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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE QUÍMICA
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE INULINA DE ACHICORIA
TESIS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
INGENIERO QUÍMICO
PRESENTA
LUIS FERNANDO IGLESIAS MARTÍNEZ
MÉXICO, D.F. 2011
UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
Restricciones de uso
DERECHOS RESERVADOS ©
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México).
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor.
2
JURADO ASIGNADO:
PRESIDENTE: Raúl Genaro Aguilar Caballero
VOCAL: Rogelio Rodríguez Sotres
SECRETARIO: Alberto López Luna
1er. SUPLENTE: Luis Tonatihut Sánchez Linares
2° SUPLENTE: Sandra Paola Sánchez Rodríguez
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: LAB 314 EDIFICIO E, FACULTAD
DE QUÍMICA. UNAM.
ASESOR DEL TEMA:
Dr. Alberto López Luna
SUSTENTANTE:
Luis Fernando Iglesias Martínez
3
A Arturo Martínez Sánchez
In memoriam
4
Agradecimientos
Quiero agradecer, na llingua asturiana, a los mis güelos, José Luis Iglesias y
María del Carmen Fernández, poles sus pallabres d’ánimu. Amás, doy les
gracies al mi padre Luis Iglesias dar el su respaldu y el su conseyu.
Igualmente, agradezco a mi madre, Hilda Martínez, y a mi hermano Julio A.
Iglesias por su apoyo incondicional.
Gracias a Jean Contreras O’Dea por su ayuda y sus miramientos.
Asimismo, estoy agradecido con mis amigos, en especial a Gustavo López G.,
por su compañía y ayuda a lo largo de mis estudios.
Finalmente, les doy las gracias a los académicos que me ayudaron a lo largo
del proyecto de investigación; al Dr. Eduardo Bárzana G., al Dr. Miquel
Gimeno S. por su supervisión, al Dr. Alberto López L. por su orientación, a la
Dra. Carmina Montiel por sus consejos, al Dr. Agustín López Munguía por sus
asesorías y atenciones. También quiero agradecer al Dr. Rogelio Rodríguez S.
y el Dr. Raúl Aguilar C. por sus recomendaciones.
5
Índice
1. Resumen 82. Marco Teórico 10
2.1 Inulina 10 2.1.1 Propiedades Físicas 10 2.1.2 Biosíntesis de Inulina 14 2.1.3 Síntesis in vitro 20 2.1.4 Producción y Extracción de Inulina 22 2.2 Hidrólisis Ácida de Inulina 24 2.3 Hidrólisis Enzimática de Inulina 25 2.3.1 Estructura de las Inulinasas 25 2.3.2 Cinética y Especificidad de Inulinasas 30 2.3.3 Producción de Inulinasas 41 2.4 Aplicaciones de la Hidrólisis Enzimática de Inulina 42 2.4.1 Producción de Fructooligosacáridos 42 2.4.2 Producción de Fructosa 44
3. Objetivo General 453.1 Objetivos Particulares 45
4. Materiales y Métodos 46 4.1 Enzima 46 4.2 Inulina y Fructooligosacáridos 46 4.3 Medición de Concentración de Proteína en N 960 46 4.4 Electroforesis SDS-Page 46 4.5 Determinación del Grado de Polimerización por Hidrólisis ________Ácida
47
4.6 Determinación del pH Óptimo 47 4.7 Determinación de la Temperatura Óptima 47 4.8 Medición de la Velocidad de Reacción 47 4.9 Medición de Azúcares Reductores 48 4.10 Identificación de Productos y Medición de Concentración 49
5. Resultados y Discusión 49 5.1 Grado de Polimerización 49 5.2 Medición de Concentración de Proteína 51 5.3 Electroforesis 53 5.4 Determinación de las Condiciones Óptimas 54 5.4.1 Determinación de la Temperatura Óptima 54 5.4.2 Determinación del pH Óptimo 56 5.5 Productos de la Hidrólisis 57 5.5.1 Balance de Materia 58 5.5.2 Combinaciones de Productos a partir de la Hidrólisis _ completa de Inulina por la Acción de la Endoinulinasa
60
5.6 Estudio Cinético 61 5.6.1 Validación del Modelo Cinético 65 5.7 Reacción en Presencia de Fructooligosacáridos 68
6. Conclusiones 70 6.1 Perspectivas 71
7. Bibliografía 72
6
Índice de Tablas y Figuras
Figura 2.1 Estructura de la Inulina de Achicoria 10Tabla 2.1 Propiedades Físicas de la Inulina de Achicoria 10
Figura 2.2 Solubilidad de Raftiline HP (Inulina de Achicoria con ______________DP mayor a 23)
12
Figura 2.3 Micrografías de Inulina durante los Primeros ______________ Segundos en Contacto con Agua
13
Figura 2.4 Estructura de la Levana 15 Figura 2.5 Estructura de la Gramanina 16 Figura 2.6 Estructura de la Agavina 16 Figura 2.7 Estructura de la Levana producida por B. subtilis 16 Figura 2.8 Estructura cristalina de la Fructosiltransferasa (FTF) ______________de Aspergillus japonicus
18
Figura 2.9 Sitio Activo de la Fructosiltransferasa (FTF) de ______________Aspergillus japonicus con 1-kestosa
19
Figura 2.10 Sitio Activo de la Invertasa de Schwaniomyces _______________occidentalis con Fructosa en el Sitio Activo
19
Figura 2.11 Producción in vitro de Inulina 21 Figura 2.12 Comparación de la Relación glucosa/inulina _______________después de dos Horas de Reacción
22
Figura 2.13 Hidrólisis Ácida de Fructanos 24 Figura 2.14 Secuencia de aminoácidos de la Exoinulinasa y _______________-Endoinulinasa.
26
Figura 2.15 Potenciales Eléctricos de A) Exoinulinasa de C. __________Intybus y de la Invertasa
27
Figura 2.16 Sitio Activo de Exoinulinasa de Aspergillus awamori 28Figura 2.17 Estructura de la Endoinulinasa de Aspergillus niger __________con Fructosa en el Sitio Activo
30
Figura 2.18 Sitio Activo de la Endoinulinasa de Aspergillus niger __________sobrepuesto en el Sitio Activo de la Exoinulinasa __________Aspergillus awamori
30
Figura 2.19 Cinética Michaelis Menten 33 Figura 2.20 Cinética de Reacción de la Mezcla comercial _______________Fructozyme L con diferentes Sustratos
35
Tabla 2.2 Parámetros Cinéticos de Fructozyme L y la _____________Exoinulinasa BfrA
36
Tabla 2.3 Parámetros Cinéticos de Fructozyme L y la _____________Exoinulinasa BfrA sobre varios Sustratos
37
Tabla 2.4 Parámetros Cinéticos de Fructozyme L en Inulina de _____________Achicoria a distintas Temperaturas
38
Figura 2.21 Validación del Modelo Cinético 40 Tabla 2.5 Comportamiento de la Endoinulinasa de distintas _____________Fuentes microbianas
40
Figura 2.22 Inhibición de Fructozyme L por Fructosa 40 Figura 2.23 Producción de Fructooligosacáridos de la Empresa ______________belga Beneo-Orafti
43
Tabla 4.1 Composición del Reactivo DNS 48
7
Tabla 5.1 Cálculo del Grado de Polimerización 50 50 Gráfica 5.1 Curva Patrón para la Medición de la Concentración de ______________Proteína
51
Tabla 5.2 Medición de la Concentración de Proteína con el _____________Método de Bradford para N 960
52
Figura 5.1 Electroforesis de la N 960 53 Figura 5.2 Cromatograma de la Reacción a 30 ºC 54 Figura 5.3 Cromatograma de la Reacción a 40 ºC 55 Figura 5.4 Cromatograma de la Reacción a 50 ºC 55 Figura 5.5 Cromatograma de la Reacción a 60 ºC _ 55 Figura 5.6 Cromatograma de la Reacción a 75 ºC 56 Gráfica 5.2 Determinación de la Temperatura Óptima 56 Figura 5.7 Cromatograma de la Reacción a pH 26 57 Figura 5.8 Cromatograma de la Reacción a pH 4.7 57 Figura 5.9 Cromatograma de la Reacción a pH 2.6 57 Figura 5.10 Cromatograma de la Reacción a pH 8 58 Gráfica 5.3 Determinación del pH Óptimo 58 Tabla 5.3 Combinaciones de Reacciones de Hidrólisis por Acción _____________de la Endoinulinasa
62
Tabla 5.4 Fracción Peso de los Productos de la Hidrólisis 63 Gráfica 5.4 Medición de Azúcares Reductores durante la _______________Hidrólisis enzimática de Inulina
63
Gráfica 5.5 Velocidades Iniciales vs. Concentraciones Iniciales 64 Tabla 5.5 Cinética de tipo Michaelis Menten comparada con los ______________Datos experimentales
65
Tabla 5.6 Cinética de Pseudo-Primer Orden comparada con los _____________ Datos experimentales
65
Gráfica 5.6 Modelo Michaelis Menten y Modelo Pseudo- ______________ Primer Orden comparados con los Datos ______________ Experimentales
66
Tabla 5.7 Concentración después de una hora de Reacción a _____________60ºC y pH de 6
67
Figura 5.11 Acercamiento a los Cromatogramas de 1 y 24 Horas _______________de Reacción
68
Tabla 5.8 Composición después de 24 horas de Reacción 68 Tabla 5.9 Composición de la Mezcla Comercial de _____________Fructooligosacáridos Actilight.
68
Gráfica 5.8 Composición de Fructooligosacáridos, Glucosa y _______________Fructosa a través del Tiempo
69
8
1. Resumen
La inulina es un polímero compuesto por una cadena lineal de D-fructofuranosa
con enlaces β-2,-1 y un residuo de glucosa unido por un enlace α-1,-2; es una
mezcla polidispersa que contiene entre 2 y 60 unidades. La inulina también
representa la segunda forma más común de almacenar energía en vegetales
después del almidón.
La achicoria (Cichorium Intybus) es la fuente más utilizada de inulina ya que
constituye alrededor del 85% de la masa seca de su raíz. La inulina vegetal se
produce a partir de sacarosa en una síntesis que utiliza dos transferasas del
grupo 32 de la clasificación Henrisatt-Davies. Durante el primer paso, la 1-
sacarosa:sacarosa-fructosiltransferasa transfiere una molécula de fructosa de
la sacarosa al extremo fructosil de otra molécula de sacarosa en posición β-2,-1
formando 1-kestosa. Posteriormente la enzima 1-fructano:fructano-
fructosiltransferasa utiliza sacarosa para añadir moléculas de fructosa a la
cadena. A diferencia de la inulina de origen microbiano sigue una síntesis de un
solo paso utilizando fructosiltransferasa.
La inulina es una fibra no digerible que posee actividad prebiótica. Es decir,
tiene la propiedad de promover el crecimiento de la flora intestinal benéfica en
el colón. También puede formar geles que tienen texturas similares a algunas
grasas, motivo por el cual es ampliamente utilizada en la industria alimenticia.
Sin embargo, la inulina de alto peso molecular es poco soluble y, por ende, los
fructooligosacáridos son de gran interés ya que conservan las propiedades
prebióticas de la inulina y son más solubles.
Una forma de producir fructooligosacáridos es la hidrólisis parcial de inulina.
Las endoinulinasas son enzimas capaces de romper el enlace β-2,-1 de forma
azarosa y formar cadenas más cortas. Distintos microorganismos son capaces
de producir endoinulinasas extracelulares, entre los cuales el más utilizado es
Aspergillus niger.
9
Las exoinulinasas y endoinulinasas, al igual que las invertasas y las
fructosiltransferasas, pertenecen al grupo 32 de la clasificación Henrisatt-
Davies. Todas ellas tienen similitudes a nivel estructural, compartiendo algunos
aminoácidos y el mecanismo de reacción nucleófilo, ácido/base.
La empresa danesa Novozyme produce la N 960 una mezcla comercial de
enzimas que contiene invertasa, endoinulinasa y exoinulinasa de Aspergillus
Niger y que produce fructooligosacáridos principalmente.
Los objetivos fueron encontrar los parámetros cinéticos y las condiciones
óptimas de operación de la N 960 por medio de la medición de la concentración
de azúcares reductores durante la reacción, asi como su anàlisis por
cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC).
Los resultados demostraron que las condiciones óptimas de operación para la
N 960 son similares al de otras mezclas comerciales de inulinasas y que el
fructooligosacárido que se produce en mayor proporción molar es la
inulotriosa, al igual que en otras endoinulinasas, mientras que el que se
encuentra en mayor proporción másica es la inulotetraosa. Los parámetros
cinéticos de la reacción de hidrólisis coinciden con el modelo Michaelis Menten.
10
2. Antecedentes
2.1 Inulina
La inulina es un polisacárido compuesto por una cadena linear de D-
fructofuranosa con enlaces β-2,1 y un residuo de glucosa en el extremo
reductor con un enlace tipo sacarosa α(1-2) (Chi,Z.-M., et al. 2011). Se
presenta como una mezcla de polisacáridos con distintos grados de
polimerización que varían típicamente entre 20 y 30 unidades de fructosa; sin
embargo en su forma nativa encontramos una mezcla de oligosacáridos y
polisacáridos entre 2 y 60 unidades de fructosa (Muñoz-Gutiérrez, Rodríguez-
Alegría, López-Munguía. 2009).
Figura 2.1 Estructura de la inulina de achicoria. (Muñoz-Gutiérrez, Rodríguez-Alegría, López
Munguía. 2009).
2.1.1 Propiedades Físicas de la Inulina
La solubilidad de la inulina depende del grado de polimerización, a medida que
la cadena es más larga resulta menos soluble. Los oligómeros de inulina cuyo
DP promedio va de 4 a 7 presentan mayor solubilidad a los polisacáridos con
DP promedio entre 22 y 24, además estos últimos forman microcristales en
agua o leche (Villegas, Costell. 2007).
11
Tabla 2.1 Propiedades de la Inulina (López-Molina et al. (2005))
Inulina de Achicoria
Estándar
Inulina de Achicoria HP
DP promedio 12 25
Materia Seca (%) 95 95
Contenido de
Inulina/oligofructosa
(% en m.s.)
92 99.5
pH (10%, w/v) 5-7 5-7
Ceniza Sulfatada (% en
m.s.)
<0.2 <0.2
Apariencia Polvo Blanco Polvo Blanco
Sabor Neutral Neutral
Dulzor (sacarosa =
100%)
10 % 0
Solubilidad en agua a 25
ºC (g/L)
120 25
m.s. : materia seca.
La inulina estándar de achicoria es el extracto seco de achicoria sin realizar un
paso de purificación adicional. Como se muestra en la tabla 2.1, la inulina
estándar tiene grado de polimerización promedio es de 12 unidades, y una
solubilidad de 120g/L a 25ºC. La inulina de alto grado de polimerización o
inulina HP, se produce utilizando un paso de purificación adicional y tiene una
solubilidad significativamente inferior (López-Molina et al. (2005)).
En términos generales la inulina de cadena larga es poco soluble en agua a 25
ºC. Kim Faqih y Wang en el 2001 realizaron pruebas de solubilidad utilizando
Raftiline® HP (también conocida como Beneo HP) un producto de la compañía
12
Orafti con sede en Bélgica que contiene inulina de achicoria con grados de
polimerización superiores a 23 (Ramchandran, Shah. 2010).
Figura 2.2.. Solubilidad de Raftiline HP( inulina de achicoria con DP mayor a 23). (Kim et al.
2001).
La estructura cristalina es ortorrómbica, dependiendo del nivel de hidratación
se pueden encontrar en estado hemi-hidratado y mono-hidratado . La forma de
estos dos estados es muy similar, la diferencia yace en el número de moléculas
de agua adjuntas al cristal (Ronkart et al. 2010). Durante el proceso de
extracción de inulina, el paso final comprende una etapa de secado con aire, si
el aire alcanza temperaturas cercanas a los 230ºC la inulina obtenida será
completamente amorfa (Glibowski et al. 2011). El almacenaje de inulina amorfa
con un porcentaje de humedad relativa del 75 % provoca la formación de
cristales. La adición acelerada de inulina amorfa en agua causa la formación de
cúmulos que son difíciles de disolver o dispersar (Glibowski et al. 2011).
Temperatura [ºC]
Solubilidad
en Agua [%
peso/volumen
]
13
Figura 2.3. Micrografías de inulina durante los primeros segundos que hace contacto con agua.
Las imágenes de la fila superior fueron obtenidas a 1, 2 y 10 segundos después de hacer
contacto con el agua mientras que las imágenes de la fila inferior fueron tomadas a 18, 30 y 43
segundos. El ancho de la imagen es de 50 µm. (Glibowski et al. 2010)
En la figura 2.3 se observa el cambio que sufre la estructura de la inulina
durante al entrar en contacto con agua. Pasa de tener una estructura
ortorrómbica a ser totalmente amorfa y disolverse en el medio.
La inulina tiene la capacidad de formar microcristales que interactúan entre sí,
formando pequeños agregados que contienen una gran cantidad de agua, por
lo que se pueden formar geles que son utilizados para sustituir grasas o para
texturizar (Tárrega et al. 2011). El grado de cristalización, el tamaño del cristal y
la firmeza del gel dependen del grado de polimerización, la agitación y el
tratamiento térmico previamente realizado a la suspensión (Tárrega et al.
2011).
El análisis calorimétrico diferencial de barrido (DSC) y termogravimetría (TG)
mostraron que la inulina comienza a degradarse a temperaturas entre 50 y
150 ºC perdiendo 9 % de la masa original. Sin embargo se cree que este
proceso puede estar relacionado con el desprendimiento de agua absorbida. El
punto de fusión ocurre a temperaturas cercanas a los 180 ºC (inulina de
achicoria 173 ºC, inulina de pataca 175 ºC, inulina de dahlia 180 ºC; inulina
sintetizada in vitro 183 ºC). La entalpía de fusión para todas las anteriores es
de 8.2 (90.4) Joules/gramo. Este proceso está relacionado con un cambio de
14
color, sin embargo no presenta variación de masa. A temperaturas entre 220 y
350ºC la degradación conlleva a la pérdida de masa del 40 % (Heyer et al.
1999).
2.1.2 Biosíntesis de Inulina
La inulina está presente en más de 30,000 productos vegetales típicamente de
la familia Asteraceae y Graminae (Figueira et al. 2004) cumpliendo la función
de un carbohidrato de reserva. Los fructanos son la segunda forma más común
para almacenar energía (siendo superado exclusivamente por el almidón)
(Muñoz-Gutiérrez, Rodríguez-Alegría, López Munguía. 2001). La achicoria
(Cichorium intybus) y la pataca (Helianthus tuberosus) son las fuentes más
utilizadas.
De acuerdo al modelo propuesto por Edelman y Jefford en 1968 (Heyer et. al,
1999) la biosíntesis de inulina comienza a partir de dos moléculas de sacarosa.
Durante la primer etapa del mecanismo una de las moléculas de sacarosa
funciona como aceptor fructosil que es transferido por la enzima
sacarosa:sacarosa fructosiltransferasa (1 SST), formando así una molécula de
1-kestosa (GF2). Este trisacárido funciona como aceptor de residuos fructosil
mientras la enzima fructano:fructano fructosil transferasa (1 FFT) alarga la
cadena utilizando más moléculas de sacarosa. Dicha enzima puede utilizar,
además de kestosa, fructanos de cadena más larga como sustrato.
Por otro lado, se conocen fructanos con estructuras distintas que tienen
funciones y propiedades similares a aquellas de la inulina. La levana (Figura
2.4) es con seguridad el segundo grupo más importante de estos. Presenta
enlaces β-2-6 y una unidad de glucosa terminal en la cadena. El primer paso en
la producción de levana es prácticamente idéntico a la etapa inicial de la
biosíntesis de inulina formando 6-kestosa a partir de dos moléculas de
sacarosa, se ha postulado la existencia de una enzima sacarosa:sacarosa-6-
fructosiltransferasa (6 SST) en algunas especies como Poa ampla , mientras
que otras especias utilizan la enzima sacarosa:fructano-6fructosiltransferasa (6
SFT) para transferir un residuo de fructosa desde la sacarosa a la posición F-
15
6 de la 1-kestosa. En la segunda etapa, la elongación de la cadena, se propuso
nuevamente la enzima sacarosa:fructano-6fructosiltransferasa como
precursora de la reacción, aunque algunos han sugerido la existencia de una
enzima fructano:fructano-6fructosiltransferasa (6 FFT) (Heyer et. al, 1999).
Figura 2.4 Estructura de la Levana. (Muñoz-Gutiérrez, Rodríguez-Alegría, López Munguía.
2009).
Además de la levana y la inulina existen otros fructanos que presentan
ramificaciones con mayor frecuencia. La gramanina (figura 2.5) presenta
enlaces β-2,-6 y β-2,-1 y se forma utilizando la enzima sacarosa:sacarosa-
1fructosiltransferasa para formar 1-kestosa y posteriormente sacarosa:fructano-
6fructosiltransferasa. Las neo-series por otro lado son otro ejemplo de
fructanos ramificados que se producen a partir de 1-kestosa con una síntesis
de tres pasos; utilizando la fructano:fructano-6glucosa-fructosiltransferasa
como segundo paso catalizando la formación de neo-kestosa y finalmente
utilizando la enzima fructano:fructano-1fructosiltransferasa o la
fructano:fructano-6fructosiltransferasa para alargar la cadena y forma neo-
series de inulina, como la agavina (figura 2.6), o levana respectivamente (Heyer
et. al, 1999).
16
Figura 2.5. Estructura de la Gramanina. (Muñoz-Gutiérrez, Rodríguez-Alegría, López Munguía.
2009).
Figura 2.6. Estructura de la Agavina, puede ser considerado como un ejemplo de neo-serie de
inulina.
Existen también microorganismos que son capaces de sintetizar fructanos.
Distintas bacterias como Streptococcus, Leuconostoc Lactobacillys y Weisella
y otras especies como Zymomonas mobilis, Gluconacetobacter diazotrophicus,
Bacillus subtilis y Bacillys polymyxa comparten esta capacidad (Muñoz-
Gutiérrez, Rodríguez-Alegría, López Munguía. 2009). Los fructanos producidos
por microorganismos son en general de cadena más larga que los fructanos
vegetales; la inulina sintetizada por bacterias puede alcanzar un peso
molecular del orden de 106 g/mol (Hicke et al. 1999) .
17
Figura 2.7. Estructura de la Levana producida por B. Subtilis. (Muñoz-Gutiérrez, Rodríguez-
Alegría, López Munguía. 2009).
Sin embargo a diferencia de la síntesis vegetal, la biosíntesis de inulina en
microorganismos se lleva a cabo en un solo paso utilizando una sola enzima; la
fructosiltransferasa (FTF). La reacción catalizada por la FTF involucra la
ruptura de la sacarosa en glucosa y fructosa y posteriormente la adición de la
fructosa via enlace β-2,-1 para producir inulina o vía enlace β-2,-6 para producir
levana.
Las fructosiltransferasas pertenecen al grupo de las glicosil hidrolasas (grupo
32 de la clasificación Henrissat y Davies (Ávila-Fernández et a. 2007)) junto
con las invertasas, inulinasas y levanasas. Las enzimas de este grupo poseen
dos dominios y un sitio activo constituido por los residuos de dos ácidos
aspárticos y uno glutámico. Esta conformación se repite a lo largo del grupo 32
(Ávila-Fernández et al. 2007).
18
Figura 2.8. Estructura cristalina de la Fructosiltransferasa (FTF) de Aspergillus japonicus con
1-Kestosa en el sitio activo. (PDB 3LDK) (Chuankhayan et al. 20120).
Figura 2.9. Sitio Activo de la Fructosiltransferasa (FTF) de Aspergillus japonicus con 1-
Kestosa. (PDB 3LDR) (Chuankhayan et al. 2010)
La figura 2.8 y 2.9 muestran la fructosiltransferasa de Aspergillus japonicus,
dicha enzima está formada por 653 aminoácidos, en su sitio activo se pueden
observar los residuos de glutámico 292, glutámico 316, aspártico 60, tirosina
404, aspártico 119, arginina 190 y leucina 143. Todos los anteriores presentan
interacciones de puentes de hidrógeno con el sustrato contribuyendo así a la
agregación de fructosa y a la ruptura de la sacarosa.
19
Figura 2.10. Sitio activo de invertasa de Schwanniomyces Occidentalis con fructosa en el sitio
activo. (PDB 3KF3) (Álvaro-Benito et al. 20120).
Comparando el sitio activo de la invertasa y de la FTF (Figuras 2.10 y 2.9) se
aprecian ciertas similitudes; la presencia de ácido aspártico 50 de ácido
aspártico 179 y de ácido glutámico 230 corresponde con el grupo 32 y es
similar a la conformación de la fructosiltransferasa de aspergillus japonicus.
Dichas similitudes han sido utilizadas para estimar la estructura de algunas
enzimas. Ávila et. al en 2007 utilizaron la estructura de la 1-exoinulinasa II de
achicoria para modelar la estructura de la sacarosa:sacarosa 1
fructosiltransferasa de agave . La estructura obtenida compartía la misma
arquitectura que la 1-exohidrolasa II de achicoria, formando una propela con
láminas beta en la región del nitrógeno terminal y un sandwich beta formado
por dos láminas beta antiparalelas en la región del carbono terminal (Ávila et al.
2007). El modelo fue comparado con invertasa de Thermotoga (PDB 1 UYP),
una exoinulinasa de Aspergillus awamori (PDB 1y4w) y la exoinulinasa II de
achicoria, todas ellas comparten la misma estructura tridimensional. El sitio
activo en estas enzimas se encuentra en la región del nitrógeno terminal y
contienen ácido aspártico y glutámico (Ávila et al. 2007).
20
2.1.3 Síntesis in vitro de Inulina.
Existe un interés creciente en la síntesis enzimática de inulina utilizando
sacarosa como materia prima en un proceso a régimen permanente (Hicke et
al- 1999).
Heyer y su equipo en 1999 utilizaron la fructosiltransferasa de Streptococcus
mutans GS-5 clonándola en un sepa de Escherichia coli deficiente en el
metabolismo de fructosa. El gen se utilizó junto con la región de codificación
del péptido maduro fusionándolo con el gen de una proteína MBP (Maltose
Binding Protein) para expresar una proteína en E. coli fácil de purificar. Una
vez purificada la enzima MBP-FTF los autores realizaron distintas reacciones y
consiguieron determinar las condiciones óptimas de operación. El pH óptimo
para tiempos de incubación menores a 20 minutos fue de 5.4, mientras que a
tiempos mayores el pH de 7.2 dio mejores resultados a temperatura ambiente.
Utilizando una concentración inicial de 600 mM de sacarosa se observó la
aparición de inulina después de 4 minutos de incubación, posteriormente se
observó un crecimiento continuo. Durante los primeros 20 minutos de
incubación la concentración de inulina fue demasiado pequeña como para
poder determinar su DP (grado de polimerización). En la figura 2.11 se observa
que los cambios más importantes en el peso molecular de la inulina sintetizada
ocurriendo después de las 6 horas y a partir de las 24 a las 48 horas el DP
permaneció constante pero la concentración de inulina fue en aumento (Heyer
et al. 1999).
21
Figura 2.11. Producción in vitro de Inulina. Peso molecular, Concentración, y Polidispersidad
en Función del Tiempo de Reacción (Heyer et. al 1999).
Sin embargo, es importante recalcar que el proceso anterior no es un proceso
continuo sino por lotes, debido a que no es posible separar la enzima del medio
de reacción.
Hans-Gerog Hicke y su equipo en el mismo año inmovilizando la enzima MBP-
FTF sobre tres membranas de PET con distintos tamaños de poro con el fin de
obtener un régimen permanente.
En primer lugar, los soportes de PET pasaron por un proceso de
copolimerización con AEMA(2-aminoethylmetacrylatehidrochloride).
Posteriormente se funcionalizaron los grupos amino del soporte PAEMA (PET y
AEMA) con glutaraldehído. Finalmente se inmovilizó la enzima mediante
enlaces covalentes con los grupos amino en un proceso de 20 horas de
duración. Se realizaron reacciones en las condiciones óptimas encontradas por
Heyer para esta enzima (pH 7.2 y temperatura 28 ºC) utilizando sacarosa como
reactivo en una concentración de 200 g/L (Hicke et al. 1999).
Se observó una reducción en la actividad catalítica, así como en la
permeabilidad de las membranas a medida que ocurría la reacción. La
disminución de la actividad y la permeabilidad fue más dramática en la
membrana de tamaño de poro menor.
Concen
tración [g/L]
MW/Mh
Peso molecular
Concentración
Tiempo de Reacción [h]
22
Los investigadores concluyeron que el motivo era el bloqueo de los poros por la
producción de inulina de alto peso molecular.
Para medir la concentración de inulina los investigadores midieron el
incremento en concentración de glucosa debido a la hidrólisis de sacarosa.
Comparando la actividad de la enzima libre y la enzima inmovilizada se puede
observar en la gráfica anterior mayor actividad inicial para la membrana con
poro de 0.4 μm. Sin embargo es importante resaltar que esta forma de trabajo
resulta poco práctica puesto que existe una disminución considerable de la
actividad debido a la acumulación de inulina en el poro, haciendo imposible
escalar este método a un proceso de producción industrial de inulina.
Figura 2.12. Comparación de la relación inulina/glucosa después de 2 horas de reacción (pH
7.2, Temperatura 28 ºC, concentración inicial de sacarosa 200 g/L). (Hicke et al. 1999).
2.1.4 Producción y Extracción de Inulina.
La achicoria (Cichorium intybus) y la pataca (Helianthus tuberosus L.)
almacenan inulina en sus raíces alcanzando hasta un 75 % de la materia seca
(Meijer, Mathijssen. 1993). La achicoria es sin lugar a duda la mayor fuente de
inulina a nivel industrial (Lingyun et al. 2007). Experimentos recientes
comprobaron que ambas especies producen una cantidad similar de materia
seca, sin embargo solo el 50 o 25 % proviene del tubérculo de la pataca
Relacióninulina/glucosa
Concentración de FTF
Relación Inulina/glucosa
Diámetro de poro de la membrana [ μm]
23
mientras que para la achicoria el valor alcanza el 85 %. Estas diferencias son
causadas por las fases de crecimiento que experimenta la pataca; en la
primera etapa almacena inulina en el tallo y el crecimiento del tubérculo es
lento, mientras que en la etapa reproductiva el crecimiento del tubérculo es
acelerado y se almacena inulina en el tubérculo (Meijer, Mathijssen. 1993).
Existen varios métodos para extraer inulina de los tubérculos. El primer paso
del proceso convencional involucra extracción con agua hirviendo por 10 o 15
minutos. La siguiente etapa consiste en la precipitación de la inulina extraída, la
precipitación con alcohol es ampliamente utilizada en el laboratorio sin
embargo a escala industrial es poco rentable. Una herramienta excelente para
la extracción a partir de varios tejidos vegetales es la extracción por
ultrasonido. La extracción por ultrasonido consiste en aplicar ondas de sonido
de alta intensidad y alta frecuencia en una mezcla que contiene un producto
deseado. En el caso de los tejidos vegetales la aplicación de ultrasonido
provoca la ruptura de las paredes de las células facilitando la liberación de
compuestos extraíbles (Lingyun et al. 2007).
Utilizando el método RSM (Response Surface Methodology) se buscaron las
condiciones óptimas para la extracción de inulina de pataca por el proceso
convencional realizando experimentos que mostraran el efecto independiente
de cada una de las variables (temperatura, pH del medio de extracción, tiempo
de extracción y la relación solvente:sólido). El experimento demostró que el pH
no es una variable importante, siempre y cuando se mantenga dentro de los
límites donde no se degrada la inulina; es decir valores superiores a 4 (Courtin
et al. 2009). La investigación se enfocó en encontrar la relación solvente:sólido
óptima y la temperatura de operación adecuada, fijando el tiempo de extracción
en 20 minutos, por haber sido el tiempo óptimo encontrado en reportes
anteriores. (Lingyun et al. 2007).
Las condiciones óptimas de extracción con agua fueron de 76.6ºC de
temperatura y 10.6 de relación solvente:sólido; alcanzando una producción del
83.6 % de inulina.
A pesar de las ventajas de la técnica de la sonicación directa se observó una
disminución en la cantidad de inulina de cadena larga, debido a que el
24
ultrasonido aplicado de esta manera puede romper algunos de los enlaces de
la inulina (Lingyun et al. 2007).
2.2 Hidrólisis Ácida de Inulina.
La inulina puede ser susceptible al pH. En condiciones ácidas la ruptura de los
enlaces puede llevar a la hidrólisis total de inulina en glucosa y fructosa, y si las
condiciones no son controladas el proceso puede continuar hasta la
deshidratación de la fructosa, el cambio de color y la aparición de
subproductos.
Los enlaces que unen a los fructanos (así como a otros polisacáridos) son
sensibles al pH. Después de una hora de reacción a 100ºC a pH de 2.0 y 3.0
(figura 2.12) se pierden la mayor parte de enlaces glicosídicos en
fructooligosacáridos (Courtin et al. 2009). El nivel observado de monosacáridos
libres es mayor a estas condiciones lo que comprueba que incluso a un pH de
2.0 se puede controlar la deshidratación de la fructosa y la glucosa (Courtin et
al. 2009).
Figura 2.13. Hidrólisis Ácida de Fructanos. Enlaces glicosídicos perdidos [%] vs. Tiempo
[minutos] (Courtin et al. 2009).
Enlaces glicosídicos perdidos por hidrólisis [%]
Tiempo [minutos]
25
2.3 Hidrólisis Enzimática de Inulina.
Existen distintas enzimas, microbiales y vegetales, capaces de hidrolizar a la
inulina. Estas enzimas pertenecen al grupo 32 de la glicosil hidrolasas de la
clasificación de Henrissat y Davies (Ávila et al. 2007), anteriormente
mencionado, junto con las invertasas y las fructosiltransferasas.
Las fructosidasas se pueden dividir de acuerdo a la siguiente clasificación
(López-Munguía et al. 2005):
A) β-fructofuranosidasas no específicas. Además de la sacarosa, estas
enzimas son capaces de hidrolizar fructósidos desde el final no reductor
de la cadena, tenga enlaces β-2,-1 o β-2,-6. Los ejemplos incluyen
exoinulinasas y exolevanasas (EC 3.2.1.80) y 2,6-β fructano-
6levanobiohidrolasa (EC 3.2.1.64).
B) Endoinulinasas (EC 3.2.1.7) enzimas específicas hacia los enlaces β-2,-
1 internos de la cadena de inulina.
C) Endolevanasas (EC3.2.1.65) enzimas específicas hacia los enlaces β-2,-
6 internos de la cadena de levana.
Las exoinulinasas son capaces de remover el extremo no reductor de la
cadena del fructano. Además de ser producidas por microorganismos las
exoinulinasas son producidas por plantas que almacenan fructanos como la
achicoria, especie que produce dos tipos de exoinulinasas pero ninguna
endoinulinasa.
2.3.1 Estructura de las Inulinasas.
En términos generales todos los miembros del grupo 32 comparten la misma
arquitectura, una propela β cerca del N-terminal y un sándwich β del lado
opuesto. Se ha encontrado que todas estas enzimas poseen el sitio activo en
la propela β (Ávila-Fernández. 2007). Se ha reportado que el dominio del N-
terminal es indispensable para la dimerización y la catálisis (Kyoung-Yun Kim et
al. 2008).
26
A lo largo de este grupo se repiten tres patrones que son comúnmente
conocidos como regiones conservadas (CR por sus siglas en inglés) (CRI; 319-
WMNDEPNGL-327), CRII (459-RDF-461) y CRIII (519-ECMP-522) (Kyoung-
Yun Kim et al. 2008).
* Residuos con actividad catalítica, Letras en negro motivo RDP involucrado en el
reconocimiento del sustrato.
Figura 2.14. Secuencia de Aminoácidos de Exo y Endoinulinasa. (Torabizadeh et al. 2010)
27
*Azul (+1 V o superior) hasta rojo (-1 V o inferior)
Figura 2.15. Potenciales Eléctricos de C) exoinulinasa de C. Intybus (PDB 1ST8) y de la
invertasa (PDB 1UYP). (Ávila-Fernández 2005)
En la exoinulinasa de C. intybus el sitio activo está constituido por Asp 22 y
Glu 201 (Ávila-Fernández), los cuales son responsables de actuar como
nucleófilo y catalizador ácido/base respectivamente al igual que en otros
homólogos como la endoinulinasa de Arthrobacter sp. 37 o la invertasa de
levadura (Kyuong-Yun Kim et al. 2008). En el caso de la exoinulinasa de
Aspergillus Awamori una cristalografía con fructosa como complejo reveló que
el Asp 41 y Glu 241 funcionan igual que en otras enzimas similares, la distancia
entre estos residuos es congruente con un mecanismo de reacción de doble
desplazamiento y el Asp 189 que forma parte de un motivo Arg-Asp-Pro le
provee de interacción de puente de hidrógeno importantes para el
reconocimiento del sustrato (Nagem et al. 2004).
B)
A)
28
Figura 2.16. Sitio Activo de Exoinulinasa de Asp. Awamori. (PDB 1Y9M) (Nagem et al. 2004).
La estructura de una endoinulinasa aún no ha sido reportada, por ello Kyoung-
Yum Kim et al. realizaron un modelo basado en la estructura de la
exoinulinasa de Aspergillus Awamori por homología para la interpretación de
los resultados de algunos estudios bioquímicos, como mutaciones sitio dirigidas
para modificar tres residuos de aminoácidos (Glu 323, Asp 460 y Glu 519)
involucrados en la catálisis y la determinación de los parámetros cinéticos.
Los estudios comprobaron que el residuo de Asp 460 cumple un papel
escencial para la actividad de la endoinulinasa. Los tres residuos ácidos Glu
323, Asp 460 y Glu 519 en la endoinulinasa están localizados en la misma
posición en los tres patrones repetidos y se conservan en otros miembros de la
familia de las glicosil hidrolasas. Glu 323 se conserva únicamente en la
secuencia CRI (región conservada uno) en las endoinulinasas y es sustituido
por Asp en las exoinulinasas. Además se comprobó que estos residuos tienen
funciones catalíticas pero son incapaces de reconocer y fijar el sustrato, ya que
enzimas producidas por mutagénesis dirigida que tenían diferencias en estos
residuos mostraron prácticamente la misma afinidad por el sustrato que la
enzima original. Estos resultados sostuvieron la conclusión de que Glu 323 y
Glu 519 tienen funciones como nucleófilo y catalizador ácido/básico
29
respectivamente. La sustitución del Asp 460 en el motivo RDF (CRII) por
alanina trajo consigo la pérdida absoluta de actividad catalítica (Kyoung Yum-
Kim et al. 2008).
A pesar de las similitudes estructurales entre la endoinulinasa y la exoinulinasa
existen varias diferencias importantes dentro del sitio activo. Algunos residuos
polares se conservan en ambas enzimas. Arg 188, Asp 189, Asn 40 y Gln 57
en exoinulinasa son sustituidos por Arg 459, Asp 460, Asn322 y Gln339
respectivamente. Dos residuos de triptófano que participan por medio de sus
grupos amino (Trp65 y Trp 335) son reemplazados por lisina (Lys 347) y
arginina (Arg606). Ser 103 es reemplazada por Ala 385 la cual parece no
afectar en el reconocimiento de sustrato. La sustitución más significativa es
Asp41 en CRI (exoinulinasa) por Glu232 en la CRI de endoinulinasa. Mediante
simulaciones de dinámica molecular se ha revelado que en la ausencia de
sustrato en el sitio de unión algunos residuos se reacomodan para interactuar
con sus vecinos, minimizando la energía del sistema. Las interacciones entre
algunos residuos como Arg 606 y Glu 519, Arg 459 y Asp 460, Arg 459 y Asp
479, Arg 459 y Glu 519, Arg 459 y Glu 519 son importantes para conservar la
actividad catalítica y el ancho del sitio catalítico (Kyoung-Yum Kim et al. 2008).
30
Figura 2.17. Estructura de la Endoinulinasa de Aspergillus niger con fructosa en el sitio activo.
(Kyoung-Yum Kim et al. 2008).
Figura 2.18. Sitio Activo de la Endoinulinasa de A. niger sobrepuesto en el sitio activo de la
Exoinulinasa de A. awamori (gris claro). (Kyoung-Yum Kim et al. 2008).
2.2.2 Cinética y Especificidad de las Inulinasas.
Podemos dividir a las inulinasas en exoinulinasas y endoinulinasas a pesar de
las similitudes existentes entre ellas. Por un lado las exoinulinasas producen
31
fructosa extrayendo un extremo de la cadena de inulina, mientras que las
endoinulinasas rompen la cadena de inulina de forma azarosa produciendo
fructooligosacáridos.
La exoinulinasa actúa reconociendo el extremo no reductor de la cadena de
algún fructano, ya sea que rompa un enlace β2-1, β2-6 (Muñoz-Gutiérrez et al.
2008).
Ecuación 6. La reacción general para la hidrólisis de inulina catalizada por
exoinulinasa. (E. Ricca et al. 2009).
Muñoz-Gutiérrez et al. estudiaron la hidrólisis de inulina utilizando una mezcla
de enzimas comercial conocida como Fructozyme L y la inulinasa Bfra. Por una
parte Fructozym L contiene endoinulinasa, exoinulinasa e invertasa de A. niger
y reportó actividad utilizando sacarosa como sustrato, E. Ricca et al atribuyeron
esta actividad a la presencia de invertasa, sin embargo las pruebas de
especificidad utilizando la inulinasa Bfra de T. maritima demostró poder
hidrolizar la sacarosa (Muñoz-Gutiérrez et al. 2008) demostrando así que las
inulinasas son capaces de hidrolizar también el enlace que une a la glucosa y
fructosa en la sacarosa.
Ambas investigaciones demostraron que las inulinasas presentan una cinética
de reacción que sigue el modelo de Michaelis-Menten. En este modelo se
asume que la reacción sigue dos pasos, un proceso reversible en el que se
forma el complejo enzima-sustrato (ES) y una segunda etapa en la que el
sustrato reacciona y el producto (P) se libera del sitio activo, como lo
ejemplifica la ecuación 7:
32
……………………………………1
De acuerdo con este modelo si la concentración de sustrato (S) ocupa todos
los sitios activos disponibles de la enzima (E), la formación de producto será
insensible al aumento en la concentración de sustrato (S), por lo tanto la
segunda etapa de la reacción se convierte en la etapa limitante, ya que controla
la velocidad de formación de producto. Por lo que la cinética de la reacción
global queda en términos de la ecuación 2:
………………………………………………………………………...2
Medir la concentración del complejo enzima-sustrato resulta prácticamente
imposible por lo que es necesario transformar la ecuación en términos que
involucren variables medibles. La ecuación 3 muestra la cinética de formación
del complejo enzima-sustrato y a partir de ella se puede transformar la
ecuación 2 en términos medibles.
……………………………………………………..3
Sabiendo que la segunda etapa es la etapa más lenta, se puede asumir que la
primera etapa llega al equilibrio:
………………………………………………………………………………...4
Además de despejar la concentración del complejo enzima-sustrato es
necesario transformar toda la ecuación en término de concentración de enzima
total, es decir la suma de la enzima acomplejada con el sustrato y la enzima
libre.
……………………………………………………………………….5
33
Finalmente se sustituye la ecuación 3 y 5, utilizando la suposición del estado
estacionario (Ec. 4) se obtiene la ecuación 6:
…………………………………………………6
Después de reordenar la ecuación 6 obtenemos la ecuación 7:
……………………………………....................7
Posteriormente se despeja la concentración del complejo enzima-sustrato y se
obtiene la ecuación 8:
……………………………………………………………………………8
Dónde:
…………………………………………………………………………….9
La Km mide la afinidad de la enzima por el sustrato, es una constante muy útil
al momento de comparar distintas enzimas con actividades similares.
Finalmente obtenemos la ecuación de cinética de Michaelis-Menten la cual
describe el comportamiento de la mayoría de las enzimas.
……………………………………………………..10
Es importante resaltar que cuando la concentración del sustrato es
significativamente mayor a la Km, la velocidad de reacción se vuelve de orden
cero con respecto al sustrato y queda en términos de la concentración de
enzima y k2, también conocida como kcat. Es por ello que a ese término se le
conoce como velocidad máxima.
34
Por otro lado es importante mencionar que si bien Km es una constante de
velocidad, tiene unidades de concentración y es equivalente a la concentración
donde se obtiene la mitad de la velocidad máxima.
Además cuando la concentración del sustrato es significativamente menor al
Km, el comportamiento de la cinética es de primer orden con respecto al
sustrato.
.
Figura 2.19. Cinética Michaelis-Menten. Velocidad Inicial vs. Concentración de Sustrato
(Lehninger).
Orden Cero Vo=Vmax
Primer Orden Vo=k''[E][S]=k' [S]
35
Para obtener los parámetros de la ecuación de Michaelis-Menten se utiliza por
lo general la recta Lineweaver-Burk . Donde se compara el inverso de la
velocidad contra el inverso de la concentración de sustrato utilizando la
siguiente ecuación:
Como se puede observar este reacomodo a la ecuación original convierte a la
ecuación de rapidez en una recta.
La investigación de Gutiérrez-Muñoz comprobó que la mezcla comercial
Fructozyme L y la inulinasa bfra se comportan de esta forma. Las velocidades
iniciales de la inulina de achicoria, la sacarosa y la agavina son similares, sin
embargo la Km es distinta para cada uno de ellos y muestra que existe mayor
afinidad por la inulina de achicoria que por la agavina debido probablemente a
la estructura ramificada de la agavina.
Figura 2.20. Cinética de Reacción de la mezcla comercial Fructozyme L (Novo) con diferentes
Sustratos. Velocidad de Reacción [μl/minmL] vs. Concentración de Sustrato [mg/mL]. (Muñoz-
Gutiérrez et al. 2007).
Muñoz-Gutiérrez y su equipo cuantificaron la hidrólisis de inulina en términos
de fructosa liberada:
Velocidad
[μl/minmL]
Concentración de Sustrato [mg/mL]
Sacarosa
Inulina de Achicoria
Agavina de A. Tequilana
36
Definiendo la concentración del polímero en términos de fructosa, donde Fo’ es
la cantidad inicial de fructosa, 180 es la masa molecular de la fructosa y r es un
factor de corrección para tomar en cuenta las moléculas de agua que se
adhieren durante la reacción.
Tabla 2.2. Parámetros Cinéticos de Fructozyme L y Exoinulinasa BfrA. (Muñóz-Gutiérrez et al.
2009)
Sustrato Vmax [U/mL] Km [mM]
FructozymeL
Sacarosa 29 900 60
Inulina de Achicoria 34 100 7,2
Agavina (A.T. Weber) 32 100 27
BfrA
Sacarosa 213 48
Inulina de Achicoria 96 26
* Los valores de la Km fueron calculados a partir de pesos moleculares promedio de la inulina
de achicoria y la agavina. Es apreciable que ambas enzimas tienen la capacidad de hidrolizar a
la sacarosa (Muñóz-Gutiérrez et al. 2009) .
En el caso de la levana de B. subtilis el comportamiento corresponde a una
cinética de primer orden debido a que la solubilidad de un fructano disminuye a
medida que aumenta su grado polimerización, por lo tanto la levana
microbiana no alcanza a saturar los sitios activos disponibles de la enzima
(Muñoz-Gutiérrez et al. 2009). Por otro lado Muñoz-Gutiérrez et al. mencionan
que los pesos moleculares de la enzima y de la levana microbiana son bastante
cercanos por lo que alcanzar el punto de saturación resulta un tanto
improbable.
37
Tabla 2.3.Comportamiento Cinético de Fructozyme L y Exoinulinasa BfrA sobre varios
sustratos.(Muñoz-Gutiérrez et al. 2007).
Fructano Masa
Molecular
[KDa]
Comportamiento
Cinético
[E] (U/mL) K’*1000
[min-1]
K’/k’’
(inulina)
[%]
Porcentaje
de
Hidrólisis
[%]
Fructozyme L
Inulina de
Achicoria
8.3 Michaelis-Menten 6.3 25.6 100 100+-1.1
Agavina de
Tequilana
Weber var. Azul
6.2 Michaelis Menten 6.3 9.01 35 81+-0.9
Inulina de
L.c.W28
3000 Primer Orden 6.3 1.68 6.5 78+-1
Levana de B.s. 8.3,3500* Primer Orden 126.6 2.64 0.5 53+-3.6
Levana de L.m.
ATCC 8293
54+-0.1
Levana de L.m.
NRRL B-512F
44+-1.8
BfrA
Inulina de
Achicoria
8.3 Michaelis-Menten 8.3 3.65 100 68+-4.4
InulinaL.c.CW28 3000 Primer Orden 16.5 0.73 9.2 46+-0.8
Levana de L.m.
NRRL B-512
2200 Primer Orden 16.5 0.35 4.5 41+-0.9
*La levana de Bacillus subtilis está dispersa en dos grupos de peso molecular distinto.
Ricca et al. obtuvieron la energía de activación aparente para la hidrólisis
llevada a cabo por la mezcla comercial Fructozyme L midiendo la velocidad de
reacción a tres temperaturas distintas y utilizando la ecuación de Arrhenius.
Los parámetros cinéticos que encontraron son cercanos a aquellos descritos
por Muñoz-Gutiérrez y su equipo.
38
Tabla 2.4. Parámetros cinéticos de Fructozyme L con inulina de achicoria a distintas
temperaturas. (Ricca et al. 2008).
T [ºC] 1/Vmax
[Lmin/g]
Error Km/Vmáx Error Km [g/L] k2 [g/Umin]
40 9,24 1,92 224 12,0 24,2 1,96x10-4
50 5,80 0,385 198 6,59 6,59 3,13x10-3
60 1,50 0,422 158 7,07 105 1,21x10-3
La energía de activación para la Km y la Kcat encontrados son los siguientes:
Donde la Km está en g/L y la temperatura está en grados Kelvin.
Las energías de activación aparentes fueron comparadas contra los datos
cinéticos obtenidos experimentalmente y el modelo probó poder predecir con
precisión el comportamiento de la reacción (Ricca et al. 2008).
*Los puntos representan los datos medidos experimentalmente mientras la línea continua muestra las velocidades
predichas por el modelo.
Figura 2.21. Validación del Modelo Cinético (Ricca et al. 2008)
39
Sin embargo la validez de este modelo es debatible ya que no se trata de una
enzima pura o de una sola reacción, se trata de tres enzimas y dos reacciones
distintas.
Existe un creciente interés en las endoinulinasas ya que producen cadenas
más cortas de inulina las cuales son más solubles, dulces y además tienen
mayor actividad prebiótica (Pompei et al. 2008).
La proporción de fructooligosacáridos en los productos de la hidrólisis por
endoinulinasas varía según la fuente de la enzima. La endoinulinasa de
Pseudomonas sp. Producen fructooligosacáridos con un DP de 2 y 3
principalmente mientras que la endoinulinasa de Xanthomonas produce
fructooligosacáridos con grados de polimerización mayores a 5 (Cho et al.
2001).
La endoinulinasa de Xanthomonas oryzae No. 5 tiene el mismo
comportamiento cinético que otras endoinulinasas microbianas (Cho, Yun.
2002) .
Los parámetros cinéticos para la ecuación Michaelis-Menten que describe la
hidrólisis de inulina por endoinulinasa de Xanthomonas fueron 16.7g/Lh como
velocidad máxima y 12.1 g/L como Km (Cho, Yun 2002).
La endoinulinasa de Aspergillus niger 12 es una de las más estudiadas. A
diferencia de la exoinulinasa, la endoinulinasa carece de actividad invertasa y
es incapaz de hidrolizar oligómeros con menos de 4 unidades de fructosa
sugiriendo que se necesita un grado de polimerización superior a 4 para
interactuar de forma apropiada con los residuos de aminoácidos que conforman
el sitio activo (Nakamura et al. 1994) [26]. Este comportamiento se repite en la
endoinulinasa de C. pannorum la cual es capaz de hidrolizar 1-
fructofuranosilnistosa (GF4), pero tiene poca actividad con kestosa (GF2) y
nistosa (GF3) (Xiao et al. 1989).
40
Tabla 2.5. Comportamiento de endoinulinasas de distintas fuentes microbianas (Nakamura et al.
1997).
Microorganismo Actividad
Específica
sobre
Inulina
[U/mg]
Actividad
Específica
sobre
Sacarosa
[U/mg]
Peso
Molecular
[kDa]
Km [mM] Hidrólisis
de Inulina
[%]
Productos
de la
Hidrólisis
A niger 12 101 0.00 66 1.25 45 F3,F4,F5
C. pannorum 106 0.00 58 No
Disponible
No
Disponible
F3,F4,F5
P. purporogenum 82.8 0.02 54 0.21 32 F3,F4,F5
Penicillium sp.
TN-88
105 0.00 68 0.20 70 F3
La inhibición por producto ha sido reportada en inulinasas. La presencia de
fructosa al inicio de la reacción provoca un descenso en la velocidad y por lo
tanto una reducción en la conversión de la inulina (figura 2.15) (E.G. Díaz et al.
2006). Se ha sugerido que la causa de este fenómeno es la competencia entre
ambos sustratos.
*□ sin fructosa, ∆concentración inicial de fructosa 50 g/L, * concentración inicial de fructosa
100g/L.
Figura 2.22. Inhibición de Fructozyme L por Fructosa (E.G. Díaz et al. 2006).
Fructosa Producida [g/L]
Tiempo [h]
41
2.3.3 Producción de Inulinasas.
Existen distintas plantas y microorganismos capaces de producir inulinasas, sin
embargo la extracción de enzimas vegetales suele ser poco práctica y
excesivamente costosa cuando se requiere a escala industrial, por lo cual las
enzimas comerciales son exclusivamente de origen microbiano.
Se han extraído inulinasas de T. maritima, K. marxianus, Xanthomonas,
Pseudomonas, Aspergillus Japonicus, Aspergillus niger y Aspergillus ficuum
entre otros. En la mayoría de los casos la presencia de inulina en el medio de
cultivo es necesaria para estimular la producción de inulinasa, sin embargo A.
niger tiene la ventaja de poder producir exoinulinasa y endoinulinasa
extracelularmente sin importar la fuente de carbono (Akimoto et al. 1999).
A. niger es de hecho el microogranismo utilizado por la empresa danesa
Novozyme para producir Novo 960 y Fructozyme L, mezclas comerciales de
exoinulinasa, endoinulinasa e invertasa.
La producción comercial se lleva a cabo por fermentación sumergida (batch,
alimentación-batch o régimen continuo) y por fermentación en estado sólido
(solid-state fermentation ;SSF) (Skowronek, Fiedurek 2006).
Skowronek y Fiedurek en el 2006 utilizaron esporas de A. niger inmovilizadas
utilizando inulina y sacarosa como la fuente de carbón. En términos generales
se encontró que si la sepa muestra actividad de inulinasa, la inulina es el
sustrato adecuado, y si por otro lado la sepa tiene actividad de invertasa la
sacarosa es el mejor sustrato. La sacarosa es una fuente de carbono atractiva
ya que tiene alta solubilidad y bajo costo.
Se probaron dos métodos de inmovilización, la adsorción física sobre piedra
pómez y sobre esponjas de poliuretano, además se compararon los
rendimientos de estos métodos con respecto la productividad del micelio en
forma libre. La actividad de inulinasa más alta se produjo por micelios
inmovilizados en 2.0 gramos del soporte al momento en que la cantidad más
grande de biomasa se acumulaba. Una cantidad más grande de soporte resultó
42
en una pérdida de actividad, probablemente a causa de una disminución en la
tasa de difusión y el abastecimiento de oxígeno. Para incrementar el tiempo de
acumulación de biomasa se utilizaron 0.5 gramos de piedra pómez, la máxima
actividad enzimática se produjo en el segundo lote utilizando 50mL del medio
basal. La temperatura óptima fue de 30ºC para todos los casos. La actividad
como inulinasa comenzó a decaer durante al final del experimento (Skowronek,
Fiedurek 2006).
Para extraer las inulinasas se sigue el mismo método que para cualquier
enzima extracelular de origen microbiano. En primer lugar se separan las
células del medio de reacción, una vez realizada esta operación se precipitan
las proteínas utilizando generalmente sulfato de amonio. Posteriormente se
separan las proteínas de la enzima que se intenta purificar a partir de una
cualidad particular que la distinga del resto, el punto isoeléctrico o el tamaño.
Para lo cual se utilizan geles o resina que tengan distintos tamaños de poros o
grupos cargados que puedan fijar cationes o aniones (Lehninger).
2.4 Aplicaciones de la Hidrólisis Enzimática de Inulina
2.4.1 Producción de Fructooligosacáridos.
La producción de fructooligosacáridos a partir de inulina se lleva a cabo por
hidrólisis parcial utilizando endoinulinasas o mezclas comerciales. La compañía
belga Beneo-Orafti utiliza este método para incrementar la producción de
fructooligosacáridos a partir de inulina extraída de achicoria (Beneo-Orafti).
43
Figura 2.23. Método de Producción de Fructooligosacáridos de la Empresa belga Beneo-Orafti.
(Beneo-Orafti)
La inulina y los fructooligosacáridos no son digeribles, por lo que pasan a
través del estómago y el intestino delgado prácticamente inalterados. Debido a
que no pueden ser absorbidos o degradados llegan al colón donde son
fermentados por la microbiota intestinal (Pompei et al. 2008).
El consumo in vivo en humanos han demostrado que la adición de inulina o
fructooligosacáridos provoca un aumento significativo de las bifidobacterias
(Pompei et al. 2008).
El aumento en la población de bifidobacterias suprime el metabolismo
proteolítico, estimula a absorción de calcio, modula el metabolismo de lípidos y
previene el cáncer (Pompei et al. 2008).
Se han hecho estudios para comparar la actividad prebiótica de los
fructooligosacáridos y la inulina y se observaron efectos similares en el modelo
fecal in vitro. A pesar de las similitudes estructurales entre ambos existen
diferencias en la cinétia de crecimiento de la población microbiana y el
metabolismo (niveles de amonio, producción de ácido láctico, etc.). El
incremento en la concentración de lactobacilos y bifidobacterias ocurrió antes
utilizando fructooligosacáridos, comprobando que los fructanos de cadena corta
son metabolizados con mayor facilidad que las cadenas más largas de inulina
(Pompei et al. 2008).
44
Los oligosacáridos son utilizados como sustitutos naturales de la sacarosa ya
que tienen un dulzor cercano al 30 % del potencial de dulzor de la sacarosa
(Beneo-Orafti). Su alta solubilidad, su dulzor y su actividad prebiótica le hacen
un ingrediente atractivo para la industria alimenticia.
2.4.2 Producción de Fructosa
La fructosa puede ser producida a partir de almidón de maíz utilizando α-
amilasas, amiloglucosidasas y glucosa isomerasas (Chi et al. 2011). Sin
embargo la máxima producción de fructosa puede llevar hasta el 50% debido a
que la constante de equilibrio de la isomerización de glucosa es de 1 (Borges
da Silva et al. 2006). Para tener una producción global de fructosa superior al
50% se necesitan métodos de separación rigurosos y costosos (Chi et al.
2011).
La fructosa puede ser obtenida a partir de inulina por dos métodos; la hidrólisis
enzimática y la hidrólisis ácida (Muñoz-Gutiérrez et al. 2009).Durante la
hidrólisis ácida, la fructosa puede ser deshidratada en presencia de ácidos,
provocando la formación de subproductos indeseables (Chi et al. 2011), por
otro lado la hidrólisis enzimática por acción de exo-inulinasas o por mezclas de
endo y exo-inulinasas son métodos de alta especificidad en el que se pueden
evitar estos problemas (Ricca et al. 2008).
Los jarabes de alta fructosa son endulzantes sustitutos de la sacarosa. Son
ampliamente utilizados en postres, mermeladas, lácteos y bebidas (Borges da
Silva et al. 2006).
El departamento de agricultura de Estados Unidos ha reportado un incremento
en el uso de jarabes de alta fructosa como edulcorantes superando incluso a la
sacarosa.
45
3. Objetivo General
Caracterización y obtención de los parámetros cinéticos de una preparación
comercial de endo y exoinulinasas de Aspergillus niger (Novo 960) a partir de la
hidrólisis enzimática de inulina de achicoria
3.1. Objetivos Particulares
Medir el grado de polimerización promedio de la inulina de achicoria
utilizada.
Determinar las condiciones óptimas de operación de la mezcla comercial
N 960.
Obtener un modelo que describa el comportamiento cinético de la
hidrólisis de inulina por acción de la mezcla comercial N 960.
Observar cuales son los productos de la reacción de hidrólisis.
Comparar los datos experimentales con los datos predichos por el
modelo cinético.
Observar cómo cambia la concentración de los productos de la hidrólisis
a través del tiempo.
46
4. Materiales y Método
4.1 Enzima
Mezcla comercial de endo y exoinulinasas (Novo 960) producida a partir de
aspergillus niger por la empresa danesa Novozyme.
4.2 Inulina y Fructooligosacáridos
Inulina de achicoria amablemente donada por la empresa danesa Beneo-Orafti.
Los fructooligosacáridos de origen microbiano se obtuvieron de Actilight.
Mientras que los estándares de nistosa, kestosa, y fructofuranosilnistosa se
adquirieron de Wako Pure Chemical Ltd. Japón.
4.3 Pruebas de Concentración de Proteína en Novo 960.
Para medir la concentración de proteína en la mezcla comercial Novo 960 se
siguió el método de Bradford. En el que se utiliza un colorante Azul Coomasie
No. 250 que es capaz de fijarse a algunos residuos de la cadena de
aminoácidos, comparando la absorbancia a 595 nm de una muestra de
proteína con concentración desconocida contra una curva patrón. La curva
patrón se realizó a partir de albúmina de suero bovino con concentración
conocida.
4.4 Electroforesis SDS-PAGE
Se siguió el método descrito por Laemmli en 1970. Se preparó una solución
monomérica con 58.4 gramos de Acrilamida, 1.6 gramos de bis-acrilamida y
200mL. Posteriormente, se prepararon; un buffer de resolución Tris-HCl 1.5 M,
con pH de 8.8, una solución de SDS al 10 %, y una solución de persulfato de
amonio al 10%. A continuación con 2.5 mL del buffer de resolución, 4 mL de la
solución de SDS, 2 mL de glicerol, 1 mL de beta-mercaptoetanol y una pizca de
azul de bromofenol se realizó un buffer de carga. Finalmente el buffer de
corrida se hizo mezclando 3 g del buffer de resolución, 14.4 g de glicina y 10
mL de la solución de SDS. La solución de tinción se preparó con 0.250 g de
azul Coomassie R-250, 100 mL de metanol y 20 mL de ácido acético al 10 %.
El gel de separación se realizó con 3.33 mL de la solución monomérica, 2.50
mL de buffer de resolución, 0.10 mL de la solución de SDS, 4 mL de agua,
47
100μL de la solución de persulfato de amonio y 13 μL de TEMED. La muestra
de proteína se trató con el buffer de carga y se calentó a ebullición por cinco
minutos. Posteriormente se cargó el gel de resolución con una banda de
marcador de peso molecular en el equipo de electroforesis. Se le hizo pasar
una carga eléctrica, hasta que las marcas de color azul llegaron a la parte
inferior de la placa. Se trató la placa de gel con solución de tinción. Finalmente,
se le agregó una solución de ácido acético, metanol y agua para desteñir la
placa y dejar marcadas exclusivamente las franjas de la enzima.
4.5 Determinación del Grado de Polimerización por Hidrólisis Ácida
Se utilizó una solución de ácido cítrico con pH de 2.6 para disolver inulina de
achicoria. Posteriormente se calentó la solución hasta llegar a 100 ºC y se dejó
hervir por 15 minutos. Finalmente se analizó una alícuota para determinar la
proporción de fructosa en glucosa, después de la hidrólisis completa de inulina.
4.6 Determinación de pH Óptimo
Se disolvieron 2 gramos de inulina en 20 mililitros de 4 soluciones con pH
diferente,(2.6-8.0). Se llevaron las soluciones a 60 ºC en un baño de
temperatura y agitaciòn constante, posteriormente se agregaron 0.5 mililitros de
la mezcla comercial Novo 960 con una concentración de proteína de 0.38g/L
para tener velocidades de reacción moderadas. Después de una hora de
reacción se tomaron alícuotas y se calentaron hasta los 100ºC durante 10
minutos para desactivar a todas las enzimas involucradas.
4.7 Determinación de la Temperatura Óptima
Utilizando la misma concentración de inulina y enzima que en el procedimiento
anterior, se realizaron cinco reacciones utilizando distintas temperaturas; 30,
40, 50, 60 y 75 ºC. Después un tiempo de residencia de una hora se tomaron
alícuotas que fueron calentadas a 100 ºC durante 10 minutos.
4.8 Determinación de la Velocidad de Reacción
Se disolvió inulina en 20 mililitros solución al pH y temperatura óptimos, con
agitación constante. Posteriormente se adicionaron 50 μL de la mezcla
comercial Novo 960 con concentración de 0.38g/L de proteìna. Se tomaron
48
alícuotas cada minuto durante diez minutos. Cada alícuota fue desactivada
calentándola a 100ºC. Se repitió este procedimiento cambiando la
concentración inicial de 5 g/l a 100 g/L. Para muestras con concentraciones
iniciales entre 5 y 50 se midieron los azúcares reductores, la velocidad de
reacción es la pendiente de la gráfica de la concentración de azúcares
reductores contra el tiempo. Por otro lado, las muestras con concentración
inicial mayores fueron analizadas por HPLC, debido a que a concentraciones
tan altas era necesario hacer demasiadas diluciones para tener datos de
absorbancia dentro del intervalo. La velocidad de reacción para estas últimas
muestras se midió como la pendiente de la concentración de inulina contra el
tiempo.
4.9 Medición de Azúcares Reductores
Los azúcares reductores fueron medidos utilizando el reactivo DNS con la
siguiente composición:
Tabla 4.1. Composición del Reactivo DNS.
Agua Destilada Desionazada 1416 mL
Ácido dinitrosalicílico 10.6 g
Hidróxido de sodio 19.8 g
Sales de Rochelle (Tartarato Na-K) 306 g
Fenol 7.6 mL
Metabisulfito de sodio 8.3 g
En tubos de ensayo se agregaron 100 μL de muestra, 200 μL de buffer citrato-
fosfato y 600 μL de reactivo DNS. Se calentaron en agua hirviendo por 5
minutos y se enfriaron con hielo. Finalmente, se agregaron 4 mL de agua y se
midió su absorbancia a 540 nm. Antes de cada prueba se realizó una curva
patrón con glucosa.
49
4.10 Identificación de Productos y Determinación de la Concentración por
HPLC
Se utilizó una columna aminada Phemonomenex con un efluente de 1mL/min y
un gradiente de agua/acetonitrilo durante 35 minutos. Se inyectó a cada corrida
10 μL de la muestra correspondiente. Todas las corridas se analizaron
utilizando un detector por dispersión de luz. Las señales obtenidas fueron
comparadas con estándares de fructosa, nistosa, kestosa,
fructofuranosilnistosa e inulina.
50
5. Resultados y Discusión
5.1 Determinación del Grado de Polimerización
Sabiendo que cada molécula de inulina contiene una unidad de glucosa
terminal, se determinó el grado de polimerización a partir de la razón
fructosa/glucosa después de la hidrólisis total de inulina.
Donde DP corresponde a grado de polimerización por sus siglas en inglés
(Degree of Polimerization), [Fructosa] y [Glucosa] son las concentraciones en
g/L de fructosa y glucosa respectivamente y PMFructosa y PMGlucosa son los pesos
moleculares de ambos, los cuales se eliminan de la ecuación por que la
glucosa y la fructosa son isómeros, se suma uno para considerar a la glucosa
en el extremo reductor de la cadena.
Los tiempos de retención de la fructosa y la glucosa son muy cercanos y
alcanzan a traslaparse. Sin embargo se alcanza a observar al final de pico de
fructosa una pequeña cumbre que corresponde al tiempo de retención de la
glucosa.
Tabla 5.1. Cálculo del Grado de Polimerización
Fructosa
Área Concentración [g/L]
2091089 23,58974099
Glucosa
Área Concentración [g/L]
109283 1,459207926
DP 18
La hidrólisis ácida fue realizada a 100 ºC para acelerar la reacción lo más
posible en un pH de 2.6 para evitar la deshidratación de la fructosa.
51
El grado de polimerización calculado fue de 18 (tabla 6.1) y es congruente con
el grado de polimerización promedio medido para achicoria estándar de otro
proveedor (tabla 2.1) (López-Molina et al. 2005).
5.2 Determinación de la Concentración de Proteína en la Mezcla Comercial
Novo 960.
Se realizó la curva patrón utilizando albúmina de suero bovina (BSA) con
concentración conocida.
Se hizo posteriormente una regresión lineal utilizando estos datos para poder
calcular la concentración de proteína a partir de una medición de absorbancia.
.
Gráfica 5.1.Curva Patrón de Concentración de Proteína
Posteriormente se diluyó la mezcla comercial Novo 960 veinte veces para tener
valores de absorbancia dentro del intervalo y se utilizaron distintos volúmenes
para tener un valor promedio.
52
Tabla 5.2. Medición de la Concentración de Proteína con el Método de Bradford para N 960.
Enzima X
20 [μL]
Abs
595 nm
Proteína
[mg]
[Proteína]
[mg/mL] X20
Promedio
[mg/mL]X 20
[Proteína ]
[mg/mL]
10 0,1332 2,332453826 0,233245383 0,190144019 3,802880387
20 0,2058 4,248021108 0,212401055
30 0,2258 4,775725594 0,159190853
40 0,2809 6,229551451 0,155738786
La concentración de proteína en Novo 960 es de 3.8 mg/mL estabilizada en
una solución 20% sorbitol y 20% manitol de acuerdo a la información del
proveedor.
5.3 Electroforesis
Los resultados de la electroforesis muestran una variedad de enzimas además
de la endoinulinasa con un peso molecular de 68.1 KDa (tercer banda en la
electroforesis), las otras dos barras anchas podrían corresponder a
exoinulinasa e invertasa, enzimas extracelulares que suelen acompañar a la
endoinulinasa en A. niger (E. Ricca et al. 2008).
Figura 5.1. Electroforesis de N 960.
N 960
Marcado
60 KDa Endoinulinasa
53
La banda más oscura es la de la endoinulinasa lo cual podría indicar que esta
se encuentra en mayor proporción con respecto al resto de enzimas. La banda
inmediatamente superior a la de la endoinulinasa corresponde a la de la
exoinulinasa con un peso molecular de 78 KDa (Megazyme) y la banda que se
encuentra hasta arriba podría ser la de invertasa con un peso molecular entre
225 y 250 KDa (Boddy et al. 1993).
5.4 Determinación de las Condiciones Óptimas de Reacción.
5.4.1 Determinación de la Temperatura Óptima de Reacción
Para determinar la temperatura óptima de hidrólisis se llevó a cabo la reacción
dentro de un intervalo de 30ºC a 75ºC, los productos se identificaron por HPLC
(figuras 6.2-6.7) se puede apreciar una tendencia similar al de otras mezclas de
inulinasas (Ricca et al. 2008, Muñoz-Gutiérrez et al. 2009) donde las
temperaturas óptimas de operación se encuentran entre los 55ºC y los 60ºC. El
pH utilizado para todas las reacciones fue 6, debido a que las investigaciones
previas en inulinasas reportaron un pH óptimo entre 5.5 y 6 (Ricca et al. 2008,
Muñoz-Gutiérrez et al. 2009).
min5 10 15 20 25 30 35
mAu
10000
15000
20000
25000
30000
35000
ADC1 B, ADC1 CHANNEL B (GUSTAVO\11031130.D)
37
98
1
Figura 5.2 Cromatograma de la Reacción a 30ºC
Inulina
54
min5 10 15 20 25 30 35
mAu
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
ADC1 B, ADC1 CHANNEL B (GUSTAVO\11031131.D)
37
92
63
79
77
Figura 5.3. Cromatograma de la Reacción a 40ºC
min5 10 15 20 25 30 35
mAu
7500
8000
8500
9000
9500
ADC1 B, ADC1 CHANNEL B (GUSTAVO\11031132.D)
37
.64
6 3
7.7
71
37
.82
43
79
56
Figura 5.4. Cromatograma de la Reacción a 50ºC
El pico 1 es fructosa, 2 glucosa, 3 sacarosa, 4 kestosa e inulotriosa, 5 nistosa e
inulotetraosa, 6 inulopentosa y fructofuranosilnistosa, 6 inulohexosa, 8 inulina y
el 9 es un pico causado por el aumento de acetonitrilo en la fase móvil y está
presente en todos los cromatogramas. De esta forma podemos identificar los
picos de todos los cromatogramas presentados en este trabajo.
Figura 5.5. Cromatograma de la Reacción a 60 ºC
Inulina
9
8
7654
3
1
2
55
min5 10 15 20 25 30 35
mAu
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
22000
ADC1 B, ADC1 CHANNEL B (GUSTAVO\11031133.D)
37
99
1
Figura 5.6. Cromatograma de la Reacción a 75ºC
Gráfica 5.2. Hidrólisis de inulina a distintas temperaturas.
En la gráfica 5.2 se puede observar que a 60ºC se obtiene la mayor
conversión. Por encima de 60ºC la energía de desactivación es demasiado alta
y la cantidad de enzima activa disminuye demasiado a pesar del aumento en
las constantes cinéticas.
5.4.2 Determinación del pH Óptimo de Reacción
Todas las pruebas fueron realizadas conservando la temperatura óptima de
reacción para la N 960 (60ºC). Los cromatogramas (figuras 5.7-5.9) mostraron
que entre el pH 4.6 y 6.0 la N 960 es activa. La hidrólisis obtenida a pH 2.6
(figura 5.9) podría ser hidrólisis ácida producida durante el la etapa de
56
calentamiento a 100ºC, la conversión a ese pH fue baja por lo que podemos
considerar que la enzima se encontraba inactiva a esas condiciones.
Figura 5.7 Cromatograma de la Reacción a pH 6.
min5 10 15 20 25 30 35
mAu
7500
8000
8500
9000
9500
ADC1 B, ADC1 CHANNEL B (GUSTAVO\11031127.D)
0.0
74
Figura 5.8 Cromatograma de la Reacción a pH 4.7
min5 10 15 20 25 30 35
mAu
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000
14000
ADC1 B, ADC1 CHANNEL B (GUSTAVO\11031126.D)
0.2
04 0
.337
Figura 5.9 Cromatograma de la Reacción a pH 2.6
57
min5 10 15 20 25 30 35
mAu
10000
15000
20000
25000
30000
35000
ADC1 B, ADC1 CHANNEL B (GUSTAVO\11031129.D)
0.1
03
Figura 5.10. Cromatograma de Reacción a pH 8
Gráfica 5.3. Determinación del pH Óptimo.
En la gráfica 5.3 se observa que el pH óptimo de operación para la N 960 es
6.0, cercano al pH óptimo de operación para la Fructozyme L, 5.5 (Ricca et al.
2008, Muñoz-Gutiérrez et al. 2009)
5.4 Productos de la Hidrólisis
Tomando en cuenta las enzimas disponibles, se tienen teóricamente las
siguientes reacciones donde: Inulina [I], Fructosa [F], Glucosa [G] y Sacarosa
[S].
58
Exoinulinasa
Endoinulinasa
Invertasa
5.4.1 Balance de Materia
Es necesario tomar en cuenta el aporte del agua a la masa final de los
productos. Ya que aunque este sea mínimo los productos de la hidrólisis son
más pesados que la inulina debido al agua que se agrega en el enlace que se
rompe.
Producción de Kestosa e Inulotriosa
Considerando que el grado de polimerización promedio de la inulina empleada
en este estudio es de 17 monómeros de fructosa por unidad de glucosa:
59
Seis moles de fructooligosacárido con DP de 3 equivalen por lo tanto a un mol
de inulina:
Producción de Nistosa e Inulotetraosa
De acuerdo al procedimiento anterior, el balance de materia para nistosa e
inulotetraosa es el siguiente:
Considerando que el método no nos permite diferenciar entre la inulotetraosa y
la nistosa, podemos simplificar la reacción considerando solo los grados de
polimerización, y tendríamos que se producen 4 moles de FOS DP 4 por uno
de tres.
Producción de Fructofuranosilnistosa e Inulopentosa
Producción de Inulohexosa
Producción de Sacarosa e Inulobiosa
Producción de Fructosa
Producción de Glucosa
60
Balance Total de Materia
Eliminando la aportación de la exoinulinasa y la producción de inulobiosa y
sacarosa se obtiene:
De esta forma se obtiene una correspondencia entre la masa de los productos
y los equivalentes de inulina.
5.4.2 Combinaciones de Productos a partir de la Hidrólisis completa de
Inulina por la Acción de la Endoinulinasa
A partir de una sola molécula de inulina se puede crear varias combinaciones
de fructooligosacáridos. Considerando el grado de polimerización promedio de
la inulina con que se trabajó se construyeron todas las combinaciones posibles.
Los cromatogramas mostraron concentraciones de sacarosa e inulobiosa muy
bajas por lo que las combinaciones en las que se formaran fructooligosacáridos
con DP de 2, se excluyeron. Por otro lado se consideró como inulina cualquier
fructano con grado de polimerización superior a 6. Durante la primera hora
parece que la inulohexosa es relativamente estable y su hidrólsis está
desfavorecida.
61
Tabla 5.3 Combinaciones de Reacciones de Hidrólisis por Acción de la Endoinulinasa
La hidrólisis completa de inulina para producir fructooligosacáridos con grado
de polimerización entre 3 y 6, produce 132 combinaciones distintas. Existen
algunas combinaciones que parecen repetirse, sin embargo el lugar donde se
hace el corte es importante tomando en cuenta a la unidad de glucosa terminal.
Por ejemplo, en la reacción que produce I6 e I5 a partir de I11, se puede obtener
GF4 o GF5, por lo que es necesario escribir ambas opciones.
Estas combinaciones producen 196 moles de inulotriosa, 172 moles de
inulotetraosa, 124 moles de inulopentosa y 80 moles de inulohexosa a partir de
132 moles de inulina. De los cuales el 19.90% tiene un extremo reductor con
glucosa para la inulotriosa, 23.84% para la inulotetraosa, 24.19% para la
inulopentosa y 27.50% para la inulohexosa. Pasando de moles a masa la
proporción obtenida se expresa en la tabla siguiente:
62
Componente Fracción Peso F. Experimental Error
I3 25,00% 27,33% 2,34%
I4 28,99% 35,17% 6,19%
I5 25,98% 19,92% 6,06%
I6 20,04% 17,58% 2,46%
Tabla 5.4 Fracción Peso de los Productos de la Hidrólisis
Comparando las fracciones peso teoricas con las fracciones peso medidas de
forma experimental, las fracciones peso de cada componente se acerca con un
error promedio del 4%. Por lo que, la probabilidad de obtener cada
fructooligosacárido estrechamente relacionado con la proporción en la que se
producen.
5.5 Estudio Cinético
Para obtener los parámetros de la ecuación de Michaelis-Menten se midió el
aumento en azúcares reductores a distintas concentraciones asumiendo que
los azúcares reductores serían los extremos reductores de algunos
oligosacáridos (GFny Fn), disacáridos (F2 y GF)y monosacáridos (fructosa y
glucosa), y que podrían ser equivalentes a moléculas de inulina hidrolizadas
por acción enzimática.
En un primer intento por medir la velocidad de reacción se tomaron alícuotas
hasta una hora veinte minutos después de haber iniciado la reacción. Se
puede observar que al llegar a los 10 minutos el comportamiento deja de ser
lineal.
63
Gráfica 5.4 Medición de Azúcares Reductores durante la Hidrólisis enzimática de Inulina
Para poder observar el incremento en la concentración de azúcares reductores
se resta la concentración inicial de azúcares reductores a la concentración final
observada. Como se puede observar en la gráfica, en la primera etapa existe
un comportamiento lineal, la velocidad inicial, en la que la concentración de
sustrato es similar a la concentración inicial y a partir de la cual se realizan la
mediciones cinéticas para obtener los parámetros de la ecuación que describe
la velocidad de reacción.
Es evidente que para medir la velocidad inicial se deben utilizar tiempos
inferiores a 10 minutos donde el comportamiento es lineal y al concentración
del sustrato es prácticamente igual a la inicial conocida.
La velocidad de reacción inicial se determinó como el aumento de azúcares
reductores descontando la cantidad de masa aportada por el segundo reactivo,
el agua, en los primeros diez minutos:
Existen varias consideraciones importantes sobre este método, la variedad de
productos puede dificultar la correspondencia entre el aumento en azúcares
reductores y la pérdida de inulina. El aporte de cada fructooligosacárido y la
proporción del mismo en los productos es imposible de calcular.
64
Para medir la velocidad de la hidrólisis enzimática de inulina en función de la
concentración de inulina se realizaron varios experimentos a temperatura y pH
fijos, midiendo el aumento en azúcares reductores en los primeros 5 o 10
minutos de reacción a diferentes concentraciones.
Se decidió utilizar 2, 4, 5, 40, 50 y 100 g/L para tener mediciones que
describieran el comportamiento cinético de la reacción desde concentraciones
diluidas hasta puntos cercanos a la solubilidad máxima a 60 ºC (gráfica 5.5).
.
Gráfica 5.5 Velocidades Iniciales vs. Concentraciones Inicales
Los estudios cinéticos previos en inulinasas de Muñoz-Gutiérrez et al., Ricca et
al. y Cho y Yun muestran una cinética de tipo Michaelis-Menten con inulina
vegetal. Sin embargo, la relación podría ser de una cinética de primer orden,
obtenida donde la concentración del sustrato es inferior a la Km y la constante
de primer orden es equivalente a la división de la velocidad máxima sobre la
Km. Por otro lado, se alcanza a observar una ligera curva.
65
Realizando el método Lineweaver-Burk se obtiene una Km de 143,88 g/L y una
velocidad máxima de 3,97 g/L:
Las velocidades predichas con esta ecuación se acercan más a las
experimentales (tabla 5.5), que las velocidades predichas considerando una
cinética de pseudo-primer orden (tabla 5.6).
[I] [g/L] Vo Calc [g/Lmin] Vo Exp [g/Lmin] Error
5 0,13 0,14 6,68%
4 0,11 0,068 37,15%
2 0,05 0,054 0,39%
40 0,86 0,82 5,23%
50 1,03 1,04 1,31%
108 1,70 1,80 5,28%
Error Promedio 9,34%
Tabla 5.5. Cinética de tipo Michaelis Menten comparada con los Datos experimentales
[I] [g/L] Vo P.O. [g/Lmin] Vo Exp [g/Lmin] Error
5 0,09 0,14 38,16%
4 0,07 0,07 4,73%
2 0,04 0,05 34,81%
40 0,71 0,82 13,87%
50 0,89 1,04 14,82%
108 1,91 1,80 6,20%
Error Promedio 18,76%
Tabla 5.6. Cinética de Pseudo-Primer Orden comparada con los Datos experimentales.
66
Gráfica 5.5 Modelo Michaelis Menten y Modelo Pseudo-Primer Orden comparados con los
Datos Experimentales
La Km obtenida es similar a la medida por Ricca et al. en el 2008 para la
Fructozyme L de 102 g/L. La actividad de la mezcla comercial N 960 fue
calculada en 18200 U/mL. Con esta actividad específica la kcat calculada es de
0.87 g/Umin.
5.5.1 Validación del Modelo Cinético
Para probar el modelo cinético, se compararon las conversiones obtenidas a
una y veinticuatro horas de reacción con aquellas predichas por la integración
del modelo cinético:
67
Para 1 hora de reacción con 10 g/L iniciales de inulina a 60ºC y pH de 6 se
obtuvo una concentraciòn final 2.98 g/L de inulina, con una desviación estándar
de +- 1.
Compuesto Área Fracción Peso Concentración [g/L]
F 1896,33 0,01 0,67
I2 6895,33 0,03 0,86
I3 44371,9 0,21 1,02
I4 57098,8 0,27 2,32
I5 32334 0,15 1,80
I6 28541,2 0,13 1,68
I 41411 0,19 2.98
Tabla 5.7. Concentración después de una hora de Reacción a 60ºC y pH de 6.
Resolviendo la ecuación integrada se obtiene 2,01 g/L. Es decir entra en el
margen de error.
Utilizando la cinética de pseudo-primer orden se obtienen en cambio 3,4 g/L. La
cual se acerca ligeramente mejor al dato experimental.
Sin embargo, después de 24 horas de reacción (tabla 5.8) no se alcanza una
conversión parecida a ninguno de los modelos, de 1E-8 en ambos casos, de
1.51 g/L. Por otro lado la proporción de los productos cambia radicalmente
(figura 5.11). La fructosa pasa de estar en un 4 % (fracción peso) a 21%,
mientras que la sacarosa e inulobiosa aumenta de ser prácticamente
inapreciable al 19%. Los fructoligosacáridos de mayor peso molecular
disminuyen a su vez y la inulohexosa prácticamente desaparece de la mezcla
de reacción.
68
Figura 5.11. Acercamiento a los Cromatogramas de 1 y 24 Horas de Reacción
.
Componete F. Peso Concentración [g/L]
Fructosa 0,21 2,19
Glucosa 0,16 1,71
I2 0,19 2,04
I3 0,09 0,65
I4 0,10 1,21
I5 0,10 1,21
I 0,14 1,51
Tabla 5.8. Composición después de 24 horas de Reacción
Como se puede ver el incremento en fructosa no corresponde a la disminución
en equivalentes de inulina, tomando en cuenta la concentración observada
después de una hora de reacción. Por lo tanto, la fructosa proviene de la
hidrólisis enzimática de fructooligosacáridos. La formación de la inulobiosa
puede provenir de la hidrólisis enzimática por acción de la endoinulinasa en los
fructooligosacáridos con DP entre 5 y 6 y por la acción de la invertasa en la
inulotriosa. Además, puede haber ocurrido que después de estar 24 horas a 60
ºC la endoinulinasa se desactivara, quizá esta enzima sea más sensible a la
exposición térmica que la exoinulinasa.
1 hora
24 horas
69
5.6 Reacción en Presencia de Fructooligosacáridos
Utilizando una mezcla comercial de fructooligosacáridos de bajo peso
molecular, Actilight, producidos por microorganismos, se puede observar el
efecto en la hidrólisis de inulina.
La mezcla Actilight contiene kestosa, nistosa y fructofuranosilnistosa. Según
datos publicados en la página web del fabricante, la proporción es la siguiente:
Kestosa 37%
Nistosa 53%
Fructofuranosilnistosa 10%
Tabla 5.9 Composición de la Mezcla Comercial de Fructooligosacáridos Actilight.
Sin embargo en la cromatografía se observó una proporción ligeramente
distinta; 36.5 % de kestosa, 51,14 % de nistosa y 12.36% de
fructofuranosilnistosa.
La conversión de inulina después de una hora fue muchas veces menor a la
esperada, la fracción peso resultante fue de 0.35, es decir una conversión del
35 %. Bastante más baja que la obtenida integrando la ecuación de Michaelis
Menten
La inulotetraosa sigue siendo el producto más favorecido, ocupando más del 50
% del peso de los productos después de una hora (gráfica 5.8). La fructosa y la
glucosa aumentan considerablemente durante la reacción. La inulobiosa por
otro lado aumenta y disminuye drásticamente. Puede que haya sido consumida
por la acción de la exoinulinasa y la invertasa. Es un sistema complejo, la
fructosilfuranonistosa (GF4) es sustrato para la endoinulinasa, su producción
tendría entonces que competir con tres formas de hidrólisis, la endo, la exo y la
acción de la invertasa retirando el extremo reductor. Finalmente es necesario
reconocer que la cormatografía no es lo suficientemente fina como para
70
separar fructanos como mismo peso molecular y estructura ligeramente
distinta, como por ejemplo sacarosa (GF) de inulobiosa (F-F) o kestosa (GF2)
de inulotriosa (F-F-F). Sabemos que los fructooligosacáridos al inicio de la
reacción tienen una unidad de glucosa terminal, sin embargo es muy difícil
saber en qué proporción se producen fructooligosacáridos que solo contengan
unidades de fructosa y mucho menos cuáles de ellos se producen o consumen
durante la reacción.
Gráfica 5.8 Composición de Fructooligosacáridos, Glucosa y Fructosa a través del Tiempo.
La concentración de inulina durante el experimento se mantuvo casi constante.
Se puede decir que la presencia de fructooligosacáridos retrasa la reacción,
probablemente actuando como un inhibidor competitivo reduciendo la cantidad
de sitios activos disponibles para la inulina.
71
6. Conclusiones
La mezcla comercial N 960 mostró un comportamiento mesófilo, lo cual a sido
reportado para otras inulinasas (Muñoz-Gutiérrez et al. 2007), (Ricca et al.
2008), (Cho et al. 2001). La temperatura y pH óptimos de operación fueron de
60 ºC, y pH 6 bajo las condiciones de trabajo. Cuando la temperatura alcanzó
los 75 ºC la N 960 perdió actividad por completo.
Al igual que otras inulinasas (Muñoz-Gutiérrez et al. 2007), (Ricca et al. 2008),
(Cho et al. 2001), la mezcla comercial N 960 mostró un comportamiento
cinético de tipo Michaelis-Menten. La concentración necesaria para alcanzar un
medio de la velocidad máxima, es decir, el valor equivalente a la Km, está más
allá de la solubilidad de la inulina a esa temperatura, motivo por el cual, el
comportamiento se asemeja al de una cinética de primer orden. La
comparación entre los datos predichos por ambos modelos cinéticos
(Micahelis-Menten y pseudo-primer orden) y los datos experimentales
demostraron que ambos modelos representan con fidelidad el comportamiento
real de la hidrólisis de inulina de achicoria por acción de la N 960.
A tiempos superiores a una hora, la actividad endo de la N 960 disminuyó
drásticamente lo cual provocó un cambio en el comportamiento de la reacción,
en este caso, ninguno de los modelos cinéticos reprodujo con precisión los
datos.
Un desglose de las combinaciones posibles en las que se puede romper una
cadena de inulina de achicoria con un grado de polimerización de 18 para
formar oligosacáridos de entre 2 y 6 unidades explica la proporción en la que
se produce cada oligosacárido. La inulotetraosa (nistosa o un fructano con
cuatro unidades) fue el producto mayoritario en masa de la hidrólisis para
tiempos de reacción inferiores a una hora, mientras que el producto mayoritario
en fracción mol es la inulotriosa (kestosa o un fructano con tres unidades). A
tiempos mayores a una hora, la proporción de los productos cambió y el
producto mayoritario fue la fructosa.
72
La presencia de fructoologosacáridos al inicio de la reacción afectó el
comportamiento de las enzimas presentes en la N 960, disminuyendo la
cantidad de inulina hidrolizada. Un comportamiento similar fue reportado para
la mezcla comercial Fructozyme L, que contiene las mismas enzimas que la N
960 pero a diferencia de esta última, produce únicamente fructosa, en este
caso la presencia de fructosa al inicio de la reacción resultaba en una
disminución en la conversión de la reacción de hidrólisis (Díaz et al. 2006).
6.1 Perspectivas
Para tener un modelo cinético más exacto se debe explorar la posibilidad de
que los fructooligosacáridos actúen como inhibidores de la endo y exoinulinasa.
Dicho estudio facilitaría el diseño de un sistema de control para un reactor a
escala industrial.
La proporción de oligosacáridos con glucosa terminal y aquellos constituídos
exclusivamente por fructosa se puede estimar por medio de un balance de
materia, sin embargo, para conocer la proporción exacta deberían de separarse
por medio de una cromatografía.
Por otro lado, la inmovilización de la N 960 puede abaratar el proceso
significativamente, ya que de esta forma las enzimas se pueden reutilizar varias
veces. Además, podría empacarse en una columna o en un reactor de
Calvary y acoplarse a una recirculación con un filtro capaz de separar la inulina
de los fructooligosacáridos; este proceso podría aumentar la conversión de la
reacción. Para explorar esta posibilidad, deberán estudiarse distintos métodos
de inmovilización, la difusividad de la inulina, los fructooligosacáridos y la
fructosa a través del poro del soporte y el tiempo de vida de la enzima a estas
condiciones.
73
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