Tesis de Grado - Final

5/26/2018 Tesis de Grado - Final

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL COMAHUE

FACULTAD DE INGENIERA

TESIS DE GRADO:

Determinacin de la condicin ptima para la

produccin de biomasa de CryptoccocusvictoriaeNPCC 1263 mediante diseo

experimental.

Tesista: HEINE, Sebastin.

Carrera: Ingeniera Qumica

Legajo: 109599

Directora: Dra. Marcela Sangorrn

Ao: 2013

Lugar de trabajo: Grupo de Biodiversidad y Biotecnologa de levaduras.

Departamento de Qumica, Facultad de Ingeniera.

Instituto Multidisciplinario de Investigacin y Desarrollo de la

Patagonia Norte (IDEPA)

Universidad Nacional del Comahue-CONICET


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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL COMAHUE - Facultad de Ingeniera

Tesis de grado

i

Agradecimientos

A mi familia, por haber sido un soporte fundamental a lo largo de mi carrera universitaria.

A mi novia, por saber respetar mis tiempos y por darme fuerzas continuamente para seguir

adelante.

A mi tutora Marcela Sangorrn, por ser mi gua durante este proyecto y por dedicar parte de

su tiempo para que esto sea posible.

A todo el equipo que forma parte del laboratorio de Biodiversidad y Biotecnologa de

Levaduras, por su buen trato y por su continua enseanza.

A la facultad de ingeniera y al Instituto multidisciplinario de Investigacin y Desarrollo de

la Patagonia Norte (IDEPA), por haberme abierto las puertas de sus instalaciones y por

proveer el equipamiento y material necesario para la realizacin de este proyecto.

Al personal docente y a la Universidad Nacional del Comahue en general, por haber

participado mi formacin acadmica y social.

A todos aquellos que colaboraron de alguna manera en la elaboracin de este proyecto.


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ii

INDICE

RESUMEN iv

ABSTRACT v

KEYWORDS v

INTRODUCCIN

1. Produccin de peras 1

1.1Cadena frutcola

2. Produccin orgnica 3

3. Podredumbres de postcosecha en peras. 54. Uso de pesticidas 6

5. Control biolgico 6

6. Importancia de optimizar la produccin de biomasa 8

7. Diseo estadstico de experimentos 9

8. Superficies de respuesta 11

7.1 Metodologa de superficies de respuesta (MSR)

7.2 Diseo central compuesto

7.3 Diseo compacto

7.4 Diseo central compuesto centrado en las caras

9. Melaza como medio de cultivo 15

10. Cintica de cultivo por lotes (batch) 16

10.1 Parmetros de produccin

10.2 Reactor batch

OBJETIVOS 19

MATERIALES Y MTODOS 20

1. Material biolgico 20

2. Equipamiento 20

3. Medio de cultivo 20

3.1 Preparacin

4. Diseo experimental 20


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iii

5. Codificacin de variables 21

6. Crecimiento microbiano a pequea escala 22

6.1 Preparacin del inculo

6.2 Experiencias en Erlenmeyer

6.3 Medicin de azcares totales

7. Modelado del crecimiento 23

8. Anlisis estadstico: superficie de respuesta 24

9. Produccin de biomasa en reactor de 20 L 24

9.1 Preparacin del inculo:

9.2 Condiciones de cultivo en el reactor:

9.3 Curva de crecimiento

9.4 Obtencin de la biomasa

9.5 Cuantificacin de la biomasa obtenida

9.6 Detalles del reactor.

RESULTADOS 28

1. Modelado del crecimiento 29

2. Superficie de respuesta 30

2.1 Modelos

3. Produccin de biomasa a nivel reactor 36

3.1 Curvas de crecimiento en reactor

DISCUSIN 40

CONCLUSIONES 43

BIBLIOGRAFA 44

PAGINAS WEB 49

ANEXOS I 50

ANEXO II 68


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iv

RESUMEN

Argentina es la primera exportadora de peras del Hemisferio Sur y la quinta en manzanas anivel mundial. El hecho de que la produccin de fruta se concentre en determinados perodos

y que la demanda se realice durante todo el ao, obliga a conservar la misma para regular su

oferta. Durante esta conservacin la fruta es susceptible a diferentes enfermedades fngicas

causando podredumbres. Las podredumbres ms frecuentes corresponden a infecciones por

hongos filamentosos como el moho azul producido por Penicillium expansumy al moho

gris producido por Botrytis cinerea. En la actualidad existe una fuerte demanda social por

una vida saludable, con alimentos naturales y una gran preocupacin por la preservacin delambiente. En este contexto, el Control Biolgico resulta como una de las alternativas ms

prometedoras para la sustitucin de los fungicidas, en particular por las ventajas que presenta

en cuanto a la sustentabilidad ambiental. El grupo de Biodiversidad y Biotecnologa de

Levaduras seleccion dos levaduras antagonistas (con potencial aplicacin en control

biolgico): Cryptoccocus victoriaeNPCC 1263 yPichia membranifaciensNPCC 1250.

Con el fin de mejorar la produccin de biomasa de la levadura antagonista C. victoriaeNPCC

1263 se buscaron las condiciones ptimas de crecimiento en un volumen pequeo de 250 ml

con 100 ml de medio y posteriormente se realiz el cambio de escala de la mejor condicin

establecida en un reactor de 20 L.

La optimizacin se realiz aplicando un Diseo Estadstico Experimental (DEE). Se eligi un

diseo central compuesto centrado en las caras para evaluar diferentes concentraciones de

Melaza, temperaturas de cultivo, niveles de agitacin y diferentes concentraciones de fuente

de nitrgeno, obteniendo como resultado una influencia predominante de la temperatura y de

la fuente de carbono en el crecimiento de la levadura. Los resultados fueron ajustados a una

regresin polinomial obtenindose una superficie de respuesta de las variables significativas

que permiten explicar el crecimiento de biomasa para la pequea escala.

La condicin ptima obtenida a pequea escala temperatura 13C, agitacin 120 rpm, urea

0,2 g/L y concentracin de melaza 6,4 g/L (mezcla compleja obtenida como subproducto de la

elaboracin de azcar de caa compuesta principalmente por sacarosa, monosacridos, sales

y otros compuestos slidos solubles) se reprodujo en reactor de 20 litros cuyos resultados

fueron comparados a modo de determinar la desviacin existente entre la produccin a

diferentes escalas


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v

ABSTRACT

Argentina is the leading pears exporter of Southern Hemisphere and the fifth worldwide

apples exporter. The fact that fruit production concentrates in certain periods and demand is

made throughout the year, force fruit to be stored to regulate their offer. During conservation

fruit is susceptible to several fungal diseases causing rot. Most common decay correspond to

"blue mold" produced by Penicillium expansum and "gray mold" produced by Botrytis

cinerea. Nowadays, a strong social demand for healthy natural food and great concern for

environment preservation exist. In this context, biological control is one of the most

promising alternatives to replace fungicides, particularly due to the advantages in terms of

environmental sustainability. Yeast Biodiversity and Biotechnology group selected two

antagonists yeast: Cryptoccocus victoriae NPCC 1263 and Pichia membranifaciens NPCC

1250.

In order to improve biomass production of the antagonist C. victoriaeNPCC 1263 yeast, the

optimal growth conditions were reached in a small volume (250 mL flask containing 100 mL

of medium) and then the best condition was scaled in a 20 L reactor.

The optimization was performed using Statistical Experimental Design (SED). Face-centered

Design was chosen to evaluate different molasses culture concentrations, temperature,

agitation levels and nitrogen source concentrations, resulting in a considerable influence of

temperature and carbon source in yeast growth. Results were adjusted to a surface response

achieving a polynomial regression of the significant variables which explain biomass growth

at small scale.

The optimal condition obtained at small scale (6.4 molasses g / L, temperature 13 C,

agitation 120 rpm, urea 0.2 g / L) was reproduced in a 20 liter reactor and results were

compared to determine deviation between output at different scales.

KEYWORDS:

Optimization, face centered design, surface response, Statistical Experimental Design,

molasses, biomass, Cryptoccocus victoriae,biological control.


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- 1 -

INTRODUCCIN.

1. PRODUCCION DE PERASArgentina es la primera exportadora de peras del Hemisferio Sur y la quinta en manzanas a

nivel mundial. Esto constituye la principal actividad econmica en la provincia de Ro Negro

y una de las ms importantes en la provincia de Neuqun, que en conjunto representan la

mitad de las exportaciones de fruta fresca del pas, representando anualmente un promedio de

460.000 toneladas de peras y 280.000 toneladas de manzanas. Esto convierte al pas en un

gran proveedor del mercado mundial. En los ltimos aos se observa en estos valles un

incremento paulatino en las superficies destinadas a perales y una disminucin en las

cultivadas con manzanos (Altube et al, 2007).

El rea productiva es de 50.000 hectreas implantadas con frutales, 85% en Ro Negro y 15%

en Neuqun, con unos 4.000 productores, 260 establecimientos de acondicionamiento y

empaque, 220 establecimientos frigorficos, y 11 empresas que elaboran jugo concentrado. En

conjunto generan 50.000 puestos de trabajo directos y 15.000 indirectos y tienen gran

relevancia en la estructura socioeconmica de las dos provincias, fundamentalmente en la

ocupacin de mano de obra (CAFI, 2013).

1.1 Cadena frutcola:

La cadena frutcola de peras y manzanas est integrada principalmente por las siguientes

etapas (Figura 1):

Produccin: En la regin se utilizan los sistemas de produccin frutcola

convencional y orgnica. En el sistema de produccin convencional, el control de

plagas y enfermedades tradicionalmente se basa en la aplicacin de agroqumicos a

campo, fungicidas de sntesis y antiescaldantes en la postcosecha. En cuanto al

sistema de produccin orgnica, se plantean estrategias de manejo preventivo, en que

slo se utilizan productos de origen ecolgico (biopesticidas) y se aplican estrictas

medidas de higiene y desinfeccin con hipoclorito de sodio en las plantas de

empaque y las cmaras frigorficas (SENASA, 2007; CAFI, 2008).

Empaque: Consiste en la clasificacin de la fruta ingresada a las plantas industriales,

en base a criterios de calidad (sanidad del fruto, tamao, y color) y posteriormente el

envasado en distintos tipos de contenedores de acuerdo al destino de la fruta


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- 2 -

Conservacin: Desde el momento en que la fruta es cosechada, es indispensable

contar con una cadena de fro que garantice la adecuada conservacin de la misma.

En la regin frutcola de peras y manzanas existen importantes inversiones en

plantas frigorficas de fro convencional y de atmsfera controlada. De esta forma

puede mantenerse el producto en adecuadas condiciones de calidad y sanidad para

poder ser comercializado en los distintos momentos del ao, dependiendo de las

variedades que se trate, como as tambin de los distintos mercados de destino. El

uso de atmsfera controlada posibilita el almacenamiento de la pera durante

perodos de hasta 9 meses para retrasar su comercializacin y obtener mejores

precios (Graell et al, 2003).

Comercializacin: La fruticultura de pepita de la regin del Valle de Ro Negro y

Neuqun, siempre ha tenido un fuerte perfil exportador. Los principales destinos

de las exportaciones son la Unin Europea, Rusia, Brasil, y Estados Unidos,

exportndose hoy a ms de 50 pases. En el caso de las exportaciones de ultramar,

la regin ha alcanzado un significativo desarrollo logstico que permite hoy

integrar la cadena hasta la salida de los buques y contenedores, con fuertes

inversiones en transporte terrestre y una profesionalizada organizacin de los

puertos de San Antonio Este y Baha Blanca (CAFI, 2008) .

Figura 1. Cadena productiva de peras y manzanas (COFECYT, 2013).


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- 3 -

2. PRODUCCIN ORGNICA:

La agricultura orgnica forma parte de una vasta gama de metodologas que apoyan la

proteccin del medio ambiente. Los sistemas de produccin orgnica se basan en normas de

produccin especficas y precisas cuya finalidad es lograr agroecosistemas ptimos, que sean

sostenibles desde el punto de vista social, ecolgico y econmico.

Argentina cuenta con ventajas naturales y competitivas para la produccin de alimentos

orgnicos, y con ello est en condiciones de incrementar la oferta y contribuir a satisfacer la

demanda de productos orgnicos, no slo a nivel de produccin de materias primas

agroalimenticias, sino tambin de productos con distintos grados de transformacin. La

produccin agropecuaria argentina se ha caracterizado por la utilizacin de un bajo nivel de

agroqumicos, y si bien en los ltimos aos ha aumentado su utilizacin, no llega a niveles

comparables a los de los pases desarrollados. Adems, el paso de la agricultura

convencional a la produccin orgnica no suele plantear a los productores mayores

dificultades, debido al modo de produccin convencional sin uso de agroqumicos, y por

las caractersticas agroecolgicas de las zonas de produccin. La extensin y fertilidad

natural de los suelos, la abundancia de tierras vrgenes y el escaso empleo de insumos

qumicos en las prcticas agrcolas convencionales permite que los agricultores pasen a la

produccin orgnica sin necesidad de introducir importantes ajustes a sus mtodos de

explotacin .(SENASA, 2009)

En este contexto se presenta en Figura 1 la evolucin de la superficie destinada a la

produccin orgnica en Argentina a lo largo de los ltimos aos observndose un incremento

del 600% desde 1995 y 2011 (SENASA, 2001, 2009, 2013).


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- 4 -

Figura 2: Superficie de cultivosorgnicos cosechados en

Argentina.

En tablas 1 y 2 se observa el incremento tanto de la superficie implantada con frutales de

peras y manzanas como el incremento de las exportaciones de dichos productos en la ltima

dcada.

Tabla 1: Superficie implantada con frutales de pera y manzana en Rio Negro y

Neuqun (ha)

Ao Orgnica Convencional

Manz y pera % Peras Manzanas Total

2000 800 1,85 17300 26000 43300

2008 2600 5,57 22500 24200 46700

2012 3068 6,49 23800 23500 47300

Tabla 2: Exportacin de manzanas y peras (Tn)

Ao Orgnica Convencional

Manz y pera % Peras Manzanas Total

2000 10800 1,80 350000 250000 600000

2008 36000 5,75 413949 212623 626572

2012 32000 4,97 429626 214426 644052

El sector de productos orgnicos cuenta con la ventaja, respecto de los tradicionales, de

que se est manifestando un gran crecimiento de la oferta de productos orgnicos elaborados

en el mundo. Por lo cual, en la Argentina queda abierta la posibilidad de desarrollar un amplio

potencial de productos de alto valor para ser colocados en los mercados demandantes.


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En conclusin, si bien el sector se viene desarrollando desde hace varios aos, en

nuestro pas existen amplias posibilidades de incrementar y diversificar la produccin

debido a una gran demanda insatisfecha y al potencial de produccin que se observa

(SENASA, 2009).

3. PODREDUMBRES DE POSTCOSECHA EN PERAS.

El hecho de que la produccin de fruta se concentre en determinados perodos y que la

demanda se realice durante todo el ao, obliga a conservar la misma para regular su oferta.

Como todo producto perecedero, esta requiere de tecnologas adecuadas que permitan el

mantenimiento de sus caractersticas organolpticas y su apariencia durante el tiempo deconservacin (febrero a septiembre) (Mondinoet al, 2006).

No obstante, durante esta conservacin la fruta es susceptible a diferentes enfermedades

fngicas que se desarrollan invadiendo los tejidos y causando podredumbres por diferentes

especies de hongos filamentosos (Barkaiet al, 2001). Una de las condiciones que favorecen el

desarrollo de podredumbre son las heridas en los frutos ya que constituyen la va de entrada

de los patgenos de postcosecha. Es por ello que resulta de gran importancia minimizar la

ocurrencia de heridas mediante prcticas cuidadosas de cosecha y manipuleo de la fruta en la

postcosecha (Vero et al, 2004).

Las podredumbres ms importantes de manzana y pera en postcosecha corresponden al

moho azul producido por Penicillium expansum y al moho gris producido por Botrytis

cinerea (Figura 3 y 4).

Figura 3: Morfologa de los patgenos. A:P.expansum1x. B:P. expansum. C:B. cinerea

1x. D:B. cinerea 400x.

A B

CD


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Figura 4: Podredumbre en peras. A: Mohogris producido por B. cinerea. B: Moho azul

producido porP. expansum(Sosa, 2010).

4. USO DE PESTICIDAS.Tradicionalmente, el uso de fungicidas sintticos ha sido la primera medida en el control de

estas enfermedades. Sin embargo, esta medida est siendo actualmente reevaluada debido a

los problemas de toxicidad provocados para el hombre, a las restricciones impuestas por los

mercados importadores y a la aparicin de cepas resistentes a los fungicidas utilizados. Segn

la U.S. National Academy of Sciences, un 60% de los fungicidas usados habitualmente

presentan riesgos oncognicos para los consumidores (Leverentz et al, 2002).

Los contenidos mximos de residuos de fungicidas permitidos han sido establecidos a nivel

mundial por diferentes directrices, que representan en muchos casos una barrera para el

comercio y en especial para las exportaciones de nuestra fruta al resto de los pases.

5. CONTROL BIOLGICO.El biocontrol consiste en la aplicacin de microrganismos naturales o modificados, para

reducir los efectos de microorganismos indeseables que daan la fruta. Los microrganismos

antagonistas comprenden cualquier organismo que interfiera en la supervivencia o el

desarrollo de los patgenos (Ezziyyanyet al, 2006).

En la actualidad existe una fuerte demanda social por una vida saludable, con alimentos

naturales y una gran preocupacin por la preservacin del ambiente. De este modo, para poder

dar respuestas a estas demandas se desarrollan, en la mayora de los pases, distintos

programas de Produccin Integrada y de Buenas Prcticas Agrcolas. En este contexto, el

A B


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Control Biolgico resulta como una de las alternativas ms prometedoras para la sustitucin

de los fungicidas en particular por las ventajas que presenta en cuanto a la sustentabilidad

ambiental.

Los ambientes donde se conservan los frutos de postcosecha presentan caractersticas

favorables para el desarrollo y aplicacin prctica de mtodos de Control Biolgico (Mari et

al, 2003), ya que son ambientes reducidos y con condiciones controladas. El elevado valor

agregado de los productos cosechados determina la viabilidad de desarrollo de mtodos de

control ms elaborados, que no seran econmicamente aplicables a campo (Wilson et al,

1992; Janisiewicz et al, 2005).

Los esfuerzos de investigacin se enfocan en la bsqueda de microorganismos epfitos,

capaces de controlar a los patgenos por medio de reduccin del inculo o por el bloqueo de

una o varias etapas de su ciclo infeccioso utilizando distintos mecanismos de accin (Spadaro

et al, 2004; Mondito et al, 2006). Los agentes de control biolgico (ACB) no tienen un nico

modo de accin y esta propiedad es frecuentemente una caracterstica a seleccionar cuando se

desea obtener un microorganismo con estos fines. El riesgo de resistencia por parte del hongo

se reduce si el antagonista acta por varios mecanismos, o si se emplean combinaciones de

antagonistas cada uno con diferente modo de accin (Conway et al, 2007). Existen varios

mecanismos posibles de accin para los antagonistas de uso en postcosecha, entre los que seencuentran: la produccin de antibiticos, de enzimas hidrolticas y de toxinas killer; la

competencia por nutrientes o espacio; el parasitismo y la induccin de resistencia del husped

(Sparado et al, 2002; Freulund et al, 2002; Calvo et al, 2007; Reuveni et al, 2007).

Las levaduras son organismos ideales paras ser usadas como antagonistas debido a que: 1)

pueden ser aisladas de los mismos alimentos que se quieren preservar; 2) pueden utilizar un

amplio rango de nutrientes y muchas pueden crecer a baja actividad de agua, bajos niveles de

oxgeno y baja temperatura; 3) son genticamente estables y efectivas en bajas cantidades; 4)tienen capacidad de sobrevivir en condiciones ambientales adversas y 5) no son patgenas y

no producen esporas alergnicas, micotoxinas u otros metabolitos que puedan comprometer la

salud humana (Wan et al, 2005).

Esta estrategia, propuesta a mediados del siglo XX, est an hoy en desarrollo. En los ltimos

aos se ha intensificado la investigacin en el campo del Control Biolgico de las

enfermedades de postcosecha en fruta; dentro de los cuales podemos destacar los realizados

sobre manzana y pera , frutos de carozo, ctricos y pltanos empleando levaduras como ACB


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(Sharma et al, 2009; Janisiewicz et al, 2010; Teixido et al, 2011). Entre las especies de

levaduras ms empleadas como organismos antagonistas se destacan: Candida saitoana,

Debaryomyces hansenii, Cryptococcus laurentii, Rhodotorula glutinis, Metschnikowia

pulcherrima y Pichia anomala (Droby et al, 2009; Jijakli et al, 2011). Existen en la

actualidad por lo menos cuatro productos comerciales cuyo principio activo es un

microorganismo antagonista para su uso como biocontrolador de enfermedades de frutas en

postcosecha. No obstante, en nuestro pas, an no se han registrado formulados comerciales

cuyo ingrediente activo sean levaduras para su uso como ACB. Han dificultado su uso el

elevado costo de la importacin del producto y la inconsistente respuesta que se ha observado

cuando stos son probados en regiones distintas a las de su origen.

La seleccin apropiada de microorganismos ACB determina en gran medida el xito de los

programas de desarrollo de sistemas de control biolgico. Diferentes estrategias de bsqueda

y seleccin del ACB ms apropiado han sido utilizadas a nivel mundial. Sin embargo las ms

prometedoras resultan ser aquellas en las que los ACB son aislados en lugares en donde no

ocurre enfermedad en presencia de patgeno y en un ambiente favorable al desarrollo de la

misma, como son las cmaras frigorficas de conservacin. Cabe esperar que en ese mbito

est actuando algn tipo de biocontrol natural que permite que la fruta se conserve libre de

podredumbre durante varios meses de conservacin.El grupo de Biodiversidad y Biotecnologa de Levaduras comenz a estudiar levaduras como

ACB desde el ao 2007 (Robiglio et al, 2011). A partir de estos trabajos dos levaduras

antagonistas fueron seleccionadas: Cryptoccocus victoriae NPCC 1263 y Pichia

membranifaciensNPCC 1250 (Lutz et al,2011, 2012). Estas levaduras fueron aplicadas en

peras a escala comercial, obteniendo resultados muy alentadores, con un 80% de reduccin de

las podredumbres a los 140 das de conservacin (Sangorrn et al,2012). El uso de estas dos

levaduras se ha patentado por el CONICET y la Universidad Nacional del Comahue en marzodel 2012 (20120101053).

6. IMPORTANCIA DE OPTIMIZAR LA PRODUCCIN DE BIOMASA.Para cumplir con los objetivos planteados por el equipo de investigacin y con perspectivas

del uso de estas levaduras como biocontrol a nivel comercial e industrial, se pretende

encontrar las condiciones ptimas de crecimiento que permitan obtener la mxima biomasa

reduciendo tiempos y costos de produccin. Por otro lado, en un futuro se debera evaluar si la


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levadura en esta condicin optimizada ha conservado o mejorando simultneamente la

actividad antagonista. Se propone utilizar melaza proveniente de la caa de azcar y urea

como base del sustrato debido a sus bajos costos.

Tradicionalmente, las condiciones de cultivo han sido optimizadas por la estrategia de

modificar una variable a la vez, es decir cambiando un factor mientras otros se mantienen

constantes (Arevalo 1998, Abadas et al, 2003). Aunque esta estrategia es sencilla y no

requiere un anlisis estadstico, s requiere un gran nmero de experiencias y las interacciones

entre los factores son ignoradas (Costa et al, 2002; Patio et al, 2005). En contraste, los

diseos experimentales basados en estadstica son aproximaciones ms eficientes que pueden

llevarse a cabo con un gran nmero de variables en simultneo y se puede estimar la

interaccin entre estas variables (Daz et al, 2005). Actualmente esta tcnica se utiliza

ampliamente por investigadores para optimizar los componentes de un medio de cultivo, ya

que es una herramienta eficiente que permite el desarrollo de modelos matemticos empricos

(Abadas et al, 2003; Pelinsky et al, 2012; Dazet al,2005; Nikel et al, 2005; Wang et al,

2011; Abadas et al, 2003).

7. DISEO ESTADSTICO DE EXPERIMENTOS:Se podra definir el Diseo Estadstico de Experimentos (DEE), tambin denominado diseoexperimental, como una metodologa basada en tiles matemticos y estadsticos cuyo

objetivo es ayudar al experimentador a:

1. Seleccionar la estrategia experimental ptima que permita obtener la informacin

buscada con el mnimo coste.

2. Evaluar los resultados experimentales obtenidos, garantizando la mxima fiabilidad en

las conclusiones que se obtengan (Ferret al, 2013).

En un diseo experimental se manipulan deliberadamente una o ms variables vinculadas alas causas (que influencian en el sistema), para medir el efecto que tienen en otra variable de

inters. El diseo experimental prescribe en una serie de pautas relativas: qu variables hay

que manipular, de qu manera, cuntas veces hay que repetir el experimento y en qu orden

para poder establecer con un grado de confianza predefinido la necesidad de una presunta

relacin de causa-efecto.

El mtodo tradicional de experimentacin, el que quizs surge de forma ms intuitiva para

estudiar un sistema, consiste en variar-un-factor-cada-vez (VUFCV): a partir de unas


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condiciones iniciales, se realizan experimentos en los cuales todos los factores se mantienen

constantes excepto el que se est estudiando. De este modo, la variacin de la respuesta se

puede atribuir a la variacin del factor, por lo tanto revela el efecto de ese factor.

La estrategia experimental VUFCV presenta inconvenientes importantes cuando existe

interaccin entre factores:

No informa sobre como un factor interacta con los otros factores o como estas

interacciones afectan a la respuesta, con lo cual slo se obtiene una comprensin

limitada de los efectos de los factores.

No proporciona la posicin del ptimo. El experimentador percibe que se ha llegado

al ptimo porque cambiando un factor cada vez la respuesta no mejora, pero se puede

encontrar lejos del ptimo real (Figura 5). Aunque se puede reiniciar la

experimentacin partiendo del ptimo encontrado, esta solucin es extremadamente

ineficiente cuando se deben estudiar muchos factores a muchos valores distintos,

puesto que el mtodo VUFCV requerira demasiados experimentos y demasiado

tiempo.

Figura 5: Limitacin del mtodo VUFCV. Seobserva que el ptimo encontrado difiere delptimo real (Ferr et al, 2001).

El DEE proporciona el marco matemtico para cambiar todos los factores simultneamente y

obtener la informacin buscada con un nmero reducido de experimentos, es decir con la

mxima eficiencia. El DEE conduce a una planificacin con menos experimentos que el

mtodo VUFCV para obtener un conocimiento equivalente.


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Segn Ferr et al (2001) la aplicacin del diseo de experimentos requiere considerar las

siguientes etapas o procedimientos:

1. Comprender el problema y definir claramente el objetivo.

2. Identificar los factores que potencialmente podran influir en la funcin objetivo y los

valores que stos pueden tomar.

3. Establecer una estrategia experimental, llamada plan de experimentacin.

4. Efectuar los experimentos con los valores de los factores decididos en el punto 3 para

obtener los valores de las respuestas estudiadas.

5. Interpretar los resultados. Si es necesario, volver a la etapa 1.

8. SUPERFICIES DE RESPUESTA.La forma de la funcin (fx) que determina la relacin entre los factores y la variable respuesta

es en general desconocida. Por ello el primer objetivo del Mtodo de Superficie de respuesta

(MSR) consiste en establecer experimentalmente una aproximacin apropiada de la fx. Para

ello, se propone un modelo de ecuacin, generalmente polinmico, en los k factores X1,

X2,..., Xk y se selecciona un conjunto de tratamientos sobre los que realizar las observaciones

experimentales. Estas se utilizarn tanto para obtener estimaciones de los coeficientes en el

modelo propuesto (por ejemplo, a travs del mtodo de mnimos cuadrados) como paraobtener una estimacin de la variacin del error experimental (para lo que es necesario tener

al menos 2 observaciones por cada tratamiento). Se realizan, entonces, contrastes sobre las

estimaciones de los parmetros y sobre el ajuste del modelo y si el modelo se considera

adecuado, puede utilizarse como funcin de aproximacin.

La MSR es una tcnica secuencial. A menudo, la estimacin inicial de las condiciones

ptimas de operacin est alejada del ptimo real, as que el objetivo es, usando un mtodo lo

ms simple y menos costoso posible, moverse rpidamente hacia las cercanas del ptimo.Los polinomios usados ms frecuentemente como funciones de aproximacin son los de

rdenes uno y dos, que nos proporcionan los siguientes modelos:


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- 12 -

En la construccin de modelos de superficies de respuesta, es muy comn la codificacin de

los valores reales de los niveles de los factores, pues las distancias medidas sobre los ejes de

las variables codificadas en el espacio k-dimensional se convierten en estndar. Esto ltimo

facilita considerablemente los clculos que deben llevarse a cabo para obtener el modelo de

aproximacin e incrementa el ajuste en la estimacin de los coeficientes. Dicha codificacin

se realiza segn:

(Ec. 3)

Donde xi corresponde a la variable codificada, Xi corresponde al valor real de la variable

independiente, Xo es el valor real de la variable independiente en el punto central y corresponde al paso o diferencia entre los extremos y el punto central. A los extremos de cadafactor le correspondern los valores + 1 y -1 mientras que el punto central asumir el valor 0.

El punto central es tomado como valor de partida para definir el rango que tomarn los

factores a ser estudiados.

8.1 Metodologa de superficie de respuesta (MSR)

La eleccin de un diseo adecuado del experimento es fundamental para modelar y explorar

la MSR usada para ajustar a un modelo polinmico el conjunto de datos recogidos en los

puntos del diseo. As pues, sera deseable que el diseo tenga determinadas caractersticas

que sirvan al inters del experimento:

1. Generar una distribucin razonable de puntos, por tanto de informacin en toda la regin

de inters, pero utilizando el menor nmero posible de puntos experimentales.

2. Asegurar que para cada punto x, el valor ajustado, (x), est tan cerca como sea posible

del valor real, Y(x).

3. Permitir la deteccin de falta de ajuste en el modelo.


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Tesis de grado

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4. Permitir la ejecucin de los experimentos en bloques.

5. Proporcionar una estimacin interna de la varianza del error.

6. Asegurar simplicidad en los clculos de las estimaciones de los parmetros del modelo.

Adems de las propiedades mencionadas, sera muy conveniente que el diseo elegido fuera

ortogonal y/o invariante por rotacin.

Un diseo ortogonales aquel en el que los trminos del modelo ajustado son incorrelados,

por tanto tambin las estimaciones de los parmetros lo son, en cuyo caso la varianza de la

respuesta esperada en cualquier punto de la regin experimental se puede expresar como la

suma ponderada de las varianzas de los parmetros estimados del modelo.

Por otro lado, en un diseo invariante por rotacin la varianza de f(x), que depende de la

situacin del punto x, es funcin nicamente de la distancia del punto al centro del diseo, lo

que significa que es la misma en todos los puntos equidistantes del centro del diseo.

Teniendo en cuenta que el objetivo de la MSR es la optimizacin de la respuesta y que se

desconoce la localizacin del ptimo antes de ejecutar el experimento, esta propiedad resulta

muy interesante puesto que garantiza que el diseo proporcionar estimaciones igualmente

precisas en todas las direcciones.

8.2 Diseo central compuesto

Por todas las propiedades que verifican los diseos compuestos centrales (DCC) son

posiblemente los ms utilizados para ajustar superficies de respuesta de segundo orden.

La Figura 6 muestra que un DCC consiste en:

1. Parte factorial: un diseo factorial 2k, completo o fraccional, en el que los niveles estn

codificados en la forma habitual como 1,

2. n0 ( 1) puntos centrales,3. Parte axial: dos puntos axiales en los ejes correspondientes a cada uno de los factores,

situados a una distancia del centro del diseo (puntos estrella).

Por lo tanto el nmero total de puntos del diseo es N = 2k+ 2k + n0. (Fernandez et al,2001)


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Tesis de grado

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Figura 6: TIPOS DE DISEOS CENTRALES. A. Diseo central circunscripto (CCC) > 1. B: Diseo central centrado en las caras (FCC) =1. B: Diseo central inscripto (CCI) < 1

En principio, los DCC as definidos no tienen por qu ser ni ortogonales ni invariantes por

rotacin (rotables). Se convierten en invariantes por rotacin mediante una eleccin adecuada

del valor de , que debe depender del nmero de puntos de la parte factorial del diseo para

conseguirlo. Por otro lado, a travs de una eleccin apropiada de n 0el diseo puede hacerse

ortogonal o incluso de precisin uniforme. Este permite mayor proteccin que un diseo

ortogonal contra el sesgo de los coeficientes de regresin producido por la presencia de

trminos de orden mayor que 2 en la superficie real. Se muestra a continuacin una Tabla con

los valores que deben tomar y n, segn el nmero de factores del modelo, para que el diseo

correspondiente sea ortogonal o de precisin uniforme (Tabla 1).

Tabla 3: DCC para k factores segn se desee un diseo ortogonal o de precisin uniforme.


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Tesis de grado

- 15 -

8.3 Diseo compacto:

Los diseos centrales compuestos estndar para ajustar una superficie de respuesta de

segundo orden tienen por lo general una gran cantidad de puntos, en especial cuando k es

grande. En algunas circunstancias es deseable reducir el nmero de puntos tanto como se

pueda, de manera tal que se siga manteniendo la capacidad de determinar los parmetros del

modelo (Draper et al, 1990).

Cuando la experimentacin resulta costosa, difcil y demandante de tiempo el diseo

compacto puede ser una buena opcin.

El uso de este mtodo puede resultar til cuando se tienen 4 o ms variables y se encuentra

disponible en los paquetes estadsticos. Es una buena opcin cuando se desea realizar un

estudio preliminar disminuyendo costos y tiempos.

8.4 Diseo central compuesto centrado en las caras

Una variante del DCC es el diseo centrado en las caras, en el cual toma el valor 1. En este

diseo los puntos estrella se localizan en los centros de las caras del cubo. Esta variante del

diseo central compuesto se emplea ocasionalmente, debido a que slo propone tres niveles

de cada factor. Este diseo tiene la desventaja de que no es rotable.

Este tipo de diseo provee una calidad relativamente alta en las predicciones dentro delespacio de diseo y no requiere el uso de puntos fuera del rango original de diseo. A pesar

que este diseo otorga una menor precisin de estimacin de los coeficientes cuadrticos

puros, es recomendado para utilizarse cuando la regin de operatividad comprende la regin

completa de inters o cuando no existe la posibilidad de operar fuera de los extremos de la

regin de diseo.

9. MELAZA COMO MEDIO DE CULTIVOLa melaza es una mezcla compleja obtenida como subproducto de la elaboracin de azcar de

caa. Contiene sacarosa, monosacridos, sales y otros compuestos slidos solubles en lcali

que normalmente estn presentes en el jugo de caa as como los formados durante el proceso

de manufactura del azcar.

La composicin de la melaza es muy heterognea y puede variar considerablemente

dependiendo de la variedad de caa de azcar, suelo, clima, periodo de cultivo, eficiencia de


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Tesis de grado

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la operacin de la fbrica, sistema de ebullicin del azcar, tipo y capacidad de evaporadores,

etc. Se caracteriza por tener grados Brix entre 68 y 75% y un pH entre un 5 y 6.

AZUCARES: Los principales azucares en la melaza son sacarosa, glucosa o dextrosa

y fructosa o levulosa. En general las melazas contienen un 68% de sacarosa, un 6% de

fructosa y un 4% de glucosa, expresados en gramos de azcar cada 100 g. de melaza.

Su contenido de glucosa y fructosa puede variar a causa de la hidrlisis de la sacarosa

a causa de distintas condiciones de pH y temperatura.

NO AZCARES: Otros compuestos encontrados en la melaza representan

aproximadamente un 33 % de sustancias inorgnicas (Fe, Na, Ca, Mg, Zn, As, Cd,

Hg, Pb, Cl, etc). El 42 % corresponde a sustancias nitrogenadas (aminocidos,

pptidos, colorantes) y el 25% restante a sustancias orgnicas libres de nitrgeno

(cidos carboxlicos, fenoles, alcoholes, steres, vitaminas, gomas, etc) (Fajardo et al,

2007).

10. CINTICA DE CULTIVO POR LOTES (batch)

Los procesos de cultivo por lote o Batch pueden considerarse como sistemas cerrados. A

tiempo cero, la solucin esterilizada de nutrientes se inocula con microorganismos y se

permite que se lleve a cabo la incubacin en condiciones ptimas de fermentacin. A lo largode toda la fermentacin en general no se adiciona nada, excepto oxgeno y en algunos casos

antiespumante y cidos o bases para controlar el pH. La composicin del medio de cultivo, la

concentracin de biomasa y la concentracin de metabolitos cambia generalmente en forma

continua como resultado del metabolismo de las clulas (Fajardo et al, 2007).

A continuacin se detalla en Figura 7, la forma tpica de un crecimiento por lote. La forma

caracterstica de esta curva, se da siempre que se cumplan ciertas condiciones: que el cultivo

sea por lotes, que todas las clulas que componen la poblacin se reproduzcan a intervalosregulares, que no existan sustancias inhibidoras del crecimiento y que la composicin del

medio sea simple, en especial en cuanto a las fuentes de carbono y nitrgeno (Acevedo et. al,

2002).


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Tesis de grado

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Figura 7: Curva de crecimiento en cultivo por lotes.

Durante el cultivo se pueden distinguir las siguientes zonas o fases:

a- Fase lag o de latencia: el microorganismo se adapta a las nuevas condiciones y pone en

marcha su maquinaria metablica para poder crecer activamente. La duracin de esta fase es

variable y en general es mayor cuanto ms grande sea el cambio en las condiciones en las que

se encuentra el microorganismo.

b- Fase de crecimiento exponencial o logartmico: las clulas se reproducen a la mxima

velocidad posible de acuerdo a las condiciones ambientales existentes, por no existir

limitacin de nutrientes.

c- Fase estacionaria: no hay aumento neto de microorganismos, lo que no significa que no se

dividan algunos, sino que la aparicin de nuevos individuos se compensa por la muerte de

otros.

d- Fase de muerte o decaimiento: el nmero de microorganismos vivos disminuye de forma

exponencial. Se presenta en aquellos cultivos en los que se inducen enzimas autolticas en

condiciones de inanicin.

10.1 Parmetros de produccin:

Rendimiento de un nutriente en clulas (Yx/s): para el estudio cuantitativo de los procesos

de fermentacin, resulta conveniente definir el rendimiento de un nutriente en clulas, como

la masa celular obtenida () por unidad de nutriente consumido (S):


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Productividad volumtrica (Qx): es la cantidad de biomasa (X) obtenida por unidad de

tiempo (t) y volumen (V). Adems de los rendimientos, se debe tener en cuenta el tiempo en

el cual se alcanza cierta conversin, ya que no es lo mismo obtener cierta cantidad de biomasa

en un corto tiempo que en uno prolongado.

10.2 REACTOR EN BATCH

El reactor, es sin duda uno de los equipos fundamentales de la microbiologa industrial: es elrecipiente donde se realiza el cultivo y su diseo debe ser tal que asegure un ambiente

uniforme y adecuado para los microorganismos.

Las funciones que cumple el reactor pueden resumirse del siguiente modo:

a. Mantener las clulas uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo, a fin

de prevenir la sedimentacin o la flotacin.

b. Mantener constante y homognea la temperatura.

c. Minimizar los gradientes de concentracin de nutrientes.

d. Suministrar oxgeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo

e. El diseo debe ser tal que permita mantener el cultivo puro una vez que todo el

sistema ha sido esterilizado y posteriormente sembrado con el microorganismo

deseado (Ertola R. pgina WEB)


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Tesis de grado

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OBJETIVOS:

Tomando como punto de partida lo mencionado anteriormente se detallan los objetivos que se

pretende alcanzar en este proyecto:

Objetivo general:

Determinacin de la condicin ptima de crecimiento para la produccin de biomasa de

Cryptoccocus victoriaeNPCC 1263 mediante diseo experimental.

Objetivos especficos:

Determinacin de la condicin ptima de crecimiento para la produccin de biomasa

de la levadura Cryptoccocus victoriaeNPCC 1263 empleando herramientas de diseo

experimental.

Evaluacin de cuatro variables fundamentales para su crecimiento.

Aprendizaje del manejo de tcnicas de laboratorio y uso de equipamiento disponible.

Utilizacin de programas estadsticos aplicados al modelado de crecimientos

microbiolgicos.

Produccin de biomasa en reactor de 20 litros en la condicin ptima establecida por

diseo experimental

Anlisis y discusin de los resultados obtenidos.


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MATERIALES Y MTODOS

1. MATERIAL BIOLGICO

Levadura Cryptoccocus victoriaeNPCC 1263 asilada en cmaras frigorficas de la regin por

el grupo de Biodiversidad y Biotecnologa de Levaduras (Lutz et al,2012).

2. EQUIPAMIENTO

Centrfuga refrigerada de alta velocidad Sorvall RC 5C Plus

Microscopio Nikon Eclipse 80i

Incubadoras Bambi modificadas con control de Temperatura

Estufa de esterilizacin

Autoclave tipo chamberland marca VZ 50litros

Agitadores orbitales Vicking Shaker ProArcano TS2000AJeioTech SK300

Espectrofotmetro PG Instrument T60

Reactor Batch de acero inoxidable (capacidad 20 litros)

Balanza

Refractmetro Ref 103 0-32brix Electrodo de oxgeno disuelto

3. MEDIO DE CULTIVO:

Con el objetivo de utilizar una fuente de nutrientes econmica, se decidi emplear melaza de

caa como medio de cultivo para la produccin de Cryptococus victoriae. Como fuente de

nitrgeno para aadir a la melaza se utiliz urea granulada debido a su bajo costo.

4. DISEO EXPERIMENTAL

Se eligi estudiar cuatro variables influyentes en el crecimiento microbiano: temperatura,

aireacin, nivel de fuente nitrogenada (urea) y carbonada (melaza) para encontrar la

condicin ptima que permita maximizar la produccin de biomasa.

Para la seleccin de las variables y el rango de implementacin se tomaron como punto de

partida las condiciones de produccin utilizadas por el equipo de investigacin (melaza 12,8%

m/v urea 0,6 g/L a 20C).


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Se utilizaron tres concentraciones de melaza ( 6,4 %, 12,8% y 19,4%), las cuales fueron

necesarias para modelar el crecimiento a partir de melaza industrial tomando como punto de

partida el valor central 12,8 % m/v. Dicho valor corresponde aproximadamente a 10

gramos de azcares totales por cada 100 mL.

Se prepararon varios frascos con las concentraciones mencionadas, a partir de los cuales se

fraccionaron los distintos Erlenmeyers con 100 ml de melaza a los diferentes porcentajes, a

los cuales se adicion de urea (0,2 g/L; 0,6 g/L; 1 g/L). Todo el material fue autoclavado

durante 20 minutos a 1 atm de presin manomtrica.

5. CODIFICACIN DE VARIABLES

Para realizar los clculos estadsticos, las variables fueron codificadas de la siguiente manera

(Tabla 4):

(Ec. 3)

Donde xi corresponde a la variable codificada, Xi corresponde al valor real de la variable

independiente, Xo es el valor real de la variable independiente en el punto central y corresponde al paso o diferencia entre los extremos y el punto central.

Tabla 4: Factores codificados segn DCC y codificacin de los niveles usados

Factores valores codificados

Estrella Bajo Centro Alto Estrella

-1 -1 0 1 1

urea (g/L) 0,2 0,2 0,6 1 1

melaza (% m/v) 6,4 6,4 12,8 19,2 19,2

temperatura (C) 13 13 20 27 27

rpm 120 120 150 180 180

Los efectos de las cuatro variables fueron testeados utilizando un diseo central compacto

con puntos estrellas centrados en las caras con 2 repeticiones en el centro. A continuacin se

detallan las distintas experiencias que fueron realizadas para obtener la superficie de

respuesta (MSR). Dichas corridas fueron determinadas con el paquete estadstico

STATISTICA 7.0 (Tabla 5).


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Tesis de grado

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Tabla 5: Corridas experimentales a realizar para obtener la superficie de respuesta segn DCCpara 4 factores

4 factor central com posite,nc=8 ns=8 n0=Standard

Run

Urea

(g/L)

Melaza

(g/100mL

T(C) RP M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17 (C)

18 (C)

1,0 19,2 27 120

1,0 19,2 13 120

1,0 6,4 27 180

0,2 19,2 13 180

1,0 6,4 13 180

0,2 6,4 27 120

0,2 19,2 27 180

0,2 6,4 13 120

0,2 12,8 20 150

1,0 12,8 20 150

0,6 6,4 20 150

0,6 19,2 20 150

0,6 12,8 13 150

0,6 12,8 27 150

0,6 12,8 20 120

0,6 12,8 20 180

0,6 12,8 20 150

0,6 12,8 20 150

6. CRECIMIENTO MICROBIANO PEQUEA ESCALA

6.1Preparacin del inculo:

La preparacin del inoculo se realiz a la temperatura, agitacin y medio de cultivo

correspondiente a la corrida experimental. Se inocul una anzada de levadura fresca, cultivada

inicialmente en Agar GPY (Extracto de levadura 5 g/L, Peptona 5 g/L, Glucosa 40 g/L,

Agar 20 g/L) en 5mL de medio.

Las distintas condiciones de temperatura se lograron utilizando incubadoras de cultivo

previamente calibradas. La agitacin se llev a cabo mediante agitadores orbitales

programados a la velocidad (rpm) correspondiente de cada experiencia.


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Tesis de grado

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Se cultiv el inculo a la temperatura y agitacin correspondiente segn la corrida

experimental (nmero de experiencia) durante 24h. Posteriormente se realiz un recuento en

cmara de Neubauer para cuantificar las clulas por mL.

6.2 Experiencias en Erlenmeyer:

Cada corrida experimental fue preparada en Erlenmeyers de 250 mL con 100 mL del medio

correspondiente, las mismas fueron inoculadas con 1x105 clulas por mL de inculo fresco.

La curva de crecimiento de cada corrida experimental se determin por densidad ptica a

640nm, desde el inicio hasta alcanzar la fase estacionaria.

El cultivo fue centrifugado a 5000 rpm durante 10 minutos para separar las clulas de

levadura del medio de cultivo. Esta operacin fue repetida 3 veces con agua destilada

(lavado). La biomasa obtenida fue colocada dentro de una estufa a 70 C en recipientes

previamente pesados para obtener su peso seco.

Los datos de peso seco vs. Absorbancia a 640 nm se utilizaron para realizar curva de

calibracin y determinar el crecimiento de C. victoriaeen gramos por mililitro de medio.

Medicin de azcares totales:

De cada experiencia en Erlenmeyer se tomaron muestras tanto al inicio como al final con el

objetivo de cuantificar el consumo de azcar de cada fermentacin. Se utiliz refractmetrode mano para poder medir azcares totales en las muestras (grados Brix).

Oxigenacin:

Al inicio de cada corrida experimental, se midi el oxgeno disuelto (mg/L) en el medio de

cultivo para luego reproducir esa concentracin de oxgeno disuelto a nivel reactor.

7. MODELADO DEL CRECIMIENTO

Para cada experiencia se determinaron los parmetros de crecimiento (Mximo valoralcanzado, velocidad especfica de crecimiento y duracin de fase lag) ajustando los datos

experimentales al modelo de Gompertz modificado (Zwietering et al, 1990), cuya ecuacin se

detalla a continuacin:

( )


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En esta ecuacin Y = ln (DO/DOo); DO corresponde a la densidad ptica a un tiempo t;

DOo es la densidad ptica a tiempo inicial. A= ln (DOmax /DOo); DOmax representa el

mximo valor de crecimiento alcanzado expresado en densidad ptica. La variable l

corresponde a la duracin de la fase lag (h) y es la velocidad mxima de crecimiento (h-1).

Los datos correspondientes a cada experiencia fueron ajustados mediante una estimacin no

lineal minimizando la suma de las desviaciones al cuadrado de los valores observados de la

variable dependiente respecto a los predichos por el modelo.

Los clculos fueron realizados utilizando el paquete estadstico STATISTICA 7.0.

8. ANLISIS ESTADSTICO: SUPERFICIE DE RESPUESTA

Para analizar los resultados del diseo experimental, se utiliz la metodologa de Superficie

de Respuesta (MSR).

La duracin de la fase lag (l), velocidad especfica () y el valor mximo (A) obtenidos en

cada corrida del diseo experimental fueron ajustados a una superficie de respuesta que posee

la siguiente forma:

Donde Y es la variable predicha por el modelo; xi y xj son las variables codificadas

influyentes en la respuesta; es el coeficiente del trmino independiente; son loscoeficientes de regresin lineal; son los coeficientes de regresin cuadrticos y son loscoeficientes que explican la interaccin entre dos variables.

Los coeficientes significativos pueden ser interpretados como el incremento o disminucin de

la variable de respuesta cuando la variable dependiente cambia una unidad y se evidencian

estadsticamente cuando p < 0,05.


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Tesis de grado

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9. PRODUCCIN DE BIOMASA EN REACTOR DE 20 L:

Una vez establecida la condicin ptima a escala Erlenmeyer, se procedi a reproducir dicha

condicin en un reactor batch de 20 litros.

9.1 Preparacin del inculo:

A continuacin se detallan los pasos seguidos para inocular el reactor:

Se realiz un inculo inicial de 105clulas por mL en dos Erlenmeyers de 250 mL

con 100 mL de medio fresco de melaza con urea a temperatura y rpm establecidas

en la optimizacin.

Durante la fase exponencial de dichos cultivos, se inocul su contenido en dos

Erlenmeyers de 2 L con 900mL de medio fresco.

Cuando los cultivos de 1000 mL alcanzaron su fase exponencial, se inocul su

contenido en el reactor, previamente esterilizado con 18 litros de medio.

9.2 Condiciones de cultivo en el reactor:

La temperatura de cultivo en el reactor y composicin qumica del medio de cultivo se

determin de acuerdo a las caractersticas propuestas por el modelado para obtener altos

valores de biomasa.

Para lograr reproducir la oxigenacin obtenida con las diferentes rpm en los agitadores

orbitales para la escala Erlenmeyer, se cuantific el oxgeno disuelto a las distintasvelocidades de agitacin. Con estos datos, cuando se escal el cultivo al reactor se igualaron

los mg/L de oxgeno disuelto del reactor ajustando las rpm del motor a la condicin ptima

para la produccin de biomasa obtenida en los Erlenmeyers

Debido a la formacin de espuma a altas velocidades de agitacin (rpm mayores a 200), fue

necesario utilizar un antiespumante para evitar su formacin. Se agregaron aproximadamente

2 mL de un antiespumante industrial.

9.3 Curva de crecimiento:Se tomaron muestras del reactor cada 24 hs aproximadamente, en las que se midi densidad

ptica a 640 nm en espectrofotmetro. El cultivo se detuvo al detectar inicio de fase

estacionaria. Tambin se cuantific en las muestras el contenido de azcar (grados Brix) a lo

largo del cultivo utilizando un refractmetro de mano.


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Tesis de grado

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9.4 Obtencin de la biomasa:

El medio de cultivo fue centrifugado durante 10 minutos y 5000 rpm a 4C para separar la

biomasa del medio. Se realiz un centrifugado inicial y 3 lavados con agua estril utilizando

tubos de 250 mL previamente esterilizados.

La biomasa obtenida fue utilizada para preparar una solucin concentrada de 1 litro que fue

almacenada en heladera a 4C.

9.5 Cuantificacin de la biomasa obtenida:

La biomasa seca fue determinada por la tcnica gravimtrica. Se tomaron muestras de 5 mL

de solucin que fueron colocadas en estufa a 70 C hasta obtener un peso constante, que

permiti obtener su peso seco y calcular la produccin obtenida (gramos de levadura seca /

litro de medio).

Adicionalmente se realiz un recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) utilizando

mtodo de diluciones seriadas.

9.6 Detalles del reactor:

A continuacin se enumeran los elementos bsicos del reactor (ANEXO II):

Cuerpo: Recipiente de acero inoxidable que contiene el cultivo y constituye la barrerafsica entre el ambiente externo y el microorganismo de estudio.

Aireador: El aire inyectado por el extremo superior del tanque ingresa hasta el fondo

del mismo y es distribuido por una corona compuesta por mltiples orificios que

esparcen el aire en forma de burbujas de manera uniforme sobre toda la seccin. Para

este trabajo se dispone de un aireador de pecera que bombea el gas hacia el interior del

recipiente y un filtro para mantener la condicin de esterilidad del cultivo.

Agitador: Distribuye las clulas de manera uniforme en todo el reactor evitando su

sedimentacin. Permite que las burbujas de aire que ingresan al sistema se distribuyan

y difundan hacia el medio de cultivo. El sistema de agitacin est formado por un

rotor que distribuye el aire dentro del sistema, un motor elctrico que aporta la

potencia necesaria y un eje trasmisor que trasmite la potencia del motor hacia el

agitador. La velocidad de agitacin es controlada mediante una caja reguladora


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Tesis de grado

- 27 -

conectada con el motor. Para mejorar la eficiencia de la agitacin se dispone de placas

deflectoras en el interior del cuerpo del reactor con el objetivo de generar una mayor

turbulencia que favorezca la difusin del oxgeno hacia el seno del lquido.

Antiespumante: La espuma producida por desnaturalizacin de las protenas reduce la

superficie de contacto del oxgeno con la levadura, disminuyendo el crecimiento de las

mismas. Adems puede volcar parte del contenido del reactor a travs de la salida de

aire y causar la eliminacin del cultivo al medio externo. Los antiespumantes son

tensioactivos que reducen la tensin superficial de la espuma y la dispersa. Su eficacia

vara en funcin de las condiciones de la fermentacin, composicin del medio, cepa

etapa de crecimiento y configuracin de la va de aireacin del reactor (Arvalo,

1998).


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Tesis de grado

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RESULTADOS

Con el fin de mejorar la produccin de biomasa de la levadura antagonista se buscaron las

condiciones ptimas de crecimiento en un volumen pequeo y posteriormente se realiz elcambio de escala de la mejor condicin establecida en un reactor de 20 L.

La optimizacin se realiz aplicando un Diseo Estadstico Experimental. Se eligi un diseo

central compuesto centrado en las caras (DFCC) para evaluar diferentes concentraciones de

melaza, temperaturas de cultivo, niveles de agitacin y diferentes concentraciones de

nitrgeno. Luego de la determinacin de los parmetros de crecimiento de la levadura C.

victoriae en las 18 condiciones obtenidas por DEE, se concluy que existe una influencia

predominante de la temperatura y de la fuente de carbono en el crecimiento de la levadura.Los resultados fueron ajustados a una superficie de respuesta obtenindose una regresin

polinomial de las variables significativas que permiten explicar el crecimiento de biomasa

para la pequea escala.

La condicin ptima obtenida a pequea escala se reprodujo en reactor de 20 litros cuyos

resultados fueron comparados a modo de determinar la desviacin existente entre la

produccin a diferentes escalas. Dado que para poder escalar el factor de la agitacin es

necesario encontrar una forma de relacionar las rpm del agitador orbital (escala pequea) con

las del reactor (escala mayor) se procedi a cuantificar el oxgeno disuelto en los medios de

cultivos al tiempo inicial de la curva de crecimiento.

El oxgeno disuelto fue cuantificado a escala Erlenmeyer para los diferentes medios

propuestos y condiciones de agitacin propuestas por el diseo. Se puede observar que a

medida que aumenta la agitacin y disminuye la concentracin de medio, la cantidad de

oxgeno disuelto es mayor (Tabla 6).

Tabla 6: Oxgeno disuelto en funcin de concentracin de melaza y velocidad de agitacin.

melaza (g/100mL) Oxgeno disuelto (mg/L)0 rpm 120 rpm 150 rpm 180rpm

6,40 4,51 7,65 7,00 8,0512,80 2,68 4,60 5,84 6,8019,20 2,32 3,01 4,52 6,80


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1. MODELADO DEL CRECIMIENTOLos parmetros de crecimiento obtenidos para las diferentes corridas experimentales son

mostrados en Tabla 7 y el detalle de datos de cada condicin se muestra en el ANEXO I.

Tabla 7: Parmetros obtenidos del crecimiento de C. victoriae.

Exp.urea(g/L)

melaza(% )

T(C)

Agitacin

(rpm)Parmetros*

ConsumoAzcar

(%)A l

1 1 19,2 27 120 0,927 0,022 48,11 16,322 1 19,2 13 120 1,897 0,027 34,92 6,253 1 6,4 27 180 2,605 0,074 21,43 7,144 0,2 19,2 13 180 2,701 0,029 29,28 23,445 1 6,4 13 180 3,979 0,068 19,19 16,676 0,2 6,4 27 120 2,195 0,040 24,59 42,867 0,2 19,2 27 180 1,974 0,028 56,32 89,478 0,2 6,4 13 120 3,256 0,047 22,19 33,339 0,6 12,8 20 150 1,915 0,034 32,53 14,5510 0,2 12,8 20 150 2,314 0,033 33,24 22,7311 1 12,8 20 150 1,666 0,035 33,66 25,0012 0,6 6,4 20 150 2,941 0,096 14,31 25,0013 0,6 19,2 20 150 0,946 0,041 18,73 12,50

14 0,6 12,8 13 150 2,098 0,033 44,33 18,1815 0,6 12,8 27 150 2,001 0,019 29,64 63,6416 0,6 12,8 20 120 1,348 0,033 34,52 18,1817 0,6 12,8 20 180 2,267 0,041 19,30 14,0518 0,6 12,8 20 150 2,345 0,031 16,57 33,10

*Velocidad especfica de crecimiento (), Mximo valor alcanzado de la curva de crecimiento (A) y fase lag (l)de las curvas de crecimiento modeladas por Gompertz.

Se obtuvieron resultados de fase lag (l) que oscilan entre las 14,31 y 56,32 horas. Con

respecto a las velocidades especficas (), estas varan desde 0,019 y 0,096 h-1 mientras que

los valores mximos alcanzados de A se encuentran entre 0,927 y 3,979. El consumo de

azcares en porcentaje vara entre 6% a 89% para las distintas experiencias (Tabla 7).

Se determin el rendimiento de nutriente en clulas (Yx/s) que relaciona el cociente entre la

biomasa obtenida (X) y el sustrato consumido (S) (Tabla 8). Los mayores rendimientos

obtenidos (0,35 y 0,33) corresponden a las experiencias 5 y 8. Como se observa ms adelante

en esta seccin, las condiciones de temperatura y concentracin de melaza corresponden a la

condicin ptima obtenida utilizando el diseo experimental.


36/76


Tesis de grado

- 30 -

Tabla 8: Coeficiente de rendimiento (Yx/s ) para el crecimiento de C. victoriae.

Experiencia Biomasa X(g/L)

Consumo sustrato S(Bx)

Yx/s

1 2,42 3,1 0,082 2,72 1,0 0,283 4,13 2,0 0,214 4,98 3,8 0,145 6,90 2,0 0,356 2,85 3,0 0,107 5,50 17,0 0,038 6,50 2,0 0,33

9 3,39 1,6 0,2210 4,33 2,5 0,1811 2,94 2,8 0,1112 3,47 1,5 0,2413 2,27 2,0 0,1214 3,69 2,0 0,1915 6,00 7,0 0,0916 2,52 2,0 0,1317 4,00 2,0 0,2118 3,88 1,9 0,21

2. SUPERFICIE DE RESPUESTA

El modelado de las curvas experimentales fue analizado mediante el DCC centrado en las

caras. En el caso del parmetro , puede observarse la existencia de 2 factores con una

influencia significativa en la respuesta (p


37/76


Tesis de grado

- 31 -

Tabla 9: Efectos estimados para parmetro de las curvas de crecimiento.

Coeff. Std.Err. p -95,% +95,%Mean/Interc. 0,0366 0,0025 0,0007 0,029 0,044

(1)urea (g/l)(L) 0,0009 0,0044 0,8502 -0,013 0,015

urea (g/l)(Q) -0,0041 0,0039 0,3727 -0,016 0,008

(2)melaza (g/100mL)(L) -0,0196 0,0044 0,0207 -0,034 -0,006

melaza (g/100mL)(Q) 0,0227 0,0039 0,0100 0,010 0,035

(3)T(C)(L) -0,0019 0,0020 0,4038 -0,008 0,004

T(C)(Q) -0,0122 0,0039 0,0520 -0,025 0,000

(4)rpm (L) 0,0040 0,0044 0,4291 -0,010 0,018

rpm (Q) -0,0008 0,0039 0,8495 -0,013 0,012

1L by 2L -0,0040 0,0049 0,4717 -0,020 0,012

1L by 3L 0,0011 0,0022 0,6393 -0,006 0,008

1L by 4L -0,0042 0,0049 0,4555 -0,020 0,011

2L by 3L -0,0007 0,0022 0,7689 -0,008 0,006

2L by 4L -0,0049 0,0049 0,3891 -0,020 0,011

3L by 4L 0,0021 0,0022 0,4092 -0,005 0,009L: Efecto lineal; Q: Efecto cuadrtico.

Figura 8: Valores observados vs valores predichospor el modelo para . R2= 0,978.

Para el parmetro A (mximo valor alcanzado de la curva de crecimiento) se observ la

existencia de 2 factores con una influencia significativa en la respuesta (p


38/76


Tesis de grado

- 32 -

melaza, con efecto lineal decreciente (Tabla 10). Si bien el p valor para la temperatura (0,053)

es mayor a 0,05, se considera como significativo para los fines de este trabajo. No se observa

influencia significativa para la concentracin de urea y velocidad de agitacin (rpm), as como

tambin para la interaccin entre los factores. El coeficiente de determinacin (R2) para el

valor mximo de crecimiento A fue de 0,945 indicando que un 94,5% de la variabilidad de la

respuesta puede explicarse por el modelo (Figura 9).

Tabla 10: Efectos estimados para el parmetro A de las curvas de crecimiento de C. victoriae.A Coeff. Std.Err. p -95,% +95,%

Mean/Interc. 1,933 0,173 0,002 1,383 2,482

(1)urea (g/l)(L) -0,324 0,305 0,366 -1,294 0,646

urea (g/l)(Q) 0,123 0,271 0,680 -0,740 0,987(2)melaza (g/100mL)(L) -1,166 0,305 0,031 -2,136 -0,196

melaza (g/100mL)(Q) 0,246 0,271 0,432 -0,618 1,109

(3)T(C)(L) -0,423 0,136 0,053 -0,857 0,011

T(C)(Q) 0,183 0,271 0,549 -0,681 1,046

(4)rpm (L) 0,460 0,305 0,229 -0,511 1,430

rpm (Q) -0,059 0,271 0,842 -0,923 0,804

1L by 2L 0,087 0,341 0,816 -0,998 1,171

1L by 3L -0,069 0,152 0,680 -0,554 0,416

1L by 4L -0,599 0,341 0,177 -1,684 0,485

2L by 3L 0,092 0,152 0,588 -0,393 0,577

2L by 4L -0,234 0,341 0,541 -1,319 0,850

3L by 4L -0,009 0,152 0,958 -0,494 0,476L: Efecto lineal; Q: Efecto cuadrtico.

Figura. 9: Valores observados vs valores predichos

por el modelo para A. R2= 0,945.

Valores observados vs PredichosParametro A

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5Valores observados

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

Valores predichos


39/76


Tesis de grado

- 33 -

En cuanto al parmetro fase lag (l) de las curvas de crecimiento no se hall influencia

significativa para ninguno de los factores analizados (Tabla 11). El p valor fue mayor a 0,05

en todos los casos y el coeficiente de determinacin (R2) para la fase lag fue de 0,823 (Figura

10).

Tabla 11: Efectos estimados para el parmetro lag de las curvas de crecimiento.lag Coeff. Std.Err. p -95,% +95,%

Mean/Interc. 26,27 4,65 0,011 11,47 41,06(1)urea (g/l)(L) 0,21 8,21 0,981 -25,91 26,34urea (g/l)(Q) 6,61 7,31 0,432 -16,65 29,87

(2)melaza (g/100mL)(L) 2,84 8,21 0,752 -23,29 28,97melaza (g/100mL)(Q) -10,95 7,31 0,231 -34,21 12,31(3)T(C)(L) 3,02 3,67 0,471 -8,66 14,70T(C)(Q) 10,15 7,31 0,259 -13,11 33,41(4)rpm (L) -7,61 8,21 0,422 -33,74 18,51rpm (Q) 0,07 7,31 0,993 -23,19 23,331L by 2L -7,16 9,18 0,492 -36,37 22,051L by 3L -1,75 4,10 0,699 -14,81 11,311L by 4L -7,31 9,18 0,484 -36,52 21,902L by 3L 4,45 4,10 0,358 -8,61 17,51

2L by 4L 1,30 9,18 0,896 -27,91 30,513L by 4L 1,71 4,10 0,705 -11,35 14,78L: Efecto lineal; Q: Efecto cuadrtico.

Figura 10: Valores observados vs valorespredichos por el modelo para fase lag. R2 =0,945.

Valores observados vs. Valores predichosParmetro Lag

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Valores observados

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Valorespredich

os


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Tesis de grado

- 34 -

2.1 MODELOS:

Teniendo en cuenta los factores significativos mencionados anteriormente, se presentan las

ecuaciones que describen el crecimiento de la levadura, tanto para la velocidad especfica

como para el mximo valor alcanzado:

En dichas ecuaciones x1 y x2 corresponden a la concentracin de melaza y a la temperatura

en forma codificada respectivamente. Los valores mximos alcanzados as como tambin las

mayores velocidades especficas se obtienen en los niveles ms bajos de temperatura y

concentracin de melaza como puede observarse en las superficies y curvas de nivel

correspondientes (Figura 11, 12, 13 y 14)

Figura 11: Superficie de Respuesta para A en funcin detemperatura y concentracin de melaza codificadas

1

0,4

-0,2-0,8

0

0,51

1,5

2

2,5

3

3,5

4

1

0,

8

0,

6

0,

4

0,

2 0

-0,

2

-0,

4

-0,

6

-0,

8-

1

Niveles deMelaza

A

Niveles de Temperatura

3,5-43-3,52,5-32-2,51,5-21-1,50,5-10-0,5


41/76


Tesis de grado

- 35 -

Figura. 12: Curva de nivel para A en funcin detemperatura y concentracin de melaza codificadas

1

0,80,6

0,4

0,2

0

-0,2

-0,4

-0,6

-0,8

-1

1

0,8

0,6

0,4

0,2

0

-0,

2

-0,

4

-0,

6

-0,

8-1

NivelesdeMelaza


3-4

2-3

1-2

0-1

10,3

-0,40

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

1

0,

8

0,

6

0,

4

0,

2 0

-0,

2

-0,

4

-0,

6

-0,

8-

1Niveles de

Melaza


0,07-0,080,06-0,070,05-0,060,04-0,050,03-0,040,02-0,03

0,01-0,020-0,01


42/76


Tesis de grado

- 36 -

Figura. 13: Superficie de Respuesta para en funcin detemperatura y concentracin de melaza codificadas

Figura. 14: Curva de nivel para A en funcin de temperatura yconcentracin de melaza codificadas.

3. PRODUCCIN DE BIOMASA A NIVEL REACTOR:

En la etapa final del trabajo, se reprodujeron en el reactor de 20 L las condiciones ptimas

obtenidas mediante anlisis estadstico a escala Erlenmeyer. Las condiciones

seleccionadas fueron: temperatura 13C, concentracin de melaza 6,4 %, urea 0,2 g/L

y oxgeno disuelto 7,65 mg/L.

Para reproducir la oxigenacin en la condicin ptima obtenida en escala Erlenmeyer (7,65

mg/L), se midi el oxgeno disuelto en el medio de cultivo seleccionado dentro del reactor a

distintas velocidades de agitacin. Para cada velocidad de agitacin se tomaron medidas tanto

en aireacin baja como en alta (Tabla 12).

1

0,8

0,6

0,4

0,2

0

-0,2

-0,4

-0,6

-0,8

-1

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8 -1

Nivelesdemelaza


0,06-0,08

0,04-0,06

0,02-0,04

0-0,02


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Tesis de grado

- 37 -

Tabla 12: Oxgeno disuelto en funcin de la velocidad de agitacin y aireacin.

rpm Oxgeno disuelto (mg/mL)Baja Alta

50 1,42 1,83

70 2,26 3,58

120 3,4 5,34

160 5 7,38

190 7 8,46

260 7,9espuma

270 8,02

En ambos casos se observa una tendencia lineal de aumento en la oxigenacin respecto a la

velocidad de agitacin (Figura 15). Tambin se observa mayor oxigenacin cuanto mayor es

la aireacin (modo High). Sin embargo a elevadas rpm, se observ la formacin de espuma en

el medio de cultivo. Se decidi emplear para el reactor a una velocidad de 200 rpm y

aireacin baja.

Figura 15: Oxgeno disuelto (mg/mL) en funcin de velocidad de agitacin(rpm). a- Aireacin baja. b- Aireacin alta.

3.1 Curvas de crecimiento en reactor:

La condicin de crecimiento que se obtuvo a partir del proceso de optimizacin fue

reproducida (escalada) en un reactor de 20L en dos ensayos. Los parmetros obtenidos

fueron promediados para construir la curva de crecimiento as como tambin la curva de

y = 0,0372x - 0,5687

R = 0,9643

0

2

4

6

8

0 50 100 150 200

oxdis(mg/l)

RPM

a- Baja

y = 0,0456x - 0,0675

R = 0,9864

0

2

4

6

8

10

0 50 100 150 200

oxdis(mg/l)

RPM

b- Alta


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Tesis de grado

- 38 -

consumo de azcar (Figura 16). En Tabla 13 se muestran los resultados obtenidos para cada

produccin. Los parmetros de crecimiento fueron en promedio: Velocidad especfica ()

0,148 h-1, Valor mximo (A) 2,307 y fase lag 11,65 h.

Figura. 16: Curva de crecimiento modelada para C.victoriae y su respectivo consumo de azcar.

Tabla 13: Produccin de biomasa en reactor de 20 L

Parmetros 1er PRODUCCN 2da PRODUCCIN PROMEDIOA 2,337 2,277 2,307

(h- ) 0,045 0,250 0,148

lag (h) 5,238 17,873 11,555

Biomasa (g/L) 5,067 5,945 5,506

Viabilidad (UFC/mL) 3,2.107 2,1.107 2,65.107

Los parmetros obtenidos fueron comparados con aquellos determinados en escala

Erlenmeyer para la experiencia 8 que fue la seleccionada (Tabla 14). Se observa una mayor

velocidad especfica de crecimiento promedio (0,148 h-1) y una menor duracin de la fase lag

(11,55 hs.). Si bien los rdenes de magnitud se corresponden, el valor mximo alcanzado

(2,307) y biomasa obtenida (5,506 g/L) fueron menores a los del modelo en escala

Erlenmeyer. El rendimiento Yx/s es similar en ambos casos (del orden del 30%) as como

tambin la productividad volumtrica Qx.

0

1

2

3

4

5

6

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 50 100 150 200

b

r

i

x

Y

t (hs)

Y

Conc. De azcar


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Tesis de grado

- 39 -

Tabla 14: Parmetros de crecimiento en las dos escalas evaluadas.

Parmetros

ERLENMEYER

100mL

REACTOR

20LA 3,256 2,307

0,047 0,148

Lag 22,194 11,555

Biomasa (g/L) 6,500 5,506

Consumo Azcar (%) 33% 36%

Yx/s 0,34 0,28

Qx(g L-

h-

) 0,043 0,045Yx/s (rendimiento de nutriente en culas); Qx(productividad volumtrica de biomasa)


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Tesis de grado

- 40 -

DISCUSIN

Se realiz un trabajo de optimizacin en pequea escala para la levadura Cryptoccocusvictoriae aislada de cmaras frigorficas de la regin, con el objetivo de su posterior uso como

agente de biocontrol. Luego de su optimizacin, se reprodujo dicha condicin a mayor escala

con xito, ya que se obtuvieron valores comparables de biomasa en ambos casos.

De acuerdo a los resultados obtenidos en el diseo experimental se observa que el valor

mximo alcanzado de biomasa (A) y la velocidad especfica de crecimiento () dependen

inversamente de la temperatura y la concentracin de melaza. Debido a que la levadura fueaislada de cmaras frigorficas, resulta lgico que a temperaturas menores, mejore su

crecimiento.

La biomasa obtenida en este trabajo mediante la optimizacin en frasco pequeo fue de 6,5

g/L, duplicando la biomasa que se obtena en las condiciones sin optimizar que se empleaban

anteriormente (Sangorrn et al,2012). El orden de magnitud de la biomasa en este trabajo es

similar a la observada en la optimizacin de otras levaduras, aunque estos valores dependen

de la especie de levadura evaluada. Daz et al, (2005) para Pichia onychis reportan una

biomasa seca de 6,3 g/L en cultivos de 25 mL. Por otro lado para la levaduraRhodosporidium

paludigenumen optimizaciones realizadas en volmenes de 50 mL la mxima biomasa fue

de 16 g/L (Wang et al, 2011).

La concentracin obtenida de la levadura C. victoriaeNPCC 1263 fue de 2,75x107UFC/mL

en el reactor de 20L, cuyo peso seco fue de 5,5 g/L. Respecto al cambio de escala en el

reactor, la produccin de biomasa obtenida (5,5 g) se corresponde con la obtenida en pequea

escala aunque existe una desviacin negativa de aproximadamente 15% respecto a la

produccin en pequea escala (6,5g). Sin embargo en el reactor se observan velocidades

especficas de crecimiento mayores que las obtenidas en pequea escala. La biomasa obtenida

es menor a los valores obtenidos en trabajos similares con reactores que emplearon melaza de

caa. En el caso deR. paludigenum, en 6L de cultivo se obtuvo 19 g/L de biomasa(Wang et

al, 2011) y con Candida sake8 108UFC/mL en 5 L de cultivo (Abadas et al, 2003).


47/76


Tesis de grado

- 41 -

Se obtuvieron valores similares de consumo de azcares totales (34%), de rendimiento (Yx/s=

0,3) y de productividad (Qx= 0,04 g L-1h-1) tanto en pequea como en mayor escala. Los

valores de Yx/s se encuentran levemente por debajo de los valores recomendados en

bibliografa (0,40-0,85 g/g; Ward 1989; Acevedo et. al,2002). La productividad obtenida fue

menor a los valores tericos definidos para levaduras en general en de reactor (5,2 g L-1h-1;

Ward 1989). Esto puede deberse a los elevados tiempos de crecimiento de Cryptoccocus

victoriae, ya que requiere 130 h para llegar a la fase estacionaria . Pelinsky et al, (2012)

obtuvo para Lachancea thermotolerans un rendimiento mximo Yx/s= 0,2 y Qx entre 0,8 y 1

g L-1h-1 tanto en bioreactor como en frascos.

Si bien este mtodo sirvi para mejorar las condiciones de crecimiento y lograr una mayor

cantidad de biomasa, el ptimo se encuentra ubicado en uno de los extremos del dominio

experimental. Por lo tanto es posible que la condicin ptima se encuentre a una temperatura

y concentracin de melaza an menor, ya que la tendencia de las correlaciones no muestran

un mximo en el rango de temperaturas (27C a 13C) y concentraciones evaluadas (16,2% a

6,4%). Se sugiere redefinir el dominio experimental hacia valores menores de temperatura y

concentracin de melaza, as como tambin extender el dominio respecto a la concentracin

de urea y agitacin de modo que pueda percibirse algn efecto en dichos factores. En trabajosfuturos podra mejorar el Yx/s y la Qx al encontrar un nuevo ptimo de produccin de

biomasa.

La formacin de espuma en la escala de reactor a elevada velocidad de agitacin hizo que

fuera necesario agregar un antiespumante. Por lo tanto tambin ser necesario incluir el efecto

de dicha variable a las corridas experimentales en un futuro.

Debido a la limitacin en cuanto al tiempo y recursos disponibles, se opt por un diseo

compacto centrado en las caras. De esta manera, se logr una aproximacin al ptimo con un

menor nmero de corridas experimentales y utilizando nicamente 3 niveles de cada factor.

Si bien se sacrific exactitud en el clculo de los coeficientes de interaccin, se ahorr un

importante tiempo y cantidad de recursos respecto al diseo central estndar. Para obtener un

modelo ms exacto, con rotabilidad y detectar la influencia de algn factor no detectado en el


48/76


Tesis de grado

- 42 -

presente trabajo, se propone utilizar un modelo central compuesto circunscripto estndar (no

compacto) trabajando en 5 niveles de cada factor y aumentando el nmero de ensayos.

Luego de la optimizacin, deber evaluarse la viabilidad y actividad antagnica de la levadura

en heridas, as como tambin se deber probar diferentes metodologas de formulacin

(lquida o liofilizada), para obtener un producto que mantenga o mejore la efectividad del

ACB, facilitando su manejo y aplicacin. Tomando como base el medio optimizado, se

debern evaluar en un futuro diferentes condiciones de cultivo, de tal forma que se obtengan

levaduras pre-adaptadas a las posteriores condiciones de stress, capaces de sobrevivir en

mayor grado a la liofilizacin y/o al stress oxidativo de colonizar las heridas de las frutas a

proteger (Teixidet al, 2011).


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Tesis de grado

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CONCLUSIONES

Se optimiz la produccin de la levadura Cryptoccocus victoriaeen pequea escala

para el dominio de los factores propuestos utilizando diseo estadstico. La condicin

ptima para el medio de cultivo es de 13 C, 6,4 g/L de melaza, 150 rpm, y 0,2 g/L de

urea.

Quedaron sentadas las bases para una posterior optimizacin que ample el rango o

dominio de experimentacin orientado hacia menores valores de temperatura y

concentraciones de melaza as como tambin la inclusin del efecto del

antiespumante.

Se realiz con xito la produccin de biomasa de la condicin ptima en reactor de

20L obtenindose valores semejantes a la pequea escala. Si bien la biomasa obtenida

fue menor en un 15% a la obtenida en pequea escala, se observ una mayor

velocidad especfica de crecimiento. El coeficiente de rendimiento (Ys/x) y

productividad (Qx) fueron aproximadamente iguales en ambas escalas. Los valores

obtenidos de biomasa seca y viabilidad (UFC/ml) son comparables con resultados

obtenidos en otros trabajos para otras especies de levadura en melaza de caa de

azcar (Dazet al,2005; Wang et al, 2011; Abadas et al, 2003).


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