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Thermo ScientificSMART Digest キット テクニカルガイド
優れた再現性 タンパク質の高速酵素消化を実現
C H R O M A T O G R A P H Y C O N S U M A B L E S
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Thermo Scientifi c™ SMART
Digest™キットは、バイオ医薬やプロテオミクスアプリケーションで要求されるハイスループットワークフローにおいて、高い再現性や感度、高速分析を実現するためにデザインされています。SMART
Digestキットは、最適化、熱安定性に優れ、固定化トリプシンを採用しているためハイスループットワークフローを可能にします。
バイオ医薬、タンパク質研究分野の課題
現代のバイオ医薬やタンパク質研究では、高品質の分析結果やハイスループット、規制対応が課題となっており、このような課題に対応するにはサンプルの前処理が非常に重要です。しかし現在の技術は、再現性および感度が悪く、自動化できない、完全な消化に24時間を要するメソッドなどに依存しています。
これらの要求に応えるには、次のような特長を持つ分析ワークフローが必要です：• 高再現性 • 高感度 • データ品質の向上 •
自動化への対応
SMART
Digestキットは簡単に使用でき、分析ワークフローの要求を満たすことができます。既存の標準的な溶液中酵素消化法よりもはるかに優れた手法です。
• 溶液中消化よりも速い消化スピード • 3ステップの前処理法 • ハイスループット • 自動化可能 •
溶液中消化より優れた再現性 • 高感度
SMART Digestキットによりシンプルで再現性あるタンパク質の高速消化を実現
2
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Analyze yoursample
SS
SH
SH
Peptide sequence
Digested fragments
Arginine: R Lysine: K Trypsin cleavage:
DTT EnzymeCys-S
I
H2N
O
O
Enzyme
Cys
H2NS
標準的な消化法
SMART Digest
SMART
Digestキットではシンプルなサンプル前処理を行えるため、エラーを低減するだけでなく、サンプル前処理の時間を大きく削減します。
現在のタンパク質消化のためのサンプル前処理法は、多くの手順と人手を必要とします。複数の反応液を使用する消化ではエラーが多数生じるため、再現性の不良が起こりやすくなり、多大なサンプル前処理時間を費やすことになります。
SMART Digest
キットは、3ステップ、シンプルな操作、シンプルなプロセス、高いデータ信頼性と卓越した再現性により、これらの課題を解決します。すべての手順を自動化して、前処理をハイスループット化することができます。
SMART Digestキットの利用により効率的でシンプルなワークフローを実現
タンパク質濃度の確認調製
タンパク質サンプルをSMART Digestチューブに加える
Thermo Scientifi c SOLAµ™ SPE または
遠心／フィルター（オプション）
SMART Digestチューブを加熱／振とう
還元 アルキル化 トリプシンによる消化
分析
分析
3
-
0
2000
020 40 60 80 100
4000
6000
8000
10000
12000
021
IgG 分析 m/z 937
60分ですべての消化が完了
SMART
Digestプロセスはシンプルなだけでなく、サンプルの前処理から分析までの時間を飛躍的に削減します。サンプルの種類にもよりますが、通常は60分以内で消化できます。下に、IgGを全消化した場合の例を示します。
＊SMART Digestは、200 pg～ 3.5 mg程度のタンパク質が消化できます。
SMART Digest vs 溶液中消化法
溶液中消化
-
2.5-10
Time (mins)
mA
U
4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32.5
50
100
150
200 機器： Thermo Scientifi c Vanquish™ UHPLC システムカラム： Thermo
Scientifi c Acclaim™ RSLC 120、C18、2.2 µm Analytical （2.1 × 250 mm）
（P/N 074812） 移動相 A： 0.05% TFA 水溶液移動相 B： 0.04% TFA 含有 8/2 アセトニトリル/水
（v/v）グラジエント： 時間 （分） %A %B 0.0 96 4 30 50 50 31 10 90 35 10 90 36 96
4 45 96 4流量： 0.40 mL/min注入量： 5 µL温度： 80 ºC検出器： 214 nm、データ採取レート 20
Hz、 レスポンスタイム 0.2 secデータ処理： Thermo Scientifi c Dionex™ Chromeleon™
7.2 クロマトグラフィーデータシステム
ピーク# 保持時間（分）保持時間 （%RSD）3 3.315 0.0829 5.231 0.065 14 6.532 0.017
15 6.937 0.023 19 10.290 0.021 23 12.013 0.012 31 14.011 0.013 39
15.177 0.012 42 15.589 0.010 51 17.511 0.007 55 17.969 0.011 61
18.546 0.010 83 20.798 0.010 85 21.095 0.012 87 22.386 0.009 96
24.774 0.012 103 26.155 0.009 106 26.155 0.009 109 27.529 0.010
SMART
Digestキットは、サンプル処理のエラーを低減し、より高いスループットでさらに多くのデータを取り出し、既存の方法よりも再現性を向上させます。SMART
Digestキットを用いた、mAb消化物の13回重ね書きのクロマトグラムを下に示します。表から分かるように、
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5000
0475.4
Comparison to Historical Method
604.5 636.5
10000
15000
20000
25000
30000
35000
SMART Digest
Clarke （2012）*
感度／データ品質SMART
Digestキットは、還元やアルキル化のステップがなく、トリプシンの残存も少ないため、高いシーケンスカバレッジを提供します。最終サンプル中の反応液や残存するトリプシンが削減されるだけではなく、翻訳後修飾も削減されるため、LC-MS分析におけるシグナルのサプレッションが低減します。
ヒト血漿からのサイログロブリンを、溶液中消化法 *とSMART Digest法で消化し、質量分析計 （MS）
ピーク面積の応答性比較を行ったところ、SMART
Digest法が優れた感度を示しました。さらに、溶液中消化法では消化に20時間かかりましたが、SMART
Digest法ではわずか3.5時間で終わりました。
ピーク面積
プリカーサーイオン （m/z）
*Clarke, N. J., et al.; J. Inv. Med. 2012, 60, 1157-1163
溶液中消化法とSMART Digest法の比較
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オーダーインフォメーション
関連製品
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SOLAµ HRP SPE プレート
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Thermo Scientific 生体分子分離のワークフロー
さまざまな生体分子を幅広くキャラクタライズ
サンプル前処理 サンプルハンドリング
データ管理
分離と検出
TEL 0120-753-670 FAX 0120-753 -671 〒221-0022 横浜市神奈川区守屋町3
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販売店CCS030_A1507CE
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