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UNIVERSIDAD DE OVIEDO
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA FUNCIONAL
(Área de Microbiología)
Lactococina 972: caracterización genética, modo de
acción y optimización de la producción en biorreactores.
Memoria presentada por Alma Hernández de Rojas para optar al
grado de Doctor
Este trabajo ha sido realizado en el Instituto de
Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC) y en
el Área de Microbiología (Departamento de
Biología Funcional) de la Universidad de Oviedo.
Oviedo, 2005
Universidad De Oviedo Departamento De Biología Funcional
RAMÓN GIRÁLDEZ CEBALLOS-ESCALERA, Director del
Departamento de Biología Funcional de la Universidad de Oviedo,
AUTORIZA:
La presentación ante la Comisión de Doctorado de la Tesis
“Lactococina 972: caracterización genética, modo de acción
y optimización de la producción en biorreactores”, realizada
por Dña. Alma Hernández de Rojas, y dirigida por la Dra. Ana
Rodríguez González y el Dr. Juan Evaristo Suárez Fernández.
Oviedo, a 17 de Enero de 2005
Universidad De Oviedo Departamento De Biología Funcional
Consejo Superior de Investigaciones Científicas INSTITUTO DE PRODUCTOS LÁCTEOS DE ASTURIAS
ANA RODRÍGUEZ GONZÁLEZ, Científico Titular del C.S.I.C. adscrito
al Instituto de Productos Lácteos de Asturias y JUAN EVARISTO
SUÁREZ FERNÁNDEZ, Catedrático de Microbiología de la
Universidad de Oviedo.
CERTIFICAN:
Que la licenciada en Ciencias Químicas Alma Hernández de
Rojas ha realizado bajo su dirección el trabajo que presenta para
optar al grado de DOCTOR con el título:
“Lactococina 972: caracterización genética, modo de acción y
optimización de la producción en biorreactores”,
Y para que así conste, firmamos la presente certificación en
Oviedo, a 17 de Enero de 2005.
A mis padres, hermanos y Miguel.
Deseo expresar mi gratitud a todas las personas que han hecho posible la
realización de este trabajo:
A mis Directores la Dra. Ana Rodríguez y el Dr. Juan Evaristo Suárez,
por su confianza y apoyo incondicionales durante todos estos años. A la Dra.
Beatriz Martínez por su inestimable ayuda.
Al Dr. Juan Carlos Bada, Director del IPLA, donde he realizado la mayor
parte de este trabajo.
Al Dr. Juan Ayala (CBM-SO, Madrid) por brindarme la oportunidad de
trabajar en su laboratorio y su ayuda en el árido tema de las PBPs y la
formación de la pared bacteriana.
A todas las personas que a lo largo de estos años he conocido, tanto en
mis comienzos en Valladolid (en el IBGM) como aquí en Asturias. Todas
ellas han contribuido a que mi interés por el mundo de la ciencia nunca
decayese. Por su apoyo y sobre todo ánimo durante el transcurso del tiempo
y sobre todo en los momentos de “vacas flacas”: muchas gracias. A todos
ellos les quiero dedicar estas palabras del Dr. Sanger (doble premio Nóbel)
sobre estos momentos:
El mejor antídoto consiste en seguir mirando hacia adelante.
Cuando un experimento es un fracaso total, lo mejor es no
pasarse demasiado tiempo preocupándose por ello, sino seguir
con la planificación y pasar al experimento siguiente. Resulta
siempre muy excitante y muy pronto se olvida uno de sus
problemas.
Por último, y no por ello menos importante, quiero dar las gracias a mi
familia por su apoyo y ánimos en todo momento y sobre todo a Miguel, que
siempre ha sabido estar a mi lado, incluso en los momentos más difíciles.
ÍNDICE
i
ÍNDICE
ABREVIATURAS GENERALES .......................................................... vii
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS ..................................................... xiii
I. INTRODUCCIÓN
1. BACTERIAS DEL ÁCIDO LÁCTICO ............................................................ 1
2. METABOLISMO
2.1. Introducción ............................................................................................ 2
2.2. Principales rutas de fermentación
2.2.1. Fermentación de las hexosas ......................................................... 3
2.2.2. Fermentación de disacáridos ......................................................... 5
3. BACTERIOCINAS
3.1. Introducción ............................................................................................ 5
3.2. Características generales de las bacteriocinas ...................................... 5
3.3. Las bacteriocinas producidas por las BAL ............................................. 6
3.4. Organización genética ........................................................................... 7
3.5. Modo de acción ..................................................................................... 11
ii
4. LACTOCOCINA 972
4.1. Características generales y genética ..................................................... 15
4.2. Modo de acción ...................................................................................... 15
5. OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE BACTERIOCINAS
5.1. Introducción ............................................................................................ 18
5.2. Cinética de la producción de bacteriocinas por BAL ............................ 19
5.3. Factores que afectan a la producción de bacteriocinas por BAL
5.3.1. Cepa microbiana .......................................................................... 19
5.3.2. El medio de cultivo ...................................................................... 20
5.3.3. Condiciones de la fermentación ................................................... 22
6. TEORÍA SOBRE EL CULTIVO EN DISCONTINUO Y EN CONTINUO
6.1. Cultivo en discontinuo
6.1.1. Introducción ................................................................................. 22
6.1.2. Tasa de crecimiento específica ..................................................... 23
6.1.3. Rendimiento en biomasa .............................................................. 23
6.1.4. Productividad en biomasa ............................................................ 24
6.2. Cultivo en continuo
6.2.1. Instrumentación ........................................................................... 24
6.2.2. Relación entre la tasa de dilución y la concentración celular ....... 25
6.2.3. Relación entre la tasa de dilución y la concentración del sustrato.26
6.2.4. Tasa de dilución crítica ................................................................. 26
6.2.5. Productividad ................................................................................ 27
6.2.6. Producción de bacteriocinas .........................................................28
7. PRESENTACIÓN DEL TRABAJO: ANTECEDENTES Y OBJETIVOS .. 29
II. MATERIALES Y MÉTODOS
1. MICROORGANISMOS, VECTORES Y CONDICIONES DE CULTIVO ..... 31
2. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
2.1. Manipulación y análisis de ácidos nucleicos
2.1.1. Extracción de ADN plasmídico y electroporación ...................... 33
iii
2.1.2. Técnicas electroforéticas y extracción de ADN a partir de
geles de agarosa ......................................................................... 34
2.1.3. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ............................... 34
2.1.4. Secuenciación de ADN ............................................................... 35
2.1.5. Análisis de las secuencias ........................................................... 35
2.1.6. Expresión controlada de genes en Lactococcus .......................... 37
2.1.7. Ensayo de actividad del promotor de la lactococina 972 ............ 38
2.2. Proteínas
2.2.1. Obtención de membranas de L. lactis ......................................... 38
2.2.2. Electroforesis de proteínas .......................................................... 39
2.2.3. Marcaje de las PBPs de Lactococcus .......................................... 39
2.2.4. Ensayos de competición de lactococina 972 y BOCILLIN FL™ 40
2.2.5. Obtención y purificación de anticuerpos policlonales ................ 40
2.2.6. Enzyme-linked inmunoabsorbent assay (ELISA) ....................... 41
2.2.7. Hibridación tipo “Western” ......................................................... 41
2.2.8. Ensayos con el tripéptido antagonista de la vancomicina:
ND-NH-diacetil-L-Lys-D-Ala-D-Ala [(Ac)2KAA] ..................... 42
3. LACTOCOCINA 972
3.1. Purificación ......................................................................................... 42
3.2. Detección de la actividad inhibitoria .................................................. 42
3.3. Ensayo de inducción de profagos ........................................................ 43
4. PRODUCCIÓN DE LA LACTOCOCINA 972 EN BIORREACTOR
4.1. Instrumentación ................................................................................... 43
4.2. Cultivo en discontinuo ........................................................................... 45
4.3. Cultivo en continuo ............................................................................... 45
4.4. Medida del crecimiento microbiano ..................................................... 45
4.5. Detección de la actividad inhibitoria .................................................... 46
4.6. Cuantificación de ácidos orgánicos y azúcares .................................... 46
4.7. Parámetros cinéticos ............................................................................. 46
4.8. Análisis estadístico ................................................................................ 48
iv
III. RESULTADOS
1. CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DEL OPERÓN DE LA LACTOCOCINA 972
1.1. Análisis de la secuencia del plásmido pBL1 ........................................... 49
1.2. Análisis estructural del operón de la lactococina 972 ........................... 50
1.3. Estudio de las secuencias de proteínas
1.3.1. LclA ............................................................................................ 55
1.3.2. LclB ............................................................................................. 57
1.3.3. LclC ............................................................................................. 58
1.4. Comparación de las secuencias deducidas de las proteínas Lcl con las
depositadas en las bases de datos........................................................... 60
2. ESTUDIO DEL PROMOTOR DE LA LACTOCOCINA 972 (Plcn972) ........... 65
3. ANÁLISIS FUNCIONAL DEL OPERÓN DE LA LACTOCOCINA 972 ...... 66
4. MODO DE ACCIÓN DE LA LACTOCOCINA 972
4.1. Efecto de la lactococina 972 sobre el crecimiento de L. lactis MG1614 69
4.2. Comparación con el modo de acción de la vancomicina ...................... 71
4.3. Implicación de las PBPs en el modo de acción de lcn972 .................... 71
4.4. Efecto de la lactococina 972 sobre la respuesta SOS en
Lactococcus lactis .................................................................................. 78
5. CRECIMIENTO, METABOLISMO Y PRODUCCIÓN DE LACTOCOCINA
972 EN BIORREACTOR
5.1. Influencia de la fuente de carbono en el crecimiento y en la
producción de lcn972 en cultivo en discontinuo ................................... 80
5.2. Efecto de la tasa de dilución y la fuente de carbono en el
crecimiento y en la producción de lcn972 en cultivo en continuo ......... 82
5.3. Metabolismo de la cepa L. lactis IPLA972 en cultivo en
discontinuo y en continuo ..................................................................... 85
v
IV. DISCUSIÓN ............................................................................................ 87
1. ORGANIZACIÓN GENÉTICA DEL OPERÓN DE LA
LACTOCOCINA 972 ..................................................................................... 88
2. MODO DE ACCIÓN ..................................................................................... 93
3. PRODUCCIÓN DE LA LACTOCOCINA 972 Y METABOLISMO DE
L. lactis IPLA 972 .......................................................................................... 98
V. CONCLUSIONES ................................................................................ 103
VI. BIBLIOGRAFÍA
A ................................................................................................................... 107
B .................................................................................................................... 108
C .................................................................................................................... 110
D ................................................................................................................... 111
E .................................................................................................................... 113
F .................................................................................................................... 114
G ................................................................................................................... 115
H ................................................................................................................... 116
I ..................................................................................................................... 117
J ..................................................................................................................... 117
K ................................................................................................................... 117
L .................................................................................................................... 118
M ................................................................................................................... 119
N ................................................................................................................... 122
O ................................................................................................................... 122
P .................................................................................................................... 123
Q ................................................................................................................... 124
R .................................................................................................................... 124
S .................................................................................................................... 126
T .................................................................................................................... 127
vi
U .................................................................................................................... 128
V .................................................................................................................... 128
W ................................................................................................................... 128
Y .................................................................................................................... 129 Z ............................................................................................................................................. 130
vii
ABREVIATURAS GENERALES
A
ABC: ATP Binding Cassette
(Ac)2KAA: ND-NH-diacetil-L-Lys-D-Ala-D-Ala
Amp: ampicilina
Ampr: resistencia a ampilicina
A+T: contenido del ADN en adenina y timina
B
Bac+: producción de lactococina 972
Bac-: no producción de lactococina 972
BAL: Bacterias del Ácido Láctico
C
CECT: Colección Española de Cultivos Tipo
Cm: cloranfenicol
Cmr: resistencia a cloranfenicol
CIM: concentración inhibitoria mínima
D
D: tasa de dilución
DAPI: 4',6-diamidino-2-fenilindol
Dc: dilución crítica
Da: Dalton
DHAP: dihidroxiacetona-3-fosfato
viii
¨Ȍ: potencial de membrana
E
EDTA: ácido etilendiamino tetracético
ELISA: Enzyme-Linked ImmunoabSorbent Assay
EMP: ruta de Embden-Meyerhof-Parnas
Ery: eritromicina
Eryr: resistencia a eritromicina
F
F: faradios
FDP: fructosa-1,6-difosfato
Fts: Filament ThermoSensitive mutant
G
gDCW: gramos de peso seco celular
GAP: gliceraldehido-3-fosfato
GUS: D-glucuronidasa
G+C: contenido del ADN en guanina y citosina
H
HPLC: cromatografía líquida de alta eficacia (High Pressure Liquid
Chromatography)
I
Inm+: resistente a la lactococina 972
Inm-: sensible a la lactococina 972
ix
K
kb: kilobase
kDa: kilodalton
KS: constante de saturación o de Monod
KV: kilovoltio
L
lcn972: lactococina 972
M
µ: tasa de velocidad de crecimiento o velocidad de crecimiento específica
µmax: velocidad de crecimiento específica máxima
N
NAD+: nicotinamida adenina dinucleotido
NBD: dominio de unión al nucleótido trifosfato (Nucleotide Binding
Domain)
NICE: sistema de expresión controlado por nisina (NIsin Controlled
Expression system)
O
orf: pauta abierta de lectura (Open Reading Frame)
P
P: cantidad de producto formado
pAbPBP3: anticuerpo policlonal frente a PBP3 de Escherichia Coli
pAblcn972: anticuerpo policlonal frente a lcn972
x
PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida
pb: pares de bases
PBP: proteína de unión a penicilina (Penicillin Binding Protein)
PCR: reacción en cadena de la polimerasa (Polimerase Chain Reaction)
PG: peptidoglicano
6-PG/PK: 6-fosfogluconato/fosfocetolasa
pI: punto isoeléctrico
Plcn972: promotor de la lactococina 972
PnisA o Pnis: promotor de la nisina
pO2: presión parcial de oxígeno
pP: productividad de los productos
pX: productividad en biomasa
R
rbs: sitio de unión al ribosoma (Ribosome Binding Site)
rpm: revoluciones por minuto
S
S: cantidad de sustrato
SDS: dodecil sulfato sódico (Sodium Dodecil Sulfate)
SEC: sistema general de secrección
sp: especie
subsp: subespecie
xi
T
TBE: tris-ácido bórico-EDTA
TMD: dominio transmembrana (TransMembrane Domain)
tD: tiempo de duplicación celular
U
ufc: unidades formadoras de colonias
UA: unidades arbitrarias de actividad
X
X: peso seco celular
X-Gal: 5-bromo 4-cloro 3-indol-ȕ-D-galactopiranósido
X-Glu: 5-bromo-4-cloro-3-indol-ȕ-D-glucosido
Y
YP/S: rendimiento de producción de producto
YX/S: rendimiento de biomasa
Z
ȍ: ohmmio
xii
ABREVIATURAS DE LOS AMINOÁCIDOS
Ala Alanina A Leu Leucina L
Arg Arginina R Lys Lisina K
Asn Asparragina N Met Metionina M
Asp Ác. aspártico D Phe Fenilalanina F
Cys Cisteína C Pro Prolina P
Gln Glutamina Q Ser Serina S
Glu Ác. glutámico E Thr Treonina T
Gly Glicina G Trp Triptófano W
His Histidina H Tyr Tirosina Y
Ile Isoleucina I Val Valina V
PREFIJOS UTILIZADOS EN EL SISTEMA INTERNACIONAL DE UNIDADES
Abreviatura Prefijo Múltiplo
T tera 1012
F giga 109
M mega 106
k kilo 103
d deci 10-1
c centi 10-2
m mili 10-3
µ micro 10-6
N nano 10-9
P pico 10-12
F femto 10-15
A atto 10-18
xiii
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
Figura 1 ..................................... 4
Figura 2 ................................... 10
Figura 3 ....................................13
Figura 4 ................................... 17
Figura 5 ................................... 23
Figura 6 ................................... 37
Figura 7 ................................... 43
Figura 8 ................................... 50
Figura 9 ................................... 53
Figura 10 ................................. 54
Figura 11 ................................. 56
Figura 12 ................................. 58
Figura 13 ................................. 59
Figura 14 ................................. 60
Figura 15 ................................. 61
Figura 16 ................................. 63
Figura 17 ................................. 64
Figura 18 ................................. 65
Figura 19 ................................. 66
Figura 20 ..................................67
Figura 21 ................................. 67
Figura 22 ................................. 68
Figura 23 ................................. 70
Figura 24 ................................. 72
Figura 25 ................................. 74
Figura 26 ................................. 74
Figura 27 ................................. 75
Figura 28 ................................. 76
Figura 29 ................................. 76
Figura 30 ................................. 77
Figura 31 ................................. 78
Figura 32 ................................. 79
Figura 33 ................................. 81
Figura 34 ................................. 83
Figura 35 ................................. 85
Tabla 1 .................................... 10
Tabla 2 .................................... 28
Tabla 3 .................................... 32
Tabla 4 .................................... 33
Tabla 5 .................................... 34
Tabla 6 .................................... 73
Tabla 7 .................................... 81
Tabla 8 .................................... 82
INTRODUCCIÓN
Introducción 1
I. INTRODUCCIÓN
1. BACTERIAS DEL ÁCIDO LÁCTICO
Las bacterias del ácido láctico son microorganismos Gram–positivos, no
esporulados, generalmente inmóviles, que están relacionados entre sí por una serie de
propiedades metabólicas y nutricionales. El nombre de bacterias del ácido láctico
(BAL) deriva del hecho de que el ATP es sintetizado a través de la fermentación de
los carbohidratos, dando lugar a la formación de ácido láctico como producto final
mayoritario (y a veces único).
Este grupo comprende bacterias de los géneros: Lactococcus, Vagococcus,
Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Tetragenococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Lactobacillus y Carnobacterium. Filogénicamente son miembros de la
división Clostridium-Bacillus de las bacterias Gram-positivas.
Las BAL son organismos anaerobios aerotolerantes. Su única fuente de ATP es
la fermentación de carbohidratos ya que no pueden regenerar el poder reductor
(NAD+) a través de rutas respiratorias debido a su incapacidad de sintetizar
citocromos y otras enzimas que posean grupos hemo. Estudios recientes realizados
en el género Lactococcus (Gaudu et al., 2002) han revelado la capacidad respiratoria
de estas células cuando se añaden al medio de cultivo precursores de los grupos
hemo.
Introducción 2
Las BAL presentan requerimientos complejos de factores de crecimiento:
necesitan vitaminas del complejo B y un número considerable de aminoácidos y de
bases púricas y pirimidínicas (Dellagio et al., 1994). Como resultado de estas
auxotrofías, las BAL se cultivan generalmente en medios que contienen peptona,
extracto de levadura u otro material digerido de origen animal o vegetal, además del
carbohidrato fermentable.
Como corresponde a su metabolismo, las BAL son muy tolerantes al ácido, lo
que les permite desplazar a microorganismos que podrían competir con ellas en los
ambientes ricos en que viven. Como resultado de esta capacidad, las BAL ocupan
hábitats naturales con unas características muy determinadas. Algunas viven en
asociación con plantas y crecen a expensas de los nutrientes liberados en la
descomposición de los tejidos vegetales. Otras forman parte de la microbiota normal
de las cavidades corporales de los animales: tracto intestinal, vagina y vías
respiratorias altas. Desde estos reservorios, las BAL pueden colonizar los productos
animales (leche, carnes) y vegetales (frutos, mostos), que se utilizan como materia
prima, induciendo la generación de los derivados fermentados: productos lácteos y
embutidos en el primer caso, y encurtidos y bebidas alcohólicas en el segundo.
2. METABOLISMO
2.1. Introducción
Como se indicó anteriormente, la generación de ATP por las BAL tiene lugar
esencialmente mediante la fermentación de carbohidratos acoplada a la fosforilación
a nivel de sustrato. El producto final del metabolismo es el ácido láctico (> 50 % de
la fuente de carbono consumida). Pero debido a su alta capacidad para adaptarse a
condiciones ambientales diversas y, dependiendo de éstas, podemos encontrar
cambios en los productos finales del metabolismo, dando lugar a diferentes patrones
de fermentación.
Introducción 3
2.2. Principales rutas de fermentación
2.2.1. Fermentación de las hexosas
Las BAL poseen dos vías principales de fermentación de las hexosas (Monnet et
al., 1996):
1) VÍA HOMOFERMENTATIVA (Figura 1a). Esta vía es característica de los
géneros Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Pediococcus y algunas especies
de Lactobacillus de los Grupos I (homofermentativos obligados) y II
(heterofermentativos facultativos). La hexosa es metabolizada a través de la ruta
glicolítica o de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), y se caracteriza por la formación
de fructosa-1,6-difosfato (FDP), la cual es convertida mediante el enzima fructosa-
1,6-difosfato aldolasa en gliceraldehido-3-fosfato (GAP) y dihidroxiacetona-3-
fosfato (DHAP). En condiciones normales (exceso de azúcar y anaerobiosis), el
piruvato es reducido a ácido láctico mediante la acción del enzima lactato
deshidrogenasa dependiente de NADH. Como producto final del metabolismo se
obtienen dos moles de ácido láctico y dos moles de ATP por cada mol de hexosa
metabolizada.
2) VÍA HETEROFERMENTATIVA (Figura 1b). Encontramos esta vía en los
organismos del género Leuconostoc y en especies del género Lactobacillus de los
Grupos II y III (heterofermentativos facultativos y estrictos, respectivamente).
También se denomina ruta del 6-fosfogluconato/ fosfocetolasa (6-PG/PK), ya que
este enzima es clave en la ruta (Axelsson, 1993). Los dos primeros pasos de la ruta
consisten en una deshidrogenación de la glucosa-6-fosfato, para formar 6-
fosfogluconato, seguida de una descarboxilación. La pentosa-5-fosfato así formada
es transformada, mediante la acción del enzima fosfocetolasa, en GAP y acetil-
fosfato. El GAP es metabolizado de la misma manera que en la ruta glicolítica,
dando lugar a la formación de ácido láctico y rindiendo un mol de ATP por mol de
hexosa. Cuando se encuentra disponible un aceptor de electrones, el acetil fosfato es
reducido a etanol, siendo los productos finales ácido láctico, etanol y CO2. En
presencia de oxígeno, el acetil-fosfato es oxidado a acetato, lo que genera un mol
extra de ATP por mol de glucosa.
Introducción 4
A) GLUCOSA B) GLUCOSA
ATP ATP c c ADP ADP Glucosa-6-P Glucosa-6-P NAD+
h NADH+H+
Fructosa-6-P 6-fosfo-gluconato ATP NAD+ i ADP CO2 NADH+H+ Fructosa-1,6-DP Ribulosa-5-P
d Pi j Gliceraldehído-3-P Dihidroxi- Gliceraldehído-3-P acetil-P 2 Pi acetona-P 2 Pi CoA 2 NAD+ NAD+
e e 2 NADH + 2 H+ NADH + H+ Pi
2u 1,3-difosfoglicerato 1,3-difosfoglicerato acetil-CoA NADH+
2 ADP ADP k + H+
2 ATP ATP CoA NAD+
2u 3-fosfoglicerato 3-fosfoglicerato acetaldehido NADH+
+ H+ l NAD+
2u 2-fosfoglicerato 2-fosfoglicerato ETANOL
2 H2O H2O 2u fosfoenolpiruvato fosfoenolpiruvato
2 ADP ADP f f 2 ATP ATP 2u piruvato piruvato 2 NADH + 2 H+ 2 NADH + 2 H+ g g 2 NAD+ 2 NAD+ 2 LACTATO LACTATO
Figura 1. Rutas mayoritarias de fermentación de la glucosa. A) homofermentativa; B) heterofermentativa. cglucoquinasa, dfructosa-1,6-difosfato aldolasa, egliceraldehido-3-fosfatodeshidrogenasa, fpiruvato quinasa, glactato deshidrogenasa, hglucosa-6-fosfato deshidrogenasa, i6-fosfogluconato deshidrogenasa, jfosfocetolasa, kacetaldehido deshidrogenasa, lalcohol deshidrogenasa.
Introducción 5
2.2.2. Fermentación de disacáridos
Dependiendo del modo de transporte, los disacáridos entran en la célula bien
como azúcares libres o fosforilados, hidrolizándose en el interior de la misma por
acción de enzimas específicos. Sin duda, la ruta metabólica mejor estudiada en el
caso de las BAL es la de la lactosa, aunque también son capaces de fermentar otros
disacáridos como la maltosa, la sacarosa, la celobiosa, la melibiosa y la trealosa. La
capacidad de fermentación de estos azúcares difiere entre las diferentes especies de
BAL (Desmazeaud y de Roissart, 1994).
3. BACTERIOCINAS
3.1. Introducción
Durante cientos de años la humanidad ha explotado la fermentación de los
alimentos producida por las BAL como un método efectivo para su conservación.
Este efecto es debido, principalmente, a la fermentación homoláctica de los azúcares,
la cual da lugar a la producción de una gran cantidad de ácido láctico, que a su vez
provoca un descenso del pH (alcanzando incluso valores inferiores a 4,0). Este
descenso del pH previene el crecimiento de la mayoría de los microorganismos
potencialmente alterantes.
Algunas BAL son capaces de producir otras sustancias antimicrobianas como
peróxido de hidrógeno, etanol, acetaldehído, diacetilo y bacteriocinas.
3.2. Características generales de las bacteriocinas
El estudio de las bacteriocinas comenzó en los años 20 del pasado siglo,
describiéndose por primera vez en Escherichia coli (Gratia, 1925) y ampliándose
posteriormente a bacterias Gram-positivas (Jacob et al., 1953; Tagg et al., 1976).
Basándose en un estudio sobre colicinas producidas por bacterias Gram-
negativas, Tagg et al. (1976) definieron los péptidos antimicrobianos producidos por
los organismos Gram-positivos, como compuestos “proteináceos” que inhiben el
desarrollo de las bacterias relacionadas taxonómicamente con la cepa productora.
Introducción 6
Posteriormente, Konisky (1982) propuso la siguiente definición: “las
bacteriocinas son compuestos de naturaleza proteica y síntesis ribosomal que
inhiben el crecimiento de otros organismos y no provocan la muerte de la célula
productora”.
Probablemente las BAL sean el grupo de bacterias que producen un mayor
número de bacteriocinas. Existen numerosas revisiones en la bibliografía sobre estos
péptidos antimicrobianos (McAuliffe et al., 2001, entre otros) y sobre los producidos
por las BAL en particular (Eijsink et al., 1998, 2002; Ennahar et al., 1999, 2000;
Cleveland et al., 2001; Garneau et al., 2002, entre otros).
3.3. Las bacteriocinas producidas por las BAL
Las BAL sintetizan una gran variedad de bacteriocinas, las cuales se han
clasificado en los siguientes grupos (Nes et al., 1996 y Cleveland et al., 2001):
(I) CLASE I o LANTIBIÓTICOS: son péptidos pequeños (<5 kDa) que afectan a
la permeabilidad selectiva de las membranas. Son modificados de forma post-
traduccional, conteniendo aminoácidos inusuales como lantionina, metil-lantionina,
dehidro-butirina y dehidro-alanina. Se subdividen a su vez en:
a) lantibióticos de Tipo A, péptidos catiónicos e hidrofóbicos que forman poros en
las membranas y poseen estructuras flexibles. El ejemplo más conocido es la
nisina, aunque también se incluyen en este grupo otras como la lacticina 481, la
lacticina 3147 y la plantaricina C.
b) lantibióticos de Tipo B, péptidos globulares, estructuralmente rígidos, que no
poseen carga neta o la tienen negativa. No se han detectado bacteriocinas de este
grupo producidas por las BAL, siendo los ejemplos más notables la mersacidina,
la actagardina y la duramicina.
(II) CLASE II o NO LANTIBIÓTICOS: son péptidos de hasta 10 kDa,
termoestables. No presentan aminoácidos modificados post-traduccionalmente. Se
subdividen en:
Introducción 7
a) Clase IIa, en esta clase se incluyen los péptidos activos frente a Listeria. Poseen
una secuencia amino-terminal conservada (YGNGVXC), y un puente disulfuro
(S-S) en la mitad amino-terminal del péptido. Ejemplos de este grupo son: la
pediocina PA-1, las sakacinas A y P, la leucocina A, la curvacina A, la
mesentericina Y105 y las carnobacteriocinas BM1 y B2.
b) Clase IIb, se incluyen en esta subdivisión bacteriocinas formadas por dos
péptidos diferentes. Entre ellas están la lactococina G, la lactocina M y la
lactacina F.
c) Clase IIIc, en este grupo se incluyen todas aquellas bacteriocinas que no pueden
incluirse en los dos grupos anteriores. Pertenece a este grupo la lactococina A.
(III) CLASE III: este grupo está formado por proteínas de gran tamaño (>30 kDa),
termolábiles. Ejemplos de este grupo son la helveticina J, la helveticina V-1829, la
acidofilucina A y las lactacinas A y B.
3.4. Organización genética
Los genes que codifican para la producción de bacteriocinas se encuentran
organizados en operones, que se localizan en plásmidos, en transposones (Engelke et
al., 1992) o en el cromosoma bacteriano (Altena et al,. 2000; Diep et al., 1996).
La biosíntesis de bacteriocinas depende de una estructura genética compuesta
generalmente por (Nes et al., 1996):
1. el gen estructural que codifica la prebacteriocina, aunque en algunos casos
existen varios genes estructurales que codifican para diferentes componentes de
la misma,
2. el gen de inmunidad, cuyo producto protege a la célula frente al efecto
antimicrobiano de la bacteriocina y que generalmente está estrechamente ligado
al gen estructural e incluso forma parte de la misma unidad de transcripción,
3. un gen que codifica para un transportador ABC que excreta la bacteriocina y
cataliza su procesamiento,
Introducción 8
4. un gen que parece codificar para una proteína accesoria que parece ser esencial
para la secreción de la bacteriocina, pero cuyo papel es todavía desconocido.
En el caso de los lantibióticos, la organización del operón es más compleja ya
que se requiere la presencia de los genes que codifican para los enzimas implicados
en las modificaciones post-traduccionales, típicas de este grupo.
El gen estructural de la bacteriocina codifica para un propéptido, es decir, el
péptido más una secuencia señal amino-terminal que tiene una longitud variable,
entre 14 y 30 aminoácidos (Klaenhammer, 1993; Harvarstein et al., 1994). La
función de este péptido parece ser:
a) estabilizar el péptido durante la traducción,
b) evitar que la bacteriocina sea biológicamente activa mientras se encuentra
dentro de la célula productora,
c) proveer una señal de reconocimiento para el sistema de transporte,
d) mantener la conformación específica de la prebacteriocina.
Cada bacteriocina tiene su propia proteína de inmunidad, la cual se expresa
junto con ella. Las proteínas de inmunidad de las bacteriocinas de Clase II son
normalmente bastante pequeñas (entre 51 – 150 aminoácidos). La homología entre
las proteínas de inmunidad es sorprendentemente baja considerando la encontrada
entre las bacteriocinas (Aymerich et al., 1996). Los análisis de hidrofobicidad de
algunas proteínas de inmunidad revelaron que éstas poseían posibles segmentos
transmembrana, lo cual nos indicaría que estos factores se localizan en el blanco de
acción de la mayoría de las bacteriocinas, llevando a cabo así una protección “in
situ” (Fremaux et al., 1998).
Uno de los problemas que todavía no está totalmente resuelto en el campo de las
bacteriocinas es el de cuál es el mecanismo de inmunidad. Ensayos realizados con
bacteriocinas que pertenecen a la Clase IIa parecen demostrar que la parte C-terminal
de la bacteriocina es la que interacciona con el extremo C-terminal de la proteína de
inmunidad (Fimland et al., 2002; Johnsen et al., 2004). Debido a que dicho extremo
C-terminal de la bacteriocina es el que a su vez interacciona con la parte hidrofóbica
de la membrana citoplasmática bacteriana, pudiera ser que las proteínas de
inmunidad bloquearan, directa o indirectamente, dicha interacción.
Introducción 9
En el caso de los lantibióticos, en la inmunidad suelen estar implicados
transportadores ABC (ATP-Binding Cassette), como ocurre por ejemplo con la
epidermina (Peschel y Götz, 1996; Otto et al. 1998), la nisina (Ra et al., 2000), la
lacticina 481 (Rincé et al., 1997), la lactacina RM (Yarmus et al., 2000) y LsA y
LsB (Gajic et al., 2003). Aunque no se conoce el papel que juegan estas proteínas en
la inmunidad, se ha postulado que podrían actuar eliminando, de forma activa, las
moléculas de bacteriocina de la membrana citoplasmática. De esta manera la
concentración de bacteriocina en ésta se mantiene por debajo del nivel crítico
necesario para la aparición de poros (Peschel y Götz, 1996).
La mayoría de las bacteriocinas son translocadas fuera de la célula mediante un
transportador ABC específico. La única excepción la constituyen unas pocas
pertenecientes a las Clases Ia y II que son exportadas mediante el sistema general de
secreción de la célula (sistema SEC), como por ejemplo la carnobacteriocina A
(Worobo et al., 1994), la acidocina B (Leer et al., 1995), la bacteriocina 31 (Tomita
et al., 1996), la enterocina P (Cintas et al., 1997), la listeriocina 743A (Kalmokoff et
al., 2001) y la lactococina 972 (Martínez et al., 1999). El gen que codifica para el
transportador ABC puede encontrarse, o bien formando parte del operón de la
bacteriocina, o en un operón aparte. Los elementos consenso encontrados en los
péptidos señal se caracterizan por poseer dos residuos de glicina adyacentes y
previos al sitio de procesamiento y dominios de residuos hidrofóbicos e hidrofílicos
separados por distancias conservadas (Tabla 1). Los transportadores que reconocen
los péptidos señal del tipo doble glicina (GG) contienen tres dominios (Figura 2), que
pueden estar codificados en un mismo polipéptido o en polipéptidos separados:
1. un dominio amino-terminal citoplasmático, con actividad proteolítica
encargado del procesamiento del prepéptido
2. un dominio de membrana, generalmente formado por seis subdominios
transmembrana, y
3. un segundo dominio citoplasmático de unión a ATP, de unos 200
aminoácidos de longitud y cercano a su extremo carboxi-terminal en el que
se observan los Motivos de Walker A y B.
Introducción 10
Basándose en la estructura de estos transportadores, Harvarstein et al. (1995)
propusieron la siguiente hipótesis para la exportación de bacteriocinas que contienen
el péptido señal “tipo doble glicina”: el precursor de la bacteriocina se une al
dominio proteolítico del transportador ABC, de manera que la hidrólisis de ATP
induce una serie de cambios conformacionales en el precursor, lo cual da lugar a un
proceso de proteolisis concomitante con el proceso de transporte de la bacteriocina a
través de la membrana citoplasmática. Esta teoría indica que este péptido señal
Tabla 1. Secuencias de péptidos señal encontrados en las bacteriocinas de clase II.
A) PÉPTIDOS SEÑAL DEPENDIENTES DE TRANSPORTADORES ABC:
secuencia consenso: - - ! h - - h h ! - - ! - - G G -: cualquier residuo !: residuos hidrofóbicos h: residuos hidrofílicos G: residuos de glicina
B) PÉPTIDOS SEÑAL DEPENDIENTES DEL SISTEMA DE SECRECIÓN
GENERAL:
divergicina A: MKKQILKGLVIVVCLSGATFFSTPQASA
acidicina B: MVTKYGRNLBLSKKVELFAIWAVLVVALLLATA
A) Dominios Dominio Dominio Dominio proteolítico transmembrana de unión ATP C �|150aa H |300aa |250aa C = motivo rico en cisteína = hélices transmembrana H = motivo rico en histidina = motivo de unión a ATP B) Localización en la membrana Exterior Interior Dominio Dominio proteolítico de unión H ATP C Figura 2. Transportador ABC de las bacteriocinas de Clase II con péptido señal del “tipodoble glicina”. A) Organización de los dominios del transportador; B) supuestalocalización de los dominios en relación con la membrana citoplasmática
Introducción 11
serviría como señal de reconocimiento para el transporte y procesamiento de la
bacteriocina.
Muchas de las bacteriocinas de Clase II presentan, junto con estos cuatro genes
básicos, una serie de genes reguladores de su producción (Diep et al., 1994; 1996;
Axelsson y Holck, 1995; Quadri et al., 1995). Estos genes forman un sistema
regulador compuesto por tres componentes: un péptido de inducción (IP), una
histidina quinasa (HPK) y un regulador de la respuesta (RR). El péptido IP funciona
como una feromona, que cuando se une a HPK provoca la autofosforilación de la
quinasa, y ésta a su vez la del RR. El RR fosforilado actúa como un activador
transcripcional del operón de la bacteriocina (Kleerebezem et al., 1997).
3.5. Modo de acción
En general, la acción de las bacteriocinas producidas por bacterias Gram-
positivas está restringida principalmente a otras especies de Gram-positivas. El rango
de organismos inhibidos por cada bacteriocina varía considerablemente; por ejemplo,
mientras que la nisina es activa frente a especies de una gran variedad de géneros
bacterianos (Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Listeria y Mycobacterium,
así como frente a las formas vegetativas y esporas de Bacillus y Clostridium), la
bacteriocina de Clase II, lactococina A, solamente es activa frente a Lactococcus.
Para aquellas bacteriocinas de BAL cuyo modo de acción se conoce, se ha
demostrado que, dada su naturaleza catiónica e hidrofóbica, éstas interaccionan con
la membrana plasmática de las células sensibles formando poros que anulan su
permeabilidad selectiva (Moll et al., 1999), lo que provoca irremediablemente la
muerte celular. Se ha sugerido que los polímeros aniónicos de la superficie celular,
como los ácidos teicoico y lipoteicoico, juegan un papel esencial en la interacción
con las bacteriocinas catiónicas, aunque parecen existir también receptores
específicos. Sin embargo, no todas las bacteriocinas forman poros. Se han descrito
otros modos de acción como la inhibición de la síntesis de peptidoglicano o de la
formación del septo de división (Héchard y Sahl, 2002).
Introducción 12
Los lantibióticos de Tipo A, como la nisina, son capaces de formar poros de
forma transitoria en la membrana celular, provocando la disipación del potencial de
membrana ('\) y la pérdida rápida de metabolitos pequeños, como aminoácidos,
nucleótidos y ATP, dando lugar a la detención del metabolismo celular (Brötz et al.,
1998; Héchard y Shal, 2002). En general, estos poros no son selectivos, aunque en
algunos casos, como la lacticina 3147 (McAuliffe et al., 1998) y la lactococina G
(Moll et al., 1996) forman poros que son exclusivos para el ion K+.
Ahora bien, la potente actividad in vivo de la nisina, activa en un rango
nanomolar, contrastaba con la concentración necesaria, mucho más alta, para la
formación de poros en membranas artificiales. Esta discrepancia se dilucidó al
comprobar que los lantibióticos nisina y epidermina (pero no Pep5 o la epilacina
K7), se unen al precursor de la síntesis de peptidoglicano, el Lípido II, como paso
previo a la formación de poros e inhiben, de este modo, la síntesis de pared celular
(Brötz et al., 1998; Breukink et al., 1999).
Estudios más recientes (Wiedemann et al., 2001) han demostrado que el
lantibiótico nisina permeabiliza las membranas a través de dos mecanismos
diferentes:
1. a altas concentraciones (rango PM) los poros se formarían sin la participación del
Lípido II. En este caso, para que se produzca una actividad óptima de la nisina,
las membranas deben poseer un contenido del 50 – 60 % de fosfolípidos cargados
negativamente, siendo muy importante su extremo carboxi-terminal, cargado
positivamente, para la unión inicial (Moll et al., 1999). Los poros formados son
selectivos para los aniones (Figura 3A).
2. por el contrario, cuando existe Lípido II disponible, la nisina actúa a bajas
concentraciones (rango nM) y el modelo a tener en cuenta es el de la Figura 3B.
La vida media de los poros, en presencia de Lípido II, aumenta de milisegundos
a 6 segundos, e incluso el diámetro de los mismos también se incrementa de 1 a 2-2,5
nm (Wiedemann et al., 1998). También se ha observado (van Heusden, 2002) que
esta unión de la nisina al Lípido II favorece el cambio de orientación de la
bacteriocina en la superficie de las membranas celulares, pasando de una orientación
paralela a una orientación perpendicular respecto a estas membranas.
Introducción 13
cadena creciente de peptidoglicano
A)
B)
C)
transglicosilación
Lípido II
Figura 3. Modo de acción de los lantibióticos de Tipo A y Tipo B: A) a concentracionesmicromoleculares, los péptidos catiónicos de Tipo A (nisina, epidermina, Pep5, etc.) forman poros sinnecesidad de una diana; B) a concentraciones nanomolares, la nisina y la epidermina forman poros através de dianas utilizando el Lípido II como molécula de anclaje; C) la mersacidina y la actagardinatambién se unen al Lípido II, bloqueando su incorporación al peptidoglicano. N: N-acetilglucosamina,G: ácido N-acetilmurámico. (Figura tomada de Héchard y Sahl, 2002).
Introducción 14
Los lantibióticos de Tipo B (mersacidina y actagardina), no producidos por
bacterias lácticas, también inhiben la biosíntesis del peptidoglicano (Somma et al.,
1971; Brötz et al., 1995), siendo la reacción bloqueada la transglicosilación (Brötz et
al., 1997). El sustrato de esta reacción es nuevamente el Lípido II que, al igual que
ocurría con la nisina, forma un complejo de gran afinidad con la mersacidina (Brötz
et al., 1998). En contraste con lo que ocurre con el glucopéptido vancomicina, el cual
se une al extremo carboxi-terminal D-Ala-D-Ala de la cadena lateral peptídica del
Lípido II, el complejo que forma el lantibiótico probablemente implique el núcleo
disacárido, siendo éste un lugar de unión no utilizado por ningún otro compuesto
antibacteriano (Figura 3C).
De acuerdo con lo descrito, observaciones al microscopio electrónico de células
tratadas con nisina, Pep5 y plantaricina C mostraron una degradación masiva de la
pared celular, particularmente en el área del septo. También se observó que la
incubación de las bacterias con estos lantibióticos producía la liberación de enzimas
autolíticas (Bierbaum y Sahl, 1985). Este efecto es mucho más lento que la
formación de poros y explica la lisis tardía de las células sensibles.
El proceso de formación de poros de las bacteriocinas de la clase II no ha sido
tan extensamente estudiado como el de los lantibióticos. Se sabe que la facultad de
estas bacteriocinas de adoptar una conformación anfipática D-helicoidal es uno de los
factores determinantes para la formación de poros (Ennahar et al., 2000). Además,
esta capacidad es dependiente del potencial de membrana ('\) y parece ser que está
mediada por algún tipo de receptor (Abee, 1995). En estudios recientes se ha
propuesto que uno de los componentes del sistema multienzimático de la permeasa
de la manosa (EIItman) es la molécula diana de la mesentericina Y105 (Dalet et al.,
2001; Héchard et al., 2001) y la leucocina A (Rammath et al., 2000).
Por otro lado, estudios realizados con análogos de bacteriocinas han demostrado
que el enantiómero de la leucocina A es inactivo biológicamente (Yan et al, 2000), lo
cual indicaría la necesidad de interacciones quirales con una molécula “receptora”
para la actividad de dicha bacteriocina. Además, la necesidad de un “receptor”
también explicaría el espectro restringido de estas bacteriocinas.
Introducción 15
4. LACTOCOCINA 972
4.1. Características generales y genética
La lactococina 972 es una bacteriocina producida por la cepa Lactococcus lactis
subsp. lactis IPLA 972 (lcn972), aislada en nuestro laboratorio (Martínez, 1996), con
características muy peculiares respecto a su estructura y modo de acción. Es un
péptido hidrofílico de 66 aminoácidos biológicos, cuya forma activa es un
homodímero. Es termosensible, activa en un rango de pH comprendido entre 4,0 y
9,0 y poco susceptible a la acción de proteasas.
La información genética tanto de la producción de la lactococina 972 como de su
inmunidad, se encuentra en un plásmido de 10,9 kb, denominado pBL1. Se
identificaron dos orfs, que codificaban para la prebacteriocina (lclA) y una proteína
integral de membrana (lclB) (Martínez et al., 1996).
La producción de lcn972 es máxima durante la fase exponencial de crecimiento
de la cepa L. lactis IPLA972. Los estudios de los niveles de expresión del ARNm de
los genes lclA y lclB indicaron que ambos genes formaban una única unidad de
transcripción, siendo la abundancia del transcrito proporcional a la velocidad de
acumulación de lactococina 972 en el sobrenadante de los cultivos (Martínez et al.,
1999).
4.2. Modo de acción
La peculiaridad más destacable de la lactococina 972 reside en su modo de
acción que ha sido parcialmente caracterizado. Esta bacteriocina es bactericida y, en
algunos casos bacteriolítica, para cultivos de Lactococcus en fase exponencial, no
habiéndose aislado hasta el momento ninguna cepa resistente. A diferencia de otras
bacteriocinas descritas, lcn972 no forma poros en la membrana plasmática de las
células sensibles. De hecho, células que previamente han acumulado [H3]-uridina no
liberan al exterior el precursor de ARN al ser tratadas con lcn972. Además, la
actividad metabólica de las células se mantiene inalterada ya que los cultivos tratados
sintetizan ADN, ARN y proteínas a tasas similares a las del cultivo control, durante
al menos una hora después del tratamiento (aproximadamente el tiempo de
Introducción 16
generación en Lactococcus) (Martínez et al., 1996). Sin embargo, no ocurre lo
mismo al medir la incorporación de [H3]-N-acetil-glucosamina en el peptidoglicano.
En los cultivos tratados, se observa una cinética lineal en lugar de una exponencial,
como correspondería a un cultivo en fase de crecimiento activo, es decir,
dividiéndose rápidamente. La observación al microscopio óptico muestra la pérdida
de la morfología cocoide y un alargamiento de las células hasta aumentar su volumen
unas cuatro veces. Mediante citometría de flujo y el uso de colorantes específicos
para determinar la viabilidad de las células (ej. DAPI) se comprobó que éstas
mantienen la integridad de su membrana plasmática, señal de viabilidad, hasta que la
relación superficie-volumen supera un valor crítico y la célula muere. Por último,
con microscopía electrónica de cortes ultrafinos de los cultivos tratados se observa
una inhibición de la formación de los septos de división (Martínez et al., 2000a).
Todos estos datos sugieren que la lactococina 972 inhibe la síntesis del
peptidoglicano en el septo, afectando así a un proceso crucial en el ciclo
biológico celular como es la división celular. Este particular modo de acción
representa un interesante modelo de estudio para el desarrollo de nuevos
antimicrobianos ya que no son muchos los actualmente descritos que actúan a este
nivel (Piddock, 1998).
En el proceso de división celular se han definido las siguientes etapas (Bramhill,
1997; Errington et al., 2003):
a) selección del sitio de división, generalmente en el punto medio de la célula;
b) ensamblaje del aparato citoplasmático, que implica la formación del anillo Z
por parte de la proteína FtsZ y, en la mayoría de los organismos, FtsA; unión
al anillo Z de las proteínas especializadas, que dirigen la síntesis del material
de la pared celular, cuyo conjunto forma el divisoma (Figura 4). Dichas
proteínas se denominan Fts (filament thermosensitive mutants), dado que
los correspondientes mutantes termosensibles en E. coli adoptan un fenotipo
filamentoso a la temperatura restrictiva. Una nomenclatura previa se refiere a
varias de estas proteínas como PBPs (penicillin binding protein), por la
propiedad que tienen de admitir en su centro activo moléculas de
compuestos ȕ-lactámicos.
Introducción 17
Una de estas proteínas, denominada PBP3 (FtsI) en E. coli, está implicada de
forma específica en la formación del peptidoglicano del septo. Así, se observó que el
antibiótico ȕ-lactámico cefalexina, que inhibe la septación sin afectar al proceso de
elongación celular o la síntesis del peptidoglicano, se une con especial afinidad a
PBP3 (Spratt, 1977). Posteriores ensayos con mutantes de ftsI en los cuales no se
produce síntesis del peptidoglicano durante la división, confirmaron esta teoría
(Margolin, 2000).
Postulamos, por tanto, que la lactococina 972 podría interaccionar con la PBP de
Lactococus homóloga a PBP3, mediante uno de los mecanismos siguientes: 1)
bloqueando su actividad directamente; 2) actuando sobre carboxipeptidasas que
parecen determinar la disponibilidad del supuesto sustrato de estas PBPs (el lípido II-
tripéptido) o; 3) evitando su localización en el septo.
Figura 4. Ciclo de formación del divisoma en E. coli. OM: membrana externa; Mur: mureina; PP:espacio periplásmico; CM: membrana citoplasmática. Tomado de www.ucs.mun.ca/~z83mmw/bioc4103/proteins.htm.
Introducción 18
5. OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN
DE BACTERIOCINAS 5.1. Introducción
El uso de las bacteriocinas como agentes conservantes puede realizarse, bien
utilizando un cultivo iniciador productor de bacteriocina in situ, o bien utilizando la
bacteriocina como aditivo. En cualquiera de los casos sería necesaria la optimización
de su producción para poder disponer de la máxima actividad antimicrobiana. Por
tanto, esto sería uno de los primeros pasos a seguir en el estudio de la aplicación de
las bacteriocinas.
La producción de bacteriocinas está influenciada por diversos factores, entre los
que se incluyen las fuentes de carbono y nitrógeno, las condiciones de fermentación
(pH, temperatura, agitación, etc.) y en general, cualquier variable que afecte al
crecimiento microbiano (Biswas et al., 1991; Callewaert y de Vuyst, 2000; de Vuyst
et al., 1996; Uguen et al., 1999).
5.2. Cinética de la producción de bacteriocinas por BAL
La producción de bacteriocinas parece ser un proceso asociado al crecimiento:
generalmente tiene lugar durante la fase exponencial y cesa al final de la misma
(Parente et al., 1997; Lejeune et al., 1998). Se ha observado que después de alcanzar
un máximo, los niveles de bacteriocina decrecen llegando, en ocasiones, a no ser
detectada en el medio de cultivo. Esto podría deberse a la adsorción de la
bacteriocina a las células productoras o bien a la degradación de la misma por
proteasas. Sin embargo, hasta ahora no ha sido detectada ninguna proteasa en los
cultivos productores capaz de degradar las bacteriocinas, aunque se ha comprobado
la existencia de procesos de adsorción para muchas de ellas como la nisina
(Meghrous et al., 1992), la enterocina 1146 (Parente y Ricciardi, 1994a), la
amilovorina L471 (de Vuyst et al., 1996; Lejeune et al., 1998) y la lactococina 140
(Parente et al., 1994). Así pues, parece ser este segundo mecanismo el que realmente
influye en la desaparición del antimicrobiano.
Introducción 19
Existen diversos modelos matemáticos (Leroy y de Vuyst, 2001) que intentan
describir el crecimiento de las bacterias lácticas. Un ejemplo son las ecuaciones
logísticas y las de Gompertz (Lejeune et al., 1998) que pueden ser útiles a la hora de
predecir el efecto de un único factor ambiental sobre la producción de bacteriocina y
otros parámetros biológicos relevantes (biomasa, evolución del pH del medio de
cultivo, etc.). La principal desventaja del uso de estas ecuaciones es que han sido
diseñadas para una cepa en concreto, de manera que su extrapolación a otras cepas,
con un crecimiento muy diferente, da resultados muy imprecisos.
Por último, cabe señalar que, aunque la producción de bacteriocina sea un
proceso concomitante con el crecimiento, las condiciones óptimas para este último
no implican necesariamente un máximo en la producción de bacteriocina. Por
ejemplo, se ha encontrado una relación bastante lineal entre la velocidad de
producción de bacteriocina y la velocidad de crecimiento celular para algunas
bacteriocinas, tanto en cultivo continuo como discontinuo (Kaiser y Montville, 1993;
Parente, et al., 1994; Parente y Ricciardi, 1994a, 1994b, 1999; de Vuyst et al., 1996;
Bhugaloo-Vial, et al.,1997), pero esta relación no se ha observado para la nisina en
ninguno de los sistemas de cultivo (Kim et al., 1997), ni para la plantaricina C en
cultivo continuo (Bárcena et al., 1998). La explicación a la falta de linealidad en
estos dos casos podría derivar del hecho de que ambas bacteriocinas son
lantibióticos, cuya biosíntesis y regulación es mucho más compleja que las de las
bacteriocinas de Clase II.
5.3. Factores que afectan a la producción de bacteriocinas por BAL
5.3.1. Cepa microbiana
Una misma bacteriocina puede ser producida por varias cepas o especies
diferentes (Bhunia et al., 1994; Jack et al., 1995; Rodríguez et al., 1995; Martínez et
al., 2000b). Este hecho no puede generalizarse, puesto que Yang y Ray (1994)
encontraron que, aunque los niveles de producción de nisina y de leuconocina Lcm1
variaban entre las diferentes especies, en la producción de pediocina AcH no
aparecía dicha diversidad. Estas diferencias en la producción pueden atribuirse a
niveles diferentes de expresión de los genes necesarios para la producción y/o
Introducción 20
inmunidad de las bacteriocinas. Así, por ejemplo, se había observado en el caso de la
nisina (Kim et al., 1998), y de la amilovorina L471 (de Vuyst et al., 1996) que la
producción siempre llegaba a un máximo que no se podía superar. Sin embargo, se
obtuvo un mutante espontáneo de L. lactis N8, la cepa LAC48, que producía 10
veces más nisina que la cepa parental, aunque los niveles de expresión de los genes
nis eran similares en ambas cepas (Quiao et al., 1997). Estudios posteriores
demostraron que la inmunidad a la nisina en el mutante era mucho mayor que en la
cepa parental.
5.3.2. El medio de cultivo
La producción de bacteriocinas también está muy influenciada por el tipo y
concentración de las fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato, así como por los
cationes y agentes surfactantes presentes en el medio.
La producción de nisina Z es óptima cuando se utiliza como fuente de carbono
glucosa, sacarosa o xilosa (Matsusaki et al., 1996; Chinachoti et al., 1997a, b). De
forma similar, la producción de pediocina AcH es máxima cuando el medio se
suplementa con glucosa, sacarosa, xilosa o galactosa (Biswas et al., 1991). Como ya
hemos mencionado anteriormente, una producción de biomasa máxima no se
corresponde obligatoriamente con una producción máxima de bacteriocina; tal es el
caso de la enterocina 1146 cuyos niveles de biomasa utilizando como fuente de
carbono sacarosa, fructosa o lactosa son similares, pero sólo se obtienen
concentraciones altas de bacteriocina con la primera (Parente y Ricciardi, 1994b).
Tan importante como el tipo de fuente de carbono es la concentración inicial de
carbohidrato. Esta variable influye tanto en la concentración final de bacteriocina
como en el rendimiento de producción de bacteriocina por unidad de biomasa (YB/X).
Estudios realizados por de Vuyst y Vandame (1992) con nisina revelaron que cuando
la concentración de sacarosa aumenta de 10 a 40 g/L, YB/X experimenta un descenso
de 19,1 a 10,9 mgCDW/g, a pesar de que se producía más biomasa. Por el contrario, en
el caso de la amilovorina L471 no se ha encontrado un incremento en la actividad
cuando se aumenta la concentración de glucosa de 20 a 60 g/L observándose, sin
embargo, un retraso en la degradación de la bacteriocina (Lejeune et al., 1998).
Introducción 21
Se ha estudiado también el efecto de diferentes fuentes de nitrógeno y su
concentración sobre la producción de nisina (de Vuyst y Vandame, 1993), de
enterocina 1146 (Parente y Hill, 1992; Parente y Ricciardi, 1994b) y de lactocina D
(Parente y Hill, 1992). Todos ellos encontraron que los mejores rendimientos en la
producción de bacteriocina se obtenían con fuentes de nitrógeno “completas”, como
por ejemplo extracto de levadura.
En lo referente a los aniones (PO43-) y cationes (Mg2+ y Ca2+) presentes en el
medio, el efecto que éstos ejercen sobre la producción de bacteriocinas es específico
de la cepa productora. Por ejemplo, la presencia de fosfato inorgánico mejora la
producción de nisina con la cepa L. lactis subsp. lactis NIZO22186 (de Vuyst y
Vandame, 1993); sin embargo, este efecto estimulador no se observa con la cepa IO-
1 (Matsusaki et al., 1996).
Otros aditivos, como el Tween 80 y el etanol, estimulan la producción de
algunas bacteriocinas. Por ejemplo, la presencia de este último (1% v/v) en el medio
de cultivo estimula la producción de lactococina S (Mørtvedt-Abildgaard et al.,
1995) y de amilovorina L471 (de Vuyst et al., 1996). Estos autores han intentado
explicar este fenómeno mediante varias hipótesis: estimulación de la expresión de los
genes involucrados en la síntesis de la bacteriocina, efecto preventivo sobre la
agregación de la misma e incremento en la YB/X debido a las condiciones de estrés.
Además, se ha estudiado el efecto que tienen ciertos compuestos osmoprotectores
sobre la optimización de la producción de lacticina 481 (Uguen et al., 1999),
observándose que ésta disminuye rápidamente cuando las células crecen en un medio
de alta osmolaridad, pero que no se ve afectada cuando a este medio se le añade
betain-glicina (GB).
5.3.3. Condiciones de la fermentación
El control del pH es esencial a la hora de optimizar la producción de
bacteriocinas. Así, el pH óptimo para la síntesis de bacteriocinas es por lo general 5,5
- 6,0, valor algo menor que el óptimo para el desarrollo de las BAL, aunque este
valor sufre variaciones entre especies e incluso entre cepas.
Introducción 22
En el caso de la temperatura se observa una relación entre la temperatura óptima
de crecimiento y la de producción máxima de bacteriocina (Meghrous et al., 1992;
Matsusaki et al., 1996; Chinachoti et al., 1997a; Lejeune et al., 1998), aunque
también se ha observado que el crecimiento a temperaturas subóptimas puede
provocar un aumento en YB/X en casos puntuales (Lejeune et al., 1998).
Otros parámetros también a tener en cuenta son las condiciones de agitación y la
aireación del cultivo (ambas relacionadas entre sí). Un aumento en cualquiera de
ellas puede provocar la disminución del crecimiento y de la producción de
bacteriocina. En el caso de la lactococina S, se ha observado una inhibición en la
síntesis de bacteriocina en cultivos aeróbicos (Mørtvedt-Abildgaard et al., 1995); por
el contrario, estas condiciones de estrés provocan un incremento en YB/X para la
amilovorina L471 (de Vuyst et al., 1996), a pesar de los niveles bajos de bacteriocina
que se observan al final de la fermentación.
6. TEORÍA DEL CULTIVO
EN DISCONTINUO Y EN CONTINUO
6.1. Cultivo en discontinuo
6.1.1. Introducción
En el cultivo en discontinuo el crecimiento del organismo se lleva a cabo en un
sistema cerrado, es decir, un biorreactor, en el cual se ha introducido un medio
adecuado, y en el que las condiciones ambientales de temperatura, pH, etc., han sido
prefijadas. En este caso las células crecerán hasta que algún componente esencial del
medio se convierta en limitante, o hasta que se produzca algún cambio en el
ambiente que inhiba el metabolismo celular (por ejemplo la acumulación de un
producto tóxico, la superación de la capacidad tamponante del medio, etc.).
A continuación vamos a definir una serie de parámetros y ecuaciones que nos
serán útiles a la hora de realizar los cálculos y analizar los resultados obtenidos de un
cultivo en discontinuo. No explicaremos su deducción matemática, que se puede
consultar en libros especializados (Scragg, 1991)
Introducción 23
6.1.2. Tasa de crecimiento específica
Se define la tasa de crecimiento o velocidad de crecimiento específica (µ, h-1)
como la velocidad de aumento de la concentración celular por unidad de tiempo.
Puede determinarse durante la fase exponencial de crecimiento mediante la ecuación
siguiente:
P �
dd
t
tttXX 693,02lnlnln 0 (1)
donde:
Xt es la biomasa del cultivo en el tiempo t de la curva de crecimiento (gCDW/L),
X0 es la biomasa inicial del cultivo (gCDW/L),
tD es el tiempo de duplicación (h).
A partir de esta ecuación podemos calcular µ en un cultivo en discontinuo
representando el logaritmo de la biomasa en función del tiempo (Figura 5).
6.1.3. Rendimiento en biomasa
Este parámetro es muy importante puesto que representa la eficiencia de la
conversión del sustrato en biomasa. Se define el rendimiento en biomasa (YX/S) como
la cantidad de biomasa formada por unidad de masa de sustrato consumido, es decir:
Figura 5. Cálculo de la tasa de crecimiento específica (P). Podemos estimar el tiempo deduplicación mediante la relación P = 0,693/td.
log
de la
bio
mas
a
pendiente = P
tiempo
Introducción 24
SXY SX '
' / (2)
6.1.4. Productividad en biomasa
La productividad en biomasa se define como la biomasa celular producida por
unidad de volumen de medio de cultivo y por unidad de tiempo (g L-1 h-1):
tXpX (3)
Generalmente, para algunos cultivos en discontinuo este parámetro debe de ser
calculado para todo el proceso, incluyendo el tiempo que se ha tardado en preparar el
biorreactor, esterilizar el sistema, el tiempo que se tarda en realizar el cultivo y el del
vaciado del biorreactor.
6.2. Cultivo en continuo
6.2.1 Instrumentación
En el cultivo en continuo las células crecen en un sistema abierto donde se
mantiene la población celular en un estado de crecimiento equilibrado, mediante la
eliminación constante de una parte del cultivo y el reemplazo de éste con medio
fresco.
Existen dos tipos de sistemas de cultivo en continuo:
1. el QUIMIOSTATO, en el cual se añade un nutriente limitante del crecimiento a
una velocidad constante, de manera que tanto la densidad del cultivo como la
velocidad de crecimiento se ajustan a este hecho,
2. el TURBIDOSTATO, en el cual se mantiene constante la densidad óptica del
cultivo añadiendo medio fresco a medida que se necesita.
En el Apartado 4.1. de Materiales y Métodos (Instrumentación) se presenta el
esquema del quimiostato utilizado en este estudio y que puede servir como
orientación sobre los diferentes elementos que componen estos aparatos.
Introducción 25
6.2.2. Relación entre la tasa de dilución y la concentración celular
En el quimiostato la velocidad de crecimiento celular está determinada por la
velocidad de adición del nutriente limitante (fuente de carbono y nitrógeno, fósforo,
elementos traza, vitaminas, etc.). Si mantenemos esta velocidad de adición constante,
el cultivo puede mantenerse en un estado estacionario o sostenido de crecimiento
de manera indefinida. Esta es una de las mayores ventajas del cultivo continuo frente
al cultivo discontinuo.
Esta propiedad del quimiostato puede expresarse mediante una serie de
ecuaciones que relacionan la concentración celular y la del nutriente limitante con la
velocidad de adición del medio. Estas ecuaciones se obtienen desarrollando los
balances materiales del biorreactor, obteniéndose como ecuación final:
XVFX
dtdX
P�� (4)
donde:
F es la velocidad de adición del medio (L/h),
V es el volumen del biorreactor (L),
X es la concentración de células en el biorreactor (gCDW/L)
P es la tasa de crecimiento específica (h-1).
El término F/V se denomina tasa de dilución (D), y equivale al número de
volúmenes de cultivo que pasan por el quimiostato por hora. Sustituyendo en la
ecuación (4), y reagrupándola obtenemos:
)( DXdtdX
� P (5)
De esta expresión deducimos que variando la velocidad de adición del medio
podemos variar la tasa de crecimiento.
Durante el estado estacionario la biomasa permanece constante dentro del
quimiostato (dX/dt = 0), de manera que sustituyendo en la ecuación (5) obtenemos
que en el estado estacionario P = D.
Introducción 26
6.2.3. Relación entre la tasa de dilución y la concentración de sustrato
El desarrollo de la ecuación que nos permite llegar a esta relación es muy similar
al de la ecuación (4), es decir, partimos de un balance de materia:
SX
R
YX
VSF
VFS
dtdS P
�� � (6)
donde:
S es la concentración del nutriente limitante en el quimiostato (g/L),
SR es la concentración del sustrato limitante en el reservorio del medio (g/L),
YX/S es el rendimiento de biomasa (g de peso seco celular formado por gramo de
sustrato consumido, gCDW/g),
P es la tasa de crecimiento específica (h-1),
F es la velocidad de adición del medio (L/h),
V es el volumen del biorreactor (L),
En el estado estacionario dS/dt = 0 y además P = D (recordemos que F/V = D),
de manera que la relación entre la tasa de dilución y la concentración de sustrato
puede escribirse como:
)( SSYX RSX � (7)
(en el estado estacionario X y S se representan como X y S por convenio).
6.2.4. Tasa de dilución crítica
Como ya hemos apuntado (ecuación 5), cuando trabajamos con el quimiostato,
variando la tasa de dilución (D) podemos variar la tasa de crecimiento específica (P).
Cuando D > Pmax, (P - D) tiene un valor negativo en la ecuación (5), de manera que a
medida que vamos aumentando el valor de D comienza a tener lugar una
disminución en la concentración celular dentro del quimiostato y como resultado se
Introducción 27
dice que hay un lavado del cultivo. Se define la tasa de dilución crítica (Dc) como
la tasa de dilución más baja a la cual ocurre el lavado del cultivo. En la práctica el
valor de Dc es similar al de Pmax.
6.2.5. Productividad
En el cultivo continuo la productividad en biomasa, px (g L-1 h-1) es un
parámetro indicativo de la efectividad del sistema, y se expresa como:
XDpx � (8)
6.2.6. Producción de bacteriocinas
La producción óptima de bacteriocinas en cultivo en discontinuo generalmente
requiere la utilización de medios complejos y de condiciones físicas (como
temperatura y pH) muy controladas (Leroy y de Vuyst, 1999; Møortvedt-Abildgaard
et al., 1995; Parente y Ricciardi, 1994; Yang y Ray, 1994). Por estas razones,
raramente el cultivo en discontinuo se elige para la producción de bacteriocinas.
El proceso de elección para la producción de bacteriocinas es el cultivo en
continuo, debido a varias razones. Podemos obtener altas densidades celulares y,
puesto que la mayoría de las bacteriocinas se producen durante la fase de crecimiento
activo, podemos obtener una producción volumétrica de bacteriocina alta. Además,
durante estos cultivos, la concentración de nutrientes puede controlarse para mejorar
y estabilizar la producción de bacteriocina. También, el cultivo en continuo permite
eliminar aquellos metabolitos inhibidores, como ácido láctico o la propia
bacteriocina, maximizándose así la producción de la misma, especialmente a tasas de
dilución que son lo suficientemente altas para proveer los nutrientes necesarios.
Finalmente, mediante la utilización de cultivos en continuo podemos evitar el
descenso en la producción de bacteriocina, que como ya hemos indicado, se observa
después de alcanzar un máximo en los niveles de producción.
Introducción 28
Tabla 2. Datos comparativos de la producción de diferentes bacteriocinas producidas por BAL en cultivos en discontinuo y en continuo.
Bacteriocina
Cepa
Proceso
B
(106 AU o
IU/L)
YB/X
(106 AU/g)
Referencia
Bavaricina
MN
Lb. bavaricus
MN
discontinuo
continuo; D=0,058
continuo; D=0,205
3,2
6,4
6,4
n.d.
n.d.
n.d.
Kaiser y Montville,
1993.
Enterocina
1146
E. faecium
DPC1146
discontinuo
continuo; D=0,14
continuo; D=0,56
2,8
3,2
1,8
2,0
1,9
1,9
Parente et al., 1997.
Divercina Cb. Divergens
V41
discontinuo
continuo; D=0,03
continuo; D=0,2
cont.+Ca-alg; D=2
cont.+MF; D=0,4
100,0
200,0
210,0
5,0
2,0
n.d.
78,1
78,1
n.d.
n.d.
Bhugaloo-Vial et
al., 1997.
Plantaricina
C
Lb. plantarum
LL441
continuo; D=0,055
continuo; D=0,12
continuo; D=0,25
3,2
0,4
0,1
2,1
0,2
0,06
Bárcena et al.,
1998.
Nisina L. lactis
IFO12007
discontinuo
cont.+MF; D=0,5
cont.+MF+B; D=0,5
0,12
0,15
0,14
0,035
n.d.
n.d.
Taniguchi et al.,
1994.
Pediocina
PO2
Pc. acidilactici
PO2 cont. Ca-alg; D=3 0,25 n.d.
Nisina L. lactis
AFIS2011 cont. Ca-alg; D=3 0,13 n.d.
Nisina L. lactis
ATCC11454
continuo; D=0,1
continuo; D=0,25
continuo; D=0,4
0,08
0,18
0,06
0,043
0,097
0,033
Meghrous et al.,
1992.
Nisina L. lactis IO-1
discontinuo
continuo; D=0,1
cont.+inm.; D=0,1
cont.+inm.; D=0,3
cont.+MF; D=0,1
cont.+MF, D=0,3
disc.+MF+SepPakC8
3,15
2,81
2,16
1,30
2,75
2,00
2,4 (+1,4)
2,25
2,14
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
2,5
Matsusaki et al.,
1996.
Chinachoti et al.,
1997c.
B: título de bacteriocina; YB/X, rendimiento de la producción de bacteriocina por unidad de
biomasa; D, tasa de dilución h-1; n.d., no disponible; Ca-alg, células inmovilizadas en alignato de
calcio; MF, microfiltración; imm., células inmovilizadas en ENTG.-3800. (Parente y Ricciardi,
1999)
Introducción 29
En la Tabla 2 se comparan procesos en discontinuo y en continuo para la
producción de algunas bacteriocinas.
Generalmente se observa en los cultivos en continuo una relación lineal entre la
D y la producción específica de bacteriocina (YB/X) (ver Apartado 6.2.2. Relación
entre la tasa de dilución y la concentración celular). Este es el caso de la enterocina
1146 (Parente et al., 1997), la bavaricina MN (Kaiser y Montville, 1993) y la
divergicina (Bhugaloo-Vial et al., 1997). Pero también se han observado otros
patrones de producción; por ejemplo, sólo se observa producción de plantaricina C a
tasas de dilución bajas (Bárcena et al., 1998).
A medida que el valor de la D aplicada aumenta, disminuye la biomasa y la
concentración de bacteriocina, pudiéndose llegar al lavado del cultivo (ver Apartado
6.2.4. Tasa de dilución crítica). Es por esto por lo que algunos autores han utilizado
fermentaciones en continuo con reciclaje de células o con células inmovilizadas
(Tabla 2). El uso de cultivos inmovilizados requiere la optimización de algunos
parámetros específicos, como el tipo de membrana empleada en la microfiltración, ya
que se han observado fenómenos de retención de la bacteriocina (Bhugaloo-Vial et
al., 1997). Este tipo de fermentaciones permiten el uso de valores de D muy altos, de
manera que aunque los valores del título de bacteriocina sean menores que para los
sistemas celulares libres, la productividad aumenta considerablemente.
7. PRESENTACIÓN DEL TRABAJO:
ANTECEDENTES Y OBJETIVOS
En nuestro laboratorio se ha identificado una nueva bacteriocina, la lactococina
972, producida por la cepa Lactococcus lactis subsp. lactis IPLA972. Esta
bacteriocina, debido a sus peculiares propiedades físico-químicas y a su particular
modo de acción, no puede englobarse en ninguna de las clases de bacteriocinas
descritas hasta el momento. Así pues, la lactococina 972 podría considerarse como el
prototipo de una nueva clase de péptidos antimicrobianos, lo que la hace muy
interesante desde un punto de vista biológico a pesar de tener una aplicación
tecnológica limitada, debido al estrecho rango de microorganismos sensibles.
Introducción 30
En este trabajo de profundización del conocimiento de las características de la
lactococina 972, los objetivos planteados han sido los siguientes:
1. Caracterización del sistema de producción/inmunidad de la lactococina 972:
1.1. Completar la secuenciación del operón que codifica para la
bacteriocina y análisis informático de la secuencia obtenida.
1.2. Análisis funcional del operón mediante su expresión controlada en
L. lactis NZ9000.
2. Caracterización del modo de acción de la lactococina 972, con especial
énfasis en su posible papel sobre las PBPs de Lactococcus lactis:
2.1. Análisis del perfil de proteínas de unión a penicilina (PBPs) de las
cepas L. lactis IPLA972 y L. lactis R2, productoras de la
bacteriocina, y comparación con el de la cepa sensible L. lactis
MG1614.
2.2. Determinación de la influencia de la lactococina 972 sobre el perfil
de PBPs de las células sensibles a la bacteriocina.
3. Optimización de la producción de bacteriocina en biorreactor mediante el
cultivo en discontinuo y en continuo de la cepa productora L. lactis IPLA972.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y métodos 31
II. MATERIALES Y MÉTODOS
1. MICROORGANISMOS, VECTORES
Y CONDICIONES DE CULTIVO Las cepas bacterianas y los vectores de clonación utilizados en este estudio se
encuentran descritos en las Tablas 3 y 4.
La cepa Lactococcus lactis subps. lactis IPLA 972, productora de lactococina
972 (lcn972), fue aislada de un queso artesanal asturiano. Esta cepa pertenece a la
colección del Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC), y ya fue
objeto de la tesis doctoral de la Dra. Martínez (Martínez, 1996). Está registrada en la
Colección Española de Cultivos Tipo como CECT5695.
Las cepas de lactococos se propagaron en medio M17 (Oxoid, Basingstoke,
Hampshire, England) suplementado con diferentes carbohidratos (glucosa, lactosa,
0,5%) a 30 ºC, sin agitación. Las cepas de Escherichia coli se incubaron en medio
2uTY (Sambrook et al., 1989) a 37 ºC, con agitación.
Los ensayos de metabolismo y producción de bacteriocina en biorreactor se
realizaron en medio ESTY (Pronadisa) (de composición idéntica al M17). Este
medio se suplementó con glucosa o lactosa (5 o 20 g/L) como fuente de carbono.
Materiales y métodos 32
Los microorganismos se conservaron congelados a –80 ºC en el medio de
crecimiento suplementado con glicerol al 10 %. Los antibióticos utilizados fueron
suministrados por Sigma-Aldrich. Durante los bioensayos rutinarios de actividad con
la cepa indicadora L. lactis MG1614 el medio de crecimiento se suplementó con
estreptomicina (Str, 500 µg/ml).
Como agentes de selección en los experimentos de clonación se utilizaron
ampicilina (Amp, 100 µg/ml) para las cepas de E. coli y eritromicina (Ery, 2,5 µg/ml)
y cloranfenicol (Cm, 10 µg/ml) para las cepas de L. lactis. Como segundo agente de
selección se utilizó (cuando fue necesario) X-Gal o X-Glu (Sigma-Aldrich).
Tabla 3. Cepas bacterianas utilizadas. Cepa Propiedades relevantes Fuente/Referencia
L. lactis subsp. lactis
IPLA 972
IL1403
F4-2
Cepa silvestre Bac+ Inm+.
Cepa libre de plásmidos, Bac- Inm-.
Cepa huésped del fago P335.
Martínez et al., 1996.
Venema et al., 1996.
Moineau, 1999.
L. lactis subsp. cremoris
MG1614
R2
NZ9000
pBL54
N12
R12
PBPX
Cepa libre de plásmidos, Bac- Inm-, Strr. Rfr.
Cepa derivada de MG1614, que contiene pBL1, Bac+, Inm+.
Cepa derivada de MG1363; contiene los genes nisK y nisR, receptora de pNZ8020 y pNZ8048E.
Cepa derivada de NZ9000, Bac+ inducible, Inm+ constitutiva.
Cepa derivada de NZ9000 que contiene el PLcn972 en pauta con el gen reportero uidA.
Cepa derivada de R2 que contiene el PLcn972 en pauta con el gen reportero uidA.
Cepa derivada de NZ9000 que contiene el gen pbpX en pauta con el PnisA
Gasson, 1983.
Martínez, 1999.
Kuipers et al., 1998.
Este trabajo.
Este trabajo.
Este trabajo.
Este trabajo.
E. coli
JM105
DH10B
KW1
KW2
endA1, thi, rpsL, sbcB15, hsdR4, ǻ(lac-proAB) (F’, traD36, proAB, lacIqZDM15)
Fí, mcrA, ǻ(mrr-hsdRMS-mcrBC), ĭ80dlacZǻ M15, ǻlacX74, deoR, recA1, endA1, araD139, ǻ (ara, leu)7697, galU, galK, Ȝí, rpsL, nupG
ǻ(add-gus-man) hsdR hsdM+ metB strA purB
Cepa derivada de KW1, que contiene el PLcn972 en pauta con el gen reportero uidA.
Woodcok et al., 1989.
Gruber, 1992.
Fiedler y Wirth, 1988.
Este trabajo.
Materiales y métodos 33
2. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
2.1. Manipulación y análisis de ácidos nucleicos
2.1.1. Extracción de ADN plasmídico y electroporación
El ADN plasmídico de L. lactis se aisló según el método de O’Sullivan y
Klaenhammer (1993). La electroporación de las cepas de lactococos se realizó de acuerdo
con el método de Leenhouts et al. (1990), utilizando cubetas de 0,2 cm en un Gene Pulser
Apparatus (Bio Rad). Las condiciones del pulso fueron de 12,5 kV/cm, 200 ȍ y 25 µF.
Para aislar los plásmidos de E. coli se utilizó el método de Birboim y Doly (1979)
cuando el análisis de los mismos era rutinario. Para la obtención de ADN plasmídico de
alta pureza se utilizó el sistema “GenEluteTM Plasmid Miniprep Kit” (Sigma-Aldrich).
La trasformación de las distintas cepas de E. coli se realizó utilizando el método descrito
por Dower et al. (1988) aplicando las mismas condiciones de pulso que para los
lactococos.
Tabla 4. Vectores utilizados.
Plásmido Propiedades relevantes Fuente/Referencia
L. lactis
pBL1
pNZ8020
pNZ8048E
pIL252
pBL11
pBL12
pBL54
Bac+ Inm+.
PnisA, Cmr.
PnisA, Cmr, Eryr.
Bajo número de copias, Eryr.
Derivado de pNZ8020 que contiene el gen pbpX, Cm+.
Derivado de pIL252 que contiene el PLcn972 junto en el gen reportero uidA.
Derivado de pNZ8020 que contiene los genes lclA, lclB y lclC, Bac+, Inm+, Cm+.
Martínez et al., 1996.
de Ruyter et al., 1996b.
de Ruyter et al., 1996b.
Simon y Chopin, 1988.
Este trabajo.
Este trabajo.
Este trabajo.
E. coli
pUC18
pTUT-mcs2
pBL2
pBL53
Clonaciones intermedias, selección por inactivación insercional del gen D-lacZ, Ampr.
Cuantificación de la actividad de promotores mediante el gen reportero de la glucuronidasa de E. coli, uidA.
Derivado de pTUTmcs2 que contiene el PLcn972.
Derivado de pUC18 que contiene los genes lclA, lclB y lclC, Ampr.
Imai y Kitajima, 1997.
Chaillou et al., 1998.
Este trabajo.
Este trabajo.
Materiales y métodos 34
2.1.2. Técnicas electroforéticas y extracción de ADN de los geles de agarosa
Para el análisis de los fragmentos de ADN éste se sometió a electroforesis en
geles de agarosa al 0,7 %, utilizando tampón TBE, y de acuerdo con las indicaciones
descritas por Maniatis et al. (1982) y Sambrook et al. (1989). Como patrón de peso
molecular se utilizó ADN del fago Ȝ, digerido con PstI o HindIII.
Para la extracción de los fragmentos de ADN de los geles de agarosa se
utilizaron fundamentalmente dos métodos: la extracción mediante “freeze and
squeeze” (Sambrook et al., 1989) o mediante el sistema “GenEluteTM Minus EtBr
Spin Columns” (Sigma-Aldrich).
2.1.3. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
En los experimentos de PCR (Saiki et al., 1985; Mullis y Faloona, 1987) se
utilizó Taq ADN polimerasa (Roche), cuando la amplificación se realizó para
comprobar la existencia de un gen determinado, y Pwo ADN polimerasa (Roche)
cuando se necesitaba una alta fidelidad en la amplificación (por ejemplo cuando el
fragmento amplificado iba a ser posteriormente clonado).
En la Tabla 5 se indican los oligonucleótidos utilizados como cebadores en este
estudio. Las amplificaciones constaron de un paso de desnaturalización del ADN a
95 ºC durante 5 minutos, seguido de una serie de ciclos de anillamiento (cuyo
Tabla 5. Oligonucleótidos utilizados.
Nombre Secuencia Enzima de
restricción
Tm
(ºC) Fragmento amplificado
P1 CGTTTGAATTCACTTTCCG EcoRI 56,8
P2 CTTGGTTTCCATGGAGAATCC NcoI 60,7 Promotor Lcn972
Nis1 ATGTGCTTATTAATCTCAGGAATTCCTGAG EcoRI 65,1
Nis2 CCCTCTAGATTAAAAAGCTAAAGCTAA XbaI 61,2 Operón Lcn972
Bac3 GTGTATCCTTACCTTGTC -- 48,4
Bac6 CAAAACTTAATGCTCC -- 47,8
Fragmento EcoRV-HindIII
de pBL1
PBP2 AGCAACGCCATGGTAAAATTTTTAA NcoI 46,0
PBP3 CCAGATCTTACCGCCGCCACTATCCC BglII 59,0
Gen pbpX de
L. lactis IL1403
PA ACTATTCCAGAACGAGCG 53,7
PB CCCAGTGCTACCAAATCC 56,0
Fragmento de 381 pb de la
dUTPasa de fagos de la
especie P335 de L. lactis
Materiales y métodos 35
número y condiciones dependieron de los cebadores utilizados, el tamaño del
fragmento a amplificar y el enzima utilizado), un paso de elongación a 72 ºC,
finalizando con un paso de extensión a 72 ºC durante 10 minutos.
2.1.4. Secuenciación de ADN
La secuenciación se realizó según el método de los desoxinucleótidos trifosfato
descrito por Sanger et al. (1977), utilizando 5’-[Į-35S]dATP (Amersham Pharmacia
Biotech) y el kit T7 Sequenase versión 2.0 (U.S. Biochemicals, Cleveland, OH), o
mediante la técnica de “chromosome walking” basada en la reacción de PCR,
utilizando como cebadores oligonucleótidos marcados fluorescentemente, Taq
polimerasa (Amersham Pharmacia Biotech) y un secuenciador automático ALF DNA
(Amersham Pharmacia Biotech). Para realizar la secuenciación del fragmento de
pBL1 EcoRV-HindIII, de 0,7 kpb, imposible de clonar en ningún vector, se
secuenció directamente el producto de PCR (amplificado con los cebadores Bac3 y
Bac6, Tabla 5). Las secuencias de ADN se ensamblaron utilizando el paquete de
programas GCG (Devereux et al., 1984).
2.1.5. Análisis de las secuencias
Los datos obtenidos tras la secuenciación de los genes fueron analizados
utilizando:
1. La base de datos blatsn (basada en el programa BLAST, Basic Local
Alignment Search Tool, Atschul et al., 1997; Zhang y Madden, 1997),
accesible en la página web del NCBI (National Center for Biotechnology
Information) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, se utilizó para el alineamiento
de las secuencias de nucleótidos.
2. El programa DNAman (versión 4.0, Lynnon Biosoft, ©1994-1999) permitió
la búsqueda de posibles pautas abiertas de lectura, así como la búsqueda de
posibles sitios de unión a ribosoma y promotores. También se utilizó para
la búsqueda de repeticiones invertidas que pueden actuar como terminadores
de la transcripción rho-independiente.
Materiales y métodos 36
El programa MFold (Zuker et al., 1999), disponible en la página web
http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfold-simple.html, se utilizó para
predecir la estabilidad de los transcritos generados a partir de las orfs previamente
identificadas.
A partir de la secuencia de ADN se dedujo la de aminoácidos utilizando el
programa DNAman (ver 4.0, Lynnon Biosoft, ©1994-1999). Esta secuencia se
sometió a análisis utilizando:
1. El programa DNAman, que nos permitió el cálculo de la composición de
aminoácidos y la predicción de las propiedades físico-químicas de la proteína
(como punto isoeléctrico y peso molecular teórico). También se utilizó para
realizar los alineamientos entre distintas secuencias de proteínas; para ello se
usó la matriz BLOSUM (blocks substitution matrix; Henikoff y Henikoff,
1992) con los siguientes parámetros: gap open penalty = 10, gap extension
penalty = 0,05 y % delay divergent sequences = 62.
2. El programa SignalP (ver 1.1, Nielsen et al., 1997), disponible en la página
web http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/, se usó para detectar la
existencia de posibles péptidos señal.
3. La base de datos de dominios de proteínas prosite (Sigrist et al., 2002) y el
programa ScanProsite (Gattiker et al., 2002), todos ellos accesibles en la
página web http://us.expasy.org/prosite/, se utilizaron para la búsqueda de
motivos comunes con otras proteínas y proteínas con dominios concretos,
respectivamente.
4. Los programas: TopPred2 (Claros y von Heijne, 1994); TMpred (Hofmann y
Stoffel, 1993); HMMTOP ver 2.0 (Tusnády y Simon, 2001); SOSUI (Mitaku
Group, Department of Biotechnology, Tokyo University of Agriculture and
Technology), todos ellos disponibles en la página Expasy Molecular Biology
Server (http://us.expasy.org/), se utilizaron para comprobar la presencia de
regiones transmembrana, así como la orientación de éstas.
5. La base de datos blastp (basada en el programa BLAST), accesible en la
página web del NCBI, nos permitió la búsqueda de proteínas homólogas a
nuestras secuencias en las bases de datos.
Materiales y métodos 37
6. La base de datos rpsblast (basada en el programa BLAST; Marchler-Bauer et
al., 2003) accesible en la página web del NCBI, se utilizó para la búsqueda de
dominios conservados (COGs, Clusters of Orthologous Groups). Dado que
cada COG incluye proteínas de organismos filogenéticamente muy diversos,
este sitio es especialmente útil para asignar función a proteínas que no
muestran un grado significativo de similitud con otras proteínas.
2.1.6. Expresión controlada de genes en Lactococcus
Para conseguir una expresión controlada de genes en Lactococcus, así como para
identificar cuáles eran los genes necesarios para la producción e inmunidad de la
lactococina 972, se utilizó el sistema NICE (NIsin Controlled Expression system,
Figura 6), que nos permite un control sencillo de la expresión de estos genes (de
Ruyter et al., 1996a).
Los ensayos de inducción se realizaron tanto en medio líquido (de Ruyter et al.,
1996b) como utilizando el sistema en multicapa (Eijsink et al., 1996).
NisK
NisR
Pi
nisina
nisK nisR
regulación de la expresión génica
transducción de señales
gen x
Pnis
proteína X
Figura 6. Diagrama del sistema NICE: nisK y nisR son los genes que codifican para la histidínkinasa (NisK) y el regulador (NisR), respectivamente; Pnis es el promotor inducible de la nisina;gen x es el gen que se clona bajo la acción del Pnis y proteína X es su producto.
Materiales y métodos 38
2.1.7. Ensayo de actividad del promotor de la lactococina 972
Para realizar el estudio cuantitativo de la actividad del promotor del operón de la
lactococina 972 (PLcn972) se llevaron a cabo diferentes fusiones con el gen reportero
de la glucuronidasa, uidA, de E. coli. El análisis cuantitativo se realizó tanto en
extractos de E. coli KW1 como de L. lactis MG1614 y R2.
Para la medida de la actividad ȕ-glucuronidasa se utilizaron extractos celulares
obtenidos mediante ruptura mecánica; su contenido en proteína se determinó
utilizando el sistema BCA (Pierce Biotechnology, Inc.). El ensayo de actividad se
realizó sobre estos extractos en microplacas, utilizando un volumen final de reacción
de 250 µl: 100 µl de extractos o diluciones + 150 µl de mezcla de reacción (148 µl
buffer + 2 µl de reactivo X-GLUC 100 mM). Las placas se analizaron utilizando un
lector de microplacas BENCHMARK PLUS (Bio Rad) y aplicando los siguientes
parámetros de lectura: longitud de onda 405 nm, a 37 ºC durante 45 min,
obteniéndose 20 puntos de lectura que nos permitieron confeccionar las rectas para el
análisis.
La actividad ȕ-glucuronidasa (UA/min) se definió como la variación de la
absorbancia por minuto (pendiente de la recta obtenida durante la lectura) y se
expresó por µg de proteína del extracto (UA min-1 µg prot-1).
2.2. Proteínas
2.2.1. Obtención de membranas de L. lactis
Los cultivos se incubaron a 30 ºC hasta alcanzar una OD600 de aproximadamente
0,8. Las células se recogieron y se lavaron con tampón fosfato potásico (100 mM, pH
7,0), congelándose el sedimento. Posteriormente, la muestra se procesó siguiendo el
método descrito por Margolles et al. (1999). Para ello, las células se trataron con una
concentración de 10 mg/ml de lisozima y se lisaron utilizando una prensa de French
(French®Press) a 20.000×psi, siguiendo el método de Bayer et al. (1982). La
suspensión se centrifugó a baja velocidad (13.000×g, 10 min., 4 ºC) para eliminar los
restos celulares, y posteriormente el sobrenadante se sometió a ultracentrifugación
Materiales y métodos 39
(125.000×g, 60 min., 4 ºC). El sedimento se resuspendió en tampón fosfato (100
mM, pH 7,0) y se congeló inmediatamente a -80 ºC hasta su utilización.
La concentración de proteína de las preparaciones de membrana se cuantificó
utilizando el método de Bradford (1976) (Bio-Rad Laboratories).
2.2.2. Electroforesis de proteínas
La electroforesis de las proteínas se realizó en geles de poliacrilamida al 10 % en
presencia de SDS al 0,1 % (SDS-PAGE, Laemmli, 1970). Para la separación de
péptidos pequeños se utilizó el método de SDS-PAGE-Tricina (Schäger y von
Jagow, 1987).
Las proteínas se tiñeron con azul de Coomassie R-250 (Bollag y Edelstein,
1991). Cuando fue necesaria la utilización de un método más sensible, debido a la
baja concentración de proteínas en el gel, se utilizó el método de tinción con plata
(Oakley et al., 1980).
La actividad inhibitoria de los péptidos separados mediante electroforesis se
ensayó siguiendo el método descrito por Bhunia et al. (1987). Para ello, los geles se
lavaron durante 3 h en H2O destilada a temperatura ambiente, y posteriormente se
cubrieron con una capa de medio de cultivo (1,2 % de agar) inoculado con L. lactis
MG1614. Las placas se incubaron durante 16 – 18 h a 30 ºC.
2.2.3. Marcaje de las PBPs de Lactococcus
En primer lugar se realizó un marcaje general de las PBPs presentes en nuestras
cepas de lactococos, utilizando el reactivo BOCILLIN FL™ (Molecular Probes) y
según el método descrito por Zhao et al. (1999). Para ello, una preparación de
membranas conteniendo 300 µg de proteína por muestra se incubó con BOCILLIN
FL a una concentración final de 50 µM, a 37 ºC durante 30 min. Las proteínas de la
muestra se separaron mediante SDS-PAGE, y las PBPs marcadas se visualizaron
mediante un FluorImager (Molecular Dynamix Storm system, The Molecular
Dinamics, USA) utilizando los parámetros de la fluoresceína (máximo de excitación
Materiales y métodos 40
495 nm, máximo de emisión 520 nm). Los resultados se procesaron utilizando el
programa ImageQuant™ (The Molecular Dinamics, USA).
2.2.4. Ensayos de competición de lactococina 972 y BOCILLIN FL™
Las membranas aisladas como se ha descrito anteriormente (300 µg de proteína
por muestra) se incubaron con lactococina 972 purificada (concentración final 400
UA/ml) durante 1 hora a 30 ºC. La suspensión se sometió a ultracentrifugación
(125.000 g, 60 min., 4 ºC) y el sedimento de membranas se resuspendió en el
volumen inicial de muestra utilizando tampón fosfato (50 mM, pH 7,5).
Posteriormente se adicionó BOCILLIN FL (concentración final 50 µM) y se incubó
durante 30 min a 37 ºC. Las muestras se sometieron a SDS-PAGE, y las PBPs
marcadas se visualizaron de la manera anteriormente descrita.
2.2.5. Obtención y purificación de anticuerpos policlonales
Se obtuvieron anticuerpos policlonales frente a la lactococina 972 y la PBP3 de
E. coli. En el caso de la lactococina 972 se empleó la bacteriocina purificada disuelta
en tampón PBS. La PBP3 se obtuvo después de sobreexpresar el gen pbpB clonado
bajo el control del promotor Pr del fago Ȝ (Ayala et al., 1988), aislándose la banda
correspondiente a esta proteína (110 kDa) a partir de un gel SDS-PAGE de los
extractos celulares.
Se emplearon conejos machos de la raza Nueva Zelanda de unos 3 meses de
edad y aproximadamente 2,5 kg de peso (Granja Cunícola San Bernardo, S.L.;
Navarra), cuidados y mantenidos durante el ensayo por el Servicio de Animalario de
la Universidad de Oviedo. Los animales fueron inmunizados cada 15 días en cada
caso, con aproximadamente 1 mg de proteína mezclado con el mismo volumen de
adyuvante de Freud incompleto (Sigma-Aldrich). Se procedió a su sacrificio a los 4
meses de inmunización mediante anestesia con Nembutal intraperitoneal y posterior
sangrado a muerte por punción cardíaca. Para comprobar la evolución de la
inmunización se recogió una pequeña fracción de sangre, de la vena marginal de la
oreja, a los 2 meses de comenzar el proceso.
Materiales y métodos 41
Los anticuerpos se purificaron siguiendo el método descrito por Harlow y Lane
(1998, cap. 8) y se almacenaron a -20 ºC hasta su utilización.
2.2.6. Enzyme-linked inmunoabsorbent assay (ELISA)
La cuantificación del suero obtenido en el sangrado intermedio y en el final se
realizó mediante un ensayo ELISA (Harlow y Lane, 1998, cap. 14), utilizando como
antígeno la lactococina 972 purificada o extractos totales de E. coli que
sobreexpresan PBP3. Como control negativo de anticuerpos se utilizó suero
preinmune de conejo; como control negativo de antígeno se incluyó seroalbúmina
bovina (BSA). Se empleó como sustrato revelador ortofenildiamina (OPD, Sigma-
Aldrich) y se leyó la absorbancia de las placas a una longitud de onda de 492 nm. El
título de cada muestra de suero se expresó como la dilución máxima cuya
absorbancia es al menos el doble que la misma dilución de suero control preinmune
de conejo.
2.2.7. Hibridación tipo “Western”
Las muestras de proteínas se sometieron a SDS-PAGE como se ha descrito
anteriormente y se transfirieron a membranas Hybond™ ECL mediante
electroelución durante 2 horas a 200 mA. Las membranas se bloquearon durante toda
la noche a 4 ºC utilizando leche desnatada en polvo (Sveltesse, Nestle) al 2 % (p/v).
Las diluciones de los anticuerpos primarios pAblcn972 y pAbPBP3 utilizadas en
los ensayos fueron de 1:1000. Como anticuerpo secundario se utilizó un anticuerpo
monoclonal anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa (monoclonal anti-rabbit
IgG (Ȗ-chain specific)-Peroxidase, Sigma-Aldrich).
Como sistema de detección se utilizó el reactivo ECL+Plus (Amersham
Pharmacia Biotech), y se siguieron las especificaciones del proveedor para la
hibridación, detección y eliminación de los anticuerpos de la membrana para su
posterior uso con otros anticuerpos primarios.
Materiales y métodos 42
2.2.8. Ensayos con el tripéptido antagonista de la vancomicina:
ND-NH-diacetil-L-Lys-D-Ala-D-Ala [(Ac)2KAA]
Para determinar si el modo de acción a nivel molecular de la lactococina 972 es
similar al del antibiótico vancomicina se utilizó el tripéptido antagonista de la misma
ND-NH-diacetil-L-Lys-D-Ala-D-Ala [(Ac)2KAA]. Para ello se siguió el método
descrito por Brötz et al. (1995): a cultivos de L. lactis MG1614 creciendo
activamente se les añadieron diferentes concentraciones de bacteriocina (533 mM – 0
mM) que había sido previamente incubada con un exceso molar de tripéptido (100,
250 y 500). Se midió la OD600 del cultivo durante las tres horas siguientes.
3. Lactococina 972
3.1. Purificación
Para la purificación de la lactococina 972 se siguió el método desarrollado por
Martínez et al. (1996). El sobrenadante de un cultivo de L. lactis IPLA972 en la fase
exponencial tardía se mezcló con 5 volúmenes de acetona a 0 ºC y se incubó durante
un mínimo de 30 minutos a -20 ºC. El precipitado obtenido, una vez resuspendido en
tampón fosfato 50 mM, pH 7,0, se pasó a través de una columna de intercambio
catiónico (High-S, Bio Rad). Para eluir la bacteriocina se utilizó un gradiente de
NaCl (0,1 – 2 M) aplicando un flujo de 1ml/min, y recogiéndose fracciones de 1 ml.
La concentración de proteína se determinó utilizando el reactivo de Bradford
(1976) (Bio-Rad Laboratories).
3.2. Detección de la actividad inhibitoria
La actividad inhibitoria de los sobrenadantes de cultivo de L. lactis y de las
fracciones purificadas de lactococina 972 se evaluó utilizando el test de difusión en
agar (Martínez et al., 1996), definiéndose la unidad arbitraria de bacteriocina
(UA/ml) como el inverso de la dilución más alta que origina un halo de inhibición
perceptible.
Materiales y métodos 43
3.3. Ensayo de inducción de profagos
En este experimento se utilizaron cultivos de L. lactis MG1614 en fase
exponencial crecidos en medio M17-glucosa, a 30º C. Cuando los cultivos
alcanzaron un valor de OD600 de 0.2 se dividieron en tres alícuotas, y a dos de las
cuales se les añadió 20 UA/ml y 40 UA/ml (concentración final) de lactococina 972,
parcialmente purificada, continuándose la incubación en las mismas condiciones
durante tres horas más. Como control se utilizó la alícuota del cultivo a la que no se
le añadió bacteriocina. Pasado este tiempo se eliminaron las células por
centrifugación. Se hicieron diluciones seriadas de los sobrenadantes y se mezclaron
100 µl de cada una con 3 ml de M17-glucosa (conteniendo 0.7% de agar) fundido al
que se habían incorporado 100 µl de cultivo exponencial de las cepas L. lactis
IL1403 o L. lactis F4-2. Estas suspensiones se extendieron sobre placas con M17-
glucosa y se incubaron durante 18 horas, pasadas las cuales los cultivos se
inspeccionaron para detectar placas de lisis en los céspedes de las bacterias utilizadas
como hospedadoras. Alternativamente, se tomaron alícuotas de 5 µl de los
sobrenadantes con los que se realizó PCR en las condiciones expuestas en el apartado
2.1.3, utilizando como cebadores dos oligonucleótidos (PA y PB, Tabla 5) cuyas
secuencias limitan un segmento de 381 pb del gen que codifica para una dUTPasa y
que es el único común a todos los aislados de fagos de la especie P335 de L. lactis
(C. Madera, comunicación personal). Los amplicones obtenidos se separaron en
geles de agarosa al 2%. Como control positivo de la amplificación se usó ADN del
fago P335, y como control negativo, la mezcla de reacción sin adición de ADN.
4. Producción de la lactococina 972 en biorreactor
4.1. Instrumentación
Los ensayos de fermentación, en discontinuo y en continuo, se realizaron en un
biorreactor BIOSTAT B (Braun-Biotech International GmbH) equipado con un vaso
de fermentación de 2 litros de capacidad (Figura 7).
El biorreactor dispone de un sistema de agitación de turbina (modelo Rushton) y
una sonda de temperatura modelo Pt-100. Las sondas de pH (InPro® 3000/225) y pO2
Materiales y métodos 44
(InPro® 600), ambas de la marca Ingold (Metter-Toledo, France), son extraíbles. Los
distintos parámetros fueron monitorizados y controlados en una unidad de control.
Esta unidad está equipada con cuatro bombas peristálticas que regulan
respectivamente la adición de ácido o álcali, de medio de cultivo fresco desde un
reservorio estéril, y el mantenimiento constante del volumen de trabajo.
En ambos tipos de cultivo se utilizaron los siguientes parámetros de reacción:
temperatura de incubación 30 ºC y agitación de 150 rpm. El pH se mantuvo
constante a un valor de 6,8 mediante la adición de NH4OH 2N. Las muestras se
tomaron en condiciones estériles y se procesaron inmediatamente.
4.2. Cultivo en discontinuo
En este caso no se produce ni adición de medio ni eliminación del cultivo del
vaso de fermentación del biorreactor. La incubación se iniciaba inoculando al 2%
(v/v) con un cultivo de una noche de la cepa productora de bacteriocina,
considerando éste el tiempo inicial del ensayo. Las muestras se tomaron estérilmente
a los tiempos indicados y se procesaron en el menor tiempo posible.
sistema de agitación sonda de pH sonda de pO2
reservorio de ácido/base entrada de O2/N2 jarra de
cultivo reservorio del medio reservorio del efluente
Figura 7. Representación esquemática de un quimiostato. Los símbolos son: : filtros de
aire; : bombas peristálticas; : sentido del flujo.
Materiales y métodos 45
4.3. Cultivo en continuo
El volumen de trabajo del biorreactor se mantuvo constante mediante el
funcionamiento ininterrumpido de una de las bombas peristálticas conectada al tubo
de aspiración introducido en el vaso de fermentación hasta el nivel prefijado del
medio de cultivo (700 ml). El cultivo celular retirado se recogió en un reservorio
estéril refrigerado (4 ºC), en el que se mantenía para su posterior centrifugación y
purificación de la bacteriocina producida.
Los ensayos de cultivo continuo se iniciaron en modo discontinuo, inoculando al
2% (v/v) con un cultivo de una noche de la cepa productora de bacteriocina. La
adición del medio fresco y retirada del cultivo se inició cuando se alcanzó la fase
exponencial de crecimiento. Se tomaron muestras estérilmente a las tasas de dilución
de 0,09; 0,24; 0,46; 0,67; 0,89 y 1,11 h-1, y se procesaron en el menor tiempo posible.
Cada ensayo se realizó por duplicado. Se consideró que el cultivo alcanzó el estado
estacionario cuando habían pasado, al menos, tres tiempos de residencia (tres
volúmenes de medio de cultivo a través del vaso de fermentación) y además se
observaba una OD600 constante.
4.4. Medida del crecimiento microbiano
Para la determinación del número de células viables, las muestras de cultivo se
diluyeron en solución Ringer ¼ (Oxoid) y se sembraron por triplicado y en
profundidad en medio M17-lactosa (Biokar).
El cálculo de la biomasa se realizó determinando el peso seco (X, gDCW/L) de
alícuotas de cultivo. Para ello se filtraron 4 ml de muestra a través de un filtro de
nitrato de celulosa previamente tarado (0,45 µm de tamaño de poro y 25 mm de
diámetro) (Whatman) que se lavó posteriormente con 4 volúmenes de agua destilada.
Los filtros se secaron a 85 ºC durante 24 h, y se pesaron nuevamente. La diferencia
entre los dos valores del peso de los filtros se tomó como el peso seco de la muestra.
Las muestras se analizaron por triplicado.
Materiales y métodos 46
4.5. Detección de la actividad inhibitoria
La actividad inhibitoria total de los cultivos de L. lactis IPLA 972 se determinó
sumando los valores obtenidos en la cuantificación de los sobrenadantes de cultivo
más los obtenidos al lavar las células con tampón fosfato sódico 50 mM, pH 7,
durante un minuto, y utilizando un volumen igual al del cultivo. La actividad
inhibitoria se determinó, en ambos casos, mediante el test de difusión en agar antes
descrito (ver Apartado 3.2.).
4.6. Cuantificación de ácidos orgánicos y azúcares
La determinación simultánea de ácidos orgánicos y azúcares se realizó mediante
cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) utilizando el método descrito por
González de Llano et al. (1996), con algunas modificaciones (Cárcoba et al., 2000).
Se utilizó una columna de intercambio iónico HPX-87H Aminex y una precolumna
Microguard H+ (Bio-Rad Laboratories). Las condiciones de trabajo fueron: una
temperatura de 65 ºC y elución isocrática a un flujo de 0,7 ml/min, usando como fase
móvil 3 mM de H2SO4 y un volumen de inyección de 50 µl.
Los detectores utilizados fueron: un detector de fotodiodos alineados (Waters
996) para la determinación de ácidos orgánicos y un detector de índice de refracción
(Waters 410) para la determinación de azúcares, ambos conectados en serie y
controlados por un sistema de software Milenium 2010 (Waters Corporation).
Tanto la cuantificación de azúcares como la de ácidos orgánicos se realizó
utilizando el método del patrón externo.
4.7. Parámetros cinéticos
Los parámetros cinéticos, así como sus expresiones y cálculo se indican en el
Apartado 6 de la Introducción (Teoría del cultivo discontinuo y continuo). En este
apartado nos limitaremos a explicar las fórmulas que hemos utilizado para realizar
los cálculos.
Materiales y métodos 47
En los ensayos de cultivo discontinuo, la tasa de crecimiento máxima (µmax) se
determinó de forma experimental en la fase exponencial de crecimiento del cultivo
como:
tX''
maxP (9)
donde t es el tiempo y X la concentración de la biomasa (g/L). El tiempo de
duplicación (tD) se calculó mediante la siguiente expresión:
max
2lnP
Dt (10)
Para calcular el rendimiento en biomasa (YX/S) se aplicó la siguiente ecuación:
SXY SX '
' / (11)
donde S es la concentración de sustrato (g/L). El cálculo de la productividad en
biomasa (pX) expresada en g L-1 h-1, se determinó utilizando la expresión:
tXPX (12)
El rendimiento en bacteriocina (YB/X, en AU/g) se define como la cantidad de
bacteriocina producida por gramo de biomasa, mientras que la velocidad específica
de producción se expresa como el rendimiento por hora (qB, UA g-1 h-1).
Materiales y métodos 48
En los ensayos en cultivo continuo, los parámetros cinéticos se calcularon en
condiciones de estado estacionario. La productividad en biomasa (pX) se calculó
como:
DXPX � (13)
donde X es el valor de la biomasa cuando se alcanza el estado estacionario y D es la
tasa de dilución. Las velocidades específicas de producción de bacteriocina (qB) se
calculan mediante la fórmula:
XDAUqB�
(14)
donde AU son las AU/L del cultivo.
4.8. Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete de programas
STATISTICA (ver. 5.5, Statsoft, Inc., USA).
Los datos relativos a la producción en biomasa en cultivo continuo se
sometieron a análisis de la varianza de un factor (ANOVA).
RESULTADOS
Resultados 49
III. RESULTADOS
1. CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DEL
OPERÓN DE LA LACTOCOCINA 972
1.1. Análisis de la secuencia del plásmido pBL1
La biosíntesis de la lactococina 972 está codificada por un operón que se
encuentra localizado en el plásmido pBL1 (Martínez et al., 1999). Como paso previo
al análisis funcional de dicho operón se procedió a la secuenciación completa del
plásmido (Sánchez et al., 2000). Dicha secuencia ha sido depositada en la base de
datos GeneBank, con el número de acceso NC_004955 (Figura 8).
El análisis de la secuencia reveló que el contenido medio en G+C del plásmido
es del 33 %, siendo este valor similar al encontrado en otros plásmidos de lactococos
(van Kranenburg et al., 2000; Dougherty et al., 1998). Sin embargo, la proporción de
G+C no es homogénea en todo el plásmido variando entre el 27 %, que presenta el
gen lclB, y el 40 % del gen estructural de la lactococina 972 (lclA).
El estudio de la estructura del plásmido revela dos aspectos importantes. En
primer lugar, se observa una asimetría en la distribución de los sitios de restricción,
encontrándose la mayoría dentro del operón de la lactococina 972, que comprende
los genes lclA, lclB y lclC, aunque curiosamente no se encuentra dentro de éste
ningún sitio de restricción Sau3AI. En segundo lugar, los genes de este operón junto
con el gen orf4 se encuentran flanqueados por dos secuencias de inserción parciales
Resultados 50
(ǻISS1 y ǻISS1CH) y una secuencia de inserción completa (ISS1) (Polzin y
Shimizu-Kadota, 1987; Huang et al., 1992), lo que sugiere que este plásmido podría
ser un mosaico generado a partir de la fusión de dos replicones diferentes.
1.2. Análisis estructural del operón de la lactococina 972
Los genes lclA (que codifica para el prepéptido de lcn972), lclB y parcialmente
lclC ya habían sido identificados en estudios anteriores (Martínez et al., 1999). El
análisis posterior de toda la secuencia de nucleótidos de pBL1 nos permitió conocer
la secuencia completa de lclC y comprobar que a continuación no existía ninguna orf
adicional (Figuras 8 y 9). Delante de las tres orfs se encuentra un único promotor
funcional seguido de dos secuencias invertidas. Además, cada orf se encuentra
precedida de un posible sitio de unión a ribosoma a la distancia adecuada para
comenzar la traducción.
pBL110897 bps
BglIINcoI
SacI
EcoRV
HindIII
AvaIClaI
PstI
SacIPstI
HindIII
AvaI
XbaI XbaI XbaI
XbaI
'ISS1CH
'ISS1
orf4
lclA
lclBlclC
ISS1 'ISS1
orfX
repB
Figura 8. Diagrama de pBL1, plásmido de L. lactis IPLA972 que contiene los genes para la producción e inmunidad de la lactococina lactococina 972. Número de acceso a GeneBank NC_004955.
Resultados 51
. . . . . . · TCATTTATTCGCCATAAATAACGTTTTTTCGAACTATTTTACTGGACGAAACTAGAGAGTGTCTCAACCA 70 . . . . . . · CGGTCTTTTCGTTTGAATTAACTTTCCGAAAAAGACAAGTTTTCATGAAAATATTAAAAATTCTTTATTC 140 . -35 . -10 . . . TTCATATATGTGAATATTGACACAAAAAAACAAAAATGATAAAATTATATTTGTAGGCGCTCTCTTGCAT 210 . . . . . rbs . AGTGAGATGTGCTTATTAATCTCATATTTACTGAGATTAAACTTTTATAATTTATGGAGGATTCTATATG 280 lclA ¾ M . . . . . . . AAAACCAAGTCTCTCGTATTGGCATTATCTGCGGTTACGTTATTCTCTGCCGGAGGAATTGTAGCTCAAG 350 K T K S L V L A L S A V T L F S A G G I V A Q . . . . . . . CTGAAGGAACATGGCAACATGGATATGGTGTTAGTTCGGCATATTCAAATTATCATCATGGTAGCAAAAC 420 A E G T W Q H G Y G V S S A Y S N Y H H G S K T Ĺ . . . . . . . TCATTCAGCCACAGTTGTAAATAATAATACTGGCCGACAAGGTAAGGATACACAACGTGCCGGTGTTTGG 490 H S A T V V N N N T G R Q G K D T Q R A G V W . . . HindIII . . . GCAAAAGCTACTGTTGGACGTAACTTAACTGAAAAAGCTTCATTTTATTATAACTTTTGGTAAAATTAAA 560 A K A T V G R N L T E K A S F Y Y N F W * . . . rbs . . . AAGCTAAGGCTTAGCTTAGCTTTAGCTTTTTAATAAAGAGGGATTTATATGTATAAAAAACTAGAAAGAG 630 lclB ¾ M Y K K L E R . . . . . . . TATTAATTACCTTATCTATTGTACTGGTTTCAGCTTTTTCCATGATAATAGTTATTAATAAGCACAAACA 700 V L I T L S I V L V S A F S M I I V I N K H K Q . . . . . . . AATGTTTGCTGGTACTAATGGAGGAGTCCTTGTTCTAAAAGCCAAAAGTAACATAAAAGAATCTATAGCT 770 M F A G T N G G V L V L K A K S N I K E S I A . . . . . . . GAAATCGCCAAAAAAAATAATGTTCTAATTGCTAAACAAATAATGGTTCCTAGTACGGATGGAAAAACGG 840 E I A K K N N V L I A K Q I M V P S T D G K T . . . . . AvaI . . ATAATCAGCCTACATTTCAAAAATTTGGGAACGGAACCCTTCCCAAAGATTTTCCCGAGCAAAAGAATAA 910 D N Q P T F Q K F G N G T L P K D F P E Q K N K . . . . . . . AGAATTTATTGAAGATAGTAATGATTCTGTTTACTACTTTATATTTGGAAAAACTTTAAGTTCAATTGAT 980 E F I E D S N D S V Y Y F I F G K T L S S I D . . . . . . . TTATCTAAATATTTAAATGAGAAAGGCAATACTTCAATGGTCTCTGATAATGATTGGAGATTTCAAGGAA 1050 L S K Y L N E K G N T S M V S D N D W R F Q G . . . . . . ClaI . TTACTGCATTACTTGACACTCGGATGATTGTTGGATTATTGTTATTTCTTATTTCTTACACATCGATATT 1120 I T A L L D T R M I V G L L L F L I S Y T S I L . . . . . . . AATGGCTAATATTATAATAAATTTAAAAAAACAAGGTGTTCAACGTTTAGCTGGAATTTCTTGTTTTAGA 1190 M A N I I I N L K K Q G V Q R L A G I S C F R . . . . . . . CTATCTTTTTTAGGCCTTAAAAAGCGACTAACTTATATATTTATTACAACAATCATTACTTTATTAACAA 1260 L S F L G L K K R L T Y I F I T T I I T L L T . . . . . . . GTAGTTTGATTCTTTACATTATAAATCTCAGAAGAATAATGTATTTTTATGTAATTATTTTTCCAACTAT 1330 S S L I L Y I I N L R R I M Y F Y V I I F P T I . . . . . . PstI . ATTTATAGTATTAGTCTTACTTTTGATTGAGTTAATCGTTGGAATTTTAGTTTATTTATTTCTGCAGAGA 1400 F I V L V L L L I E L I V G I L V Y L F L Q R . . . . SacI . . . CAAAAAATAAATCTTGTAATAAAAGATATGGCTCCAATAAGAGCTCTAATGAGTTTCGTCTTTTTACTAC 1470 Q K I N L V I K D M A P I R A L M S F V F L L
Resultados 52
. . . . . . . AATTAATTTCCCTCCTCTGTCTTATTTTTTCTTTTTCAAGCATCAGTTCATCACACAAAGATTTGGTATT 1540 Q L I S L L C L I F S F S S I S S S H K D L V L . . . . . . . ATTGAAGAAAGCAACCAATAAATGGAAATCACAAGATTATTATTCTCCTAGTCTATTAAATGGAAATACA 1610 L K K A T N K W K S Q D Y Y S P S L L N G N T . . . . . . . GAAAAATCTAAAGAGAATGTATTAAGATTTTTATCTGAAGCGAATCAAAAAGAAGAAGTCTTAATAATTG 1680 E K S K E N V L R F L S E A N Q K E E V L I I . . . . . . .
CAGATAACTTTAATAAGTATCCATTACAAAACCAATATTTTCCAACCAGCAATGGAAATGAAAATATCCT 1750 A D N F N K Y P L Q N Q Y F P T S N G N E N I L . . . . . . . TTATGTAACCCCTAACTATCTAAAGAAAGTTGGAATTAAATTTAATAACACTATGAAAAGTGATATTACT 1820 Y V T P N Y L K K V G I K F N N T M K S D I T . . . . . . . ATTTTAGTTCCTGAGACTGAAAAATCGCGTAAAAATAAATTATCAACTTTATGGTCACAAGCATTCAACT 1890 I L V P E T E K S R K N K L S T L W S Q A F N . . . . . . . CTTTAAATGAAACATCTTTCAGTTATAATTCTAGCGTTTATAAATCGCCCTCAAAAGACCTATTCACTTT 1960 S L N E T S F S Y N S S V Y K S P S K D L F T F . PstI . . . . . CCGCATTTTTGGCTGGTCTGCAGTAGATAATCAGGCATTTGTTCAAGAACCTTTAATTGTCGTTATGTCA 2030 R I F G W S A V D N Q A F V Q E P L I V V M S . . . . . . . CCTAAACTCTTTAATATTAACAATAAAAACATTAACAGTGACGTTTTATTTTCTTGGTTTAGTCGTGAAC 2100 P K L F N I N N K N I N S D V L F S W F S R E . . . . . . . AAATTTTATTTTCCAATAACAAAACAACAGCAGATTTGATAAAAAAATATAGGTTAGAAAACGTTCTAGG 2170 Q I L F S N N K T T A D L I K K Y R L E N V L G . . . . . . . TTCTTTTTCAAATGGAAATTTGTCTGTCAAAAATAGATTTGTAGAAATAAAATCACAACAACTATTTATA 2240 S F S N G N L S V K N R F V E I K S Q Q L F I . . . . . . . GTTGTTACCTCAAGTATAGCTTTGATTAGCTCTACATTTTTATTTTATCTTATGAATAAAATCTATCTCT 2310 V V T S S I A L I S S T F L F Y L M N K I Y L . . . . . . . ATCAAAATAGAAAAAAATTTGCAGTAGCTCGAATATCTGGCGAGTCTCTGTTTACTACGCATAAAACTTA 2380 Y Q N R K K F A V A R I S G E S L F T T H K T Y . . . . . . . CTTAATTCAACTATTCATAATTATTATTTTCGCAATAGGAATGATTTTTATTTGGCACTTAAATCCATTA 2450 L I Q L F I I I I F A I G M I F I W H L N P L . . . . . . . ACCCTCATAATTCCTCCAATTTTAGGAGGTTTGCAGCTAATACTTTTAACAAGACAAATAAAAAATAATA 2520 T L I I P P I L G G L Q L I L L T R Q I K N N . . rbs . . . . AAACATTTAATATTTCCGTTTTGAAAGGGGAGTAATGTGATTGAATTAAAAAATATTGAAAAATCTTACG 2590 K T F N I S V L K G E * lclC ¾ M I E L K N I E K S Y . . . . . . . ATAATCATAATATTTTACATAATTTTAACTACCAATTTAAAGATAATAAAAGTTATGCCTTAGTAGGAAA 2660 D N H N I L H N F N Y Q F K D N K S Y A L V G . . . . . . . ATCTGGTTCAGGGAAAACAACACTACTTAATATCATCGGAAGACTAGAACTTCCAGACAAAGGTGATATA 2730 K S G S G K T T L L N I I G R L E L P D K G D I . . . . . . . TTGATAGATGATGATAACTTAAAAACAATTCCTGAGAGAAGATACTTCAAAGATTATCTTGGATATTTAT 2800 L I D D D N L K T I P E R R Y F K D Y L G Y L . . . . . . . TTCAAAACTATGGTTTAATAGATAACGAGAGTATAAAAGACAATTTAAAATTAGCTTTTATTGGAAAAAA 2870 F Q N Y G L I D N E S I K D N L K L A F I G K . . . HindIII . . . GTTAAAAAATCAGGACCAAGAAATTATAATGTCTAAAGCTTTAAGTAAAGTTGGGCTAGAAAATTATAAC 2940 K L K N Q D Q E I I M S K A L S K V G L E N Y N
Resultados 53
. . . . . . . ATAGATAGAAAAATTTTTTCATTATCCGGAGGAGAAGCGCAACGTGTTGCTATAGCAAAGTTAATTATAA 3010 I D R K I F S L S G G E A Q R V A I A K L I I . . . . . . . AAAGTCCACCAATTATTTTGGCTGATGAACCGACAGGTTCATTAGATAGAGAAACTGGAAAAGAAGTGAT 3080 K S P P I I L A D E P T G S L D R E T G K E V . . . . . . . GGATATACTTCTAAGTTTAGTTAAGGAAAATACTACTGTTATTATCGCTACGCATGATTCACATGTGTAC 3150 M D I L L S L V K E N T T V I I A T H D S H V Y . . . . . . . AATCGTGTAGATTCTATAATTAATCTATAAGAGTTTCACTAAACTTTTTTCGAGGGACGAGAAAAACAAA 3220 N R V D S I I N L * . . . . . . . AGAGACGGGTAAACCGTCTTTTTTTGCTTGCTTGGGGTCTGGGGCAAACGCCCCATTTTGCCAACTGAAA 3250
Figura 9. Secuencia del operón de la lactococina 972 y regiones adyacentes. -10 y -35: secuencias promotoras consenso; Ɣ: sitio de inicio de la transcripción; ĺĸ: posición de secuencias invertidas; rbs: secuencia consenso de unión al ribosoma; Ĺ: sitio de procesamiento del péptido señal de la bacteriocina; *: triplete de parada de la traducción. Se indican las secuencias diana de los enzimas de restricción.
Todos estos datos, junto con el hecho de que lclA codifica para el gen estructural
de la lactococina 972, sugieren que estas tres orfs pueden formar el operón que
regularía tanto la síntesis como la inmunidad de la lactococina 972.
Entre el nucleótido de inicio de la transcripción situado en la posición -85
(Martínez et al., 1996) respecto al punto de inicio de la traducción de lclA y el sitio
de unión a ribosoma (rbs) de dicha orf aparecen dos secuencias invertidas
parcialmente solapadas que poseen una energía libre (ǻG) de -15 y -20 kcal/mol,
respectivamente (Figura 9). Estas secuencias podrían estar implicadas en procesos de
regulación de la expresión o bien en la estabilidad del ARNm resultante de la
transcripción del operón. El estudio de la secuencia de este transcrito, utilizando el
programa MFold, desde su inicio hasta el sitio de unión a ribosoma de lclB (nt
número 598) predice moléculas de ARNm con estructuras secundarias muy estables
(ǻG > -100 kcal/mol) (Figura 10). Estas moléculas presentan una serie de
características comunes:
1. En el extremo 5’ del ARNm, correspondiente a la región que no va a ser
traducida (denominada 5’-UTR, untranslated region), nos encontramos
con una organización típica con varias estructuras en horquilla (dos
como mínimo) seguidas de la región de unión al ribosoma (Rauhut y
Klug, 1999).
Resultados 54
2. En el extremo 3’ del ARNm también existe otra región que no participa
en la traducción (3’-UTR, untranslated region) pero que también está
implicada en la estabilidad del ARNm, aunque en este caso es muy
difícil distinguir si estas estructuras en horquilla son terminadores de la
transcripción rho-independientes (Platt, 1986) o estructuras
estabilizadoras del ARNm.
El codón de inicio de la traducción del gen lclB (AUG) se encuentra precedido
por un posible sitio de unión a ribosoma (GAGGGA), y en su extremo 3’ (a unos 60
pb desde la señal de parada UGA) encontramos dos secuencias invertidas, de las que
una está incluida dentro de la otra, que poseen un ǻG de -22 y -16 kcal/mol,
respectivamente.
Figura 10. Dos posibles estructuras secundarias del ARNm de lclA. Con una flecha roja se señala el sitio de inicio de la transcripción (G). La secuencia consenso de unión al ribosoma (rbs) se señala mediante una flecha azul; esta región correspondería al 5’-UTR (ver texto). La flecha verde indica el lugar del codón de parada y la flecha magenta el final del transcrito de ARNm; ambas flechas limitan la región 3’-UTR (ver texto). Los valores de ǻG para ambas estructuras son: A) -104,73 kcal/mol; B) -105,93 kcal/mol
B)
Resultados 55
El codón de inicio de la traducción del gen lclC (GUG) está en pauta con el
codón de parada de lclB. Al igual que en el resto de las orfs está precedido por un
posible sitio de unión al ribosoma (GAAAGGGGAG). Además, 40 pb después de su
codón de parada encontramos dos pares de secuencias invertidas, de las que, sobre
todo la primera, podrían actuar como terminadores rho-independientes, debido a la
cola de uridinas que presenta. Dichas repeticiones invertidas poseen ǻGs de -4,20 y -
4,10 kcal/mol, respectivamente.
El estudio de la estructura secundaria del ARNm del operón completo de la
lactococina 972 (3086 nt), utilizando el programa MFold, da lugar a más de 60
estructuras posibles, las cuales presentan valores de ǻG superiores a 600 kcal/mol.
1.3. Estudio de las secuencias de proteínas
1.3.1. LclA
El producto de lclA (lcn972) es un polipéptido de 91 aminoácidos que posee un
sitio de procesamiento en su residuo Ala-25, que ha sido confirmado mediante la
secuenciación del péptido maduro (Martínez et al., 1996; Martínez et al., 1999).
En el presente estudio se llevó a cabo el análisis del perfil de hidrofobicidad de
la prebacteriocina, habiéndose encontrado dos partes claramente diferenciadas
(Figura 11A). El extremo amino-terminal, que correspondería al péptido señal es
predominantemente hidrofóbico, mientras que el resto de la molécula es claramente
hidrofílico. Dicho péptido señal contiene todos los elementos necesarios para que la
proteína sea exportada a través del sistema general de secreción (SEC) de la célula
(Pugsley, 1993). Así podem
1. el dominio N, hidrofílico, posee dos aminoácidos cargados
os reconocer en él los tres dominios característicos
(Figura 11B):
positivamente (lisinas),
2. el dominio H, apolar, formado predominantemente por residuos
hidrofóbicos. Muestra un alto contenido en alanina y leucina, lo que hace
que el péptido señal adopte una estructura de Į-hélice en ambientes
apolares,
Resultados 56
3. el dominio C, menos hidrofóbico que el dominio H, y que contiene la
secuencia Ala-X-Ala que es reconocida por la peptidasa del sistema
general de secreción. Asímismo, al inicio del dominio C aparecen dos
residuos G, los cuales forman un giro en la Į-hélice, cuya función parece
ser la de hacer accesible el sitio de corte del dominio C a la peptidasa
señal.
El péptido maduro posee una longitud de 66 aminoácidos cuyo peso molecular
teórico (7,381 kDa) coincide con el estimado mediante SDS-PAGE-tricina (Martínez,
1996) y mediante espectrometría de masas (7,383 kDa; Martínez, comunicación
personal). Como ya hemos señalado antes, el gen lclA presenta el mayor contenido
en G+C (40 %) de todo el plásmido pBL1, debido a un alto contenido en tripletes que
codifican para alanina y glicina. La abundancia de estos aminoácidos pequeños es
característico de las bacteriocinas de Clase II y les confiere un alto grado de libertad
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
1 91 23 46 69
Hid
rofo
bici
dad
Número de aminoácidos
M K T K L V L A L S A V T L F S A G G I V A Q A Figura 11. A) Perfil de hidrofobicidad de pre-lcn972. La secuencia se analizó utilizando una ventana de 6 aminoácidos y el método de Kyte y Doolittle (1982). B) Dominios del péptido señal de la lactococina 972. En amarillo el dominio H, en azul el dominio N y en verde el dominio C. Se muestra subrayados los aminoácidos que son reconocidos por la peptidasa del SEC.
A)
B)
Resultados 57
conformacional (Kaiser y Montville, 1996). Además, lcn972 es un péptido muy
básico (con un pI teórico de 9,7), otra característica común a las bacteriocinas de
Clase II, cuyos pIs varían entre 8 y 11,1, aunque a diferencia de ellas no muestra
regiones claramente hidrofóbicas.
1.3.2. LclB
El producto de lclB es una proteína de 648 aminoácidos (74,139 kDa), con un
punto isoeléctrico teórico de 9,81. El análisis del perfil hidropático revela la
presencia de varios segmentos hidrofóbicos, lo cual nos indica que posiblemente
LclB sea una proteína de membrana.
Para predecir la topología de LclB utilizamos cuatro programas diferentes:
TopPred2, TMpred, HMMTOP ver 2.0. y SOSUI. Tres de estos programas
(TopPred2, TMpred y SOSUI) propusieron siete segmentos transmembrana
(numerados de I – VII, Figura 12) mientras que HMMTOP predijo ocho (numerados
de 1 – 8, Figura 12). Podemos observar que los seis primeros segmentos son casi
idénticos, tanto en posición como en longitud, discrepando los programas en la parte
C-terminal de la molécula. De acuerdo con los programas TopPred2, TMpred y
SOSUI, en esta parte sólo existe un segmento transmembrana, aunque en el caso del
programa SOSUI este segmento se encontraría situado en una posición intermedia
entre los segmentos 7 y 8 predichos por el programa HMMTOP (602 – 624).
Además, los programas TopPred2 y SOSUI predicen que el extremo amino se
encuentra en el exterior de la célula, mientras que los otros dos suponen que se
encuentra en el interior. Esta diversidad de predicciones no es sorprendente puesto
que se ha observado que la topología de estas proteínas de membrana no es fácil de
predecir mediante algoritmos, siendo necesaria cierta evidencia experimental
mediante fusiones con enzimas, como por ejemplo PhoA y LacZ (Franke et al.,
1999).
A la vista de las distintas predicciones, cabría preguntarse ¿cuál de todas estas
configuraciones es la más factible?. Para obtener una respuesta estudiamos cuál de
todas ellas sigue la regla “positive-inside” (von Heijne, 1992), que establece que las
hélices transmembrana se distribuyen de tal modo que los lazos de la región
Resultados 58
citoplasmática tienen mas cargas positivas que los lazos en la zona exterior de la
célula. El resultado de este estudio indica que la configuración más probable de LclB
es la indicada por el programa TMPred, cuya estructura se representa esquematizada
en la Figura 13.
1.3.3. LclC
La proteína codificada por lclC tiene una longitud de 205 aminoácidos (23,160
kDa), con un punto isoeléctrico teórico de 6,11. El análisis de la secuencia de
aminoácidos reveló la presencia de los motivos de Walker A (GXXGXGKS/T) y B
(hhhD seguido por DEA/PTSALD o similar), donde X es cualquier aminoácido y h
es un aminoácido hidrofóbico (Walker et al., 1982) (Figura 14A). Estos motivos se
I 1 MYKKLERVLI TLSIVLVSAF SMIIVINKHK QMFAGTNGGV LVLKAKSNIK 1 51 ESIAEIAKKN NVLIAKQIMV PSTDGKTDNQ PTFQKFGNGT LPKDFPEQKN 101 KEFIEDSNDS VYYFIFGKTL SSIDLSKYLN EKGNTSMVSD NDWRFQGITA II 151 LLDTRMIVGL LLFLISYTSI LMANIIINLK KQGVQRLAGI SCFRLSFLGL III 2 IV 201 KKRLTYIFIT TIITLLTSSL ILYIINLRRI MYFYVIIFPT IFIVLVLLLI 3 V 4 251 ELIVGILVYL FLQRQKINLV IKDMAPIRAL MSFVFLLQLI SLLCLIFSFS 5 301 SISSSHKDLV LLKKATNKWK SQDYYSPSLL NGNTEKSKEN VLRFLSEANQ 351 KEEVLIIADN FNKYPLQNQY FPTSNGNENI LYVTPNYLKK VGIKFNNTMK 401 SDITILVPET EKSRKNKLST LWSQAFNSLN ETSFSYNSSV YKSPSKDLFT 451 FRIFGWSAVD NQAFVQEPLI VVMSPKLFNI NNKNINSDVL FSWFSREQIL VI 501 FSNNKTTADL IKKYRLENVL GSFSNGNLSV KNRFVEIKSQ QLFIVVTSSI VII 551 ALISSTFLFY LMNKIYLYQN RKKFAVARIS GESLFTTHKT YLIQLFIIII 6 601 FAAIIGGMMIIFFIIWWHH LLNNPPLLTTLLIIIIPPPP IILLGGGGLQLILL TRQIKNNKTF NISVLKGE 7 8 Figura 12. Localización de los segmentos transmembrana de LclB: segmentos predichos por los programas TopPred2 y TMpred (numerados I-VII); segmentos predichos por el programa HMMTOP (numerados de 1-8); en negrita se indica la posición del segmento 7 predicha por SOSUI.
Resultados 59
encuentran altamente conservados en las proteínas que unen ATP-GTP (Fath y
Kolter, 1993).
Además de estos motivos, encontramos en LclC una secuencia altamente
conservada (LSGG) denominada “signature sequence” o péptido de unión (Figura
14A), característica de todos los miembros de la superfamilia de transportadores
ABC (Ames et al., 1990; Higgins et al., 1988), cuya función parece ser la de
transmitir las señales desde el NBD (Nucleotide Binding Domain) al TMD
(TransMembrane Domain) (Borges-Walmsley et al., 2003). También encontramos
en LclC otros dominios o regiones conservadas (Saurin et al., 1999), identificadas
mediante comparación de las posibles estructuras secundarias de algunos módulos
NBD con las estructuras tridimensionales bien conocidas de algunas enzimas que
hidrolizan ATP. Son la región Switch (con un residuo histidina altamente
conservado a una distancia de 25 aminoácidos del motivo Walker B) denominada así
por analogía con la secuencia en la proteína RecA, y que juega un papel en la
propagación de los cambios de conformación que siguen a la hidrólisis de ATP; y el
dominio helicoidal, con los residuos conservados Q y N, implicados en el transporte
del ATP (Mourez et al., 1997) (Figura 13A y B).
III IIIIII
IIIIIIIII IIIVVV
VVVVVVIII
VVVIIIIII IIIIIIIII IIIVVV
VVV III IIIIII
citoplasma
exterior
Figura 13. Posible representación de LclB, utilizando las predicciones del programa TMpred.
Resultados 60
1.4. Comparación de las secuencias deducidas
de las proteínas Lcl con las depositadas en las bases de datos
Con objeto de dilucidar las posibles funciones de las proteínas que forman parte del
operón de la lactococina 972 procedimos a realizar la búsqueda de homologías en las
bases de datos.
LclA muestra muy baja homología con otras proteínas, sin embargo, LclB y LclC
muestran alta homología y dominios conservados con otras proteínas, de acuerdo con los
resultados obtenidos por los programas blastp y rpsblast.
LclA presenta homología con las proteínas NP_358194 de St. pneumoniae R6,
NP_344656 de St. pneumoniae TIGR4, NP_3741525 y NP_395555 de S. aureus subsp.
aureus N315 (Figura 15). Todas estas proteínas poseen un tamaño entre 90 y 110
aminoácidos, un posible péptido señal del tipo SEC y, excepto NP_358194, poseen pIs
A)
MIELKNIEKSYDNHNILHNFNYQFKDNKSYALVGKSGSGKTTLLNIIGRL 50
Walker A
ELPDKGDILIDDDNLKTIPERRYFDYLGYLFGNYGLIDNESIKDNLKLAF 100
IGKKLKNQDQEIIMSKALSKVGLENYNIDRKIFSLSGGEAQRVAIAKLII 150 dominio helicoidal ABC-signature
SPPIILADEPTGSLDRETGKEVMDILLSLKENTTVIIATHDSHVYNRVD 200
Walker B región Switch
SIINL 205
B)
Q N H
Figura 14. A) Localización de los motivos A y B de Walker (x, cualquier residuo; h residuo hidrofóbico), el péptido de unión (LSGG) y los residuos conservados de la región Switch. B) Dominios y secuencias conservadas en los módulos ABC. El módulo ABC se representa mediante la línea horizontal, con el extremo amino a la izquierda. Las secuencias consenso se representan mediante rectángulos: Walker A y Walker B, péptido de unión y dominio helicoidal. También se representan el centro activo (con los residuos de glutamina y asparagina altamente conservados) en el dominio helicoidal, así como motivo Switch con el residuo histidina, cerca del extremo C-terminal.
Resultados 61
A)
66LclA_- 70NP_344656_- 74NP_358194_- 70NP_371556_- 70NP_395555_-
.......EGTWQHGYG..VSSAYSNYHHGSKTHSATVVNNNTGRQGKDTQRAGVWAKATVGRNLTEKASFYYNFW
...VWVEGGQWNYGVGWTGTFGYSDYLHSTRYHTATVR..HGGRTSKDYAKPEAWARASLTKIPPTGMEYFYGFE
.AVQYPDGGVWTYGEGSGGGWAFSNYYHGKKYHYSSIVSRWDGHSDKGEAPAGKTSYAWIWTKWGEQVAFYYDYD
.STEYAEGGTWSHGVG..SKYVWSYYYHGHKGHGATAIGKYRSFSG..YTRAGVKAKASATKHNCWVNRAYYNIYAATVHVAGGVWSHGIG..KHYVWSYYSHNKRNHGSTAVGKYSSFSG..VARPGVQSKASAPKAWGGNKTFYSLH
GGGGG
WWWWW
GGGGG
GGGGG
SSSSS
YYYYY
HHHHH
HHHHH
AAAAA
B)
LclA_-
NP_371556_-
NP_395555_-
NP_358194_-
NP_344656_-
100% 20%80% 60% 40%
C) Lcn972 L. lactis IPLA972 NP_358194 St. pneumoniae R6 NP_344656 St. pneumoniae TIGR4 NP_374152/NP_395555 S. aureus N315 Figura 15. A) Alineamiento múltiple de los péptidos relacionados con LclA. NP_344656: St. pneumoniae TIGR4; NP_358194: St. pneumoniae R6: NP_374152; S. aureus subsp. aureus N315; NP_39555: S. aureus subsp. aureus N315. Los aminoácidos comunes a todas las secuencias (100% homología) se muestran en negro. Se utilizó el programa DNAman (matriz BLOSUM62).Todos ellos presentan un 49,33 % de identidad. Se muestran sombreados los aminoácidos conservados. B) % Homología entre los diferentes péptidos. C) Organización del entorno de los genes que codifican para proteínas homólogas a LclA. Se indica el número NP de acceso a la base de datos GeneBank de las proteínas homólogas a LclA, y la especie y cepa que contiene los genes. Los genes no están representados a escala. LclA; Proteína similar a LclA; LclB; proteñina del COG4562 LclC; proteína del COG1136
LclA NP_344656 NP_358194 NP_374152 NP_395555
LclA
NP_374152
NP_395555
NP_358194
NP_344656
LclA
NP_374152
NP_395555
NP_358194
NP_344656
66LclA_- 70NP_344656_- 74NP_358194_- 70NP_371556_- 70NP_395555_-
.......EGTWQHGYG..VSSAYSNYHHGSKTHSATVVNNNTGRQGKDTQRAGVWAKATVGRNLTEKASFYYNFW
...VWVEGGQWNYGVGWTGTFGYSDYLHSTRYHTATVR..HGGRTSKDYAKPEAWARASLTKIPPTGMEYFYGFE
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Figura 15. A) Alineamiento múltiple de los péptidos relacionados con LclA. NP_344656: St. pneumoniae TIGR4; NP_358194: St. pneumoniae R6; NP_374152 y NP_39555: S. aureus subsp. Aureus N315. Los aminoácidos comunes a todas las secuencias (100% homología) se muestran en negro; en rosa los que presentan una homología del � 75%; y en azul � 50% de homología. Se utilizó el programa DNAman (matriz BLOSUM62). Todos ellos presentan un 49,33% de identidad. B) % de homología entre los diferentes péptidos. C) Organización del entorno de los genes que codifican para proteínas homólogas a LclA. Se indica el número NP de acceso a la base de datos GeneBank de las proteínas homólogas a LclA, y la especie y cepa que contiene los genes. Los genes no están representados a escala. LclA; proteína similar a LclA; LclB; proteína del COG4562; LclC; proteína del COG1136.
Resultados 62
teóricos muy básicos (mayores de 9), y perfiles de hidrofobicidad muy parecidos a LclA
(datos no mostrados). El alineamiento de sus secuencias (Figura 15A) muestra una
identidad del 49,33 %. Se observan dos secuencias consenso: G-X-W-X2-G-G y S-X-Y-
X-H-X4-H en el extremo amino de las proteínas maduras. La búsqueda de patrones
similares mediante el programa ScanProsite no proporcionó ningún resultado
concluyente. En la Figura 15B se muestra el grado de homología entre las diferentes
proteínas. LclA se parece más a las proteínas de S. aureus (35 %) que a las de St.
pneumoniae (32 %), a pesar de que la cepa productora de lactococina 972 está más
relacionada filogenéticamente con esta última especie.
Al analizar el entorno genético de estas proteínas dentro de los genomas de los
microorganismos (Figura 15C) observamos que preceden a una proteína integral de
membrana (con 7 segmentos transmembrana) seguida de una proteína de unión a ATP.
Es decir, tienen la misma organización genética que el operón de la lactococina 972. Un
estudio detallado de estas proteínas de membrana reveló que pertenecían al COG número
4652 (COG4652), en el cual también está incluida la proteína LclB.
Todas las proteínas pertenecientes al COG4562 tienen una longitud de entre 644 y
713 aminoácidos. El alineamiento múltiple de sus secuencias indica que poseen una
identidad del 35,9 % en su parte carboxi-terminal (136 – 146 aminoácidos) (Figura 16).
El alineamiento de esta región muestra una secuencia altamente conservada: Y-F-X3-(R,
K)2-X-(L, I, F)-X-(I, V, L)-(K, R)2-(L, I)-X-G, donde el aminoácido glicina está presente
de forma invariable en todas las secuencias. Esta secuencia posee una proporción de
aminoácidos hidrofílicos del 37,5 % (de los cuales el 25 % poseen carga positiva a pH 6,0
y el resto son neutros) y una proporción del 25 % de aminoácidos hidrofóbicos. Además,
está secuencia consenso se encontraría localizada entre los segmentos transmembrana 6 y
7, en el interior celular. La búsqueda de patrones utilizando el programa ScanProsite no
proporcionó ningún resultado.
La proteína LclC posee homología con un elevado número de proteínas de unión
a ATP, y en particular con las pertenecientes a la familia de los transportadores de
tipo ABC. Esta proteína se encuentra incluida en los COG1136 y COG2884.
El COG1136 agrupa a todas las proteínas de unión a ATP que forman parte de
los transportadores de tipo ABC y que están implicadas en el transporte de péptidos
Resultados 63
antimicrobianos. En la Figura 17A se representa el alineamiento de estas secuencias
que presenta una identidad del 57,79 %. La proteína representativa de este COG es
SalX que forma parte del transportador de la salivaricina A. Estos sistemas de
transporte no poseen componentes periplasmáticos. Además, el dominio de unión a
ATP se encuentra fusionado con el dominio transmembrana en la mayoría de los
sistemas.
En el COG2884 se encuentran incluidas las proteínas FtsE (o relacionadas con
ella). FtsE es una proteína hidrofílica que une ATP (ATPasa) que se asocia a la
563LclB 626NP_241146 577NP_266165 574NP_268176 606NP_344657 587NP_345191 169NP_346383 591NP_346415 587NP_358195 569NP_371557 569NP_374153 559NP_395556
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Figura 16. Alineamiento múltiple del extremo carboxi-terminal de las proteínas pertenecientes al COG4562. B. halodurans; NP_268176: L. lactis IL1403; NP_345191, NP_ 346283 y NP_346415: St. Pneumoniae TIGR4; NP_374153 y NP_395556: S. aureus N3115; NP_371557: S. aureus Mu50; NP_358195: St. Pneumoniae R6. Las secuencias tienen una identidad del 35,9 %. Los aminoácidos conservados (100 % homología) se muestran sombreados en negro; en rosa los que presentan una homología del � 75 %; y en azul de � 50 % de homología. Se utilizó el programa DNAman (matriz BLOSUM62).
Resultados 64
A) 75LclC 75NP_268175 73NP_241147 76NP_266166 73NP_395558 76NP_345192 74NP_346384 75NP_346414 73NP_374155
MIELKNIEKSYDN....HNILHNFNYQFKDNKSYALVGKSGSGKTTLLNIIGRLELPDKGDILIDDDNLKTIPERRYFK.MFELTNIIKEFLH....RKVFDNFKLTFEAGKVYAIIGQSGSGKTTLLNMIAKLESYE.GSILYEGKELSKIKKHSYFLNMIKLENVFVKKGN....KNILDGCNFNFEKGKSYALVGESGAGKSTLLNIIAGFEDVS...QGSIYIEDKLLKKKVDFYRMIEIEELTKSYKG....HIIFDKLNLRIPEGKMTAIYGTSGAGKSTLLNIIGLIEDYDDGKYYFNGQFAPPFNSSLALKMMIKLENVFVKKGN....KNILDGCNFNFEKGKSYALVGESGAGKSTLLNIIAGFEDVS...QGSIYIEDKLLKKKVDFYRMIELKNISKKFGS....RQLFSDMNLHFEGGKIYALIGTSGCGKTTLLNMIGRLEPYDKGQIIYDGTSLKDIKPSVFFRDMIELKQVSKSFGE....RELFSNLSMTFEAGKVYALIGSSGSGKTTLMNMIGKLEPYD.GTIFYRGKDLANYKSSDFFR.MIDIQGLEKKFND....RAIFSGLNLKLEKGKVYALIGKSGSGKTTLLNILGKLEKIDGGRVLYQGKDLKTIPTREYFR.MIELKDLTIQKGN....IHILKKLNLKFQCGKSYALIGKSGCGKSTLLNTIAGLEKTG...KQYVYFNGQLEQFKSNFYR
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DD
DD
Figura 17. A) Alineamiento múltiple de LclC con las secuencias del COG1163. El grado de identidad para todas ellas es de 57,79 %. NP_241147: B. halodurans; NP_266166 y NP_268175: L. lactis IL1403; NP_345192, NP_346284 y NP_346414: St. pneumoniae TIGR4; NP_374155 y NP_395558: S. aureus N315. B) Alineamiento múltiple de LclC con las secuencias de las proteínas FtsE (COG2884). Todas ellas poseen un grado de identidad del 63,55 %. LisInn: Lis. innocua; NeisMen: N. meningitidis Z2491; BacSub: B. subtilis subsp. subtilis 168; IL1403: L. lactis subps. lactis IL1403; MycoTub: M. Turberculosis; StpyM1G: St. pyogenes M1GAS; StpnTIG: St. pneumoniae TIGR4. Los aminoácidos conservados (100 % homología) se muestran sombreados en negro; en rosa, los que presentan un � 75 %; y en azul � 50 % de homología. Se utilizó el programa DNAman (matriz BLOSUM62).
Resultados 65
membrana interior (en E. coli) mediante la unión con FtsX. Los mutantes de FtsE
con capaces de crecer solo en medios con cantidades elevadas de sal (1 % de NaCl),
lo cual aporta datos sobre su papel en la división celular o en el transporte. En la
Figura 17B presentamos el alineamiento de LclC con diferentes proteínas FtsE de
diferentes microorganismos, con una identidad del 63,55 %.
2. ESTUDIO DEL PROMOTOR DE LA
LACTOCOCINA 972 (Plcn972) La actividad del promotor del operón de la lactococina 972 (Plcn972) se analizó en
tres entornos genéticos distintos: E. coli KW1, L. lactis NZ9000 y L. lactis R2. Para
ello, el promotor se amplificó utilizando la técnica de PCR (oligonucleótidos P1 y
P2, Tabla 5) y se fusionó con el gen reportero uidA. La actividad ȕ-glucuronidasa de
los extractos celulares se determinó como se indica en Materiales y Métodos (2.1.7.
Ensayo de actividad del promotor de la lactococina 972).
Para los experimentos en E. coli se procedió a la construcción del plásmido
pBL2 (Figura 18), clonando el promotor Plcn972 en el plásmido pTUTmcs2. Esta
construcción se electroporó en la cepa de E. coli KW1, denominándose la nueva cepa
E. coli KW2. La determinación de la actividad ȕ-glucuronidasa en E. coli KW2 dió
un valor medio de 71,59 ± 0,96 UA min-1 µg proteína-1 (Figura 19).
pBL25107 bps
1000
20003000
4000
5000
EcoRINcoI
XhoI
NheINaeI
ScaI
BglI
PLcn972
uidA
amp
pBL25107 bps
1000
20003000
4000
5000
pBL12 6585 bps
1000
2000
3000 4000
5000
6000
NcoI AvaII
XhoIXbaI
ScaI
HindIIIKpnI
HindIII
EcoRI
PLcn972
' uidA
ery repF
repD
repE
pBL12 6585 bps
1000
2000
3000 4000
5000
6000
'
Figura 18. Diagramas de los plásmidos pBL2 y pBL12, utilizados.
Resultados 66
Para observar cómo se comportaba este promotor en cepas de L. lactis, se
procedió a construir el plásmido pBL12 (Figura 18), clonando el promotor Plcn972 en
el plásmido pIL252. Esta construcción se electroporó en L. lactis NZ9000
(denominándose la cepa L. lactis N12) y en la cepa L. lactis R2 (denominándose L.
lactis R12). Los ensayos de la actividad enzimática ȕ-glucuronidasa realizados en
ambas cepas dieron valores de 0,267 ± 0,051 UA min-1 µg proteína-1 para L. lactis
N12 y de 0,198 ± 0,003 UA min-1 µg proteína-1 para el caso de L. lactis R12 (Figura
19).
3. ANÁLISIS FUNCIONAL DEL OPERÓN
DE LA LACTOCOCINA 972 Para comprobar si los genes lclA, lclB y lclC son necesarios y suficientes para la
producción de la lactococina 972 y para la inmunidad de las células productoras frente a
ésta, dichos genes se clonaron bajo el control del promotor de la nisina. La clonación se
llevó a cabo en el plásmido pNZ8020 (Figura 20), realizándose una fusión transcripcional
con PnisA. El plásmido así obtenido se denominó pBL54 (Figura 20) y se electroporó a la
cepa L. lactis NZ9000, denominándose a la nueva cepa L. lactis pBL54.
La capacidad de producción de lactococina 972 de la cepa L. lactis pBL54 se estudió
utilizando el sistema de inducción en placa descrito en Materiales y Métodos (2.1.6.
Expresión controlada de genes en Lactococcus). En la Figura 21 podemos observar los
71,59
0,267 * 0,198 *
0
10
20
30
40
50
60
70U
A m
in-1
ug
prot
eína
-1
E. coli KW2 L. lactis N12 L. lactis R12
Figura 19. Valores de actividad ȕ-glucuronidasa en las diferentes cepas ensayadas. p<0,01(*).
Resultados 67
resultados obtenidos. Cuando se indujo la cepa L. lactis pBL54 con 1 ng de nisina se
observó la presencia de halos de inhibición de crecimiento de la cepa sensible L. lactis
MG1614 (Figura 21A), mientras que con la cepa L. lactis NZ9000, electroporada con el
plásmido control pNZ8020, no se observaban dichos halos (Figura 21B). Estos
resultados nos indican que la cepa L. lactis pBL54 secreta al medio lactococina 972
activa, y además es inmune a la misma, puesto que se observa un crecimiento normal de
las colonias de L. lactis pBL54.
En un segundo ensayo se determinó el grado de inducción de la síntesis de
lactococina 972 en la cepa L. lactis pBL54. Para ello se incubaron las células en medio
líquido con diferentes concentraciones de nisina (0 – 1 ng/ml) y se recogieron los
sobrenadantes del cultivo a diferentes tiempos (0 – 3 horas). Estos sobrenadantes fueron
Figura 21. Ensayo en multicapa (ver Materiales y métodos) de inducción de las cepas A) L. lactis pBL54 y B) L. lactis pNZ8020, en presencia de 1 ng/ml de nisina Z.
A) B)
NdeI
pNZ8020 3163 bps
500
1000
1500 2000
2500
3000
SalI
NcoI
BglII
Pnis
repC
repA
cm
BamHISmaI EcoRIBglII XbaI XhoI
XhoIAvaIXbaI
pBL546136 bps
1000
2000
3000
4000
5000
6000
ClaI
Pnis
lclB
pBL546136 bps
1000
2000
3000
4000
5000
6000
BamHIKpnI SpeI AvaI SmaI PstI EcoRI
HindIII
AvaI
PstISacI
PstI
XmnI
HindIII
NdeI
SalI
XmnINcoI
lclA
lclC
repC
repA
cm
Figura 20. Diagrama de los plásmidos pNZ8020 y pBL54.
Resultados 68
sometidos al ensayo de inhibición por difusión en placa de agar utilizando como cepa
indicadora L. lactis MG1614 (Figura 22A). Los resultados indicaron que en ausencia de
nisina las células no fueron capaces de secretar lactococina 972 al medio (no aparece halo
de inhibición). Al añadir nisina a los cultivos se observo que el tamaño del halo era
proporcional al tiempo de incubación de las células en presencia de nisina y a la
concentración de la misma utilizada para la inducción (Figura 22A). Además, hemos
observado, al igual que otros autores (de Ruyter et al., 1996b), que existía una saturación
del sistema con el tiempo (a partir de 1,5 – 2 horas de incubación no se produce más
bacteriocina) y con la concentración de nisina en el medio (la producción de lcn972
aumenta hasta 0,75 ng/ml de inductor, permaneciendo constante a partir de ese punto).
Se comprobó además que la inhibición se debía a la producción y secreción de
lactococina 972 al medio de cultivo, sometiendo los sobrenadantes de los cultivos a
electroforesis en geles SDS-Tricina (Figura 22B). La tinción con plata de estos geles
reveló la presencia de la banda de 7,5 kDa (monómero de lcn972) y la banda de 15 kDa
(dímero y forma activa de lcn972). Además, se realizó la caracterización de la actividad
A) B)
Figura 22. A) Ensayo de difusión en agar de sobrenadantes de L. lactis pBL54 a diferentes tiempos de inducción y con diferentes concentraciones de nisina Z. B) Gel SDS-PAGE Tricina de sobrenadantes de medio de cultivo de L. lactis pBL54 recogidos a diferentes tiempos después de añadir 0,25 ng/ml de nisina Z. 0: control, 1: 30 min, 2: 1 hora, 3: 1,5 horas, 4: 2 horas, 5: 3 horas, MW: marcadores de pesos moleculares.
30 min
1 hora
1,5 horas
2 horas
3 horas
0 0,1 0,25 0,75 1 ng/ml nisZ
0 1 2 3 4 5 MW
2 kDa
18 kDa 16 kDa 10 kDa 8 kDa 6 kDa
Resultados 69
inhibitoria de estos péptidos (descrita en Materiales y Métodos, 2.2.2. Electroforesis de
proteínas) confirmándose que el péptido de 15 kDa poseía actividad bacteriocinogénica
(datos no mostrados).
Para determinar si alguno de los genes era responsable de la inmunidad de las células
frente a la lactococina 972 se realizaron ensayos de inhibición del crecimiento de L. lactis
pBL54 en placas, con diferentes concentraciones de nisina para inducir la expresión del
promotor. Observamos que la cepa es inmune a la acción de la lactococina 972 incluso
hasta concentraciones de 800 UA/ml. Sorprendentemente, la cepa es resistente a la acción
de la bacteriocina incluso sin inducir la expresión del operón con nisina. Es posible que la
transcripción basal del promotor nis (de Ruyter et al., 1996b) sea suficiente para inducir
una inmunidad elevada incluso en ausencia de agente inductor de su expresión.
No ha sido posible clonar los genes lclB y lclC, ni de forma independiente ni
conjunta, en cepas de L. lactis. Así pues ha sido imposible comprobar si alguno de ellos o
ambos son responsables de la inmunidad de las cepas frente a la lactococina 972. Sin
embargo, sí fue posible clonar una forma mutante del gen lclB que presentaba un
desplazamiento de pauta a partir del triplete que codifica para el tercer aminoácido de
LclB. Esto sugiere que el gen lclB intacto se comporta como letal cuando se clona en
multicopia en L. lactis.
4. MODO DE ACCIÓN DE LA LACTOCOCINA 972
4.1. Efecto de la lactococina 972 sobre
el crecimiento de L. lactis MG1614
La inhibición que ejerce la lactococina 972 sobre la incorporación del precursor
del peptidoglicano N-acetilglucosamina y la observación de las secciones de células
tratadas con lactococina 972 al microscopio electrónico, realizadas en trabajos
preliminares sobre el modo de acción de ésta (Martínez et al., 1996; Martínez et al.,
2000a) sugerían que actuaba como un inhibidor de la división celular y en concreto
de la formación del septo.
Estos datos se confirmaron al observar la filamentación que induce la
bacteriocina a concentraciones subinhibitorias sobre cultivos sensibles de L. lactis
Resultados 70
MG1614 creciendo exponencialmente. La observación de las células al microscopio
óptico de contraste de fases (Figura 23) reveló dos efectos diferentes: cuando se
utilizan concentraciones iguales o superiores a la CIM (10 UA/ml, Figura 23D) se
observa el fenotipo ya descrito anteriormente donde las células pierden su morfología
cocoide (Martínez et al., 2000a). Sin embargo, cuando la concentración de
bacteriocina era ligeramente inferior a la CIM (entre 2,5 y 5 UA/ml, Figuras 23B y
23C), las células son incapaces de separarse formándose filamentos largos.
La filamentación es un efecto que también inducen diversos antibióticos
inhibidores de la síntesis de peptidoglicano, especialmente aquéllos que afectan a la
fase extracelular del proceso. De entre ellos los más importantes son los
glucopéptidos y los ȕ-lactámicos. Por esa razón, nos planteamos si la lactococina 972
actuaba de modo semejante a alguno de estos antimicrobianos.
Figura 23. Fotografías al microscopio óptico de contraste de fases de cultivos de L. lactis MG1614 tratadas con diferentes concentraciones de lcn972 después de dos horas: A) control; B) 2,5 UA/ml; C) 5 UA/ml; D) 10 UA/ml. La barra de la escala representa 10 µm.
A) B)
C) D)
Resultados 71
4.2. Comparación con el modo de acción de la vancomicina
La vancomicina se une a la fracción D-alanil-D-alanina terminal del disacárido
pentapéptido, impidiendo así su polimerización a través de la formación de puentes
entre los péptidos de cadenas diferentes del peptidoglicano. Este proceso es inhibido
por el tripéptido antagonista de la vancomicina, NĮ-Nİ-diacetil-L-Lys-D-Ala-D-Ala
[(Ac2)KAA]. Para determinar si la lactococina 972 reconocía la misma diana en el
peptidoglicano se trató con dicho tripéptido antes de añadirla a cultivos en fase
exponencial de la cepa L. lactis MG1614.
Como control se realizaron ensayos en los que se utilizó vancomicina
(concentración máxima 2,38 µM) y el tripéptido antagonista (exceso 100 molar) con
la misma cepa, observándose una completa inhibición de la actividad del antibiótico,
es decir que los cultivos crecían normalmente en presencia de concentraciones letales
del quimioterapéutico (datos no mostrados). Una vez comprobado el efecto
antagonista del tripéptido sobre la vancomicina, L. lactis MG1614 se incubó en
presencia de diferentes concentraciones de la bacteriocina (0 nM - 533 nM), y en
presencia de bacteriocina tratada con un exceso molar del tripéptido (100, 250 y 500
veces).
Los resultados (Figura 24) indican que existe un efecto antagonista parcial que
se observa sobre todo a la concentración de lactococina que se corresponde con la
CIM para la cepa L. lactis MG1614 (133 nM). A esa concentración el tripéptido
protege claramente a las células de la acción de la bacteriocina. Por otro lado, la falta
de efecto protector a concentraciones superiores de lactococina 972, podría indicar
que ésta interacciona de algún modo con el proceso de polimerización del
peptidoglicano pero que su blanco de acción no es el mismo que el de los
glucopéptidos.
4.3. Implicación de las PBPs en el modo de acción de lcn972
El hecho de que la bacteriocina bloquee el crecimiento del septo de división nos
llevó a plantearnos la hipótesis de que su diana podría ser la PBP implicada en dicho
proceso. En el momento de iniciar este estudio no existían referencias bibliográficas
Resultados 72
sobre las proteínas que participan en la división y formación del septo en lactococos,
de manera que utilizamos otros microorganismos como referencia. Por ejemplo, se
sabe que en E. coli la proteína denominada PBP3 (producto del gen ftsI) está
implicada en la formación del septo (Errington et al., 2003), siendo PBP2 su
homóloga en B. subtilis (Yanouri et al., 1993) y PBPX en St. pneumoniae (Laible et
al., 1989). Al realizar una comparación entre las secuencias de estas proteínas y las
PBPs de L. lactis IL1403, observamos que la proteína más homóloga a ellas era
PBP2X, producto del gen pbpX (Tabla 6).
Una vez localizado el gen, nos propusimos sobreexpresar la proteína con la
intención de determinar si un aumento en la concentración de la misma podría
inducir la resistencia a la bacteriocina, lo que indicaría que se producía una
interacción entre ambas. Para ello, el gen pbpX se clonó bajo el promotor inducible
de la nisina en el plásmido pNZ8048E (Figura 25) realizándose una fusión
traduccional. El plásmido así obtenido se denominó pBL11 (Figura 25) y se
electroporó en la cepa L. lactis NZ9000, denominándose a la nueva cepa L. lactis
PBPX.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 33 67 133 267 533lcn972 (nM)
OD600
Figura 24. Valores de OD600 de las células L. lactis MG1614 tratadas con diferentes concentraciones de lactococina 972 (0 nM – 533 nM) o bien con lactococina 972 previamente tratada con un exceso molar (500) del tripéptido antagonista de la vancomicina [(Ac)2KAA]. lcn972 y lcn972 + 500 exceso de (Ac)2KAA.
Resultados 73
Tabla 6. Comparación entre los diferentes genes y las PBPs que codifican de E. coli y lactis IL1403 (Ayala, comunicación personal).
gen E. coli Proteína Actividades gen
L. lactis Proteína
ponA PBP1A TGasa TPasa ponA PBP1A
ponB PBP1B TGasa TPasa pbp1B PBP1B
pbpC PBP1C TGasa TPasa pbp2A PBP2A
pbpA PBP2 TPasa pbp2B PBP2B pbpB PBP3 TPasa pbpX PBP2X
dacB PBP4 EPasa CPasa -- --
pbp4b PBP4b EPasa ? CPasa ? BLasa ?
yvdA PBP4
dacA PBP5 CPasa dacA PBP3 dacC PBP6 CPasa dacB PBP5 dacD PBP6B CPasa -- --
ampH AmpH CPasa ? BLasa ? -- --
ampC AmpC BLasa CPasa -- --
pbpG PBP7/8 EPasa -- -- mepA MepA EPasa -- -- mtgA MtgA TGasa -- --
TGasa: transglicosilasa; TPasa: transpeptidasa, EPasa: endopeptidasa; CPasa: carboxipeptidasa; BLasa: ȕ-lactamasa, ?: actividad no confirmada enzimáticamente.
NdeI
SalI
XbaIHindIII
AvaI XhoI
BglII
ery
repCrepA
cm
PnisA
pNZ8048E 4379 bps
1000
2000
3000
4000 SalI
EcoRV
NcoI AvaI EcoRI PstI SalI HindIII
pBL21 5612 bps
1000
2000 3000
4000
5000
AvaI
XhoI ClaI
HindIII
AvaI
XhoI
NdeI
SalI
BglII XhoII
pbpX
repC
repA
cm PnisA
pBL11
Figura 25. Diagrama de los plásmidos pNZ8048E y pBL11.
Resultados 74
A continuación se indujo la síntesis de la proteína PBPX en presencia de nisina
(Figura 26A). Sin embargo, la proteína resultaba tóxica para las células ya que se detenía
su crecimiento (Figura 26B). Debido a este hecho no pudimos comprobar si estas células
eran más resistentes a la lactococina que los controles con pNZ8048E, ya que la
bacteriocina sólo es activa sobre células en fase de crecimiento activo.
Puesto que la división celular es un proceso muy complejo, que depende de la acción
coordinada de numerosas proteínas, pudiera ser que la diana fuera otra de las PBPs
presentes en L. lactis. Por ello procedimos, en primer lugar, a caracterizar el perfil de
PBPs de nuestros lactococos, utilizando un compuesto ȕ-lactámico fluorescente
(BOCILLIN FL) que se une de forma específica a estas proteínas. (Materiales y Métodos,
apartado 2.2.3. Marcaje de las PBPs de Lactococcus).
A) 1 2 3 4 5 6 7 8
B)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 30 60 90 120 150
OD 600
minutos
Figura 26 A) Gel SDS-PAGE de inducción de PBPX. Calles 1-4 extractos de L. lactis PBPX recogidos a diferentes tiempos de inducción (0, 15, 30 y 60 minutos, respectivamente); calles 5-7 extractos de L. lactis NZ9000 con el plásmido control pNZ8048E recogidos a diferentes tiempos de inducción (0, 15 y 60 minutos, respectivamente); calle 8 patrón de pesos moleculares. La flecha muestra la banda de aproximadamente 88 kDa que corresponde a PBPX. B) Curva de crecimiento de las cepas L. lactis PBPX y L. lactis NZ9000 con el plásmido control pNZ8048E.
- 91 kDa
- 51,4 kDa
- 34,7 kDa
Resultados 75
El análisis de los geles de membranas de distintas cepas de lactococos, marcadas
con BOCILLIN FL (Figura 27), reveló la presencia de siete proteínas cuyos pesos
moleculares oscilaban entre 85 y 44 kDa, a las que se denominó PBP1, PBP2a,
PBP2b, PBP2c, PBP3, PBP4 y PBP5. Sorprendentemente, la proteína PBP5 de la
cepa productora de lactococina L. lactis IPLA 972 tiene más afinidad por este
compuesto que las PBP5 de las otras cepas, dando lugar a una banda de mayor
intensidad.
Para determinar si la actividad de alguna de las PBPs detectadas se veía afectada
por la lactococina 972, se realizó un ensayo de competición. Para ello se procedió a
incubar las membranas de las cepas L. lactis IPLA972 y R2, productoras y resistentes
a la bacteriocina, y de MG1614, no productora y sensible, con bacteriocina
purificada. Posteriormente, las membranas se marcaron con BOCILLIN FL y se
sometieron a electroforesis. Los resultados se muestran en la Figura 28. La banda
correspondiente a la PBP4 de L. lactis MG1614, de 55 kDa, tratada con lactococina
972, presenta una menor intensidad que en las muestras control. Estos resultados nos
indican que la posible diana de la lactococina 972 podría ser esta proteína.
Por otro lado, las membranas de L. lactis MG1614 recogidas a diferentes
tiempos de incubación (partiendo de un inóculo al 1 %) y sometidas a SDS-PAGE se
marcaron con anticuerpos policlonales generados frente a PBP3 de E. coli
(pAbPBP3). Se observó que una proteína de peso molecular similar a PBP4
IPLA972IPLA972 R2 MG1614R2 MG1614IPLA972IPLA972 R2 MG1614R2 MG1614
Figura 27. Perfil de PBPs de L. lactis IPLA972, L. lactis MG1614 y L. lactis R2, marcadas con Bocillin FL™.
IPLA972 MG1614 R2
PBP 1 (85 kDa) 2a (81 kDa) PBP 2b (79 kDa) 2c (78 kDa)
PBP 3 (62 kDa)
PBP 4 (55 kDa)
PBP 5 (44 kDa)
Resultados 76
1 2 3 4
Figura 29. Hibridación tipo “Western” de extractos de L. lactis MG1614, a diferentes tiempos de crecimiento (inóculo 1% (v/v), en GM17, 30ºC), con pAbPBP3 de E. coli. 1: 30 min; 2: 1 h; 3: 1,5 h; 4: 2 h. A la izquierda se indican los pesos moleculares del patrón de proteínas.
93 kDa - 105 kDa -
49 kDa -
35 kDa -
55 kDa
IPLA972 MG1614 R2
lcn972 - + - + - + Figura 28. Ensayo de competición entre el Bocillin FL™ y la lactococina 972. La flecha roja indica la única banda cuya intensidad disminuye en la cepa L. lactis MG1614 cuando las membranas son tratadas con lcn972. IPLA972: L. lactis IPLA972, MG1614: L. lactis MG1614, R2: L. lactis R2. A la izquierda se indican los pesos moleculares del patrón de proteínas.
105 kDa -
90 kDa -
65 kDa -
49 kDa -
Resultados 77
reaccionaba con estos anticuerpos (Figura 29). Al estudiar la presencia de esta
proteína a lo largo de la curva de crecimiento de L. lactis MG1614 observamos que
ésta se sintetiza principalmente en la fase de crecimiento activo, comenzando a
desaparecer al final de la fase exponencial de crecimiento (Figura 29). Este resultado
concuerda con el hecho de que la lactococina 972 sólo es activa frente a células que
se encuentran creciendo de forma activa, siendo las células en fase estacionaria más
refractarias a su acción.
Posteriormente, los anticuerpos pAbPBP3 de E. coli se utilizaron también para
poner de manifiesto esta proteína en extractos de células tratadas con diferentes
concentraciones de lactococina 972 (Figura 30). Se puede observar que la banda de
55 kDa (PBP4) aumenta de tamaño en presencia de bacteriocina y aparece como una
proteína de aproximadamente 70 kDa. Esta masa molecular se correspondería con la
de un posible complejo formado por PBP4 (55 kDa) y el dímero de la lactococina
972 (15 kDa).
Figura 30. Hibridación tipo “Western” de extractos de L. lactis MG1614 tratadas con concentraciones decrecientes de lactococina 972 (max 14 UA/ml – min 0 UA/ml) y revelados con anticuerpos policlonales frente a la PBP3 de E. coli (pAbPBP3). A la izquierda se indican los pesos moleculares de los marcadores y las flechas indican las bandas de 55 y 70 kDa.
Lcn972
70 kDa -
121 kDa -
50 kDa -
55 kDa
70 kDa
Resultados 78
Por último, utilizando anticuerpos policlonales generados frente a lactococina
972, que reconocen tanto la forma dimérica como el monómero de bacteriocina, se
comprobó que la banda de 70 kDa reaccionaba también con dichos anticuerpos
(Figura 31), lo que refuerza la hipótesis de la formación del complejo PBP4-lcn972
anteriormente mencionado. Además, este complejo es muy estable, ya que es capaz
de soportar el tratamiento al cual son sometidos los extractos celulares para realizar
su electroforésis (temperatura elevada en presencia de SDS).
4.4. Efecto de la lactococina 972 sobre la respuesta SOS en Lactococcus lactis
En un artículo reciente (Miller et al., 2004) se propone que la inhibición de la
actividad enzimática de PBP3 induce la respuesta SOS en Escherichia coli. Por otra
parte, los resultados expuestos en este trabajo sugieren que la lactococina 972 se une
a PBP4 de L. lactis, que es el análogo funcional de PBP3 de E. coli. Por ello, nos
planteamos determinar si la lactococina 972 inducía la respuesta SOS en L. lactis ya
que, si fuera así, tendríamos un dato indicativo adicional de que el blanco molecular
de la bacteriocina sería la PBP4 de este último organismo. Si a esto añadimos que
muchos profagos responden a la inducción de la respuesta SOS, iniciando un ciclo
lítico que conducirá a la generación de una progenie viral, resultaba conveniente
comprobar si la lactococina 972, añadida a un cultivo en fase exponencial de L. lactis
70,0 kDa
Figura 31. Hibridación tipo “Western” de extractos de L. lactis MG1614 sin tratar (calle 1) y tratados con 14 UA/ml de lactococina 972 (calle 2) revelados con A) anticuerpos policlonales frente a la PBP3 de E. coli (pAbPBP3); B) con anticuerpos policlonales frente a la lactococina 972 (pAblcn972). A la derecha se indican los pesos moleculares estimados para las bandas.
70,0 kDa
55,0 kDa A)
B)
1 2
70,0 kDa
Resultados 79
MG1614 a la concentración inhibitoria mínima (20 UA/ml) o al doble de ésta (40
UA/ml), inducía profagos residentes en su genoma. Con este objetivo, se incubaron
los cultivos durante tres horas más para permitir la generación de la progenie, y sus
sobrenadantes se procesaron para comprobar si producían placas de lisis sobre L.
lactis IL1403 y L. lactis F4-2.
En ninguno de los dos casos se observaron dichas placas, por lo que se procedió
a realizar un ensayo de PCR utilizando oligonucleótidos específicos para fagos de la
especie P335 como cebadores, con objeto de poner de manifiesto la posible presencia
de ADN fágico en los sobrenadantes de los cultivos. El resultado obtenido se
presenta en la Figura 32. Como puede verse, los sobrenadantes de cultivos incubados
en presencia de la lactococina 972 dan lugar a una banda de ADN amplificado (calles
4 y 5), cuyo tamaño se corresponde con el que se obtiene al amplificar el ADN del
fago P335 (calle 2). Dicha banda no aparece en la muestra correspondiente al
sobrenadante del cultivo sin tratar con la bacteriocina. De todo ello se deduce que la
lactococina 972 induce la respuesta SOS en L. lactis, al igual que lo hacen ciertos
antibióticos ȕ-lactámicos, específicos para la PBP3, en Escherichia coli.
Figura 32. Gel de agarosa de la amplificación por PCR del gen de la dUTPasa de fagos de la especie P335 de: 2: ADN del fago P335; 3: sobrenadante de L. lactis MG1614 sin tratar; 4:sobrenadante de un cultivo de L. lactis MG1614 tratado con 20 UA/ml y 5: con 40 UA/ml de lactococina 972; 6: control. Calle 1: patrón de pesos moleculares ȜPstI.
1 2 3 4 5 6
Resultados 80
5. CRECIMIENTO, METABOLISMO Y PRODUCCIÓN
DE LACTOCOCINA 972 EN BIORREACTOR
El estudio de la influencia de las fuentes de carbono, lactosa y glucosa, sobre el
crecimiento, metabolismo y producción de lactococina 972 de la cepa L. lactis
IPLA972 se realizó en cultivo discontinuo y continuo a valores de pH constantes
(6,8). Las concentraciones de azúcar utilizadas fueron de 5 y 20 g/L.
5.1. Influencia de la fuente de carbono sobre el crecimiento
y la producción de lcn972 en cultivo en discontinuo
Las velocidades de crecimiento (µmax) en presencia de glucosa y lactosa fueron
similares, aunque algo mayores en el caso de la glucosa. También se observó un
incremento en la producción de biomasa al aumentar la concentración de azúcar,
indicándonos que no existía ningún otro componente del medio llegaba a hacerse
limitante aparte de la fuente de carbono. Sin embargo, el recuento del número de
células viables después de 24 horas de cultivo era similar en todos los casos (109
ufc/ml) (datos no mostrados). El aumento en la biomasa, sin que se produzca
variación en el número de células viables, puede ser debido a una acumulación
intracelular de compuestos de reserva o a la producción de metabolitos secundarios
como los exopolisacáridos. El rendimiento óptimo de biomasa (YX/S) se obtiene con
glucosa 5 g/L y la productividad (pX) es máxima cuando se utiliza la fuente de
carbono a una concentración de 20 g/L (Tabla 7).
La producción de bacteriocina tuvo lugar de forma paralela a la evolución de la
biomasa durante la fase exponencial de crecimiento y decreció durante la fase
estacionaria (Figura 33). A medida que la concentración de azúcar aumentaba,
también lo hizo la actividad de bacteriocina detectada (Figura 33; Tabla 7). De
hecho, la actividad fue unas 8 veces mayor cuando la concentración de la fuente de
carbono era de 20 g/L (glucosa o lactosa) frente a 5 g/L. En la Tabla 7 podemos
observar también que el mejor rendimiento (YB/X) y velocidad específica de
producción de bacteriocina (qB) se obtuvo con lactosa 20 g/L.
Resultados 81
Tabla 7. Parámetros cinéticos de crecimiento y producción de bacteriocina en cultivo en discontinuo de L. lactis IPLA972 en M17, con diferentes concentraciones de glucosa y lactosa a pH 6,8 y 30 ºC.
Azúcar (g/L)
�Pmax (h-1)
td
(h)
Xmax
(gDCW /L)
YX/S
(gDCW/g)
pX
(gDCW L-1 h-1)
Actividad
lcn972 (AU/ml)
YB/X (AU/ gDCW)
qB (x103 AU g-1
DCW h-1)
Glucosa
5 0,729 0,951 1,850 0,379 0,185 1440 1129 226
20 0,737 0,940 4,650 0,233 0,465 12800 3145 524
Lactosa
5 0,700 0,990 1,125 0,225 0,188 1280 1574 394
20 0,684 1,013 4,650 0,233 0,465 10560 7634 1521
Pmax: tasa de crecimiento específica durante la fase exponencial de crecimiento; td: tiempo de duplicación; gDCW: peso seco; g: gramos de azúcar; Xmax: máxima concentración de biomasa; YX/S: rendimiento en biomasa; pX: productividad de biomasa; YB/X: rendimiento en bacteriocina; qB: velocidad específica de producción de bacteriocina. Los cálculos se describen en Materiales y Métodos.
A) B)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h)
AU
/ml
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
biom
asa
(g/L
)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h)
AU
/ml
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
biom
asa
(g/L
)
C) D)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h)
AU
/ml
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
biom
asa
(g/L
)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h)
AU
/ml
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
biom
asa
(g/L
)
Figura 33. Producción de biomasa (�) y de lactococina 972 ( ) por L. lactis IPLA972 en cultivo en discontinuo a pH 6,8 y 30 ºC en medio M17 suplementado con: A) glucosa 5 g/L; B) glucosa 20 g/L; C) lactosa 5 g/L y D) lactosa 20 g/L. Los datos representados son los obtenidos en una de las fermentaciones.
AU
/ml
AU
/ml
AU
/ml
AU
/ml
Tiempo (h)
Tiempo (h)
Tiempo (h)
Tiempo (h)
biom
asa
(g/L
)
biom
asa
(g/L
)
biom
asa
(g/L
)
biom
asa
(g/L
)
Resultados 82
5.2. Efecto de la tasa de dilución y la fuente de carbono sobre
el crecimiento y la producción de lcn972 en cultivo en continuo
Los cultivos en continuo nos permitieron estudiar la cinética de crecimiento de
la cepa L. lactis IPLA972 y la producción de lcn972 en función de la tasa de dilución
(D) y la fuente de carbono. Para ello se utilizaron diferentes tasas de dilución en las
que se alcanzaban los estados estacionarios. Los valores de biomasa y bacteriocina
obtenidos se muestran en la Figura 34, y los parámetros cinéticos correspondientes
en la Tabla 8.
Es especialmente destacable que es posible obtener estados estacionarios
estables para tasas de dilución superiores a los valores de µmax calculados
previamente en cultivos en discontinuo (Tabla 7), sin que se observe el lavado del
cultivo. Este crecimiento hipertrófico (wall-growth) del cultivo se produce como
Tabla 8. Parámetros cinéticos de crecimiento celular y producción de bacteriocina en cultivos en continuo de L. lactis IPLA972 en M17 con diferentes concentraciones de glucosa y lactosa a varias tasas de dilución, pH 6,8 y 30 ºC. Concentración
de azúcar (g/L)
D
(h-1)
YX/S
(gDCW g-1)
pX
(g L-1 h-1)
YB/X
(x103 AU g-1)
qB
(x103 AU g-1DCW h-1)
Glucosa 5 0,090 0,322 ± 0,098 0,097 ± 0,030 998 ± 302 89 ± 27
0,239 0,329 ± 0,007 0,393 ± 0,009 973 ±22 232 ± 5 0,457 0,306 ± 0,014 0,699 ± 0,032 2735 ± 870 1251 ± 398 0,673 0,254 ± 0,006 0,855 ± 0,020 113170 ± 5592 8858 ± 3761
20 0,090 0,125 ±0,000 0,226 ± 0,000 9216 ± 0 829 ± 0 0,239 0,157 ±0,001 0,750 ± 0,003 7334 ± 28 1753 ± 7 0,673 0,097 ± 0,000 1,300 ± 0,000 11919 ± 0 8022 ± 0
Lactosa 5 0,090 0,203 ± 0,011 0,091 ± 0,005 1424 ± 75 129 ± 7
0,457 0,218 ± 0,005 0,449 ± 0,011 1319 ± 28 603 ± 13 0,673 0,195 ± 0,000 0,656 ± 0,000 8862 ± 3249 5960 ± 2185
20 0,090 0,146 ± 0,005 0,264 ± 0,010 1651 ± 371 149 ± 47 0,239 0,160 ± 0,004 0,766 ± 0,020 3295 ± 380 906 ± 91 0,457 0,143 ± 0,009 1,311 ± 0,086 7243 ± 3002 3311 ± 1373 0,673 wall-growth wall-growth wall-growth wall-growth
D: tasa de dilución; gDCW: peso seco; g: gramos de azúcar; YX/S: rendimiento en biomasa; pX: productividad de biomasa; YB/X: rendimiento en bacteriocina; qB: velocidad específica de producción de bacteriocina. Los datos se obtuvieron en el estado estacionario y se representan como la media de duplicados ± desviación estándar. Wall-growth: no se pudieron realizar los cálculos debido al crecimiento hipertrófico del cultivo (ver texto).
Resultados 83
A)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Tasa de dilución (h-1)
biom
asa
(g/L
)
B)
0
5000
10000
15000
20000
25000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Tasa de dilución (h-1)
AU
/ml
Figura 34. A) Producción de biomasa y B) producción de lactococina 972 por L. lactis IPLA972 a diferentes tasas de dilución en cultivos en continuo a pH 6,8 y 30 ºC en medio M17 suplementado con: �: glucosa 5 g/L; z: lactosa 5 g/L; �: glucosa 20 g/L; z: lactosa 20 g/L. Los datos representados son los obtenidos en una de las fermentaciones.
Tasa de dilución (h-1)
Tasa de dilución (h-1)
Resultados 84
consecuencia de la adhesión de una proporción significativa de células a las paredes
del biorreactor. Este hecho fue particularmente evidente cuando se aplicaron tasas de
dilución superiores a 0,457 h-1 en cultivos crecidos en presencia de 20 g/L de lactosa
(las células adheridas constituían el 40% de la biomasa), y superiores a 0,673 h-1 en
el resto de condiciones de fuente de carbono. Por lo tanto, los parámetros cinéticos
calculados para las tasas de dilución superiores a esos valores no se corresponden
con los reales y no se muestran en la Tabla 8. A tasas de dilución mayores de 0,894
h-1 se produjo el lavado de los cultivos crecidos en presencia de 5 g/L de lactosa.
Con respecto a la producción de biomasa (Figura 34A), ésta se vio claramente
afectada por la fuente de carbono cuando se aplicaron tasas de dilución próximas a la
µmax (D = 0,673 h-1). La glucosa proporcionó mayor biomasa que la lactosa en las dos
condiciones ensayadas (5 g/L, p < 0,01; 20 g/L, p < 0,00001); los rendimientos en
biomasa en todos los casos fueron mejores a valores de D bajos (Tabla 8). Además,
al igual que se observó en los cultivos en discontinuo, la concentración más alta de
azúcar dio lugar a una productividad en biomasa mayor.
La síntesis de lactococina 972 (Figura 34B) siguió un comportamiento similar
para ambos azúcares a baja concentración (5 g/L). Aunque se detectó actividad
lcn972 en todas las tasas de dilución, se observó un máximo de actividad a D = 0,673
h-1 (91 – 96 % de µmax). Esto indicaría que la lactococina 972 es principalmente
sintetizada cuando las células están creciendo de forma activa. Este comportamiento
no se observó cuando la concentración de azúcar era de 20 g/L. En este caso, cuando
la fuente de carbono utilizada era lactosa, el máximo de actividad se observó a D =
0,457 h-1 (66 % de µmax), mientras que en presencia de glucosa la actividad
bacteriocinogénica alcanzó niveles elevados en un amplio rango de de tasas de
dilución (0,09 – 0,673 h-1), lo cual significaría que la producción de lactococina 972
se mantiene alta incluso cuando las células están creciendo lentamente (12 % de
µmax). En general, y al igual que ocurre en los cultivos en discontinuo, el valor
máximo de la biomasa da lugar a valores de actividad de bacteriocina también
máximos. Los valores máximos de rendimiento (YB/X) y velocidades específicas de
producción (qB) de bacteriocina se obtuvieron con glucosa (Tabla 8).
Resultados 85
5.3 Metabolismo de la cepa L. lactis IPLA972
en cultivo en discontinuo y en continuo
En los cultivos en discontinuo ambas fuentes de carbono se consumieron
completamente después de 4 - 5 h (a la concentración más baja de azúcar) o 6 - 8 h (a
la concentración más alta) de incubación (datos no mostrados). En estos cultivos, L.
lactis IPLA972 presentó un metabolismo homoláctico con respecto a su perfil de
producción de metabolitos. La producción de ácido láctico supuso del 80 al 96 % del
azúcar consumido, aunque también se acumularon ácido acético y fórmico al final
del cultivo (10 h a 24 h). También se detectó etanol, aunque su concentración era
muy similar al límite de detección y no pudo ser cuantificada adecuadamente (datos
no mostrados).
0%
25%
50%
75%
100%
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0%
25%
50%
75%
100%
0,09 0,24 0,46 0,67 0,89 1,11 0,09 0,24 0,46 0,67 0,89 1,110
200
400
600
800
1000
1200
1400
Figura 35. Productos metabólicos finales y concentración de azúcar residual en cultivos en continuo de L. lactis IPLA 972 a diferentes tasas de dilución (D) de M17 suplementado con glucosa (A, B) o lactosa (C, D) a 5 g/L (A, C) o 20 g/L (B, D). Las muestras se tomaron en el estado estacionario.
: azúcar residual; : ácido acético; : ácido fórmico; : ácido láctico.
Prod
ucci
ón d
e ác
ido
(%)
Azú
car r
esid
ual (
mg/
100
ml)
Tasa de dilución (h-1)
B)
C) D)
A)
Resultados 86
El análisis de los productos finales del metabolismo en los cultivos en continuo
dio lugar a los resultados representados en la Figura 35. Se observó que el balance
entre las fermentaciones homoláctica y ácido-mixta es dependiente de la
disponibilidad del azúcar. El crecimiento de L. lactis IPLA972, en presencia de un
exceso de azúcar (glucosa o lactosa, 20 g/L) y a altas tasas de dilución, daba lugar a
una fermentación homoláctica en la que más del 90 % del azúcar metabolizado se
convirtió en ácido láctico. Sólo a D � 0,457 h-1 se pudieron detectar cantidades
apreciables de otros metabolitos, siendo la fuente de carbono completamente
consumida. A la concentración más baja de azúcar ensayada se hizo más notable
el cambio de fermentación homoláctica a ácido-mixta a medida que descendía D.
DISCUSIÓN
Discusión 87
IV. DISCUSIÓN
Las bacteriocinas son péptidos producidos por las bacterias, que presentan
propiedades antimicrobianas frente a otras bacterias, a menudo estrechamente
relacionadas con la cepa productora. Desde el descubrimiento de la primera
bacteriocina ha pasado casi un siglo, pero ha sido en estos últimos 25 años cuando ha
aumentado el interés por estos compuestos y su utilización como agentes
conservantes de los alimentos, y también como potenciales agentes que podrían
complementar o incluso reemplazar a los antibióticos. A este respecto cabe citar la
aparición de numerosos artículos de revisión, que se han centrado en el estudio de las
bacteriocinas producidas por bacterias Gram-positivas, relacionados con su síntesis
(Ennahar et al., 2000; Riley, 1998; Nes et al., 1996), estructura y mecanismo de
acción (Cleveland et al., 2001; McAuliffe et al., 2001; Nes y Holo, 2000; Abee,
1995), actividad biológica (Ennahar et al., 1999; Requena y Peláez, 1995) y
aplicaciones (Cleveland et al., 2001; de Vuyst y Vandamme, 1996; Hoover, 1993).
La lactococina 972 se ha revelado como una nueva bacteriocina que no puede
ser clasificada dentro de ninguno de los grupos descritos hasta el momento: posee
una elevada resistencia a proteasas específicas, es termosensible y muy hidrofílica.
Además, su modo de acción es totalmente diferente al de otras bacteriocinas, ya que
la forma activa es un homodímero y no induce la formación de poros, sino que inhibe
la formación del septo bacteriano, lo cual provoca la detención del ciclo celular y
posteriormente la muerte de las bacterias.
Discusión 88
1. ORGANIZACIÓN GENÉTICA DEL
OPERÓN DE LA LACTOCOCINA 972
Para comprender mejor la organización genética que subyacía a la biosíntesis de
la lactococina 972 decidimos realizar en primer lugar la secuenciación completa del
plásmido pBL1 en el cual se encontraba codificada, ya que por estudios previos se
sabía que la producción e inmunidad eran transmisibles por electroporación de este
replicón a células sensibles (Martínez et al, 1996).
El análisis de dicha secuencia nos reveló algunos aspectos importantes. En
primer lugar, el gen estructural (lclA) precede a dos genes (lclB y lclC)
estrechamente ligados, lo que sugiere que los tres forman parte de un operón, y todos
ellos se encuentran junto con otra orf (orf4) flanqueados por dos secuencias de
inserción defectivas (ǻISS1 y ǻISS1CH) y una secuencia de inserción completa
(ISS1). Este hecho, junto con que los sitios de restricción se encuentren distribuidos
de forma asimétrica nos hace pensar que fue introducido como un bloque genético
dentro de un antecesor de pBL1, a través de una transferencia mediada por ISS1. En
el caso de los plásmidos que codifican para la colicina Js (pColJs), para la klebicina
B (pKlebB) (Riley y Wertz, 2002) y la lacticina 3147 (Dougherty et al., 1998)
también se ha observado este hecho, pudiéndose considerar que estos elementos
extracromosómicos están compuestos por un plásmido críptico que aportaría la
información para su mantenimiento y replicación en las células hospedadoras y un
bloque de genes que codifican para una bacteriocina concediendo, probablemente,
una ventaja selectiva apreciable a las células que los albergan. Por otro lado, el
solapamiento entre el triplete stop de lclB y el de inicio de lclC sugería que este
último gen también formaría parte del acervo genético necesario para la biosíntesis
de la bacteriocina. Además, este solapamiento indicaría la existencia de un
acoplamiento traduccional de los genes, asegurando que la producción de ambas
proteínas se realiza en la proporción adecuada (van de Guchte et al., 1991). Existen
otros ejemplos de estructuras de genes acoplados de esta manera, como lctF, lctlE y
lctG del operón de la lacticina 481 (Rincé et al., 1997), nisF, nisE y nisG del
agrupamiento de la nisina (Siegers y Entian, 1995) y epiF, epiE y epiG del grupo de
genes de la epidermina (Peschel y Götz, 1996). Finalmente, los experimentos de
Discusión 89
expresión del conjunto de los tres genes lcl bajo el promotor de la nisina, en una cepa
previamente sensible, indujo tanto la inmunidad como la capacidad de producción de
la bacteriocina, pudiendo afirmarse así que toda la información genética necesaria
para la síntesis e inmunidad de lcn972 se encuentra en un único operón que consta de
tres genes, lclA, lclB y lclC, en cuyo extremo 5’ se encuentra un solo promotor
funcional.
Entre dicho promotor, PLcn972, y el punto de inicio de la traducción aparecen dos
secuencias invertidas. ¿Cuál puede ser la posible función de estas secuencias?. El
extremo 5’ del ARNm que no se traduce (5’-UTR) no sólo sirve para la unión de los
ribosomas al inicio de la síntesis proteica sino también como potencial punto de
ataque de las RNasas, de manera que la existencia de estructuras secundarias en esa
zona podría servir para estabilizar el ARNm. Esta función ha sido descrita en
diferentes sistemas (RNA1 de ColE1, ARNm del operón rnc, ambos de E. coli, el
mensajero de pufBA de Rhodobacter, etc) (Rauhut y Klug, 1999). Otra importante
característica que aparece en nuestro transcrito, y que también aparece en el RNA1,
sería la presencia de una región de cadena sencilla (SS) a continuación del lazo que
contiene el sitio de unión a ribosoma así como el codón de inicio. Parece ser que esta
región de cadena sencilla estabilizaría el ARNm mediante la saturación con
ribosomas que se unirían fuertemente a la secuencia Shine-Dalgarno.
La gran estabilidad de este ARNm parece confirmarse no sólo con los valores
obtenidos de ǻG al estudiar su estructura secundaria del ARNm utilizando el
programa MFold, sino también mediante los resultados obtenidos en los estudios de
expresión de los genes lclA y lclB (Martínez et al., 1999). En estos experimentos se
encontró que el transcrito perteneciente al gen lclA es muy abundante a lo largo de
toda la curva de crecimiento, detectándose incluso en cultivos de 24 h. Pudiera ser
que en esta persistencia del ARNm correspondiente a lclA participen también dos
secuencias invertidas (con un ǻG de -35 kcal/mol) que aparecen entre los genes lclA
y lclB y que podrían actuar como una 3’-UTR estabilizadora, además de como
señales de terminación de la transcripción rho-independientes. Esta última función de
las dos secuencias invertidas no debe ser muy efectiva ya que durante la fase
exponencial se detecta un segundo transcrito que cubre todo el operón, aunque éste
último es mucho menos abundante que el correspondiente a la lectura de lclA
Discusión 90
exclusivamente (Martínez et al., 1999). Esta organización en la que aparece una
secuencia terminadora entre el gen estructural y el resto de las orfs implicadas en el
transporte e inmunidad ha sido descrita también para otros operones de bacteriocinas
como la lacticina 481 (Rincé et al., 1997), la nisina (Rauch y de Vos, 1992) y la
lacticina RM (Yarmus et al., 2000) entre otras.
Los estudios de expresión de PLcn972 mostraron sorprendentemente que este
promotor es muy activo en E. coli, mientras que su actividad en lactococos fue más
de dos órdenes de magnitud menor a juzgar por los valores de ȕ-glucuronidasa
obtenidos. Posiblemente este hecho se deba a la preferencia de la polimerasa de E.
coli por promotores localizados en regiones ricas en A+T, que sería el caso de PLcn972
(Nishi y Itoh, 1986). Complementariamente, la mayor actividad enzimática,
observada en E. coli KW2 respecto a L. lactis N12 y L. lactis R12, podría ser el
producto del alto número de copias que presenta el plásmido PTUTmcs2 frente a
pIL252. La elevada expresión del promotor en su ubicación original, el plásmido
PBL1, podría deberse en parte a que dicho plásmido presente unas 50 copias/célula
(B. Mayo, comunicación personal).
El análisis de la secuencia de aminoácidos de la lactococina 972 deducidos a
partir de la secuencia del gen estructural lclA, reveló una de sus características más
importantes: la presencia de un péptido señal típico que es reconocido por el sistema
de secreción general (SEC). Este hecho, aunque no muy frecuente, también ocurre en
algunas bacteriocinas de clase II, como la acidocina B (Leer et al., 1995), la
divergicina A (Worobo et al., 1994), la bacteriocina 31 (Tomita et al., 1996), la
enterocina P (Cintas et al., 1997) y la listeriocina 743A (Kalmokoff et al., 2001). En
todos estos casos, al igual que ocurre con la lactococina 972, la producción de
bacteriocina depende de la expresión de un solo operón que comprende el gen
estructural y el/los (posibles) gen/es de inmunidad, sin la necesidad de proteínas
especializadas para su secreción y maduración.
No está claro porqué la mayoría de las bacteriocinas de bacterias lácticas de
Clase II poseen un sistema de exportación de tipo doble glicina cuando otras utilizan
el sistema SEC de la célula. En cambio, la necesidad de un sistema específico puede
entenderse mejor en el caso de las bacteriocinas de Clase I, las cuales serían
Discusión 91
incapaces de atravesar la membrana citoplasmática utilizando el sistema SEC porque
las estructuras de los anillos de lantionina probablemente mantengan al péptido en
una conformación inadecuada para la secreción. Evidentemente este razonamiento no
puede aplicarse para las de Clase II.
Por otra parte, los resultados obtenidos del análisis de la secuencia de
aminoácidos de las proteínas LclB y LclC indican que ambas formarían un complejo
que daría lugar a un transportador ABC. Los transportadores ABC pertenecen a la
superfamilia ABC (ATP-Binding Cassette) y se caracterizan porque estas proteínas
son capaces de utilizar la energía de hidrólisis del ATP para promover la exportación
de metabolitos muy variados (Holland y Blight, 1999; Nikaido y Hall, 1998, Fath y
Kolter, 1993). Los transportadores ABC presentan dos dominios esenciales, uno de
unión e hidrólisis de los nucleótidos trifosfato y otro que atraviesa la membrana
citoplasmática, y forma el canal a través del cual tiene lugar el proceso de
exportación. Dichos dominios pueden estar formando parte de un único polipéptido
o, como en nuestro caso, de polipéptidos diferentes. Así, en LclC se encontraría el
dominio de unión a nucleótidos, mientras que la región transmembrana sería parte de
LclB.
Ahora bien, si la bacteriocina se excreta a través del sistema general de
secreción, parece redundante que exista al mismo tiempo un sistema específico de
exportación. Por ello, defendemos la hipótesis de que ambos genes, lclB y lclC,
codificarían para la/s proteína/s de inmunidad de la lactococina 972. Las razones que
avalan esta asunción son variadas. En primer lugar, se ha observado que los genes de
inmunidad de la mayoría de las bacteriocinas de Clase II se encuentran a
continuación del gen estructural, formando un operón (Nes et al., 1996), como ocurre
con los genes lclB y lclC. Por otro lado, aunque los ensayos destinados a clonar y
posteriormente expresar estos genes individualmente en una cepa de L. lactis
sensible a la bacteriocina no han sido positivos, todos nuestros resultados indican que
sus productos participan en la inmunidad de las células frente a la lactococina 972.
Al clonar todo el operón bajo el control del promotor de la nisina, las células se
hacían resistentes a la acción de la bacteriocina, incluso con la expresión basal del
promotor en ausencia de inducción. La imposibilidad de clonar lclB o lclC no es un
caso excepcional. De hecho, tampoco ha sido posible la clonación de los genes lctF y
Discusión 92
lctE de la lacticina 481 (Rincé et al., 1997), concluyendo los autores que
posiblemente el nivel de expresión de estos genes puede ser tóxico para la bacteria en
ausencia de un tercer gen denominado lctG.
Por último, aunque la mayoría de las bacteriocinas de Clase II poseen proteínas
de inmunidad de pequeño tamaño, cuya función a nivel molecular es aún
desconocida, no es raro que un transportador ABC actúe como una proteína de
inmunidad. Así ocurre por ejemplo con los lantibióticos como la nisina, la subtilina y
la epidermina. No se sabe con certeza cuál es el mecanismo de acción de estas
proteínas, aunque experimentos realizados con los genes epiF, epiE y epiG de la
epidermina (Otto et al., 1998; Sahl y Bierbaum, 1998) sugieren que proporciona
inmunidad activando la extrusión de las moléculas de bacteriocina, manteniendo así
la concentración del lantibiótico en la membrana muy por debajo del nivel crítico
necesario para la aparición de poros.
Otro dato interesante ha sido la homología encontrada entre el operón de la
lactococina 972 y una serie de operones de Streptococcus y Staphylococcus de
función desconocida. En todos los casos un gen que codifica para una proteína de
pequeño tamaño y pI alto precede a una proteína integral de membrana con siete
segmentos transmembrana y ésta a una proteína de unión a ATP. En el género
Staphylococcus aparece un gen adicional que codifica una proteína semejante a LclA
entre la proteína de membrana y la de unión a ATP. En esta situación resulta muy
atractivo especular que los péptidos de pequeño tamaño podrían tener función
antimicrobiana (por homología con LclA), mientras que las otras dos proteínas
podrían formar un transportador de tipo ABC que proporcionaría inmunidad a la
célula protegiéndola frente a su propio producto. En este sentido es notable que todos
los péptidos homólogos que pertenecen a estos sistemas, son sintetizados como pre-
péptidos que poseen un péptido señal típico del sistema SEC bacteriano.
La presencia de estos operones en los cromosomas de las bacterias
pertenecientes a otros géneros bacterianos emparentados con Lactococcus y su
homología con el de la lactococina 972 nos hace plantearnos dos cuestiones. En
primer lugar, ¿podría haber evolucionado el operón de la lactococina 972 a partir de
uno de estos sistemas?. A favor de esta hipótesis esta su localización plasmídica y el
Discusión 93
hecho de que esté flanqueado por ISs. Si esto es así, y debido al peculiar modo de
acción de la lactococina 972, ¿están implicados estos sistemas de algún modo en la
división celular?. A este respecto es llamativa la homología de LclC con las proteínas
pertenecientes al COG2884 (que agrupa a las proteínas FtsE), que están implicadas
en la formación del septo. Tendríamos así un escenario en que una agrupación de
genes, cuya expresión estaría muy bien controlada debido a la naturaleza del proceso
de división, habría pasado a un entorno fisiológico distinto, lo que provocaría la
pérdida de dichos controles. Esto, unido a la presencia de los genes en un plásmido
multicopia, daría lugar a una expresión desordenada de los mismos y a la
acumulación de un péptido que, en proporción inadecuada respecto a los otros
elementos que median la división celular, podría tener un efecto letal.
2. MODO DE ACCIÓN
Estudios preliminares sobre el modo de acción de la lactococina 972 revelaron
que la forma activa de esta bacteriocina es un homodímero. Se han descrito
aproximadamente 20 bacteriocinas diméricas (Garneau et al., 2002), de las cuales 14
pertenecen al grupo de no-lantibióticos (Clase II). A diferencia de la lactococina 972,
todas ellas están formadas por dos péptidos diferentes, sintetizados como prepéptidos
que poseen una señal de procesamiento de tipo doble glicina (excepto la enterocina
L50 que se sintetiza directamente como bacteriocina madura). Por otra parte, todas
las bacteriocinas diméricas cuyo modo de acción se conoce parecen abrir poros en las
membranas plasmáticas de las células sensibles. Por lo tanto, podemos concluir que
la lactococina 972 no se parece a ninguna bacteriocina de las sintetizadas como dos
péptidos, ni estructuralmente ni por su modo de acción.
Como ya se había apuntado en trabajos anteriores (Martínez et al., 2000a),
cuando las células se incuban con concentraciones letales de lactococina 972, se
produce la inhibición de la formación del septo de división. Además, las células
comienzan a lisarse (a partir de los 60 minutos de tratamiento), probablemente
debido al debilitamiento de la pared celular, lo que provocaría a su vez la ruptura de
la membrana plasmática por efecto de la presión osmótica. Rice y Bayles (2003) han
Discusión 94
sugerido que este hecho podría ser un tipo de muerte celular programada (PCD,
programmed cell death), al igual que ocurre en los organismos eucariotas (apoptosis).
Consistente con el modo de acción descrito, cuando las células tratadas se
observan al microscopio presentan un aspecto alargado y un tamaño medio que
coincide, aproximadamente, con el de dos células normales. Un estudio más
exhaustivo al microscopio electrónico reveló que las células presentaban las
constricciones ecuatoriales así como el primordio del septo. Este hecho, junto con
que la bacteriocina es sólo activa frente a poblaciones bacterianas que se encuentran
en fase exponencial de crecimiento, parecía indicar un modo de acción similar al de
los antibióticos que inhiben las últimas etapas de la biosíntesis de la pared celular.
Para determinar si la lactococina 972 actuaba de manera similar a los
glucopéptidos se trataron cultivos de células sensibles con el tripéptido antagonista
de la vancomicina, diacetil-L-Lys-D-Ala-D-Ala, el cual fue incapaz de inhibir
totalmente la actividad de la bacteriocina, en concentraciones superiores a la CIM, lo
que nos indica que el modo de acción, a nivel molecular, de la lactococina es
diferente al de los antibióticos glucopéptidos. Ahora bien, este ensayo reveló que el
tripéptido antagonizaba parcialmente la acción de la lcn972, sobre las células
sensibles, en concentraciones inferiores o iguales a la CIM lo que sugiere que la
bacteriocina interactúa de algún modo con el pentapéptido de la unidad de
peptidoglicano.
Por otra parte, determinados antibióticos ȕ-lactámicos ejercen un efecto sobre S.
aureus que parece ser similar al observado para la lcn972, ya que inhiben la
formación del septo, provocando, en último término la lisis celular (Rohrer y Berger-
Bächi, 2003). Complementariamente, experimentos recientes (Pinho y Errington,
2003) han demostrado que en S. aureus RN4220 pueden tener lugar dos modos de
síntesis de pared celular: una localizada fundamentalmente en el septo cuando las
células crecen normalmente, y otra dispersa, como ocurre en los bacilos, cuando la
maquinaria de síntesis de la pared celular pierde su localización específica. En este
último caso las células son capaces de seguir creciendo (hasta 8 veces su volumen
normal) debido a la formación de pared celular nueva a lo largo de toda la bacteria,
dando lugar a células no viables que no pueden ser “rescatadas” cuando se restaura
Discusión 95
su crecimiento normal. Este podría ser nuestro caso: aunque la síntesis de septo está
bloqueada, las células continúan formando peptidoglicano a lo largo de la bacteria, a
través de la síntesis de pared celular de forma dispersa. También se ha observado en
E. coli que cuando se realizan mutaciones en el gen fstI (que codifica PBP3), se
inhibe la síntesis de peptidoglicano durante la división, pero las células son capaces
de seguir creciendo, formando largos filamentos sin septos (Spratt, 1977). Todo esto
sugiere que la diana de la lactococina 972 podría ser o bien la proteína equivalente en
L. lactis a PBP3 de E. coli, o bien cualquier otra proteína que participe en la
elongación del septo.
La proteína homóloga a PBP3 de L. lactis IL1403 es PBP2X (producto del gen
pbpX). Cuando sobreexpresamos esta proteína observamos que las células detenían
su crecimiento, de manera que no pudimos comprobar si su sobreexpresión protegía
o no a las células frente a la lactococina 972. Por ello, como aproximación alternativa
al problema, realizamos en primer lugar un análisis del perfil de PBPs de nuestras
cepas. En todas ellas se detectaron 7 PBPs: PBP 1 (85 kDa), PBP 2a (81 kDa), PBP
2b (79 kDa), PBP 2c (78 kDa), PBP 3 (62 kDa), PBP 4 (55 kDa) y PBP 5 (44 kDa);
aunque la intensidad observada para esta última era mucho mayor en L. lactis
IPLA972 que en MG1614 y su derivado R2, productor de la lactococina 972.
El ensayo de competición entre BOCILLIN y lactococina 972, realizado para
observar si la bacteriocina dificultaba la unión del ȕ-lactámico al centro activo de
alguna PBP de L. lactis MG1614, reveló que se producía una disminución en la
intensidad de una de las bandas del gel, la cual correspondía a PBP4, lo que se
consideró como una primera evidencia de que el blanco molecular de lcn972 podría
ser dicha proteína.
Para confirmar el efecto de la bacteriocina sobre PBP4 de L. lactis se razonó del
siguiente modo: el análogo molecular de esta proteína en E. coli debería ser PBP3,
dado que los antibióticos ȕ-lactámicos específicos para esta PBP bloquean la
formación de septos en E. coli e inducen la filamentación de los cultivos. Es posible,
por lo tanto, que anticuerpos generados frente a PBP3 de E. coli reaccionen frente a
PBP4 de L. lactis, pudiendo revelar así alteraciones en la movilidad electroforética
de esta proteína como consecuencia de su interacción con la bacteriocina. Los
Discusión 96
resultados obtenidos confirmaron la hipótesis. Así, los anticuerpos policlonales
generados frente a PBP3 de E. coli (pAbPBP3) eran capaces de reconocer una
proteína de peso molecular similar a la PBP4 en extractos de L. lactis MG1614
recogidos a diferentes tiempos de incubación. Además, se observó que esta proteína
es más abundante durante la fase exponencial de crecimiento. Estos resultados
concuerdan con el hecho de que la actividad inhibitoria de la lactococina 972 sólo se
observe en células que se encuentran creciendo activamente.
El ensayo de marcaje con anticuerpos pAbPBP3 de extractos de células sensibles
que habían sido previamente incubadas con lactococina 972, reveló la desaparición
de la banda correspondiente a PBP4 y la aparición de una nueva banda de unos 70
kDa, que podría corresponderse con la formación de un complejo PBP4-lcn972. Para
comprobar este hecho, se realizó un segundo marcaje, esta vez con anticuerpos
policlonales frente a la lactococina 972 (pAblcn972), y se observó que la banda
superior de 70 kDa era reconocida por estos anticuerpos, confirmándose así que
correspondía al complejo PBP4-lcn972.
Por último, se ha descubierto que determinados antibióticos ȕ-lactámicos como
la piperacilina y la cefalexina, que se unen exclusivamente a la PBP3 de E. coli
(Botta y Park, 1981; Pogliano et al., 1997), inducen la respuesta SOS (Miller et al.,
2004). Este efecto ocurre porque la inactivación de PBP3 estimula, a través de la
inducción del operón dpiBA, la síntesis de la proteína DpiA, la cual se une al origen
de replicación e impide el acceso al mismo de los factores DnaA y DnaB,
bloqueando así la duplicación del material genético celular. Esto induce el sistema
SOS y particularmente la expresión del gen sfiA, cuyo producto inhibe la
polimerización de FtsZ y, por tanto, la división celular (Miller et al., 2003). De forma
análoga, si la lactococina 972 inhibiera la formación de los septos a través de su
unión al homólogo funcional de PBP3 en L. lactis, podría esperarse que indujera la
respuesta SOS en este organismo.
Ahora bien, una de las consecuencias de la respuesta SOS es la inducción de los
profagos residentes en los genomas bacterianos, lo que ocurre porque la proteasa
RecA rompe el represor viral, induciéndose así el ciclo lítico de dichos fagos
(Ptashne, 1992).
Discusión 97
Todos los fagos atemperados de L. lactis descritos hasta el momento se engloban
en la especie P335, y todos ellos comparten homología de secuencia a nivel de ADN
en un único gen que codifica para una dUTPasa (Labrie y Moineau, 2002).
En este contexto, si L. lactis MG1614 fuera lisogénico para algún fago, una
característica muy común entre las cepas de lactococos (Cuesta et al., 1995), podría
ocurrir que el tratamiento de sus cultivos con lactococina 972 indujera la liberación
de una progenie viral, lo que indirectamente confirmaría la acción de la bacteriocina
sobre el homólogo funcional de PBP3 de E. coli. La producción de nuevos fagos
podría detectarse bien por la aparición de placas de lisis sobre céspedes de otros
lactococos, o bien por amplificación de un segmento de ADN limitado por
oligonucleótidos correspondientes al gen de la dUTPasa. La inducción de profago no
dio lugar a placas de lisis en las cepas indicadoras utilizadas, pero sí fue posible
amplificar ADN fágico. Por lo tanto, los resultados obtenidos indican que la
lactococina 972 induce un profago residente en el genoma de L. lactis MG1614,
presumiblemente como consecuencia de la activación de la respuesta SOS, lo que
apunta a que, como se había postulado, la bacteriocina inhibe al homólogo de PBP3
de E. coli, el cual había sido identificado en experimentos anteriores como PBP4 de
L. lactis.
De todo lo anterior se deduce que PBP4 sería una transpeptidasa de localización
preferente en el septo de división, lo que indirectamente explicaría el efecto
antagonista parcial del tripéptido diacetil-L-Lys-D-Ala-D-Ala sobre la actividad de la
bacteriocina, ya que éste, al ser un análogo del sustrato del enzima (Nguyen-Disteche
et al., 1982), podría dificultar la unión de la lactococina 972 a PBP4.
Así pues, parece claro que la lactococina 972 tiene un modo de acción
radicalmente diferente al mostrado por los péptidos catiónicos antimicrobianos que,
como ya se indicó, inducen la formación de poros en la membrana citoplasmática.
Sin embargo, es posible que su acción sobre la pared celular, y en concreto en la fase
de septación, no sea un caso excepcional. En un trabajo reciente (Friedrich et al.,
2000) sobre la acción de diferentes péptidos catiónicos sintetizados químicamente
frente a bacterias Gram-positivas, se observó que algunos de ellos son capaces de
inducir septación anormal, e incluso uno de ellos (Bac2A-NH2, una versión
Discusión 98
linealizada de 12 aminoácidos del péptido cíclico bactenecina, producido por los
neutrófilos bovinos) es capaz de provocar la lisis de células de S. aureus actuando en
la zona de formación del septo.
Por lo tanto, la lactococina 972 tiene un valor aplicado potencial como prototipo
de una nueva familia de compuestos que, inhibiendo la actividad enzimática de las
PBPs, no poseen anillo ȕ-lactámico. Estos compuestos, en principio, deberían ser
activos sobre bacterias patógenas productoras de ȕ-lactamasas y no deberían inducir
efectos colaterales indeseables, ya que la septación es un proceso que no tiene lugar
en los organismos eucariotas. Ahora bien, la aplicación de estos compuestos pudiera
verse limitada por el espectro de acción tan estrecho de la lactococina 972. Por ello,
es necesario seguir profundizando en el estudio de la interacción PBP-lactococina,
con el objeto de determinar qué componentes del dipéptido están implicados en el
reconocimiento específico de las células diana y cuáles antagonizan la actividad
transpeptidasa de estos enzimas.
3. PRODUCCIÓN DE LA LACTOCOCINA 972
Y METABOLISMO DE L. lactis IPLA972
La explotación de la cepa bacteriocinogénica L. lactis IPLA972 como cultivo
iniciador, así como la obtención de grandes cantidades de lactococina 972 para poder
estudiarla en profundidad, nos impulsó a realizar un estudio exhaustivo de los
parámetros fisiológicos óptimos que permitiesen obtener una producción máxima
tanto de biomasa como de bacteriocina. Para ello se estudió el efecto de la fuente de
carbono en el crecimiento, metabolismo y producción de lcn972 en cultivo en
discontinuo, mientras que en cultivo en continuo (quimiostato) se evaluaron los
efectos combinados de la tasa de dilución y de la fuente de carbono.
Estos estudios complementarían a otros realizados previamente (Martínez, 1996)
en los cuales se evaluó la influencia del pH en la producción de lactococina 972 en
cultivo en discontinuo. Los resultados obtenidos revelaron que la producción de
bacteriocina en medio de crecimiento M17 era máxima cuando el pH se mantuvo
constante a un valor de 6,8. Por lo tanto, este fue el valor que se eligió para realizar
Discusión 99
los cultivos, tanto en discontinuo como en continuo, de la cepa productora L. lactis
IPLA972, y se utilizó un medio de cultivo complejo, ESTY (de composición idéntica
al M17), suplementado con glucosa o lactosa.
Los valores de las velocidades de crecimiento obtenidos en los cultivos en
discontinuo son elevados, como era de esperar cuando se utilizan medios de
crecimiento complejos, de acuerdo con lo observado anteriormente para otros
lactococos (Thompson y Gentry-Weeks, 1994). A pH 6,8, los rendimientos en
biomasa (0,23 a 0,37 gDCW/g) fueron similares a los descritos para otros lactococos
silvestres (R. Cárcoba, comunicación personal). Este parámetro disminuye a medida
que la concentración en glucosa se incrementa en el medio de cultivo, lo cual podría
sugerir un mayor consumo en energía destinado al mantenimiento celular,
probablemente debido a la acumulación de productos metabólicos finales en
concentraciones que pueden resultar tóxicas para las células (Bibal et al., 1998;
Loubiere et al., 1997).
En los cultivos en continuo se observa que, a medida que aumenta la
concentración de azúcar en el medio, se incrementa la biomasa dentro de un amplio
rango de tasas de dilución (0,090 – 0,673 h-1). Esto nos indica que es muy
improbable que cualquier otro componente del medio de cultivo sea limitante. Sin
embargo, a D > 0,673 h-1, la biomasa se reduce considerablemente a pesar de que se
detecta un exceso de fuente de carbono, y se produce un lavado de los cultivos en el
medio que contiene una concentración de lactosa del 5 g/L a D > 0,894 h-1. La única
excepción se observa en el medio con glucosa 5 g/L, en el cual no se detecta azúcar
residual. En este sentido, cabe señalar que algunos autores indican que la arginina es
el nutriente limitante en los cultivos en continuo cuando en el medio existe un exceso
de fuente de carbono (Goldner et al., 1985).
De acuerdo con el patrón de productos metabólicos finales, L. lactis IPLA972 se
comporta como una cepa homoláctica, capaz de sintetizar ácido láctico en grandes
cantidades. Sin embargo, es capaz de producir un cambio hacia un metabolismo
ácido-mixto, principalmente en los cultivos en continuo a bajas tasas de dilución. En
la literatura se ha descrito que este cambio tiene lugar cuando el flujo glicolítico está
limitado por la disponibilidad del azúcar (Cocaign-Bousquet et al., 2002). Se ha
Discusión 100
observado que este metabolismo ácido-mixto mejora considerablemente las
propiedades organolépticas de los quesos fermentados con lactococos silvestres
(Cárcoba et al., 2000; Rilla et al., 2003).
En lo referente a la producción de bacteriocina, los resultados obtenidos
confirman la importancia de la elección de las condiciones apropiadas para su
biosíntesis, favoreciéndose en medios que proporcionan una alta densidad celular
(Parente y Ricardi, 1999). De acuerdo con esto, cuando incrementamos la
concentración de la fuente de carbono observamos en los cultivos en discontinuo que
aumenta considerablemente la producción de lcn972. En nuestro estudio utilizamos
20 g/L como límite superior de concentración de fuente de carbono. Descartamos la
utilización de niveles superiores porque existen diversos estudios que indican que
concentraciones muy altas, no sólo no aumentan el título de bacteriocina sino que
poseen efectos negativos en la producción de la misma (Parente et al., 1997; Zamfir
et al., 2000; Guerra et al., 2001; Cheigh et al., 2002). Además, la cepa L. lactis
IPLA972 es muy acidificante y los niveles de ácido láctico y fórmico obtenidos (125
nM y 20 mM, respectivamente) son muy próximos a los descritos como
autoinhibitorios (Cachon y Divies, 1993; Loubiere et al., 1997).
La naturaleza de la fuente de carbono (glucosa o lactosa) apenas afecta al total
de la actividad de bacteriocina obtenida en los cultivos en discontinuo. Sin embargo,
el rendimiento de bacteriocina y la velocidad específica de producción fueron
superiores en los cultivos con lactosa. Esto podría implicar una regulación mediante
la fuente de carbono, como en el caso de la nisina, cuyo promotor es inducible por la
lactosa y galactosa (Chandrapati y O’Sullivan, 2002).
Los datos de producción de bacteriocina en los cultivos en discontinuo deben
interpretarse con precaución a la hora de obtener las conclusiones sobre la cinética de
la producción de bacteriocina, puesto que los niveles detectados en los sobrenadantes
representan el balance entre la acumulación y la inactivación durante el proceso de
fermentación. Además, en este tipo de cultivos existen diferentes variables que son
susceptibles de cambiar a lo largo del periodo de incubación, como la velocidad de
crecimiento, la disponibilidad del nutriente limitante y la acumulación de los
productos metabólicos finales, lo cual puede influenciar la velocidad de síntesis de la
Discusión 101
bacteriocina. A este respecto, los cultivos en quimiostato nos ofrecen la posibilidad
de manipular la velocidad de crecimiento, mientras el resto de las variables se
mantienen constantes.
Así, la producción de bacteriocina en quimiostato confirma que sigue la cinética
de un metabolito primario asociada con el crecimiento celular, ya que la síntesis de
lcn972 tiene lugar, principalmente, a tasas de dilución cercanas a la µmax (91% -
96%) en las diferentes condiciones de fuente de carbono ensayadas, excepto en
presencia de lactosa 20 g/L. En este caso, el máximo de la producción tiene lugar al
66% de la µmax. Sin embargo, este dato debe tomarse con precaución debido a la
fuerte adherencia celular a la pared del vaso (wall-growth), observada a altas D bajo
estas condiciones de crecimiento. Debido a esto, los cálculos de los parámetros
cinéticos no son muy exactos, pues las células adheridas pueden sintetizar
bacteriocina pero no son cuantificadas como biomasa. Este fenómeno ha sido
descrito previamente en los lactococos (Rogers et al., 1978) y se ha asociado a
cambios en la superficie bacteriana debidos, por ejemplo, a la síntesis de
exopolisacáridos, un hecho común entre las BAL que se encuentran creciendo en
exceso de fuente de carbono (de Vuyst et al., 2001). Precisamente, es éste el
ambiente en el que se encuentran los cultivos de L. lactis IPLA972 cuando estamos
trabajando a valores altos de D.
En los cultivos en quimiostato, se observa también una elevada influencia de la
tasa de dilución en la síntesis de lcn972. Esta correlación con la velocidad de
crecimiento ha sido descrita para otras bacteriocinas. La producción de nisina y
plantaricina C (Meghrous et al., 1992; Bárcena et al., 1998) tiene lugar a valores de
D inferiores a la µmax, mientras que existe una relación lineal para la bavaricina MN y
la enterocina 1146 (Kaiser y Monteville, 1993; Parente et al., 1997).
Los rendimientos en lcn972 se mejoran unas 10 veces en los cultivos en
continuo. De los diferentes tipos de cultivo utilizados, se obtiene el mejor
rendimiento en quimiostato a pH 6,8 y glucosa 20 g/L. De esta manera, podemos
asegurar altos niveles de lcn972 en los sobrenadantes en un amplio rango de
condiciones (entre 12% y 91% de la µmax), lo que facilitaría la obtención lcn972 en
grandes cantidades, destinadas a la caracterización posterior de esta bacteriocina.
Discusión 102
Además, estas condiciones de crecimiento son adecuadas también para obtener una
gran cantidad de biomasa, necesaria para disponer de concentrados de la cepa
productora que podrían ser utilizados como cultivo iniciador en la fabricación de
quesos.
CONCLUSIONES
Conclusiones 103
V. CONCLUSIONES
1ª El plásmido pBL1, de 10,9 kb, alberga todos los determinantes genéticos
necesarios para la biosíntesis de la lactococina 972 y para la inmunidad de la
cepa productora frente a dicho péptido antimicrobiano. En el plásmido se
distinguen dos regiones que están flanqueadas por secuencias de inserción
derivadas de ISS1. Una de ellas alberga los genes de replicación, mientras en
la otra se encuentran los tres genes responsables de la síntesis/inmunidad de
la bacteriocina.
2ª Los genes de síntesis/inmunidad de la bacteriocina forman un único operón,
cuyos transcritos presentan regiones 5’ y 3’ que no se traducen y que,
presumiblemente, les confieren estabilidad.
3ª La lactococina 972, producto de la expresión de lclA, se sintetiza como una
prebacteriocina que contiene un péptido señal, típico de las proteínas que se
exportan por el sistema SEC de secreción general. El resto de la molécula
presenta una alta proporción en aminoácidos de pequeño tamaño, lo que le
confiere un alto grado de libertad conformacional.
Conclusiones 104
4ª Las proteínas LclB y LclC, que derivan de los otros dos genes del operón,
presentan características que sugieren que actúan coordinadamente. LclB
posee varios segmentos hidrofóbicos que indican una localización
transmembranal, mientras que LclC presenta los motivos típicos de las
proteínas que transfieren energía a través de la hidrólisis de ATP. Se postula
que ambas participan en la inmunidad frente a la bacteriocina, al impedir que
alcance su blanco molecular de acción.
5ª En los genomas de múltiples bacterias Gram-positivas aparecen operones con
una organización semejante a la del que codifica para la lactococina 972. Este
hecho, junto a la presencia del operón de la bacteriocina en un plásmido y que
esté flanqueado por secuencias de inserción, sugiere que dicho operón se
habría incorporado a un plásmido ancestral críptico, para dar lugar a pBL1.
6ª En Lactococcus lactis se han detectado siete proteínas de unión a penicilina
con tamaños que oscilan entre 85 y 44 kDa. De entre ellas, la PBP4, de 55
kDa, es el blanco al que se une la lactococina 972, lo que tiene como
consecuencia el bloqueo de la formación del septo de división celular. Por
tanto, PBP4 de L. lactis se comporta fisiológicamente como la PBP3 de
Escherichia coli, una transpeptidasa cuya inhibición provoca la detención de
la generación del septo en este último organismo. Esta semejanza no es solo
funcional, sino también estructural, ya que anticuerpos generados contra
PBP3 de E. coli, reconocen a PBP4 de L. lactis como antígeno.
7ª La lactococina 972 induce la respuesta SOS en Lactococcus lactis ya que
provoca la inducción de un profago en una cepa lisogénica. De modo
semejante, ciertos antibióticos ȕ-lactámicos, específicos para la proteína
PBP3 también inducen la respuesta SOS en E. coli. Este es un nuevo dato a
favor de la identidad funcional de PBP4 de L. lactis y PBP3 de E. coli.
Conclusiones 105
8ª La cinética de biosíntesis de la lactococina 972 es la propia de un metabolito
asociado a crecimiento, es decir, su concentración aumenta de forma
directamente proporcional al incremento en biomasa que se produce durante
la fase exponencial de crecimiento de Lactococcus lactis IPLA972 cuando se
cultiva en cultivo discontinuo. Correspondientemente, el incremento de la
concentración de fuente de carbono (glucosa o lactosa) se traduce en un
mayor rendimiento en bacteriocina.
9ª La cinética de metabolito asociado a crecimiento mostrada por la lactococina
972 fue corroborada mediante cultivo continuo (quimiostato), dado que la
biosíntesis de bacteriocina tuvo lugar principalmente en tasas de dilución
próximas a la µmax en todas las condiciones de fuente de carbono ensayadas,
excepto en presencia de 20 g/L de lactosa. En este caso, el máximo de
producción tuvo lugar a una tasa de dilución equivalente al 66% de la µmax.
10ª El cultivo en continuo (quimiostato) en un medio de crecimiento complejo a
pH 6,8 y utilizando como fuente de carbono glucosa a 20 g/L, permite
obtener el máximo rendimiento en bacteriocina, que se consigue, además, en
un amplio rango de tasas de dilución (entre el 12 % y el 91 % de µmax).
11ª La cepa productora de lactococina 972 muestra un metabolismo
predominantemente homoláctico con las dos fuentes de carbono ensayadas y
a altas tasas de dilución. A tasas bajas, la menor disponibilidad de azúcar se
traduce en un cambio hacia un metabolismo ácido-mixto, de modo que,
además de ácido láctico, se producen otros ácidos orgánicos (acético y
fórmico).
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