Tesis en opción al título de Máster en Desarrollo de

Universidad Central "Marta Abreu" de Las Villas

FACULTAD QUÍMICA-FARMACIA

Departamento de Ciencias Farmacéuticas

Tesis en opción al título de Máster en Desarrollo de

Medicamentos de Origen Natural

Título: Composición química y estudios

farmacológicos de las hojas de tres especies de

Mirtáceas.

AUTOR: Lic. Yadira Morales Fernández

TUTOR: Dra C. María Elisa Jorge Rodríguez Dra C. Yanelis Saucedo Hernández

“Año 56 de la Revolución”

2014

Hago constar que el presente trabajo de maestría fue realizado en la Universidad

Central “Marta Abreu” de Las Villas como parte de la culminación de estudios de la

maestría en Desarrollo de Medicamentos de Origen Natural, autorizando a que el

mismo sea utilizado por la Institución, para los fines que estime conveniente, tanto de

forma parcial como total y que además no podrá ser presentado en eventos, ni

publicados sin autorización de la Universidad.

Firma del Autor

Los abajo firmantes certificamos que el presente trabajo ha sido realizado según

acuerdo de la dirección de nuestro centro y el mismo cumple con los requisitos que

debe tener un trabajo de esta envergadura referido a la temática señalada.

Firma del Autor Firma del Jefe de Departamento

donde se defiende el trabajo

Firma del Responsable de

Información Científico-Técnica

Pensamiento

Lic. Yadira Morales Fernández

“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” II

Si yo tuve la suerte de alcanzar algo, solamente se debe a que me apoyé en

hombros de gigantes.

Isaac Newton

Dedicatoria


“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” IV

Dedicatoria

Hay personas que con solo existir hacen de nuestras vidas un sendero feliz, que

iluminan tu camino con su amor y dedicación. A ellos les dedico este triunfo.

A mi mamá, por ser la luz de mi vida dedico este trabajo con mucho amor, por ser

madre, compañera y amiga, por confiar en mí y darme seguridad infinita, por

hacerme comprender que siempre se puede llegar más lejos, por enseñarme que no hay

nada imposible, solo hay que proponérselo y que para llegar al final del camino

Solamente hay que luchar.

A mi papá, por su infinita bondad, por ser mi compañero en todo momento y por

guiarme por el camino correcto.

A mis hermanos, les dedico este importante momento de mi vida, por formar

parte de mí y porque en ellos he encontrado el apoyo y la fuerza necesaria para

llevar a cabo todos mis propósitos.

A mis cinco sobrinos que adoro con el alma y que me han brindado todo el amor y el

cariño que necesito.

Agradecimientos


“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” VI

Agradecimientos A mis padres por el esfuerzo, cariño, admiración, confianza y la dedicación que han tenido

durante toda su vida, a quienes les debo mucho porque se han sacrificado, dando todo para que

yo sea la persona que soy hoy, porque con su apoyo incondicional pude seguir adelante y vencer

todos los obstáculos, pero sobre todo por haberme regalado la vida.

A mis Hermanos por la buena fe, la confianza, el apoyo inigualable que siempre me brindaron,

por darme lo que necesitaba en los momentos más oportunos de mi carrera y además por formar

parte mi vida profesional.

A mis cinco sobrinos que adoro con el alma; que me cambiaron la vida y la llenaron de alegría y

amor.

A mi novio que estuvo ahí siempre que lo necesité, dándome su apoyo en los buenos y malos momentos de mi vida y las fuerzas necesarias para lograr el triunfo final.

A mis amigos por brindarme su amistad, solidaridad, por compartir momentos buenos y malos,

por estar siempre ahí cuando los necesité, en especial a William porque más que un amigo, es mi

hermano del alma, a Yuriam por ser incondicional y, a todos en general por llenarme de alegría y

sobre todo por dejarme ocupar un espacio importante dentro de sus corazones.

A mis tutoras por su paciencia y dedicación, por trasmitirme sus conocimientos, por los

momentos de alegría y de tristeza que pasamos y por brindarme toda la ayuda incondicional

para que mi trabajo fuera un éxito.

Agradecimientos


“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” VII

A todos los profesores de la maestría que me brindaron su apoyo incondicional y tuvieron

confianza en mí.

A mi familia que fue un factor fundamental dentro del círculo de mi vida, por brindarme todo

el apoyo siempre y cuando lo que necesité para que pudiera hacer este sueño realidad.

A Urbano, Xiomara, Mario y los técnicos de laboratorio por la ayuda incondicional que me

brindaron hasta el último momento.

En fin deseo agradecer a todas aquella personas que me apoyaron incondicionalmente y no me

abandonaron, a los que me enseñaron que en la vida se lucha hasta el final por lo que uno quiere

y pusieron en mí su esperanza, su confianza, su respeto para que sea un mejor ser humano y una

mejor profesional en el futuro.

“Sentir gratitud y no expresarla es como envolver un regalo y no darlo.”

William Arthur Ward

Resumen


“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” IX

Resumen

En el presente trabajo se estudió la composición de aceites esenciales y extractos obtenidos de tres

especies de mirtáceas. El rendimiento de aceite para cada planta fue de 0,38 para el Psidium guajava L,

0,44% para la Eugenia axillaris y 1,72% para la Melaleuca leucadendrom L; mientras que el rendimientos

de extracto para cada especie fue 0,43, 1,57 y 1,43 %, en base a droga seca, respectivamente. En la

determinación de la composición química de los aceites, empleando la cromatografía gaseosa acoplada a

masa (GC-MS, siglas en inglés), se obtuvo la presencia del Cineol en las tres especies, siendo este el

componente mayoritario en las especies P. guajava y M. leucadendrom, mientras que la E. axillaris

muestra una composición compleja con una gran cantidad y variedad de compuestos . Los perfiles

cromatográficos por Cromatografía Gaseosa con detección por ionización por llama (GC-FID, siglas en

inglés) para todas las muestras evaluadas aportó que los aceites de la M. leucadendrom y el P. guajava

poseen cromatogramas muy limpios con un componente mayoritario, cuya cuantía en el aceite es muy

superior a los restantes, el 1,8 cineol; este componente está presente entre los 14 que fueron identificados

en el aceite de E. axillaris y también se encuentra en los extractos evaluados de cada planta. En el

presente trabajo se validó la GC-FID como ensayo cuantitativo para la identificación y cuantificación del

cineol presente en las muestras, la técnica fue fiable y con ella se determinó que el contenido de este

metabolito, el cual resultó ser 0.44; 0,04 y 0,37% para el aceite esencial de P. guajava, E. axillaris y la M.

leucadendrom, respectivamente y 0,56; 0,28 y 0,63% para sus extractos en el mismo orden. La evaluación

cualitativa de la actividad antimicrobiana arrojó que los extractos poseen una actividad antimicrobiana muy

superior a los aceites frente a los gérmenes positivos y negativos seleccionados y la actividad antioxidante,

realizada a través de cuatro ensayos in vitro, permitió determinar que la especie P. guajava posee esta

actividad muy superior a las otras dos especies, lo que está en total correspondencia con el contenido

fenólico de la misma que supera a las restantes.

Introducción


“Composición química y estudios farmacológicos de las hojas de tres especies de Mirtáceas” 1

Índice

Introducción. ................................................................................................ ¡Error! Marcador no definido. Capítulo 1: Revisión Bibliográfica. ............................................................. ¡Error! Marcador no definido. 1.1. Consideraciones generales sobre plantas medicinales y aromáticas. . ¡Error! Marcador no definido. 1.2. Estudios realizados en el campo farmacéutico de las plantas estudiadas en el presente trabajo. ¡Error! Marcador no definido. 1.2.1. Psidium Guajava L. ............................................................................ ¡Error! Marcador no definido. 1.2.1.1. Usos tradicionales de la planta. ............................................ ¡Error! Marcador no definido. 1.2.1.2. Estudios fitoquímicos y analíticos de la planta. ..................... ¡Error! Marcador no definido.

1.2.1.3. Propiedades farmacológicas y toxicológicas ......................... ¡Error! Marcador no definido. 1.2.2. Eugenia axillaris (Sw.) Willd. ............................................................... ¡Error! Marcador no definido. 1.2.2.1. Usos tradicionales de la planta. ............................................ ¡Error! Marcador no definido.

1.2.2.2. Estudios fitoquímicos y analíticos de la planta. ....................... ¡Error! Marcador no definido. 1.2.3. Melaleuca leucadendrom L. .................................................... ¡Error! Marcador no definido.

1.2.3.1. Usos tradicionales de la planta. ........................................... ¡Error! Marcador no definido. 1.2.3.2. Estudios fitoquímicos y farmacológicos reportados de la planta.¡Error! Marcador no

definido. 1.3. Generalidades en la obtención y composición de aceites esenciales y extractos.¡Error! Marcador no definido. 1.3.1. Extractos. Obtención. .............................................................. ¡Error! Marcador no definido.

1.3.2. Aceites esenciales. Obtención. ................................................ ¡Error! Marcador no definido. 1.3.3. Análisis de componentes volátiles presentes en aceites esenciales y extractos de plantas. Cromatografía gaseosa. ................................................................................ ¡Error! Marcador no definido. 1.4. Validación de los métodos analíticos. Determinación de los parámetros de desempeño. .......... ¡Error! Marcador no definido. 1.4.1. Linealidad .............................................................................. ¡Error! Marcador no definido.

1.4.2. Precisión. ............................................................................... ¡Error! Marcador no definido. 1.4.3. Especificidad. ......................................................................... ¡Error! Marcador no definido.

1.4.4. Exactitud. ............................................................................... ¡Error! Marcador no definido.

1.4.5. Límite de detección y cuantificación. ........................................ ¡Error! Marcador no definido. 1.5. Evaluación de la actividad antioxidante en productos naturales. ......... ¡Error! Marcador no definido. 1.5.1. Mecanismos de acción de los antioxidantes y métodos para determinar la actividad antioxidante.

.......................................................................................... ¡Error! Marcador no definido. 1.6. Evaluación de la actividad antimicrobiana en productos naturales. ..... ¡Error! Marcador no definido. 1.6.1. Métodos para evaluar la actividad antimicrobiana. Ejemplos....... ¡Error! Marcador no definido. 1.7. Consideraciones finales del estudio bibliográfico. ............................... ¡Error! Marcador no definido. Capítulo 2: Materiales y Métodos ............................................................... ¡Error! Marcador no definido. 2.1. Material vegetal, equipos y reactivos químicos. ...................................... ¡Error! Marcador no definido. 2.2. Metodología de obtención del aceite esencial y de los extractos a partir de las hojas de las tres

especies. ............................................................................ ¡Error! Marcador no definido. 2.2.1. Obtención del aceite esencial. ................................................. ¡Error! Marcador no definido. 2.2.2. Obtención de los extractos ..................................................... ¡Error! Marcador no definido.

Introducción



2.3. Determinación del rendimiento de aceite esencial y de extracto obtenido de cada especie estudiada. ...................................................................................................... ¡Error! Marcador no definido. 2.4. Determinación de la composición de los aceites esenciales y los extractos de las tres especies de

Mirtáceas estudiadas. .......................................................... ¡Error! Marcador no definido. 2.4.1. Determinación cuantitativa de Cineol en los aceites y extractos de las tres especies. ........... ¡Error!

Marcador no definido. 2.4.1.1. Desarrollo del método. ......................................................... ¡Error! Marcador no definido. 2.4.1.2. Validación del método. ......................................................... ¡Error! Marcador no definido. 2.4.2. Determinación del contenido de cineol presente en cada aceite estudiado.¡Error! Marcador no

definido. 2.5. Determinación de la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales y los extractos obtenidos de las

tres especies de Mirtáceas estudiadas. .................................. ¡Error! Marcador no definido.

2.6. Resultados de la evaluación de la actividad antioxidante de los extractos obtenidos de las tres especies de Mirtáceas estudiadas.

2.6.1. Actividad secuestradora del radical libre DPPH. ........................ ¡Error! Marcador no definido.

2.6.2. Fuerza reductora .................................................................... ¡Error! Marcador no definido. 2.6.3. Actividad antioxidante por el método tiocianato férrico. .............. ¡Error! Marcador no definido. 2.6.4. Capacidad antioxidante total (TAOC)........................................ ¡Error! Marcador no definido.

2.6.5. Determinación del poder reductor\antioxidante férrico (FRAP) .... ¡Error! Marcador no definido. 2.7. Determinación del contenido total de compuestos fenólicos. ........ ¡Error! Marcador no definido. Capítulo 3: Resultados y Discusión. .......................................................... ¡Error! Marcador no definido. 3.1. Resultados del rendimiento de aceite esencial y de extracto obtenido de cada especie estudiada. ¡Error! Marcador no definido. 3.2. Resultados obtenidos en la determinación de componentes volátiles presentes en los aceites esenciales y extractos obtenidos de las hojas de las tres especies de Mirtáceas estudiadas. ............. ¡Error! Marcador no definido. 3.2.1. Composición de los aceites esenciales. .................................... ¡Error! Marcador no definido. 3.2.2. Perfil cromatográfico de los aceites esenciales y extractos por GC-FID. Identificación de

componentes con el uso de patrones. .................................... ¡Error! Marcador no definido.

3.2.2.1. Perfil cromatográfico de los aceites esenciales. ...................... ¡Error! Marcador no definido. 3.2.2.2. Perfil cromatográfico de los extractos. ................................... ¡Error! Marcador no definido. 3.3. Determinación cuantitativa del contenido de cineol en los aceites esenciales y extractos obtenidos de las tres especies estudiadas. ......................................................................... ¡Error! Marcador no definido. 3.3.1. Validación de la técnica cromatográfica (GC-FID) para la determinación de 1,8-Cineol. ........ ¡Error!

Marcador no definido. 3.3.2. Aplicación de la técnica validada a la determinación de cineol presente en los aceites y extractos

obtenidos de las especies de mirtáceas estudiadas en el presente trabajo.¡Error! Marcador no

definido. 3.4. Determinación de la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales y los extractos obtenidos de las tres especies de Mirtáceas estudiadas. ......................................................... ¡Error! Marcador no definido. 3.5. Resultados de la evaluación de la actividad antioxidante de los extractos obtenidos de las tres especies de Mirtáceas estudiadas. ................................................................ ¡Error! Marcador no definido. 3.5.1. Cuantificación de los compuestos fenólicos – método de Folin-Ciocalteu.¡Error! Marcador no

definido.

Introducción



3.5.2. Actividad secuestradora del radical libre DPPH. ........................ ¡Error! Marcador no definido. 3.5.3. Fuerza reducida. .................................................................... ¡Error! Marcador no definido. 3.5.4. Determinación del poder reductor\antioxidante férrico (FRAP) .... ¡Error! Marcador no definido.

3.5.5. Capacidad antioxidante total. ................................................... ¡Error! Marcador no definido. 3.5.6. Relación entre el contenido fenólico total con la actividad antioxidante evaluada en el presente

trabajo, a través de diferentes ensayos. ................................. ¡Error! Marcador no definido. Conclusiones ................................................................................................. ¡Error! Marcador no definido. Recomendaciones ......................................................................................... ¡Error! Marcador no definido. Bibliografía ................................................................................................................................................... 24

Introducción



Introducción.

Las plantas han sido usadas como fuente de medicina a través de la historia y continúan siendo la base de

muchos fármacos empleados actualmente, contienen una gran cantidad de compuestos bioactivos como

lípidos, fitoquímicos, saborizantes, fragancias y pigmentos. Los problemas de salud y la difícil consecución

de medicamentos comerciales, han llevado nuevamente a la búsqueda de la medicina tradicional a través

del uso y manejo de las plantas. Lo anterior justifica que hoy, las grandes industrias farmacéuticas a nivel

mundial dependen en gran medida de las plantas medicinales, numerosos medicamentos modernos

provienen de plantas utilizadas desde hace siglos. Además ellas cumplen todavía un rol primordial en la

atención primaria de la salud en las comunidades rurales que viven con un bajo acceso a la salud

(Estomba y col., 2006).

La Organización Mundial de la Salud estructuró en 1985 un

Programa de Medicina Tradicional Herbolaria, reconociendo la

existencia de 119 sustancias químicas de origen vegetal que

pueden considerarse fármacos importantes, útiles en más de 60

categorías terapéuticas y obtenidas principalmente de

91 especies. Aún hoy día, esta organización mundial

considera que la atención primaria de la salud de

cerca del 80 % de los habitantes del mundo se realiza

con plantas salutíferas, o con los principios extraídos de ellas.

Introducción



Ello se justifica en la probada eficacia y ausencia de efectos secundarios de las fitomedicinas bien

empleadas, aunadas a las graves condiciones socioeconómicas de franjas cada vez mayores de la

humanidad, que impiden el acceso al medicamento industrializado. Así, los fitomedicamentos están

tomando una importancia cada vez mayor para la atención de la salud humana, tanto sea por su probada

efectividad como por sus escasos efectos colaterales. Se agrega a esto los graves problemas económicos

por los que atraviesan grandes sectores de la humanidad en general, que impide el acceso a

medicamentos industrializados. Las plantas medicinales, que han sido empleadas desde la más remota

antigüedad, han resultado una fuente casi inagotable de sustancias activas para combatir las

enfermedades. A través de la investigación multidisciplinaria llevada a cabo por botánicos, etnobotánicos,

farmacognostas, farmacólogos, etc. ha podido ser recabado, sistematizado y contrastado un gran caudal

de conocimientos empíricos, el que llega hoy a la comunidad a través de productos naturales genuinos, o

modificados por semisíntesis o síntesis mediante una avanzada tecnología farmacéutica (Carballo y col.,

2005).

Nuestro país presenta una riqueza y mega diversidad de plantas nativas, es uno de los pilares de la

etnofarmacología y la medicina tradicional, desde la época del Incario hasta la actualidad. Siendo estas

utilizadas en forma empírica por sus bondades terapéuticas en el cuidado y restauración de la salud, de

forma similar a lo que ocurre en la mayoría de los países, las plantas medicinales se encuentran incluidas

en la categoría de medicamentos. Asimismo, el Ministerio de Salud tiene establecido un Programa de

Investigaciones de Medicina Tradicional, que fue aprobado en 1991, para estudiar las plantas medicinales

más utilizadas por la población y evaluar con métodos científicos actuales sus efectos farmacológicos y

tóxicos. Permitiendo incorporar a la llamada medicina moderna los medios medicinales tradicionales con

verdadera efectividad, ganando prestigio en la práctica médica actual (González., 2007). Lo anterior

justifica que, se hace necesario hacer llegar a la sociedad la idea de que todo fitopreparado, empleado con

fines terapéuticos (preventivo, curativo, sintomático), es un medicamento al que hay que exigir el

cumplimiento de los parámetros de: calidad, seguridad y eficacia. Su uso racional (indicaciones,

dosificación, posología, consejo sanitario), conjuntamente con los controles preestablecidos en cuanto a

calidad y seguridad, son los factores determinantes de la eficacia terapéutica en los preparados

elaborados a partir de plantas (Navarro C., 2000).

Dentro de las plantas aromáticas que crecen silvestres en Cuba se encuentra la Melaleuca leucadendrom

L. (Cayeput), Psidium guajava L. (Guayaba) y la Eugenia axillaris (Sw.) Willd. (Clavo), tres mirtáceas que

Introducción



son usadas tradicionalmente por su acción antimicrobiana. El Cayeput y la Guayaba se encuentra

insertado en el programa de medicina natural y tradicional del Ministerio de Salud Pública siendo

recomendado el uso de extractos alcohólicos, que se produce en todos los laboratorios de fitofármacos del

país y se expenden por su uso como antisépticos (Formulario Nacional Fitofármacos y Apifármacos,

2010), mientras que la Eugenia tiene demostrada su acción antimicrobiana (Setzer., 2006)

Teniendo en cuenta el efecto terapéutico propuesto y la poca información de estas plantas en la literatura,

el presente trabajo se propone estudiar el aceite esencial y extractos obtenidos de las hojas de estas

especies de la familia Mirtáceas, constituyendo, por tanto, el problema científico del presente trabajo que

las especies de la familia Mirtáceas han demostrado tener potencialidad farmacológica, fundamentalmente

como antimicrobianos, sin embargo, son escasos los estudios fitoquímicos y farmacológicos que permitan

fundamentar científicamente su posible introducción en la terapéutica y establecer su calidad para ser

registradas como drogas vegetales.

Teniendo en cuenta el problema planteado se propone para resolver el mismo la siguiente hipótesis: Si

se realizan estudios que permitan conocer la composición y evaluar acciones farmacológicas de aceites

esenciales y extractos de estas especies se realizará un aporte importante a la información necesaria

para proponer su uso en la industria farmacéutica, alimentaria o cosmética. Para fundamentar dicha

hipótesis se plantea el siguiente objetivo general:

Evaluar la composición química y la actividad farmacológica de los aceites esenciales y extractos

obtenidos de las hojas de tres especies de mirtáceas (Psidium guajava L., Eugenia axillaris (Sw.) Willd. y

Melaleuca leucadendrom L.).

Para ello se trazaron los siguientes objetivos específicos:

Determinar el rendimiento de aceites esenciales y extractos obtenidos de las hojas de Psidium guajava

L., Eugenia axillaris (Sw) Willd. y Melaleuca leucadendrom L.

Identificar y cuantificar componentes mayoritarios presentes en los aceites esenciales y extractos

obtenidos de las tres especies mediante Cromatografía de Gases (GC-FID, por sus siglas en inglés.)

Evaluar la actividad antimicrobiana de los aceites y de los extractos obtenidos de las tres especies a

través de métodos in vitro.

Evaluar la actividad antioxidante de los extractos obtenidos de las tres especies estudiadas, empleando métodos in vitro.

Introducción



Capítulo 1: Revisión Bibliográfica



Capítulo 1: Revisión Bibliográfica.

1.1. Consideraciones generales sobre plantas medicinales y aromáticas.

Las plantas medicinales son todas aquellas plantas que contienen, en alguno de sus órganos, principios

activos, los cuales, administrados en dosis suficientes, producen efectos curativos en las enfermedades de

los hombres y de los animales en general. Se calcula en unas, 260,000 especies de plantas que se

conocen en la actualidad, de las que el 10% se pueden considerar medicinales, es decir se encuentran

recogidas en tratados médicos de fitoterapia modernos y de épocas pasadas, por presentar algún uso.

Evidentemente, sobre todo en las regiones ecuatoriales, la proporción de especies medicinales puede

variar sensiblemente de este porcentaje, ya que ni siquiera se conoce la totalidad de la flora (Navarro.,

2000).

El uso de las plantas en medicina tiene una historia honorable, ya que en determinados momentos todos

los medicamentos se obtenían de fuentes naturales. Los primeros herbolarios datan de la época de los

asirios, los babilonios y los fenicios y constituyen una recopilación de los conocimientos de la época sobre

las propiedades curativas de las plantas, comenzando así la historia de la fitoterapia (Carballo y col.,

2005). En 1948 se imprimió la primera farmacopea, y la Botánica, que hasta aquel momento había sido

patrimonio exclusivo de médicos, boticarios y yerbateros, empieza a estudiarse de forma racional, ayudada

por los grabados en madera que se realizan de las plantas. El primer gran libro sobre las propiedades

medicinales de las plantas es “De materia médica”, en el año 50 a. C. y que aún hoy, se s igue

consultando. Posteriormente en el siglo XI, los monasterios tomaron el relevo convirtiéndose en grandes

botánicos. A finales del siglo XIX principios del siglo XX, debido al gran avance de la ciencia, se comenzó

a aislar y a sintetizar en el laboratorio los principios activos, surgiendo entonces fármacos de síntesis, en

detrimento de los remedios naturales (Font y col., 1983).

La gran variedad de principios activos, que están asociadas a los procesos vitales básicos en las plantas, y

los metabolitos secundarios presentes participan activamente en el ajuste del vegetal a las condiciones

ambientales así como con la interrelación con parásitos y simbiontes. Para el ser humano, los metabolitos

secundarios, especialmente aquellos de origen vegetal, poseen diversas aplicaciones siendo utilizadas en

salud, alimentación, perfumería e higiene personal. En las últimas décadas puede observarse como

tendencia mundial, un aumento del consumo de plantas medicinales, tanto en los países industrializados




como los del tercer mundo. Se estima que alrededor del 80 % de la población mundial, aproximadamente

unos cuatro mil millones de personas, recurre a la medicina tradicional herbolaria para la atención primaria

de la salud. En Asia, millones de personas mantienen su salud a través del uso de hojas, raíces y cortezas

de árboles. De hecho el 25 % de las medicinas prescritas por los médicos europeos y estadounidenses se

derivan de plantas existentes en los bosques. Según reconocidos investigadores, prácticamente todas

esas plantas se han descubierto gracias a la información derivada de su uso en medicina tradicional

(Boletín de Plantas Medicinales y Aromáticas., 2002).

Entre las plantas medicinales, las aromáticas ocupan un lugar muy especial por el contenido sobresaliente

de aceites esenciales que las distingue y representan una amplia variedad de especies, constituyendo las

más estudiadas en la actualidad, ya sean sus extractos o los propios aceites esenciales. Como grupo son

especies valoradas por sus aromas y sabores característicos así como por sus propiedades medicinales;

representan alrededor de un 0,7% del total de las plantas medicinales. El comercio de los aceites

esenciales mantiene un crecimiento sostenido debido a su aplicación en diversas industrias como:

cosmética, farmacéutica, alimenticia, de productos de limpieza, plaguicidas, entre otras (Davies., 2004).

No siempre es válido suponer que una planta aromática es simplemente aquella que genera un olor o

sabor particular, sea este agradable o no. En esta caracterización deben plantearse muchas veces

excepciones. Una planta puede carecer de olor típico en condiciones naturales, pero puede generar una

esencia de gran valor si se le procesa adecuadamente. Tal es el caso del pachulí (Pogostemon patchouli),

cuyas hojas es necesario fermentarlas para lograr el aceite esencial tan afamado. También debe tenerse

en cuenta que no necesariamente todo producto aromático debe tener características organolépticas

agradables, sea por su olor o su sabor (Bandoni., 2000).

Según (Lawrence., 1995), fueron encontradas en el mundo, alrededor de 17 500 plantas aromáticas

donde las familias Mirtáceas, Lauráceas, Rutáceas, Verbenácea, Zingiberáceas y Piperáceas, representan

las plantas con mayor contenido de esencias. Sin embargo, el universo de las plantas aromáticas es

muchísimo mayor, si se considera su origen biológico y su significación comercial. La variabilidad genética

de las plantas es una de sus más valiosas virtudes, al aportar una casi infinita riqueza de posibilidades. La

naturaleza expresa con esto una libertad de creación aún no igualada por la imaginación del hombre. A

esta variabilidad deben sumarse factores ecológicos, culturales, metodológicos agrícolas e industriales,

que relativizan casi cualquier intención de querer acortar en un número la cantidad de plantas aromáticas.




1.2. Estudios realizados en el campo farmacéutico de las plantas estudiadas en el presente trabajo.

1.2.1. Psidium Guajava L.

Según Roig., (1974), la guayaba como se le conoce popularmente en Cuba, tiene como nombre científico

Psidium guajava Lin y pertenece a la Familia Mirtáceas. Es un arbusto que crece silvestre en toda Cuba.

Como parte de su descripción botánica se presenta como un arbusto, a veces de siete metros de altura; el

tronco hasta de dos decímetros de diámetro; las ramillas pubescentes.

1.2.1.1. Usos tradicionales de la planta.

Roig describe que las partes empleadas de Psidium guayaba L. son las hojas, los frutos y la corteza. En

Cuba usan las hojas, en baños, como astringente en la cura de lesiones de la piel, la decocción de las

hojas en las diarreas, como remedio para la sarna y una decocción de la corteza es astringente, se aplica

a las úlceras y se toma internamente para los dolores de estómago. La raíces, hojas, corteza y frutos,

especialmente verdes, son muy astringentes (Roig., 1974).

El Formulario Nacional Fitofármacos y Apifármacos, (2010), refiere el uso de la planta con las partes

utilizadas en dos formas farmacéuticas: Talco de guayaba de acción fungicida, tópica y la Tintura al 20%

de acción Antidiarreica. En Cuba le es reconocida oficialmente esta acción por el Ministerio de Salud

Pública. En su composición tiene Flavonoides (quercetina, guyaverina), taninos hidrolizables, aceite

esencial (cariofileno, óxido de cariofileno, beta-bisaboleno, aromadendreno, beta-selineno, alfa-pineno,

1,8-cineol, selin-11-en-4-alfa-ol), triterpenoides, ácido oleánico, ácido ursólico, ácido crataególico, ácido

guayavólico, beta-sitosterol.

Según Vademecum de prescripción de plantas medicinales (Vanacloxta., 2003) esta planta, en

decocción o infusión de las hojas, se le atribuyen propiedades antibióticas, antifúngicas cicatrizantes y

para curar la dermatitis seborreica. Se usa para tratar diarreas, disentería y dolores de estómago. Sus

frutos son antiescorbúticos, debido a su riqueza en vitamina C (ácido ascórbico).

1.2.1.2. Estudios fitoquímicos y analíticos de la planta.

Los estudios fitoquímicos de la planta se iniciaron en el año 1985, en el cual Idstein H, y col identificaron

la presencia de ácidos volátiles en frutas tropicales entre las cuales se encontraba la guayaba (Idstein y

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Idstein+H%22%5BAuthor%5D




col., 1985). En la década 90 fueron caracterizados varios flavonoles, derivados de la quercetina, presentes

en un extracto metabólico de las hojas de la guayaba y se relacionaron estos con la acción

antiespasmódica (Lozoya y col., 1994).

Posteriormente en el aceite esencial de las hojas de guayaba fueron analizados cualitativa y

cuantitativamente por Cromatografía de Gases- Espectrometría de masa (CG-MS) 60 compuestos que

representaban una proporción de 90.56% (Li y col., 1999). En este mismo año en Brazil se aislaron 60

caratenoides de guayabas frescas coloradas (Mercadante y col., 1999).

Entre los componentes químicos de la guayaba se encuentra la vitamina C, muy abundante en los frutos,

mientras que en las hojas hay flavonoides como quercetina, aviculatina y guaijaverina a los que se les

atribuye el efecto antimicrobiano (Martínez y col., 2001) y en las hojas un grupo de investigadores

pakistanies han aislado y caracterizado por métodos espectroscópicos diferentes triterpenoides (Begun y

col., 2002 a; Begun y col., 2002 b Begun y col., 2002c).

De la fruta de guayaba se aislaron compuestos volátiles, se realizó una extración mediante un proceso de

destilación a vapor utilizando solventes de acuerdo con el método de Likens-Nickerson y caracterizado por

Cromatografía de Gases (GC), la cantidad de ésteres alifáticos y compuestos terpenicos contribuían al

único sabor de la fruta (Pino y col., 2002). Un estudio realizado en el zumo congelado y fresco de

guayaba se cuantificó la vitamina C determinado por el método directo de titración con yodo. Después de

ocho semanas las muestras deshidratadas por congelación contenían solo rastros de vitamina C, esto se

comprobó mediante la técnica de Cromatografía en Capa Delgada (CCD) (Suntornsuk y col., 2002).

En el año 2003 dos investigaciones marcan la continuidad de los trabajos de investigación de la planta.

(Masuda y col., 2003) aislaron e identificaron, con la ayuda de la Cromatografía Líquida de Alta

Eficacia(CLAE) un poderoso compuesto antiradical en los extractos de tres plantas con actividad

antioxidante entre las cuales se encontraba la Psidium guajava L., mientras que Jordan y col.

caracterizaron y cuantificaron un total de 51 componentes por Cromatografia de Gases y Espectrometría

de Masa (CG- MS, siglas en inglés) en el aceite esencial y el puré de la fruta fresca de la guayaba. El

aceite esencial comercial fue caracterizada por presentar un perfil vólatil rico en los componentes de bajo

peso molecular sobre todo alcoholes, aldehídos y ésteres considerando que en el puré fresco de la fruta

estaba más abundante los hidrocarburos terpenicos y la 3-hidroxi-2-butanona (Jordan y col., 2003).

Posteriormente las hojas molidas de guayaba se usaron para la realización de una extracción acuosa y

otra alcohólica al 50% (1:100) obteniendo compuestos fenólicos por una determinación




espectrofotométrica de acuerdo con el método de Folin-Ciocalteu y calculado como ácido gálico

equivalente (Qian y col., 2004), mientras que el equipo pakistani, citado anteriormente, aisló de las hojas

de Psidium guajava L. cinco constituyentes incluyendo un nuevo triterpenoide pentacíclico (ácido

guajanoico) y cuatro compuestos conocidos (beta –sitosterol, uvaol,ácido oleanólico y ácido ursólico),

determinándose por Resonancia Magnética Nuclear (RMN) las transformaciones químicas del nuevo

compuesto (Begun y col., 2004 ).

(Liang y col., 2005) identificaron en el extracto alcohólico de las hojas de Psidium guajava L. dos

compuestos fenólicos conocidos y cinco recientemente informados usando CLAE con detección

espectrofotométrica. Se obtuvo información estructural de los compuestos en los espectros UV y de masa

sin la necesidad de aislar los compuestos individuales.

1.2.1.3. Propiedades farmacológicas y toxicológicas

Los primeros reportes de la planta, de interés farmacéutico, aparecen en la década del 80, en los cuales

investigadores de Taiwan estudiaron el efecto antidiabético de la misma y como resultado concluyeron

que puede ser utilizada para mejorar y prevenir la Diabetes Mellitus (Cheng y col., 1983). La actividad

más estudiada para esta planta ha resultado ser su acción antidiarreica y la acción antibacteriana

relacionada con esta. En la década del 90 aparecen varios trabajos que se realizan para demostrar

diversas acciones relacionadas con esta. (Cáceres y coL., 1993) comprobaron la efectividad de un

extracto etanólico de la guayaba in vitro frente a diferentes desórdenes gastrointestinales causados por

diferentes tipos de bacterias entero patógenas (Escherichia coli, Salmonella enteritidis y Shigella flexneri),

mientras que (Morales y col., 1994) evaluaron las propiedades antidiarreicas de los extractos acuosos y

metanólicos y el efecto espasmolítico de las hojas de Psidium guajava se le atribuyeron a la quercetina

flavonoide presente en ella debido a que produce relajación de la musculatura lisa intestinal. Por su parte

investigadores Mexicanos probaron in vitro la efectividad de 14 extractos de plantas incluidas dentro de

ellas la guayaba frente a la giardia y solo 9 mostraron ser efectiva a este parásito (Ponce- Macotela y

col., 1994), mientras que (Almeida y col., 1995) realizaron un estudio en animales infectados con

agentes enteropatogénos que mostró la efectividad de extractos acuosos de la planta debido a su efecto

antidiarreico.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Caceres+A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Morales+MA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Ponce%2DMacotela+M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Almeida+CE%22%5BAuthor%5D




En África del Sur extractos crudos de 21 plantas medicinales se han usado tradicionalmente con actividad

antibacteriana. La actividad más alta fue exhibida por los extractos metanólicos de Psidium guajava L.

frente a las bacterias Gram-positivas (Rabe y col., 1997); mientras que en el Congo esta planta formó

parte de una lista de 45 extractos de plantas usadas como antidiarreicos que mostraron que 35 (77,78%)

tenían actividad antiparasitaria (Tona L y col., 1998) y un año más tarde se demostró que eran agentes

antidiarreicos, mostrando actividad antibacteriana, antiparasitaria y antiespasmódica (Tona y col., 1999).

Posteriormente estos autores demostraron que ambas actividades biológicas estaban dadas por la

presencia de polifenoles en los fragmentos de estos. (Tona y col., 2000).

En España (Vieira y col., 2001) estudiaron los extractos de brote de guayaba diluidos al 50% en etanol,

los cuales inhibieron eficazmente el crecimiento de E. coli, mientras aquellos al 50% en acetona fueron

menos eficaces. Concluyeron que los extractos de brote de guayaba constituyen una opción del

tratamiento factible para diarrea causada por E. coli o por las toxinas aureus producidas.

La actividad antidiarreica, asociada directamente a la actividad antibacteriana, ha constituido objeto de

investigación de múltiples trabajos publicados en la pasada década. En el año 2002 se comprobó que la

corteza, fruto y hojas de la guayaba poseen actividad antibacteriana, hipoglicemiante, antinflamatoria,

analgésica, antipirética, espasmolítica y depresora del SNC (Begun y col., 2002 b). También se

demostró que los extractos acuosos y metanólicos de la corteza poseen actividad antibacteriana

(Abdelrahim y col., 2002); Holetz y col., (2002); Lozoya y col., (2002) y se empleó en la medicina del

sur de África por su actividad antimalárica (Nundkumar y col., 2002).

Un estudio para establecer el mecanismo de acción antidiarreico del extracto de guayaba mostró que la

quercetina inhibió la concentración in vitro del íleon de cobayo y la movilidad peristáltica del intestino

delgado de ratón; así como redujo la permeabilidad de los capilares abdominales (Zhang y col., 2003),

mientras que investigadores japoneses evaluaron el efecto cardioprotector del extracto de Psidium guajava

L. frente lesiones isquémicas-reperfusión en corazones de ratas aislados, quercetina y ácido gálico

también ejercieron efectos beneficiosos similares (Yamashiro y col., 2003).

Estos estudios antimicrobianos, iniciados en la década del 80, continúan hasta nuestros días, los trabajos

que se relacionan a continuación dan fe de esta afirmación: Varios investigadores estudiaron el efecto

inhibitorio in vitro del extracto de hojas de Psidium guajava L. y Juglans regia frente al desarrollo de

microorganismos aislados en lesiones de la acné de diferentes jóvenes concluyendo que los extractos son

beneficiosos en el tratamiento de ellas por sus propiedades antiinflamatorias (Qadan y col., 2005). Se

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Rabe+T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Tona+L%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Vieira+RH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Abdelrahim+SI%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Holetz+FB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Nundkumar+N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Yamashiro+S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Qadan+F%22%5BAuthor%5D




evaluó el extracto metanólico con actividad antimicrobiana frente a diferentes microorganismos, tales como

stafilococus aureus, Eschericha Coli, Pseudomonas aeruginosa, proteus sp y Shigella sp usando el

método de difusión. (Chah y col., 2006). Investigadores en Brasil verificaron el sinergismo entre 13 drogas

intimicrobianas y 8 extractos de plantas, incluido entre los extractos al Psidium guajava L., frente a

enfermedades producidas por Stafilococus aureus, (Betoni y col., 2006) y en un estudio realizado en la

India se demostró que uno de los flavonoides activos aislado de la guayaba (guaijaverina) inhibió el

crecimiento de estreptococus mutans resultando ser bacteriostático (Prabu y col., 2006).

Otra actividad farmacológica evaluada en la planta es la actividad antioxidante. En Madrid España

realizaron un estudio con la fruta de guayaba y los resultados indicaron que podría ser una fuente

conveniente de antioxidantes naturales (Jiménez-Escrig y col., 2001); mientras que en China se evaluó el

extracto liofilizado de las hojas de la guayaba y el estudio reveló que el mismo contiene un principio activo

potencial, efectivo de antioxidantes naturales. Además se demostró que el ácido asçórbico fue

sustancialmente un poderoso antioxidante, esta actividad fue determinada a temperatura ambiente con

detección colorimétrica y evaluada por la disminución en la absorbancia (Qian y col., 2004). Estos

estudios fueron continuados en los EEUU donde correlacionó con la vitamina C, y los fenólicos totales y se

demostró que no tenía relación con los beta-caroteno (Thaipong y col., 2005).

La planta ha sido sometida a varios estudios toxicológicos que han permitido dar garantía de su uso en la

terapéutica, así como una evaluación genotóxica de los extractos. Los resultados toxicológicos no

arrojaron muertes en ninguno de los 2 modelos experimentales y los resultados histológicos no sugieren

daños atribuibles a toxicidad del material vegetal probado. En el estudio in vitro con Aspergillus nidulans D-

30, los resultados demuestran la ausencia de efecto genotóxico de estos extractos, así como en el sistema

de inducción de micro-núcleos en médula ósea de ratón. Estos estudios farmacológicos preclínicos han

demostrado su efecto antimicrobiano sobre patógenos gastrointestinales que incluye un efecto

antigiardiásico, contra diferentes gérmenes Gram positivo y negativo y otros microorganismos como los

dermatofitos. Existen reportes en la literatura del efecto antimutagénico en el sistema de ensayos de

Salmonella typhimurium aunque son escasos los estudios toxicológicos publicados (Martínez y col., 2001;

Echemendia y col., 2004).

.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Betoni+JE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Prabu+GR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Jimenez%2DEscrig+A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Qian+H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Thaipong+K%22%5BAuthor%5D




1.2.2. Eugenia axillaris (Sw.) Willd.

La Eugenia axillaris (Sw.) Willd pertenece a la familia Myrtaceae, género Eugenia (clavo). Se desarrolla

creciendo en alturas y desarrolla un tronco deshojado, que lleva una densa copa. Esta planta en invierno

asume una coloración verde blanco; es de talla grande y puede alcanzar los 19 m de grandeza. Mantiene

las hojas en invierno. Esta planta tiene el desarrollo de un árbol, necesita al menos de algunas horas de

luz solar, soporta también las temperaturas rígidas, entonces se puede cultivar al abierto sin temer las

bajas temperaturas. Durante el invierno, las plantas jóvenes, pueden necesitar de una ligera protección del

viento o del frío (Fitomed., 1991).


El aceite de clavo se emplea en jabones de tocador y cosméticos y en aplicaciones dentales. El clavo de

olor es una especie aromática que forma parte de la composición de muchos compuestos que actúan

sobre el aparato digestivo, ejerce un discreto efecto antivomitivo. En uso externo, es un antiséptico y

desinfectante con un poder analgésico bastante efectivo, esta es una de las razones por la cual el clavo de

olor es tan utilizada por los dentistas en el tratamiento de las caries dentales, pulpitis o dolores de dientes

y muelas.

1.2.2.2. Estudios fitoquímicos y analíticos de la planta.

Los estudios publicados de esta planta son escasos, habiéndose encontrado en la literatura consultada

solo dos reportes relacionados con la presencia del aceite esencial en sus hojas. El primero incluye los

estudios realizados en Cuba donde se analizó la composición química del aceite obtenido de las hojas de

esta planta empleando la GC-MS y se obtuvo que los componentes mayoritarios eran el guajol (35.4%)

and germacreno D (12.1%). (Pino., 2003). Posteriormente (Schmidt y col., 2006), estudiaron el aceite

esencial de las hojas de la Eugenia axillaris que crece en las Bahamas y obtuvieron que el mismo posee

una variada composición siendo sus componentes mayoritarios el β-pineno (15.5%), dihidroagarofurano

(9.2%), β-cariofileno (8.8%), β-humuleo (6.9%), 1,8-cineol (6.6%), and germacreno D (6.2%). Estos

componentes contribuyen a su apreciable acción antimicrobiana y citotóxica.




1.2.3. Melaleuca leucadendrom L.

Es una planta natural de Australia e Islas del Océano Índico, pertenece a la familia Mirtáceas y se conoce

comúnmente como Cayeput o simplemente Melaleuca. Se utilizan las hojas y ramas, las que contienen

aceite esencial (1%), rico en cineol o eucaliptol (entre 50 y 60%), L-pineno, terpineol, L-limoneno,

dipenteno, aldehídos (valeraldehído, benzaldehído), sesquiterpenos, azuleno; este presenta una tonalidad

verdoso-amarillento lo cual lo distingue de otros aceites de especies provenientes del género Melaleuca y

tiene un olor muy penetrante, medicinal y alcanforado (Roig., 1991 y Fitomed., 1991).


Las primeras comunicaciones sobre esta planta fueron hechas por (Roig., 1991), quien refiere

propiedades como expectorante, estimulante, antiséptico urinario, contrairritante en el reumatismo y

parasiticida en enfermedades de la piel, mientras que el (Fitomed., 1991), refiere las propiedades como

insecticida, analgésico, antirreumático, carminativo y el aceite esencial como antimicrobiano. Lo anterior

sirvió de base para la elaboración de la tintura al 20%, fitofármaco utilizado por la población cubana

indicado como antiséptico de las vías respiratorias (Guía Terapéutica de Fitofármacos y Apifármacos.,

1992). El aceite volátil de M. armillaris fue el más efectivo (99%) seguido por el de M. leucadendrom L. (92

%) y M. ericifolia (91,5 %). Recientemente (Farag y col., 2004), realizaron la evaluación química y

biológica de los aceites esenciales de diferentes especies de Melaleuca, cultivadas en Egipto. En este

estudio se analizaron los aceites esenciales de las hojas frescas de M. ericifolia, M. leucadendrom L., M.

armillaris y M. styphelioides, los cuales fueron aislados por hidrodestilación y analizados con un

cromatógrafo de gases y espectrometría de masa. Este aceite esencial resultó ser rico en 1,8-cineol (64,3

%); los aceites esenciales de estas especies mostraron actividad antibacteriana y antifúngica.

1.2.3.2. Estudios fitoquímicos y farmacológicos reportados de la planta.

Los estudios realizados a la planta son pocos y los primeros datan de principios de la década de los 90.

(Tsuruga y col., 1991), realizaron un estudio en la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad

de Tokio en Japón quienes obtuvieron extractos en cloroformo y en metanol de los frutos de la Melaleuca

leucadendrom L., los cuales inhibieron fuertemente la liberación de histamina. El ácido ursólico, un

triterpeno, fue el compuesto más activo contenido en el extracto clorofórmico. (Hiermann y Bufar., 1994),

http://www.sld.cu/fitomed/g304.html




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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Tsuruga%20T%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract




publicaron un trabajo sobre la influencia de algunas plantas medicinales tradicionales de Senegal en la

biosíntesis de prostaglandinas donde se investigaron extractos acuosos de Melaleuca leucadendrom L.

para el cual no se obtuvo resultado sobre la biosíntesis de prostaglandinas, mientras que (Sweeney y

col., 1994), realizaron un estudio sobre la inmunodetección y comparación del polen de la Melaleuca

leucadendrom L., los extractos de polen de dicha planta se analizaron para comprobar la reactividad

cruzada antigénica y alérgica, con resultados satisfactorios.

Los primeros estudios fitoquímicos de la planta fueron realizados por (Lee., 1998), quien aisló un nuevo

nortriterpeno nombrado como 28-norlup-20(29)-ene-3β, 17β-diol y 13 compuestos conocidos fueron

aislados de las hojas de Melaleuca leucadendrom L. por métodos químicos y espectrales.

(Nawawi y col., 1999), estudiaron los efectos inhibitorios de plantas medicinales de Indonesia sobre la

infección del virus del herpes simple tipo 1, realizando un estudio con extractos de metanol de la fruta de

Melaleuca leucadendrom L. para ensayos de infección en ratones, donde dicho extracto prolongó

significativamente el desarrollo de las lesiones cutáneas y redujo la mortalidad.

Los estudios de (Lee y Chang., 1999), determinaron cuatro nuevos triterpenos presentes en el corazón de

la Melaleuca leucadendrom L.

Más recientemente (Farag y col., 2004), realizaron la evaluación química y biológica de los aceites

esenciales de diferentes especies de Melaleuca, cultivadas en Egipto. En este estudio se analizaron los

aceites esenciales de las hojas frescas de M. ericifolia, M. leucadendrom L., M. armillaris y M.

styphelioides, los cuales fueron aislados por hidrodestilación y analizados con un cromatógrafo de gases y

espectrometría de masa. Los aceites mostraron actividad antibacteriana y antifúngica.

En el año 2006 fueron publicados dos trabajos de la planta. (Subehan y col., 2006) realizaron un estudio

para evaluar su acción basada en sus mecanismos de inhibición del citocromo P450 obteniéndose como

resultado que los extractos en metanol de las hojas de Melaleuca leucadendrom L. producían un 30 % de

inhibición del citocromo, dependiente del NADPH (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato). Por su parte

(Amer y Mehlhorn., 2006) evaluaron el aceite como repelente de mosquitos, para el estudio se disolvió el

mismo en diferentes solventes al 1% y se obtuvieron resultados muy satisfactorios en todos los casos.

Recientemente, extractos etanólicos de la planta fueron estudiados por investigadores cubanos,

(Fernández-Calienes y col., 2008), quienes evaluaron la actividad antifúngica, in vitro, frente a

Microsporum canis y Candida albicans, la actividad antibacteriana (Escherichia coli y

Staphylococcusaureus) y la actividad antiprotozoaria (Trypanosoma b. brucei, Trypanosoma cruzi,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Sweeney%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Nawawi%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

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Leishmania infantum y Plasmodium falciparum), obteniéndose que el extracto de la Melaleuca

leucadendrom L tenía una actividad selectiva frente a los microorganismos analizados.

1.3. Generalidades en la obtención y composición de aceites esenciales y extractos.

1.3.1. Extractos. Obtención.

Los procesos más popularmente conocidos para transformar una Planta Medicinal en fitomedicamento para

el hombre son la infusión y la decocción. En estos procesos, se usa el agua hirviendo como líquido para

extraer las sustancias activas de dentro de los tejidos vegetales. El agua en ebullición, en contacto con la

planta fresca o seca, hace que las células vegetales estallen vertiendo su contenido de sustancias activas.

Los preparados como estos se denominan técnicamente "Extractos acuosos" y su ventaja principal es que

son fáciles y rápidos de preparar en la casa. Sin embargo, los extractos acuosos deben ser usados en el

momento, o dentro de un período reducido de tiempo, ya que no son estables. La degradación bioquímica y

la contaminación microbiana hacen que rápidamente estos preparados ya no sean aptos para el consumo

humano o que pierdan sus propiedades curativas. Otra limitación importante de los extractos acuosos tales

como las infusiones y decocciones es que algunas sustancias activas vegetales son sensibles a las altas

temperaturas y entonces pierden sus propiedades cuando son sometidas al agua en ebullición.

(http://www.natureduca.com/anat_nutric_vitaminas.php).

Esta limitación en la estabilidad de los extractos acuosos es subsanada mediante el empleo de otras

sustancias disolventes tales como los alcoholes u otros disolventes orgánicos, entre los cuales hay autores

que recomiendan al metanol como el disolvente de extracción más eficiente respecto a otros como el etanol,

acetona, hexano y acetato de etilo. La presencia de solventes orgánicos en los extractos trae consigo

aparejada una limitación que es preciso remarcar, su toxicidad para el organismo, por lo que actualmente se

recomienda eliminar el mismo por evaporación, quedando los ingredientes de la planta listos para su

formulación como ingrediente farmacéutico activo o para realizar los estudios investigativos

correspondientes.(Jayasinghe y col., 2003).

http://www.natureduca.com/anat_nutric_vitaminas.php




1.3.2. Aceites esenciales. Obtención.

Los aceites esenciales proceden de las flores, frutos, hojas, raíces, semillas y corteza de los vegetales. El

aceite de espliego, por ejemplo, procede de una flor, el aceite de pachulí, de una hoja, y el aceite de

naranja, de un fruto. Los aceites se forman en las partes verdes (con clorofila) del vegetal y al crecer la

planta son transportadas a otros tejidos, en concreto a los brotes en flor. Se desconoce la función exacta

de un aceite esencial en un vegetal; puede ser para atraer los insectos para la polinización, o para repeler

a los insectos nocivos, o puede ser simplemente un producto metabólico intermedio (Bandoni., 2000).

La hidrodestilación es el método tradicional más utilizado que prescribe la mayoría de las farmacopeas

vigentes (Ej: Farmacopea Europea., 2005). Se basa en efectuar una hidrodestilación de un peso

conocido de material vegetal y recoger el aceite esencial en un tubo graduado (1 mL dividido en 0,01 mL)

que se encuentra en un colector de destilación especialmente diseñado para este tipo de análisis. El

colector se acopla a un matraz que contiene el material vegetal y un cierto volumen de agua, el cual se

calienta mediante una manta calefactora de potencia regulable para provocar la destilación. Tras la

destilación, podemos medir el volumen de esencia destilado y fácilmente calcular el contenido, que se

expresa en porcentaje volumen/peso (mL de aceite esencial por 100 g de material vegetal). Aunque este

equipo (también llamado trampa de tipo Clevenger) está universalmente aceptado, y está citado salvo

mínimas variaciones, por casi todas las normas existente sobre extracción de esencia, conviene tener en

cuenta que los resultados que se obtienen con el mismo no siempre puede extrapolarse a un proceso

realizado a escala industrial. Pero si se quiere utilizar la información obtenida del equipo siempre es

conveniente ensayar previamente en una escala intermedia o piloto, para confirmar los resultados en

escala de laboratorio y así poder extrapolar a escala industrial. Finalmente, debe considerarse que el

proceso que se realiza en esta trampa, es más un proceso de cohobación que de destilación simple, pues

el agua condensada en el refrigerante vuelve al matraz o balón extractor, por lo que permite hacer una

extracción más exhaustiva de los componentes hidrosolubles (Bandoni., 2000).

Este método de extracción aparece reportado en la mayoría de las investigaciones relacionadas con

aceites esenciales. Algunos ejemplos de los artículos publicados en los dos últimos años muestran su

amplio uso: Yousefzadi y col., (2007); Loizzo y col., (2007); Kosar y col., (2008); Safaralie y col.,

(2008); Hajhashemi y Abbasi., (2008); Oladipupo y Adebola., (2009); Ogunbinu y col., (2009) y Hu y

col., (2009).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Yousefzadi%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Loizzo%20MR%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Safaralie%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Hajhashemi%20V%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Abbasi%20N%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Oladipupo%20LA%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Adebola%20OO%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Hu%20H%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Hu%20H%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract




1.3.3. Análisis de componentes volátiles presentes en aceites esenciales y extractos de plantas. Cromatografía gaseosa.

Teniendo en cuenta que los aceites esenciales son mezclas que pueden llegar a ser muy complejas, la

identificación de sus componentes no es una tarea simple. Antiguamente esta identificación se convertían

en una larga y tediosa operación, que consumía muchísimo tiempo ya que requería del aislamiento y

purificación de cada componente, utilizaban por ejemplo (la cromatografía en capa fina, cromatografía en

columna, destilación fraccionada), y su posterior determinación estructural por métodos químicos

tradicionales (obtención de derivados, reacción de coloración, pruebas de grupos funcionales, etc.). Por su

parte en los extractos confluyen componentes de muy variada naturaleza, volátiles y no volátiles. Sin

embargo, para el presente trabajo resultaron de interés los componentes volátiles, por disponer de

mayores facilidades analíticas para su identificación y cuantificación. Para el análisis de estos compuestos

volátiles presentes en las plantas medicinales las técnicas de elección son las cromatográficas y entre

estas especialmente la Cromatografía Gaseosa la cual en las últimas décadas ha tenido un desarrollo

vertiginoso con el acoplamiento a sistemas informático y base de datos que han cambiado

sustancialmente el panorama, agilizando de forma notable la identificación de los componentes. Además,

han contribuido especialmente a este cambio, al desarrollo de esta técnica, el surgimiento de las columnas

capilares y el acoplamiento a técnicas espectroscópicas, particularmente la espectroscopía de masas

(EM), la espectroscopía infrarroja (IR) y la espectroscopía de resonancia magnéticas nuclear (RMN)

(Bubbert. y Jennet., 2002).

La cromatografía gaseosa (CG) es una técnica de separación basada principalmente en fenómenos de

partición entre una fase móvil gaseosa (helio, argón, hidrógeno, nitrógeno) y una fase estacionaria constituida

por un líquido muy viscoso retenido en el interior de una columna cromatográfica, es un proceso por el cual

los componentes de una muestra son volatilizados y separados. El cromatógrafo se completa con un sistema

de inyección, que nos permite introducir la muestra en la columna y es rápidamente volatilizada y transportada

por la fase móvil a través de una columna. La columna se coloca en un horno con temperatura regulable y

programable, los que nos permite influir de forma decisiva en la separación de los componentes de la mezcla

(Skoog., 2000). La separación se produce debido a que los diferentes componentes de la muestra tienden a

desplazarse a través de la columna a distintas velocidades debido a su diferente solubilidad y velocidad de

difusión en la fase estacionaria, esta técnica requiere que los componentes a separar sean volátiles o




volatilizados por efecto de la temperatura. Los componentes de la muestra son eluídos de la columna por el

gas portador y transportados hasta el detector, cuya función es detectar las diferentes sustancias a medida

que van saliendo de la columna, una vez separadas. La respuesta del detector es ampliada y enviada a un

registrador dando una representación gráfica (Cela., 2002).

Como variables respuestas importantes de la CG se pueden agrupar según el uso que se le de a la misma;

para la identificación de los componentes de una muestra son utilizados fundamentalmente el tiempo de

retención (tiempo que tarda cada uno de los picos en aparecer registrado, esta es una característica de un

componente particular en un sistema dado) y los índices de retención que se calculan a partir de los tiempo de

retención y por comparación con una serie de sustancia a las cuales se le asignan valores arbitrarios de índice

de retención, mientras que para la cuantificación de los componentes son utilizadas como variables

respuestas la altura y el área de los picos (Cela., 2002).

En esta técnica, de elección para el análisis de componentes volátiles de aceites esenciales y extractos,

suelen emplearse dos tipos de fase estacionaria: polietilenglicol de peso molecular 20000 (Carbowax 20M)

que es una fase polar, y polidimetilsiloxano en diferentes variantes (OV101, ultra 1, HP-5, DB-1, etc.), que es

una fase apolar. La CG no solo es útil para estudiar la composición de un aceite esencial, como veremos

seguidamente, sino que también es una herramienta indispensable en el control de la calidad de estos

compuestos. Para la identificación de los componentes del aceite esencial mediante CG se utiliza

frecuentemente la comparación de sus tiempos de retención con los patrones. Sin embargo, los tiempos de

retención están fuertemente influenciados por numerosas variables, como la técnica de inyección, las

variaciones de temperatura o flujo de los gases y por esto son empleados con mayor frecuencia los índices de

retención. Estos índices se calculan a partir de los tiempos de retención y por comparación con una serie de

sustancia a las cuales se les asignan valores arbitrarios de índice de retención. La identificación de los

componentes del aceite se realiza a través de comparación de los índices de retención de las sustancias

patrones en dos fases estacionarias polar y apolar, con los índices obtenidos para los componentes del aceite

esencial (Bandoni., 2000) para lo cual existe una recopilación muy importante de estos índices en bases de

datos especializadas entre las cuales se destaca la realizada por Adams RP (Adams., 2001).

Generalmente la cuantificación de los componentes de un aceite esencial o de los componentes volátiles en

un extracto se efectúa por normalización de las áreas de los pico del cromatograma obtenido con un detector

FID. No suelen utilizarse factores de corrección. Esta simplificación, que supone que todos los componentes

de la esencia tienen el mismo grado de respuesta al detector, es comúnmente aceptada dada la dificultad para




disponer de los patrones necesarios para otros tipos de análisis más exactos. A pesar de que este detector

resulta el más utilizado en el análisis de los aceites esenciales, en los últimos años la necesidad de disponer

de aplicar otras técnicas más sensibles y específicas como detectores ha llevado al uso de la Espectrometría

de masas que es una técnica experimental que permite la medición de iones derivados de moléculas. El

espectrómetro de masas es un instrumento que permite analizar con gran precisión la composición de

diferentes elementos químicos e isótopos atómicos, separando los núcleos atómicos en función de su relación

masa-carga (m/z). Puede utilizarse para identificar los diferentes elementos (Bandoni., 2000).

Teniendo en cuenta que la técnica utilizada en el presente trabajo fue la GC-FID y la GC-MS, a

continuación en la (Tabla 1.1), se cita unos trabajos, como ejemplos, de los cientos que aparecen en la

literatura especializada en la última década empleando esta técnica como método de análisis para estudio

de la composición química de los aceites esenciales y extractos, describiéndose también las condiciones

cromatográficas utilizadas en cada caso.

Tabla 1.1. Ejemplos de investigaciones que emplean la GC y la GC-MS, para la determinación de la

composición de aceites esenciales y extractos, y las condiciones cromatográficas utilizadas en cada caso.

Nombre de la

Planta Columna T. Horno oC

T.Inyector(oC)

/T. Interfase

oC

Detector

Gas / V. de

Flujo Referencias

Calocedrus

macrolepis

(aceite esencial)

Capilar (100%

dimetilpolisiloxan

e)

Inicial 50 * 5 min.+

120 a 2 °C/min-1 + 220

a 2 °C/min-1 * 5 min.

FID Helio/1,0

ml/min.

(Hui-Ting y

col., 2008)

Pericarpium citri

reticulatae(aceite

esencial)

Capilar de sílica

OV-1

Inicial 65 + 260 a

razón de 6 °C/min. 300/280°C MS

Helio/1,0

ml/min.

(Lunzhao y

col., 2008)

Piper nigrum

(Oleoresinas) Capilar DB5

Inicial 60 °C (1 min),

60-185 °C (1.5°C/min),

185-275°C(9 °C/min),

275 °C (2 min).

300°C MS Helio/1,0

ml/min Kapoor, 2009

Thymus vulgaris

(Extracto) Capilar DB5

Inicial 40°C, a 3°C

hasta 230 y 15°C - FID

Helio/1,0

ml/min

http://es.wikipedia.org/wiki/I%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9cula

http://es.wikipedia.org/wiki/Is%C3%B3topo

http://es.wikipedia.org/wiki/Masa

http://es.wikipedia.org/wiki/Carga_el%C3%A9ctrica




Nombre de la

Planta Columna T. Horno oC

T.Inyector(oC)

/T. Interfase

oC

Detector

Gas / V. de

Flujo Referencias

hasta 310°C

1.4. Validación de los métodos analíticos. Determinación de los parámetros de desempeño.

El uso de una técnica analítica para la cuantificación de componentes en una muestra obliga a que la

misma sea sometida previamente a su validación, siguiendo normativas nacionales e internacionales al

efecto. Dicha validación desempeña un papel determinante pues de ellos depende la comprobación

confiable y reproducible de los resultados, lo cual contribuye a obtener resultados confiables. En el

presente trabajo se realizó la validación de la técnica de Cromatografía Gaseosa siguiendo las normativas

descritas en las normas de la Conferencia Internacional de Armonización (ICH, siglas en inglés) y del

Centro Estatal para el Control de la Calidad de los Medicamentos de Cuba, (CECMED). A continuación se

resumen los aspectos de los parámetros de validación que fueron tomados en consideración en el trabajo.

Bibliografía consultada:(ICH., 2005 y Validación de métodos analíticos (CECMED., 2007).

1.4.1. Linealidad

Este estudio se efectuará tanto sobre soluciones patrón de analito como sobre muestras problemas que

contengan concentraciones crecientes del analito. Los estudios de linealidad responderán a diseños

similares a los que se describen a continuación:

a) El ensayo se puede efectuar tanto con material de referencia del analito, como con muestras problemas

que contengan concentraciones crecientes de analito que cubran el intervalo del método. El análisis se

realizará como mínimo por triplicado.

b) Se evaluarán los datos estadísticamente a fin de verificar la linealidad y proporcionalidad según se

describe a continuación:

Significación de la regresión: Se determinará el coeficiente de correlación (debe ser ≥ 0.990) y el

de determinación (valores superiores a 0.98).




Verificación de linealidad: Se efectuará por determinación del CV de los factores de respuesta

(cociente respuesta / concentración), el cual no será superior al 5%. También se evaluará la

varianza de la pendiente de la línea de regresión.

Verificación de proporcionalidad: Los resultados de este ensayo deberán incluir el 0 para el grado

de probabilidad definido.

Prueba de falta de ajuste: Se implementará para demostrar que los valores se ajustan a una línea

recta.

1.4.2. Precisión.

La precisión de un procedimiento analítico expresa el grado de concordancia entre una serie de

mediciones obtenidas a partir de la misma muestra homogénea bajo las condiciones prescritas.

Debe investigarse la precisión utilizando muestras homogéneas, auténticas. Sin embargo, si no es posible

obtener una muestra homogénea se emplean muestras artificialmente preparadas o una disolución de la

muestra.

La determinación de la precisión se realizará a 3 niveles, siempre que proceda: intraensayo (repetibilidad),

interensayo (precisión intermedia) e interlaboratorios (reproducibilidad).

a) Evaluación de la repetibilidad: realizar un mínimo de 6 determinaciones a la concentración del 100 %.

b) Evaluación de la precisión intermedia: Se implementará un diseño donde se evaluarán 3

concentraciones de una muestra (como mínimo) en duplicado, por al menos 2 analistas en 3 días

diferentes. Se recomienda, siempre que sea posible, que cada analista emplee instrumentos y materiales

diferentes.

1.4.3. Especificidad.

La especificidad es la capacidad de un método analítico de detectar inequívocamente el analito en

presencia de compuestos que pueden estar presentes en la muestra (impurezas, productos de

degradación, componentes de la matriz, etc.).

La especificidad de un método analítico se determina comparando los resultados del análisis de muestras

conteniendo impurezas, productos de degradación, sustancias relacionadas o excipientes con los

resultados del análisis de muestras que no contienen dichas sustancias.




La determinación cuantitativa de un componente (o para ensayos de actividad): Se asegurará que la señal

medida por el método analítico corresponde exclusivamente al analito sin interferencias posibles.

1.4.4. Exactitud.

La determinación de la exactitud deberá realizarse por estudios de adición y recuperación de cantidades

conocidas de muestras de referencia o patrones a excipientes a fin de comparar el valor medido

experimentalmente (observado) con el valor real (esperado).

La determinación de este parámetro podrá realizarse por diferentes métodos, de los cuales la adición del

patrón constituye el más utilizado en muestras vegetales, ante la poca disponibilidad de patrones de

referencias certificados:

Método de adición de patrón: Se tomarán alícuotas de una muestra a las que se añaden cantidades

conocidas de un patrón, dejando una alícuota como control de muestra. Dichas muestras se analizarán en

paralelo por triplicado y se evaluarán contra una curva de calibración preparada con soluciones patrones.

Se calculará la recuperación como medida de exactitud y su significación por pruebas estadísticas

apropiadas.

Para que la evaluación de la exactitud se considere satisfactoria, no existirán diferencias significativas

entre los valores obtenidos experimentalmente y los valores verdaderos. Si esta diferencia es pequeña, la

exactitud es buena.

1.4.5. Límite de detección y cuantificación.

Límite de cuantificación: Cantidad más baja de analito que puede medirse cuantitativamente en una

muestra con exactitud y precisión aceptables.

Límite de detección: Cantidad más baja de analito que puede detectarse, pero no necesariamente

cuantificarse, como una concentración o cantidad exacta.

La evaluación de ambos parámetros puede efectuarse y responder a diferentes diseños entre los cuales

uno de los más empleados es la relación señal ruido. Se compararán la respuesta del blanco (matriz sin

analito) con las muestras que contienen pequeñas cantidades de analito adicionadas al blanco. Deberá

obtenerse el nivel medio de ruido del blanco y se multiplicará por 2 ó 3 para el límite de detección o por 6 ó




10 para el de cuantificación. Posteriormente se compararán estos valores con las respuestas de las series

blanco + analito y se hallará la concentración de analito que corresponda al valor de la señal.

1.5. Evaluación de la actividad antioxidante en productos naturales.

Se consideran radicales libres (RL) aquellas moléculas que en su estructura atómica presentan un electrón

desapareado o impar en el orbital externo, dándole una configuración espacial que genera una alta

inestabilidad. Es una entidad química que contrario a la normal tendencia espontánea de los electrones

localizados en los átomos y moléculas a la formación de parejas es desapareado. Esto lo hace muy

inestable, extraordinariamente reactivo y de vida efímera, con una enorme capacidad para combinarse

inespecíficamente en la mayoría de los casos, así como con la diversidad de moléculas integrantes de

estructura celular: carbohidratos, lípidos, proteínas, ácidos nucleicos y derivados de cada uno de ellos.

(Halliwell B, Gutterioge, JMC., 1989)

En 1954 una investigadora argentina, Rebeca Gerschman, sugirió por primera vez que los RL eran

agentes tóxicos y generadores de enfermedades. (Gerschman R., 1954). Los RL son elaborados

continuamente como un producto del metabolismo normal de cada célula e inactivados por un conjunto de

mecanismos (unos enzimáticos y otros de atrapamiento). Son componentes normales de células y tejidos,

existiendo una poza de RL particular en cada estirpe celular y en algunos tipos celulares permiten la mejor

adaptación a su hábitat. Al elevarse o disminuir las concentraciones fisiológicas de las especies reactivas

de oxígeno (EROS) puede acarrear importantes alteraciones funcionales. Las principales especies

reactivas del oxígeno o sustancias prooxidantes son: Hidroxilo, Alcoxilo, Superóxido, peróxido, entre otros

(Cabrera., 2000, Moreira et al., 2000). El desbalance entre la producción de EROS y la defensa

antioxidante provoca un daño orgánico conocido como estrés oxidativo, que lleva a una variedad de

cambios fisiológicos y bioquímicos los cuales ocasionan el deterioro y muerte celular. Este desequilibrio en

favor de los oxidantes conduce a un potencial daño oxidativo sobre biomoléculas (Avello and Suwalsky.,

2006, Ortega et al., 2003).

El ser humano está protegido del estrés oxidativo gracias a la acción de estas sustancias antioxidantes

que poseen diferentes funciones (Shi, Noguchi y Niki., 2001). Es difícil intentar definir los antioxidantes

naturales, pero en general el término alude a aquellas sustancias que se presentan o pueden ser extraídas

de los tejidos de las plantas y los animales y aquellos que se forman durante la cocción o el procesado de

compuestos alimenticios de origen vegetal o animal. Los antioxidantes naturales se encuentran presentes




en prácticamente todas las plantas, microorganismos, hongos e incluso en los tejidos animales

(Yanishlieva-Maslarova., 2001).

(Gastell and Luis., 2000) señalaron que uno de los mecanismos de acción de los antioxidantes presentes

en el cuerpo es aquél en que la molécula de antioxidante, al colisionar con un radical libre de oxígeno, le

cede un electrón, que se oxida a su vez y se transforma en un radical libre de oxígeno débil no tóxico. No

todos los antioxidantes actúan de esta manera, los llamados enzimáticos catalizan o aceleran reacciones

químicas que utilizan sustratos que a su vez reaccionan con los RL. Cada antioxidante posee una afinidad

hacia un determinado RL o hacia varios RL. (Maestri et al., 2006).

1.5.1. Mecanismos de acción de los antioxidantes y métodos para determinar la actividad antioxidante.

Los antioxidantes engloban un grupo de sustancias que presentan estructuras químicas y mecanismos de

acción muy variados. Así que no hay una definición internacional para el mejor antioxidante. (Gordon.,

2001).

En la realidad, las propiedades antioxidantes de diferentes extractos, aceites esenciales y compuestos

puros se podrían ser evaluados utilizando varios ensayos in vitro que pueden se divididos en dos grupos

(Macdonald-Wicks., 2006):

1. Los que evalúan la peroxidación lipídica.

2. Los que miden la habilidad secuestradora a los radicales libres.

En la valoración de la peroxidación lipídica, la actividad antioxidante del sistema podría ser detectada

midiendo la formación de los substratos y el consumo de los antioxidantes, y los intermedios o los

productos finales. Estas medidas se lleva a cabo en los ensayos como:

Valor peróxido.

Valor de ácido tiobarbitúrico (TBA).

Contenido de ácidos grasos libres.

Formación de los dienos conjugados por la absorción a 232 y 268nm.

Composición de los ácidos grasos.

Proporción de los ácidos grasos insaturados y los ácidos saturados.




La mayoría de estos ensayos basados en los sustratos lipídicos necesitan las condiciones de oxidación

aceleradas: incrementando presión parcial de oxígeno y la temperatura, adicionando los catalizadores de

la transmisión metálica, expuesto a la luz, varias fuentes de agitación y radicales libres.

Para medir la habilidad secuestradora a los radicales libres, el método se divide en dos grupos de acuerdo

a las reacciones químicas involucradas: uno basado en la transferencia de los átomos de hidrógenos u

otro basado en la transferencia de los electrones singulares. Ambas transferencias pueden ocurrir

simultáneamente y la reacción dominante en el sistema se puede determinar según las propiedades y la

estructura de los antioxidantes, los coeficientes de partición y solubilidad, el solvente.

En el método basado en la transferencia de los átomos de hidrógenos, los antioxidantes pueden apaciguar

los radicales libres dándole hidrógeno.

Las reacciones son rápidas, no dependen del solvente y pH. Ellos son: inhibición de la inducción de

oxidación de LDL, capacidad absorbida de los radicales de oxígeno (ORAC).

El método basado en la transferencia de electrón singular detecta la habilidad de un antioxidante para

transferir un electrón o reducir cualquier compuesto, incluyendo metales, grupos carbonilos y radicales. Es

un método depende del valor de pH. Ellos son: ensayo de fenólicos totales por reactivo Folin-Ciocalteu,

capacidad antioxidante equivalente Trolox (TEAC, siglas en inglés), 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPD, siglas

en inglés), la fuerza antioxidante reducida del ión férrico (FRAP, siglas en inglés), ensayo de potencial total

antioxidante utilizando el complejo de Cu(II) como antioxidante.

Los métodos basados en este principio incluyen que un oxidante (substrato) puede abstraer un electrón

desde el antioxidante, dando el cambio de color del substrato. El grado del cambio de color es proporcional

a la concentración del antioxidante. El punto final de la reacción se alcanzaría cuando el cambio de color

se había parado. A través de la pendiente de la curva trazada de la variación de absorbancia contra la

concentración de antioxidante se refleja la actividad antioxidante.

Algunos autores proponen el orden de tres pasos principales en la evaluación de la muestra (Huang.,

2005):

Cuantificación e identificación de los compuestos fenólicos.

Cuantificación de la actividad secuestradora de radical, utilizando más que un método y

considerando el efecto del solvente en el mecanismo de antioxidante.




Evaluación de habilidad de los antioxidantes para inhibir o suspender la oxidación lipídica en el

sistema adecuado.

Esta actividad ha sido muy estudiada por múltiples grupos de investigadores en todo el mucho, los

siguientes trabajos, como ejemplos, dan fe de esta afirmación; Firuzi y col., (2011) evaluaron la actividad

antioxidante del aceite esencial y varios extractos del Tanacetum sonbolii Mozaff, obteniendo los mejores

resultados para el extracto acuoso y el de acetato de etilo. En este mismo año se evaluaron extractos

metanólicos y el aceite esencial del Eucalyptus loxophleba que aportó mejor actividad antioxidante en los

extractos que en el aceite. (Rahimi-Nasrabadi., 2011); mientras en Malasia se realizaron estudios

similiares en la especie Tetrastigma con resultados muy buenos para el extracto metanólico (Hossain M

Amzad., 2011). Más recientemente se pudiera citar el trabajo realizado por (Cavar y Maksimovi., 2012),

quienes determinaron la actividad antioxidante del aceite esencial y los extractos metanólicos de las hojas

y las flores Pelargonium graveolens, obteniendo mejores resultados para las hojas en todos los ensayos.

1.6. Evaluación de la actividad antimicrobiana en productos naturales.

Los antimicrobianos son sustancias que atacan a los microorganismos, de diferentes maneras: por

inhibición de la síntesis de la pared celular, de las funciones de la membrana celular, de la traducción del

material genético y de la síntesis de ácidos nucleicos. Estos pueden actuar, matando las formas

vegetativas de los gérmenes (bactericida, refiriéndose a bacterias y fungicida, refiriéndose a hongos) o

inhibiendo el creciemiento de los microorganismos (bacteriostático, refiriéndose a bacterias y fungistático,

refiriéndose a hongos) (Lizcano y Vergara., 2008).

La sociedad actual, demanda también, productos con menos aditivos químicos ya que, algunos de estos

poseen cierto grado de toxicidad. Es así, como los productores han sido forzados a remover completamente

el uso de antimicrobianos químicos y adoptar alternativas para el mantenimiento o extensión de la vida útil

de sus productos. La mayoría de los compuestos con actividad antimicrobiana encontrados en plantas,

hierbas y especias, son compuestos fenólicos, terpenos, alcoholes alifáticos, aldehídos, cetonas, ácidos e

isoflavonoides (Figueroa y col., 2007).

De las plantas se pueden obtener extractos y aceites esenciales para muchos y diversos fines; por un lado

estos aceites presentes en variada proporción en la planta protegen la mima de plagas, enfermedades e

inclusive de la invasión de otras plantas, para atraer insectos y aves (polinizantes). Estas cualidades de




protección y atracción, se ven reflejadas en propiedades: antisépticas, antiinflamatorias, antidepresivas,

afrodisíacas y otras, presentes en mayor o menor grado en la totalidad de los aceites (Müller., 1981;

Morales de Godoy., 1996; Smith y col., 1998; Martínez., 2003).

1.6.1. Métodos para evaluar la actividad antimicrobiana. Ejemplos.

Existen diferentes métodos que prueban la eficacia “in vitro” en medios microbiológicos, en los que

generalmente el agente antimicrobiano se aplica directamente al producto que se desea probar. Entre estos

métodos tenemos el de Dilución en agar y caldo y el de Difusión en agar o “Proceder de Kirby-Bauer”. Este

último se trata de un método sencillo que se basa fundamentalmente en incorporar al medio de cultivo el

antibiótico o el microorganismo en concentración conocida, para que luego de solidificado el medio, se

adicione la contraparte y observar la inhibición del crecimiento o halos de inhibición según la técnica

utilizada. Esta técnica también abarca el método de difusión en discos de papel, en la cual el antimicrobiano

a ensayar viene incorporado a discos de papel absorbente en concentración conocida que se colocan sobre

la superficie de una placa de agar sembrada masivamente con el microorganismo en estudio, luego de

incubar a la temperatura y tiempo adecuados, se observarán halos de inhibición del crecimiento; donde el

efecto inhibitorio del compuesto que se va a evaluar depende de su habilidad de difundirse en el medio

(Mitscher y col., 1987; Arévalo y Enciso., 1996; Alderman y Smith., 2001; NCCLS., 2003; NCCLS.,

2009).

El tamaño de esta zona de inhibición indica si las bacterias objeto de análisis tienen una sensibilidad alta,

intermedia o baja frente a las soluciones del aceite esencial. Se considera inhibitorio un valor mayor de 2

mm alrededor de cada orificio o disco (Dabbah y col., 1970; Dellacasa y col., 1999; Figueroa y col.,

2007).

Las ventajas de los métodos de difusión es que utilizan pequeñas cantidades de muestra y ofrecen la

posibilidad de ensayar varias sustancias contra un mismo microorganismo. (Arévalo y Enciso., 1996,

Déciga., 2007). Además permite medir la susceptibilidad “in vitro” de microorganismos patógenos y

fitopatógenos frente a una sustancia o la mezcla de varias sustancias desconocidas de origen vegetal con

potencial antimicrobiano (Torres., 2007).

Las propiedades antimicrobianas de los aceites esenciales y extractos han sido reconocidas por muchos

años y sus preparaciones han encontrado aplicaciones como agentes antimicrobianos en el campo




terapéutico y como preservos de alimento. Los aceites esenciales y extractos que poseen actividad

antimicrobiana han sido blanco de muchas investigaciones, realizándosele el screening a una gran variedad

de especies de plantas que han revelado estructuralmente compuestos activos (Zaika., 1988). En los

últimos años múltiples investigadores reportan la actividad antimicrobiana y antifúngica de aceites

esenciales y extractos de diferentes especies de plantas, siendo destacable que en la mayoría de los

trabajos que aparecen reportados en los últimos 6 años relacionan estas actividades farmacológicas con los

componentes mayoritarios presentes en las mismas (Tabla 1.2).

Tabla 1.2. Reporte de plantas con acciones farmacológicas demostradas.

Planta Medicinal Acción demostrada M.O Fuente

Ambrosia trífida (Aceite esencial)

bactericida y fungicida 6 especies bacterias y 2 de hongos

Wang y col. (2006)

Arracacia tolucensis var. Multifida. (Aceite esencial)

Antibacteriana Mycobacterium tuberculosis.

Figueroa y col. (2007)

Woodfordia fruticosa Antibacteriana Staphylococcus Parekh (2008)

Cleistocalyx operculatus (Extractos etanólicos)

Bacterias Gram positivas y Gran negativas P. aeruginosa

Staphylococcus aureus.

Thi Dung (2008)

Moringa oleifera Lan (aceites esenciales y extractos)

Antifúngica Staphylococcus aureus.

Chiang y col. (2007)

Clalocedrus macrolepis (aceites esenciales y extractos)

Antifúngica Staphylococcus aureus.

Chang y col. (2008),

Satureja montana actividad antimicrobiana Streptococcus. Serrano y col., (2011)

1.7. Consideraciones finales del estudio bibliográfico.

Después de haberse realizado una exhaustiva revisión de la literatura especializada se puede resumir lo

siguiente: (I)- Los aceites esenciales poseen una gran cantidad y variedad de componentes, entre los

cuales abundan aldehídos de cadena corta, terpenos, sesquiterpenos etc. Y las técnica de extracción de

aceite más empleada suele ser la hidrodestilación (II)-La técnica analítica de elección para identificar y

cuantificar los componentes volátiles presentes en aceites esenciales y extractos de plantas medicinales

suele ser la cromatografía de gases con detección FID y/o acoplada a la espectrometría de masa (GC–

MS); (III)- La acción antioxidante y la antibacteriana constituyen las acciones farmacológicas más




estudiadas en los aceites esenciales y ya se encuentran ampliamente comprobadas en extractos; (IV)- Los

estudios reportados para la Melaleuca leucadendrom L. y el Psidium guajava L. muestran la presencia de

1,8 cineol en sus hojas y su acción antifúngica y antibacteriana; mientras que los estudios reportados para

la Eugenia axillaris(Sw.) Willd. son muy escasos, apareciendo solo algunos reportes sobre sus usos

tradicionales y su composición.

Capítulo 3: Resultados y discusión



Capítulo 2: Materiales y Métodos

2.1. Material vegetal, equipos y reactivos químicos.

La presente investigación se realizó en el Departamento de Farmacia de la Facultad de Química y

Farmacia, durante la etapa comprendida desde septiembre de 2010 hasta diciembre del 2013. En todos

los procedimientos desarrollados se emplearon: cristalería específica de laboratorio previamente

descontaminada, reactivos de calidad analítica y equipos e instrumentos de medición certificados como

aptos para el uso.

Para la obtención del aceite esencial y los extractos se utilizaron las hojas secas de las especies Psidium

guajava L., Eugenia axillaris (Sw.) Willd. y Melaleuca leucadendrom L. . Las especies Eugenia axillaris

(Sw.) Willd y Psidium guajava L., fueron recolectadas en las áreas del Jardín botánico de la UCLV,

mientras que la especie Melaleuca Leucadendrom L. fue recolectada en las montañas del macizo

Guamuaya en la zona de Topes de Collantes y las tres especies fueron identificadas por botánicos

especialistas del Jardín Botánico donde aparecen registradas con la siguiente numeración:

La identificación taxonómica del material vegetal se realizó en el lugar de colecta por el especialista Dr. C.

Alfredo Noa Monzón, se lavó con abundante agua potable y se secó con la estufa durante 3 días a 30oC

para su evaluación analítica.

Se utilizó, en todos los procedimientos desarrollados, cristalería específica de laboratorio, previamente

descontaminada, empleando reactivos de calidad analítica y equipos certificados como aptos para el uso.

Equipos, instrumentos de medición y reactivos.

Autoclave, RAYPA modelo AES-28 España.

Balanza digital, BOECO, Alemania.

Baño ultrasónico, BRANSON 1510, México.

Cámara para cromatografía (25 x 10 cm)

Centrífuga, 5702 EPENDORF, Alemania

Cristalería de laboratorio.

Cromatógrafo Gaseoso, AGILENT 6890N series, Estados Unidos.

Cromatógrafo GC-MS, QP5050A, SHIMADZU.

Rotoevaporador BUCHI R-200, Alemania.

Espectrofotómetro UV-VIS, Termo electrón, Genesys 10UV, Estados Unidos.




Estufa, BINDER

Filtro miliporo de 0,45 µm, MILLEX-HA

Flujo laminar, FASTER

Incubadoras, HERAEUS modelo IP-20 Klasse 3.1. Alemania

Lámpara UV, CAMAG.

Micropipetas de 5, 20, 100, 1000 µL, EPENDORF, Alemania.

Máquina sacudidora THYS 2, Alemania.

Molino de Cuchillas (Retsh GMBH). Alemania.

Reactivos y disolventes utilizados:

2, 2-difenil-1-picril-hidracilo (DPPH), SIGMA- ALDRICH.

n-butanol, Merck.

Acetona, UNI-CHEM.

Ácido ascórbico, UNI-CHEM.

Ácido linoleico, Merck.

. 2,4,6/tripiridil/s/triazina (TPTZ).

Ácido tricloroacético, EPB “Carlos J Finlay”.

Agar Mueller-Hinton, BioCen.

Agua desionizada y destilada.

Anisaldehído, Merck.

Buffer fosfato (0.2 M, pH 6.6)

Buffer fosfato (300 mM)

Buffer fosfato (40mM).

Caldo Mueller-Hinton, BioCen.

Carbonato de sodio, Merck.

Ciclohexanol, SAFC.

Cineol, SAFC.

Cloruro férrico, Panreac.

Cloruro ferroso, Merck

Dimetilsufóxido (DMSO), Riedel de Haën




Etanol, UNI-CHEM.

Ferricianuro de potasio, UNI-CHEM.

Hidroxianisol butilado (BHA), SIGMA- ALDRICH.

Ácido sulfúrico 0,6M.

Hidroxitolueno butilado (BHT), SIGMA- ALDRICH.

Mentol, SAFC.

Metanol, Lichrosolv, Merck.

Pirogalol, SCHARLAU.

Propilgalato, SAFC.

Reactivo Folin–Ciocalteau, SIGMA- ALDRICH

Salicilato de metilo, SAFC.

Sulfato de sodio anhidro, UNI-CHEM.

Terpineno, SAFC.

Timol, SAFC.

Tiocianato de amonio, Merck.

Tolueno, Panreac.

α-pineno, SAFC.

Molibdato de amomio (4mM).

Fosfato de sodio (28mM).

Eugenol

Ácido sulfúrico

Vitamina E.

Ácido gálico

Disco de Amikacina 30 µg, BioCen.

Disco de Eritromicina 15 µg, BioCen.

Disco de Ácido nalidixico 30 µg, BioCen.

Disco de Penicilina 10 IU, BioCen.




2.2. Metodología de obtención del aceite esencial y de los extractos a partir de las hojas de las tres

especies.

2.2.1. Obtención del aceite esencial.

El aceite esencial de las tres especies evaluadas se obtuvo empleando el método de hidrodestilación que

describe la Farmacopea Europea (2005), el cual se basa en efectuar una hidrodestilación de un peso

conocido de material vegetal y recoger el aceite esencial en un tubo graduado (1mL dividido en 0,01mL)

que se encuentra en un colector de destilación especialmente diseñado para este tipo de análisis, trampa

de tipo Clevenger, (Figura 2.1.), este equipo está universalmente aceptado, y está citado salvo mínimas

variaciones, por casi todas las normas existentes sobre extracción de esencias. Este equipo se acopló a

un balón que contenía 50 g de material vegetal y un volumen de agua que ocupó las ¾ partes del mismo,

el cual se calentó mediante una manta calefactora de potencia regulable para provocar la destilación. Tras

la destilación, se separó la fase acuosa del aceite esencial y se agregó a este último la cantidad necesaria

de sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua remanente.

Figura 2.1. Equipo de destilación de aceite esencial (Trampa Clevenger)

2.2.2. Obtención de los extractos

Los extractos se obtienen utilizando las hojas de cada especie previamente secada y molida. Se pesaron

10g del polvo y se añadieron en los mismos 100mL de acetona. Fueron colocados en una agitador

(Zaranda) 24h a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo se filtró cada extracto utilizando filtros de




papel 0,45µm y se procedió a repetir la extracción en iguales condiciones otras 24h. A continuación se

juntan los extractos obtenidos en cada extracción, para cada planta por separado, y el solvente se evaporó

utilizando un rotoevaporador en vacío a 400C hasta la sequedad. Las muestras obtenidas se almacenaron

a 40C hasta el próximo uso. Para obtener el rendimiento, se realiza el cálculo en base de extracto seco

obtenido después de la rotoevaporación (%).

2.3. Determinación del rendimiento de aceite esencial y de extracto obtenido de cada especie

estudiada.

Antes de proceder a realizar la determinación del contenido de aceite esencial y extracto, aplicando los

métodos descritos anteriormente, fue necesario determinar el contenido de humedad del material vegetal

sometido a los procesos de extracción, lo cual permitió realizar el cálculo en base a droga seca. Esta se

determinó por el método azeotrópico, que es el que se emplea para plantas que contienen aceites

esenciales, el cual se describe a continuación:

A un balón de 500 mL se transfirieron 200 mL de Tolueno, se le añadió 2 mL de agua, se colocó en la

plancha de calentamiento, se destiló en el equipo para tolueno (Figura 2.2.), hasta que el volumen del

agua en el tubo colector permaneció constante, se midió el volumen inicial (V1). Se dejó enfriar el tolueno

(tolueno saturado). De la muestra de ensayo pulverizada y tamizada, se pesó 10 g y se transfirieron al

balón que contenía el tolueno saturado; se colocó en la plancha de calentamiento, se destiló hasta que el

volumen del agua en el tubo colector permaneció constante, se midió el volumen final de agua (V2).

El contenido de humedad (H) de la porción de ensayo expresada en por ciento (v/p) se calculó mediante la

fórmula siguiente:

Donde: m masa de la porción de ensayo

100 factor matemático para los cálculos

V2 volumen de agua final

V1 volumen de agua inicial




.

Figura 2. 2. Equipo de arrastre de agua en aceites esenciales (método del tolueno)

Tras la destilación y de cada extracción, se midió el volumen de esencia destilado se pesó el extracto

obtenido, respectivamente y se calculó el contenido de aceite y/o extracto, que se expresó en porcentaje

volumen/peso (mL de aceite esencial o g de extracto por 100 g de material vegetal) en base a la droga

seca, según la siguiente expresión:

Donde: R contenido de aceite esencial o extracto en % (v/p)

C cantidad de aceite esencial obtenida en mL

M masa de la droga sin humedad residual en gramos, que se calcula:

Donde: H humedad de la droga

M0 cantidad de planta sometida a la destilación en gramos

100 factor matemático




2.4. Determinación de la composición de los aceites esenciales y los extractos de las tres especies

de Mirtáceas estudiadas.

2.4.1. Determinación de la composición de los aceites esenciales

Para la determinación de la composición de los aceites obtenidos se utilizó la técnica GC-MS. El análisis

se realizó en un cromatógrafo GCMS-QP5050A Shimadzu, empleando las siguientes condiciones

cromatográficas:

Se utilizó una columna capilar DB-5MS.

Como gas portador se utilizó Helio.

Programa de temperatura del horno: 50-150 a razón de 3 oC·min-1 manteniendo la temperatura de 150

oC durante 15 min (el tiempo del análisis es de 48 min).

Temperatura del inyector de 250 oC.

Flujo del gas a través de la columna de 0,7 mL/min.

Temperatura de la interface de 290 oC.

Impacto electrónico (IE).

Intervalo de barrido de masas de 50-500 amu a 70 eV; una velocidad de barrido de 2000 y un voltaje

de 0,80 kV.

Preparación de la muestra

Se realizaron dos identificaciones a partir de los aceites obtenidos por los métodos de hidrodestilación y

arrastre con vapor respectivamente. Para ambas muestras de aceite esencial se tomó:

50µL y se diluyeron en 1mL de acetona (muestra concentrada).

20 µL y se diluyeron en 1mL de acetona (muestra diluida)

2.4.2. Determinación del perfil cromatográfico de los extractos y el aceite esencial por GC.

Identificación de componentes con el uso de patrones.

El perfil cromatográfico de los aceites y extractos obtenidos se realizó en un Cromatógrafo gaseoso

AGILENT, empleando el siguiente procedimiento:

Disolución problema: Se preparó una dilución del aceite en acetona (50 µL/1000 µL), mientras que los

extractos se diluyeron 20 µL/1000 µL




Disoluciones de referencia: Fueron probadas 8 sustancias de referencias, que constituyen componentes

comunes reportados en múltiples aceites esenciales: 1,8-cineol, eugenol, DL-mentol, α- pineno, alcanfor.

Todas fueron preparadas en acetona en la proporción 50 µL/1000 µL.

La cromatografía se llevó a cabo utilizando las siguientes condiciones cromatográficas:

Columna capilar de sílice fundida de 30 m de longitud y 0,32 mm de diámetro interno.

Nitrógeno para cromatografía como gas portador.

Programa de temperatura: temperatura de la columna a 55 OC durante 1 min, luego aumentándola a

una velocidad de 3 OC por minuto hasta 150 OC y aumentar nuevamente a razón de 2 OC por minuto

hasta 200 OC y luego mantener durante 5 min antes de inyectar.

Inyectar aproximadamente 1 μL de la disolución de referencia y la muestra problema.

Detector de ionización por llama, 280 OC.

Los tiempos de retención de los compuestos que eluyeron en el aceite esencial fueron comparados con los

de los patrones de referencia.

2.4.3. Determinación cuantitativa de Cineol en los aceites y extractos de las tres especies.

2.4.3.1. Desarrollo del método.

La determinación de cineol presente en el aceite de Psidium guajava L., Eugenia axillaris (Sw.) Willd. y

Melaleuca leucadendrom L. se realizó por la técnica de cromatografía de gases (CG-FID).

Preparación de las Muestras:

Psidium guajava L:

Solución madre: Se pesó 10 mg de aceite, se disolvió en 100µL de acetona (A).

Solución de estándar interno (γ-Terpineno): Se pesó 100mg de (γ-Terpineno y se disolvió en 5 mL.

Disolución problema de aceite de P. guajava: Se toma 5 µL de la solución madre, se añade 5 µL de la

solución de estándar interno y se completó volumen hasta 100 µL de acetona. Se procedió a inyectar en

el cromatógrafo de gases 1 µL de esta solución.

Eugenia axillaris (Sw.) Willd:

Solución madre: Se pesó 9,4mg de aceite, se disolvió en 100µL de acetona (A).

Solución de estándar interno (γ-Terpineno): Se pesó 100mg de (γ-Terpineno y se disolvió en 5 mL.

Disolución problema de aceite de Eugenia: Se toma 10 µL de la solución madre de Eugenia, se añade 5

µL de la solución de estándar interno y se completó volumen hasta 100 µL de acetona. Se procedió a

inyectar en el cromatógrafo de gases 1 µL de esta solución.




Melaleuca leucadendrom L:

Solución madre: Se pesó 96mg de aceite esencial, se disolvió en 1000µL de acetona (A).

Solución de estándar interno (γ-Terpineno): Se pesó 100mg de γ-Terpineno y se disolvió en 5 mL

Disolución problema de aceite de Melaleuca: Se toma 10 µL de la solución madre de Melaleuca, se añade

20 µL de la solución de estándar interno y se completó volumen hasta 1000 µL de acetona. Se procedió

a inyectar en el cromatógrafo de gases 1 µL de esta solución.

Preparación de los extractos:

Se toma 100 µL de la solución madre de cada extracto, se añade 20 µL de la solución de estándar interno

y se completó a volumen hasta 1000 µL de metanol. Se filtraron las tres muestras y se procedió a inyectar

en el cromatógrafo de gases 1 µL de esta solución.

Disolución de referencia (cineol):

Solución madre: Se pesó 100mg de cineol, se disolvió en 5mL de acetona (A).

Solución de estándar interno (γ-Terpineno): Se pesó 100mg de γ-Terpineno y se disolvió en 5 mL.

Disolución de referencia (cineol): Se toma 100 µL de la solución madre de cineol, se añade 10 µL de la

solución de estándar interno y se completó volumen hasta 1000 µL de acetona. Se procedió a inyectar en

el cromatógrafo de gases 1 µL de esta solución.

2.4.3.2. Condiciones cromatográficas:

Fase Estacionaria: Columna capilar de Silice fundida de 30 m de longitud y 0,53 mm de diámetro

interno (250 °C durante 55 min) Polimetilsiloxano 5% DB5

Fase móvil: Nitrógeno e hidrógeno para cromatografía R, como gas portador y auxiliar,

respectivamente, a un caudal de 1,3 mL/min,

Detector: Ionización por llama (T=280 °C.)

Inyector: Modo Splitless y la T=250 °C

Programa de temperatura: temperatura de la columna a 60 OC durante 1 min, luego aumentándola a

una velocidad de 2 OC por minuto hasta 120 OC por 40 min y aumentar nuevamente a razón de 10 OC

por minuto hasta 220 OC.

Se calculó la concentración (%) de cineol utilizando la ecuación de la recta teniendo en cuenta las

diluciones realizadas en cada muestra.




2.4.3.3. Validación del método.

Se evaluaron algunos parámetros de desempeño para este método, según la literatura consultada (ICH.,

2005 y Validación de métodos analíticos, (CEDMED., 2007). El procesamiento de los resultados se

realizó utilizando las posibilidades de cálculo estadístico del Microsoft Office Excel, 2003.

Linealidad

Procedimiento: Se construyeron dos curvas de calibración de cada uno de los patrones en el intervalo de

concentraciones siguiente:

Preparación del estándar interno (γ-Terpineno)

Se preparó una solución A de 100 µl de (γ-terpineno) en 5 mL de acetona, constituyendo la solución

madre, Preparación del Patrón (cineol)

Se pesó 94,9 mg del 1.8 cineol, se enrasó a 5 m l acetona constituyendo la solución madre de las cuales

se tomaron las alícuotas siguientes: Las concentraciones del patrón 1,8 cineol fueron: 25 ug/mL, 50 ug/mL,

75 ug/mL, 100 ug/mL, 125 ug/mL, 150 ug/mL, 175 ug/mL y se procedió a inyectar en el cromatógrafo de

gases.

Criterios adoptados: r: Coeficiente de correlación múltiple (Criterio ≥ 0.9900); C.V.F: Coeficiente de

variación de los factores de respuestas (Criterio < 5%); Sbrel %: Desviación stándard relativa de la

pendiente (Criterio < 2%); Error típico (Et) Desviación Standard de Y (Sy) Criterio Et < Sy; a tSa y b tSb

Límites de confianza del intercepto y de la pendiente respectivamente (Criterio: Para a Contener el cero y

para b no contenerlo). También se realizó un análisis de varianza (ANOVA) y se determinó el coeficiente

de calidad (CC) (Criterio CC < 2,5%)

Precisión

Procedimiento: Este parámetro incluyó la repetibilidad y la precisión intermedia para las muestras de los

tres aceites esenciales y los tres extractos estudiados, siguiendo la preparación de muestra descrita en el

(epígrafe 2.4.3.1.).

Para la repetibilidad se procesaron seis muestras (concentración 100%) a las cuales se les aplicó la

técnica a validar en condiciones homogéneas, un mismo analista y en un mismo día; mientras que la

precisión intermedia consistió en un procedimiento similar, con la misma concentración, realizado en

diferentes días. En ambos casos se determinó el coeficiente de variación de los resultados.




Criterios adoptados: El coeficiente de variación (CV) para la repetibilidad CV ≤ 1,5% y para la precisión

intermedia CV ≤ 3%. Para evaluar la precisión intermedia se usó, además, el Test de Cochran, el

Coeficiente de Variación de Horwitz y un análisis de varianza.

Exactitud

Procedimiento: Se utilizó el método de adición del patrón. Las muestras (concentración 10%) se analizaron

por triplicado, aplicándoles el procedimiento de muestra. Para ello se adicionaron a una cantidad conocida

de la muestra (10 %) cantidades crecientes del patrón de cineol (Concentración: 20mg/mL) 5 μL, 10 μL,

15 μL. En cada caso se completó a 100 μL con acetona. Se realizaron tres réplicas de cada una de las

concentraciones añadidas. Las concentraciones añadidas y recuperadas se representaron en un gráfico y

se evaluó el recobrado como el valor obtenido para la pendiente del mismo. Además, se calcularon los

porcentajes de recuperación para cada una de las muestras analizadas. Este parámetro se desarrolló en la

técnica de cromatografía gaseosa para los dos patrones analizados en este trabajo (cineol).

Criterio adoptado: Recobrado en el intervalo 97–103% (Fernández A., 1996).

Especificidad

Procedimiento: Se compararon los tiempos de retención de las sustancias presentes en la muestra y en el

patrón. Se midió, el ancho de la semialtura y se calcularon los factores de simetría de los picos en los

cromatogramas correspondientes a once inyecciones de patrón y once de muestras; se determinó la

media y la varianza del patrón y de la muestra, se halló la T de Student y se calculó la F de Fisher, se

compararon los valores de T y de F con los tabulados, con el objetivo de descartar posibles solapamientos

de picos. Para ello se calcularon los límites de confianza para los factores de simetría por la siguiente

ecuación.

Cálculo de los Límites de Confianza para los factores de simetría:

n

Stx

Para comparar los factores de simetría de los picos para el patrón y la muestra, se calcularon los intervalos

de confianza de dichos factores, de forma tal que unos intervalos incluyan a los otros.

Límite de detección y Límite de cuantificación

Procedimiento: Como una medida de la sensibilidad se tomó el valor de la pendiente de la curva así como

los límites de detección (LD) y límite de cuantificación (LC). Los cálculos se realizaron por el criterio de 3S




y 10S, es decir el límite de detección (LD) como la concentración de analito que produce una señal igual a

tres veces la desviación estándar del blanco (criterio 3σ de la IUPAC) bajo las condiciones experimentales

óptimas. Por su parte el límite de cuantificación (LC) la concentración de analito que produce una señal

igual a diez veces la desviación estándar del blanco bajo las condiciones experimentales óptimas. Una

vez calculados los LD y LC se comprobaron los mismos, aplicando las dos técnicas evaluadas.

2.4.4. Determinación del contenido de cineol presente en cada aceite estudiado.

Se aplicó la técnica de Cromatografía Gaseosa, descrita y validada según la metodología en el epígrafe

2.4.3 a los tres aceites y extractos obtenidos de las tres especies de Mirtáceas y se determinó el contenido

de cineol en cada muestra, aplicando la fórmula descrita en el propio epígrafe.

2.5. Determinación de la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales y los extractos

obtenidos de las tres especies de Mirtáceas estudiadas.

Este ensayo tuvo como objetivos realizar un tamizaje primario frente a cepas de referencia mediante

difusión en agar con discos cargados y determinar la Concentración Inhibitoria Mínima mediante

microdilución en caldo.

Sustancias de ensayo: Se empleó el aceite esencial y los extractos de las hojas de tres especies de

Mirtáceas: Psidium guajava L., Eugenia axillaris (Sw.) Willd. y Melaleuca leucadendrom L. y como

disolvente se utilizó el dimetilsulfóxido (DMSO) de calidad farmacéutica. Además fueron probados cuatro

metabolitos encontrados en plantas medicinales de la familia mirtáceas (1,8-cineol, Eugenol, γ-terpineno y

α-pineno), todos disueltos en el mismo disolvente que las muestras.

Microorganismos de ensayo: El estudio se realizó con cuatro cepas de bacterias, dos Gram-positivo

(Bacillus subtilis ATCC 6633 y Staphylococus aureus ATCC 25932) y dos Gram-negativo (Pseudomona

aeruginosa ATCC 27853 y Escherichia coli ATCC 25922) pertenecientes a la colección de cultivos

microbianos del Centro de Bioactivos Químicos de la Universidad Central de Las Villas. Las cepas se

encuentran en medio de conservación semisólido para garantizar su disponibilidad en el laboratorio

Medios de cultivo: Para el tamizaje primario se empleó el método difusión en agar según la norma M02-

A10 (CLSI; 2009). Se utilizó como medio de cultivo Agar de Mueller – Hinton (BioCen, Cuba), el cual se

dispensó en placas petri (Anumbra) garantizando una altura de 4 mm x placa y discos de 6 mm de

diámetro de papel de filtro Watman 3.




Controles positivos: Se emplearon discos de antibacterianos de referencia como: Ampicilina (10 ug),

Eritromicina (15 ug), Amikacina (30 ug) y Ácido nalidixico (30ug).

Control negativo: Se utilizó el disolvente DMSO.

Procedimientos y técnicas: La secuencia de las operaciones fue la siguiente:

Preparación de los medios: El agar Mueller-Hinton fue preparado de acuerdo con las instrucciones del

productor. Inmediatamente después, se esterilizaron en autoclave a 120 ºC, por 15 min. Los medios fueron

vertidos en placas Petri de 100 mm de diámetro, previamente esterilizadas, añadiéndose de 25 a 30 mL de

medio en cada una, para lograr una altura uniforme de alrededor de 4 mm.

Preparación del inóculo: El inóculo se preparó mediante una suspensión directa de colonias que se

estandarizó con el patrón 0,5 de Mc Farland. Luego de inocular las placas, se colocaron los discos

cargados con 5 µL de las muestras a su máxima concentración y se incubaron a 37°C x 18h. Transcurrido

el tiempo de incubación se midió con una regla el halo de inhibición incluyendo el diámetro del disco.

Preparación de las concentraciones de las sustancias de ensayo: Las diluciones del aceite esencial y

los extractos en DMSO se prepararon a partir de una concentración aceite esencial del 100 %. Se

prepararon concentraciones de muestras de ensayo de 25, 50 % y 100 % (aceite puro), posteriormente se

cargaron los discos con las diferentes concentraciones del aceite (Figueroa y col., 2007).

Carga de los discos: Se utilizaron discos de papel Whatman No. 3 con un diámetro de 6 mm los que se

esterilizaron en autoclave a 120 ºC por 30 min. Para el ensayo se cargó cada disco con 10 µL de cada una

de las concentraciones preparadas de las sustancias de ensayo, teniendo en cuenta que la misma es un

aceite esencial de composición variada, por lo que no todos sus componentes tienen que tener actividad

biológica, a diferencia de los productos sintéticos que cuentan con un alto porcentaje de pureza (Lizcano y

Vergara., 2008; Vukovic y col., 2007). Se colocaron en placa Petri (anumbra) y se secaron a 35 ºC por 30

min. También se prepararon discos cargados con 10µL de DMSO como blanco.

Inoculación de las placas: De los tubos que contenían la suspensión de los microorganismos

seleccionados en el medio de cultivo líquido, se embebió un hisopo de algodón previamente esterilizado,

se eliminó el exceso y estrió sobre las placas con los medios de agar, en tres direcciones con ángulos de

60º entre cada una, quedando la placa totalmente cubierta con el inóculo. Se invirtieron y colocaron en una

incubadora a 35 ºC por 15 min. Transcurrido este tiempo se colocaron 5 discos en cada placa. Un disco

con el DMSO como control negativo, otro con el antibiótico seleccionado como control positivo y tres

concentraciones diferentes de la muestra. Después de 24 horas de incubación a 35 ºC para las bacterias




fueron examinadas las placas y se midió el diámetro de la zona de inhibición incluyendo el diámetro del

disco. Valores menores de 8mm fueron considerados no activos (Alzamora y col. 2001 y Figueroa y col.,

2007).

Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

2.6. Actividad antioxidante de los extractos obtenidos de las tres especies de Mirtáceas estudiadas

Se evaluó la actividad antioxidante de los aceites esenciales y los extractos obtenidos de las tres especies

de Mirtáceas estudiadas, empleando diferentes métodos: actividad secuestradora del radical libre (DPPH),

fuerza reductora, método FRAP y el método capacidad Antioxidante total (TAOC). Fueron empleados

como controles de referencia los antioxidantes Vitamina E y Vitamina C, Eugenol y Cineol.

2.6.1. Actividad secuestradora del radical libre DPPH.

La actividad antioxidante de los extractos fue evaluada en base a la actividad secuestradora del radical

libre estable 1,1-difenil-2-picril-hidracilo (DPPH). A 3 mL de una solución de DPPH de concentración 0.004

% (p/v) fue adicionado 1 mL de cada muestra a diferentes concentraciones en metanol. Las muestras

fueron colocadas durante 30 minutos en la oscuridad y fue medida la absorbancia a 517 nm frente a un

blanco (Shimada y col., 1992). El porcentaje de inhibición del radical libre DPPT fue calculado por:

Donde: ADPPH es la absorbancia del blanco (contiene todos los reactivos excepto la muestra)

AS es la absorbancia de la muestra.

El valor de IC50 (concentración de muestra que se requiere para reducir el 50 % los radicales libres) fue

calculado empleando de la ecuación de regresión, preparada a partir de concentraciones de extractos y el

porcentaje de inhibición de la formación de radicales libres. El mismo procedimiento fue utilizado para los

antioxidantes empleados como controles de referencia. Las curvas de calibración se realizaron en el rango

de concentraciones para el Eugenol (10-50 µg/mL ), BHT (50-200 µg/mL), Vitamina C (5-50 µg/mL) y

para el cineol (200-800 µg/mL. Los ensayos fueron realizados por triplicado.




2.6.2. Fuerza reductora

La fuerza reductora de las muestras fue analizada por el método descrito por Senevirathne y col., (2006).

Una alícuota de 1 mL de cada extracto y de los antioxidantes sintéticos (concentraciones de 1,25-5,0

mg/mL en metanol) fueron mezclados con 1mL de buffer fosfato (0,2 M, pH 6,6) y 1mL de 1g/L de

ferricianuro de potasio; la mezcla fue incubada a 50 °C durante 30 min. Después de enfriar rápidamente,

fue mezclada con 1 mL de ácido tricloroacético al 10 % y centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos. A 2,5

mL de la fracción sobrenadante fue añadida 2,5 mL de cloruro férrico (FeCl3) al 0,1 %. Después de 10

minutos fue registrada la absorbancia a 700 nm.

El cineol, el eugenol y la Vitamina E fueron usados como controles de referencia. Los ensayos fueron

realizados por triplicado.

2.6.4. Capacidad antioxidante total (TAOC).

La capacidad antioxidante total (TAOC) en los extractos de las tres especies de Mirtáceas fue determinada

por el método del molibdato de amonio según el método de (Umamaheswari y Chatterjee 2008),

utilizando ácido ascórbico como sustancia de referencia.

Preparación de la curva de calibración de ácido ascórbico:

Solución madre de ácido ascórbico: Se pesó 5 mg del compuesto se disolvió en H2O destilada y se enrasó

a un volumen de 1 mL para obtener una solución madre con concentración 5 mg/mL (Disolución A). Se

pipetearon a partir de la disolución A las siguientes alícuotas: 20, 40, 60, 80, 100 µL y se completaron a

1mL con H2O destilada para completar la curva de calibración.

Procedimiento: Se tomó 300 µL de cada disolución de la curva, se adicionó 3mL de la mezcla de los

siguientes reactivos (1 mL de ácido sulfúrico 0,6M, 1 mL de fosfato de sodio 28 mM y 1 mL de molibdato

de amonio 4 mM). Las muestras se calentaron durante 90 min a 95oC, se enfriaron y se midió la

absorbancia a 695 nm, utilizando la solución preparada con el mismo procedimiento sin la muestra como

blanco.

Preparación de los extractos:

Solución madre de cada extracto: Se pipeteó 80 µL de cada disolución de los extractos de las hojas

(concentración 10 mg/mL) y se disolvió en 1 mL con metanol.

Procedimiento: Se tomó 300 µL de cada disolución de cada muestra y se siguió el mismo procedimiento

descrito para la curva de calibración del ácido ascórbico. La capacidad antioxidante total en cada extracto




se determinó en mg equivalente de ácido ascórbico/ g de extracto, utilizando la ecuación obtenida de la

curva de calibración de ácido ascórbico.

2.6.5. Determinación del poder reductor\antioxidante férrico (FRAP)

Preparación del reactivo (FRAP): 10 volúmenes de buffer fosfato 300 mM volumen de

2,4,6/tripiridil/s/triazina (TPTZ) 10 mM y 1 volumen de cloruro férrico 20 mM.

Preparación de las muestras:

Extractos: Se toman 15 µL del extracto de P. guajava, 25 µL del extracto de E. axillaris, 25 µL del extracto

de M. leucadendrom y cada uno se diluye en 1 mL de agua destilada.

Procedimiento: Se toman 200 µl de cada muestra, se le adiciona 3.8 mL del reactivo FRAP. Transcurrido 5

minutos se realiza la lectura a 593nm.

2.7. Determinación del contenido total de compuestos fenólicos.

Teniendo que en múltiples estudios se refiere que la actividad antioxidante está relacionada con el

contenido de fenoles totales, en el presente trabajo se determinó espectrofotométricamente el contenido

de estos en los extractos, utilizando el método de Folin-Ciocalteau, de acuerdo con el procedimiento

descrito por (Nurmi y col., 1996). Para ello, a 100 μL de la muestra (7,58 μg/mL en metanol) se adicionó

20 μL de reactivo Folin–Ciocalteau, 2 mL de agua y 1 mL de solución de carbonato de sodio al 15 %.

Después de 30 minutos de reacción, se midió la absorbancia a 765 nm. Las medidas fueron realizadas,

por triplicado y frente a un blanco. La recta de calibrado para la estimación de las concentraciones de

compuestos fenólicos se realizó utilizando el pirogalol (compuesto fenólico) disuelto en metanol,

empleando un rango de concentraciones comprendidas entre 1,21 a 6,06 μg/mL. El contenido de fenoles

totales en los extractos se determinó en µg equivalentes a pirogalol/mg de extracto.







Capítulo 3: Resultados y discusión 3.1. Resultados del rendimiento de aceite esencial y de extracto obtenido de cada especie

estudiada.

Para cada aceite se determinó el tiempo de destilación, siendo este de 4h, 6h y 1h, para la Psidium

guajava L., Eugenia axillaris (Sw.) Willd. y Melaleuca leucadendrom L, respectivamente. A partir de este

tiempo se mantuvo constante la cantidad de aceite esencial en el tubo graduado acoplado al colector del

destilador. Mediante el procedimiento descrito en el (epígrafe 2.3.) se obtuvo un contenido de humedad de

8.5% para las hojas secas de Psidium guajava L, un 10 % para la Eugenia axillaris (Sw.) Willd. y un 9 %

para las hojas secas de Melaleuca leucadendrom L,. Este valor fue utilizado en la determinación del

contenido de aceite en la planta, para expresar el mismo en base a droga seca.

Realizando la extracción por el método de hidrodestilación, se obtuvo un contenido de aceite esencial en

las hojas de Psidium guajava L. de 0.38%, valor similar al obtenido en Brasil por (Da Silva y col. 2003),

en las hojas de la Eugenia axillaris (Sw.) Willd. se obtuvo 0,44%, valor que no aparece reportado en la

literatura, mientras que el contenido de aceite esencial en las hojas de Melaleuca leucadendrom L. fue de

1,72 %, este valor resultó ser mayor que el obtenido por (Farag y col., 2004), para la planta cultivada en

Egipto, donde el contenido de aceite fue de 1,2 %.

Teniendo en cuenta los bajos rendimientos de aceite presentes en las hojas, las dificultades para su

obtención y la necesidad de considerar otros componentes presentes en la planta que pudieran contribuir

a las acciones farmacológicas de esta, se decidió obtener y evaluar un extracto de cada una, para lo cual

fue seleccionado como solvente la acetona, por ser de elección para los aceites esenciales y otros

componentes de posible interés como compuestos oxigenados, fenoles etc. Los rendimientos de extracto

para cada especie de planta fueron 0,43, 1,57 y 1,43 %, en base a droga seco, para la Psidium guajava L,

Eugenia axillaris (Sw.) Willd. y Melaleuca leucadendrom L, respectivamente.

3.2. Resultados obtenidos en la determinación de componentes volátiles presentes en los aceites

esenciales y extractos obtenidos de las hojas de las tres especies de Mirtáceas estudiadas.

3.2.1. Composición de los aceites esenciales.




La composición de los aceites esenciales es estudiada por un gran número de investigadores en todo el

mundo, empleando la técnica de GC-MS gracias a la volatilidad de estos compuestos (Bandoni., 2000).

Los cromatogramas obtenidos para cada aceite al aplicar la técnica GC-MS aparecen en las figuras 3.1.,

3.2. y 3.3.

RT: 0.00 - 68.03

0 10 20 30 40 50 60

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Relativ

e Abun

dance

7.38

17.71

12.47

18.95

30.95 65.2257.8653.7923.20 31.98 48.17

NL:2.46E9

TIC MS aceite_esencial_1_13julio

Figura 3.1. Cromatograma obtenido para el aceite obtenido de Psidium guajava L. al aplicar la técnica

GC-MS.




RT: 1.11 - 69.98

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

3.29

47.73

43.15

46.69

8.69

29.05

32.61

34.79

41.5735.44

25.67 48.7336.87

37.59

60.1613.90 49.38 62.90 67.34

16.98 59.7954.7212.22 17.81

NL:3.25E7

TIC MS Eugenia5-2

Figura 3.2. Cromatograma obtenido para el aceite obtenido de Eugenia axillaris (Sw.) Willd al aplicar la

técnica GC-MS.

Figura 3.3. Cromatograma obtenido para el aceite obtenido de Melaleuca leucadendrom L. al aplicar la

técnica GC-MS.

El análisis exhaustivo del espectro de masa de cada pico empleando la librería NIST, permitió identificar

los compuestos mayoritarios de cada planta, siendo 3 para el Psidium guajava, 11 compuestos para la

Eugenia axillaris y 4 para la Melaleuca leucadendrom, los cuales aparecen descritos en la Tabla 3.1 Las




pequeñas variaciones en los tiempos de retención obtenidos para los compuestos coincidentes son

debidas a la variación en las condiciones cromatográficas utilizadas, especialmente la variación en los

gradientes de temperatura para cada aceite.

Tabla 3.1. Compuestos mayoritarios identificados en los aceites esenciales de cada planta al aplicar la técnica GC-MS.

Nombre de la planta

No. Pico

Tiempo de retención

% Área RI Compuesto identificado

Psidium guajava L.

1 7,38 68,36 1024 1,8-cineol

2 12,47 9,63 1138 DL-mentol

3 17,71 12,3 1350 α-Cubebeno

Eugenia axillaris (Sw.) Willd.

1 3,79 8,27 917 α -Tujeno

2 5.35 43,5 993,8 α-Pineno

3 8.69 6,45 1042 1,8-cineol

4 25,67 1,46 1352 Eugenol

5 29,05 5,68 1378 Copaeno

6 32,61 5,46 927 Cariofileno

7 34,79 4,78 967 α -Cariofileno

8 41,19 9,19 1496 α -Selineno

9 43,15 7,56 1584 Viridiflorol

10 44,35 9,78 1647 Ƭ.-Cadinol

11 47,73 3,56 1689 Humeleno

Melaleuca leucadendrom L.

1 7,60 53,4 1031 1,8-cineol

2 12,68 15,44 1142 DL-mentol

3 20,60 6,56 944 Germacreno

4 28,28 11,86 919 Cariofileno

En los resultados obtenidos es significativo en las tres especies la presencia del Cineol, siendo el

componente mayoritario en las especies P. guajava y M. leucadendrom. Los resultados obtenidos en la

Eugenia axillaris muestran una composición compleja con una gran cantidad y variedad de compuestos.

De forma individual es importante señalar que al emplear la misma técnica analítica en el estudio de la

composición de los aceites esenciales, para el aceite en las hojas de P. guajava cultivdas en Brazil tuvo

en su componente mayoritario el 1,8 cineol, aunque en menor proporción que la obtenida por el aceite

estudiado en el presente trabajo (Da Silva y col. 2003), Por su parte el aceite obtenido de las hojas de E.

axillaris el α-Pineno constituye el componente mayoritario, seguido por el 1,8 cineol, resultados que

coinciden con los reportados por (Schmidt y col. 2006), únicos reportes del aceite de esta planta en la

literatura, mientras que para la M. leucadendrom los compuestos 1 y 2 coinciden con lo reportado en un

artículo publicado sobre la composición química del aceite de la planta cultivada en Egipto, cuyos autores




obtuvieron un 64,30 % de 1,8 cineol como el componente mayoritario y un 11,02 % de DL-mentol (Farag y

col., 2004), mientras que la única publicación que existe en Cuba sobre el aceite de esta planta cita una

composición más variada pero mantiene la coincidencia con el componente mayoritario, el 1,8-Cineol con

un 43% en área. Este comportamiento se puede justificar por la influencia, demostrada, que poseen en la

composición de las plantas factores externos como el clima, el tipo de suelo, la época de recolección, etc.

(Calcines, 1993).

Teniendo en cuenta que la determinación de los componentes de una muestra por GC-MS, empleando

como vía de caracterización las librerías de espectros, no ofrece una garantía de correcta caracterización

de dichos componentes, se procedió a obtener los perfiles cromatográficos de cada aceite por GC-FID y

ratificar con patrones analíticos disponibles la presencia de los componentes mayoritarios anteriormente

identificados, con el objetivo de buscar la relación de estos con acciones farmacológicas que serán

estudiadas para las plantas incluidas en el presente trabajo.

Estos estudios fueron extendidos a los extractos de cada planta y los resultados se muestran a

continuación.

3.2.2. Perfil cromatográfico de los aceites esenciales y extractos por GC-FID. Identificación de

componentes con el uso de patrones.

3.2.2.1. Perfil cromatográfico de los aceites esenciales.

El perfil cromatográfico de los aceites se realizó empleando la técnica de cromatografía gaseosa con

detección por Ionización por llama (GC-FID). Los perfiles obtenidos se muestran en las Figuras 3.4., 3.5. y

3.6., para los aceites obtenidos de las hojas de Psidium guajava L, Eugenia axillaris (Sw.) Willd. y la

Melaleuca leucadendrom L, respectivamente. Como se observa en la Figura 3.6, a diferencia de la

mayoría de los aceites esenciales, la cantidad de componentes presentes en la Melaleuca es muy baja

sólo se distinguen claramente pocos picos que tienen correspondencia con los compuestos presentes en

el aceite. Por su parte el aceite de la Eugenia muestra una gran cantidad de componentes. En la Tabla 3.2

se muestran los tiempos de retención obtenidos para cada pico en ambos cromatogramas.

.





Figura 3.4. Cromatograma GC del aceite esencial de las hojas de Psidium guajava L.

Figura 3.5. Cromatograma GC-FID del aceite esencial de las hojas de Eugenia axillaris (Sw.) Willd.




Figura 3.6. Cromatograma GC del aceite esencial de las hojas de Melaleuca leucadendrom L.

Tabla 3.2. Tiempos de retención obtenidos en los cromatogramas de los tres aceites estudiados.

No. Pico

Psidium guajava L Eugenia axillaris (Sw.)

Willd. Melaleuca leucadendrom L

t. retención (min) t. retención (min) t. retención (min)

1 - 3.58 3.58

2 6.6 6.6 6.59

3 - 8.06 8.05

4 10,42 10.32 10.27

5 - 14.69 -

6 - 15.84 -

7 - 16.65 -

8 - 17.37 -

9 - 18.11 -

10 18.85 18.85 18.85

11 - 29.01 -

12 31.52 32.41 -

13 34.82 34.27 -

14 37.12 36.95 -

Los perfiles cromatográficos de los aceites de la M. leucadendrom y el P. guajava poseen cromatogramas

muy limpios con un componente mayoritario, cuya cuantía en el aceite es muy superior a los restantes




componentes, el 1,8 cineol. Por su parte el aceite de E. axillaris posee 14 componentes entre los cuales

hay dos que se destacan como los mayoritarios, dan muestra de tres aceites que difieren

significativamente en su composición en cuanto a la cantidad de compuestos presentes en cada aceite.

Sin embargo, es representativo que los compuestos presentes en la M. leucadendrom y en el P. guajava

se encuentran también presentes en la E. axillaris, algo aceptable si se tiene en cuenta que son plantas de

la misma familia.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en los estudios GC-MS se seleccionaron los patrones: α-

pineno, 1,8 cineol, alcanfor, DL-mentol y Eugenol, los cuales al aplicar la técnica GC, bajo las mismas

condiciones cromatográficas que la muestra, aportaron los cromatogramas que se muestran en las figuras

3.7 A-E.

min4 6 8 10 12 14 16 18

pA

0

2500

5000

7500

10000

12500

15000

17500

20000

FID1 A, (YAMIRI\PATRONES\PINENE000220.D)

6.832

A: α-Pineno (tr=6,8)

min6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

pA

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

FID1 A, (YURIAM\CINEOLA000043.D)

10.387

B: 1,8 Cineol (tr=10,4)

min5 10 15 20 25 30

pA

70

80

90

100

110

120

FID1 A, (YAMIRI\ALCANFORA100694.D)

15.51

5

C: Alcanfor(tr=15,5)

min6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

pA

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

FID1 A, (YURIAM\DL-MENTOL000041.D)

18.825

D: DL-Mentol (tr=18,8)




min5 10 15 20 25 30

pA

0

50

100

150

200

250

300

350

400

FID1 A, (YAMIRI\EUGENOL2B000548.D)

29.037

E: Eugenol

Figura 3.7. Cromatograma de los patrones evaluados, obtenidos al aplicar la técnica GC.(A: α-Pineno;

B:1,8 cineol; C:Alcanfor; D:DL-Mentol y E: Eugenol.

Al evaluar la coincidencia de los tiempos de retención de cada patrón en el cromatograma obtenido para

cada aceite esencial se pudo reafirmar la presencia del α-Pineno, 1,8 cineol y el DL-mentol en los tres

aceites estudiados, mientras que el alcanfor y el eugenol solo está presente en el aceite obtenido de las

hojas de la Eugenia axillaris (Sw.) Willd.

3.2.2.2. Perfil cromatográfico de los extractos

Con el objetivo de comparar la composición, en cuanto a componentes volátiles, del extracto obtenido y el

aceite esencial de cada planta se obtuvo el perfil cromatográfico de cada extracto aplicando iguales

condiciones cromatográficas.

La Figura 3.8 muestra el cromatograma obtenido para el extracto de P. guajava. Al comparar este con el

cromatograma del aceite (Figura 3.4) se observa la aparición de cuatro picos adicionales en el

cromatograma del extracto y una coincidencia en los tiempos de retención para el α-Pineno y 1,8 cineol.




min5 10 15 20 25 30 35

pA

80

100

120

140

160

180

200

220

FID1 A, (YURIAM\GUAYABA7R000080.D)

6.946

8.474

10.38

1 10.78

8

19.58

0

26.52

2

29.89

4

35.29

7

38.88

7

Figura 3.8. Cromatograma obtenido para el extracto de P. guajava, aplicando la técnica GC.

El cromatograma obtenido para el extracto de E. axillaris (Figura 3.9) muestra un incremento significativo

de picos con respecto al cromatograma del aceite esencial obtenido de las hojas de esta planta (Figura

3.5), observándose una coincidencia en los tiempos de retención de los compuestos α-Pineno, 1,8 cineol y

el eugenol.

min5 10 15 20 25 30 35

pA

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

FID1 A, (YAMIRI\EUGENIA10000325.D)

1.08

5 1.

124

1.16

3

6.86

7 7.

094

8.07

2

9.90

6 10.34

9

11.77

4

16.07

6 16

.760

17.45

1

18.94

7

29.03

8

31.50

2 32.49

3

34.34

1

37.03

5

39.59

6 40

.148

Figura 3.9. Cromatograma obtenido para el extracto de E. axillaris, aplicando la técnica GC.




La Figura 3.10 muestra el cromatograma obtenido para el extracto de M. leucadendrom. Al comparar este

con el cromatograma del aceite (Figura 3.6) se observa una coincidencia en los tiempos de retención para

el 1,8 cineol, apareciendo cinco picos adicionales que no pudieron ser identificados por falta de patrón.

min5 10 15 20 25 30 35

pA

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (YURIAM\YADIRA7000057.D)

6.932

10.76

3

19.52

5

29.85

0

35.24

5

38.81

5

Figura 3.10. Cromatograma obtenido para el extracto de M. leucadendrom, aplicando la técnica GC

De forma general en la comparación de los perfiles cromatográficos de aceites esenciales y extractos de

cada planta aportó la aparición de nuevos picos en el cromatograma de los extractos que poseen una

mayor variedad y cantidad de componentes, aunque se hace evidente la coincidencia de compuestos en

ambas extracciones. Este resultado debe ser tenido en cuenta al evaluar las actividades farmacológicas de

uno u otro producto.

La presencia del 1,8-Cineol como compuesto mayoritario en los aceites y extractos evaluados del P.

guajava y la M. leucadendrom, así como la presencia en la especie E. axillaris constituyó una buena razón

para decidir su cuantificación en estas muestras y buscar una posible relación de este metabolito con las

acciones farmacológicas que serán estudiadas en las plantas. A continuación se exponen los resultados

de esta determinación.

3.3. Determinación cuantitativa del contenido de cineol en los aceites esenciales y extractos

obtenidos de las tres especies estudiadas.

Varios miembros de la familia Mirtácea han sido estudiados por su potente acción antimicrobiana,

resaltándose su uso en enfermedades de la piel provocadas por varias bacterias resistentes entre los que

se cita el Staphylococcus aureus (MRSA, siglas en inglés). Las especies C. operculatus, Eugenia globulus,




Melaleuca alternifolia son algunos de los ejemplos que se pueden citar. Estas plantas poseen como

metabolitos principales el 1,8-cineol y el terpineol a los cuales se les pudiera atribuir la acción citada, ya

que para los mismos aparecen reportes que justifican esta razón (Loughlin, 2008,); (McMahon, 2008) y

(Gudrun, 2011). Teniendo en cuenta lo anterior resulta de gran importancia evaluar en los aceites

estudiados la presencia y el contenido de estos metabolitos, con vistas a su posible uso en el campo

farmacéutico.

Una vez obtenidos los cromatogramas de cada aceite (Figuras 3.4-3.6), extractos (Figuras 3.8-3.10),

tomando como referencia el cromatograma del patrón de cineol y el γ-terpineno como estándar interno

(tr=11.7. (Figura 3.11.) se procedió a la validación de dicha técnica, aplicando las normas del CECMED,

2007

min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

pA

200

400

600

800

1000

FID1 A, (YAMIRI\CINEOL10000448.D)

1.108

1.173

3.581

10.28

0

11.77

0

Figura 3.11. Cromatograma GC correspondiente al cineol (tiempo de retención (tr) = 10,28) y el γ-

terpineno (tiempo de retención (tr) = 11,77).

3.3.1. Validación de la técnica cromatográfica (GC) para la determinación de 1,8-Cineol.

Linealidad

La Figura 3.12 muestra la curva de calibración obtenida al evaluar el parámetro linealidad en la técnica

cromatografía gaseosa usada para la determinación de cineol en los aceites esenciales. Los criterios

estadísticos utilizados para evaluar el parámetro aparecen en la Tabla 3.3. Si se comparan los valores

obtenidos en cada parámetro con los criterios establecidos por las normas ICH (2005a y b), se puede

afirmar que en todos los casos se encuentran dentro del intervalo especificado. La ecuación de la recta

obtenida fue Área=0.509*Conc–0.0438 con un coeficiente de correlación de 0.99, un coeficiente de




variación de los factores respuesta 4.2 (inferior al 5%) y una desviación estándar de la pendiente de

0.025 (menor que el 2 %). La fiabilidad de la ecuación se evaluó, además, a través del error típico cuyo

valor es muy inferior a la desviación estándar de la variable Y. Finalmente se determinó el coeficiente de

calidad que resultó ser muy inferior a 2,5 (1,18 E-06) por lo que se puede plantear que el método es

lineal en el rango de concentración evaluado.

Figura 3.12. Curva de calibración para la determinación de cineol en aceites esenciales, empleando la

GC.

Tabla 3.3. Resultados de los criterios estadísticos utilizados para evaluar la linealidad en la técnica de GC.

Parámetro Valor obtenido Criterio Establecido

Ecuación de la recta Área=0.509X-0.04387

ri;

Coeficiente de correlación 0.998 ri ≥ 0,99

C.V.F: Coeficiente de variación de los factores de respuestas.

4.2% C.V.F ≤ 5%

Sbrel %: Desviación estándar relativa de la pendiente.

0.0256% Sbrel %≤ 2%

Error típico de la regresión 0≤0.0034≤0.6 0 ≤ Error típico ≤ Sy (Sy desviación Estándar de Y)

Intervalo de confianza del intercepto

+29.2 -29.14

Incluir el cero

CC: Coeficiente de calidad 1,18 E-06 CC<2,5%

Precisión

Este parámetro incluye los términos repetibilidad y precisión intermedia. Para el primer caso la técnica se

repitió sin alterar las condiciones, mientras que en el segundo la técnica se desarrolló en diferentes días.




La Tabla 3.4 muestra los resultados estadísticos obtenidos al evaluar ambos parámetros. El coeficiente de

variación obtenido para la repetibilidad (1,48 %) resultó ser menor que el establecido para este ensayo

cuando es realizado a materias primas farmacéuticas (1,5 %) lo que indica que la técnica posee buena

repetibilidad. Por su parte en la precisión intermedia se obtuvo también un coeficiente de variación (2.02

%) inferior al establecido (3 %), además, en este parámetro se evaluaron otros parámetros estadísticos

que garantizan la veracidad de los resultados y cuyos estadígrafos aparecen también reflejados en la

misma tabla.

El análisis de varianza realizado muestra que no hay diferencias significativas entre los grupos al

obtenerse en la prueba Fischer una Fcal < CCrítica. Esto es ratificado por el Test de Cochrans (Ccal.=

0,59) en el cual se obtuvo una Ccal < CCrítica. Finalmente el Coeficiente de variación entre los grupos (CV

(%) = 2.09) resultó ser menor que el valor obtenido para el coeficiente de variación de Horwitz (3.83)

ratificando con esto la veracidad del resto de las pruebas.

Los resultados obtenidos en ambos parámetros permiten asegurar que la técnica de Cromatografía

Gaseosa es “precisa” para la determinación de cineol en los aceites esenciales y extractos.

Tabla 3.4. Resultados estadísticos obtenidos al evaluar el parámetro precisión en la técnica de GC.

REPETIBILIDAD

Réplica 1 (Am/AsI) Parámetros estadísticos

1,38

1,364 Media 1,358

1,368 SD 0,020

1,329 CV (%) 1,48

1,336

1.369

PRECISIÓN INTERMEDIA

Dia 1 (Am/AsI) Dia 2 (Am/AsI) Dia 3 (Am/AsI)

1,38 1,381 1,316

1,364 1,282 1,36 Media 1,345

1,368 1,312 1,345 SD = 0,027

1,329 1,317 1,365 CV (%) = 2,02

1,336 1,336 1,369 Horwitz = 3,83

1,369 1,329 1,352

Dentro de los Grupos S =0,025% ; CV(%) = 1,84

Entre los Grupos S =0,028% ; CV(%) =2,09




Cochrans (C calculada)= 0,23 Cochrans (C crítica) 0,59

Horwitz 3,83

Exactitud

Existen diferentes procedimientos para evaluar la exactitud de un método. Cuando se trabaja con matrices

complejas, como es el caso de los productos herbarios, cualquiera sea su forma de presentación, el

procedimiento de adición de estándar es de gran utilidad, siempre que se cuente con el apropiado

marcador químico o metabolito mayoritario de interés. En el presente estudio se cuenta con el cineol como

patrón. Según el método de adición de estándar la recuperación obtenida fue de 103,7 % en

correspondencia con la pendiente de la curva de recuperación con el siguiente modelo matemático: y =

1,013X+0,034 (Figura 3.13.).

Estos valores demuestran una elevada exactitud en las determinaciones de cineol, con el procedimiento

utilizado. Para confirmarla, se aplicó una prueba t de Student. Al ser texp< ttab no existen diferencias

significativas entre recuperación media y 100, por lo que el método es exacto.

Figura 3.13. Curva de recuperación para la técnica GC.

Especificidad

La inyección del blanco, demostró la no existencia de interferencias al tiempo de retención de las

sustancias presentes en la muestra (Figura 3.13.) Si se compara el pico cromatográfico del patrón de




cineol (Figura 3.11.) con el pico correspondiente en la muestra bajo las condiciones óptimas de análisis, no

se observaron a simple vista colas, frentes difusos ni hombros y se puede inferir que no debe existir

solapamientos de picos. Tampoco se observaron variaciones significativas en los tiempos de retención, los

cuales se mantienen dentro de un intervalo de ± 2%.

min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

pA

0

500

1000

1500

2000

2500

FID1 A, (YAMIRI\BLANCO3000488.D)

0.13

5 0.80

1 1.

101

1.15

5

2.07

9

2.98

4 3.57

9

Figura 3.14. Cromatograma GC correspondiente al blanco.

Estos resultados muestran la no existencia interferencias apreciables que puedan afectar la determinación

confiable del cineol en los aceites esenciales y extractos. Sin embargo, con vistas a ratificar los mismos se

analizaron los factores de simetría de picos del patrón y las muestras de aceites y extractos en estudio.

Los intervalos de confianza de los factores de simetría de los picos para el patrón y la muestra, se incluían

entre sí. Para el patrón estos intervalos van desde 1,073 hasta 1,46 y en el caso de la muestra los

intervalos oscilan desde 1,15 hasta 1,37 (Tabla 3.5.).

Tabla 3.5. Resultados estadísticos al calcular el intervalo de confianza del cineol (patrón y muestra)

Patrón Muestra

x

= 1,41 x

= 1.11

t = 1,83 t = 1,83

S = 0,13 S = 0,11

n = 10 n = 10




Límite de detección (LD) y de cuantificación (LC).

Los resultados del LD y LC para el cineol se recogen en la Tabla 3.6. Como límite de detección para el

cineol se obtuvo un valor de 0,25 µg/mL y como límite de cuantificación 0.60 µg/mL, valores que se

encuentran por debajo del valor más bajo de concentración evaluado en la técnica, la cual incluye un

intervalo amplio de concentración, teniendo en cuenta la variabilidad de este componente en los diferentes

aceites esenciales.

Tabla 3.6. Resultados obtenidos del LD y LC para el cineol en la técnica GC.

Resp. Blanco (Am/ASI)

Media Desv. Estándar

Pendiente Límite de detección (LD) (µg/mL)

Límite de cuantificación (LC) (µg/mL)

2,30 2,32

0,01

0,509

0,25

0,60

2,33

2,32

2,32

Teniendo en cuenta el cumplimiento de todos los parámetros de desempeño, la técnica analítica es fiable y

por tanto se concluye que la técnica analítica GC-FID puede ser utilizada en la determinación cuantitativa

de cineol en los aceites esenciales.

3.3.2. Aplicación de la técnica validada a la determinación de cineol presente en los aceites y

extractos obtenidos de las especies de mirtáceas estudiadas en el presente trabajo.

Una vez validada la técnica se aplicó en la determinación del contenido de cineol presente en las muestras

de aceite esencial y extractos obtenidos de las hojas de las tres especies de plantas evaluadas, cultivadas

en la zona central de Cuba. La Tabla 3.7 muestra los valores promedios de este compuesto obtenido para

las especies. Como se observa las especies M. leucadendrom y P. guajava poseen mayor contenido de

cineol que la E. axillaris tanto en el aceite esencial como en los extractos, lo que debe lograr un

comportamiento farmacológico similar para estas plantas si se tienen en cuenta que para ambas este es el

metabolito mayoritario.

Tabla 3.7. Valores promedios del porcentaje de cineol presente en las especies de Mirtáceas.

Muestra Psidium guajava L.

Eugenia axillaris (Sw.) Willd.

Melaleuca leucadendrom L.

Aceite Esencial 0,37± 0.025 0,04 ± 0,01 0,44 ± 0,014

Extractos 0,56±0.025 0,28 ± 0,14 0,63 ± 0,045




3.4. Determinación de la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales y los extractos

obtenidos de las tres especies de Mirtáceas estudiadas.

Los resultados del tamizaje primario realizado frente a bacterias Gram positivas aparecen reportado en la

Tabla 3.8 y en la Figura 3.15. Como se observa frente a bacterias Gram positivas, Bacillus subtilis ATCC

6633 y Staphylococcus aureus ATCC 25923, los aceites esenciales de Guayaba y Cayeput tuvieron

actividad frente al primero, no así frente al segundo, mientras que el aceite esencial de la Eugenia no

mostró actividad frente a las bacterias Gram positivas. Por su parte los tres extractos resultaron activos

frente a estos dos microorganismos. La evaluación de los patrones aportó que el eugenol manifestó

actividad frente al Bacillus subtilis ATCC 6633 y frente al Staphylococcus aureus mostraron actividad,

además, el Cineol y el α- pineno (Figura 3.15.). El diámetro de la zona de inhibición de los antibacterianos

de referencia fue superior al mínimo reportado por el CLSI en su norma M100-S20.

Tabla 3.8. Resultados del tamizaje primario realizado a aceites esenciales y extractos frente a bacterias Gram positivas.

Producto Bacillus subtilis ATCC 6633 Halo (mm)

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Halo (mm)

AE-Guayaba 9 N.S

AE-Eugenia N.S N.S

AE-Cayeput 10 N.S

Ext-Guayaba 10 11

Ext-Eugenia 10 10

Ext-Cayeput 10 11

Eugenol 17 16

Cineol N.S 8

α-Pineno N.S 8

Terpineol N.S N.S

DMSO N.S N.S

Eritromicina 20 29

Ampicilina No evaluado 31

Leyenda: N.S. no sensible, 0mm. Ext: Extracto. AE: Aceite esencial




Figura 3.15. Resultados del tamizaje primario realizado a aceites esenciales y extractos frente a bacterias Gram positivas. Leyenda P1: 1, Eritromicina; 2, AE Guayaba; 3, AE Eugenia; 4, AE Cayeput. P2: 1, Extractos:1 Eugenia; 2, Guayaba; 3, Cayeput; 4, Eugenol P3: 1, DMSO; 2, Cineol; 3, α-Pinene; 4 Terpineol; Eugenia 100ug Los resultados del tamizaje primario realizado frente a bacterias a bacterias Gram negativas aparecen

reportado en la Tabla 3.9 y en la Figura 3.16. Frente a la Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

mostraron actividad los extractos de Eugenia, Guayaba y Cayeput, así como el patrón Eugenol, mientras

que frente a Escherichia coli ATCC 25922 solamente tuvieron actividad los patrones Eugenol y Terpinol.

Según la norma M100-S20 el ácido nalidixico es sensible frente a enterobacterias cuando el diámetro de la

zona de inhibición es mayor a 19 mm y la Amikacina es sensible frente a Pseudomonas aeruginosa

cuando el diámetro de la zona de inhibición es mayor que 17 mm. Teniendo en cuenta los resultados de

este ensayo ambos antibacterianos mostraron diámetros de inhibición del crecimiento bacteriano

superiores al mínimo establecido por la norma demostrando la sensibilidad de las cepas bacterianas

ensayadas.




Tabla 3.9. Actividad de las muestras evaluadas frente a bacterias Gram negativas. .

Producto Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Halo (mm)

Escherichia coli ATCC 25922 Halo (mm)

AE-Guayaba N.S N.S

AE-Eugenia N.S N.S

AE-Cayeput N.S N.S

Ext-Guayaba 11 N.S

Ext-Eugenia 9 N.S

Ext-Cayeput 9 N.S

Eugenol 7 14

Cineol N.S 10

α-Pinene N.S 0

Terpineol N.S 17

DMSO N.S N.S

Amikacina 23 No evaluado

Ácido Nalidixico No evaluado 30

Leyenda: N.S. no sensible, 0mm. Ext: Extracto. AE: Aceite esencial

Figura 3.15. Resultados del tamizaje primario realizado a aceites esenciales y extractos frente a bacterias Gram negativas. Leyenda: P1: 1, Amikacina o Ácido nalidixico; 2, AE Guayaba; 3, AE Eugenia; 4 AE Cayeput. P2: Extractos: 1, Eugenia; 2, Guayaba; 3, Cayeput; 4, Eugenol P3: 1, DMSO; 2, Cineol; 3, a-Pinene; 4 Terpinol; Eugenia 100ug.




Los resultados anteriormente expuestos relacionados con la actividad antimicrobiana permiten asegurar

que los extractos de las tres Mirtáceas poseen buenas potencialidades como antimicrobianos, no así los

aceites esenciales, para los cuales está bien disminuida esta actividad.

3.5. Resultados de la evaluación de la actividad antioxidante de los extractos obtenidos de las tres

especies de Mirtáceas estudiadas.

Como etapa inicial de la evaluación de la actividad antioxidante fue determinada en cada muestra el

contenido fenólico, lo que se explica porque múltiples reportes dan cuenta de la relación directa entre la

actividad antioxidante y el contenido fenólico total presente en las muestras obtenidas de plantas

medicinales (Singh y col., 2008). Esta actividad fue evaluada en los extractos obtenidos de las tres

especies de Mirtáceas estudiadas frente a los antioxidantes BHT, Vitamina E y C, eugenol y cineol por

diferentes métodos: actividad secuestradora del radical libre DPPH, fuerza reductora, método del

tiocianato férrico (FTC), poder reductor\antioxidante férrico (FRAP) y actividad antioxidante total.

3.5.1. Cuantificación de los compuestos fenólicos – método de Folin-Ciocalteu.

El ensayo espectrofotométrico desarrollado por Folin-Ciocalteau se utiliza para determinar los compuestos

fenólicos totales. Se fundamenta en una reacción de oxidación/reducción que es el mecanismo básico;

gracias al carácter reductor del reactivo Folin-Ciocalteau (3H2O-P2O513WO3-5MoO3-10H2O:

Heteropolianión molibdofosfowolfrámico) en el cual el Mo (VI) es reducido a Mo (V) con un e- donado por

un antioxidante. Mo (VI) (amarillo) + e- (de AH) → Mo (V) (azul) (Boveris, 1976). El contenido total de

compuestos fenólicos fue calculado empleando la curva de calibración del Ácido Gálico (Figura 3.17.)

como mg de ácido gálico/g de extracto (mg AGE/g de extracto).




Figura 3.17. Curva de Calibración del Ácido Gálico. Como resultado se obtuvo que el contenido total de compuestos fenólicos para cada extracto fue: para el

extracto del Psidium guajava de 259,2 ± 0,56 mg de ácido gálico equivalentes/g de extracto, superior al

obtenido para los extractos de la Eugenia axillaris y la Melaleuca leucadendrom, en los cuales se obtuvo

108,6 ± 1,86 y 90,3 ± 0,94 mg de ácido gálico equivalentes/g de extracto, respectivamente. Estos

resultados sugieren que el extracto de Psidium guajava debe mostrar mayor actividad antioxidante. Estos

valores obtenidos son específicos para cada extracto y no se encuentran reportados en la literatura para

estas plantas.

Al comparar el valor del contenido fenólico obtenido con los valores reportados para otros extractos de

plantas medicinales, se observa que estos valores varían en gran medida para plantas de diferentes

especies, familias etc. Lo anterior se puede observar al comparar los resultados obtenidos con los valores

descritos para varias plantas en la Tabla 3.10. Como se observa en los extractos evaluados los resultados

obtenidos para las hojas de las tres especies estudiadas superan considerablemente los valores

reportados para las especies de Lavanda (Messaoud., 2011), mientras que los extractos de la Melaleuca y

la Eugenia poseen valores similares al Satureja montana (Serrano., 2011) e inferior con respecto a los

valores obtenidos para la Rosa micrantha. El extracto del Psidium guajava superó en contenido fenólico a

las plantas citadas y su valor es inferior al obtenido para la Rosa micrantha, considerándose por tanto el

más enriquecido con estos metabolitos.




Tabla 3.10. El contenido fenólico total del extracto de algunas plantas medicinales publicado en la literatura.

Nombre de planta Contenido fenólico total reportado (mg/g)

Referencias bibliográficas

Satureja montana (Ext. Etanólico) 111,18 ± 1,59 Serrano, 2011

Rosa Micrantha (Ext. Metanólico-Pétalos)

424,20± 31,77 Guimaraes, 2010

L.coronopifolia 31,20±4,67 Messaoud, 2011

N. bettonicifolia 25,20±8,3 Messaoud, 2011

L. stoechas 25,30±6,56 Messaoud, 2011

3.5.2. Actividad secuestradora del radical libre DPPH.

En este ensayo se procesaron las curvas de calibración correspondientes a cada uno de los patrones

antioxidantes utilizados (BHT, Eugenol, Cineol y Vitamina C) y los extractos, de las cuales se obtuvo las

ecuaciones de las rectas y el coeficiente de correlación para cada caso. La Figura 3.18 muestra las curvas

obtenidas para los patrones antioxidantes (A: BHT; B: Eugenol; C: Cineol y D: Vitamina C), mientras que la

Figura 3.19 muestra las curvas obtenidas para los extractos evaluados (D: Extracto de Guayaba; E:

Extracto de Eugenia; F: Extracto de Cayeput). Como se obseva la actividad secuestradora se incrementa

con el aumento de la concentración de la muestra debido a la reacción de donación de electrones entre las

moléculas de antioxidante y los radicales libre (Huang., 2005), estas curvas permitieron determinar el valor

de IC50 para cada muestra, utilizando el método de Litchfield and Wilcoxon, valores que aparecen

descritos en la Tabla 3.11. Los bajos valores de IC50 indican alta actividad secuestradora de radicales

libres.

A

B




C

D

Figura 3.18. Curvas de calibración obtenidas para los patrones evaluados en el ensayo de la actividad secuestradora del radical libre DPPH (A: BHT; B: Eugenol; C: Cineol y D: Vitamina C).

D

E

F

Figura 3.19. Curvas de calibración obtenidas para los extractos evaluados en el ensayo de la actividad secuestradora del radical libre DPPH (D: Guayaba; E: Eugenia; F: Cayeput).




Tabla 3.11. Resultados de la actividad secuestradora del radical DPPH para los extractos y patrones evaluados.

Muestras Concentración

(μg/mL) Inhibición (%)

IC50 (μg/mL)

Vitamina C

5 10,26

5,4 7,5 53,28

9 79,48

12 94,64

Cineol

200 40,79

230,1 250 55,04

300 74,01

350 48,54

BHT

50 13,74

128,4

80 23,32

127 35,96

162 46,07

200 59,07

232 13,74

Eugenol

10 25,75

29,0

20 35,72

30 45,79

40 54,92

50 61,56

Extracto Psidium guajava

0,2 80,97

0,48 0,4 82,90

0,6 85,10

0,8 87,74

Extracto de Eugenia axillaris

3,85 63,87

10,8 7,7 71,10

11,6 76,32

15,4 87,81

Extracto Melaleuca

leucadendrom

14 67,23

35,7 28 76,77

42 83,35

56 92,97

Si se tiene en cuenta que los bajos valores de IC50 obtenidos para los patrones de antioxidantes son

representativos de una marcada actividad antioxidante se puede inferir que la actividad antioxidante de los

tres extractos evaluados es muy buena para las concentraciones estudiadas, por este mecanismo de

acción antioxidante. El valor obtenido de IC50 para el extracto de la Psidium guajava permite afirmar que




este extracto posee una alta actividad antioxidante, siendo superior a la Vitamina C, compuesto

antioxidante de referencia.

El efecto secuestrador del radical DPPH de las muestras estudiadas se resume en el siguiente orden:

Extracto Psidium guajava > Vitamina C >Extracto de Eugenia axillaris > Eugenol > Extracto

Melaleuca leucadendrom >BHT > Cineol.

Los altos valores de la actividad antioxidante en los extractos permiten proponer la valoración de estas

plantas para su uso en la industria farmacéutica, cosmética y alimentaria.

3.5.3. Fuerza reducida.

La determinación de la fuerza reducida de los compuestos presentes en la muestra se lleva cabo por la

reducción de Fe3+a la forma de Fe2+, el color amarillo de la solución examinada cambia en varios tonos de

verde tinto o azul prusiano dependiendo en fuerza reducida de cada muestra. A mayor valor de la

absorbancia, mayor será la fuerza reducida. En la Tabla 3.12 se muestran los valores de la absorbancia de

los antioxidantes patrones y los extractos evaluados en el sistema de fuerza reducida.

Tabla 3.12. Valores de la absorbancia de los patrones antioxidantes y los extractos evaluados en el sistema de fuerza reducida.

Concentración (mg/mL)

Valores de absorbancia

Vitamina E Cineol Eugenol Extracto Psidium guajava

Extracto de

Eugenia axillaris

Extracto Melaleuca leucadendrom

1,25 0,296 0,182 0,586 0,97 1,53 0,23

2,5 0,907 0,64 1,167 2,29 2,22 0,79

3,75 1,437 0,923 1,487 2,63 2,68 1,07

5 2,464 1,745 1,965 3,23 3,19 1,92




Figura 3.20. Efecto antioxidante de los patrones antioxidantes y los extractos evaluados en el sistema de fuerza reducida. En la Figura 3.20. se describe el efecto antioxidante de los patrones antioxidantes y los extractos

evaluados en el sistema de fuerza reducida. Es de destacar que los mejores resultados se obtienen para

los extractos de guayaba y de Eugenia, superiores incluso a los patrones antioxidantes, quedando muy por

debajo el extracto de cayeput que posee actividad antioxidante similar al cineol. El efecto antioxidante en

el sistema fuerza reducida de las muestras estudiadas se resume en el siguiente orden:

Extracto Psidium guajava ≈ Extracto de Eugenia axillaris > Eugenol > Vitamina E > Extracto cayeput >cineol.

3.5.4. Determinación del poder reductor\antioxidante férrico (FRAP)

La determinación del poder reductor\antioxidante férrico (FRAP) fue calculado empleando la curva de

calibración de Sulfato de Hierro II (Figura 3.21) y está expresado en mmol de FeSO4 equivalentes por

gramo de extracto. Los resultados obtenidos para este ensayo se reflejan en la Figura 3.22 donde se

observa con claridad que los mejores resultados fueron obtenidos para el extracto de Guayaba, seguido

por el extracto de Eugenia y el de Cayeput. Lo anterior muestra que el extracto con mayor poder reductor

tiene mayor potencial que el resto para reducir el ion férrico a ion ferroso.




Figura 3.21. Curva de calibración del Sulfato de Hierro II

Figura 3.22. Comportamiento del poder reductor\antioxidante férrico (FRAP) de los extractos

3.5.5. Capacidad antioxidante total.

La capacidad antioxidante total fue calculada empleando la curva de calibración del Ácido ascórbico

(Figura 3.23.).

Figura 3.23. Curva de calibración del Ácido Ascórbico o Vitamina C

A partir de la ecuación de la recta se determinó la capacidad antioxidante total obtenida para cada extracto

(Figura 3.23), como se observa el extracto de Psidium guajava mostró la mayor actividad antioxidante con

un valor de 20,2 mg de ácido ascórbico equivalentes /g de extracto, seguido por el extracto de Cayeput y

el de Eugenia, en los cuales se obtuvo 5,21 y 1,63 mg de ácido ascórbico equivalentes/g de extracto,




respectivamente. Estos resultados se corresponden totalmente con los resultados obtenidos en los

ensayos de DPPH y FRAP. Estos valores son específicos para cada extracto y no se encuentran

reportados en la literatura para esta planta.

Figura 3.24. Actividad antioxidante total de los extractos obtenidos de las hojas de las tres especies de

Mirtáceas evaluada.

3.5.6. Relación entre el contenido fenólico total con la actividad antioxidante evaluada en el presente trabajo, a través de diferentes ensayos.

Múltiples reportes dan cuenta de la relación directa entre la actividad antioxidante y el contenido fenólico

total en los extractos de plantas medicinales.(Singh et al., 2008a).

La (figura 3.25A) muestra la curva de regresión que permite correlacionar el contenido fenólico con la

actividad antioxidante, mientras que la (Figura 3.25B) muestra la curva de regresión que permite

correlacionar el contenido fenólico con el poder reductor\antioxidante férrico (FRAP). En ambos casos se

observa una excelente relación entre ambos parámetros para los tres extractos evaluados, el extracto de

la guayaba posee el mayor contenido fenólico y en correspondencia la mayor capacidad antioxidante,

seguido en orden por el extracto de la Eugenia y el extracto de Cayeput. Estos resultados tienen total

correspondencia con los resultados obtenidos para los restantes ensayos antioxidantes incluidos en el

presente trabajo.




A

B

Figura 3.25. Relación entre el contenido fenólico total con el poder reductor y la capacidad antioxidante

total en los extractos evaluados.

Conclusiones 1- El contenido de aceites esenciales en las hojas de Psidium guajava L fue 0,38%, para la

Melaleuca leucadendron L de 0,44% y para la Eugenia axillaris resultó ser; y 1,72%, mientras que

el rendimiento de los extractos fue 0,43, 1,57 y 1,43 %, en base a droga seco, respectivamente.

2- El perfil cromatográfico de los extractos y aceites obtenidos de las tres especies, confirma la

presencia de 1,8 cineol, siendo este metabolito mayoritario en las en las especies P. guajava y M.

leucadendrom.

3- La técnica GC-FID resultó ser fiable para la determinación cuantitativa de cineol en el aceite y los

extractos y al aplicarla se comprobó que el contenido de este metabolito en las muestras de M.

leucadendrom es superior a las restantes especies evaluadas.

4- .Los resultados obtenidos en la evaluación de la actividad antimicrobiana demuestran que los

extractos de las tres Mirtáceas poseen buenas potencialidades como antimicrobianos, muy

superior a los aceites esenciales obtenidos de estas plantas.

5- Los extractos de Psidium guajava muestran un alto poder antioxidante en comparación con la

Vitamina C, antioxidante de referencia de mejores resultados; mientras que los extractos de

Eugenia axillaris y de Melaleuca leucalendron superan los patrones BHT y cineol.

Recomendaciones



Recomendaciones



Recomendaciones

1. Continuar los estudios de la composición de aceite y extractos de estas especies, hasta lograr

identificar todos los componentes presentes en los mismos.

2. Realizar otros ensayos antioxidantes in vitro e in vivo, que permitan llegar a conclusiones

definitorias con respecto a esta actividad.

3. Determinar la Mínima Concentración inhibitoria para todas las muestras evaluadas con resultados

positivos en el ensayo de determinación de la actividad antimicrobiana.

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