Tesis Def 2 Light

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Laboratorio Bases Moleculares de la Proliferacin Celular

Departamento de Biologa Molecular y Bioqumica

Facultad de Ciencias

Universidad de Mlaga

Tesis Doctoral

Aproximaciones computacionales, dinmicas y

topolgicas al estudio del metabolismo

Ral Montaez Martnez

Mlaga, 9 de marzo de 2010


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Aproximaciones computacionales, dinmicas ytopolgicas al estudio del metabolismo

Memoria presentada para optar al grado de Doctor por laUniversidad de Mlaga

Fdo.: Ral Montaez Martnez

Directores

Fdo.: Franscisca M Snchez Jimnez

Fdo.: Miguel ngel Medina Torres

Fdo.: Carlos F. Rodrguez Caso


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Laboratorio Bases Moleculares de la Proliferacin Celular

Departamento de Biologa Molecular y Bioqumica

Facultad de Ciencias

Universidad de Mlaga

Francisca M Snchez Jimnez, Catedrtica de Bioqumica y Biologa Molecular de laUniversidad de Mlaga, Miguel ngel Medina Torres Catedrtico de Bioqumica yBiologa Molecular de la Universidad de Mlaga y Carlos F. Rodrguez Caso,Investigador Post-doctoral de la Universitat Pompeu Fabra,

CERTIFICAN

Que Ral Montaez Martnez, Licenciado en Biologa por la Universidad de Mlaga,

ha realizado bajo nuestra direccin el trabajo de investigacin correspondiente a suTesis Doctoral que lleva por ttulo Aproximaciones computacionales, dinmicas ytopolgicas al estudio del metabolismo.

Una vez revisado el trabajo estimamos que puede ser presentado ante el tribunalencargado de juzgarlo.

Para que conste a efecto de lo establecido en el Artculo 8 del Real Decreto 778/1998,regulador de los estudios de Tercer Ciclo- Doctorado, AUTORIZAMOS lapresentacin de esta Tesis Doctoral en la Universidad de Mlaga.

Mlaga, enero de 2010

Fdo.: Francisca M Snchez Jimnez Fdo.: Mi uel n el Medina Torres Fdo.: Carlos F. Rodr uez Caso


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Este trabajo ha sido financiado por el Programa de Formacin del ProfesoradoUniversitario (FPU) del actual Ministerio de Educacin, los proyectos P07-CVI-02999, CVI-657 y el grupo BIO-267 de la Junta de Andaluca, el proyecto SAF2005-01812 y SAF 2008-02522 del Ministerio de Ciencia e Innovacin, la FundacinRamn Areces, EU 6th framework project ComplexDis (NEST-043241, CRC) y elCIBER de Enfermedades Raras. CIBERER es una iniciativa del ISCIII (Espaa).


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AgradecimientosLa gratitud, virtud o hipocresa?. La gratitud debera ser esa reconfortante

sensacin de saber que hay alguien que te acompaa y apoya, que confa en ticiegamente y te cuida. Lamentablemente, la realidad es otra, la gratitud es condemasiada frecuencia la ofrenda a la falsa cordialidad que nos permite vivir ensociedad. Confo en ser lo suficientemente hipcrita como para que nadie notela diferencia.

Quiero agradecer en primer lugar a las personas que me acogieron en sus grupos durante las dos estancias que he realizado y que me han permitidosumergirme un poco ms en el ocano del conocimiento. Dr. Ramnek, Thomas,Sren, Tejal, y dems, gracias por vuestra amabilidad y dedicacin durante losmeses que pas en el Center of Biological Sequences, esos tres meses avuestro lado me han enseado que hay otra manera de hacer ciencia. A vosotros,Ricar, Bernat, Sergi, Andrea, Javier y dems integrantes del Laboratorio deSistemas Complejos muchsimas gracias. Cada caf, cada almuerzo, cada cigarroa vuestro lado han sido fascinantes y divertidos y con ellos habis reavivado unacuriosidad que olvid en algn bolsillo tiempo atrs. He disfrutado mucho a

vuestro lado.A mis directores, a todos ellos los habra ahogado en un cubo un par deveces durante estos aos. Por suerte el litio y la lobotoma frontal me hanmantenido estable.

Kikita hija, Gracias a ti he aprendido, tal vez, lo ms desagradable, lo que nadiequiere mostrar, me has enseado que la ciencia no es una sociedad idlica en laque todos cooperan en pro del conocimiento, me has enseado que no siemprees bueno ir de cabeza y a pecho descubierto, que este mundo es sibilino y losfrancos son presa fcil. Me has ayudado, guiado y defendiendo cada una de misideas. Gracias por creer en mi.

Miguel ngel, tras tu aparente frialdad e inexpresividad hay una persona buena. De ti he aprendido la otra cara, la cara hermosa de la ciencia, la cienciaplatnica, la que no es ms que un juego, la de sistemas auto-organizados, la que no obvia y sabe que cada parte es importante, la que es bella por serinalcanzable. Muchas gracias Miguel ngel por acercarme a un mundo tanmaravilloso.

Carlos, me enseaste cuando eras compaero y me rescataste cuando meencontr perdido. Has sido mentor y eres amigo, me has escuchado y

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aconsejado, en la ciencia y en la vida, y me has hecho rer en los momentosdifciles. Me has enseado que sin preguntas la ciencia es slo un merodesarrollo tecnolgico. Muchas gracias Carlos.

Dani, el director de mi tesina y quien me brind el contexto para hacer miprimera aportacin escrita a la ciencia, ese impulso fue definitivo Dani, muchasgracias.

Con respecto a los restantes jefes, quiero empezar por JL, he conocido pocas personas tan nobles y desinteresadas, muchas gracias por estar haysiempre. Ignacio, capaz de hacerse odiar en un instante y arrancarte una sonrisa

al siguiente, cido y elegante, metdico como un obsesivo compulsivo, graciaspor soportarme. Juan Antonio, tu eres jefe o no?. Bueno, seas lo que seas, gracias por dedicarme tu escaso tiempo en las mltiples charlas que hemostenido.

En cuanto a mis compaeros, Luisio y Javi el rubio, juntos fuimos el grandioso Imperio Redox capaz colonizar el laboratorio en un instante y dereducirse a una caja de cartn en el siguiente, nos hemos redo y hemossufrido largas horas de cinticas junto al Shimatsu. A vosotros, a misprimeros compaeros de ciencia y otras muchas cosas, gracias.

Alejandro, la bondad tentada por el lado ms oscuro del comportamiento

humano, sin ti este trabajo que se presenta no habra sido posible. Armando, elchico del cerebro inquieto, muchas gracias a ambos por acompaarme en el day en la noche haciendo del paso del tiempo algo ms divertido.

Hicham, tu generosidad y buen corazn han conseguido que un xenfobo portero de discoteca ahora lamente alejarse de ti. Muchas gracias por tuamistad y por cuidar de Catalina.

Aurelio, Almudena Ian, Gianni, Esther, Flor Beatriz, Luis Gustavo, Lucas,Casimiro, Auxi, Pepe, Ana, Mara, Mara Victoria (una mujer a la que admirosinceramente), Mara Jesus, Javi, Melissa, Germn y dems, vosotros conformisel contexto, ayudis a que el grupo sea lo que es y a que sea agradable

pertenecer a el y acudir cada maana. Me he divertido y aprendido mucho avuestro lado. Muchas gracias, gracias por vuestras enseanzas y por llegar aconsiderarme casi como un amigo. Muchas gracias a todos.

Pero si realmente hay personas que han hecho posible este trabajo son los que me han generado, en primer lugar como ente fsico y posteriormenteconformando la persona que soy, esas personas son mi pequea familia.

Gracias madre por ensearme que las caadas reales no son el nico camino,que aunque el rebao da calor y acompaa, solo pace y camina. Por ensearme a

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ser critico con la realidad y a no conformarme. Por ensearme que elconocimiento y las ideas propias son las que te hacen libre.

Gracias padre por ensearme a sentirme orgulloso del trabajo bien hecho.Gracias Sergio, mi hermano, mi hermano mayor, mi referencia. Tu cuidaste de

mi y me llevaste de la mano por una infancia difcil sin separarte nunca.Gracias Dama, mi hermana, mi pequea hermana, fortaleza y ternura en dosis

letales. Te quiero pequea.Gracias Rubn, Adam, Daniela Mara y Mario, en diferentes etapas de mi vida

habis sido y sois aun la infancia renovada y las ganas de jugar.

Gracias a mis tos, Manolo y Fali, me habis cuidado como a un hijo y aligual que mi madre me habis enseado a ser yo mismo.Gracias Bo, el espalda plateada, el abuelo, aun recuerdo tu mano en mi

cabeza mientras caminabas despacio, tu entereza y tu ganas de vivir.Gracias, Karin, Fali, Krishna, y Concha por cuidar de las personas a las que

quiero y hacerlos felices.Finalmente, agradecer a la persona que me cuida a diario y me ha mostrado,

quizs lo ms importante, cmo se ha de querer a una persona. GraciasCatalina.

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A mi madre

El da que nos cansemos de ser,seremos simplemente uno ms


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Puede parecer dramtico pensar quecada uno de nuestros pasos no es ms queuna gota en el mar, mas esa es la verdad.

Este trabajo no ser ms que una efmeraaportacin al conocimiento. Pero sin gotasno habra mar.

Siempre me ha maravillado pensar en eldevenir del universo. Cmo las partculassubatmicas burlaron el estado de mximaentropa formando tomos. Cmo los to-mos colapsaron en estrellas y cmo estasenriquecieron el universo de nuevos to-

mos hasta generar entidades fsicas tansorprendentes como los seres vivos. Curiosainconsistencia con la inercia entrpica que

determina el sentido del tiempo.

The irreversibility of time is the mecha-nism that brings order out of chaos.

Ilya Prigogine

En el interior de una clula la materia y laenerga son transformadas y ordenadasgenerando vida. La periodicidad, intensi-dad y composicin de esta materia y

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Cada uno de nuestros pasos es el inicio de un insondableviaje atravesando el jardn de Borges hacia la singular cer-

teza del equilibrio.


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energa es interpretada por la clula reajus-tando su composicin y variables de esta-do, apresurndose a cambiar para mante-nerse constante. Es sorprendente cmo lavida elude incesantemente el equilibrio,incrementando la entropa de su entornopara generar su propio orden gracias a losmiles de procesos fsico-qumicos que sedan en el interior y la frontera de las clu-las.

Para favorecer su comprensin, la espesatrama de procesos interconectados fue

cortada por la navaja de Occam. Se defi-nieron y se estudiaron as el metabolismo,los sistemas de biosealizacin, los procesosde replicacin, reparacin, transcripcin ytraduccin del ADN, etc. Pero, ms all denuestra propia necesidad de comprensin,tal frontera no existe y en ocasiones es dif-cil discernir un lmite claro entre cada unode estos mdulos funcionales.

Lo que pretend, en origen, con el trabajoque mostrar a continuacin es alcanzarun mayor nivel de comprensin de la di-nmica de la vida. Una gran meta, un r-bol de elucubraciones propias de un nefi-to en el quehacer cientfico. Inevitable-mente la realidad ha de acotarse en ma-yor o menor grado. Necesitamos definirsistemas reales cuyos sistemas conceptua-les y resultados derivados puedan abarcar-se empleando nuestra limitada capacidadde comprensin.

Estos cuatro aos de trabajo me hanayudado a comprender que la necesidadde acotar y definir un sistema no ha deconducirnos necesariamente al estricto

reduccionismo. Que, con las abstraccionesapropiadas, la madeja de incertidumbrepuede ir desenredndose poco a poco.

El trabajo de mi tesis se inici ya con unainterpretacin holista del quehacer cientfi-co, aunque en origen supeditado a la tra-yectoria histrica y el mbito de conoci-miento del grupo en el que me integraba.El laboratorio de Proliferacin Celular delDepartamento de Biologa Molecular y

Bioqumica de la Universidad de Mlagaera por aquel entonces un laboratorio cen-trado en el estudio del metabolismo y fun-ciones biolgicas de las aminas bigenasen clulas animales proliferantes.

El grupo parta de un enfoque puramenteexperimental y reduccionista. Enfoque quepermiti la caracterizacin de propiedadesde diversos elementos de estas rutas meta-blicas: ornitina descarboxilasa (ODC, unade las enzimas limitantes de la biosntesis depoliaminas) y su regulacin por aminas,

histidina descarboxilasa (HDC, enzima res-ponsable de la biosntesis de histamina),modos preferenciales de unin entre ami-nas y cidos nucleicos, sistemas de trans-porte de aminas y respuestas fenomenol-gicas del metabolismo de aminas en mo-delos celulares y animales donde estoscompuestos tienen un papel fisiopatolgi-co relevante [10-12]. Pero en el seno delgrupo se senta ya la necesidad de un en-foque ms amplio.

Como refleja la cronologa de los artcu-los que dan soporte a esta tesis, mi trabajocomenz con la consolidacin de un estu-dio ya iniciado por uno de mis actualesdirectores de Tesis en el que se pretendahacer una abstraccin matemtica quecaracterizase la dinmica de un sistemacompuesto por las principales enzimas queconforman el biciclo de las poliaminas ycaracterizar las enzimas y metabolitos rele-vantes en el control de su dinmica. Enaquel trabajo se daban la mano antiguasdisciplinas, que hoy parecen olvidadas ba-jo la sobretecnificacin de la actual biolo-ga molecular, tales como la enzimologa

[3], la teora general de sistemas [1] o inclu-so la ciberntica [9], para poner de mani-fiesto que el metabolismo pueden ser re-ducido a un sistema de ecuaciones capazno slo de reproducir, sino de predecir sucomportamiento. En nuestro caso, repro-ducamos el comportamiento del metabo-lismo de poliaminas en ratones transgni-cos y el efecto de las principales drogasempleadas en esta ruta y fuimos capacesde predecir la dependencia en la activi-

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dad del ciclo de las poliaminas de la dis-ponibilidad de S-adenosilmetionina y deacetil-CoA [Captulo 3.1], prediccin quefue corroborada despus [4].

Este modelo fue mi primera aproximacina la abstraccin de un sistema biolgico ysu implementacin en un programa infor-mtico. Adems de la experiencia meto-dolgica, los mltiples intentos de ajustarlos parmetros de las diferentes variables seconvirtieron en la comprobacin de factode que incluso un micro-sistema como era

el modelo de las poliaminas poda mostrarun elevado nmero de correlaciones delarga distancia, lo que despert mi curiosi-dad por los sistemas complejos. De estemodo, el modelo de las poliaminas se mos-tr no slo como una importante expe-riencia procedimental sino tambin filosfi-ca.

Todo esto reforzado por la esperanza enuna emergente metodologa que parecaconsolidarse poco a poco: la Biologa deSistemas se convirti en la base de unaapuesta mucho ms amplia en la que seintent ir incrementando la abstraccininicial de modo modular. Si fuera cierta lapropuesta segn la cual el metabolismo esun sistema modular y cada uno de los m-dulos una unidad funcional independiente[15], podra reconstruirse un modelo cinti-co cada vez mayor mediante la adicinrecurrente de modelos construidos y vali-dados por separado. Para tal fin, se gene-r un nuevo modelo para el catabolismode la arginina [Captulo 3.2] y se readapta-ron modelos existentes [14, 17]. Los resulta-dos de esta integracin se presentan de

modo resumido en la seccin de posibili-dades futuras del captulo 3.

Se pueden mencionar muchas dificulta-des en el camino trazado, cuyos intentosde solucin han constituido buena partedel entrenamiento y la experiencia adqui-ridos:

La recopilacin de la informacin ne-cesaria para comprender el conjunto de

elementos implicados en cada uno de lossubsistemas y las relaciones entre ellos, in-cluyendo la caracterizacin de las dinmi-cas de cada una de las enzimas, los modi-ficadores de su actividad y la determina-cin de los parmetros cinticos necesariospara acotar el dominio de esas funciones.

La consolidacin de la necesidad deaplicar aproximaciones realmente holistas,que contemplasen en su conjunto la ele-vada complejidad de los sistemas biolgi-cos.

La creciente acumulacin en bases dedatos de informacin no estructurada niconsensuada que entorpece la localiza-cin y aprovechamiento eficiente de lainformacin.

Como apoyo tecnolgico indispensablepara hacer nuestra tarea ms eficiente, serequeran nuevas herramientas de recopi-lacin y anlisis de la informacin [Captulo1.1]. En los ltimos aos, Internet se ha con-solidado como el principal repositorio deinformacin biolgica proveniente de las

tcnicas de anlisis de alto rendimiento.Esto inspir la idea de desarrollar un sistemaautnomo capaz de aplicar un criterio ex-perto. Para la mayora de los usuarios, estainformacin es accesible manualmentemediante entornos de interfaces webs.Sin embargo, la flexibilidad y accesibilidadde las consultas manuales puede ser unatraba cuando pretende conectarse a ellasuna aplicacinsoftware automatizada.

En este punto de encuentro era necesa-rio hallar el soporte tecnolgico ms apro-piado para hacer viable la idea (que pu-

diera tildarse de ambiciosa) de desarrollarun sistema autnomo capaz de generar lasconsultas apropiadas con las que recupe-rar la informacin requerida.

Gracias a la paciente colaboracin yasesoramiento de Jos Aldana Montes,investigador principal del grupo KHAOS(adscritos al Departamento de Lenguajes yCiencias de la Computacin, de la Univer-

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sidad de Mlaga), se puso en marcha elproyecto de un mediador semntico me-diante el cual se facilitara la recuperacinde informacin biolgica en muy diferentesreas.

El principal propsito de la mediacinsemntica consiste precisamente en reali-zar consultas automticas sobre los conte-nidos almacenados en internet. Para tal finmuchas de las bases de datos o de cono-cimiento estructuran su informacin acordea un patrn unvoco resultado del consen-

so entre consorcios web, haciendo expl-cita la semntica del contenido para undominio concreto de conocimiento.

En mi caso, particip previamente en unaexperiencia piloto en la que se gener unaaplicacin software con la que recuperarla informacin referente a las interaccionesentre protenas, (PROTOPIA) [16] cuyas ba-ses procedimentales se plasmaron en elartculo presentado en [Captulo 1.3]. Eltiempo dedicado a este trabajo nos pusoen antecedentes acerca de la rpida ob-solescencia de este tipo de herramientas,as como de las deficiencias de buena par-te de las bases de datos a nuestro alcanceen aquel momento: un sustancial grado deincompletitud en la informacin, falta deconsenso en la nomenclatura, referenciascruzadas incorrectas, redundancia, cadu-cidad, informacin no validada, etc. Parasolventar este importante escollo, se plan-te la posibilidad de emplear contextuali-zaciones del conocimiento preexistentes,tales como Gene Ontology, Tambis, CellOntology o Proten Ontology. El inconve-niente que planteaban estos contextos de

conocimiento era su pobreza de relacio-nes, al consistir en jerarquizaciones por sub-suncin de conceptos. Era evidente quedeba generar mi propio andamio concep-tual, una ontologa que definiese, de modoconcreto y explcito, el contexto de cono-cimiento en el que pretenda trabajar.

Defino as AMMO (The AMine MetabolismOntology), una ontologa que representalos elementos claves del metabolismo, su

regulacin, su dinmica, llegando incluso asu estructura tridimensional. En esta ontolo-ga los nodos son los conceptos implicadosen el dominio de conocimiento de interspara mi trabajo, los arcos no identificadosson las relaciones jerrquicas que estructu-ran la informacin, siendo los identificadoslos que definen el modo en que los con-ceptos se relacionan entre s.

AMMO era slo el soporte sobre el quenuestro conocimiento biolgico cobrabaorden y sentido. Como toda ontologa, esta

debe ser fruto del consenso de opiniones yser aprobada por una comunidad de ex-pertos. De este modo, mientras AMMO seenriqueca con las aportaciones de la co-munidad cientfica, nosotros debamoscomprobar su validez y viabilidad paranuestros propsitos.

La ontologa permita que, de modo or-denado, un sistema de gestin de consul-tas determinase qu informacin era re-querida para dar una respuesta lo suficien-temente completa a una consulta. Ahoratocaba conectar los diferentes conceptosy relaciones contenidos en la ontologa almundo de conocimiento de las bases dedatos. Se inicia as el proceso demapping, operacin que asocia cadaelemento de un conjunto (el dominio) conuno o ms elementos de un segundo conjunto (su rango). En nuestro caso, los ele-mentos y relaciones de la ontologa erancorrelacionados con campos o hiperenla-ces concretos de las bases de datos, ascomo con los conceptos equivalentes enotras ontologas. De este modo, el conjuntode nuestra ontologa, junto con el conjunto

de ontologas con conceptos correlacio-nados con la nuestra, los campos y relacio-nes de las bases de datos, y dos ontologasnter-relacionadas que describen las se-mnticas del conjunto, constituyen el direc-torio semntico de nuestra aplicacin. Losmetadatos contenidos en el directorio se-mntico pueden ser gestionados por unrepertorio de herramientas que van desdesimples parsers para archivos en formato

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OWL (Web Ontology Language Reference)hasta elaborados razonadores ontolgicos.

Basndonos en esta potente herramientade gestin de la informacin y el contextode conocimiento, planteamos la posibili-dad de contrastar su funcionalidad desa-rrollando una aplicacin capaz de aportarel mejor modelo molecular posible de lasprincipales protenas implicadas en el me-tabolismo de poliaminas [Captulo 2.1]. Elxito conseguido con esta pequea prue-ba controlada permiti ir un paso ms all

y afrontar la tarea original para la que sehaba planteado la aplicacin.

Comienzo as a planificar y dar forma a loque ser el System Biology Metabolic Mo-deling Assistant (SBMM) [Captulo 2.2], unaherramienta capaz de facilitar la genera-cin de modelos metablicos cinticosexportables en SBML y compatible, por tan-to, con distintas aplicaciones matemticasy de representacin de modelos metabli-cos de uso estandarizados. Para adaptarnuestros recursos a la generacin delSBMM, refin los conceptos implicados enla ontologa y las relaciones entre estos pa-ra que se ajustasen mucho mejor a nuestrasnecesidades y fuesen coherentementegestionadas por el razonador de ontologassin posibilidades de ambigedad. Junto ami compaero Armando Reyes Palomares,revis las correlaciones ms correctas conlas bases de datos. Con la ayuda de miamigo Wenceslao Vereda, diseamos elentorno de la aplicacin a la que finalmen-te dio forma e integr con el mediador migenial amigo y compaero Alejandro del-Real.

Durante esta singladura, continu inda-gando sobre los sistemas complejos, asis-tiendo a congresos de Biologa de Sistemasy comprobando que, como en todo aflo-ramiento ecolgico, la abundancia de re-cursos haba propiciado el desplazamientode los especialistas por los generalistas. LaBiologa de Sistemas era por muchos en-tendida como Biologa Molecular a granescala o trabajos puramente computacio-

nales o de ingeniera.

Siempre he sido, quizs, demasiado crti-co y consider que deba de manifestarseque ese proceder no era el apropiado yque se requera una visin real de los siste-mas biolgicos como sistemas integrados.Slo de este modo se procedera y seavanzara hacia una autentica Biologa deSistemas.

De este modo, aprovechando una invi-tacin de Biochemical Society Transactions,

convenc a uno de mis directores, la Dra.Snchez-Jimnez, acerca de la necesidadde plasmar esa opinin. Surge de este mo-do la primera de mis aportaciones concep-tuales al contexto del conocimiento cient-fico en la que se planteaba una interpre-tacin de lo que debera ser una autnticaaproximacin sistmica a un problema bio-lgico [1.1]. La segunda llegara un aoms tarde, con la colaboracin de mi pri-mer mentor oficial, el Dr. Medina. En sta sehaca una vez ms referencia a la necesi-dad de aplicar la Biologa de Sistemas altema de las poliaminas, pero adems seplasmaba de un modo ms crtico la err-nea concepcin de la Biologa de Sistemasy la necesidad de una revisin de la misma[1.2].

Como es evidente, he intentado que mitrabajo se desarrollase acorde a mi con-cepcin de cmo haba de enfrentarse unproblema biolgico. De ese modo, poco apoco, me fui alejando del metabolismo delas aminas bigenas para ir teniendo unavisin ms amplia del metabolismo y de sufuncionamiento integrado.

Todo este trabajo me permiti aprenderacerca de la estructura de las bases dedatos, entender sus estructuras relacionalesy familiarizarme con las herramientas conlas que poder gestionar su informacin. Deese modo, la informacin se desplegabaante m como un extenso abanico de po-sibilidades y preguntas.

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Las diferentes lecturas y el asesoramientode mi director ms joven, el Dr. Rodrguez-Caso, coetneo mo, favorecieron quetendiese a integrar toda esa informacinen grafos. Al enfocar mi atencin a la teo-ra de grafos, descubr nuevas inconsisten-cias en el modo de proceder de la comu-nidad cientfica. En primer lugar, los siste-mas biolgicos eran muchas veces abstra-dos por ingenieros o fsicos, los cuales portradicin dominan el soporte conceptual yde procedimiento de la metodologa, perofrecuentemente caen en el error de des-cuidar o sobresimplificar el problema quepretenden afrontar. Por otro lado, los bilo-gos desconocamos el sentido y las impli-caciones que estos ingenieros y fsicos ex-traan de sus anlisis. Ambas circunstanciashan favorecido que la comunidad cientfi-ca adoptase un importante nmero degeneralizaciones, basadas en una topolo-ga comn, sin tan siquiera plantearse qusignificado tenan. Este problema se haplanteado por diferentes autores, incluidosnosotros [Captulo 4.1][2, 5, 6, 8, 13].

Dos ejemplos de generalizaciones son:

1) Las distribuciones de ley de potencianegativa. Estas distribuciones y su justifica-cin mediante el modelo de unin prefe-rencial se han asumido como una ley quese ha de cumplir y que cuando no se cum-ple es justificada por la incompletitud de losdatos en lugar de asumir que falla el mode-lo [6]. Se han consolidado como la cons-triccin esencial que ha guiado la evolu-cin y se ha empleado para generar mlti-ples modelos de evolucin [7].

2) El concepto de robustez o tolerancia aerrores, aplicado a las redes biolgicas sinla consideracin espacio-temporal propiade los organismos vivos. La robustez delproteoma, aplicada a una red general enla que todas las protenas sintetizables porun organismo y capaces de interaccionarson valoradas, ignora la expresin diferen-cial de genes en las diferentes fases celula-res y fisiolgicas de los organismos, la com-partimentacin o el nmero limitado de

dominios de unin de las protenas. En elcaso del metabolismo, adicionalmente, seignora que para suprimir un determinadometabolito, el nmero de reacciones quese deben silenciar (aun ms en el caso demetabolitos altamente conectados) puedealcanzar el centenar y evidentemente elorganismo no ser viable. Si la valoracinse hace sobre reacciones, protenas enzi-mticas o genes metablicos, el problemaes similar, ya que los hubs surgen de unartefacto introducido por un proceso ma-temtico llamado proyeccin. El procesode proyeccin es aquel por el cual una rednaturalmente bipartita es colapsada a unared con solo uno de los dos tipos de nodos,conectados stos por los nodos comunesentre pares.

3) Por otro lado, los parmetros que ca-racterizan a las redes unipartitas se asumencomo parmetros capaces de caracterizarcualquier tipo de red. Sin embargo, la in-certidumbre en las abstracciones introdu-cidas por las diferencias entre redes basa-das en reacciones, en enzimas, segn c-

digo EC, en protenas con actividad enzi-mtica o en genes, condiciona notable-mente las caractersticas globales de losgrafos generados.

Intent solventar todas estas incertidum-bres con el empleo de una abstraccin enla que el metabolismo era modelado em-pleando ambos tipos de nodos, reaccionesy metabolitos. Aplicando esta aproxima-cin he podido no slo evidenciar algunosde los artefactos antes mencionados, sinoque he podido alcanzar el propsito inicialde comprender un poco mejor cmo fun-

ciona el metabolismo.

Los! periodos de formacin acadmicason y deben ser finitos, aunque a menu-do! tan ficticios como las fronteras de co-nocimiento o las separaciones del metabo-lismo en vas metablicas y, adems,!sueleocurrir que en un! tema de investigacinque permanece vivo, cuanto ms se traba- ja ms cuestiones suelen abrirse y que en

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definitiva, como deca Mayor-Zaragoza hay que

"emprender!y reemprenderpor las soadas

sendas...sabiendo!

que siempretodo

queda inacabado"

("Sentir". F. Mayor-Zaragoza, Terral, Ed. Litoral)

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Bibliografa

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En esta Tesis Doctoral se presentan 4 ca-ptulos en los que se plasma parte de mi

trabajo y mi modo de entender el queha-cer cientfico.

Resumen de los contenidos del captulo 1

El primer captulo, titulado Mi concep-cin de la ciencia (haciendo referencia almagnfico libro de Erwin Schrdinger Miconcepcin del mundo) [12], consta detres artculos de opinin: The usefulness ofpost-genomics tools for characterization of

the amine cross-talk in mammalian cells[Captulo 1.1][10], Polyamines: metabolism

to systems biology and beyond[Captulo1.2][7] e Information integration of pro-teinprotein interactions as essential toolsfor immunomics[Captulo 1.3][6].

En el primero de estos trabajos [Captulo1.1] se refleja el papel multifuncional de lasaminas bigenas y su relacin con mltiplesprocesos fisiopatolgicos. La aminas semuestran as como un sistema biolgicocomplejo de un elevado nmero de inte-

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Nuestro conocimiento es necesariamente finito, mientras que nues-tra ignorancia es necesariamente infinita

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rrelaciones no lineales, lo que crea la nece-sidad de abordad su estudio bajo una p-tica integrada.

Se describe la necesidad de conjugar lastecnologas in silicio con las tcnologasmicas para poder establecer una di-nmica cruzada de prediccin y valida-cin absolutamente necesaria para avan-zar de forma firme y eficiente en el cono-cimiento de un sistema biolgico. Se haceuna revisin de aquellos sistemas celularesy animales donde se han detectado fen-

menos de interrelacin metablica en elmetabolismo de aminas.

En la figura tres de este trabajo se presen-ta de modo esquemtico una propuestade aproximacin sistmica al estudio de unproblema biolgico y se expone la estrate-gia del grupo para avanzar en una visinms holista y contextualizada de ese co-nocimiento.

La elegancia de la navaja de Occamcon la que se pretenda descomponer to-do problema hasta las unidades mnimas

de comprensin se convierten aqu en ale-gora del eterno retorno. El conocimientoen el que nos basamos surge de la aplica-cin de la simplificacin y la hiptesis finalhabr de ser contrastada y refutada ensistemas experimentales simplificados en losque la nica variable libre nos permitaasociar el comportamiento observado enlas variables dependientes al comporta-miento de la variable libre.

Mi posicin como segundo autor en estapublicacin, refleja mi participacin direc-ta en esas reflexiones. La Dra. Snchez, uno

de mis directores, fue la persona invitada arealizar la revisin, y como representanteespaola en la accin COST que gener lapublicacin deba ir a la cabeza. Mis otrosdos directores tambin constan como au-tores, lo que prueba que las bases sobre lasque se desarrollara mi proyecto de TesisDoctoral, estaban consensuadas y plas-madas por escrito desde tiempo atrs.

En el segundo trabajo [Captulo 1.2],manifestamos nuevamente la necesidadde aplicar aproximaciones sistmicas alestudio de las poliaminas y el metabolismo.Pero en este artculo no slo proponemosun modo de aproximarse a el estudio, sinoque manifestamos nuestra desaprobacinhacia las desacertadas interpretaciones dela biologa de sistemas:

In the wikipedia, systems biology is defined as anacademic field that seeks to integrate different levels ofinformation to understand how biological systems

function. The identification of systems biology as anacademic field (namely, an additional speciality ofbiology) is suspicious. In fact, since the objects ofstudy of biology (cells, organisms, populations, ecosys-tems) are all of them complex systems, should not the whole biology be considered as a systems biology?We are afraid that most of the scientists convertedto systems biology make an instrumental use of it tomanage the huge amount of information provided bynew omics technologies and bioinformatics. Al-though this instrumental approach is indeed also requi-red, this cannot surpass the limitations of reductio-nism. It is our understanding that an authentic holisticand systemic view of biology should be based on theanalysis of the relationships among elements of a

biological system in a given steady-state, as well asalong the response of the system against any perturba-tion of its environment, with the final aim to know notonly the system itself but also its dynamics. To achievethis goal, the approaches provided by the generaltheory of systems, the theory of dynamical systemsand, in general, the new sciences of complexity shouldbe applied. Complexity is a keyword, which wasidentified as one of the three main challenges of bio-logy (the others are consilience and communica-tion) for the incoming century in an influential edito-

rial published in BioEssays (1999).

El tercer y ltimo trabajo [1.3], surge nue-vamente como consecuencia de una invi-tacin. En 2006, nuestro grupo fue invitadoa participar en el Congreso Immunomics(Budapest), y all presentamos el plantea-miento inicial y las hiptesis con las quetrabajaramos para la consecucin delproyectoAmine System Project [1].

Este fue el comienzo del proyecto demediacin semntica y la contextualiza-cin de una idea en una ontologa en la

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que los mltiples fragmentos del reduccio-nismo se integraban y contextualizabandando soporte a una herramienta quepermitiera capturar informacin metabli-ca y molecular desde distintas bases dedatos internacionales. Algunos de esos re-sultados se expondrn en el captulo 3.

En ese mismo Congreso, nuestro grupoofreci un tutorial del manejo y funciona-miento de una herramienta con la que po-der integrar informacin sobre interaccio-nes protena-protena. El resultado fue el

manuscrito que aqu se presenta, en el quese reflejan mis ideas personales con rela-cin a las caracterizaciones protemicasde los organismos y su importancia en elmetabolismo de cualquier clula viva, En eltrabajo se hace referencia a las inconsis-tencias en la informacin depositada enlas bases de datos y en qu modo estainformacin debe ponderarse sobre la ba-se de un criterio de valoracin. En aquellapoca, consideraba que cualquier esfuer-zo para poder ayudar en este sentido, si-quiera sea en la integracin de la informa-

cin que ya exista, podra ser interesante.Aunque por decisin propia no fui final-mente autor de la herramienta publicadapor el grupo para la captura de esta infor-macin [9], la realidad es que junto con midirector Carlos Rodrguez-Caso, contribui-mos en gran medida a la concepcin dela herramienta, la procedencia de la infor-macin que deba integrarse, su interpre-tacin, los criterios de refinado de la infor-macin y a la generacin de la ontologaque subyace a esta herramienta. Con laperspectiva que da el tiempo transcurridodesde la preparacin de esta revisin, hay

que reconocer que los esfuerzos realizadospor los distintos grupos internacionales paramejorar las herramientas de integracin dela informacin sobre interacciones protei-cas les dan la razn a muchas de las afir-maciones hechas en este artculo, mientrasque otros puntos an permanecen sin re-solver.


El capitulo 2 rene los trabajos de inte-gracin de informacin automatizada. Aeste captulo lo he titulado Buscando laverosimilitud en un mundo abierto.

Hacer realidad la construccin de unmediador semntico me oblig a trabajarcodo con codo con un grupo de inform-ticos. Esto fue una experiencia no siempregrata pero me permiti familiarizarme conun nuevo lenguaje y una forma de trabajarmuy diferente a la que habitualmente yodesarrollaba. De manos del grupo Khaos

aprend a contextualizar mi conocimientoen un sistema lgico formal y estructurado,las ontologas. Aprend su programacinfacilitada y su visualizacin empleando elentorno Protg [4] y el visualizadorJamba-laya as como, los estndares del Web On-tology Language Reference (OWL).

Puesto que en el primero de los artculosque componen esta seccin [Captulo2.1][8] se explican minuciosamente tantolos antecedentes como el objetivo generalde construccin de un director semntico,incluyendo su organizacin y componen-tes, obviar la repeticin de todos estosconceptos en esta seccin. Cualquier lec-tor interesado en estos aspectos puedeseguir ilustrndose a partir de esta referen-cia, de la pgina web del grupo Khaos, yde las pginas webs donde las herramien-tas siguen activas, a las que se puede ac-ceder tambin a travs de [1].

En esta Memoria se incluyen dos de lasherramientas que se desarrollaron a partirde la generacin del directorio semnticoinicial. Ambas se han publicado en revistas

de Bioinformtica y de ambas soy primercoautor. A continuacin expondr breve-mente el sentido de cada una de ellas, ymi contribucin especifica a su desarrollo:

El primero de los trabajos de mediacinsemntica [Captulo 2.1] constituy el ex-perimento piloto de nuestro mediador se-mntico. AMMO-Prot es un mediador se-mntico que pretende facilitar la recupe-racin de estructuras tridimensionales de

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protenas. A la aplicacin se accede me-diante una interface de usuario centradaen las principales protenas del metabolis-mo de poliaminas e histamina, AMMO-Protbusca para el organismo definido por elusuario, las estructuras tridimensionales, dela protena seleccionada, almacenadas enel Protein Data Bank (PDB) [2]. En caso deno encontrarse un registro adecuado mo-dela, a partir del homlogo ms cercanoencontrado, la estructura tridimensional dedicha protena empleando la aplicacinde modelado comparativo o por homolo-ga Modeller [3]. La herramienta devuelvefinalmente un fichero en formato .pdbcompatible con cualquier visualizador demolculas. Esta herramienta se present enel Seventh International Workshop on Net-work Tools and Applications in Biology (NET-

TAB 2007) Pisa, Italy. 12-15 June 2007 y co-mo consecuencia de esta comunicacin,nos invitaron a preparar esta publicacinpara la revista [8].

Como se ha explicado anteriormente,gener la ontologa y defin las rutinas ne-

cesarias para acceder a los distintos pro-gramas y pginas de forma automatizada(Swiss-Prot, Modeler, Protein Data Bank) ycomprob la validez de los resultados ob-tenidos en colaboracin con mi compae-ra Almudena Pino ngeles. Pese a la res-triccin impuesta por la interface, estaherramienta puede emplearse para cual-quier protena de igual modo que lo haceSwiss-Model [5].

En el segundo de los trabajos de media-cin semntica [Captulo 2.2] se consolidael propsito inicial de generar una herra-

mienta general (no restringida a va meta-blica alguna) que facilitase de modo au-tomatizado tareas esenciales para la gene-racin de modelos metablicos predictivosaplicando un protocolo de razonamientobasado en la estructura lgica definida enla ontologa. Se trata de un asistente quecaptura la informacin cintica, desde lasrelaciones entre las enzimas, pasando porlos moduladores o las ecuaciones cinti-cas, hasta el conjunto de parmetros ne-

cesarios para acotar su dinmica. La infor-macin es recuperada de las bases de da-tos KEGG, Brenda y SABIORK, sobre cual-quier enzima de cualquier organismo, yotra informacin complementaria captu-rada de PubChem o Uniprot. El usuario tie-ne la posibilidad de editar los datos obte-nidos. Tambin prepara los datos y ecua-ciones para facilitar la generacin de mo-delos matemticos cinticos. Este asistentese ha usado ya con distintos fines; entreellos, ha servido para actualizar y enrique-cer una base de datos sobre el metabolo-ma peroxisomal, recientemente publicada[11].


Durante las primeras dcadas del sigloXX, investigadores como Leonor Michaelis,Maud Menten y John Burdon SandersonHaldane, generaban hiptesis y trabajabansobre la posibilidad de formalizar en ecua-ciones matemticas la dinmica de losprocesos vitales. Gracias a ese esfuerzo, lacintica de las reacciones enzimticas pu-do expresarse en el lenguaje de las mate-mticas. La formalizacin de los mecanis-mos de reaccin como funciones permitiel avance de una Enzimologa formal queabra las puertas de teoras generalistas,como la teora general de sistemas, el an-lisis e incluso la prediccin del comporta-miento de mltiples macromolculas biol-gicas.

Una va metablica no es sino el torrentetermodinmico que concatena las trans-formaciones moleculares dentro de los se-res vivos (reacciones metablicas) confor-

mando el conjunto una red de mnimosenergticos similar a los paisajes de plega-miento.

Cada hebra termodinmica es unacreoda modelable por separado pero im-posible de escindir de su conjunto, puesdepende de los aportes de este entorno.Desde esta perspectiva, puede pensarseen las distintas rutas metablicas como enlas piezas de un lego, cuya estructura apor-

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ta informacin sobre el control general delsistema. No sera descabellado pensar enla posibilidad, por tanto, de ir descubriendolas propiedades emergentes del sistema apartir de la conexin de distintos mdulosmetablicos siguiendo una aproximacinbottom-up.

Bajo esta hiptesis se comenz el trabajocontenido en este captulo que he tituladoMetabolizando nmeros, en el que sepretenda el modelado de dos mdulosmetablicos interesantes para los proyec-

tos financiados del grupo: catabolismo dela arginina por clulas endoteliales y meta-bolismo de poliaminas en clulas de mam-feros. Este trabajo dio lugar a las dos publi-caciones que forman parte de este captu-lo.

El primero de los trabajos de modeladocintico del metabolismo [Captulo 3.1] secentr en el metabolismo de poliaminas. Elobjetivo de este trabajo era encontrar lasbases del control homeosttico del meta-bolismo de poliaminas. Pese a los importan-tes esfuerzos por entender el comporta-miento de los diferentes elementos impli-cados en la homeostasis de esta ruta, sucompleja regulacin (transcripcional, tra-ducional y metablica) as como su estre-cha relacin con mltiples procesos celula-res, dificultaron la comprensin de sus me-canismos de regulacin conjunta. Para sol-ventar esta limitacin se aplico una aproximacin de tipo Bottom-up en la que laruta era modelada matemticamente apartir de las cinticas individuales de cadaenzima, extradas de la informacin biblio-grfica. Como resultado, el modelo captu-

raba las tendencias observadas en ratonestransgnicos para las principales enzimasimplicadas as como el efecto de los prin-cipales inhibidores empleados tradicional-mente en esta ruta. Adems, el modeloevidenci la implicacin directa de S-ade-nosilmetionina y acetil-CoA en la homeos-tasis de los niveles de poliaminas.

En el segundo de los trabajos de mode-lado cintico del metabolismo [Captulo

3.2] aplicamos la misma metodologa apli-cada en el trabajo anterior [Captulo 3.1]para modelar los principales elementosimplicados en el catabolismo de arginina.El modelo era consistente con los resultadosexperimentales descritos en la bibliografa.Los anlisis de control de flujo metablicopermitieron predecir los coeficientes decontrol de todos y cada uno de los ele-mentos implicados en esta ruta, cumplien-do el teorema del sumatorio.

Sin embargo, ya desde el comienzo tena

claro que estos dos trabajos que aqu sepresentan deban ser nicamente el co-mienzo de un proyecto ms ambicioso quetratara de contextualizar estas vas meta-blicas en un entorno de funcionamientoglobal. Los resultados obtenidos, especial-mente los correspondientes al metabolismode poliaminas remarcaron esa necesidad.Nuestras predicciones, validadas por losresultados experimentales de distintos gru-pos internacionales (fundamentalmente losde los laboratorios de los Dres. Anthony E.Pegg, Juhane Janne y Carl W.. Porter, todos

ellos pioneros en el campo de las poliami-nas), indicaban que el metabolismo depoliaminas debe estar ntimamente ligado,no slo a la capacidad proliferativa celulara travs de su unin directa a los cidosnucleicos y la importancia de la metilacinde la cromatina, sino tambin al metabo-lismo oxidativo celular.

Aunque no se incluye en esta memoria,comenz a trabajar en la integracin delmetabolismo de aminocidos catinicoscon el metabolismo de aminocidos azu-frados, y el ciclo de los metilos. Fue la lle-

gada de mi compaero Armando ReyesPalomares la que me sirvi de relevo enesta tarea y me permiti afrontar la ltimaetapa de esta Tesis. En su mano qued elreto de consolidar esa integracin e inte-grar las rutas fundamentales del metabo-lismo oxidativo de clulas de mamferos(Esquema).

Tambin es preciso especificar que, pormantener el orden lgico de todo trabajo

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cientfico, he optado por presentar nuestroanlisis inicial (antecedentes en forma derevisiones) en el Captulo 1, y las herramien-tas desarrolladas (tecnologa de integra-cin de la informacin) en el captulo 2;dejando en este tercer captulo los trabajosde modelado metablico aplicados al me-tabolismo de aminocidos catinicos. Sinembargo, como puede deducirse de lasfechas de las publicaciones, concretamen-te estos dos artculos de modelado comen-zaron sin la ayuda de las herramientas des-critas en el captulo 2, que estaban an enconstruccin, de manera que la bsquedade datos se realiz de forma manual. Estaexperiencia fue la que me hizo ver la nece-sidad de desarrollar nuevas herramientasde integracin, manipulacin y anlisis au-tomtico de la informacin. Puede decirse,entonces, que el desarrollo de los conteni-dos de los captulos 2 y 3 coincidieron du-rante gran parte en el tiempo, y que es enla actualidad cuando las herramientas pre-sentadas en esta Memoria, especialmenteel SBBM Assistant, nos estn facilitando lacaptura y manipulacin de la informacin

de otros proyectos ms ambiciosos que seestn desarrollando en la actualidad ennuestro grupo, y en algunos casos en cola-boracin con otros laboratorios y redes degrupos, como por ejemplo el CIBER de En-fermedades Raras.


En el captulo 4 que titulo Simples lneas ypuntos, el foco se abre, el metabolismo esahora abstrado como un sistema en suconjunto. Un nuevo propsito, entenderqu constricciones han condicionado la

estructura del metabolismo, comprendercmo las relaciones de las diferentes trans-formaciones metablicas se integran en untodo funcional, se convierte en el nuevoobjetivo.

ste, pese a ser el enfoque ms grosero(que aporta un menor grado de detalle),es uno de los que permite trazar lneas ge-nerales. El metabolismo, tal como lo cono-cemos actualmente, es un sistema alta-

mente imbricado. La simplificacin delentramado metablico a simples puntosunidos por lneas ha puesto de manifiestoque las relaciones entre sus elementos nosurgen al azar. Los nodos del metabolismomuestran una distribucin de conexionesque se ajusta a una ley de potencia nega-tiva, es libre de escala, mundo pequeo y jerrquicamente modular. Actualmentesabemos que estas generalidades, pese aencajar con posibles caractersticas delmetabolismo, son en realidad fruto de ladensificacin que introduce el proceso deproyeccin. Durante la proyeccin, las re-des se densifica, incrementando el nmerode nodos. El agrupamiento aparece comouna correlacin de esta densificacin.Como demuestran lo trabajos del captulo4, estas anomalas resultantes del procesode proyeccin han condicionado una vi-sin alterada de la realidad metablica.

En el primero de los trabajos de anlisistopolgico del metabolismo [Captulo 4.1]se muestran los principales problemas de lasobre-simplificacin de una red natural-

mente bipartita (como lo es el metabolis-mo) y se plantea la necesidad de refutarlas conclusiones extradas a partir de laspropiedades topolgicas ms sensibles alos artefactos derivados de la proyeccin.

En el segundo de los trabajos [Captulo4.2], se trata de dar respuesta a las pregun-tas planteadas en el captulo anterior. Severifica la presencia de artefactos en lacaracterizacin derivados de la inflacin ylas correlaciones locales que la proyeccinincorpora a las redes proyectadas. Por otrolado se revisan las propiedades topolgicas

bajo una ptica puramente biolgica, in-tentando hacer lo ms comprensible posi-ble las medidas.

En el tercero de los trabajos [Captulo4.3], se revisa de modo independiente lasmedidas que se emplean para caracterizara las redes metablicas como redes detipo mundo pequeo (Small-world). El me-tabolismo ha sido considerado desde elao 2000 un ejemplo paradigmtico de

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mundo pequeo. Sus diferentes represen-taciones unipartitas (metabolitos conecta-dos a travs de reacciones o reaccionesconectadas por metabolitos en comn)presentan un elevado grado de conexio-nes locales en comparacin a sus equiva-lentes aleatorias. Ahora sabemos que estasobre-representacin de conexiones entre

nodos vecinos en las proyecciones del me-tabolismo vienen de la manos del propioproceso de proyeccin. Es este trabajo seevala en que grado el sesgo afecta a lacaracterizacin del metabolismo comomundo pequeo y se trata de identificar lascausas de este comportamiento.

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Summar


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This work entitled Computational,

Dynamics and Topological Approaches to

Study Metabolism started more than 5

years ago within a biochemical and

molecular biology research group. One ofthe major objectives of the group is to

locate elements that can be considered

new and more eff icient targets for

intervention.

The massive data acquisition in this post-

genome era has given rise to an over-

accu mula tio n of hug e amou nt of

information. These data, far from the

understanding of individual researchers,

require of the use of computational

techniques but also, of new perspectives

a roadmap - where data can be

incorporated in an integrative way. Such a

view requires a molecular system to betreated as a whole and this framework is

provided from a Systemic Biology discipline.

Data integration, mathematical modeling

and experimental testing are the key point

where these emergent discipl ine is

grounded.

Biogenic amines are involved in several

physiopathological problems (mainly

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Summary

Our knowledge can only be finite, while our ignorancemust necessarily be infinite.

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cancer and inflammation). The pleiotropic

biological activities of these compounds,

acting at very different levels of the cell

physiology has inspired the turn to a new

more systemic view in our group research.

Here, where reductionistic approaches

were not enough, biogenic amines should

be understood within the framework of a

multi-scale view: from molecular structure to

cell response.

In the light of this view, this Thesis was

conceived to respond to the need of a

integrative view of our study system.However, although in most cases the

research in this work is oriented to the

understanding of biogenic amines, this

work is not restricted exclusively to this

system and a broader perspective and

more general works can be found in this

document. In this way, for the specialized

reader focused on the study of biogenic

amines, this work is a rigorous exploration

about the contribution in this field using a

systemic biology perspective; on the other

hand the systems biologist will appreciate

this system as a case study and the startingpoint for more general considerations.

This work has been possible by the

collaborative interaction with computer

science and theoretical research groups.

The final body of work is divided into 4

sections:

Chapter 1, My conception of science.

This first chapter is devoted to present the

ideas, aims and planning of our group to

advance in a more efficient way in a more

comprehensive view of biogenic aminemetabolism and their physiopathological

roles. Somehow, these reviews reflect the

state of the art in this biological topic, as

well as the hypothesis and aims of the

present project (and those of other group

member projects, too). The weight of my

contribution to these reflexions and

planning can be deduced from the order

of the authors (first/second authorship).

These references are:

Chapter 1.1 The usefulness of post-

genomics tools for characterization of the

amine cross-talk in mammalian cells [11].

Evidence is growing in favour of a

relationship between cancer and chronic

inflammation, and particularly of the role of

a polyamine and histamine metabolic

i n t e r p l a y i n v o l v e d i n t h e s e

physiopathological problems, which are

indeed highly complex biological systems.

Decodification of the complex inter- and

intra-cellular signalling mechanisms thatcontrol these effects is not an easy task,

which must be helped by systems biology

technologies, including new tools for

location and integration of database-

s tored informat ion and predict ive

mathematical models, as well as functional

genomics and other exper imental

molecular approaches necessary for

hypothesis validation. We review the state

of the art and present our latest efforts in

th i s area, focused on the amine

metabolism field.

Chapter 1.2 Polyamines: metabolism to

sys tems b io logy and beyond [4] .

Polyamines and the metabolic and

physiopathological processes in which they

are involved represent an active field of

research that has been continuously

growing since the seventies. In the last

years, the trends in the focused areas of

interest within this field since the 1970s have

been confirmed. The impact of -omics in

polyamine research remains too low in

comparison with its deep impact on other

biological research areas. These high-

throughput approaches, along with systemsbiology and, in general, more systemic and

holistic approaches should contribute to a

renewal of this research area in the near

future.

Chapter1.3 Information integration of

protein-protein interactions as essential

tools for immunomics [2]. After a brief

introduction to point out the necessity to

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advance for a global understanding of the

macromolecular interactions occurring

during the immune system development

and responses, Section 2 will be devoted to

analyze the current tools for an automatic

location of information on these protein

protein interactions in the web. In the next

section (Section 3), we will point out

diferent action lines to improve these tools

and, consequently, to increase the

eciency to establish (to understand) the

protein network skeleton that controls

our immune responses. Finally, we will briefly

present our current strategy and work to

advance towards this goal.

Chapter 2, Looking for verisimilitude in

an open world.

Papers included in this section describe

the need and the characteristics of a

semantic mediator built as the technical

support of a biocomputational platform

able to integrate information from different

international respositories of information

concerning macromolecular structures andmetabolic data. The mediator, shortly

named as AMMO, was initially applied to

develop AMMO-Prot, a tool able to locate

and to represent the 3D structure of proteins

related to amine metabolism of any

species, if they are available in Protein Data

Bank. Alternatively, the system can find a

putative template and build a first 3D

model assisted by Modeller [1]. Then,

AMMO was used to develop the Systems

Biology Metabolic Modeling Assistant, able

to locate kinetic data on enzymes,

metabolites and regulators of any enzymeof any species, and to process the data to

be understood by other biocomputational

tools of metabolic modeling and dynamic

analysis. The references of these works are:

Chapter 2.1 AMMO-Prot: amine system

project 3D-model finder [8]. Amines are

biogenic amino acid derivatives, which

play pleiotropic and very important yet

complex roles in animal physiology. For

many other re levant biomolecules,

biochemical and molecular data are being

accumulated, which need to be integrated

in order to be effective in the advance of

biological knowledge in the field. For this

purpose, a multidisciplinary group has

started an ontology-based system named

the Amine System Project (ASP) for which

amine-related information is the validation

bench.

In this paper, we describe the Ontology-

Based Mediator developed in the Amine

System Project (http://asp.uma.es) usingthe infrastructure of Semantic Directories,

and how this system has been used to solve

a case related to amine metabolism-

related protein structures.

This infrastructure is used to publish and

manage not only ontologies and their

relationships, but also metadata relating to

the resources committe d with the

ontologies. The system developed is

a v a i l a b l e a t h t t p : / / a s p . u m a . e s /

WebMediator.

Chapter 2.2 Systems biology metabolicmodeling assistant: an ontology-based tool

for the integration of metabolic data in

kinetic modeling [9]. We present Systems

Biology Metabolic Modeling Assistant

(SBMM Assistant), a tool built using an

ontology-based mediator, and designed to

facilitate metabolic modeling through the

integration of data from repositories that

contain valuable metabolic information.

This software can be used for the

visualization, design and management of

metabolic networks; selection, integration

and storage of metabolic information; andas an assistant for kinetic modeling.

SBMM Assistant for academic use is freely

available at

http://www.sbmm.uma.es.

Chapter 3 Metabolizing numbers

This section includes the two first

published works of a more ambitious and

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http://www.sbmm.uma.es/http://www.sbmm.uma.es/http://asp.uma.es/WebMediatorhttp://asp.uma.es/WebMediatorhttp://asp.uma.es/WebMediatorhttp://asp.uma.es/http://asp.uma.es/http://www.sbmm.uma.es/http://www.sbmm.uma.es/http://asp.uma.es/WebMediatorhttp://asp.uma.es/WebMediatorhttp://asp.uma.es/WebMediatorhttp://asp.uma.es/WebMediatorhttp://asp.uma.es/http://asp.uma.es/


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long-term bottom-up approach (currently

funded in our lab) to the dynamic modeling

of both amino acid metabolism and energy

metabolism with predictive capabilities and

potentially useful in different pathologies

related to proliferating cells and rare

genetic syndromes. Mathematical models

predict the behavior described by

independent and reputated international

groups. The references are:

Chapter 3.1 Mathematical Modeling of

Polyamine Metabolism in Mammals [10].

Polyamines are considered as essential

compounds in living cells, since they are

involved in cell proliferation, transcription,

and translation processes. Furthermore,

polyamine homeostasis is necessary to cell

survival, and its deregulation is involved in

relevant processes, such as cancer and

neurodegenerative disorders. Great efforts

have been made to elucidate the nature

of polyamine homeostasis, giving rise to

relevant information concerning the be-

havior of the different components of

polyamine metabolism, and a great

amount of information has been gener-

ated. However, a complex regulation at

transcriptional, translational, and metabolic

levels as well as the strong relationship be-

tween polyamines and essential cell proc-

esses make it difficult to discriminate the

role of polyamine regulation itself from the

whole cell response when an experimental

approach is given in vivo. To overcome this

limitation, a bottom-up approach to model

mathematically metabolic pathways could

allow us to elucidate the systemic behavior

from individual kinetic and molecular prop-

erties. In this paper, we propose a mathe-matical model of polyamine metabolism

from kinetic constants and both metabolite

and enzyme levels extracted from biblio-

graphic sources. This model captures the

tendencies observed in transgenic mice for

the so-called key enzymes of polyamine

metabolism, ornithine decarboxylase, S-

adenosylmethionine decarboxylase and

spermine spermidine N-acetyl transferase.

Furthermore, the model shows a relevant

role of S-adenosylmethionine and acetyl-

CoA availability in polyamine homeostasis,

which are not usually considered in sys-

temic experimental studies.

Chapter 3.2 In silico analysis of arginine

catabolism as a source of nitric oxide or

polyamines in endothelial cells [3].

We use a modeling and simulation

approach to carry out an in silico analysis of

the metabolic pathways involving arginine

as a precursor of nitric oxide or polyamines

in aorta endothelial cells. Our modelpredicts conditions of physiological steady

state, as well as the response of the system

to changes in the control parameter,

external arginine concentration. Metabolic

flux control analysis allowed us to predict

the values of flux control coefficients for all

the transporters and enzymes included in

the model. This analysis fulfills the flux control

coefficient summation theorem and shows

that both the low affinity transporter and

arginase share the control of the fluxes

through these metabolic pathways.

Chapter 4 Simple dots and lines

Papers in this section provide a view

about the application of graph theory on

the study of the organization of metabolism.

In a initial paper we analyze the impact of

the metabolic network definition in our

topological understanding of metabolism .

Since metabolism consists of reactions and

metabolites, its natural representation

agrees with a bipartite graph. However,

these networks have been commonly sim-

plified in one-mode versions through the

application of a process called projection.

We demonstrate in this work that this treat-

ment introduces a bias in the results. In par-

ticular we highlight the fact that a simple

bipartite random network is just enough! toexhibit similar topological properties such as

small-world pattern and hierarchical order

by the simple effect of projection. At this

point, a revision of the topological organi-

zation of metabolism is required. According

to this need we reproduce in a compara-

Ral Montaez Martnez

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28.0


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tive study the most fundamental topologi-

cal statistics using metabolic networks for

different species attending to their bipartite

representation. After that, we explore and

define a concept of small-world for bipar-

tite networks.!

Chapter 4.1 When metabolism meets

topology:reconciling metabolite and

reaction networks [5]

The search for a systems-level picture ofmetabolism as a web of molecular

interactions provides a paradigmatic

example of how the methods used to

characterize a system can bias the

interpretation of this functional meaning.

Metabolic maps have been analyzed using

novel techniques from network theory,

revealing some non-trivial, functionally

relevant properties. These include a small-

world structure and hierarchical modularity.

However, as discussed here, some of these

properties might actually result from an

inappropriate way of defining network

interactions. Starting from the so-calledbipartite organization of metabolism, where

the two meaningful subsets (reactions and

metabolites) are considered, most current

works use only one of the subsets by means

o f s o c a l l e d g r a p h p r o j e c t i o n s .

Unfortunately, projected graphs often

ignore relevant biological and chemical

constraints, thus leading to statistical

artifacts. Some of these drawbacks and

alternative approaches need to be

properly addressed.

Chapter 4.2 Analyzing the bipartite

structure of the metabolic network [6].

Metabolism is a natural bipartite network

that has always been treated as an one-

mode network with the focus on

compounds or reactions. Projections of

bipartite networks to obtain one-mode

versions reduce the information contents in

the system and modify topological

properties, such as density, degree and

clustering coefficient. In consequence,

some topological generalizations assumed

for metabolic networks must be reviewed in

the light of a bipartite graph analysis.

Herein, we analyze E. coli, S. cerevisiae and

H. sapiens bipartite reactions-metabolites

networks, and highl ight differences

between both graph abstractions and the

advantages of bipartite measures such as

strength or squares cliquishness, on the

bases of a biological interpretation of the

topological parameter.

Chapter 4.3 Is metabolism small-

world? [7]

Universal patterns as Small-World can

emerge as an artifactual consequence of

the inappropriate use of the methodology.

Its noteworthy that the projection of

bipartite networks increases the density of

local connections in the resulting networks.

Consequently, as we show in this work,

even completely random bipartite networks

could seem small-worlds when projected,

this contributing to consider erroneously the

small-world pattern as an universal one. In

this article, we develop an alternative

method, inspired in the fraction of cycles

with size four, to perform a correct

evaluation of the small-world characteristics

of bipartite networks, and it is applied to

metabolic networks of 11 species. The

results obtained indicate that, indeed,

metabolism maintains the small worldfeatures even when analyzed as a bipartite

network.

Bibliography

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28.0


42/174

1.! Eswar N, et al. Comparative protein structure modeling using Modeller. Curr Protoc Bioinforma-tics. 2006;Chapter 5: Unit 5 6.

2.! Montanez R, et al. Information integration of protein-protein interactions as essential tools forimmunomics. Cell Immunol. 2006;244(2): 84-86.

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2010;Manuscript.

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Hiptesisy

Objetivos


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Planteamiento general

La investigacin descrita en el presente documento responde a la necesidad de ex-plorar aquellos aspectos planteados en el prembulo que, desde un punto de vista for-mal, constituye la proposicin y contrastacin de las siguientes hiptesis:

Hiptesis 1.- La definicin adecuada de una ontologa orientada a la organizacinsemntica dentro del campo de la biologa molecular permite la integracin de lainformacin biolgica de una forma automatizada, requisito previo para el diseode plataformas informticas que gestionen y proporcionen de manera eficiente lainformacin necesaria para el desarrollo de proyectos de Biologa de Sistemas.Hiptesis 2.-La integracin de modelos matemticos de vas! metablicas basadaen una adicin progresiva de mdulos individuales! constituye una estrategia bo-ttom-up capaz de revelar nuevas propiedades emergentes del metabolismo. Estaaproximacin puede aplicarse para obtener una visin integrada del metabolismosecundario de amincidos (y derivados), generando predicciones cuantitativascontrastables experimentalmente.Hiptesis 3.- La teoria de grafos constituye una excelente aproximacin top-downal estudio del metabolismo. Sin embargo, la forma en que se defina la red metab-lica es determinante, pues una sobresimplificacin en la misma introduce artefactosen las medidas topolgicas de la red que pueden distorsionar nuestro conocimien-to acerca de la organizacin del metabolismo.!En base a estas hiptesis, se establecieron los siguientes objetivos:

Objetivo 1.- Desarrollar un mediador semntico capaz de capturar informacin so-bre propiedades de elementos metablicos, as como validar estas capacidadesdel mediador desarrollando herramientas piloto que fuesen de utilidad para losproyectos del grupo en curso, centrados fundamentalmente en problemas estruc-turales y funcionales de elementos implicados en el metabolismo de aminocidos yderivados.Objetivo 2.- Establecer las bases para la construccin de un modelo metablicointegrado del metabolismo de aminocidos y metabolismo oxidativo con capaci-dad predictiva mediante la implementacin computacional de los mdulos esen-ciales de dicho macromodelo. En concreto, crear los mdulos esenciales corres-

pondientes al catabolismo de la arginina y el metabolismo de las poliaminas.Objetivo 3.- Evaluar el efecto de la proyeccin en redes metablicas en distintasmedidas topolgicas tales como el patrn de mundo pequeo y la libertad de es-cala, as como reproducir el anlisis topolgico de redes metablicas en su versinbipartita para distintas especies.

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Hypothesis

&Goals


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General approach

This work was planned and executed on the bases of the following hypotheses:

Hypothesis 1.-!! ! Integration of biological information by semantic web technologiescan be a helpful effort for efficient advance of Systems Biology projects.

Hypothesis 2.-! ! ! Modeling of metabolic systems by integration of mathematicalmodels of single pathways (metabolic modules) can be considered a valid bottom-up strategy. This approach applied to secondary metabolism of amino acids and

their derivatives can provide a comprehensive view of the relationships among ele-

ments with potential predictive value, which can be validated and/or refined by

experimentation.

Hypothesis 3.-!! ! Graph Theory is an excellent top-down approach to study metabo-lism. However, a careful definition of metabolic network is required. Any oversimpli-

fication of this definition can introduce artifacts in the topological measurements of

the network that can affect to the quality of our knowledge on metabolic organiza-

tion.

!According to these hypotheses, the following objectives were established:

!Goal 1.-! ! ! To develop a semantic mediator able to capture information on theproperties of the metabolic elements. In order to validate the mediator capabilities,

pilot tools should be developed being useful for the current projects of our research

group. Thus, these pilot projects should solve structural and functional questions on

elements related to amino acid (and their derivatives) metabolism and physiopa-

thological conditions.

Goal 2.-! ! ! To start a long-term project on a predictive metabolic macro-model,containing elements related to both amino acid and oxidative metabolism in

mammalian tissues, with a bottom-up strategy (by sequential addition of new

modules).! Specifically, within the present Project, we wanted to start working onmodeling of arginine and polyamine-related pathways.

Goal 3.-! ! ! To evaluate the effect of the metabolic network projections on differenttopological measures, such as the small-world pattern and scale-freeness and to

reproduce the topological analysis for metabolic networks from different species in

their bipartite versions.

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Conceptos


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En este captulo, todos los trabajos, ade-ms de revisar el papel de poliaminas ehistamina [C1.1] en mltiples procesos fisio-patolgicos, la escasa repercusin de lasmicas en el campo de la poliaminas[C1.2] o la falta de estandarizacin en lasbases datos de interacciones [C1.3]),transmiten una idea. Esta idea subyacenteen todos los trabajos propugna una biolo-

ga de sistemas en la que la meta sea en-contrar las propiedades emergentes de lossistemas y comprender su origen. Hacer verque las micas, por s solas, no son otracosa que biologa molecular de alta a granescala en la que los sistemas se diseccio-nan en sus componentes individuales paraser estudiados.

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Mi concepcin de la ciencia:El punto de partida de un recorrido bottom-up hacia la Biologa de Sistemas

La supresin real de la metafsica convierte al arte y a la ciencia enptreos esqueletos sin almas, incapaces del ms mnimo progresos

Erwin Schrdinger, Mi concepcin del mundo


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Captulo 1

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Health Implications of Dietary Amines 381

The usefulness of post-genomics toolsfor characterization of the amine cross-talkin mammalian cellsF. Sanchez-Jimenez*1, R. Montanez*, F. Correa-Fiz*, P. Chaves*, C. Rodrguez-Caso*2, J.L. Urdiales*, J.F. Aldanaand M.A. Medina**Department of Molecular Biology and Biochemistry, Campus de Teatinos, University of M alaga, 29071 M alaga, and CIBER of Rare Diseases, Spain, and

Department of Computer Languages and Computer Sciences, Campus de Teatinos, University of M alaga, 29071 Malaga, Spain

AbstractEvidence is growing in favour of a relationship between cancer and chronic inflammation, and particularly ofthe role of a polyamine and histamine metabolic interplay involved in these physiopathological problems,

which are indeed highly complex biological systems. Decodification of the complex inter- and intra-cellular

signalling mechanisms that control these effects is not an easy task, which must be helped by systems

biology technologies, including new tools for location and integration of database-stored information

and predictive mathematical models, as well as functional genomics and other experimental molecular

approaches necessary for hypothesis validation. We review the state of the art and present our latest efforts

in this area, focused on the amine metabolism field.

A brief overview of amine metabolism inimmune system and cancer cellsDecarboxylation of amino acids produces biogenic amines

that play important biosignalling roles in mammalian cells.Those derived from arginine/ornithine (polyamines) are

essential for proliferation in every living cell (especially incancer and other highly proliferative cells and tissues), as ex-

plained elsewhere in this issue of Biochemical Society Trans-actions. Histamine (the product of the histidine decarboxyl-ase reaction) is mainly synthesized in immune cells (mastcells, basophils, macrophages, platelets, T-cells and dendri-tic cells), where it is considered as a proinflammatory medi-

ator [1]. Mast cells, the major producer of histamine in thehuman body, are bone-marrow-derived cells expressing avariety of phenotypic features as determined by the localenvironment. They are located in connective tissue (skin and

peritoneal cavity) and mucosa, and synthesize inflammatorymediatorsreleasedto theenvironmentin responseto differentstimuli [2].Some of thesemast cellmediatorsare accumulatedinto granules and released by exocytosis, as is the case withspecific proteinases (tryptase) and histamine. Histamine is

synthesized by HDC (histidine decarboxylase) [3]. Otherimmune cells (for instance, macrophages) produce but donot store histamine into granules. Of course, these immunecells also produce polyamines, as essential compounds for

macromolecular synthesis and cell survival. Thus they can be

Key words: cancer, histamine, inflammation, metabolic modelling, polyamine, protein

modelling.

Abbreviations used: HDC, histidine decarboxylase; ODC, ornithine decarboxylase; SAM, S-

adenosylmethione; SSAT, spermine spermidine N1-acetyltransferase.1To whom correspondence should be addressed (email [email protected]).2Present address: Complex System Lab., University Pompeu-Fabra, Barcelona, Spain.

considered as complex amine-producing and amine-handlingcell models.

Nowadays, clear relationships are being established be-tweenchronicinflammation and several typesof tumours [4].Histamine- and polyamine-producing cells are often close

in vivo (for instance, during carcinoma and/or leukaemiagrowth), and malignant forms of histamine-producing cellshave been reported (mastocytosis, basophilic leukaemias andsome types of gastric cancer, among others) [58]. Specificroles of histamine and polyamines in the cross-talk betweenmast cells and tumour cells have been reported [9]: histamine

can promote or inhibit tumour growth depending on thereceptor expressed by the target tumour cell type. In turn,polyamines and their oxidized products are related to themast cell proliferation/death equilibrium and the liberation

dynamics of mastcell granule mediatorsto the medium [9,10].Working on murine mast cell models, we have previously

observed antagonistic relationships between histamine andpolyamine metabolisms [11,12]. We also observed that mast

cells are particularly sensitive to the apoptosis inducersproduced from polyamines by serum amine oxidases [10,13].

All of these facts are particularly interesting for gut physio-logy, since diet can provide compounds (i.e. drugs, biogenicamines, enterobacterial products, etc.) affecting mast cell

proliferation/death and, consequently, mast cell roles in gutinflammatory and neoplastic diseases.

From a biochemical point of view, interferences betweenhistamine and polyamine metabolic pathways are not sur-

prising, since both types of biogenic amines share structuralproperties and common metabolic steps, as observed withpurified enzymes or animal cultured cell models (Figure 1)[14]: (i) histamine interferes with spermine transport systemsandhas a co-operativeeffect with inducers of thekey enzyme

C2007 Biochemical Society


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382 Biochemical Society Transactions (2007) Volume 35, part 2

Figure 1 Interplay between polyamine metabolism and histamine metabolism

Bl

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