencia de secuencias aminoacídicas
específicas que tengan este rol. Probablemente el requerimiento más importante de
una cisteína para ser glutationilada sea su accesibilidad [66]. Cuando esta cisteína se
encuentra en el sitio activo de una enzima, por ejemplo, la glutationilación suele
resultar en la inhibición de la actividad de la proteína. Este es el caso de la mayor parte
de las proteínas, aunque algunas de ellas sufren un aumento de su actividad o
presentan una actividad diferencial regulada por cofactor [71, 74].
Además de constituir un mecanismo de resistencia al estrés oxidativo, se le han
atribuido otros roles a la glutationilación proteica, entre ellos la modulación de vías de
transducción de señales como la fosforilación de tirosinas, regulación de la
transcripción, procesamiento proteolítico, ubiquitinación y degradación de proteínas
[69].
La glutationilación tiene varias características requeridas para actuar como un
mecanismo de señalización. En primer lugar, es rápida, normalmente ocurriendo unos
pocos minutos luego de la exposición a un oxidante. En segundo lugar, es reversible
bajo detiolación enzimática por glutarredoxina y también como consecuencia del
potencial redox. Por último, es específica: las proteínas y sus diferentes cisteínas
tienen diferente reactividad a los oxidantes, existe compartimentalización redox del
interior celular, y existe especificidad en la detiolación enzimática. Se ha demostrado
que el ditiotreitol (DTT) es menos selectivo que la glutarredoxina (Grx) 1 en la
remoción de GSH, indicando que podrían existir proteínas glutationiladas que sirvan de
sustratos específicos para la Grx. Es posible además que exista especificidad en la
tiolación enzimática dado que, dependiendo de las condiciones, la Grx también puede
facilitar la glutationilación [74].
29
Entre las proteínas que han mostrado ser sensibles a reacciones de glutationilación se
incluyen enzimas involucradas en el metabolismo central y periférico (glucosa 6-
fosfato deshidrogenasa, piruvato quinasa, aldolasa, enolasa, anhidrasa carbónica), en
la transducción de señales (5-lipooxigenasa y guanilato ciclasa), en el catabolismo
proteico (colagenasa y tripsina), proteínas mitocondriales (citocromo c oxidasa),
proteínas de heat shock (HSP-70), chaperoninas, Prx, y factores de transcripición
(subunidad p50 de NF-ΚB). También están representadas algunas proteínas del
citoesqueleto (actina, miosina, profilina y vimentina) [71, 75].
El nivel de proteínas glutationiladas en células en reposo es al menos un orden de
magnitud menor que aquel en células bajo estrés oxidativo. De esta manera, se
generan patrones de glutationilación alterados en situaciones de desregulación redox,
como enfermedades cardiovasculares, pulmonares, inflamatorias, o
neurodegenerativas, que pueden ser utilizados como biomarcadores [72]. Algunos
autores plantean que el análisis de proteínas glutationiladas como indicadores de
estrés oxidativo es ventajoso con respecto a la medida de GSH y GSSG, sobre todo
teniendo en cuenta que estas son más estables que el GSSG al ser menos susceptibles
a la reducción enzimática [76].
2.5.1. Glutationilación de hemoglobina
Los glóbulos rojos han sido propuestos como los principales atrapadores de los
oxidantes generados a nivel circulatorio [77, 78], y como la sangre puede ser estudiada
como indicador del estado oxidativo general del organismo, se ha propuesto que la
hemoglobina glutationilada (Hb-SG), en particular, puede servir como marcador clínico
[79]. Niwa y colaboradores [80] realizaron el primer estudio que demostró que los
niveles de Hb-SG están incrementados en pacientes diabéticos, así como en pacientes
con hiperlipidemia. En estos pacientes, el aumento de Hb-SG puede producir un
descenso en el suministro de O2 a los tejidos debido a que esta presenta una alta
afinidad por el O2 y baja cooperatividad, contribuyendo así a la hipoxia tisular. Además,
aumentos significativos de Hb-SG han sido encontrados en ataxia de Friedreich y falla
renal crónica, y se ha propuesto como marcador también en terapias crónicas
sustitutivas como diálisis y trasplantes [81].
En cuanto al sitio de glutationilación, múltiples autores proponen que la unión de la
molécula de GSH a la hemoglobina se daría en alguna de sus cadenas β. La
30
hemoglobina contiene dos residuos de cisteína en cada cadena β, en las posiciones 93
y 112, y un residuo de cisteína en cada cadena α, en la posición 104. Mientras que el
residuo β93 se encuentra accesible en la superficie, los residuos β112 y α104 están
orientados hacia el interior de la molécula, y aunque no forman enlaces disulfuro están
involucrados en el contacto entre subunidades, por lo que no están disponibles para
ser modificados. Por esto la modificación se generaría en el residuo β93 [80, 82]. Sin
embargo, existen estudios que indican la unión del GSH a otras de estas cisteínas.
Mawatari y colaboradores [83] plantearon la formación de al menos tres tipos de
Hb-SG en los eritrocitos. El primer tipo es un disulfuro mixto entre GSH y hemoglobina
normal. El segundo tipo es un enlace disulfuro entre la cisteína β93 de la metHb y
GSSG, y el tercer tipo es un enlace disulfuro entre los otros residuos de cisteína de la
cadena β de metHb y/o de la cadena α de la metHb y GSSG. Tsikas y colaboradores
[84], por otro lado, demostraron la oxidación de hemoglobina a Hb-SG inducida por
nitrito en las cisteínas β-93 y β-112.
Para la detección y estudio de proteínas glutationiladas, entre ellas la hemoglobina, se
han utilizado sobre todo técnicas de proteómica como cromatografía líquida de alta
resolución y espectrometría de masa. Además, existen resultados en donde se empleó
a la enzima GST como herramienta para detectar este tipo de proteínas modificadas
[85].
2.5.2. Glutatión S-transferasa
La familia de enzimas GST utiliza GSH en reacciones que contribuyen a la
transformación de un amplio rango de compuestos, incluyendo carcinógenos, drogas
terapéuticas y productos de estrés oxidativo [15]. La inducción de la expresión de GST
es un mecanismo celular conservado a lo largo de la evolución en respuesta a la
exposición a oxidantes y estrés oxidativo, así como distintos químicos dañinos
producidos de manera endógena o por el medio ambiente [86, 87].
La mayor parte de las GSTs catalizan la conjugación de GSH a compuestos que
presentan un centro electrofílico, por medio de la formación de un enlace tioéter entre
el átomo de azufre del GSH y el sustrato [88]. Esta conjugación forma parte de las
reacciones de la fase II del proceso de detoxificación de xenobióticos [89]. En la fase I
del metabolismo de xenobióticos, por lo general miembros de la familia del citocromo
P450 introducen un grupo funcional en el xenobiótico que proporciona un centro
31
electrofílico. Este centro electrofílico podrá ser atacado en la fase II por GSH y esto le
permitirá al conjugado ser removido de la célula durante la fase III, proceso que
requiere la participación de transportadores especiales. Una vez transportados fuera
de la célula, la porción peptídica de los conjugados será sometida al ataque por una
peptidasa y, en última instancia, será convertida en ácido mercaptúrico. Este es el
metabolito final que es eliminado del organismo por la orina [88].
En cuanto a la detoxificación de productos de estrés oxidativo, algunas isoenzimas de
GST muestran actividad GPx independiente de selenio, pudiendo reducir
hidroperóxidos lipídicos de membrana, tanto de colesterol como de ácidos grasos [86].
En un primer paso de la reacción se da la reducción del peróxido a un alcohol, con la
producción de GSH sulfénico (GSOH) (Figura 18A), y en un segundo paso se da la
reacción espontánea del GSOH con una molécula de GSH para generar agua y GSSG
(Figura 18B) [88].
Figura 18: Reducción de hidroperóxidos lipídicos catalizada por GST. El esquema (a) corresponde al primer paso de la reacción y el esquema (b) al segundo paso.
Además de esto, los productos de la peroxidación lipídica y de la oxidación de
nucleótidos y catecolaminas pueden ser conjugados a GSH mediante la acción de la
GST previniendo la continuación de ciclos redox [86].
Además de su función enzimática, se ha sugerido que las GSTs pueden servir también
como transportadores intracelulares de algunas moléculas orgánicas, como el grupo
hemo, bilirrubina, pigmentos biliares y esteroides [7, 90].
Las distintas formas de GST se expresan diferencialmente dependiendo del tejido y de
la etapa de desarrollo del individuo, modificándose la expresión durante la transición
de feto a adulto. Las GSTs purificadas de hígado humano originalmente fueron
designadas como α, β, γ, δ, ε, y fueron colectivamente llamadas como transferasas
básicas o transferasas (α-ε). Posteriormente, se encontró una nueva GST denominada
µ, y un tercer tipo, la GST π, que corresponde a la GST encontrada en placenta,
pulmones y riñones, entre otros órganos. En consecuencia, se clasifica a las varias GST
citosólicas de mamífero en tres clases diferenciadas por su estructura: las clases α, µ y
π [90].
32
Figura 19: Estructura de la GSTµ2 humana. Se observan, representadas en diagrama de cintas, las dos subunidades proteicas coloreadas con gradiente de colores (código 3GUR) [10, 11].
Las enzimas citosólicas son dímeros, formadas por subunidades idénticas o diferentes
pero siempre de la misma familia (Figura 19) [7]. La GST dimérica funcional presenta
un sitio de unión para GSH y uno para el sustrato electrofílico por cada subunidad. El
sitio de unión a GSH presenta una alta especificidad, aunque algunos derivados como
homoglutatión y γ-glutamilcisteína pueden funcionar como sustratos alternativos [90].
GSTs estructuralmente similares muestran actividades específicas altas con ciertos
compuestos característicos. Por ejemplo, la clase µ es altamente reactiva con epóxidos
[90]. En esta clase de enzimas se han identificado dos residuos de tirosina en el sitio
activo que participan en la catálisis. La tirosina 6 estabiliza el tiolato nucleofílico GS-
mientras que la tirosina 115 actúa como electrófilo en las reacciones de apertura de
anillos de epóxido. Además, esta última juega un papel estructural en el sitio activo
[91].
2.6. Hipótesis
Debido a la alta afinidad que presenta la enzima GST por el GSH, esta es utilizada
normalmente como módulo en proteínas de fusión recombinantes al permitir una fácil
purificación por cromatografía de afinidad en resinas de glutatión inmovilizado. El gen
de GST utilizado en el desarrollo de vectores pGEX para la expresión de estas proteínas
de fusión fue originalmente clonado del helminto Schistosoma japonicum, cuya GST
está relacionada a la clase μ de mamíferos (ver Anexo).
33
Considerando que la GST sirve para purificar proteínas recombinantes por unión
selectiva a una fase estacionaria con GSH inmovilizado, se plantea que podría ser
posible alternar su rol y utilizarla como fase estacionaria que interaccione con el GSH
de proteínas glutationiladas que se encuentren en la fase móvil. Es nuestra hipótesis
que distintas GST pertenecientes a la clase μ pueden ser entonces utilizadas para
capturar proteínas glutationiladas, y en particular hemoglobina, destacada por su
calidad de indicador de estrés oxidativo.
34
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo general
Capturar proteínas glutationiladas selectivamente utilizando como herramienta a la
enzima GST.
3.2. Objetivos específicos
Producción de proteínas glutationiladas y determinación de su glutationilación. Se
trabajará sobre todo con hemoglobina y alternativamente con albúmina. Los niveles de
glutationilación obtenidos se determinarán por medio de técnicas de HPLC.
Captura de proteínas glutationiladas utilizando GST proveniente del parásito
Echinococcus granulosus. Esta GST, relacionada a la clase μ de mamíferos, será
anclada a diferentes resinas de sefarosa para intentar capturar las proteínas
glutationiladas en un ensayo en batch.
Detección de Hb-SG por medio de GST biotinilada proveniente del parásito
Schistosoma japonicum. Una vez biotinilada, esta GST también relacionada a la clase μ
de mamíferos se empleará a modo de sonda de detección de proteínas glutationiladas
en ensayos de dot blot.
35
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Reactivos y equipos
Se utilizaron reactivos obtenidos de Sigma-Aldrich (San Luis, Missouri, EEUU) y
Applichem (Darmstadt, Alemania). Las resinas empleadas para cromatografía de
intercambio iónico y ensayos de captura, así como las columnas de gel filtración,
provinieron de GE Healthcare Life Sciences (Little Chalfont, Reino Unido). Los filtros
utilizados se obtuvieron de Corning Inc. (Corning, Nueva York, EEUU) y GE Healthcare.
Las medidas de absorbancia se realizaron en un espectrofotómetro Varian Cary 50
(Agilent, Santa Clara, California, EEUU). En todos los geles de poliacrilamida realizados
se utilizó el marcador de peso molecular (MPM) See Blue Plus 2 de Thermo-Fisher
Scientific (Waltham, Massachussetts, EEUU), a menos que se especifique lo contrario, y
en todos los casos se reveló con Coomassie Colloidal Blue.
4.2. Obtención de muestras
Los concentrados de glóbulos rojos se obtuvieron del Departamento de Hemoterapia
del Hospital de Clínicas de la Universidad de la República, previo consentimiento
informado de los donantes. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de dicho
Hospital. Para la obtención de los concentrados de sangre total donada se mezcla en el
momento de la extracción con una solución de citrato, fosfato y dextrosa (CPD) (3.27
g/L ácido cítrico, 26.3 g/L citrato trisódico, 2.51 g/L fosfato de sodio y 25.5 g/L glucosa),
para evitar su coagulación. Posteriormente se centrifugaron a 2200 rpm en una
centrífuga de bolsas de transfusión Roto Silenta 63RS (Hettich, Alemania) a 20 °C, para
separar el plasma y las plaquetas de los glóbulos rojos, los cuales se almacenan a una
densidad de 8.77 g/L en una solución denominada SAGM (NaCl 8.8 g/L, glucosa 8.2 g/L,
manitol 5.2 g/L y adenina 0.3 g/L; OPTISOL, Terumo Corporation, Tokio, Japón).
Procedimiento realizado por el personal del Hospital de Clínicas.
36
4.3. Purificación de hemoglobina
Se partió de sangre humana, de la cual se separaron los glóbulos rojos por
centrifugación a 800 g, por 10 minutos. El enriquecido de glóbulos rojos fue lavado con
solución isotónica (NaCl 150 mM) y luego fue suspendido en la misma, con posterior
centrifugación y descarte del sobrenadante. Esto se llevó a cabo un total de 3 veces.
Para lisar los glóbulos rojos, se agregó un volumen equivalente de agua destilada, y
luego se disolvió en buffer Tris 50 mM pH 8.3 con EDTA 0.1 mM (buffer de inicio).
Para la purificación de hemoglobina a partir del lisado de glóbulos rojos se utilizó una
resina DEAE Sepharosa CL-6B montada en una columna para cromatografía. Esta fue
previamente equilibrada con buffer de inicio.
Se utilizó buffer de inicio para eluir todo el material que no quedó retenido en la
columna, y posteriormente se eluyó la muestra con un gradiente de pH entre 8.3 y 7.0,
alcanzado este último con el agregado de buffer Tris 50 mM pH 7.0 con EDTA 0.1 mM
(buffer final).
Una vez recolectadas las fracciones eluidas, se determinó la concentración de
hemoglobina en las mismas. Esto se realizó a través de la medición de absorbancia a
λ=630 nm y λ=577 nm, dado que para una solución formada por una mezcla de oxiHb y
metHb, las concentraciones se pueden obtener a partir de las siguientes fórmulas:
[oxiHb] (μM) = 66 Abs577 - 80 Abs630
[metHb] (μM) = 279 Abs630 - 3 Abs577
4.4. Glutationilación de proteínas
Se preparó una solución de GSSG 200 mM en agua con adición de NaOH 400 mM para
promover la solubilización. La glutationilación de hemoglobina se llevó a cabo
incubando 200 μM de la misma con 20 mM de GSSG en buffer fosfato 100 mM pH 7.4
con ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) 100 μM. Esto se dejó reaccionando
toda la noche a 4 °C [92].
Se trabajó además con HSA. Esta fue reducida previamente a realizar la
glutationilación. Se incubó 1 mM de proteína con 10 mM de β-mercaptoetanol (βME)
en buffer fosfato con DTPA, por 30 minutos en agitación a temperatura ambiente.
Posteriormente se separó la proteína del reductor por medio de una gel filtración en
37
columna PD10, durante la cual se cambió el buffer en el que estaba disuelta la proteína
a un buffer acetato 100 mM pH 4.5 con DTPA 100 μM. Se determinó la concentración
proteica de las fracciones recolectadas por medición de absorbancia a λ=279 nm (Ɛ=
0.531 (g/L)-1cm-1) [92, 93].
La glutationilación de la HSA se realizó de manera similar que para la hemoglobina,
pero en buffer acetato con DTPA a pH 4.5. En general, cuanto más alcalino sea el pH de
la mezcla más rápido se dará el intercambio tiol-disulfuro (de ahí el pH 7.4 utilizado
para la hemoglobina), pero en el caso de la HSA se encuentra puesta a punto la
reacción a pH más ácidos [92].
Luego de la incubación se separó el GSSG de la proteína por medio de gel filtración en
PD10. Para esta se utilizó buffer fosfato pH 7.4. Se midió posteriormente la
concentración de proteína en las fracciones eluidas. Esto se realizó tanto para la
hemoglobina como para la HSA.
4.5. Determinación de GSH por mBrB
Para confirmar la glutationilación de las proteínas se las hizo reaccionar con DTT en
orden de reducir el enlace disulfuro que las une al GSH. Este luego puede ser
detectado por medida de fluorescencia si se lo conjuga a monobromobimano (mBrB),
al dar lugar a un compuesto con un máximo de absorción a 396 nm y un máximo de
emisión a 482 nm (Figura 20). Para llevar esto a cabo se preparó una solución de mBrB
de 20 mM en acetonitrilo.
Figura 20: Reacción de mBrB con GSH. El producto obtenido presenta un máximo de emisión a λ=482 nm [53].
Se incubó, por un lado, 44.5 μM de Hb-SG con 0.2 mM de DTT, y por otro 50 μM de
HSA glutationilada (HSA-SG) con 0.2 mM de DTT. En ambos casos se dejó reaccionar 30
minutos a temperatura ambiente, y luego se filtró durante 10 minutos a 15000 g
38
usando filtros Spin X UF de tamaño de poro de 5 kDa para obtener la fracción
conteniendo al GSH.
En el caso de la hemoglobina, se diluyó lo obtenido 1:2.5, y se tomó 20 μl para
reaccionar con mBrB 0.2 mM. Se realizó lo mismo con la HSA sin la dilución previa.
A modo de control, se filtraron las proteínas sin ser reducidas y se tomaron 20 μl de la
fracción filtrada para reaccionar con 4 μl de DTT 1 mM. Luego de incubar 30 minutos a
temperatura ambiente se le agregó mBrB 0.2 mM. Con esto se buscó determinar el
contenido de GSSG residual para evitar sobreestimar el porcentaje de glutationilación.
Las muestras fueron analizadas por medio de un HPLC 1260 Infinity Quaternary LC
(Agilent), utilizando una columna de fase reversa C18 y un flujo de 0.8 ml/min. Las
fases móviles utilizadas fueron A: ácido acético 0.25% en agua y B: metanol. El método
empleado consistió en 10% de B durante 0-2 minutos, 100% de B durante 18-21
minutos y 10% de B durante 22-28 minutos. El volumen de muestra inyectado fue de 5
μl. La detección se hizo mediante medición de fluorescencia a λex=396 nm y λem=482
nm, con un blanco consistiendo en mBrB en ausencia de GSH [58].
La curva de calibración se realizó utilizando diferentes concentraciones de GSH en un
rango de 0-50 μM, haciéndolo reaccionar, al igual que las muestras, con 0.2 mM de
mBrB y fue analizado en las mismas condiciones.
4.6. Control de calidad de proteínas
4.6.1. Cuantificación de GST de E. granulosus
Se partió de GST recombinante de Echinococcus granulosus expresada en una cepa
BL21(DE3) transformada con el plásmido O16058_ECHGR y purificada en el laboratorio
como descrito [94]. Previamente a la cuantificación se centrifugó la proteína por 10
minutos a 10000 g para sedimentar fracciones agregadas.
La cuantificación de proteína se realizó por el método de Bradford. Para la curva de
calibración se emplearon diluciones en un rango de 0-60 μg/ml de un estándar de
lisozima 0.1 mg/ml.
Las muestras analizadas consistieron en triplicados de tres diluciones diferentes de
GST: una de ellas con una concentración estimada de 30 μg/ml, otra 5 veces más
concentrada, de 150 μg/ml, y otra 5 veces más diluida, de 6 μg/ml. Estas
concentraciones estimadas se calcularon a partir de la medición de absorbancia a
39
λ=280 nm, considerando un coeficiente de extinción molar teórico Ɛ= 41400 M-1cm-1
(ProtParam, ExPASy Bioinformatics Resource Portal) [95].
Tanto las muestras como la curva de calibración se incubaron con 200 μl de reactivo de
Bradford en una placa de 96 pocillos, y se midió la absorbancia de todas ellas a λ=595
nm en un lector de placas Varioskan Flash (Thermo-Fisher Scientific).
4.6.2. Determinación de actividad enzimática de GST
Para la medida de actividad se utilizó 1 μl de GST con 2 mM de GSH en buffer fosfato
100 mM pH 6.5. La reacción fue iniciada con el agregado de 2 mM de
clorodinitrobenceno (CDNB), compuesto que es capaz de conjugarse a GSH mediante
reacción catalizada por GST, formando un producto que absorbe a λ=340 nm (Ɛ= 9600
M-1cm-1) [94] (Figura 21). Para determinar la actividad de la GST, se midió la
absorbancia a esta longitud de onda cada 10 segundos durante 2 minutos.
Se llevó a cabo un control de la reacción en ausencia de catálisis enzimática en las
mismas condiciones, sin el agregado de GST.
Figura 21: Reacción de CDNB y GSH catalizada por GST. El producto obtenido presenta un máximo de
absorbancia a a λ=340 nm [53].
4.6.3. Electroforesis
Se corrió un gel de poliacrilamida, con gel de resolución 15% y stacking 5%, en
condiciones desnaturalizantes y no reductoras. Se sembró tanto la GST, para evaluar su
pureza e integridad, como hemoglobina glutationilada y sin glutationilar. Las muestras
fueron incubadas previamente con buffer de muestra (Tris-HCl pH 6.8 con 34.7 mM
SDS) y fueron corridas a 30 mA en buffer de electrodo (Tris-glicina pH 8.3) [96].
40
4.7. Captura por IMAC-Sefarosa
Para la captura de proteínas glutationiladas se utilizó una resina Ni Sepharose Fast
Flow 6 en batch acomplejada con GST. De manera de obtener esta unión se incubaron
50 μl de resina con 500 μl de GST en buffer fosfato 50 mM pH 8 con NaCl 500 mM
(buffer de unión), durante 30 minutos en agitación a temperatura ambiente.
Posteriormente, para eliminar toda la GST no unida, se hicieron 3 lavados con buffer
de unión. Resultados previos mostraron que la EgGST se une completamente en estas
condiciones [94].
En general, la proteína a ser capturada se agregó en conjunto con buffer de unión,
asumiendo una unión 1:1 con la GST. Se dejó establecer la interacción por 2 horas en
agitación a temperatura ambiente. Una vez pasadas las 2 horas, se hicieron 5 lavados
con buffer de unión para eluir todos los componentes de la muestra que no
establecieron una interacción específica con la enzima, recolectando dichas fracciones.
La elución se realizó a través del agregado de GSH 10 mM en buffer de unión, con una
incubación de 10 minutos en agitación a temperatura ambiente.
La hemoglobina fue previamente gel filtrada en columna PD10, utilizando buffer de
unión. Se realizó, además, un control del ensayo en las mismas condiciones con
hemoglobina reducida con βME para determinar si existen interacciones con la GST no
relacionadas con el GSH.
En el caso de la HSA, se realizó el ensayo con proteína glutationilada, y también con
HSA reducida con βME y HSA sin reducir.
4.7.1. Análisis de eficiencia
La fracción no unida a la GST, los lavados y el eluido se corrieron, en todos los ensayos,
en un gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes y no reductoras.
En los ensayos realizados con HSA la composición del gel de resolución fue de
poliacrilamida 12.5% y stacking 5%, y en los realizados con hemoglobina se utilizó un
gel de resolución 15% y stacking 5%. En todos los casos las muestras fueron incubadas
previamente con buffer de muestra y fueron corridas a 30 mA en buffer de electrodo.
41
4.8. Captura por sefarosa activada con CNBr
Para este ensayo de captura alternativo se usó una resina CNBr-activated Sepharose
4B en batch. Se utilizaron 50 mg de resina (previamente lavada con HCl 1 mM) que se
incubaron con 400 μl de GST en buffer NaHCO3 0.4 M pH 8.3 con NaCl 2 M, llegando a
un volumen final de 600 μl. Se hicieron sucesivos lavados para desprender toda la GST
no unida alternando pH 8.3 y pH 4, usando el buffer NaHCO3 y ácido acético/acetato
de sodio 0.1 M pH 4 con NaCl 0.5 M. Por último se lavó con buffer fosfato 100 mM pH
7.5 con DTPA 0.1 mM y NaCl 500 mM.
Una vez acoplada la GST a la resina, se agregaron 200 μL de Hb-SG 94 μM en buffer
fosfato y se dejó incubando toda la noche en cámara fría. Los lavados para eluir la
hemoglobina no unida se realizaron también con buffer fosfato, y la elución de la
hemoglobina unida específicamente a la GST se llevó a cabo con 10 mM de GSH
disuelto en buffer NaHCO3, dejándolo reaccionar con la GST 10 minutos a temperatura
ambiente.
Este procedimiento se realizó además, a modo de control, con hemoglobina reducida
con βME, no glutationilada.
Se llevó a cabo, en paralelo, un ensayo en las mismas condiciones pero con una resina
control. En este caso, la resina se incubó con un volumen equivalente de agua y buffer
NaHCO3, en lugar de GST, para determinar si se establecen interacciones entre la
hemoglobina (glutationilada o no glutationilada) y la fase estacionaria.
4.8.1. Análisis de eficiencia
Al igual que en los ensayos de captura por IMAC-Sefarosa, la fracción no unida a la
GST, los lavados y el eluido se corrieron en un gel de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes y no reductoras. La composición del gel de resolución fue de 15% y
la del gel de stacking 5%. Las muestras fueron incubadas con buffer de muestra y
fueron corridas a 30 mA en buffer de electrodo.
42
4.9. Preparación de GST biotinilada de Schistosoma japonicum
4.9.1. Purificación de GST de S. japonicum
Se partió de una muestra de GST de S. japonicum obtenida de la expresión de
cistationina β-sintasa recombinante, a partir del plásmido pGEX4T1/hCBSΔC143 en una
cepa BL21(DE3) de E. coli, por Dayana Benchoam y Ernesto Cuevasanta [97]. La GST se
utiliza como módulo en proteínas de fusión para facilitar la purificación, pudiendo
posteriormente ser cortada de la proteína de interés utilizando trombina.
La SjGST fue concentrada utilizando filtros de 10 KDa de corte, centrifugando a 7000 g
en varias tandas de 30 minutos, siempre a 4 °C.
En un paso siguiente, la SjGST concentrada se purificó en dos tandas (primero una
parte de la muestra y luego otra) por medio de gel filtración con una columna
Superdex 200 16/60 unida a un equipo ÄKTA (GE Healthcare Life Sciences) de
purificación proteica. Los valores de flujo y presión usados correspondieron a 1 ml/min
y 0.30 MPa, respectivamente, y la detección se realizó por medio de medición de
absorbancia a 280 nm. La SjGST fue centrifugada 10 minutos a 10000 g previamente a
ser inyectada en la columna.
Las fracciones obtenidas se corrieron en un gel de poliacrilamida al 15% con stacking
5%, en condiciones desnaturalizantes y reductoras, para determinar la presencia y
pureza de la proteína en las mismas. Las muestras fueron previamente incubadas con
buffer de muestra con agente reductor (Tris-HCl pH 6.8 con 34.7 mM SDS y 2.5% βME,
100 °C), y fueron corridas a 30 mA en buffer de electrodo. En este caso el MPM
utilizado fue Sigma Marker Wide Range 6.5-200 kDa (Sigma-Aldrich).
Una vez seleccionadas las fracciones con GST, estas se juntaron y a la mezcla
resultante se le calculó la concentración proteica por medio de la medición de
absorbancia a 280 nm. Posteriormente, se llevó a cabo un ensayo de actividad
enzimática como el realizado anteriormente para la GST de E. granulosus (ver sección
4.5.2. Determinación de actividad enzimática de GST).
43
4.9.2. Biotinilación de GST
De manera de poder biotinilar la proteína, fue necesario previamente formar biotina-
N-hidroxisuccinimida (biotina-NHS). Para esto se incubaron 100 μl de biotina 900 mM,
100 μl de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) 900 mM y 100 μl de NHS
900 mM por 2.5 horas aproximadamente, en agitación y a temperatura ambiente
(Figura 22A). Todas las soluciones se realizaron en dimetilformamida.
La biotinilación se realizó sobre la GST unida a una resina Glutathione Sepharose 4 Fast
Flow en batch, en orden de bloquear el sitio activo y evitar la biotinilación del mismo
(Figura 22B). La resina fue previamente equilibrada con buffer fosfato de sodio 50 mM,
NaCl 150 mM, pH 7.4, e incubada con 1 ml de GST de 69.3 μM por 30 minutos en
agitación a temperatura ambiente. Luego de realizar sucesivos lavados con buffer se
agregó la biotina-NHS en 5 tandas, cada una de ellas con 2.8 mM de concentración y 5-
10 minutos de incubación. Se lavó con buffer nuevamente, y se pasó a la etapa de
elución por medio del agregado de GSH 10 mM. Esto se realizó tres veces, incubando
cada vez 10 minutos y colectando la fracción liberada.
Una vez finalizado este ensayo, se tomaron todas las fracciones obtenidas (GST no
unida a la resina, lavados, biotina no unida a GST y eluidos) y se les hizo una prueba
semi-cuantitativa de presencia de proteína. Para cada muestra se tomaron 10 μl y se
mezclaron con 10 μl de reactivo de Bradford para observar el cambio de color de
marrón a azul en caso de haber proteína, siendo este azul más intenso con mayores
concentraciones proteicas.
Frente a estos resultados, se eligieron las fracciones de eluido que mostraron mayor
contenido proteico. A la mezcla de las mismas se le realizó un espectro de absorbancia
y se calculó la concentración de proteína en base al valor de absorbancia a 280 nm.
Para confirmar la ocurrencia de biotinilación y averiguar la eficiencia de la misma se
utilizó un FluoReporter Biotin Quantitation Assay Kit (Thermo-Fisher Scientific).
44
Figura 22: Reacciones que involucran a biotina-NHS. A. Formación del N-hidroxisuccinimidil ester de biotina a partir de la activación del carboxilato por medio de EDC. B. Reacción de biotiniliación de la GST utilizando la biotina-NHS como agente [53].
Se realizaron diferentes diluciones de la muestra y para cada una se incubaron 50 μl de
la misma con 50 μl de reactivo Biotective Green por 5 minutos a temperatura
ambiente y en oscuridad. Posteriormente se midió la intensidad de fluorescencia, con
λex=485 nm y λem=530 nm.
La curva de calibración para determinar la concentración de biotina en las muestras se
realizó con diferentes concentraciones de biocitina –análogo de la biotina-, en un
rango entre 0 y 0.8 μM.
A
B
45
4.10. Dot blot con GST biotinilada
Para la detección de proteínas glutationiladas por GST biotinilada se utilizó una
membrana de PVDF (GE Healthcare Life Sciences).
Previo al ensayo, la GST-biotina fue lavada para liberarla del GSH con el que se eluyó
durante la etapa de biotinilación. El lavado se realizó utilizando filtros Vivaspin 500 (GE
Healthcare) con 10 kDa de corte, centrifugando 3 veces a 14000 g por 10 minutos con
el posterior agregado de buffer 50 mM fosfato de sodio, 150 mM NaCl pH 7.4.
La membrana fue previamente activada con metanol 100% y equilibrada en TBS-
Tween (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.6% Tween pH 7.4). A las proteínas se las trató con
1% SDS y se las calentó a 100 °C por 3 minutos antes de ser sembradas, en orden de
favorecer la desnaturalización y retención de las mismas en la membrana. Se
sembraron 2 μl de Hb-SG 636 μM, así como de hemoglobina sin glutationilar 553 μM y
GST-Biotina 13.6 μM como controles, y luego se sometió a la membrana a vacío sobre
un papel de filtro con el mismo objetivo.
El bloqueo de sitios no específicos en la membrana se realizó con una solución TBS-
Tween-1% BSA, y se dejó incubando 1 hora a temperatura ambiente en agitación.
Posteriormente, se agregó aproximadamente 70 μg/ml de GST-biotina diluida en la
solución de bloqueo y se dejó nuevamente en agitación por 1 hora a temperatura
ambiente. Una vez pasado este tiempo, se realizaron tres lavados de 10 minutos con
TBS-Tween.
En un último paso se incorporó Streptavidina-Alexa Fluor 680 (Molecular Probes,
Eugene, Oregon, EEUU) diluido 1/1000 en solución de bloqueo, en orden de detectar
aquellos sitios donde se unió la GST por medio de la interacción Biotina-Streptavidina.
La incubación en este caso se realizó en oscuridad, a temperatura ambiente y en
agitación. Al cabo de 45 minutos se realizaron tres lavados de 10 minutos con TBS-
Tween y se dejó la membrana en TBS lista para ser revelada.
El revelado de la membrana se llevó a cabo en un G:Box Chemi XT4 (Syngene,
Cambridge, Reino Unido).
46
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. Determinación de GSH por mBrB
Una vez glutationiladas la HSA y hemoglobina, se procedió a determinar la eficiencia
de esta glutationilación. Para esto se redujo las proteínas con DTT. El GSH liberado por
acción del reductor es capaz de conjugarse a mBrB, dando lugar a un compuesto con
un máximo de absorción a 396 nm y un máximo de emisión a 482 nm, que puede ser
separado por HPLC utilizando una columna de fase reversa.
De este modo, se realizó una curva de calibración con concentraciones crecientes de
GSH para poder identificar el perfil cromatográfico del mismo y determinar
posteriormente su concentración en las muestras de interés (Figura 23).
Se determinó que el mismo eluye a los 6.5 minutos en las condiciones en que se realizó
el ensayo, a partir de la detección de un pico cuya área crece con el aumento en la
concentración de GSH, y el cual no está presente en el blanco (con mBrB y 0 μM de
GSH).
Figura 23: Control de GSH conjugado a mBrB. A. Perfil cromatográfico de concentraciones crecientes de GSH, visto en un gráfico de intensidad de fluorescencia (IF) en función del tiempo. La flecha señala el pico correspondiente al GSH. B. Curva de calibración: área bajo la curva (AUC) en función de concentración de GSH.
Teniendo esta información, se procedió a analizar las muestras conteniendo el GSH
liberado por las proteínas al ser reducidas, así como las fracciones obtenidas de la
y = 1.56x – 3.32
R2 = 0.990
A B
47
filtración de las proteínas glutationiladas sin reducir. Esto se realizó como control, de
modo de detectar la posible presencia de GSSG remanente y evitar sobreestimar el
porcentaje de glutationilación.
Según los resultados obtenidos, las dos proteínas resultaron glutationiladas con el
método utilizado, confirmado por la aparición del pico en el minuto 6.5 del
cromatograma, ausente en el blanco y en la muestra con DTT (Figura 24). Sin embargo,
el porcentaje de glutationilación varió ampliamente entre una y otra. En el caso de la
HSA, la concentración total de GSH detectada fue de 18.3 μM. Cuando se corrigió con
el valor de GSH obtenido para el control se obtuvo una concentración de 10.9 μM que,
en relación con la concentración de proteína (50 μM), dio un porcentaje de
glutationilación de 22%. Para la hemoglobina la concentración de GSH obtenida fue de
139.3 μM, y al ser corregida con el control arrojó un valor de 120.7 μM. Esto equivale a
un porcentaje de glutationilación de 270%, cuando se considera la concentración total
de hemoglobina (44.5 μM).
Figura 24: Perfil cromatográfico de las muestras. Gráfico de intensidad de fluorescencia (IF) en función del tiempo, con el control de DTT en verde, el blanco con mBrB en negro, la hemoglobina en azul y HSA en rojo.
Sin embargo, en el total de sus cuatro subunidades la hemoglobina presenta seis
grupos tiol, por lo que en una situación de máxima glutationilación habrá 1.5
moléculas de GSH por cada subunidad. Por lo tanto, bajo estas condiciones, se
esperaría un 150% de glutationilación.
48
Dado que el porcentaje de glutationilación de la hemoglobina obtenido supera el valor
máximo esperado, se puede pensar que la purificación por gel filtración luego de la
glutationilación o las filtraciones de control sin previa reducción con DTT no fueron
eficientes, detectándose entonces GSSG residual que interaccionó con mBrB. Esto se
tuvo en cuenta en ensayos posteriores, donde se sometió a la hemoglobina a un paso
adicional de purificación por gel filtración.
5.2. Control de calidad de proteínas
El método de captura de proteínas glutationiladas se basa en la enzima GST, por lo que
resultó fundamental la confirmación de su integridad y presencia de actividad. Para
esto se llevó a cabo su cuantificación y ensayo de actividad enzimática, en conjunto
con la observación de la misma en un gel de poliacrilamida.
5.2.1. Cuantificación de glutatión S-transferasa
La cuantificación de GST se realizó mediante el método de Bradford, utilizando un
estándar de lisozima para la elaboración de la curva de calibración (Figura 25). Esta
permitió obtener los valores de concentración de proteína a partir de mediciones en la
absorbancia a λ=595 nm de tres diluciones distintas de proteína.
Figura 25: Curva de calibración del método de Bradford. Gráfico de absorbancia a λ=595 nm en función de concentración proteica (y=0.003x + 0.293).
49
Se tomó el promedio de estos resultados de absorbancia y se calculó la concentración
real de proteína a partir del mismo. El valor obtenido fue de 2.25 mg/ml, siendo muy
similar al valor que se llegó por medición de absorbancia a λ=280 nm, que fue de 2.38
mg/ml.
5.2.2. Determinación de actividad enzimática de GST
La medida de actividad enzimática se realizó incubando a la GST con GSH, iniciándose
la reacción con el agregado de CDNB. Se realizaron mediciones de absorbancia a
λ=340 nm durante 2 minutos para detectar la formación de producto. Se realizó,
además, un control de la reacción en ausencia de enzima (Figura 26).
Figura 26: Determinación de actividad enzimática de GST. Seguimiento de la absorbancia a λ=340 nm en el tiempo, en presencia (rojo) y ausencia (azul) de enzima.
Los resultados mostraron valores de absorbancia crecientes con el paso del tiempo,
indicando la formación de producto y presencia de actividad enzimática.
Al corregirse con el control sin enzima se obtuvo una actividad específica igual a 7.56
U/mg. Este valor es superior al valor reportado, siendo este último 2.50 U/mg [98],
pero se mantiene en el mismo orden. Esta diferencia probablemente esté dada por
diferencias en el método de cuantificación proteica.
50
5.2.3. Electroforesis
Una vez confirmada la conservación de actividad enzimática de la GST, se procedió a
analizar su integridad y pureza por medio de un gel desnaturalizante de poliacrilamida
15% (Figura 27). Se realizó también un control de calidad de la hemoglobina,
analizando tanto hemoglobina reducida como glutationilada, dado que esta sería
utilizada posteriormente en los ensayos de captura.
Se observó que la hemoglobina reducida y la hemoglobina glutationilada presentan la
misma movilidad electroforética, manifestándose una banda marcada de
aproximadamente 16 kDa en ambos casos correspondiente al monómero. Se detectó
además, tanto en la reducida como en la glutationilada, una segunda banda de mayor
tamaño que podría estar correspondiendo a la formación de dímeros de hemoglobina
oxidada. Desde el punto de vista de la pureza, no parecieron haber otros
contaminantes presentes.
La GST mostró también una banda marcada, en este caso de alrededor de 25 kDa. Esto
indicó que la enzima no se encontraba degradada, lo cual concuerda con la
confirmación de presencia de actividad. Además de esta banda identificada como la
GST propiamente dicha, se vio una serie de bandas de mayor tamaño. La principal
hipótesis es que se trata de contaminantes, pudiéndose mejorar esto con una gel
filtración de la enzima para mejorar su pureza. Sin embargo, a juzgar por los pesos
moleculares, no se puede descartar que estas bandas correspondan a agregados
multiméricos formados por uniones covalentes por sobreoxidación de la enzima. Para
poder, eventualmente, diferenciar esto de especies contaminantes se podría utilizar
técnicas de espectrometría de masa o de western blot.
51
Figura 27: Análisis electroforético de las proteínas. De izquierda a derecha se muestra: en el primer carril, el MPM, dos carriles con hemoglobina, dos carriles con hemoglobina glutationilada y dos carriles con glutatión S-transferasa.
5.3. Captura por IMAC-Sefarosa
El ensayo de captura consistió en la utilización de GST como un “anzuelo” de proteínas
glutationiladas, por su capacidad de unir GSH en su sitio activo. Esta a su vez fue
retenida por una resina de sefarosa con níquel, al formarse enlaces de coordinación
entre el grupo imidazol de las histidinas de la cola de la GST y el metal en cuestión.
Se incubó, en batch, esta resina unida a GST y la proteína glutationilada, así como un
control en paralelo con proteína reducida. Se espera que las proteínas glutationiladas
interactúen específicamente con la GST y de ese modo permanezcan unidas a la resina,
mientras que las proteínas que no presentan GSH en su estructura se eluyan con
lavados. Para eluir las proteínas glutationiladas se utilizó GSH.
64 98
52
Figura 28: Esquema de ensayo de captura para hemoglobina.
El ensayo se realizó con hemoglobina y con HSA. Para analizar la eficiencia del mismo
se corrieron las distintas fracciones eluidas en un gel de poliacrilamida y se observó el
patrón de bandas obtenido (Figura 29).
El gel correspondiente a las fracciones obtenidas del ensayo con HSA glutationilada
mostró un perfil de bandas que concuerdan con lo esperado. En el primer carril se
sembró HSA reducida como referencia, y se vio una banda de alrededor de 64 kDa. En
la fracción no unida se detectó gran cantidad de HSA (posiblemente atribuible a la
saturación por alta concentración proteica), la cual continúa eluyendo con los lavados
hasta llegar al lavado n°5. En ese punto la resina pareció haberse limpiado totalmente
de proteína excedente. Con el eluido con GSH se esperó desprender proteína unida
específicamente a la GST y, en efecto, se detectó HSA en dicha fracción.
53
Figura 29: Análisis electroforético de las fracciones obtenidas del ensayo de captura de HSA-SG con GST unida a resina IMAC. De izquierda a derecha se muestra: MPM, HSA control, carril vacío, dilución 1/10 de la fracción no unida, lavados 1-5, dilución 1/10 del eluido, dilución ½ del eluido, eluido sin diluir, carril vacío, MPM.
Para validar este resultado, se analizó el control realizado con HSA no glutationilada
(Figura 30A). Si se observa el gel correspondiente a las fracciones obtenidas con este
ensayo control, se puede apreciar que el patrón de bandas es el mismo que con HSA-
SG. Los lavados realizados disminuyeron la cantidad de proteína excedente detectada
en la fracción no unida (aunque no totalmente), para luego eluir una gran proporción
de la misma con el agregado de GSH, mecanismo ideado para desfavorecer
interacciones específicas establecidas.
Una de las hipótesis para explicar este resultado podría ser que parte de la HSA
utilizada como control se encuentra glutationilada. Esta fracción glutationilada podría,
entonces, unirse a la GST y luego ser eluida con el agregado de GSH.
Para descartar esta hipótesis, se realizó un control adicional con HSA pre-reducida con
βME para asegurar que no exista glutationilación (Figura 30B). El patrón de bandas
mostrado en el gel correspondiente a este ensayo se mantuvo igual a los
anteriormente realizados.
54
Uniendo estos resultados se puede pensar que la HSA está estableciendo interacciones
inespecíficas, ya sea con la GST o con la resina. Considerando que la HSA es conocida
por unir diferentes ligandos [93], se pasó entonces a probar el mismo procedimiento
con hemoglobina.
Figura 30: Análisis electroforético de las fracciones obtenidas de los ensayos de captura de HSA no glutationilada con GST unida a resina IMAC. A. Ensayo realizado con HSA no glutationilada sin reducir. B. Ensayo realizado con HSA no glutationilada pre-reducida con βME. En ambos casos se muestra, de izquierda a derecha: MPM, HSA control, carril vacío, dilución 1/10 de la fracción no unida, lavados 1-3, lavado 5, dilución 1/10 del eluído, dilución ½ del eluído, eluído sin diluir, carril vacío, MPM.
Tanto para Hb-SG como hemoglobina reducida con βME, el ensayo dio el mismo
resultado (Figuras 31 y 32, respectivamente). En ambos casos la hemoglobina se unió
completamente a la resina, pudiéndose ver a nivel macroscópico (la resina adquirió un
color rojo) y también detectándose en el gel. Se corrió, al igual que con la HSA,
hemoglobina como referencia en el primer carril. En este se observó una banda de
alrededor de 16 kDa que no se volvió a detectar en ningún otro carril. Es decir, no fue
posible eluir la hemoglobina (glutationilada o no) ni con lavados ni con GSH libre.
A B
55
Figura 31: Análisis electroforético de las fracciones obtenidas del ensayo de captura de Hb-SG con GST unida a resina IMAC. Se muestra, de izquierda a derecha: MPM, hemoglobina control, carril vacío, lavados 1-5, eluido, MPM.
Al igual que lo visto en el gel de control de calidad de proteínas, la hemoglobina
presentó una segunda banda cerca de 36 kDa atribuida a la formación de dímeros.
Figura 32: Análisis electroforético de las fracciones obtenidas del ensayo de captura de hemoglobina no glutationilada con GST unida a resina IMAC. Se muestra, de izquierda a derecha: MPM, hemoglobina control, carril vacío, lavados 1-5, eluido, MPM.
En conclusión, se puede decir que este método no resultó útil para capturar las
proteínas glutationiladas. Es posible que este tipo de resina esté interfiriendo con el
ensayo, siendo la responsable de las interacciones inespecíficas, o que la GST utilizada
56
no tenga la capacidad de unir el GSH unido a proteínas por impedimento estérico o
fallas en su plegamiento al estar adherida a la resina.
5.4. Captura por sefarosa activada con CNBr
Frente a los resultados negativos obtenidos con la resina de IMAC, se procedió a
cambiar la plataforma de anclaje de la GST. A diferencia de la anteriormente utilizada,
esta resina forma uniones covalentes con su ligando, inmovilizándolo por medio del
método de bromuro de cianógeno. El ligando en cuestión puede ser cualquier
molécula que contenga grupos amino primarios (como el grupo amino de los residuos
de lisina y el N-terminal en proteínas), siendo aquí la GST.
En este caso el ensayo se realizó únicamente con hemoglobina, tanto glutationilada
como el control en paralelo con hemoglobina reducida. Esta se incubó con el complejo
resina-GST y se hicieron lavados para eluir toda la proteína no unida. La elución de la
Hb-SG se llevó a cabo del mismo modo que los ensayos anteriores, con GSH libre.
Además, se llevó a cabo un ensayo en las mismas condiciones pero con una resina
control. Esta fue incubada con un volumen equivalente de agua y buffer NaHCO3, en
lugar de GST, para determinar si se establecen interacciones entre la hemoglobina
(glutationilada o no glutationilada) y la fase estacionaria.
El análisis de eficiencia consistió también en la corrida de las fracciones obtenidas en
un gel de poliacrilamida.
Los geles corridos con las fracciones obtenidas del ensayo con esta resina fueron
iguales para la hemoglobina glutationilada y reducida (Figuras 33 y 34,
respectivamente). No se detectó proteína en ninguno de los lavados, ni tampoco en el
eluído, observándose una banda correspondiente a la hemoglobina únicamente en la
fracción no unida. Además se observó coloración roja en la resina durante todas las
etapas del procedimiento, lo que señaló la unión de hemoglobina a la misma.
Frente a estos resultados se puede determinar que la proteína está siendo retenida
inespecíficamente por la resina de sefarosa.
57
Figura 33: Análisis electroforético de las fracciones obtenidas del ensayo de captura de Hb-SG con GST unida a resina de sefarosa activada con CNBr. Se muestra, de izquierda a derecha: MPM, hemoglobina control, carril vacío, dilución 1/5 de la fracción no unida, lavados 1-5, eluido, MPM.
Más evidencia de esto se obtuvo en los resultados del ensayo realizado con la resina
control, la cual también se coloreó de rojo (no se muestran estas imágenes).
Otro problema persistente durante el desarrollo de esta técnica fue la pérdida de
resina en los lavados y el resto de los pasos en donde se necesitó de centrifugación.
Esto pudo haber determinado la pérdida de proteína en conjunto con la resina, por
falta de sedimentación total de la misma.
Figura 34: Análisis electroforético de las fracciones obtenidas del ensayo de captura de hemoglobina no glutationilada con GST unida a resina de sefarosa activada con CNBr. Se muestra, de izquierda a derecha: MPM, hemoglobina control, carril vacío, dilución 1/5 de la fracción no unida, lavados 1-5, eluido, MPM.
58
En conclusión, este método tampoco permitió la captura específica de Hb-SG. De todos
modos, sigue siendo imposible descartar que el problema radique en la GST y su
incapacidad de unir proteínas glutationiladas cuando es empleada en estas
condiciones.
5.5. Preparación de GST biotinilada de Schistosoma japonicum
5.5.1. Purificación de GST de S. japonicum
Dos alícuotas de GST fueron purificadas por medio de gel filtración, luego de ser
concentradas y centrifugadas. La Figura 35 muestra el perfil electroforético de los
picos obtenidos durante las dos cromatografías de las alícuotas.
En el carril número 1 se sembró la muestra sin purificar, del 2-6 se sembraron los picos
obtenidos en la purificación de la primera alícuota de la muestra, y del 7-9 los picos
obtenidos en la purificación de la segunda alícuota de la muestra. Considerando que la
GST es un homodímero y sus monómeros presentan un peso molecular de alrededor
Figura 35: Análisis electroforético de fracciones obtenidas de cromatografía de SjGST. La muestra se dividió en dos partes y estas fueron purificadas por gel filtración. Se muestra, de izquierda a derecha, MPM, 1- muestra sin purificar, 2-6- picos obtenidos en la purificación de la primera parte de la muestra, 7-9, picos obtenidos en la purificación de la segunda parte de la muestra.
59
de 26 kDa, se tomaron las fracciones sembradas en el carril número 4 y número 9 y
fueron almacenadas en conjunto.
Usando un Ɛ280 teórico = 43110 M.cm-1 calculado a partir de la secuencia aminoacídica
de la proteína (ProtParam, ExPASy Bioinformatics Resource Portal) [95], se determinó
una concentración de 1.81 g/L de GST para la mezcla de fracciones obtenida.
Una vez establecida su concentración, se procedió a medir la actividad enzimática para
corroborar la integridad funcional de la proteína. Esto se llevó a cabo de la misma
manera que para la GST de E. granulosus. Se observó también un aumento de
absorbancia con el paso del tiempo, indicando la formación de producto y presencia de
actividad enzimática. En este caso, el valor de actividad específica fue de 18.2 U/mg,
siendo este considerablemente mayor al valor reportado en la bibliografía, de 6.78
U/mg [99]. Al igual que con la GST de E. granulosus, esto pudo haberse dado por
diferencias en los métodos de trabajo.
5.5.2. Biotinilación de GST
La biotinilación de GST se llevó a cabo con la proteína previamente unida a una resina
de GSH-Sefarosa para evitar la biotinilación de su sitio de unión a GSH. Luego de
incubar con biotina-NHS y eluir la GST de la resina, se determinó la eficiencia de
biotinilación mediante el kit de cuantificación de biotina FluoReporter Biotin
Quantitation Assay Kit.
Figura 36: Curva de calibración del FluoReporter Biotin Quantitation Assay Kit. Gráfico de intensidad de fluorescencia del reactivo Biotective Green en función de concentración de biocitina, ajustado a un polinomio de segundo grado.
60
El reactivo utilizado, Biotective Green, emite fluorescencia a 530 nm de manera
proporcional a los niveles de biotina presentes.
A partir de la curva de calibración realizada con biocitina (análogo de biotina) (Figura
36), y conociendo la concentración de GST eluida de la resina, se calculó un porcentaje
de biotinilación de GST de 90%. Este método de biotinilación resultó eficiente,
pudiéndose usar esta GST para detectar proteínas glutationiladas sin riesgos mayores
de competencia por parte de GST no biotinilada.
5.6. Dot blot con GST biotinilada
El dot blot se realizó en una membrana de PVDF, en la cual se sembró la Hb-SG para
luego detectarla utilizando GST biotinilada. Se buscó que la GST cumpliera la función
de sonda, uniéndose al GSH de la proteína glutationilada, mientras que el revelado del
dot blot se realizó por medio de streptavidina fluorescente, que se asocia a aquellos
sitios donde se encuentre la GST por unión a la biotina.
Además de Hb-SG, también se sembró hemoglobina sin glutationilar y GST-biotina a
modo de control. La hemoglobina sirve para confirmar que no hay unión entre la GST
biotinilada y proteínas que no estén glutationiladas, y la GST-biotina para controlar
que la streptavidina esté efectivamente uniéndose a la biotina.
Figura 37: Resultados del dot blot revelado con Streptavidina-Alexa Fluor 680. A. Imagen del dot blot. De izquierda a derecha, se muestra: dos sitios con hemoglobina reducida, dos sitios con Hb-SG, y dos sitios con GST-biotina como control positivo. B. Misma imagen que A, sin control positivo y con mayor acumulación. C. Relación entre las áreas bajo la curva de los gráficos de señal para hemoglobina reducida y glutationilada. Tomando la de Hb-SG como 1, la hemoglobina reducida mostró un AUC de 0.36.
C
61
La Figura 37A muestra la membrana con los seis sitios donde fueron sembradas las
proteínas. No se detectó señal fluorescente con hemoglobina reducida o
glutationilada. Sin embargo, se obtuvo una fuerte señal con el control positivo (los
primeros dos sitios comenzando de la derecha) que permitió confirmar que todos los
pasos de la técnica de dot blot se llevaron a cabo correctamente, incluyendo el
revelado por streptavidina fluorescente.
En la Figura 37B, se omite el control positivo de GST-biotina para no opacar posibles
señales más débiles con su intensa fluorescencia. De este modo, se logró divisar una
leve fluorescencia en aquellos sitios donde se sembró Hb-SG, pudiéndose tomar esto
como un potencial resultado positivo al no observarse señal con la hemoglobina
reducida. De manera de confirmar este resultado, se realizó un análisis cuantitativo del
dot blot mostrado en esta figura mediante el programa ImageJ 1.46r [100].
Este análisis indicó, en efecto, un aumento de la intensidad de la señal fluorescente
para la Hb-SG en comparación con la hemoglobina reducida: en promedio, el área bajo
la curva del gráfico obtenido para Hb-SG fue 2.8 veces mayor.
A pesar de ser baja la sensibilidad del método, estos resultados sugieren la formación
de un complejo entre Hb-SG y SjGST, abriéndose la posibilidad de eventualmente
mejorar la sensibilidad y utilizar este método como herramienta de detección.
62
6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
En este trabajo se buscó desarrollar un método para capturar o detectar proteínas
glutationiladas, en particular hemoglobina, que resulta relevante por su calidad de
marcador de estrés oxidativo. En el proceso de llevar esto a cabo se lograron aplicar
diferentes técnicas y metodologías del área de bioquímica de proteínas, tanto para su
modificación, como para su purificación y análisis.
En cuanto al objetivo de capturar proteínas glutationiladas utilizando GST de E.
granulosus, no se pudo llegar a un procedimiento exitoso inmovilizándola en resinas
de IMAC-sefarosa o sefarosa activada con CNBr. Es importante tener en cuenta que las
mediciones de actividad de la enzima se llevaron a cabo en solución, en condiciones
diferentes a aquellas en las que se la está utilizando. Frente a esto, algunas estrategias
a aplicar en el futuro podrían consistir en la medida de su actividad en condiciones de
inmovilización, o la incubación en solución de la GST con la proteína glutationilada.
Posterior a esto, se podría realizar una gel filtración (para separar el complejo de las
especies libres) y la retención del complejo con la matriz de afinidad IMAC. Otras
mejoras al protocolo podrían incluir el aumento de concentración de GSH al momento
de la elución, y un lavado con imidazol para eliminar interacciones inespecíficas.
Asimismo, en el protocolo de captura por sefarosa activada con CNBr, se debería
incorporar un paso de bloqueo de sitios con el mismo objetivo de eliminar estas
interacciones.
Por otro lado, en el ensayo de dot blot con la SjGST biotinilada combinada con
streptavidina fluorescente se mostró una señal mayor para la Hb-SG que para
hemoglobina reducida. Sin embargo, en comparación con el trabajo anteriormente
mencionado donde también se utilizó a la GST como herramienta de detección (Cheng
y colaboradores) [85], se obtuvo una menor sensibilidad del método. Una diferencia
con este trabajo es que se usó hemoglobina en lugar de albúmina, lo que puede estar
cambiando el resultado del protocolo.
De todos modos, se destaca que no existieron trabajos que continuaran investigando
sobre esta herramienta. En general, los métodos presentes en la bibliografía para la
detección de proteínas glutationiladas consisten en técnicas de cromatografía líquida y
espectrometría de masa [101, 102], así como western blots con anticuerpos anti-GSH
[103], marcado del GSH intracelular con 35S y posterior electroforesis en dos
dimensiones y autorradiografía [104, 105], y técnicas de derivatización de cisteínas
63
catalizada por Grx1 [106]. Todas estas estrategias involucran procedimientos costosos,
y en algunos casos son técnicas indirectas de detección.
Frente a esto se destaca que, con mejoras en su sensibilidad, la SjGST biotinilada
podría funcionar como herramienta selectiva para la detección de proteínas
glutationiladas intactas, en un método simple y accesible. Si bien es un objetivo
ambicioso, en este trabajo se llegó a resultados preliminares interesantes que podrían
ser explorados en mayor profundidad en otra etapa.
64
7. ANEXO
Para mostrar la relación estructural entre la enzima GST de S. japonicum y las GST de
clase μ de mamíferos, se realizó un alineamiento de la secuencia de SjGST con la base
de datos de UniProt usando la herramienta BLAST [107]. En total se encontraron 125
hits (de 250) correspondientes a GST de clase μ de mamíferos, todos ellos
significativos, con un porcentaje de identidad en el rango 41.2-47.6% y e-values de
órdenes menores a 1x10-52.
Figura 38: Alineamiento de secuencias entre GST μ 4 humana y SjGST.
65
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