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EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIFNGICA DEL EXTRACTO DE
TOMILLO (Thymus vulgaris) CONTRA
Botrytis cinerea, Fusarium oxysporumy Sclerotinia sclerotiorum
MARIA CAROLINA LIZCANO GONZALEZ
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al ttulo de
MICROBILOGA AGRCOLA Y VETERINARIA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA
BOGOTA D.C.
Diciembre 12 de 2007
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NOTA DE ADVERTENCIA
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por
sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se publiquenada contrario al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no
contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en
ellas el anhelo de buscar la verdad y la jus ticia .
Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Ju lio de 1946
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EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANIFNGICA DEL EXTRACTO DE
TOMILLO (Thymus vulgaris) CONTRA
Botrytis cinerea, Fusarium oxysporumy Sclerotinia sclerotiorum
MARIA CAROLINA LIZCANO GONZALEZ
APROBADO
----------------------------------------------- -------------------------------------------------
Dr JAIRO CUERVO A. MARIA XIMENA RODRIGUEZ Ph. D
DIRECTOR ASESOR
------------------------------------------------ ----------------------------------------------
ING. AGRNOMO OMAR GUTIRREZ MARCO HELI FRANCO MSc.
JURADO JURADO
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EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIFNGICA DEL EXTRACTO DE
TOMILLO (Thymus vulgaris) contra
Botrytis cinerea, Fusarium oxysporumy Sclerotinia sclerotiorum
MARIA CAROLINA LIZCANO GONZALEZ
APROBADO
---------------------------------------------------------------
Dra. ANGELA UMAA
Decana Acadmica
Facultad de Ciencias
-----------------------------------------------------------------
Dra. JANETH ARIAS
Directora de Carrera
Microbiologa Agrcola y Veterinaria
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DEDICATORIA
A Dios que siempre ha estado presente en mi vida.
A los que ya no estn y siempre me acompaan.
A mis padres.
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AGRADECIMIENTOS
A mis padres Edgar y Ligia que siempre estuvieron presentes en este largo
camino y que me mostraron las cosas importantes de la vida.
A mis hermanitos Andrs, Camilo y Laura por su buena energa y compaa.
A Alejandrito que en los momentos difciles siempre estuvo dndome nimo y
haciendo parte de los felices.
A todas aquellas personas que siempre confiaron en m, Sonia y Gabriel.
Al Doctor Jairo Leonardo Cuervo por su apoyo y paciencia para la realizacin de
este trabajo.
A Maria Ximena Rodrguez por su comprensin, colaboracin y tiempo.
A Carolina Parra por su amistad, apoyo, ayuda incondicional y desinteresada.
A todas las personas que hacen parten, de una o de otra manera del Laboratorio
de Biologa del Suelo de la Facultad de Agronoma de la Universidad Nacional
de Colombia.
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TABLA DE CONTENIDO
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIN 112. MARCO TERICO 132.1 Fungicidas Biolgicos 132.2 Generalidades del Culti vo de Tomillo (Thymus vulgaris) 152.3 Generalidades del Culti vo de Albahaca (Ocimun basil icum 172.4 Control contra Hongos Fitopatgenos en Plantas Aromticas 182.5 Hongos Fitopatgenos de Plantas Aromticas 192.5.1 Generalidades de Botrytis cinerea 232.5.1.1 Descripcin bsica 232.5.1.2 Huspedes y Especializacin 232.5.1.3 Enfermedad 232.5.1.4 Epidemiologa 24
2.5.1.5 Control 242.5.2 Generalidades de Fusarium oxysporum 242.5.2.1 Descripcin bsica 242.5.2.2 Especializacin de huspedes 242.5.2.3 Sntomas de enfermedad 252.5.2.4 Ciclo de enfermedad 252.5.2.5 Epidemiologa y control 262.5.3 Generalidades de Sclerotinia sclerotiorum 272.5.3.1 Descripcin bsica 272.5.3.2 Huspedes 282.5.3.3 Enfermedad 282.5.3.4 Epidemiologa 282.5.3.5 Control 29
2.6 Extraccin de Extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) 302.6.1 Mtodos de extraccin 313. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN 353.1 Formulacin del Problema 353.2 Justificacin 354. OBJETIVOS 374.1 Objetivo General 374.2 Objetivos Especficos 375. MATERIALES Y MTODOS 385.1 Diseo de la investigacin 385.1.1 Obtencin del Extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) 385.1.1.1 Obtencin del Extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) 38
5.1.2 Pruebas In Vitro 395.1.2.1 Tcnica de Crecimiento Radial 396.1.2 Prueba de Invernadero 406. RESULTADOS Y DISCUSIN 436.1 Prueba In Vitro 436.1.1 Tcnica de Crecimiento Radial 436.2 Prueba de Invernadero 516.2.1 Funcin Curativa 52
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6.2.2 Funcin Preventiva 537. CONCLUSIONES 558. RECOMENDACIONES 569. REFERENCIAS 5710. ANEXOS 64
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RESUMEN
Los extractos vegetales forman una parte muy importante en la agroecologa, ya
que estos benefician al medio ambiente, combatiendo organismos fitopatgenos,
sin recurrir a agentes qumicos.
El objetivo principal de este estudio es el de evaluar la actividad antifngica del
extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) sobre los hongos fitopatgenos Botrytis
cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum causantes de
enfermedades en Albahaca (Ocimum basilicum), haciendo que cultivos enteros
se pierdan debido a la baja calidad y a la muerte total de las plantas.
El estudio se desarrollo en los laboratorios y en los invernaderos de la Facultad
de Agronoma de la Universidad Nacional de Colombia. En esta investigacin,
se evalu el extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) a concentraciones de 150,
250 y 500g/L con dos tiempos de tratamiento trmico (15 y 30 min). Las pruebas
realizadas fueron In vitro; se obtuvo un medio de cultivo con los extractos y se
evalu la tasa de crecimiento radial de los hongos, El tratamiento de 500 g/L y
30 minutos fue el que obtuvo mejores resultados, se le adicion a plantas de
albahaca inoculadas con Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia
sclerotiorum.
En la prueba de Invernadero se evalu la actividad del el extracto de Tomillo
(Thymus vulgaris) en forma preventiva y curativa o de control de la enfermedad,
se estim el porcentaje de incidencia y severidad. Despus de ser evaluados los
resultados se obtuvo que el extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) puede
disminuir el crecimiento de Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia
sclerotiorum.Y al adicionarse sobre las plantas inoculadas se redujo la expresin
de los sntomas de las enfermedades.
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ABSTRACT
The vegetal extracts makes a very important role in the Agro-ecology, they
benefit to the environment and to the entire ecosystem around, fighting Infectious
diseases in plants caused by Phyto-pathogens organisms, without using any
kind chemical agents.
The intention of this analysis is to estimate the fungicide action of the Thyme
(Thymus vulgaris) extract in the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea,
Fusarium oxysporum and Sclerotinia sclerotiorum, this fungus are able to cause
diseases in the Basil (Ocimumbasilicum), which can cause serious damage in
this herb, resulting in loss of yield and thus profit.
The entire investigation was developed in the greenhouses and laboratories of
the Department of Agronomy of the Universidad Nacional de Colombia.
In this investigation was evaluate the Thyme (Thymus vulgaris) extract in
concentrations of 150, 250 y 500g/L in different times of boiling (15 and 30
minutes). The related examinations were made In vitro; using this extracts, there
was obtained a Growth medium, at the same time, the radial grown rate of the
fungus was evaluated, later, the treatment with better results was added to the
sick Basil (Ocimum basilicum), previously inoculated with Botrytis cinerea,
Fusarium oxysporum and Sclerotinia sclerotiorum.
During the tests was seen the reactions and activities of the Thyme (Thymus
vulgaris)extract, in a preventive, curative, control and healthy way for the Basil
(Ocimum basilicum); the percentage of incidence and severity was measured.
After a large and punctual examination of the results, we can conclude that the
Thyme (Thymus vulgaris) extract can change the growth of the Botrytis cinerea,
Fusarium oxysporum and Sclerotinia sclerotiorum in the Basil (Ocimum
basilicum) for good, giving better results in a preventive way than a curative way.
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1. INTRODUCCIN
La agricultura ecolgica, orgnica o biolgica enmarca todos los sistemas
agrcolas que promueven la produccin sana y segura de fibras y alimentos,
desde el punto de vista ambiental, social y econmico. Est basada en un
sistema de produccin sostenible, en el cual no se hace uso de fertilizantes,
herbicidas o pesticidas qumicos, u otras sustancias toxicas que pueden llegar a
causar algn dao a la salud humana, animal y al medio ambiente. Dicho de otra
forma, la agricultura ecolgica trabaja bajo el concepto de produccin sostenible
y competitividad, sin deterioro de los recursos naturales, con un fin muy claro, el
crecimiento econmico y del mejoramiento de la calidad de vida de la poblacin.
La agricultura ecolgica aboga por una produccin ms limpia, libre de
sustancias perjudiciales tanto para las personas como para el medio ambiente,
y puede en algunos casos representar una mejora en la ganancia del
productor.
En la actualidad se han ido desarrollando diferentes formas de contribuir a la
conservacin del medio ambiente en el rea agrcola con productos biolgicos,
estos productos evitan o excluyen insumos externos de sntesis qumicas que
empobrecen el suelo contrarrestando la accin de las poblaciones de
organismos benficos, disminuyendo los nutrientes para las plantas y
contaminando fuentes de agua.
El Manejo Integrado de Plagas es un mtodo para combatir poblaciones no
deseadas siendo responsable con el medio ambiente. Existen productos
biolgicos que pueden llegar a ser muy efectivos para el control de plagas. Se
conocen sustancias extradas de plantas que tiene un efecto antifngico contra
la poblacin daina y sin contaminacin del recurso suelo y agua.
La Albahaca (Ocimum basilicum) es una de las plantas aromticas ms cultivada
y comercializada debido a su importancia medicinal y culinaria. Esta a su vez
sufre ataques de hongos fitopatgenos, los ms representativos son Botrytis
cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum que llevan a veces a
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perdidas hasta de un 100% de la produccin de este cultivo por su agresividad al
atacar.
Teniendo conocimiento de la problemtica del cultivo de la Albahaca (Ocimum
basilicum)se utiliz un antifngico natural, extracto acuoso de Tomillo (Thymusvulgaris) que es una planta reconocida por sus propiedades teraputicas y
cuyas partes areas ya han sido estudiadas comprobndose la existencia de
sustancias en ella con actividad antifngica.
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2. MARCO TEORICO
2.1 FUNGICIDAS BIOLGICOS
Los Hongos constituyen el grupo ms importante entre los agentes causales detipo infectivo que provocan enfermedades de las plantas. El nmero exacto de
hongos fitopatgenos se desconoce, pero se estiman en un nmero superior a
las diez mil especies, pertenecientes a diversas categoras taxonmicas
(Asocolflores, 1995).
El uso de Productos Naturales es tan antiguo como la humanidad. Los productos
naturales son de naturaleza muy variada, desde sustancias biolgicamente
activas de origen marino, exudados de raz y los ms explorados, aquellos
provenientes de plantas. La qumica orgnica estudia la estructura,transformacin y efectos biolgicos de los metabolitos secundarios presentes en
diferentes organismos. Debido a sus propiedades y principios activos se estn
aplicando en medicina moderna, cosmetologa, farmacutica, biotecnologa y
ltimamente con contribucin muy prometedora en la agricultura ecolgica
(Fonnegra y Jimnez 2006).
En la naturaleza existen de 250.000 a 500.000 especies vegetales, de las cuales
se estima que al menos el 10% han sido estudiados en sus aspectos qumicos y
propiedades biolgicas. Como se mencion anteriormente, esta temtica no esnueva, se haba dejado en el olvido por un largo periodo de tiempo y
recientemente, el inters ha sido renovado valorando la diversidad de estructuras
qumicas en la bsqueda de nuevos compuestos bioactivos (Piol, 2001).
Los productos de origen vegetal han sido, en las ltimas dos dcadas,
mayormente estudiados en su parte qumica, con nfasis en los metabolitos
secundarios, los cuales estn implicados en el control biolgico contra patgenos
o plagas, y en ciertos casos, activando procesos de defensa en la planta,
brindando una proteccin preventiva (Kagale et al. 2004).
Los metabolitos secundarios, son sustancias de bajo peso molecular, no son
comunes en todas las plantas y por el contrario, pueden ser una expresin de la
individualidad qumica de un organismo. Los productos del proceso fundamental
de la fotosntesis proporcionan los intermediarios biosnteticos necesarios para
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dar lugar a la formacin de los metabolitos secundarios, hacindose evidente la
interconexin entre productos del metabolismo primario con el secundario (Gil,
2002).
Los compuestos fenlicos sencillos (hidroxibenzoicos o hidroxicinmicos), sonmetabolitos secundarios comunes en las plantas con propiedades fungicidas.
Las cumarinas clasificadas como antifngicas y antibacteriana. Los conjugados
de fenilpropanoides con aminas, se incorporan a la pared celular vegetal para
aumentar su rigidez e impedir la entrada de los patgenos. En cuanto a las
fitoalexinas, estas son sintetizadas por las plantas, despus de la infeccin y en
actividad inhibitoria de microorganismos patgenos, se han identificado un grupo
importante, por ejemplo, la pisatina, la cual es un flavonoide sintetizado por el
guisante, Pisum sativum, como reaccin a la infeccin por hongos, siendo esta la
primera fitoalexina aislada y caracterizada (Gil, 2002).
Por otro lado, aquellas que hacen parte de la respuesta hipersensible, como es
el caso de algunos compuestos pertenecientes a los grupos de los alcaloides,
los terpenoides y los fenilpropanoides, participan activamente eliminando
directamente al microorganismo patgeno y/o restringiendo su invasin al resto
de la planta. Al mismo tiempo, otros metabolitos secundarios contribuyen a
destruir las especies reactivas de oxgeno que son txicas para la misma clula
vegetal, las cuales se sintetizan durante las etapas tempranas de la respuesta
de defensa. Es as, como algunos metabolitos secundarios constituyen una parte
importante de la respuesta de la defensa de las plantas sometidas al ataque por
patgenos (Seplveda et al. 2003).
Existen varios reportes en la literatura en donde registran plantas con actividad
fungicida, como es el caso de Allium sativum, la cual contiene como compuesto
activo alina un aminocido sulfurado; el aceite esencial de hojas de organo
mexicano (Lipp iagraveolens), presenta fenoles timol y carvacol que son los
principales componentes que le confieren poder antibacteriano y antifngico(Kagale et al. 2004). El aceite esencial obtenido desde hojas de limn
(Cymbopogon citratus), que es rico en citral, myrceno, dipenteno,
methylheptenona, ciertos alcoholes, y cidos voltiles, presento actividad
antifngica, contra Mycosphaerella fijiensis en bioensayos realizados in vitro
(Obledo et al. 2004).
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En Colombia evaluaron el efecto biofungicida de Momordica charantia, Awinglea
glutinosa, Salvia officinalis, Carica papaya, Azadirachta indica y Jatropha sp.
Utilizando como adherente natural el aceite de Ricinus comunis, los autores
encontraron que hubo respuesta de sensibilidad del hongo a los tratamientos, sin
embargo el qumico present los mejores resultados en todas las variables
(Marn et al. 2006).
En el caso del patosistema pepino-Podosphera xanthii, causante del mildeo
polvoso, al ser tratado con un inductor exgeno, proveniente de las hojas de
malsana (Reynoutria sachalinensis), se observ rpidamente la sntesis de una
fitoalexina, C-glycosdsil conocida como cucumarina, la cual se acumula en el
sitio de penetracin del hongo, jugando un papel importante en el bloqueo,
colonizacin y supervivencia del patgeno. Se reporto la lignificacin de la pared
celular y el aumento en actividad de las enzimas quitinasas, peroxidasas y -1,3
glucanasas (Fofana et al. 2005).
Los efectos fungicidas in vitro de los Aceites esenciales de plantas aromticas
contra Fusarium sp ha sido determinados por la capacidad inhibitoria en el
crecimiento del fitopatgeno con estos productos (Fernndez y Vega 1990).
Los extractos provenientes del cedro blanco (Hiba arborvitae) inhiben la
germinacin de esporas de Botrytis cinerea (Hernndez y Bautista 2007); y el
crecimiento micelial Sclerotinia sclerotiorum aplicados a diferentes
concentraciones (Zapata et al. 2003).
2.2 GENERALIDADES DEL CULTIVO DE TOMILLO (Thymus vulgaris)
El tomillo (Thymus vulgaris)pertenece de la familia Lamiaceae. Es una planta
aromtica, vivaz, leosa, muy polimorfa, de 10 a 40 cm de altura, con numerosas
ramas leosas, erectas, compactas, parduzcas o blanco-aterciopeladas. Las
hojas de 3 a 8 mm son lineares, oblongas, sentadas o brevemente pediceladas,
opuestas, tomentosas, sin cilios, con el pecolo o sus mrgenes revueltos hacia
abajo y blanquecinas por su envs. Las flores son axilares y agrupadas en la
extremidad de las ramas, formando una especie de capitulo Terminal, a veces,
con inflorescencia interrumpida; las brcteas son verde griscea; el cliz, algo
giboso, con pelos duros, con tres dientes en el labio superior, cortos, casi iguales
y dos en el inferior, muy agudos, mas largos , con pelos es sus bordes y de color
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rojizo; la corola, un poco mas larga que el cliz, con el labio superior erguido y el
inferior trilobulado y de color blanquecino o rosado; los cuatro estambres
sobresalen de la corola. El fruto es un tetraquenio, lampio, de color marrn (Gil,
2002).
Es una especie muy variable, tanto en su fenologa como en la composicin
qumica de su aceite, en la que ya se han detectado siete quimotipos. Debido a
esto ha dado lugar a confusiones taxonmicas en este gnero, en el que se han
considerado como especies distintas, a sus variedades o ecotipos (Fonnegra y
Jimnez 2006).
Su hbitat son pases de cuenca mediterrnea occidental, sobre suelos secos y
soleados. Es abundante en el este, centro y sur de la pennsula y en Baleares.
Crece sobre suelos calizos, arcillosos y menos frecuentes en silicios. La latitud
es de 0 a 1.800 m. El clima ms favorable para su cultivo es templado, templado-
calido y de montaa. Resiste bien a las heladas y sequas, pero no el
encharcamiento ni exceso de humedad ambiente. Aunque prefiere los suelos
ricos y calcreos, se adapta a los arcillosos, ligeros y silicios. Prefiere la
exposicin a medio da. Su reproduccin puede hacerse por semillas o
vegetativamente, por divisin de pies o por esquejes (Latorre,1999).
Las enfermedades que puede atacar el cultivo, se destaca sobre la parte area,
a veces, un amarillamiento de hojas, de algunas ramas, de la parte superior,
debido a un ataque de nematodos fitfagos, a nivel de las races. Una invasin
generalizada conduce a la desaparicin de la totalidad de los pies atacados. El
responsable principal es Meloidogyne hapla. La nica lucha posible es la
desinfeccin de suelos y mediante la multiplicacin vegetativa, recurrir a los pies
sanos. No se debe implantar el cultivo de tomillo en parcelas donde se ha
detectado presencia de nematodos. La defoliacin y el amarilleo confirmado
despus de la floracin, son fenmenos naturales, que no deben confundirse
con enfermedades (Gutierrez, 1996)
La composicin qumica de las ramas contiene flavonoides, derivados del
apigenol y del luteolol; cidos fenolitos, cafico, rosmarnico, clorognico; cidos
triterpnicos, urslico y oleanoico; saponinas; contiene tambin elementos
minerales. El aceite esencial contiene carvacrol y timol (aunque las plantas
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espaolas, apenas contienen timol) en porcentaje del 20 al 70%, segn las
razas; tambin contiene p-cimeno, terpinenos, linalol, borneol y sus esteres
acticos, celo, geraniol, cariofileno. En Francia se han encontrado hasta la
fecha, siete quimiotipos diferentes de Thymus vulgaris (Fonnegra y Jimnez
2006).
La mayora del aceite comercial de tomillo es extrado de Thymus zygis. Los
principales componentes del aceite de tomillo son mostrados en la TABLA N 1.
Los aceites ricos en timol son producidos en grandes cantidades y son valorados
por su aroma. Se observan las variaciones en la composicin del aceite debido a
diferentes quimiotipos reconocidos. Se reportan rendimientos de aceite entre 0.5
1.5%.
TABLA N 1 .Contenido (%) de algunos de los principales componentes de
diferentes quimiotipos deThymus zygis.
COMPUESTO
QUIMIOTIPO
QUIMOL
QUIMIOTIPO
CARVACROL
QUIMIOTIPO
LINALOL
Y - terpineno 9.9 11.9 0.2
P cimeno 18.9 20.8 1.5
Linalol 3.2 4.1 79.0
Timol 49.8 0.8 0.9Carvacrol 2.0 43.9 1.1
Fuente: Proyecto Hierbas Aromticas. UNAL
2.3 Generalidades del Cultivo de Albahaca (Ocimum basilicum).
La albahaca (Ocimum basilicum) es una planta herbceas, anual, de tallos
erectos y ramificados, que alcanza de 30 a 50 cm de altura. Las hojas de 2 a 5
cm son opuestas, pecioladas, aovadas, lanceoladas y ligeramente dentadas. Las
flores son blancas o ligeramente purpreas, dispuestas en espigas alargadas,
axilares, en la parte superior del tallo o en los extremos de las ramas. El fruto
esta formado por cuatro aquenios pequeos lisos (Latorre, 1999).
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Es originaria Persia y Asia menor, se ha extendido su cultivo por las regiones
templadas, sobre todo los pases de la cuenca mediterrnea.
Su multiplicacin puede ser por semilla o por siembra directa durante 15 das a
una temperatura de 20 a 25C (Jarvis, 1981).
En plena floracin de la planta cuando se estima a obtener su aceite se recolecta
se corta a unos 15cm del suelo con el fin de preservar las yemas basales de los
tallos. La albahaca produce aceite esencial, de color amarillo rico en linalol, metil
chavicol y eugenol, con rendimientos aproximados de 0.6%(en peso fresco) y 1.2
% (en peso seco) (Espitia, 2004).
2.4 Control con tra hongos fitopatgenos en plantas aromticas
El mtodo tradicional para el control de hongos en plantas aromticas, ha sido
las prcticas culturales, dirigida a reducir la fuente de inculo del patgeno y
forma parte de un programa de manejo integrado de la enfermedad. En este
sentido, el establecimiento de un buen sistema de drenaje, la remocin de las
hojas viejas en el suelo junto con la poda sanitaria, se han utilizado durante aos
como estrategias para reducir la densidad del inculo, sin dejar de lado, un
adecuado programa de fertilizacin. Se ha propuesto el establecimiento de altas
densidades de siembra, con el fin de generar un micro y mesoclima al interior de
la plantacin, creando condiciones desfavorables para el patgeno (Rosales et
al. 2002).
El mtodo de control qumico, es el ms ampliamente utilizado, se establece
dentro de un programa normal de rotacin entre fungicidas, sistmicos y
protectantes, a lo largo del ciclo del cultivo. De acuerdo a Marn y Romero
(1998), los fungicidas para el control de esta enfermedad se pueden agrupar en
tres categoras, con base en su modo de accin: fungicidas de contacto o
protectantes, de accin sistmica local y fungicidas sistmicos. En cuanto a los
fungicidas protestantes, estos son utilizados de forma alternada con fungicidas
sistmicos, estos ltimos, son aplicados con aceites o emulsiones como
adherente (Romero, 2006).
En la bsqueda de nuevas alternativas para el control de enfermedades de
platas aromticas, se tienen algunas aproximaciones en el control biolgico,
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tendiente a reducir el inculo de la enfermedad, utilizando microorganismos, que
en buena medida actuaran como antagonistas o en competencia contra los
hongos fitopatgenos (Patio et al. 2006; Gutirrez, 1996). A pesar de los
avances, el empleo de estos microorganismos y el como hacerlos eficientes para
uso masivo, esta an poco desarrollado, mxime que una de las limitantes en su
aplicacin es la efectividad disminuida causada por el efecto negativo de
factores ambientales, los cuales pueden alterar la supervivencia, actividad y vida
til de estos en la superficie de la hoja.
La importancia de los metabolitos secundarios en control, se ve claramente en
los trabajos con extractos de plantas, en donde se han evidenciado como
potentes productos antifngicos, antibacterianos, estimuladores del desarrollo
fisiolgico de la planta o activando los mecanismo de defensa contra plagas y
enfermedades (Kagale, 2004).
2.5 Hongos fitopatgenos de plantas Aromticas
En Estragn (Artemisa dracunculus) la principal enfermedad es la roya del
estragn, Puccinia dracunculina,que hace su aparicin en los meses donde hay
elevadas temperaturas y la es humedad imperante (Gmez, 2004).
En la Albahaca slo dos enfermedades de origen bitico de importancia han sido
descritas para esta especie, ambas causadas por patgenos que representan un
amplio rango de hospederos afectando otros cultivos (Goto, 1990).
El Tizn, este es ocasionado por el hongo Botrytis cinerea, constituye el
principal problema patolgico que afecta la parte area de las plantas de este
cultivo. Su presencia se manifiesta inicialmente como manchas foliares marrn,
que al crecer pueden comprometer toda la hoja. Es comn observar la aparicin
de moho gris sobre el tejido afectado, lo que facilita el diagnstico. El desarrollodel agente causal de esta enfermedad se ve favorecido, como ya se ha
sealado, por condiciones de alta humedad y agua libre sobre el follaje, siendo
particularmente susceptible el tejido senescente. De aqu que sea importante
favorecer la aireacin dentro del cultivo para evitar que el agua se acumule en
hojas por periodos prolongados. Otras medidas culturales tambin indicadas
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para esta enfermedad en otros cultivos son vlidas para albahaca. As es
importante la eliminacin de hojas o cualquier tejido muerto o senescente y evitar
exceso de fertilizacin nitrogenada (Gil, 2002).
Pudriciones radicales y de corona, causadas por hongos de los gneros Pythium
spp., Rhizoctonia spp. Phytophthora spp. y Fusarium sp., los que producen
necrosis y podredumbre del sistema radical y corona, asociado a clorosis y
marchites de las plantas. Las races pierden su color blanco caracterstico,
adquiriendo una coloracin marrn. La principal va de llegada de estos
patgenos al cultivo es a travs de sustrato, bandejas, agua, solucin nutritiva,
tanques y caeras contaminados. De aqu, que una medida de control
fundamental la constituya el asegurar la limpieza de todas estas posibles fuentes
de inculo del hongo. De igual manera se debe evitar la contaminacin con suelode todos los componentes del sistema o recipientes que se vayan a utilizar
(Gmez, 2004).
En la Menta a existencia de enfermedades afecta el estado sanitario de los
cultivos y por lo tanto reducen la produccin de materia verde y aceite esencial.
La enfermedad de mayor importancia en la Argentina para las mentas es la roya
(Puccinia menthae Pers) que, ataca a hojas y tallo, se caracteriza por la
aparicin de pstulas amarillas que luego oscurece a tonos marrones (Goto,
1990).
Cuando el ataque es muy intenso puede provocar la cada de las hojas. El
control de esta enfermedad es difcil, en general se recomienda adelantar la
cosecha cuando se prev un ataque severo (Latorre, 1999).
El marchitamiento es, una enfermedad producida por el hongo (Verticillum sp),
que se caracteriza porque las hojas se toman amarillas, la planta crece con
dificultad y termina por morir en poco tiempo, especialmente si el clima es seco
(Goto, 1990).
La antracnosis es causada por el hongo Sphaceloma mendiak, se caracteriza
por la aparicin de manchas, grises con bordes marrn-rojizos en las hojas
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jvenes, que pueden extenderse a, los brotes, provocando la cada de las
primeras y la muertes de los segundos (Gutirrez, 1996).
En Organo (Pelcthranthus amboinicus), el ataque del tizn foliar (Alternaria
alternata) que si bien no se manifiesta severamente, es la enfermedad que
reviste mayor importancia, ya que causa el deterioro del producto. Se manifiesta
desde, el pice hacia la base de la planta en forma de manchas foliares que se
localizan principalmente en las hojas superiores. En ataques severos se produce
la muerte de la planta. La predisponen la sucesin de das lluviosos, elevada
humedad y temperatura (Gil, 2002).
Dentro de la enfermedades fngicas se nombra Phythophthora cryptogea que
produce necrosis a nivel del cuello de la raz se caracteriza por un importantedeterioro de las plantas, ramas secas y las hojas presentan manchas amarillas,
marrones y negras, este hongo , se presenta en primavera en especial en suelos
hmedos y compactados (Gmez, 2004).
El organo puede ser atacado por una podredumbre debido al desarrollo de
Botrytis cinerea y por Puccinia rubsaameni. Para el caso de la mejorana se
menciona a su vez el ataque de Puccinia menthae,as como Septoria origanicola
var. Mejorana ambas afectan al sistema fotosinttico de las plantas (Gmez,
2004).
Una de las ms importantes enfermedades del organo es debida a
Colletotrichum sppcausante de necrosis foliares que deprecian la calidad de la
produccin en verde. Los sntomas que se observan primero son unas pequeas
manchas pardas sobre las hojas y los tallos. Al extenderse progresivamente por
la lmina foliar, las reas necrticas coalescentes producen el total
marchitamiento de las hojas, que caen finalmente. Dos han sido las especies de
Colletotrichum aisladas del organo: Colletotrichum dematium y Colletotrichum
gloeosporioides, ambos fueron aislados y cultivados en PDA (Patata-Dextrosa-
Agar) dando dos tipos diferentes de colonias (Latorre, 1999).
De igual forma se ha descrito un hongo perteneciente a la familia de la
Pythiaceas, Phythophthora cryptogea, presente igualmente sobre romero, tomillo
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y salvia, que provoca unas necrosis a nivel del cuello y de las races. El
marchitamiento del pie de las plantas afectadas se caracteriza por la presencia
de ramas secas y de hojas con manchas amarillas, pardas y negras. El hongo
est presente en los suelos hmedos y compactos, propensos a los
encharcamientos (Gutirrez, 1996).
Tambin se ha podido observar sobre cultivos de organo un oidio causado por
Erysiphe galeopsidisel cual provoca unas manchas blancas sobre los tallos y las
hojas de las plantas enfermas (Gmez, 2004).
Otros agentes causantes de enfermedades de origen fngico en el organo son
Botrytis cinereay una roya, Puccinia rubsaameni. Ambos parasitan al organo y
le causan podredumbres (Goto, 1990).
El Damping-off en Salvia (Pluchea odorata)causado por Pythium debaryanum y
Pellicularia filamentosa. En los semilleros, donde las plantas estn bastante
apiadas y bajo muchas condiciones algunos de los plantones muertos pueden
ser la consecuencia de la accin de alguno de estos hongos. El control que se
puede realizar hoy por hoy es difcil pero se recomienda la solarizacin de los
suelos como prevencin (Apablaza, 1999).
Manchas en las hojas es causado por Cercospora salviicola y Ramularia
salviicola.Arrancar y destruir las primeras hojas manchadas frecuentemente es
utilizado como mtodo de control preventivo (Gamboa, 1998).
Muchas especies de royas atacan principalmente a especies silvestres de Salvia.
Algunas de las ms comunes son Puccinia caulicola, P. farinacea, y P.salviicola.
Raramente se aplican mtodos de control (Apablaza, 1999).
2.5.1 Generalidades de Botrytis cinerea
2.5.1.1 Descripcin bsica
Botrytinia se diferencia de Sclerotinia por tener una medula esclorotial ms
compacta, gelatinizada y un anamorfo en Botrytis. El telemorfo puede
encontrarse en el campo, aun que predomina el anamorfo Botrytis cinerea. Los
esclerocios varan de forma y tamao, pero normalmente son al menos de 3 mm
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de dimetro; para que se produzcan apotecios se necesita un periodo de
almacenamiento en fro; los tallos de los apotecios llegan a 3 cm de longitud y a
1-2 mm de grueso; los discos son cncavos , pardo amarillentos y de hasta 8mm
de dimetro. Las ascas son cilndricas, las ascosporas elipsoidales a fusiformes,
y uninucleadas. Los conidiforos son mas o menos rectos, ramificados, pardos,
pero mas plidos cerca del pice; las ramas terminales producen conidias lisas,
unicelulares, obobales o elipsoidales, hialinas a pardo claro o, en masa, pardo
grisceo (Elad y Volpin, 1999).
2.5.1.2 Hospedero y especializacin
Es un parasito inespecfico que ataca un amplio numero de especies vegetales
(hortcola, ornamentales, cultivos extensivos, frutales) especialmente anuales;
tambin ataca a plntulas de rboles forestales. Puede comportarse como
patgeno y como saprofito. Aunque entre los aislados existen variaciones
notables de morfologa cultural y de agresividad, no se ha encontrado
especializacin respecto al husped (Smith 2002).
2.5.1.3 Enfermedad
Produce una podredumbre blanda (podredumbre gris), marchitez sbita o
lesiones pardas. El hongo infecta a las plantas casi exclusivamente a partir de
tejidos colonizados muertos o senescentes o a travs de heridas; puede causarmuerte de plntulas en pre y post emergencia (ornamentales, hortcolas, rboles
forestales); en tallos y pecolos aparecen lesiones pardas que se extienden
lentamente por los tejidos del tallo. Sobre las hojas se desarrollan lesiones
pardas, a veces hidrpicas, que se extienden con rapidez, especialmente en
condiciones hmedas (Avila, 1993).
2.5.1.4 Epidemiologa
El hongo sobrevive principalmente sobre restos vegetales infectados; aunqueciertos aislados producen esclerocios in Vitro, no se conoce bien su papel en
vivo; puede infectar a la semilla. La principal fuente del inculo son conidias
dispersadas por viento y lluvia (salpicaduras); las alternancia de humedad
relativa elevadas y bajas parecen favorecer la liberacin de las conidias; tambin
puede dispersarse por el viento y la lluvia y constituyen la base de un inculo
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saprofitito importante que se adhiere a las superficies mojadas de las plantas
(Bayona, 1996).
2.5.1.5 Cont rol
Los problemas de resistencia a fungicidas y en este caso, la falta de
especificidad del husped, la enfermedad puede extenderse fcilmente de un
cultivo a otro (Doss, 1995).
2.5.2 Generalidades de Fusarium oxysporum
2.5.2.1 Descr ipcin bsica
Esta especie, la mas importante del gnero Fusarium,en PDA las colonias tiene
un aspecto variable que depende de la cepa; en general el micelio areo ye el
medio cambia de color a distintos tonos desde violeta a morado oscuro; si
abundan los esporodoquios las colonias puede aparecer crema o naranja. Las
microconidias, siempre presentes, son oval-elipsoides, mono o bicelulares, y se
forman en fialidas cortas no ramificadas, nunca en cadena, pero agrupadas en
falsos captulos. Las macroconidias, normalmente 3-5 septadas, son fusoides,
ligeramente curvadas y a menudo tienen una clula basal pedicelada; se forman
al principio en fialidas individuales, luego en esporodoquios. Las clamidosporas
son solitarias o estn en cadenas cortas (Agrios, 1998).
2.5.2.2 Especializacin de hospedero
F. oxysporum es predominantemente un saprofito abundante y activo del suelo y
de materia orgnica. Adems algunas cepas tienen una actividad patognica
especfica, pero constituyen una porcin muy pequea de la poblacin total del
suelo aunque causan enfermedades importantes en los cultivos. Algunas estn
poco especializadas y causan muerte de plntulas, necrosis o podredumbres; sin
embargo las formas responsables de las marchitez vasculares son las msimportantes. Causan perdidas en plantas pertenecientes a todas las familias
importantes de angiospermas (a excepcin de las Gramineae) en regiones
templadas o tropicales (Smith 2002).
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2.5.2.3 Sntomas de la enfermedad
Los sntomas de la marchitez fusrica varan segn el husped, el patotipo y las
condiciones de infeccin; en general las hojas mas viejas muestran al principio
un aclarado vascular leve, clorosis de la lamina o marchitez, y estos sntomasprogresan posteriormente a las hojas jvenes, a menudo inicindose
unilateralmente en algunas en correspondencia con una infeccin localizada en
parte del sistema vascular de raz y tallo; las partes afectadas de la planta
empardecen. En el tallo aparecen estras longitudinales necrticas que se
extienden hacia el pice; los sntomas internos pueden verse a simple vista en
secciones de raz, tallo y pecolo. El empardecimiento comienza en el tejido
vascular y se extiende al crtex en las fases tardas de la infeccin. La marchitez
se desarrolla con especial rapidez en la floracin o fructificacin. En los cultivos
aparecen en focos que se extienden gradualmente, causando la muerte
prematura de las plantas afectadas. Debido a la consecuencia respecto al control
y a la posibilidad de conjuncin con otras enfermedades es importante
comprobar los sntomas de las marchiteces debidas a Fusarium (Mazzanti,
1994).
2.5.2.4 Ciclo de la enfermedad
Las marchiteces debidas a Fusariumson enfermedades tpicas del suelo, y en el
la principal fuente del inculo son los restos vegetales infectado; las
clamidosporas pueden resistir de forma inactiva durante varios aos y germinar
al disponer de nutrientes, por ejemplo la proximidad de partes jvenes de races.
La clamidospora germinada da lugar a inculo al gormar hifas, conidias y
clamidosporas; en este aspecto las cepas del patgeno se comportan igual que
otras especies de Fusarium (Agrios, 1998).
En la rizosfera hay una competencia intensa con otros microorganismos y en
particular con otros Fusarium; aunque muchas cepas de F. oxysporum son
capaces de penetrar en los tejidos corticales de la raz las cepas especificas de
husped son las nicas capaces de penetrar al tejido vascular y causar
marchitez; la penetracin tiene lugar principalmente en la zona de elongacin de
la raz y puede facilitarse por heridas y por ataque de nematodos; desde el punto
de penetracin el hongo se extiende hacia arriba por los vasos xilematicos
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mediante crecimiento miceliar y formacin de microconidias que se transportan
en la corriente transpiratoria (Latorre, 1999).
En estados posteriores puede extenderse al tejido adyacente causando necrosis
visibles exteriormente. La patognesis esta relacionada con el bloqueo de losvasos y la formacin de enzimas y toxinas. Los Fusarium causantes de
marchitez pueden tambin invadir y colonizar plantas que no son huspedes, en
las que causan sntomas leves; estos portadores asintomticos contribuyen al
transporte y multiplicacin del inculo (Smith, 2002).
2.5.2.5 Epidemiologa y control
Los Fusarium patognicos causantes de marchiteces, que tiene una importancia
primordial en muchos cultivos (excepto cereales), puede dispersarse en el suelo,polvo, agua de riego o por plantas infectadas (pero rara vez por semilla); los
agentes mas importantes en la practica son el suelo y el material de
multiplicacin vegetativa, que deben someterse a controles fitosanitarios para
impedir la dispersin. Aunque las clamidosporas son muy resistentes es posible
utilizar termoterapia en bulbos y tratamientos desinfectantes en el suelo que, sin
embargo, tiene a ser mas bien ineficaces en suelo in situ, dado que incluso
pequeas cantidades de inculo residual pueden ser acusa de ataques
importantes y que el inculo que permanece en zonas profundas colonizar de
nuevo con rapidez la zona desinfectada, en la que existe un vaci
microbiolgico (Smith, 2002).
En los sistemas intensivo de cultivo las races se desarrollan en un volumen
limitado de sustrato, que puede mantenerse en un principio libre de F.
oxysporum, sin embargo debe evitarse la re-infestacin con plantas, polvo o
agua de riego. Algunos suelos son supresivos para las marchiteces debidas a
Fusarium, debido a que un alto nivel de competencia con otros microorganismos
impide que las formas especiales ataquen a las plantas cultivadas en ellos; este
efecto supresito puede incluso trasferirse a otros suelos y establecerse all, lo
que abre perspectivas a un control microbiolgico (Agrios, 1998).
Dado que suelo cidos con deficiencias en potasio; y fertilizacin con Nitrgeno
amonico tiende a favorecer la enfermedad, el encalado, la fertilizacin potasita y
el uso de nitrato reducen a veces las perdidas. Otros factores que favorecen las
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marchiteces por Fusariumson las temperaturas elevadas, el crecimiento rpido y
la transpiracin intensa, pero no son fciles de alterar sin afectar directamente la
produccin. El xito inicial del control con fungicidas sistmicos
(benzimidazoles) fue de corta duracin al aparecer con rapidez cepas resistentes
de F. oxysporum. Las principales perspectivas para el control residen de hechos
en la mejora de cultivares resistentes, de los que se dispone comercialmente
para la amatoria de huspedes importantes; tales cultivares pueden ser muy
resistentes solo a algunas razas o ser ampliamente tolerantes a distintas razas,
en algunos casos pueden dar buen resultado injertar sobre patrones con un
buen nivel de resistencia de base amplia (Polanco, 2004).
2.5.3 Generalidades de Sclerotinia sclerotiorum
2.5.3.1 Descr ipcin bsica
El hongo crece rpidamente en cultivo produciendo un micelio algodonoso
blanco, abundante, en el que se desarrollan esclerocios negros hasta de 1 cm.
de dimetro, con una superficie ligeramente punteada, que a menudo exudan
gotitas de liquido en atmsferas saturadas en hipoctilos Sclerotinia
sclerotiorum se han descrito dos tipos morfolgicamente distintos de hifas: Hifas
infecciosas intercelulares anchas (dimetro medio 17m) orientadas
predominantemente en paralelo al eje longitudinal de hipoctilo, que se forman al
principio, apareciendo el segundo tipo morfolgico: hifas que se ramifican con un
dimetro medio de 8.5 m y que se desarrollan sub-apicalmente a partir de las
hifas de infeccin, se ramifican abundantemente y se penetra en el husped inter
e intracelularmente. En las colonias viejas se forman a menudo microconidias
fialidicas unicelulares cuyo papel en el ciclo vital, si es que lo tiene, no se ha
aclarado, aunque en distintas ocasiones se ha supuesto que se pueden
funcionar como espermatidas y se ha sealado su germinacin in Vitro. No hay
Macroconidias. Los esclerocios tienen germinacin miceliognica y carpognica;
en el primer caso dan lugar a hifas vegetativas y en segundo, a apotecios quetiene forma de copa, son pardo-amarillento de hasta 10 mm de dimetro, sobre
un tallo cilndrico liso que se origina del esclerocio. Las ascas son cilndricas
clavadas de hasta 130 x 10 , con 8 esporas. Las ascosporas son uniseriadas y
elpticas de 9-13 x 4-6.5 (Smith, 2002).
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2.5.3.2 Hospederos
S. sclerotiorum es uno de los patgenos con una gama de huspedes ms
amplia, se seala como huspedes a 225 gneros de 64 familias de plantas
superiores, principalmente angiospermas. Es especialmente frecuente elparasitismo a las Solanaceae, Cruciferae, Umbeliferae, Compositae,
Curcubitaceaey Leguminoseae. En raras ocasiones ataca a plantas leosas, a
gramneas y a cereales. Se ha demostrado que son capaces de atacar una
amplia gama de huspedes (Agrios, 1998).
2.5.3.3 Enfermedad
S. sclerotiorum causa en una amplia gama de huspedes una podredumbre
blanda progresiva de tejidos no lignificados; los daos son especialmentefrecuentes en tallos de plantas herbceas y en rganos de almacenamiento de
hortcola; tambin causa lesiones de hojas, pero solo si las condiciones para su
extensin son muy favorables. En distintos cultivos se dan nombre distintos a la
enfermedad, siendo generalizado el del mal del esclerocio. Son rasgos
caractersticos la formacin de lesiones extensas blandas, normalmente de color
claro y el crecimiento de un tapiz miceliar blanco algodonoso sobre la superficie
y en el interior de las cavidades del husped; posteriormente se forma en las
cavidades medulares de los tallos y de los pecolos esclerocios negros
prominentes cuya aparicin es un carcter diagnostico fiable. El primer sntoma
notable en plantas infectadas en el eje principal cerca del nivel del suelo suele
ser un marchitamiento, al que sigue rpidamente un colapso total y el
encamado (Purdy, 1999).
2.5.3.4 Epidemiologa
Los esclerocios constituyen el principal medio de supervivencia; su supervivencia
en el suelo es muy variable, pero se considera seis-ocho aos el lmite superior.
El micelio tambin puede sobrevivir en las semillas, lo que tiene poca
importancia epidemiolgica. En una amplia gama de condiciones la germinacin
miceliognica tiene poca importancia debido a que en el suelo no estril la
extensin saproftica es limitada; sin embargo cuando se encuentran prximos
los esclerocios y las plantas susceptibles pueden tener lugar infecciones
devastadoras del suelo (Adams, 1999).
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Una condicin para la germinacin carpognica es que haya habido un periodo
de helada que rompa la dormicon y a continuacin temperaturas mayores y
humedades altas; en las altitudes templadas los apotecios maduran tpicamente;
los estipes de los apotecios se alargan en respuesta a la luz y las ascosporas se
dispersan por el viento; al aterrizar sobre huspedes potenciales necesitan
durante 16-24 horas agua para germinar; pueden germinar en un intervalo de
temperatura desde 0-25 C, con un ptimo a 15-20 C (Smith, 2002).
Tambin parece que para la infeccin se necesita una base exgena de
nutrientes. Los tejidos heridos, muertos o senescentes se colonizan con facilidad
y sirven como una base nutritiva, desde la que puede tener lugar la infeccin de
tejidos sanos (Adams, 1999).
Las ascosporas germinales producen apresorios que pueden variar desde
formas lobuladas simples a cojinetes ramificados complejos; la penetracin
normalmente es directa a travs de la cutcula, ayudada por una importante
disolucin pectoltica y celuloltica de la estructura de la estructura celular del
husped. Al descomponerse el husped los esclerocios vuelven al suelo o
pueden distribuirse por las operaciones culturales, la recoleccin el pastoreo, etc.
(Agrios, 1998).
En la mayora de las regiones la ausencia de un estadio condico y las
limitaciones ambientales para la formacin de apotecios reducen a un ciclo nico
anual de infeccin (Smith, 2002).
2.5.3.5 Control
El control qumico se ha dirigido tanto a inhibir el desarrollo de los esclerocios
como a proteger las plantas contra la infeccin por ascosporas; lo primero se ha
intentado con distintos esterilizantes de suelo y con fungicidas de amplio
espectro (Smith, 2002).
El control biolgico con antagonistas microbianos que colonizan los esclerocios
parece que pueda resultar prometedor en el futuro. Los mtodos culturales de
control deben utilizarse con cuidado: el realizar labores profundas en dos aos
sucesivos puede reexponer esclerocios viables enterrados, y la rotacin de
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cultivos tiene un valor limitado, dado la amplia gama de huspedes (Adams,
1999).
2.6 OBTENCIN DE EXTRACTOS
Las plantas poseen una variedad de mezclas de compuestos bioactivos tales
como lpidos, grasas, fotoqumicos, fragancias, pigmentos y sabores que son
ampliamente utilizados en la agroindustria alimentara y no alimentara, en la
industria Farmacutica y en la industria cosmtica. Para separar estos
compuestos (solutos) de la fase slida, sta se pone en contacto con una fase
lquida, ambas fases entran en contacto ntimo y el (los) soluto(s) se difunde(n)
desde el slido a la fase lquida, lo que permite una separacin de loscomponentes de su estructura natural original.
Este proceso se conoce como lixiviacin y para realizarlo existen varios
mtodos. Un proceso importante es la lixiviacin de azcar de las remolachas
con agua caliente. Otros procesos muy utilizados consisten en la extraccin de
aceites vegetales, en los cuales se emplean disolventes orgnicos como hexano,
acetona y ter, para extraer aceites de man, soja, semillas de lino, ricino, girasol
o algodn (Geankoplis, 1999).
Los mtodos tradicionales de extraccin requieren altos tiempos de residencia ygrandes cantidades de solvente. Estos mtodos se basan en la seleccin del
solvente asociado con el uso de calor y/o agitacin e incluyen el soxhlet, la
hidrodestilacin y maceracin mezclada con agua, alcohol o grasa caliente. El
soxhlet es una tcnica estndar y la principal referencia para evaluar el
rendimiento de otros mtodos de extraccin slido lquido (Luque de Castro y
Garca-Ayuso, 1998).
De un tiempo a esta parte se han desarrollado varias tcnicas nuevas para la
extraccin de solutos de matrices slidas, entre ellas se tiene: la extraccin
asistida con ultrasonido (Vinatoru, 2001), la extraccin asistida con microondas
(Kaufmann y Christen, 2002), la extraccin con solvente acelerado (Kaufmann y
Christen, 2002; Smith, 2002) y la extraccin con fluidos supercrticos (Brunner,
2005; Rozzi y Singh, 2002), con el objeto de acortar el tiempo de extraccin,
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disminuir el consumo de solvente, aumentar el rendimiento de extraccin y
mejorar la calidad del extracto.
Se empezar describiendo los mtodos de extraccin con soxhlet y con fluidos
supercrticos, tambin se citaran algunos resultados comparativos entre estos
dos mtodos y finalmente se mostrarn algunas de las aplicaciones
agroindustriales con fluidos supercrticos FSC, con el objeto de continuar la
divulgacin que ya se viene haciendo de ste mtodo y de sus bondades entre
los acadmicos e industriales de nuestros pases latinoamericanos.
2.6.1 MTODOS DE EXTRACCIN
2.6.1.1 EXTRACCION CON SOXHLET
Para la extraccin con soxhlet se deben tener en cuenta: la seleccin del
solvente, la matriz slida y las condiciones de operacin.
2.6.1.1.1Seleccin del solvente
Debe seleccionarse un solvente conveniente de tal forma que ofrezca el mejor
balance de varias caractersticas deseables: alto lmite de saturacin y
selectividad respecto al soluto por extraer, capacidad para producir el material
extrado con una calidad no alterada por el disolvente, estabilidad qumica en las
condiciones del proceso, baja viscosidad, baja presin de vapor, baja toxicidad e
inflamabilidad, baja densidad, baja tensin superficial, facilidad y economa de
recuperacin de la corriente de extracto y bajo costo (Dahlstrom et al., 1999).
Cada solvente diferente produce extractos y composiciones especficos
(Zarnowski y Suzuki, 2004). El solvente ms ampliamente utilizado para extraer
aceites comestibles de las plantas es el hexano. El hexano tiene un rango en el
punto de ebullicin bastante estrecho, de aproximadamente 6369 0C y es un
excelente solvente de los aceites en lo que se refiere a su solubilidad y facilidad
de recuperacin. Sin embargo, el n-hexano, el elemento principal del hexanocomercial, est ubicado como el nmero uno en la lista de los 189 contaminantes
del aire ms riesgosos por la Agencia Americana de Proteccin del ambiente
(Mamidipally y Liu, 2004).
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El uso de solventes alternativos tales como: isopropanol, etanol, hidrocarburos, e
incluso el agua, se ha incrementado debido a asuntos del medioambiente, la
salud, y a preocupaciones de seguridad. Se us d-cineno y hexano en la
extraccin de aceite a partir del salvado de arroz y se observ que el d-cineno
extrajo una cantidad significativamente superior de aceite que el hexano bajo
cualquier serie dada de condiciones (Mamidipally y Liu, 2004). Tambin se ha
utilizado agua para extraer el aceite del salvado de arroz a un valor del pH de 12.
El aceite extrado con agua tuvo un volumen ms bajo de cido graso libre y un
color ms claro que el obtenido con hexano (Hanmoungjai et al., 2000).
Sin embargo, los solventes alternativos producen a menudo menos recuperacin
debido a una afinidad molecular disminuida entre el solvente y el soluto. Los
costos de los solventes alternativos pueden ser superiores. A veces se agregaun co-solvente para aumentar la polaridad de la fase lquida. Adems, se han
reportado extracciones de mezclas de isopropanol y el hexano para aumentar el
rendimiento y la cintica de extraccin (Li et al., 2004).
2.6.1.1.2Caractersticas de la matriz
La extraccin con Soxhlet depende fuertemente de las caractersticas de la
matriz y de las dimensiones de las partculas puesto que la difusin interna
puede ser el paso limitante durante la extraccin. Para la extraccin total de las
grasas de las semillas oleaginosas, se realiz una extraccin de 2-h obteniendo
un rendimiento del 99% cuando la dimensin de las partculas era 0.4 mm,
mientras que fue necesaria una extraccin de 12-h para obtener una eficacia
similar si la dimensin de las partculas era 2.0 mm (Luque-Garcia y Luque de
Castro, 2004).
2.6.1.1.3Condiciones de operacin:
Durante la extraccin con Soxhlet, el solvente se recupera normalmente por
evaporacin. Las temperaturas de extraccin y evaporacin tienen un efecto
significativo en la calidad final de los productos. Adems, se ha encontrado que
el aceite del salvado de arroz extrado con d-cineno era ligeramente ms oscuro
comparado con el aceite extrado con hexano, probablemente debido a las
mayores temperaturas de extraccin y evaporacin al usar d-cineno como
solvente. Las altas temperatura de ebullicin para la recuperacin del solvente
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pueden disminuirse usando evaporacin flash o separacin por membrana para
recuperar el solvente (Mamidipally y Liu, 2004).
2.6.1.1.4Comparacin Soxhlet y CO2SC
La extraccin con Soxhlet es una tcnica bien establecida. Entre sus ventajas,
por encima de otros nuevos mtodos como la extraccin ayudada con
ultrasonido, la ayudada con microondas y la extraccin con fluidos supercrticos
est la de tener bastantes aplicaciones industriales, buena reproduci-bilidad y
eficacia, y menor manipulacin del extracto. Sin embargo, comparada con
CO2SC, el mtodo Soxhlet es una tcnica anticuada y consumidora de tiempo y
de solvente. En la extraccin de aceites de rosa silvestre (Rosa canina L),
utilizando n-hexano con soxhlet se consumieron 180 minutos para extraer 48.5
g/kg, mientras que con CO2SC a 35 C y 250 bar, se consumieron 35 minutospara extraer 57.2 g/kg, cuando se le agrego propano (cosolvente) al CO2SC a
28O C y 100 bar se consumieron 35 minutos para obtener 66.8 g/kg
(Szentmihalyi et al., 2002).
Algunos solventes usados con el Soxhlet convencional se han cuestionado
recientemente debido a su toxicidad (n-hexano). El uso de solventes no txicos
como el CO2supercrtico y el agua estn en el orden del da.
2.6.1.2 EXTRACCION CON FSC
Un fluido supercrtico es cualquier sustancia a una temperatura y presin por
encima de su punto crtico termodinmico. Tiene la propiedad de difundirse a
travs de los slidos como un gas, y de disolver los materiales como un lquido.
Adicionalmente, puede cambiar rpidamente la densidad con pequeos cambios
en la temperatura o presin. Estas propiedades lo hacen conveniente como un
sustituto de los solventes orgnicos en los procesos de extraccin.
Los fluidos supercrticos (FSC) tienen la capacidad de extraer ciertos
compuestos qumicos con el uso de determinados solventes especficos bajo la
combinacin de temperatura y presin (Brunner, 2005; Rozzi y Singh, 2002).
El CO2 es el fluido supercrtico ms utilizado debido a que es no txico, no
inflamable, no corrosivo, incoloro, no es costoso, se elimina fcilmente, no deja
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residuos, sus condiciones crticas son relativamente fciles de alcanzar y se
consigue con diferentes grados de pureza, se puede trabajar a baja temperatura
y por tanto, se pueden separar compuestos termolbiles, se puede obtener a
partir de procesos de fermentacin alcohlica y ayuda a prevenir la degradacin
trmica de ciertos componentes qumicos del alimento cuando son extrados
(Brunner, 2005; Hurtado, 2002; Rosa y Meireles, 2005).
Las ventajas de los fluidos supercrticos son: (Bruner, 2005; Hurtado, 2002;
Snchez et al., 2005; Tonthubthimthong et al., 2001; Zkal et al., 2005).
1. Poseen alto coeficiente de difusin y viscosidad ms baja que los lquidos; 2.
Ausencia de tensin superficial, la cual aumenta la operacin de extraccin dada
la rpida penetracin de estos al interior de los poros de la matriz heterognea;3. La selectividad durante la extraccin puede ser manipulada dada la variacin
de las diferentes condiciones de operacin temperatura y presin afectando la
solubilidad de varios componentes en el fluido supercrtico; 4. La extraccin con
fluidos supercrticos no deja residuos qumicos; 5. La extraccin con CO2
supercrtico permite su fcil recuperacin por procesos de reciclaje. El CO2
supercrtico tambin ha sido usado en innumerables aplicaciones industriales
que incluyen diferentes campos como: alimentos, agricultura, acuicultura,
pesticidas, procesos microbianos, petroqumica y farmacutica (Brunner, 2005;
Snchez et al., 2005; Tonthubthimthong et al., 2001; Vagi et al., 2005).
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3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
3.1 FORMULACIN DEL PROBLEMA
Existe una gran incidencia de hongos fitopatgenos como Botrytis cinerea,
Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum en los cultivos de Albahaca
(Ocimum basilicum) tipo exportacin, en los invernaderos de la Facultad de
Agronoma de la Universidad nacional de Colombia, sede Bogot.
La enfermedades producidas por estos hongos fitopatgenos han ocasionado
prdidas en la produccin hasta de un 60%, debido a una considerable baja de
la calidad del producto, la disminucin de la productividad del cultivo y llegando
incluso la prdida total de las plantas.
Para evitar el control qumico de estos hongos se propone un manejo natural
integrado del extracto acuoso de Tomillo (Thymus vulgaris), que es conocido por
tener propiedades antifngicas, pero no ha sido evaluado sobre estos hongos
de gran importancia en el cultivo de la Albahaca.
3.2 JUSTIFICACIN
El control de patgenos con aceites esenciales y extractos de plantas aromticas
es un campo poco explorado en nuestro pas, aunque por muchos aos haya
habido evidencia del conocimiento de las propiedades de las plantas aromticas
y sus mltiples usos. El empleo de estas plantas y sus componentes han sido de
una forma artesanal.
Aprovechando la problemtica generada en cultivos de Albahaca (Ocimum
basilicum) tipo exportacin, por hongos fitopatgenos como Botrytis cinerea,
Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum en los invernaderos de la
Facultad de Agronoma de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogot;
nos lleva a pensar que esta problemtica tambin afecta a los productores de
plantas aromticas en nuestro pas.
La necesidad de buscar alternativas que sean viables para productores nos da la
pauta para evaluar la accin antifngica del extracto de de la planta aromtica
de Tomillo (Thymus vulgaris), que beneficiara en el futuro a un gran nmero de
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productores y comercializadores, ya que se dara a conocer un mtodo para
combatir los agentes causales de las enfermedades de la Albahaca (Ocimum
basilicum), y esto a su vez contribuira al estudio del manejo biolgico de las
enfermedades fitopatolgicas
La importancia de esta investigacin va encaminada a la bsqueda de nuevos
productos biolgicos que se pueden generar a un menor costo, y lo ms
importante es que tienen un efecto menos agresivo que los productos qumicos
en el medio ambiente.
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5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo General
Evaluar la actividad antifngica del extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) sobrelos hongos fitopatgenos Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia
sclerotiorum causantes de enfermedades en Albahaca (Ocimum basilicum).
5.2 Objetivos Especficos
Obtener extractos acuosos de Tomillo (Thymus vulgaris).
Probar las propiedades antifngicas del extracto de Tomillo (Thymus
vulgaris) sobre los hongos fitopatgenos Botrytis cinerea, Fusarium
oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum in vitro aislados de albahaca(Ocimum basilicum).
Evaluar la actividad antifngica del extracto de Tomillo (Thymus vulgaris)
sobre plantas de Albahaca (Ocimum basilicum) inoculadas con
Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea y Fusarium oxysporum en
pruebas de invernadero.
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5. MATERIALES Y METODOS
5.1 Diseo de la investigacin
El proyecto se realiz dentro de las instalaciones de los Laboratorios de Biologa
del Suelo y en los Invernaderos de la Facultad de Agronoma de la UniversidadNacional de Colombia, sede Bogot.
Este procedimiento se realiz con extracto de Menta (Mentha spicata) pero no
hubo ninguna inhibicin de crecimiento para los hongos, por eso se realiz con
tomillo, ya que no todos las plantas tienen los mismos principios activos.
Los extractos acuosos se realizaron con concentraciones de 150, 250 y 500 g/L
de extracto Tomillo en agua, el tratamiento trmico se realiz con tiempos de 15
y 30 min de ebullicin respectivamente, ya que en los tiempos 0, 45 y 60 min no
se observ inhibicin de ningn tipo. La tasa de crecimiento se midi los das 2,
5 y 7.
5.1.1 Obtencin de Extracto de Tomillo (Thymus vulgaris)
Se recolectaron plantas de Tomillo (Thymus vulgaris) de 10 semanas de edad
del Invernadero N 2 de la Facultad de Agronoma de la Universidad Nacional de
Colombia, sede Bogot, las cuales se cortaron con tijeras de podar, dejando
ramas de 2 centmetros sobre el eje principal de la planta. Posteriormente sepesaron y se procesaron en una picadora de cocina marca Oster.
Se utiliz 150 gramos, 250 gramos y 500 gramos respectivamente de material
vegetal fresco de Tomillo, pesados en Balanza analtica marca Petller P 5000, ya
molido se le practic un prelavado con solucin de hipoclorito de sodio al 0,2%
por 2 minutos y luego 4 lavados con agua destilada estril; se agregaron 1000ml
de agua doblemente destilada y esterilizada y se licuaron por separado hasta
obtener una mezcla homognea en licuadora industrial marca Oster por 5min.
Posteriormente se dispuso a ebullicin cada concentracin por 15, 30 y 45
minutos, se filtr utilizando cuatro capas de gasa estril y luego se utiliz bomba
al vaco con papel de filtro estril para la ltima filtracin. El extracto obtenido se
dejo enfriar, se dispuso en frascos hermticos Schott y se llev a refrigeracin en
oscuridad a 4 C hasta su utilizacin (Bianchi et al. 1997).
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5.1.2 Prueba in vitro
Las cepas de los hongos fitopatgenos Botrytis cinerea, Fusarium oxysporumy
Sclerotinia sclerotiorum; fueron aisladas anteriormente de plantas de Albahaca
(Ocimum basilicum) enfermas en el Laboratorio de Biologa del Suelo de laFacultad de Agronoma de la Universidad Nacional de Colombia, sede
Bogot. Las cepas se conservaron en Agar Papa Dextrosa (PDA OXOID ).
5.1.2.1 Evaluacin de la Inhibicin del Crecimiento Radial
La evaluacin de la actividad del extracto, contra hongos se hizo por medio de la
medicin del halo del crecimiento del hongo respecto al control negativo. Se
prepar Agar Papa Dextrosa (PDA OXOID ) como indica el fabricante, 39
gramos en 1000 mL de agua destilada estril, se dispuso a esterilizacin enautoclave de marca All American a 121 C por 15 minutos y luego se dispuso en
cajas de Petri estriles 50% de Agar Papa Dextrosa (PDA OXOID ) y 50% de
las diferentes concentraciones del extracto con los diferentes tiempos de
ebullicin, se dej solidificar y se llevaron a refrigeracin a 4 C hasta su
posterior utilizacin (Ramrez 1998).
Para la siembra se usaron rodajas de 3 mm de dimetro de colonias de los
hongos fitopatgenos de ocho das de edad que se cortaron con un
sacabocados. Para colocar la rodaja con el micelio en contacto con el medio decultivo en el centro de la caja se utilizaron palillos de madera de 10 centmetros
de largo y 2 milmetros de grosor puntiagudos esterilizados con calor seco. Las
cajas se sellaron y etiquetaron y se incubaron a 26 C.
Para la evaluacin de los hongos fitopatgenos se utiliz el procedimiento de
crecimiento radial midiendo el dimetro de la colonia a los dos, cinco y siete das
despus de la inoculacin (Martnez 1999).
Como control positivo se utiliz un producto comercial que tiene comocomponente activo Propamocarb-HCl, que se le adicion al Agar Papa Dextrosa
(PDA OXOID ) como indica la casa comercial y como control negativo se utiliz
Agar Papa Dextrosa (PDA OXOID ) para todos los hongos fitopatgenos.
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40
Para todas las concentraciones y los tiempos al igual que para los controles se
hizo 4 repeticiones para obtener datos representativos estadsticamente.
Se midi el dimetro en milmetros de la zona de crecimiento del hongo en
cuatro direcciones a intervalos de dos das tomando como resultado el valor
promedio de estas mediciones. Este ensayo se realiz cuatro veces por
duplicado determinndose el porcentaje de crecimiento y el porcentaje de
inhibicin del crecimiento del hongo para el extracto acuoso:
Dimetro del crecimiento del hongo
En el extracto X 100
% de crecimiento = -------------------------------------------------------
Dimetro del control negativo
% de inhibicin = 100-% de crecimiento
Los resultados obtenidos se evaluaron considerndose activo los extractos que
presentaron un porcentaje de crecimiento menor o igual al 80 y un porcentaje de
inhibicin mayor o igual al 20 (Mrquezet al. 2007).
5.1.3 Prueba de Invernadero
Se sembraron en un banco de propagacin en los invernaderos de la Facultad
de Agronoma de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogot; 200
semillas de plantas de Albahaca (Ocimum basilicum), las semillas se obtuvieron
en Semicol Ltda. Estas semillas se dispusieron en bandejas plsticas con turba
estril sin nutrientes, se les proporcion riego con aspersor cada dos das y al
paso de 30 das se realizaron los dos ensayos simultneos:
La inoculacin de la turba con Fusarium oxysporum se realiz tomando 1000gramos de turba por el hongo fitopatgeno, esta turba se esteriliz en autoclave
a 121C por 15 min. Se tomaron cajas de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA
OXOID ) con este hongos con 10 das de edad, se dispusieron perlas de vidrio
estriles con 20 ml de tween 80, se hicieron movimientos circulares para
desprender las esporas por 3 min, se realizaron conteos de esporas (del
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inculo) en cmara de Neubauer antes de iniciar el proceso para obtener una
concentracin inicial, este inculo se mezcl con 500 ml de agua destilada estril
y se llev a una concentracin de 1 x 107 esporas / ml. Para inocular la turba con
Fusarium oxysporum, se tom 1000 gramos de turba estril en empaques
individuales y flexibles en polietileno con cierre hermtico y se incub durante 7
das a 26C, se realizaron 4 repeticiones (Rodrguez 2004).
El inculo de Sclerotinia sclerotiorum y Botrytis cinerea, se realiz tomando
esclerocios de los hongoscon 10 das de edad en medio PDA, se dispusieron 50
esclerocios en dos porciones de 1000 gramos de turba estril en empaques
flexibles en polietileno con cierre hermtico y se incub durante 7 das a 26C.
Se realizaron 4 repeticiones (Rodrguez 2004).
Se tom 2000 gramos adicionales de turba estril para los controles, sin
patgenos.
Al cabo de 7 das de la inoculacin de la turba, las plantas de Albahaca (Ocimum
basilicum) de 30 das de edad se transplantaron a recipientes de poliestireno
expandible de 4 onzas.
Se le proporcion 100 gramos de turba inoculada con los tres hongos
fitopatgenos respectivamente a cada recipiente, y la turba estril se dispuso 4
recipientes para el control positivo y 4 para el negativo.
A las plantas se les dispuso una bolsa de plstico para crear un micro ambiente
hmedo por 72 horas. Despus de la siembra se regaron con aspersor cada dos
das por 15 das. Cuando se evidenci crecimiento micelial sobre la turba, se les
proporcion a cada planta por aspersin 20 mL de las diferentes
concentraciones utilizadas en el ensayo in vitro tendran efecto antifngico, cada
dos das por 15 das ms.
A cada una de las plantas restantes se aplic 20 mL por aspersin de lasdiferentes concentraciones del extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) y a los 10
das se inculo la turba con Sclerotinia sclerotiorum(5 esclerocios / 100 gramos
de turba). El riego fue cada dos das con aspersor por 15 das.
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Se midi el porcentaje de la planta afectada. Como referencia se us una tabla
de incidencia y severidad de la enfermedad. Como control se tomaron plantas
sin aplicacin de los extractos. Se tom por cada tratamiento 4 repeticiones.
Se realiz el anlisis estadstico utilizando el programa SAS.
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6. RESULTADOS Y DISCUSIN
6.1 PRUEBA IN VITRO
6.1.2 EVALUACIN DE LA INHIBICIN DEL CRECIMIENTO RADIAL
Muchas plantas han sido aceptadas para su uso antifngico porque en su
anlisis qumico y evaluacin farmacolgica han demostrado que contienen un
principio especial, (Zapataet al., 2003) labsqueda es muy intensa en casi todo
el mundo y se basa en explorar el parentesco sistemtico con plantas curativas
ya reconocidas que han servido para hallar otras nuevas; o bien se han
descubierto por casualidad o por validacin sistmica de la flora de una regin
(Romero et al., 2006).
Las concentraciones a las cuales se produjo la inhibicin son altas con respecto
a otros estudios hechos con diferentes tipos de plantas; sin embargo, se debe
tener en cuenta que se est trabajando con extractos crudos que contienen otros
metabolitos o impurezas sin actividad antifngica.
Dada la extensa variedad de la flora y los numerosos principios activos que en
ella se encuentran, es muy probable que de esta fuente puedan aislarse
molculas novedosas y eficaces para ser usadas como antimicticos; dado que
en la literatura revisada no se encontraron reportes de estudios fitoqumicos que
aislaran o implicaran una sustancia qumica en particular con efectos
antifngicos, no es posible, por el momento, definir la naturaleza qumica de los
compuestos bioactivos de esta especie. A partir de tomillo frescose han aislado
Carvacrol (2-hidroxi -p. cimeno) y P- cimenol (Isopropil-tolueno) a las cuales se
les ha encontrado actividad antifngicas (Espitia, 2004).
En nuestra poblacin existe una amplia tradicin en el uso emprico de plantas
con fines medicinales (Marnet al., 2006);es por tanto, muy importante validar a
travs de la experimentacin, la eficacia y seguridad de las mltiples especies
vegetales utilizadas.
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Los extractos acuosos de tomillo en las concentraciones empleadas tienen
efecto inhibitorio sobre las tres cepas evaluadas. Mediante la prueba de
comparar el comportamiento en conjunto de todos los tratamientos se
encuentran diferencias significativas entre todos los tratamientos.
Segn lo descrito por Vokou et al. (1993) y Daferera et al. (2003), tomillos de
diferentes orgenes geogrficos mostraron que los componentes mayoritarios
son el carvacrol, en la mayora de las muestras estudiadas, el timol, en un
nmero menor de casos, o una sumatoria de estos dos compuestos fenlicos
conformando entre el 50 y 90% del total. Como componentes secundarios estn
descriptos en estos trabajos, el p-cimeno y al terpineno en todas las muestras
analizadas.
La capacidad antifngica podra ser atribuida a la presencia de los compuestos
monoterpnicos fenlicos, principalmente timol y carvacrol. Se ha informado la
reactividad de los grupos hidroxilofenlicos, formando enlaces puentes de
hidrgenos con sitios activos de ciertas enzimas (Farag et al., 1989). Adems
estos compuestos atacan la membrana citoplasmtica del microorganismo
destruyendo la capacidad selectiva y permitiendo el escape de componentes
intracelulares (Nychas, 1995) lo que sumado a su capacidad de inactivar
enzimas, explicara la actividad contra el desarrollo fngico.
Un ejemplo de este comportamiento son los datos obtenidos de la administracin
del extracto acuoso de tomillo, en estos ensayos, donde se encontr correlacin
entre los das de administracin y la accin inhibitoria.
En las siguientes figuras los resultados de la evaluacin de la actividad
antifngica del extracto acuoso, se aprecia el crecimiento de los hongos
patgenos y se evidencia la respuesta de inhibicin de los extractos junto con los
controles ensayados
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45
Porcentaje de Crecimiento segn concentracin
010
20
3040
50
6070
8090
100
2 5 7
Da
%
Conc. 150 Conc . 250 Conc . 500 Desv . Std.
FIG.1. Porcentaje de Crecimiento segn concentracin
En la Figura 1 se observa que la concentracin de extracto acuoso de 500g/L
fuel el que obtuvo menor crecimiento (60%) en los das de evaluacin, en los
das 5 y 7 se mantuvo el porcentaje de crecimiento de los hongos, esto
comparado con la concentracin de 150 g/L que obtuvo un crecimiento del 90%
en el da 5.
Porcentaje de Crecimiento segn Tiempo
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
2 5 7
Da
%
15 min. 30 min. Desv. Std.
FIG.2.Porcentaje de crecimiento segn tiempo.
El extracto con el tratamiento trmico de 30 min fue el que obtuvo un menor
porcentaje de crecimiento de los hongos 63% el da 5 y el da 7 un 58 % de
crecimiento; el tratamiento trmico de 15 min obtuvo un crecimiento de los
hongos ms alto 80% en el da 5 y 72% el da 5 respectivamente (Figura2).
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46
Porcentaje de Crecimiento segn Especie
0
20
40
60
80
100
120
2 5 7
Da
%
Fusarium oxysporum Botrytis cinerea
Sclerotinia sclerotiorum Desv. Std.
FIG.3. Porcentaje de Crecimiento segn especie.
B. cinerea tuvo un mayor crecimiento en los tres das evaluados, F. oxysporum
en el da 5, tuvo un porcentaje de crecimiento del 52%, mientras que B. cinerea
tuvo uno de 107%, S. sclerotiorumtuvo un porcentaje de 46%. El da 7 se obtuvo
una disminucin del porcentaje de crecimiento de F. oxysporum (27%) y B.
cinerea (81%), mientras S. sclerotiorum tuvo aumento en el porcentaje de
crecimiento de 35% (Figura 3)
Porcentaje de inhibicin segn concentracin
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
2 5 7
Da
%
Conc. 150 Conc. 250 Conc. 500 Desv. Std.
FIG.4. Porcentaje de Inhibicin segn concentracin.
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47
El porcentaje de inhibicin de la concentracin de 500g/L fue el que obtuvo un
mayor valor (48%) en el da 5 y en el da 7 fue 44%, esta concentracin fue la
que alcanzo un menor porcentaje de crecimiento y un mayor porcentaje de
inhibicin de los tres hongos (Figura 4)
Por el valor del porcentaje de inhibicin de los das 5 y 7 en la concentracin
500g/L se presume que la accin antifngica del extracto permanece durante
estos das; ya que su poder de inhibicin disminuye en un 2% durante estos dos
das, el porcentaje de inhibicin del extracto de 250g/L, aunque es menor el
comparado con el de la contraccin de 500g/L, en el da 5 fue de 41% y aumento
en un 3% el da 7. El porcentaje de inhibicin de la concentracin 150g/L fue la
menor, aumento un 4% del da 5 al 7 (Figura 4).
Porcentaje de inhibicin s egn tiem po
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
2 5 7
Da
%
15 min. 30 min. Desv. Std.
FIG.5.Porcentaje de inhibicin segn tiempo.
El porcentaje de inhibicin con tratamiento trmico de 30 min fue el que produjo
un mayor valor 42% el da 5 y 44% el da 7, El tratamiento con 15 min alcanzo
en el da 5 un porcentaje de 34% y disminuyo el da 7 hasta 31 %. El
tratamiento trmico de 30 min fue el que obtuvo un menor porcentaje de
crecimiento y un mayor porcentaje de inhibicin de los hongos (Figura 5).
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Porcentaje de Inhibicin segn espec ie
0
10
20
30
40
50
6070
80
90
100
2 5 7
Da
%
Fusar ium oxysporum Botry tis c inerea
Sclerotinia sclerotiorum Desv. Std.
FIG. 6.Porcentaje de Inhibicin segn especie.
F. oxysporum tuvo un porcentaje de inhibicin el da 5 de 46% y el da 7 la
inhibicin aumento en un 28%. Mientras que S. sclerotiorum el da 5 obtuvo una
inhibicin de 53% y fue disminuyendo hasta llegar a 15 %. B. cinereael da 5
alcanzo un porcentaje de inhibicin del 19 y aumento el da 7 a 22% (Figura 6).
Teniendo en cuenta que el porcentaje de inhibicin mayor al 20% es positivo
para evidenciar la inhibicin del crecimiento de los hongos (Mrquezet al. 2007),
la concentracin del extracto acuoso con una concentracin de 500g/L y un
tratamiento trmico de 30 min, es el que obtiene la propiedad antifngica capaz
de disminuir el crecimiento de los hongos (Figura 6).
La inhibicin del crecimiento micelial de F. oxysporum se observaen la figura 7
donde el control, es decir el medio de cultivo que no tiene adicin de extracto
acuoso de tomillo se ve invadido completamente con el hongo patgeno,
mientras que con la adicin del extracto inhibe su normal desarrollo.
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Fusarium oxysporum
Da 7
150g/L 150g/L
Control
250g/L250g/L
500g/L500g/L
15 min 30 min
FIG. 7. Crecimiento F. oxysporum en extracto Albahaca da 7
B. cinereatuvo un comportamiento en el crecimiento similar al de F. oxysporum
en el control; con la adicin al medio de cultivo del extracto acuoso de tomillo se
observa una inhibicin del crecimiento con los tratamientos utilizados (Figura 8).
Botrytis cinerea
Da 7
Control
15 min
150g/L
250g/L
500g/L
150g/L
250g/L
500g/L
30 min
FIG. 8. Crecimiento B. cinerea en extracto Albahaca da 7.
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50
En la figura 9 se observa que S. sclerotiorum tuvo un menor crecimiento en el
medio con el extracto en todas las concentraciones y con los tratamientos
trmicos comparados con el control.
Sclerotinia sclerotiorum
Da 7
150g/L 150g/L
Control
250g/L250g/L
500g/L500g/L
15 min30 min
FIG. 9. Crecimiento S. sclerotiorum en extracto Albahaca da 7.
En las figuras anteriores (Figura 7, 8 y 9) se observa que el extracto de tomillo
logra inhibir el crecimiento normal de los hongos patgenos, los controles que no
estn adicionados con el extracto confirma el comportamiento normal en el
crecimiento de los hongos patgenos.
6.2 PRUEBA DE INVERNADERO
Al evidenciarse la enfermedad, se aplic el extracto que tuvo mayor valor en el
porcentaje de inhibicin contra los fitopatgenos en la prueba in vitro, esteextracto fue el de concentracin de 500g/L con un tiempo de ebullicin de 30
min; se calcul el porcentaje de incidencia y severidad de la enfermedad con
cada planta inoculada con los diferentes hongos fitopatgenos, tomando como
referencia la siguiente escala.
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ESCALA DE SEVERIDAD
NIVEL PORCENTAJE SNTOMAS
0 0 Planta sana
1 0 - 10 Leves
2 10 - 50 Severos
3 50 -75 Muy severos
4 75 Planta muerta
TABLA N 2. Escala de Severidad (Agri os, 1998)
FIG. 10.Escala de Severidad (Agrios, 1998)
6.2.1 FUNCIN CURATIVA
La dosis del extracto se le aplic a las plantas cuando se observ el crecimiento
micelial por encima de la turba. En las figuras 11 y 12 se puede observar que S.
slcrerotiorum presenta un mayor porcentaje de incidencia de enfermedad con un
valor de 44%, y un porcentaje de severidad de 71.5%, este es uno de los hongos
fitopatgenos con alto grado de agresividad en el cultivo de albahaca, se
demuestra que tiene la capacidad de causar graves daos a los cultivos y tiene
una incidencia alta por encima de los otros hongos fitopatgenos utilizados paraeste estudio.
% INCIDENCIA Nivel Curativo
3239
44
14
23
0
10
20
30
40
50
60
70
80
HONGOS FITOPATOGENOS
%
F. oxysporum
Sclerotinia sclerotiorum
B. Cinerea
C+
C-
FIG. 11. Porcentaje de Incidencia de la enfermedad causada por hongos con aplicacin de extracto
de tomillo a nivel Curativo.
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52
% SEVERIDAD Nivel Curativo
10
71,5
26,9
1 6
-10
0
10
20
30
4050
60
70
80
HONGOS FITOPATOGENOS
%
F. oxysporum
SclerotiniasclerotiorumB. Cinerea
C+
C-
FIG. 12. Porcentaje de Severidad de la enfermedad causada por hongos con aplicacin de extracto
de tomillo a nivel Curativo.
6.2.2 FUNCIN PREVENTIVA
El extracto acuoso de tomillo con tratamiento trmico se aplic antes de la
inoculacin durante 10 das. Al observar las figuras 13 y 14 se puede establecer
que S. sclerotiorum, presenta un porcentaje de incidencia y de severidad ms
alto que los otros hongos (25% de incidencia y 18 % de severidad). Aunque
estos porcentajes comparados con los valores del funcin curativa de extractosean ms bajos S. sclerotiorumsigue siendo la mayor amenaza en el cultivo de
albahaca.
B. cinerea es el segundo hongo con valores ms altos de porcentajes de
incidencia y severidad, en la funcin preventiva se disminuy el valor del
porcentaje de incidencia ms de la mitad con respecto a la funcin curativa del
extracto, 44% a nivel curativo y 21% a nivel preventivo, por otro lado, los
resultados en el porcentaje de severidad de la enfermedad no son buenos,
26.9% de severidad en la funcin curativa y 17% en la funcin preventiva. Al
observar estos resultados se demuestra que la prevencin es la mejor opcin de
atacar enfermedades causadas por microorganismos(Figuras 13 y 14).
7/24/2019 tesis100.pdf
53/71
53
Siendo F. oxysporum uno de lo hongos ms agresivos sobre muchos cultivos,
fue el que menor porcentaje de incidencia y severidad tuvo con la funcin
curativa y preventiva del extracto (Figuras 13 y 14).
% INCIDENCIA Prevencin
16
2521
59
0
10
20
30
40
50
60
70
80
HONGOS FITOPATOGENOS
%
F. oxysporum
Sclerotinia sclerotiorum
B. Cinerea
C+
C-
FIG. 13. Porcentaje de Incidencia de la enfermedad causada por hongos con aplicacin de extracto
de tomillo a nivel
![H20youryou[2] · 2020. 9. 1. · 65 pdf pdf xml xsd jpgis pdf ( ) pdf ( ) txt pdf jmp2.0 pdf xml xsd jpgis pdf ( ) pdf pdf ( ) pdf ( ) txt pdf pdf jmp2.0 jmp2.0 pdf xml xsd](https://img.pdfslide.net/doc/110x75/60af39aebf2201127e590ef7/h20youryou2-2020-9-1-65-pdf-pdf-xml-xsd-jpgis-pdf-pdf-txt-pdf-jmp20.jpg)
