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Tierärztliche Hochschule Hannover
Etablierung der Mikrodialyse zur Bestimmung von Sulfonamidkonzentrationen
in der Nasennebenhöhlenschleimhaut des Pferdes
INAUGURAL-DISSERATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Caroline Gietz
Bremen
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Bernhard Ohnesorge
Klinik für Pferde
1. Gutachter: Prof. Dr. Bernhard Ohnesorge 2. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Bäumer Tag der mündlichen Prüfung: 08.05.2012 Gefördert durch: CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH, Burgdorf
Meinen Eltern und Großeltern
Teile dieser Dissertation wurden in Form eines Vortrags auf folgender
Fachtagung präsentiert:
22. Arbeitstagung der Fachgruppe Pferdekrankheiten der Deutschen Veterinär-
medizinischen Gesellschaft e. V. in Hannover (2012):
GIETZ C, OHNESORGE B, KIETZMANN M, STAHL J, STASZYK C,
BIENERT-ZEIT A
Untersuchungen zur Pharmakokinetik von Sulfadimidin in der Nasenneben-
höhlenschleimhaut von Pferden mittels Mikrodialyse.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 3
2.1 Sinusitis des Pferdes 3
2.1.1 Klinische Anatomie der Nasennebenhöhlen 3
2.1.2 Vorkommen von Sinusitiden 5
2.1.3 Ätiopathogenese von Sinusitiden 6
2.1.4 Symptome von Sinusitiden 7
2.1.5 Diagnose von Sinusitiden 8
2.1.6 Therapie von Sinusitiden 12
2.1.7 Prognose von Sinusitiden 14
2.2 Potenzierte Sulfonamide 15
2.2.1 Struktur und Klassifizierung 15
2.2.2 Pharmakokinetische Eigenschaften 16
2.2.3 Pharmakodynamische Eigenschaften 19
2.2.4 Resistenzen 23
2.2.5 Indikationen und Kontraindikationen 24
2.2.6 Unerwünschte Arzneimittelwirkungen 25
2.2.7 Anmerkung zum verantwortungsbewussten Umgang mit Antiinfektiva in der Veterinärmedizin 27
2.2.8 Verwendetes Präparat 27
2.3 Antiinfektiva-Konzentrationen in Zielgeweben 28
2.3.1 Definition: Zielgewebe von Antiinfektiva 28
2.3.2 Einflussfaktoren auf die Gewebegängigkeit von Antiinfektiva 29
2.3.3 Notwendigkeit der Bestimmung von Antiinfektiva-Konzentrationen in Ziel- geweben 31
2.3.4 Methoden zur Bestimmung von Antiinfektiva-Konzentrationen in Zielgeweben 33
2.4 Mikrodialyse 37
2.4.1 Grundprinzip der Mikrodialyse 37
2.4.2 Berechnung der Wiederfindung 38
2.4.3 Anwendung der Mikrodialyse 44
2.4.4 Vor- und Nachteile der Mikrodialyse 46
Inhaltsverzeichnis
3 Material und Methoden 47
3.1 Vorversuche 47
3.1.1 Implantation des Mikrodialysekatheters 47
3.1.2 In-vitro-Kalibration der Mikrodialysekatheter 48
3.2 Hauptversuch 53
4 Ergebnisse 55
4.1 Vorversuche 55
4.1.1 Implantation des Mikrodialysekatheters 55
4.1.2 In-vitro-Kalibration der Mikrodialysekatheter 57
4.2 Hauptversuch 58
5 Manuscript I 61
5.1 Abstract 61
5.2 Introduction 62
5.3 Materials and Methods 63
5.3.1 Horses 63
5.3.2 Microdialysis equipment 64
5.3.3 Microdialysis probe implantation 64
5.3.4 In vivo microdialysis study 67
5.3.5 Post-surgical treatment 67
5.3.6 Histological analysis 68
5.4 Results 68
5.4.1 Microdialysis probe implantation 68
5.4.2 In vivo microdialysis study 69
5.4.3 Post-surgical outcome 70
5.4.4 Histological analysis 71
5.5 Discussion 72
5.6 Conclusion 75
5.7 Tables and Figures 76
Inhaltsverzeichnis
6 Manuscript II 81
6.1 Abstract 81
6.2 Introduction 82
6.3 Materials and Methods 84
6.3.1 Horses 84
6.3.2 Microdialysis equipment and probe implantation 84
6.3.3 Reagents 85
6.3.4 In vivo experiment 85
6.3.5 Drug analysis 86
6.3.6 Calculation of recovery values and paranasal mucosa concentrations 87
6.3.7 Data analysis 88
6.4 Results 88
6.5 Discussion 90
6.6 Conclusion 95
6.7 Figures and Tables 96
7 Übergreifende Diskussion 99
7.1 Implantation des Mikrodialysekatheters 99
7.1.1 Methodisches Vorgehen 99
7.1.2 Auswirkungen der Katheterimplantation auf Knochen und Schleimhaut 100
7.1.3 Eignung des verwendeten Mikrodialysesystems für die Anwendung in der Nasennebenhöhle des Pferdes 102
7.2 Mikrodialyse 103
7.2.1 Kalibration des Mikrodialysesystems 103
7.2.2 Schwankungen der Dialysatvolumina 106
7.3 Sulfadimidinkonzentration 107
7.3.1 Nachweis von Sulfadimidin im Mikrodialysat und Berechnung der Sulfadimidinkonzentrationen in der Nasennebenhöhlenschleimhaut 107
7.3.2 Beziehung zwischen den Wirkstoffkonzentrationen im Plasma und in der Nasennebenhöhlenschleimhaut 108
7.3.3 Pharmakokinetische Simulation 108
7.3.4 Gewebekonzentration im Verhältnis zu MHK-Werten 111
7.3.5 Mögliche Einflussfaktoren auf die Gewebekonzentration 111
Inhaltsverzeichnis
7.4 Auswirkungen der Mikrodialyse-Studie auf die Pferde 113
7.4.1 Postoperative Auswirkungen der Katheterimplantation 113
7.4.2 Durchführung In-vivo-Mikrodialyse-Studie 114
7.5 Schlussfolgerungen 115
8 Zusammenfassung 117
9 Summary 119
10 Literaturverzeichnis 121
11 Danksagung 141
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
AP Appaloosa
AR Araber, Arabian
AUC Fläche unter der Kurve, area under the curve
AUMC Fläche unter der ersten-Moment-Kurve, area under the first moment curve
bilat. bilateral
bzw. beziehungsweise
C Konzentration, concentration
C0 Initialwirkstoffkonzentration, initial drug concentration
Clast Wirkstoffkonzentration zur Zeit des letzten Probenentnahmezeitpunktes innerhalb eines Dosierungsintervalls, drug concentration at the last observation during the respective dosing interval
Cmax maximale Wirkstoffkonzentration, maximum drug concentration
ca. circa
Ch. Kapitel, chapter
Cl Gesamtkörperclearence, total body clearence
cm Zentimeter, centimeter
CMS Sinus maxillaris caudalis
CT Computertomographie
d Tag(e), day(s)
d. h. das heißt
DNA Desoxyribonukleinsäure
EDTA Ethylendiamintetraacetat, ethylendiamintetraacetic acid
e. g. exempli gratia
Abkürzungsverzeichnis
EMEA European Agency for the Evaluation of Medicinal Products
et al. et alii
etc. et cetera
evtl. eventuell
F weiblich, female
FDA Food and Drug Administration
Fig. Abbildung, figure
FS Sinus frontalis
g Gramm, gram
ggf. gegebenenfalls
h Stunde(n), hour(s)
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, high-performance liquid chromatography
HWZ Halbwertszeit
i. d. R. in der Regel
IS interner Standard, internal standard
ISF interstitielle Flüssigkeit, interstitial fluid
i. v., IV intravenös, intravenous(ly)
k. A. keine Angabe
Kap. Kapitel
kg Kilogram, kilogram
l Liter, liter
L links, left
Lnn. mand. Lymphonodus mandibularis
M männlich, male
MD Mikrodialyse, microdialysis
Abkürzungsverzeichnis
µg Mikrogramm, microgram
mg Milligramm, milligram
MHK minimale Hemmkonzentration
MIC minimale Hemmkonzentration, minimal inhibitory concentration
Min, min Minute(n), minute(s)
µl, µL Mikroliter, microliter
µm Mikrometer, micrometer
mm Millimeter, millimeter
Mo. Monat(e), month(s)
MRT mittlere Verweildauer, mean residence time
MW Mittelwert
n Anzahl, amount
NA Nasenausfluss
ND Nasenausfluss, nasal discharge
NMA Apertura nasomaxillaris
NNH Nasennebenhöhle(n)
No. Nummer, number
NQ nicht quantifizierbar
Nr. Nummer
NSAID nicht-steroidale Antiphlogistika, non-steroidal anti-inflammatory drugs
OAW obere Atemwege
PBS phosphat-gepufferte Salzlösung, phosphate buffered saline
PEH progressives Siebbeinhämatom
PD Pharmakodynamik, pharmacodynamic
pH negativ dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration
Abkürzungsverzeichnis
PK Pharmakokinetik, pharmacokinetic
pKa negativ dekadischer Logarithmus der Ionisationskonstante einer Säure
q quaque: jede, every
R rechts, right
Ref. Referenzphase
RL relativer Verlust, relative loss
RMS Sinus maxillaris rostralis
rpm Umdrehungen pro Minute, revolutions per minute
RR relative Wiederfindung, relative recovery
s Sekunde(n), second(s)
S Sulfonamid
SD Standardabweichung, standard deviation
SDM Sulfadimidin, sulfadimidine
SDZ Sulfadiazin, sulfadiazine
SF Sinus frontalis
SI gesuchte Substanz, substance of interest
sog. sogenannt
ssp. subspecies
ST Traber, Standardbred
Staph. Staphylococcus
Strept. Streptococcus
t Zeit, time
tmax Zeit bis zum Erreichen der maximalen Wirkstoffkonzentration, time to reach maximum drug concentration
t1/2 Halbwertszeit, elimination half-life
Tab. Tabelle, table
Abkürzungsverzeichnis
TMP Trimethoprim
TMS Trimethoprim-Sulfonamid, trimethoprim-sulfonamide
US Untersuchung
U. S. United States (of America)
Vss Verteilungsvolumen im Steady State, volume of distribution at steady state
Vz Verteilungsvolumen während der terminalen Phase, volume of distribution based on the terminal phase
v. a. vor allem
vs. versus
WB Warmblut, warmblood
y Jahr(e), year(s)
z. B. zum Beispiel
°C Grad Celsius, degree Celcius
% Prozent, percent
λz terminale Dispositionskonstante, elimination rate constant
< kleiner als, less than
> größer als, greater than
≤ kleiner oder gleich, less than or equal to
≥ größer oder gleich, greater than or equal to
= gleich, equals
~ ungefähr, approximately
Die chemischen Elemente werden gemäß des internationalen Periodensystems abgekürzt.
Einleitung 1
1 Einleitung
Die Sinusitis des Pferdes stellt die häufigste Erkrankung der Nasennebenhöhlen
(NNH) des Pferdes dar (NICKELS 2006). Bei der Therapie von equinen Sinusitiden
werden vielfach Antiinfektiva eingesetzt, obwohl regelmäßig unzureichende
Therapieerfolge beschrieben worden sind (MASON 1975; BOULTON 1985;
TROTTER 1993; TREMAINE u. DIXON 2001b; DIXON u. O'LEARY 2012). Der
klinische Erfolg einer antimikrobiellen Therapie ist in hohem Maße davon abhängig,
ob und über welchen Zeitraum effektive Wirkstoffkonzentrationen am Ort der
Infektion erreicht werden (MCKENZIE 2009). Subinhibitorische
Wirkstoffkonzentrationen können eine Persistenz der Erreger zur Folge haben,
welche ihrerseits mit einem Therapieversagen und der Entstehung von bakteriellen
Resistenzen vergesellschaftet sein kann (MÜLLER et al. 2004; STEINER et al.
2004). Diese Aspekte sollten auch bei der Therapie equiner Sinusitiden in Betracht
gezogen werden.
Innerhalb eines Gewebes ist eine bakterielle Infektion zumeist auf den interstitiellen
Raum begrenzt, welcher somit das Zielgewebe für einen antimikrobiellen Wirkstoff
darstellt. Lediglich der nicht-plasmaproteingebundene Wirkstoffanteil kann
Kapillarmembranen überwinden und aus dem Plasmakompartiment in die
interstitielle Flüssigkeit übertreten (RYAN 1993). In Bezug auf Antiinfektiva bedeutet
dies, dass nur der ungebundene Wirkstoffanteil seine antimikrobielle Wirkung in der
interstitiellen Flüssigkeit (ISF) entfalten kann. Das Konzentrationsprofil eines
antimikrobiellen Wirkstoffs im Zielgewebe ist in besonderem Maße geeignet den
klinischen Erfolg einer Therapie abzuschätzen, daher sollten
Wirkstoffkonzentrationen direkt am Ort der Infektion, d. h. im Interstitium des zu
untersuchenden Gewebes bestimmt werden (JOUKHADAR et al. 2001; MÜLLER et
al. 2004). Die Mikrodialyse (MD) stellt eine Methode dar, welche die gezielte
Bestimmung des pharmakologisch aktiven Wirkstoffanteils in der ISF ermöglicht
(MÜLLER et al. 1996; JOUKHADAR et al. 2001; BRUNNER et al. 2005;
CHAURASIA et al. 2007). Diese Technik ist bereits zur Untersuchung
2 Einleitung
verschiedenster Wirkstoffe in humanen und tierischen Geweben, jedoch nicht im
Bereich der NNH, eingesetzt worden.
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Methode der MD für die
Anwendung in der NNH-Schleimhaut des Pferdes etabliert. Dies beinhaltete
zunächst die Methodenentwicklung zur Implantation eines MD-Katheters in die NNH
von Pferden. Ein weiteres Ziel der Arbeit war die kontinuierliche Bestimmung des
pharmakologisch aktiven Wirkstoffanteils des Antiinfektivums Sulfadimidin in der
NNH-Schleimhaut von Pferden mithilfe der In-vivo-MD nach systemischer
Wirkstoffapplikation.
Literaturübersicht 3
2 Literaturübersicht
2.1 Sinusitis des Pferdes
2.1.1 Klinische Anatomie der Nasennebenhöhlen
Die NNH stellen luftgefüllte und mit respiratorischer Schleimhaut ausgekleidete
Hohlräume dar, die sich ausgehend von der Nasenhöhle zwischen den Außen- und
Innenlamellen einzelner Schädelknochen entwickelt haben. Das Pferd besitzt sieben
paarige NNH (Abb. 2.1), welche in direkter und indirekter Verbindung mit der
Nasenhöhle der jeweiligen Seite stehen (NICKEL et al. 2001):
Stirnhöhle (Sinus frontalis)
rostrale Kieferhöhle (Sinus maxillaris rostralis)
kaudale Kieferhöhle (Sinus maxillaris caudalis)
Gaumenkeilbeinhöhle (Sinus sphenopalatinus)
dorsale Muschelhöhle (Sinus conchae dorsalis)
mittlere Muschelhöhle (Sinus conchae mediae)
ventrale Muschelhöhle (Sinus conchae ventralis)
Ein knöchernes Septum (Septum sinuum maxillarium) trennt die kleinere rostrale
Kieferhöhle von der größeren kaudalen und lässt so zwei funktionelle Kompartimente
innerhalb des NNH-Systems entstehen.
4 Literaturübersicht
Abb. 2.1: Schematische Darstellung der Nasennebenhöhlen des Pferdes (Sinus conchae mediae nicht dargestellt) (KÖNIG u. LIEBICH 2009).
Die NNH des Pferdes sind mit einer respiratorischen Schleimhaut ausgekleidet, die
bei gesunden Pferden einen glatten, feuchtglänzenden, rosafarbenen Überzug der
knöchernen Unterlage (TREMAINE et al. 1999) von 0,05 bis maximal 0,25 mm Dicke
(JLLIG 1910) darstellt. Auf histologischer Ebene (Abb. 2.2) besteht sie aus einem
zwei- bis vierschichtigen Flimmerepithel (Lamina epithelialis), welches vereinzelt
Becherzellen enthält. Die daruntergelegenen subepithelialen Schichten, Lamina
propria mucosae und Tela submucosa, bestehen aus einem lockeren Bindegewebe,
welches eine enge Verbindung mit dem sich knochenwärts anschließenden Periost
eingeht. Eingebettet in diese Schichten finden sich zahlreiche Gefäße und Drüsen
(JLLIG 1910; TREMAINE et al. 1999), letztere produzieren kontinuierlich ein
muköses Sekret, welches aktiv durch den ziliären Transportmechanismus in
Richtung der sinunasalen Öffnung (Apertura nasomaxillaris; NMA) transportiert wird
(BARAKZAI 2004). Über den so genannten „sinus drainage angle“ (Abflusswinkel) im
kaudalen Abschnitt des mittleren Nasenganges gelangt das Sekret in die kaudale
Nasenhöhle, von dort aus wird es weiter in den Nasopharynx transportiert und
schließlich abgeschluckt. Das Auftreten größerer Sekretmengen kann das
mukoziliäre Transportsystem überfordern, die Folge ist das Abfließen des Sekrets in
Richtung der Nüstern als Nasenausfluss (O'LEARY u. DIXON 2011).
Literaturübersicht 5
Abb. 2.2: Histologischer Schnitt durch die paranasale Schleimhaut eines Pferdes (Sinus frontalis). Die Lamina epithelialis (a) bildet ein mehrreihiges Flimmerepithel, welches vereinzelte Becherzellen (Pfeile) enthält. Knochenwärts schließen sich die subepithelialen Schichten (b) an, welche schließlich in das Periost (c) des Knochens (d) übergehen. (Bild: eigene Untersuchung)
2.1.2 Vorkommen von Sinusitiden
Der Begriff Sinusitis beschreibt die entzündliche Erkrankung der NNH. Die Inzidenz
von Erkrankungen der Nasen- und Nasennebenhöhlen des Pferdes wird von
BOULTON (1985) mit 1,06 % aller Patienten beziffert.
Sinusitiden können primär, d. h. ohne erkennbare prädisponierende Ursache, oder
sekundär als Folge von Erkrankungen der Zähne oder der NNH (Mykose,
Sinuszyste, progressives Siebbeinhämatom, Neoplasie, Trauma) auftreten
(O'LEARY u. DIXON 2011). Die Sinusitis des Pferdes ist zumeist sekundär bedingt,
ungefähr die Hälfte der Erkrankungen sind dentogenen Ursprungs (MASON 1975;
FEIGE et al. 2000; STOIAN et al. 2006). Sinusitiden treten beim Pferd i. d. R.
einseitig auf, können aber in seltenen Fällen auch bilateral vorkommen (TREMAINE
a
b
d
c
100 µm
6 Literaturübersicht
u. FREEMAN 2007; O'LEARY u. DIXON 2011). Die Mehrheit der Pferde befindet sich
bei Vorstellung bereits in einem chronischen Krankheitsstadium (BOULTON 1985;
TREMAINE u. DIXON 2001a). Es sind weder Alters-, Rasse- noch
Geschlechtsprädispositionen für bestimmte Formen der Sinusitis nachweisbar
(TREMAINE u. FREEMAN 2007).
2.1.3 Ätiopathogenese von Sinusitiden
Es gibt drei Schlüsselelemente, welche die physiologische Funktion der NNH
maßgeblich beeinflussen (REIMER et al. 1978): die Durchgängigkeit der natürlichen
Drainagewege, die Funktion des mukoziliären Systems sowie die Qualität und die
Menge der Sekrete. Diese Faktoren beeinflussen einander und so kann sich die
Störung eines dieser Faktoren nachteilig auf das gesamte System der NNH
auswirken.
Das Einwirken eines entzündlichen Reizes auf die Schleimhaut führt zu einer
erhöhten Sekretproduktion sowie zu einer Obstruktion der ohnehin englumigen NMA
durch hyperplastische und hypertrophische Veränderungen der Schleimhaut
(SIMHOFER u. ZETNER 2003; TREMAINE u. FREEMAN 2007). Dieses
Ungleichgewicht hat eine Ansammlung von Sekret und entzündlichem Exsudat in
den NNH zur Folge. Einwandernde Bakterien finden dadurch günstige
Wachstumsbedingungen vor (O'LEARY u. DIXON 2011). Eine granulozytäre
Einwanderung und Phagozytose führen schließlich zur Ausbildung eines Empyems
(SIMHOFER u. ZETNER 2003). Im weiteren Verlauf kann eingetrockneter Eiter
weitere Entzündungserscheinungen hervorrufen und so die Voraussetzungen für die
chronische Manifestation der Sinusitis schaffen (PERKINS u. BARAKZAI 2005;
DIXON u. O'LEARY 2012).
Primäre Sinusitis
Bakterielle oder virale Infektionen der oberen Atemwege schädigen das mukoziliäre
Reinigungssystem der paranasalen Schleimhaut und führen zu einer Stagnation von
Sekreten in den betroffenen Sinuskompartimenten mit den oben genannten
Konsequenzen (RUSH u. MAIR 2004). Bakterielle Erreger, die bei primären
Literaturübersicht 7
Sinusitiden kulturell nachgewiesen werden können, sind typischerweise β-
hämolysierende Streptokokken (BEARD u. HARDY 2001). Seltener werden auch
Pseudomonas aeruginosa, Bacteroides ssp., Escherichia coli, Staphylococcus ssp.,
Peptostreptococcus ssp. und Corynebacterium ssp. nachgewiesen (RUGGLES et al.
1993), wobei die ätiologische Bedeutung der Erreger häufig unklar bleibt
(TREMAINE u. FREEMAN 2007).
Es scheint, dass ältere Ponys mit equinem Cushing-Syndrom eine Prädisposition für
chronische oder rekurrierende Sinusitiden haben (TREMAINE u. DIXON 2001a;
RUSH u. MAIR 2004). Möglicherweise besteht ein Zusammenhang mit peridontalen
Erkrankungen und einer Immunsuppression durch Hyperadrenocortizismus (RUSH
u. MAIR 2004).
Sekundäre Sinusitiden
Bei sekundären Sinusitiden können einerseits Bakterien, die durch eine primäre
Grunderkrankung in die Sinus gelangt sind, zu den oben beschriebenen
entzündlichen Veränderungen führen, andererseits können raumfordernde Prozesse
in den NNH zu einer Obstruktion der NMA führen und so den Abfluss der
natürlicherweise auftretenden Sekrete verhindern (O'LEARY u. DIXON 2011).
Einzelheiten zu den Grunderkrankungen sind in Tab. 2.1 aufgeführt.
2.1.4 Symptome von Sinusitiden
Typischerweise werden Sinusitiden von einem einseitigen, mukopurulenten oder
purulenten Nasenausfluss begleitet (Tab. 2.1). Schwellungen im Angesichtsbereich
treten vermehrt bei Sinuszysten, sinunasalen Neoplasien und Traumata auf, d. h. vor
allem bei Läsionen, die mit raumfordernden Prozessen einhergehen (TREMAINE u.
DIXON 2001a). Auch die benachbarten Strukturen der Sinus, wie die
Nasenmuscheln, das Nasenseptum, die knöcherne Orbita oder der Ductus
nasolacrimalis können von diesen Mechanismen betroffen sein. In der Folge kann es
zur Verlegung der Nasengänge mit Dyspnoe und Stridor sowie zu Exophthalmus und
Epiphora kommen (BERTONE et al. 1993; FREEMAN 2003). Weiterhin sind
regelmäßig Vergrößerungen der ipsilateralen, mandibulären Lymphknoten
8 Literaturübersicht
feststellbar; Fistelbildungen im Angesichtsbereich hingegen sind seltener zu
beobachten und zumeist begleitend bei dentalen Sinusitiden und sinunasalen
Traumata (TREMAINE u. DIXON 2001a).
2.1.5 Diagnose von Sinusitiden
Die Diagnose sinunasaler Erkrankungen wird durch die Größe und räumliche
Ausdehnung der beteiligten Strukturen und ihre komplexe Anatomie erschwert. Hinzu
kommt, dass sich die Erkrankungen bei Diagnosestellung meist bereits in einem
chronischen Stadium befinden (FREEMAN 2003).
Klinische Allgemeinuntersuchung
Die Durchführung der klinischen Allgemeinuntersuchung ist an anderer Stelle
ausführlich beschrieben (GLITZ u. DEEGEN 2010). Bei Verdacht auf das Vorliegen
einer sinunasalen Erkrankung ist v. a. auf etwaigen Nasenausfluss und dessen
Charakter zu achten. Ein abgeschwächter oder seitenvergleichend ungleichmäßiger
Luftstrom aus den Nüstern sowie abnormale Atemgeräusche bei In- und Exspiration
geben Hinweise auf eine Einengung der Nasengänge (BEARD u. HARDY 2001).
Schwellungen im Angesichtsbereich mit möglicherweise asymmetrischer
Ausprägung, Exophthalmus und Epiphora deuten auf raumfordernde Prozesse in
den Sinus hin. Die Untersuchung mittels Perkussion ist auf die Stirn- und
Kieferhöhlen beschränkt: ein dumpfer Schall kann das Vorhandensein von
Flüssigkeit oder pathologischen Gewebsmassen in diesen Sinus anzeigen, jedoch
gilt diese Technik als wenig zuverlässig (BERTONE et al. 1993; FREEMAN 2003).
Auch Vergrößerungen der mandibulären Lymphknoten (i. d. R. einseitig) können
regelmäßig bei sinunasalen Erkrankungen festgestellt werden (TREMAINE u. DIXON
2001a).
Untersuchung der Maulhöhle
Die Untersuchung der Maulhöhle (EASLEY 1998) kann wichtige Hinweise auf
mögliche dentale Ursachen einer Sinusitis liefern. Frakturierte Backenzähne im
Bereich des Oberkiefers sowie – vorrangig bei jüngeren Pferden – eröffnete
Literaturübersicht 9
Pulpenhöhlen und Diastasen oder andere tiefe periodontale Erkrankungen bei
älteren Pferden können Auslöser für Sinusitiden sein (O'LEARY u. DIXON 2011).
Gelegentlich können Ausführungsgänge in der Gingiva beobachtet werden, die auf
das Vorliegen oro-maxillärer Fisteln hindeuten (BEARD u. HARDY 2001).
Proliferative Weichteilmassen am harten Gaumen sprechen für neoplastische
Vorgänge, die auch die NNH betreffen können (BEARD u. HARDY 2001; O'LEARY
u. DIXON 2011).
Endoskopie
Die nasale Endoskopie ermöglicht die nicht-invasive Untersuchung der Nasenhöhle
und dient bei Sinusitiden vor allem dem Ausschluss differentialdiagnostischer
Erkrankungen der oberen und tiefen Atemwege (BEARD u. HARDY 2001;
FREEMAN 2003). Die Nasengänge werden nach vorhandenem Sekret bzw.
Exsudat, mykotischen Läsionen, Traumata und sinunasalen Fisteln abgesucht
(O'LEARY u. DIXON 2011). Deutliche Hinweise auf das Vorliegen pathologischer
Veränderungen in den Sinus geben der Abfluss von entzündlichem Exsudat oder das
Herausragen von Gewebe aus der NMA. In seltenen Fällen kann es möglich sein, die
Sinus während einer nasalen Endoskopie zu untersuchen, dies gilt z. B. für Pferde
mit vorhergehendem operativen Eingriff in diesem Bereich (BEARD u. HARDY
2001).
Röntgen
Typische röntgenologische Befunde bei Sinusitiden sind Flüssigkeitsansammlungen
in den Sinus, die sich auf laterolateralen Aufnahmen in Form von horizontalen Linien
zeigen, wobei die Bereiche unterhalb der Linien eine höhere Dichte aufweisen als
jene darüber (BARAKZAI u. MCALLISTER 2007). Primäre Sinusitiden verursachen
durch eine stark angeschwollene Schleimhaut und/oder Eiteransammlungen häufig
diffuse Verschattungen im Bereich der Sinus (O'LEARY u. DIXON 2011). Die
meisten raumfordernden Läsionen der NNH stellen sich röntgenologisch ähnlich dar,
nämlich als runde, expansive, weichteildichte Strukturen (BEARD u. HARDY 2001).
10 Literaturübersicht
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Literaturübersicht 11
Weitere bildgebende Verfahren
Moderne bildgebende Verfahren wie die Computertomographie (HENNINGER et al.
2003), die Magnetresonanztomographie (ARENCIBIA et al. 2000) sowie die
Szintigraphie (BARAKZAI et al. 2006) finden ihren Einsatz vor allem in der
Absicherung und Ergänzung der röntgenologischen Untersuchungsergebnisse.
Sinuszentese
Die Sinuszentese erlaubt den Zugang zu den NNH unter minimalinvasiven
Bedingungen. Diese Technik ist geeignet um Flüssigkeiten für zytologische oder
bakteriologische Untersuchungen aus den Sinus bzw. um Gewebebiopsien für
histologische Untersuchungen zu gewinnen (BERTONE et al. 1993). Die Zentese
kann am stehenden, sedierten Pferd nach aseptischer Vorbereitung und
Lokalanästhesie mittels eines Steinman-Pins (2 - 4 mm) oder einer Kanüle
(16 Gauge) erfolgen (FREEMAN 2003). Die Lokalisationen für eine Zentese der
entsprechenden Kieferhöhlen sind an anderer Stelle ausführlich beschrieben
(RUGGLES et al. 1991; BERTONE et al. 1993).
Sinuskopie
Die Sinuskopie erlaubt – nach Trepanation der Stirn- oder Kieferhöhlen – die
Untersuchung der meisten Strukturen innerhalb der NNH und ggf. die gleichzeitige
Entnahme von Biopsien unter direkter Sichtkontrolle (BEARD u. HARDY 2001;
O'LEARY u. DIXON 2011). Sie ermöglicht die adspektorische Beurteilung der
paranasalen Schleimhaut und der darunterliegenden Alveolen sowie den Nachweis
von Flüssigkeitsansammlungen, mykotischen Plaques und abnormen Geweben
(progressives Siebbeinhämatom, Sinuszyste, Neoplasie).
Die Lokalisationen für die Endoskopieportale wurden wie im Folgenden aufgeführt
von RUGGLES et al. (1991) und BERTONE et al. (1993) beschrieben:
Sinus frontalis: 60 % der Strecke zwischen dorsaler Mittellinie des Kopfes und
medialem Augenwinkel in laterale Richtung und 0,5 cm kaudal dieser Linie
12 Literaturübersicht
Sinus maxillaris caudalis: 2 cm rostral und 2 cm ventral des medialen
Augenwinkels
Sinus maxillaris rostralis: 50 % der Strecke zwischen dem rostralen Ende der
Crista facialis und dem medialen Augenwinkel sowie 1 cm ventral der
Verbindungslinie zwischen Foramen infraorbitalis und medialem Augenwinkel
Histopathologie
Eine Biopsieentnahme kann während einer Sinuszentese oder einer Sinuskopie
erfolgen (TREMAINE et al. 1999). Bei der Auswertung der Biopsien ist zu beachten,
dass häufig nur sekundäre pathologische Veränderungen nachgewiesen werden
können, jedoch kaum Hinweise auf die eigentliche Ursache zu finden sind
(TREMAINE et al. 1999; O'LEARY u. DIXON 2011).
2.1.6 Therapie von Sinusitiden
Primäre Sinusitis – konservativ
Die Wiederherstellung einer adäquaten Abflussmöglichkeit und einer aktiven
mukoziliären Selbstreinigung (Clearence) ist das vorrangige Therapieziel bei
primären Sinusitiden (LANE 1993b). Im akuten Stadium primärer Sinusitiden können
Dampfinhalation (RUSH u. MAIR 2004) oder Mukolytika (PERKINS u. BARAKZAI
2005) den Abfluss von Exsudat aus den NNH fördern. Nicht-steroidale
Antiphlogistika wie Phenylbutazon oder Flunixin-Meglumin können dazu beitragen,
Schwellungen der Drainageöffnungen und weitere Entzündungserscheinungen zu
reduzieren (FREEMAN 1991). Weiterhin sollten die Patienten vom Boden gefüttert
(PERKINS u. BARAKZAI 2005) und leicht bewegt werden, da dies die
Schleimsekretion und den Abfluss der Exsudate fördert (TROTTER 1993).
Der systemische Einsatz von Antiinfektiva ist nur bei bakteriell bedingten Sinusitiden
angezeigt (DIXON u. O'LEARY 2012) und sollte erst nach eingehender Diagnostik
und in Verbindung mit weiteren therapeutischen Maßnahmen erfolgen (BEARD u.
HARDY 2001). Der alleinige Einsatz einer systemischen, antimikrobiellen Therapie
Literaturübersicht 13
kann zwar in Einzelfällen zielführend sein, jedoch wird eine komplette Eliminierung
der Infektion selten erreicht (TROTTER 1993; TREMAINE u. DIXON 2001b). Von
einer (alleinigen) Langzeittherapie mit Antibiotika ist aufgrund des Risikos von sich
möglicherweise entwickelnden Resistenzen abzuraten (SCOTT 1987). Die Auswahl
des Antiinfektivums sollte individuell nach Antibiogramm erfolgen (FREEMAN 2003).
Primäre Sinusitis – chirurgisch
In Fällen chronischer Sinusitiden, in denen konservative Maßnahmen keine oder nur
eine temporäre Besserung erbringen, ist häufig eingedickter Eiter in den Sinus für
das Sistieren und Fortschreiten der Krankheit verantwortlich (SCHUMACHER et al.
1987; TREMAINE u. DIXON 2001b; DIXON u. O'LEARY 2012). Um dies zu
verhindern, wird ein chirurgisches Eingreifen notwendig.
Die Sinuslavage stellt eine minimalinvasive Möglichkeit dar, angesammelte
Flüssigkeit und ggf. eingedickten Eiter aus den Sinus zu spülen und so die bakterielle
Population in den betroffenen NNH zu dezimieren (SCOTT 1987; FREEMAN 1991).
Es wird dafür – nach Trepanation (Kap. 2.1.5) – ein großlumiger Verweilkatheter in
die Stirn- oder Kieferhöhle eingebracht, welcher es erlaubt die NNH über mehrere
Tage oder Wochen mehrmals täglich mit großen Volumina (4 - 5 l) körperwarmer
Lösungen zu spülen (TREMAINE u. DIXON 2001b; DIXON u. O'LEARY 2012). Als
Spülflüssigkeit eignen sich 0,9-prozentige Natriumchloridlösung sowie
hochverdünnte Povidoniod-Lösung (PERKINS u. BARAKZAI 2005), ggf. unter Zusatz
von antimikrobiellen Substanzen oder Enzymen (z. B. Trypsin), wobei deren
Anwendung umstritten ist (FREEMAN 1991). Die Spülungen werden solange
wiederholt, bis die abfließende Flüssigkeit klar und geruchlos ist (TREMAINE u.
DIXON 2001b).
Sollte sich das eitrige Sekret durch die Lavage nicht lösen oder die Schleimhaut
bereits stark verändert sein, kann eine Sinustomie in Form eines frontonasalen oder
eines maxillären Boneflaps durchgeführt werden (FREEMAN et al. 1990;
SCHUMACHER et al. 2000; NICKELS 2006). Diese Öffnungen erlauben eine
chirurgische Entfernung der Exsudate und die Kürettage abnormer
14 Literaturübersicht
Schleimhautbereiche unter Sichtkontrolle. Am Ende des Eingriffs wird mitunter eine
sinunasale Fistel im Dach der ventralen Nasenmuschel geschaffen, die den Abfluss
von Exsudat in die Nasenhöhle ermöglichen soll; der Nutzen einer solchen Fistel gilt
jedoch inzwischen als fragwürdig (SCHUMACHER et al. 2000; TREMAINE u. DIXON
2001b).
Sekundäre Sinusitis
Bei sekundären Sinusitiden steht die Therapie der zugrundeliegenden Erkrankung im
Vordergrund (Tab. 2.1), die Sinusitis selbst wird mit den oben genannten
begleitenden Maßnahmen behandelt.
2.1.7 Prognose von Sinusitiden
Die Prognose für akute, primäre Sinusitiden ist generell gut (TREMAINE u. DIXON
2001b). Bei sekundären Sinusitiden ist die Prognose maßgeblich von der
Grunderkrankung abhängig: bei dentogenen, mykotischen, traumatischen sowie
durch Sinuszysten verursachten Sinusitiden ist die Prognose grundsätzlich gut
(TREMAINE u. DIXON 2001b; DIXON et al. 2011). Es ist jedoch davon auszugehen,
dass die Therapie von chronischen NNH-Entzündungen langwierig sein kann und
mehrere Behandlungen erfordert (TREMAINE u. DIXON 2001b; DIXON et al. 2011).
Progressive Siebbeinhämatome neigen zu Rezidiven, daher ist die Prognose hier
vorsichtig einzuschätzen. Liegt der Sinusitis ein malignes, neoplastisches
Geschehen zugrunde, so ist die Prognose schlecht (TREMAINE u. DIXON 2001b;
DIXON et al. 2011).
Literaturübersicht 15
2.2 Potenzierte Sulfonamide
2.2.1 Struktur und Klassifizierung
Potenzierte Sulfonamide bestehen aus einem Sulfonamid und einem antibakteriell
wirksamen Diaminopyrimidin (PRESCOTT 2006). Es handelt sich bei den beiden
Substanzen um synthetisch hergestellte Chemotherapeutika (SKOLD 2001), welche
– im Gegensatz zu rein fermentativ hergestellten Antibiotika – auch als Antiinfektiva
bezeichnet werden (TROLLDENIER u. UNGEMACH 2000).
Sämtliche Sulfonamide sind Derivate des Sulfanilamids, welches strukturell der Para-
Aminobenzoesäure (PABA) ähnelt (PAPICH u. RIVIERE 2009) und damit die
Voraussetzungen für die antimikrobielle Aktivität bildet (PRESCOTT 2006). Die
Grundstruktur aller Sulfonamide besteht aus einer Amidgruppe (-SO2NHR), die an
einen Benzolring gebunden ist und einer paraständigen Aminogruppe (-NH2). Die
einzelnen Derivate unterscheiden sich durch funktionelle Gruppen, welche üblicher-
weise an die Amidgruppe gebunden sind oder (seltener) die Aminogruppe
substituieren (Abb. 2.3). Die entstehenden Derivate unterscheiden sich in ihren
physikochemikalischen und pharmakokinetischen Eigenschaften sowie in dem Grad
ihrer antimikrobiellen Aktivität (PRESCOTT 2006).
Abb. 2.3: Struktur des Sulfadimidins (links) und des Sulfadiazins (rechts) (PRESCOTT 2006).
Die antibakteriell wirksamen Diaminopyrimidine (Trimethoprim, Aditoprim,
Baquiloprim, Ormetoprim) bestehen aus einem Pyrimidinring, an den typischerweise
zwei Aminogruppen sowie unterschiedliche funktionelle Gruppen gebunden sind
(Abb. 2.4). Die verschiedenen Diaminopyrimidine ähneln sich in ihrer antimikrobiellen
16 Literaturübersicht
Wirksamkeit, wobei die anderen Diaminopyrimidine dem Trimethoprim (TMP) in
Hinblick auf die Gewebeverteilung und längere Halbwertszeiten überlegen sind
(PRESCOTT 2006).
Abb. 2.4: Struktur des Trimethoprims (PRESCOTT 2006).
Die Vorteile der potenzierten Sulfonamide werden in einem synergistischen
Zusammenwirken der beiden Wirkstoffe gesehen. Dieses soll die Dosisreduzierung
der Einzelkomponenten bei gleichzeitiger Reduktion der minimalen
Hemmkonzentration (MHK) zur Folge haben. Weiterhin wird angenommen, dass die
Wirkstoffkombination zu einer Erweiterung des antibakteriellen Spektrums, einer
bakteriziden Wirkung und schließlich zu einer Verlangsamung bzw. Verhinderung der
Resistenzentwicklung führt (LÖSCHER 1984; VAN DUIJKEREN et al. 1994b).
2.2.2 Pharmakokinetische Eigenschaften
Die Pharmakokinetik (PK) beschreibt die Wirkungen des Organismus auf ein
Arzneimittel (FREY 2002) bzw. die Änderung der Wirkstoffkonzentrationen im
Organismus über die Zeit (KIETZMANN 2000).
Sulfonamide sind schwache organische Säuren, deren pKa-Werte (negativ
dekadischer Logarithmus der Ionisationskonstante für Säuren; FREY 2002)
wirkstoffabhängig zwischen 5,0 und 10,4 liegen (Sulfadimidin [SDM] 7,7; Sulfadiazin
[SDZ] 6,4 - 6,6). Sulfonamide sind in ihrer ursprünglichen Form kaum wasserlöslich.
Ihre Löslichkeit erhöht sich in alkalischen Medien oder in Verbindung mit Salzen.
TMP ist eine schwache organische Base mit pKa-Werten von 7,1 bis 7,6 und ist
ebenfalls in Wasser schwer löslich (PAPICH u. RIVIERE 2009). Sowohl TMP als
Literaturübersicht 17
auch Sulfonamide verfügen über lipophile Eigenschaften, wobei TMP stärker
lipidlöslich ist als z. B. SDZ (HAGGETT u. WILSON 2008).
Resorption
Die orale Bioverfügbarkeit von Trimethoprim-Sulfonamid(TMS)-Präparaten bei
Pferden ist grundsätzlich gut (VAN DUIJKEREN et al. 1994b; HAGGETT u. WILSON
2008), sie beträgt ca. 58 - 84 % für Sulfonamide und 67 % für TMP (VAN
DUIJKEREN et al. 1994a; VAN DUIJKEREN et al. 1994b). Es ist jedoch zu
beachten, dass die Futteraufnahme den Grad und die Geschwindigkeit der
Resorption beeinflusst: Bei Verabreichung des Wirkstoffs mit dem Futter wurde bei
Pferden eine reduzierte und verzögerte Resorption beobachtet (VAN DUIJKEREN et
al. 1995).
Distribution
Ein Teil der Wirkstoffmoleküle bindet an Plasmaproteine (v. a. Albumin) und kann
aufgrund dieser Bindung nicht in die Gewebe diffundieren (Kap. 2.3.2; RYAN 1993).
Die Höhe der Plasmaproteinbindung ist wirkstoff- und speziesabhängig, für
Sulfonamide variiert sie zusätzlich in Abhängigkeit von der Wirkstoffkonzentration im
Plasma (VAN DUIJKEREN et al. 1994b). Die Plasmaproteinbindung von SDM
beträgt beim Pferd 50,5 - 73,3 % (NOUWS et al. 1985). Das TMP liegt – unabhängig
von der Plasmakonzentration – zu ca. 50 bis 60 % an Plasmaproteine gebunden vor
(VAN DUIJKEREN et al. 1994b; PRESCOTT 2006).
Die lipidlöslichen Diaminopyrimidine penetrieren die zellulären Barrieren schnell
mittels Diffusion und reichern sich in den Geweben an (PRESCOTT 2006). Die
weniger lipophilen Sulfonamide (HAGGETT u. WILSON 2008) verbleiben länger im
Plasmakompartiment (PRESCOTT 2006) und kommen in den Geweben v. a. in der
wässrigen Phase des interstitiellen Raums vor (VAN DUIJKEREN et al. 1994b).
Während die TMP-Konzentrationen im Gewebe jene im Plasma übersteigen, verhält
es sich für die Sulfonamide umgekehrt. Das TMP hat mit 1,5 - 2,7 l/kg ein höheres
Verteilungsvolumen als die Sulfonamide (0,3 - 0,7 l/kg) (VAN DUIJKEREN et al.
1994b).
18 Literaturübersicht
Grundsätzlich verteilen sich jedoch sowohl die Diaminopyrimidine als auch die
meisten Sulfonamide in alle Gewebe und Körperflüssigkeiten (PRESCOTT 2006).
Beispielsweise konnten sowohl Sulfonamide als auch TMP nach intravenöser
Applikation in Blut, Urin, Synovia, zerebrospinaler und peritonealer Flüssigkeit sowie
im Endometrium von Pferden nachgewiesen werden (BROWN et al. 1983; BROWN
et al. 1988). OH-ISHI (1968) untersuchte die Gewebeverteilung von zwei
Sulfonamiden nach intravenöser Injektion bei Pferden und konnte die Wirkstoffe in
einer Vielzahl von Geweben und Körperflüssigkeiten nachweisen.
Metabolismus
Sowohl Sulfonamide als auch Diaminopyrimidine werden hauptsächlich in der Leber
verstoffwechselt. Sulfonamide unterliegen dabei zum Großteil einer Acetylierung der
Aminogruppe. Weiterhin werden die Wirkstoffmoleküle karboxyliert und hydroxyliert
(Methylgruppe am Pyrimidinring) oder glukuronidiert (PAPICH u. RIVIERE 2009).
Unabhängig vom Stoffwechselpfad haben die entstehenden Metaboliten keine oder
eine stark herabgesetzte antibakterielle Wirkung (VAN DUIJKEREN et al. 1994b;
PAPICH u. RIVIERE 2009). Für das TMP bilden die Oxidation und die anschließende
Konjugation in der Leber die vorrangigen Stoffwechselprozesse (PRESCOTT 2006).
Exkretion
Sulfonamide werden hauptsächlich renal ausgeschieden. Der Exkretions-
mechanismus beinhaltet die glomeruläre Filtration des nicht-proteingebundenen
Wirkstoffs aus dem Plasma und die aktive, transportprotein-gesteuerte Ausscheidung
des ionisierten Wirkstoffanteils und seiner Metaboliten im proximalen Tubulussystem.
Gleichzeitig findet eine passive Reabsorption von nicht-ionisiertem Wirkstoff aus dem
distalen Tubulussystem statt (PRESCOTT 2006; PAPICH u. RIVIERE 2009).
Geringe Konzentrationen an Sulfonamiden werden über die Tränenflüssigkeit,
Schweiß, Milch, Galle und Kot ausgeschieden (VAN DUIJKEREN et al. 1994b;
PAPICH u. RIVIERE 2009). TMP wird zu gleichen Teilen in Harn und Kot
ausgeschieden, der Anteil des metabolisierten Wirkstoffs überwiegt dabei (VAN
DUIJKEREN et al. 1994b).
Literaturübersicht 19
Die Halbwertszeiten (HWZ) von Sulfonamiden und TMP unterscheiden sich deutlich.
Während die HWZ des TMP beim Pferd bei 1,9 - 4,3 h liegt, unterliegen die HWZ der
Sulfonamide wirkstoffabhängig starken Schwankungen (2,7 - 14 h), für das SDM
beträgt die HWZ zwischen 5,4 und 11,4 h (VAN DUIJKEREN et al. 1994b).
2.2.3 Pharmakodynamische Eigenschaften
Die Pharmakodynamik (PD) beschreibt die Wirkungen eines Arzneimittels auf den
Organismus (FREY 2002) bzw. das Ausmaß und den zeitlichen Verlauf eines
pharmakologischen Effekts (EMEA 2000).
Wirkmechanismus
Die Folsäure ist ein wichtiges Substrat für die DNA-Synthese von Bakterien und
Säugetieren. Die antimikrobiellen Eigenschaften der potenzierten Sulfonamide
beruhen auf dem Zusammenwirken von Sulfonamiden und Diaminopyrimidinen,
welche beide selektiv in den Folsäure-Metabolismus von Bakterien eingreifen
(Abb. 2.5; PRESCOTT 2006).
Sulfonamide ähneln strukturell der Para-Aminobenzoesäure (PABA) und hemmen
kompetitiv deren Einbau in die Folsäuremoleküle. Während Säugetiere die benötigte
Folsäure mit der Nahrung aufnehmen, sind einige Bakterienarten darauf angewiesen,
die Folsäure selbst zu synthetisieren. Somit hemmen Sulfonamide selektiv die
bakterielle Neusynthese der Folsäure (PRESCOTT 2006).
Diaminopyrimidine wie das TMP inhibieren die Weiterverarbeitung der Folsäure
durch Blockade der Dihydrofolat-Reduktase (PRESCOTT 2006). Dieses Enzym ist
sowohl bei Bakterien als auch bei Säugetieren vorhanden (VAN DUIJKEREN et al.
1994b). Da aber die bakterielle Dihydrofolat-Reduktase eine um den Faktor 50.000
bis 100.000 höhere Wirkstoffaffinität hat als das entsprechende Säugerenzym
(PAPICH u. RIVIERE 2009), entfalten auch die Diaminopyrimidine ihre antibakterielle
Wirkung selektiv (PRESCOTT 2006).
Sowohl Sulfonamide als auch Diaminopyrimidine wirken, einzeln angewendet,
bakteriostatisch. Die Kombination aus Sulfonamid und Diaminopyrimidin jedoch führt
20 Literaturübersicht
dazu, dass aufeinanderfolgende Schritte der Folsäuresynthese gehemmt werden.
Die Wirkstoffkombination hat einen in vitro nachweisbaren Synergismus zur Folge,
der zu einer bakteriziden Wirkung führt (PRESCOTT 2006). Dieser synergistische
Effekt ist vermutlich auf die Behinderung des Dihydrofol- bzw. Tetrahydrofolsäure-
Recyclings durch das Diaminopyrimidin zurückzuführen (BUSHBY 1980;
PRESCOTT 2006).
Abb. 2.5: Wirkmechanismus der Sulfonamide und des Trimethoprims (KROKER et al. 2002).
Die antimikrobielle Aktivität von TMP ist in vitro um den Faktor 20 größer als jene der
Sulfonamide. Dementsprechend wurde für die meisten empfänglichen Bakterien ein
maximaler Synergieeffekt nachgewiesen, welcher in Abhängigkeit von dem
jeweiligen Sulfonamid und Bakterium bei einem Wirkstoffverhältnis von ca. 1:20
(TMP:Sulfonamid) vorliegt. Dieses sog. optimale Verhältnis beschreibt jenes In-vitro-
Wirkstoffverhältnis, bei dem die Wirksamkeit der Wirkstoffkombination bei maximaler
Dosisreduktion der Einzelkomponenten ohne Einbußen erhalten bleibt (BUSHBY
1980; FEY u. SCHMID 1995). Im Blut des Menschen wird das angestrebte
Wirkstoffverhältnis (1:20) zumindest zeitweise mittels einer – oral oder parenteral
verabreichten – Wirkstoffpräparation im Verhältnis 1:5 erreicht (LÖSCHER 1984;
PAPICH u. RIVIERE 2009). Die Verschiebung des Verhältnisses ist darauf
zurückzuführen, dass sich die Diaminopyrimidine im Gewebe anreichern, während
Sulfonamide hauptsächlich im extrazellulären Raum verbleiben (PRESCOTT 2006).
Die meisten der im Handel verfügbaren TMS-Präparate in der Human- und
Literaturübersicht 21
Veterinärmedizin beruhen auf dem genannten Wirkstoffverhältnis von 1:5. In diesem
Zusammenhang ist allerdings zu beachten, dass das Wirkstoffverhältnis von 1:5 im
Arzneimittel bei Tieren wahrscheinlich nur kurzfristig und nicht in allen Geweben zu
dem angestrebten Wirkstoffverhältnis von 1:20 im Körper führt (LÖSCHER 1984;
PRESCOTT 2006). Dies liegt darin begründet, dass sich die Wirkstoffkomponenten
unterschiedlich schnell und unterschiedlich stark in die Gewebe verteilen und dass
das TMP im tierischen Organismus sehr viel schneller eliminiert wird als das
Sulfonamid (PRESCOTT 2006). Obwohl demzufolge unter In-vivo-Bedingungen die
Hauptwirkung vom länger wirksamen Sulfonamid getragen wird und ein
synergistischer Effekt nur in einem kurzen Zeitfenster nach der Wirkstoffapplikation
zu erwarten ist, scheint diese kurze Phase bereits zu der Überlegenheit der Wirk-
stoffkombination gegenüber der alleinigen Anwendung eines Sulfonamids
beizutragen (LÖSCHER 1984). Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass
signifikante Synergieeffekte über einen großen Bereich von Wirkstoffverhältnissen
(1:1 - 1:500) auftreten (FEY u. SCHMID 1995).
Bei den potenzierten Sulfonamiden handelt es sich um zeitabhängige Wirkstoffe
(HAGGETT u. WILSON 2008), d. h. ihre Wirksamkeit ist davon abhängig, dass die
erreichten Wirkstoffkonzentrationen im Körper über einen längeren Zeitraum die
MHK überschreiten. MHK-überschreitende Konzentrationen führen nicht zu einer
Erhöhung der Wirksamkeit.
Wirkspektrum
Potenzierte Sulfonamide zeichnen sich durch ein breites Wirkspektrum aus, welches
eine bakterizide Wirkung gegen viele grampositive und -negative Bakterien sowie
Protozoen hat (Tab. 2.2; PRESCOTT 2006).
Während TMS-Kombinationen in vitro eine gute Aktivität gegen Anaerobier zeigen,
ist diese Wirkung in vivo i. d. R. nicht vorhanden. Vermutlich ist dies darauf
zurückzuführen, dass in infizierten und nekrotischen Geweben erhöhte
Konzentrationen an Thymidin und PABA vorliegen, welche die antimikrobielle
22 Literaturübersicht
Aktivität der beiden Komponenten hemmen (PRESCOTT 2006; PAPICH u. RIVIERE
2009).
Tab. 2.2: Wirkspektrum potenzierter Sulfonamide (PRESCOTT 2006).
Gute Wirksamkeit MHK ≤ 0,5/9,5 µg/ml
Grampositive Aerobier Streptococcus spp., Staphylococcus aureus , Corynebacterium spp.,
Actinomyces spp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Listeria monocytogenes
Gramnegative Aerobier Actinobacillus spp., Bordetella spp., Brucella spp.
Enterobactericeae: Escherichia coli , Klebsiella spp., Proteus spp.,
Salmonella spp., Yersinia spp., Haemophilus spp., Pasteurella spp.
Anaerobier Bacteroides spp. , Actinomyces spp., Fusobacterium spp., Clostridium
spp., Chlamydia spp.
Moderate Wirksamkeit MHK ≤ 2/38 µg/ml
Mycobacterium spp., Nocardia spp.
Resistenz MHK ≥ 4/76 µg/ml
Pseudomonas aeruginosa , Rickettsia spp., Leptospira spp.,
Mycoplasma spp.
fettgedruckte Erreger: bei primären Sinusitiden nachgewiesen
Zur Einschätzung der Wirksamkeit von Chemotherapeutika wird die MHK ermittelt,
welche die niedrigste Konzentration einer antimikrobiellen Substanz angibt, die unter
standardisierten In-vitro-Bedingungen das Bakterienwachstum vollständig zu
hemmen vermag (EMEA 2002). Der MHK-Wert ermöglicht die Einstufung eines
Keims als “empfindlich” (sensibel), “intermediär” oder “unempfindlich” (resistent)
gegenüber dem jeweils getesteten Wirkstoff. Diese Einteilung erfolgt
präparatspezifisch anhand von Grenzwerten (breakpoints), welche unter
Einbeziehung von chemisch-physikalischen Eigenschaften, pharmakokinetischen
und mikrobiologischen Daten sowie Angaben zur klinischen Wirksamkeit ermittelt
werden (BÖTTNER et al. 2000). Werden TMS-Kombinationen getestet, so werden
die MHK-Werte – i. d. R. unter Angabe des verwendeten Wirkstoffverhältnisses –
gemeinsam angeben (MHKTMP/MHKS [µg/ml]). Ein Überblick über aktuelle MHK-
Werte von TMS-Kombinationen ist Tab. 2.3 zu entnehmen.
Literaturübersicht 23
Tab. 2.3: MHK-Werte für Trimethoprim-Sulfonamid-Kombinationspräparate.
MHK-Wert
TMP/S (µg/ml)
Verhältnis
TMP:S
Sulfonamid Erreger (Ursprung) Referenz
k. A. Sulfadiazin Staph. aureus BERTONE et al. 1988
1:19 Sulfamethoxazol equine Isolate
(Respirationstrakt)
WINTHER et al. 2010
k. A. Sulfadiazin equine Isolate ADAMSON et al. 1985
1:19 Sulfamethoxazol adaptiert aus Human-
medizin, systemische
Infektion
CLSI 2008
1:20 Sulfamethoxazol equine Isolate HIRSH u. JANG 1987
0,5/32 1:1 - 1:500 Sulfadoxin bzw.
Sulfadimethoxin
equine Isolate
(Respirationstrakt)
FEY u. SCHMID 1995
1/20 1:20 Sulfadiazin bzw.
Sulfatroxazol
equine Isolate ENSINK et al. 1993
0,25/4,75
0,5/9,5
k. A.: keine Angabe, MHK: minimale Hemmkonzentration, S: Sulfonamid, Staph.: Staphylococcus ,
TMP: Trimethoprim
2.2.4 Resistenzen
Der Begriff der Resistenz beschreibt die Unempfindlichkeit eines Mikroorganismus
gegen einen antimikrobiellen Wirkstoff. Bei Vorliegen einer Resistenz kann dieser
nicht in den bakteriellen Stoffwechsel eingreifen. Dementsprechend ist bei
Feststellung einer Resistenz (in vitro) kein klinischer Erfolg des jeweiligen
Chemotherapeutikums zu erwarten (TROLLDENIER 2000). Der alleinige Einsatz von
Sulfonamiden hat in den vergangenen Jahren durch die weite Verbreitung von
Resistenzen an Wert verloren. Zwar durchlaufen auch die Resistenzen gegenüber
der Wirkstoffkombination mit Diaminopyrimidinen eine progressive Entwicklung,
jedoch haben die potenzierten Sulfonamide durch diese Kombination wieder an
Bedeutung gewonnen (PRESCOTT 2006).
Den häufigsten Resistenzmechanismus gegen Sulfonamide stellen die sich schnell
entwickelnden plasmid- und Integron-vermittelten Resistenzen dar. Sie beruhen auf
der Produktion einer sulfonamidresistenten Dihydrofolat-Synthetase und einer
beeinträchtigten Wirkstoffpenetration. Im Gegensatz dazu entwickeln sich
chromosomale Resistenzen langsam und stufenweise. Sie resultieren in der
Beeinträchtigung der Wirkstoffpenetration, der Produktion einer sulfonamid-
resistenten Dihydropterin-Synthetase und der Überproduktion von PABA
(PRESCOTT 2006; PAPICH u. RIVIERE 2009).
24 Literaturübersicht
Auch Resistenzen gegen TMP (und die anderen antibakteriellen Diaminopyrimidine)
werden immer häufiger beobachtet (PRESCOTT 2006). Chromosomale Resistenzen
bestehen in der Überproduktion oder Modifikation der Dihydrofolat-Reduktase.
Zusätzliche plasmidvermittelte Resistenzen beruhen auf der Synthese einer
Dihydrofolat-Reduktase, welche nicht an das TMP bindet (VAN DUIJKEREN et al.
1994b; SKOLD 2001).
Resistenzen gegenüber den Sulfonamiden sind häufig mit Kreuzresistenzen
verbunden (VAN DUIJKEREN et al. 1994b). Bei Resistenzen gegen
Diaminopyrimidine handelt sich oft um multiple Resistenzen, die auch gegenüber
Sulfonamiden ausgebildet sind (PRESCOTT 2006). Es wird davon ausgegangen,
dass sich die Resistenzlage bei Einsatz der Kombinationspräparate langsamer
entwickelt als bei Einsatz der Einzelkomponenten (VAN DUIJKEREN et al. 1994b).
Kritische Stimmen bezweifeln dies jedoch, da die Resistenzfaktoren für TMP und
Sulfonamide – zumindest in vitro – bei vielen gramnegativen Bakterienstämmen
gekoppelt sind und so die Kombination der Wirkstoffe keine Vorteile erzielen würde
(LÖSCHER 1984).
In den vergangenen Jahren wurden vermehrt Resistenzen von Streptococcus equi
spp. zooepidemicus gegenüber TMS registriert (PRESCOTT 2006). Darüber hinaus
wurde berichtet, dass dieser Erreger in experimentell induzierten Gewebekammern
trotz ausreichender TMS-Spiegel und gegebener Wirksamkeit (in vitro) nicht
eliminiert werden konnten (ENSINK et al. 2003; ENSINK et al. 2005).
2.2.5 Indikationen und Kontraindikationen
TMS-Kombinationspräparate werden in der Pferdemedizin häufig eingesetzt
(PRESCOTT 2006; HAGGETT u. WILSON 2008). Sie zeichnen sich durch ein
breites Wirkspektrum und klinische Effizienz zu einem relativ kostengünstigen Preis
aus (VAN DUIJKEREN et al. 1994b), darüber hinaus stehen sie auch in oralen
Applikationsformen zur Verfügung (PRESCOTT 2006; HAGGETT u. WILSON 2008).
TMS-Präparate werden in der Veterinärmedizin u. a. für die Therapie von akuten
Infektionen der oberen und tiefen Atemwege mit entsprechend empfänglichen
Literaturübersicht 25
Erregern eingesetzt (Tab. 2.2). Darüber hinaus werden sie bei akuter
Harnwegsinfektion (PRESCOTT 2006; HAGGETT u. WILSON 2008), Plazentitis,
septischer Arthritis, Osteomyelitis und Meningitis verwendet (HAGGETT u. WILSON
2008). Für die Wirkstoffkombination TMP-SDZ wurden im Rahmen einer klinischen
Studie an Pferden gute bis sehr gute Therapieerfolge bei der Behandlung bakterieller
Infektionen verschiedener Organsysteme nachgewiesen (MILLER et al. 1984). Für
die Therapie von eitrigen Abszessen ist TMS nur bedingt geeignet, da freie Purine im
Eiter den Effekt der Sulfonamide neutralisieren. Die Entfernung von purulentem
Material, Gewebeexsudaten und nekrotischem Gewebe ist daher vor dem
Therapiebeginn unbedingt erforderlich (PRESCOTT 2006).
TMP-Sulfonamide sollten nicht bei Tieren mit schweren Leber- und Nierenfunktions-
störungen, Azidurie, unzureichender Flüssigkeitsversorgung oder Schädigungen des
hämatopoetischen Systems angewendet werden. Weiterhin sollten die Wirkstoffe
nicht gemeinsam mit zentralnervös wirkenden Substanzen (Kap. 2.2.6) eingesetzt
werden. Resistenzen gegen eine oder beide der Wirkstoffkomponenten (Kap. 2.2.4,
Tab. 2.2) stellen weitere Ausschlusskriterien dar (CP-PHARMA 2010).
2.2.6 Unerwünschte Arzneimittelwirkungen
Sollten im Zusammenhang mit einer TMS-Therapie unerwünschte Arzneimittel-
wirkungen auftreten, so sind diese i. d. R. auf die Sulfonamidkomponente zurückzu-
führen (PRESCOTT 2006; PAPICH u. RIVIERE 2009). Sofern die Tiere über
sinnvolle Therapiezeiträume (< 2 Wochen) mit therapeutischen Konzentrationen
behandelt werden, sind jedoch auch die durch Sulfonamide hervorgerufenen
Nebenwirkungen selten zu beobachten. Zu den häufigsten dieser Art zählen
Auswirkungen auf die Harnwege (Kristallurie, Hämaturie, Obstruktion der renalen
Tubuli) sowie hämatopoetische Störungen (Thrombozytopenie, Anämie, Leukopenie)
und dermatologische Reaktionen (Pruritus) (PRESCOTT 2006).
Vereinzelt wurden bei adulten Pferden systemische Nebenwirkungen in Form von
reversiblen neurologischen Ausfallerscheinungen beschrieben, die im Zusammen-
hang mit der intravenösen Injektion von TMS-Kombinationspräparaten in
26 Literaturübersicht
therapeutischer Dosierung aufgetreten waren. Sie äußerten sich in hypermetrischem
Gang, Agitation und unberechenbarem Verhalten (STACK u. SCHOTT 2011).
Darüber hinaus können bei Pferden lebensbedrohende anaphylaktische oder
anaphylaktoide Schockreaktionen im Zusammenhang mit intravenösen Injektionen
von TMS auftreten (CP-PHARMA 2010). Die genauen Gründe für diese Fälle sind
derzeit nicht bekannt, es wurde jedoch beobachtet, dass diese fatalen
Nebenwirkungen vor allem dann auftreten, wenn die Pferde mit
Detomidinhydrochlorid oder anderen α2-Agonisten sediert wurden (VAN
DUIJKEREN et al. 1994b; PRESCOTT 2006). Möglicherweise führen Stress oder
Anästhesie zu einer kardialen Sensibilisierung und stellen so einen
prädisponierenden Faktor dar (VAN DUIJKEREN et al. 1994b). ZELLER et al. (1988)
berichteten von einer statistisch signifikanten Senkung des systolischen und
diastolischen arteriellen Blutdrucks sowie einer Steigerung der Herzfrequenz bei der
Gabe von Sulfonamiden an allgemeinanästhesierte Pferde. Zusätzlich beobachteten
sie bei der Gabe von SDM einen Abfall des endexspiratorischen CO2-Anteils in der
Exspirationsluft sowie bei 3/6 Pferden einen kurzfristigen Atemstillstand. Im
Gegensatz dazu führte die intravenöse Gabe zweier TMP-Sulfonamid-Präparate an
unsedierte Pferde zu temporären Blutdruckschwankungen, jedoch konnten keine
kontinuierlichen Veränderungen des Blutdrucks nachgewiesen werden (BRANDT
1993). Aus den genannten Gründen sollte sowohl die intravenöse Injektion von TMS-
Präparaten allgemein vermieden oder langsam durchgeführt werden als auch die
Gabe von TMS an mit α2-Agonisten sedierte Pferde unterbleiben (VAN DUIJKEREN
et al. 1994b).
Es wurde vermutet, dass die orale Gabe von TMS-Präparaten bei Pferden vermehrt
zu gastrointestinalen Störungen in Form von Kolitis und Diarrhö führt (HAGGETT u.
WILSON 2008). Entsprechende Studien konnten jedoch keine langfristigen
Auswirkungen auf die intestinale Bakterienflora nachweisen (GUSTAFSSON et al.
1999). Das Auftreten von Diarrhö nach oraler Applikation von TMS scheint nicht
höher zu sein als bei oraler Gabe anderer Antiinfektiva (WILSON et al. 1996).
Literaturübersicht 27
2.2.7 Anmerkung zum verantwortungsbewussten Umgang mit Antiinfektiva in der Veterinärmedizin
Die Bundestierärztekammer sowie die Arbeitsgruppe Tierarzneimittel der Länder-
arbeitsgemeinschaft Verbraucherschutz formulieren in ihren “Leitlinien für den
sorgfältigen Umgang mit antibakteriell wirksamen Tierarzneimitteln”
Mindestanforderungen für den verantwortungsbewussten Einsatz antimikrobieller
Wirkstoffe bei Tieren (BTK u. AGTAM 2010). Die Gesellschaft für Pferdemedizin
spezifiziert in Anlehnung an diese Leitlinien die Voraussetzungen für den
verantwortungsvollen Gebrauch von Antibiotika in der Pferdemedizin (GPM et al.
2006). Demnach sollte der Einsatz von Antibiotika nur bei Vorliegen einer
gesicherten Indikation, d. h. im Falle einer bakteriellen Infektion, erfolgen. Die Wahl
eines geeigneten Wirkstoffs sollte nach Möglichkeit auf einer bakteriologischen
Untersuchung und einem Antibiogramm basieren. Weiterhin sollte kritisch hinterfragt
werden, ob der gewählte Wirkstoff sowie dessen Dosis und Applikationsintervall
geeignet sind, ausreichend hohe und lange Wirkspiegel im infizierten Gewebe zu
erzeugen. Die Therapiedauer muss dem jeweiligen Krankheitsgeschehen angepasst
sein.
2.2.8 Verwendetes Präparat
TMP-Sulfadimidin wird unter dem Präparatenamen Bigram®, einem Produkt der
Firma CP-Pharma Handelsgesellschaft, Burgdorf, Deutschland, vertrieben. Es
handelt sich dabei um eine Injektionslösung zur intravenösen oder intramuskulären
Verabreichung. Ein Milliliter der Lösung enthält 215,8 mg SDM-Natrium (entspricht
200 mg SDM) und 40 mg TMP.
Als Indikationsgebiet nennt der Hersteller die Therapie von akuten Infektions-
erkrankungen (u. a. Primär- und Sekundärinfektionen des Respirationstraktes) mit
SDM- und TMP-empfindlichen Erregern bei Pferden, Rindern und Schweinen. Er
empfiehlt zur Anwendung am Pferd die intravenöse Gabe von 16 - 24 mg
Gesamtwirkstoff/kg Körpergewicht/Tag über drei bis fünf Tage bei gegebener
Empfindlichkeit der Erreger gegen beide Einzelkomponenten (CP-PHARMA 2010).
28 Literaturübersicht
2.3 Antiinfektiva-Konzentrationen in Zielgeweben
2.3.1 Definition: Zielgewebe von Antiinfektiva
Damit Antiinfektiva ihre antimikrobielle Wirkung entfalten können, ist es notwendig,
dass sie sich im selben Kompartiment befinden wie die infizierenden Mikro-
organismen (THEURETZBACHER 2007). Es gilt daher zunächst den Ort der
Infektion und damit das Zielgewebe eines Antiinfektivums zu bestimmen.
Bakterielle Infektionen betreffen im Allgemeinen periphere Organe und seltener das
Plasmakompartiment (MÜLLER et al. 1999). Innerhalb eines Gewebes sind die
Infektionen i. d. R. auf den interstitiellen Raum begrenzt (RYAN 1993), die wenigen
Ausnahmen davon stellen intrazelluläre Infektionen, z. B. mit Rickettsien,
Chlamydien und Mykoplasmen dar (MCKELLAR et al. 2004; MÜLLER et al. 2004).
Die darauf beruhende Annahme, dass der interstitielle Raum der Ort der Infektion ist
und damit die ISF das Zielgewebe der Antiinfektiva darstellt, findet breite
Zustimmung (CHAURASIA 1999; JOUKHADAR et al. 2001; HERKNER et al. 2002;
MÜLLER et al. 2004; THEURETZBACHER 2007).
Für infektiöse Erkrankungen der NNH ist der Ort der Infektion nicht eindeutig
definiert. Angesichts der Tatsache, dass die bakterielle Besiedlung der Sinus i. d. R.
über einen Bakterieneinstrom aus dem Nasenrachen erfolgt und die
Mikroorganismen dementsprechend zuerst im Sinussekret nachgewiesen werden
können, wird das Sinussekret als primärer Ort der Infektion angesehen
(THEURETZBACHER, persönliche Mitteilung; THEURETZBACHER 2007). Darüber
hinaus können bakterielle Infektionen zu sekundären Epithelschäden führen, und es
muss davon ausgegangen werden, dass sich die Bakterien auch in der ISF der
Schleimhaut befinden (THEURETZBACHER, persönliche Mitteilung; EKEDAHL et al.
1978). In diesem Fall wäre die sinunasale Mukosa Ort der Infektion bei Sinusitiden
(EKEDAHL et al. 1978). In Hinblick darauf, dass sich Sinusitiden bei Pferden zum
Zeitpunkt der Diagnosestellung i. d. R. in einem chronischen Krankheitsstadium
befinden und sekundäre, entzündliche Veränderungen der Schleimhaut häufig zu
beobachten sind (TREMAINE et al. 1999; TREMAINE u. DIXON 2001a), wird in der
Literaturübersicht 29
vorliegenden Arbeit die ISF der sinunasalen Schleimhaut als Ort der Infektion bei
Sinusitiden des Pferdes angenommen.
Anmerkung: In der verwendeten Literatur werden die Begriffe der interstitiellen
Flüssigkeit (ISF) und der extrazellulären Flüssigkeit teilweise synonym genutzt. Um
Verständnisproblemen vorzubeugen, sollen die Begrifflichkeiten kurz erläutert
werden: Das Körperwasser verteilt sich im Intrazellularraum (~ 60 %) sowie im
Extrazellularraum (~ 40 %). Letzterer wird weiter in einen intravasalen (Blut, ~ 5 %),
einen interstitiellen (ISF, ~ 15 %) sowie einen transzellulären (Wasser in epithelial
ausgekleideten Hohlräumen, ~ 20 %) Anteil gegliedert (GÄBEL 2005). In der vor-
liegenden Arbeit wird einheitlich der Begriff der ISF genutzt, um Prozesse und
Konzentrationsgehalte im Interstitium des Gewebes zu beschreiben.
2.3.2 Einflussfaktoren auf die Gewebegängigkeit von Antiinfektiva
Die Penetrationsfähigkeit eines Antiinfektivums wird einerseits durch den Wirkstoff
selbst und andererseits durch patientenspezifische Faktoren beeinflusst (Tab. 2.4).
Die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Wirkstoffs sowie dessen
Molekulargewicht, elektrische Ladung und lipo- oder hydrophiler Charakter
bestimmen, ob und wie leicht ein Wirkstoff aus dem Plasmakompartiment in die ISF
und damit in das Gewebe übertreten kann. Kleine, lipophile und ungeladene
Substanzen können am leichtesten in das Gewebe übergehen (STEINER et al.
2004).
Die Verteilung des Wirkstoffs im Körper basiert grundsätzlich auf dem Blutfluss. Im
Gewebe treten die Wirkstoffmoleküle dann aus dem Blutplasma durch die
Kapillarmembran hindurch in den interstitiellen Raum des Gewebes über (RYAN
1993). Die Kapillardichte des Gewebes bestimmt die zur Verfügung stehende
Oberfläche für den Stoffaustausch. Der Stoffaustausch zwischen den beiden
Kompartimenten erfolgt entweder passiv und unspezifisch entlang eines
Konzentrations- (Diffusion) oder Druckgradienten (Massenstrom) oder über aktive,
spezifische Transportmechanismen (STEINER et al. 2004). Welche dieser
Transportformen stattfindet bzw. dominiert, wird auch durch die Beschaffenheit der
30 Literaturübersicht
Kapillarwände vorgegeben (RYAN 1993). Fenestrierte Kapillaren mit Poren in
Basalmembran und Endothel erlauben eine schnelle Diffusion durch die Poren
(BARZA 1993a; BARZA 1993b). In kontinuierlichen Kapillaren, zu denen auch jene in
der menschlichen Kieferhöhlen-Schleimhaut zählen (TOPPOZADA u. TALAAT
1980), findet die transepitheliale Diffusion unter erschwerten Bedingungen deutlich
langsamer statt (BARZA 1993a; BARZA 1993b; RYAN 1993).
Ein weiterer wichtiger Aspekt für die Gewebegängigkeit von Antiinfektiva ist die sog.
Plasmaproteinbindung. Ein Teil der Wirkstoffmoleküle bindet an Plasmaproteine
(v. a. Albumin) und ist aufgrund dieser Bindung weder im Plasma pharmakologisch
aktiv, noch können diese proteingebundenen Wirkstoffmoleküle die Kapillarmembran
durchdringen und in die ISF übertreten (RYAN 1993). Dementsprechend führt eine
hohe Plasmaproteinbindung (> 80 %) des Wirkstoffs in Hinblick auf die Gesamt-
wirkstoffkonzentration zu hohen Plasma- und niedrigen Gewebespiegeln (RYAN
1993; STEINER et al. 2004). Die Höhe der Plasmaproteinbindung ist grundsätzlich
wirkstoffabhängig, jedoch schwankt sie bei den meisten Substanzen in Abhängigkeit
von der Wirkstoffkonzentration und dem Proteingehalt des Plasmas (STEINER et al.
2004).
Weiterhin nimmt der pH-Wert von Plasma und Gewebe Einfluss auf die
Penetrationsfähigkeit von Antiinfektiva, indem er maßgeblich den Ionisationsgrad der
Wirkstoffmoleküle bestimmt. In ihrer Eigenschaft als schwache Säuren oder Basen
liegen die meisten Antiinfektiva pH-abhängig sowohl in ionisierter als auch in nicht-
ionisierter Form vor. Lediglich der nicht-ionisierte Wirkstoffanteil kann
Zellmembranen passieren und so führt ein herabgesetzter pH-Wert, wie er in
entzündeten oder hypoxischen Geweben vorkommt, dazu, dass sich basische
Arzneimittel in dem vorherrschenden sauren Milieu anreichern, während saure
Wirkstoffe schlechter in diese Gewebe penetrieren können (STEINER et al. 2004).
Literaturübersicht 31
Tab. 2.4: Einflussfaktoren auf die Gewebegängigkeit von Antiinfektiva (nach STEINER et al. 2004).
Chemische Struktur
Relative Molekülmasse
Elektrische Ladung
Hydro-/Lipophilie
Patientenspezifische Faktoren Durchblutung Blutfluss
Kapillardichte
Perfusionsdruck
Proteingehalt des Plasmas
Wirkstoffgehalt des Plasmas
Begleitmedikation
Zielgewebe Gewebetyp
pH-Wert
Konzentrationsgradient
Stofftransport Kapillartyp
Diffusionsbarrieren
aktive Transportmechanismen
Entzündung Dilatation
Granulation
Wirkstoffspezifische Faktoren Chemisch/physikalische
Eigenschaften
Plasmaproteinbindung
2.3.3 Notwendigkeit der Bestimmung von Antiinfektiva-Konzentrationen in Zielgeweben
Der klinische Erfolg einer antimikrobiellen Therapie ist unmittelbar davon abhängig,
ob und wie lange therapeutische Wirkstoffkonzentration am Ort einer Infektion
erreicht werden (MCKENZIE 2009). Das Streben nach der optimalen Dosierung
eines Antiinfektivums beruht daher auf dem Ziel eine therapeutisch wirksame
Konzentration im Zielgewebe zu erreichen (JOUKHADAR et al. 2001).
Bedauerlicherweise basiert jedoch die Auswahl eines Wirkstoffs in vielen Fällen nur
auf der Annahme und nicht dem wissenschaftlichen Beweis, dass dieser das
Zielgewebe tatsächlich erreicht (BRUNNER et al. 2005). Ist dies nicht der Fall oder
sind die erreichten Konzentrationen subinhibitorisch, so treten mitunter
schwerwiegende klinische Folgen auf, die Erregerpersistenz, Therapieversagen und
die Entwicklung bakterieller Resistenzen beinhalten können (MÜLLER et al. 2004;
STEINER et al. 2004).
Die Bestimmung pharmakokinetischer Daten basierte in der Vergangenheit vielfach
auf den Wirkstoffkonzentrationen in leicht zu entnehmenden Proben, wie
beispielsweise Blut, Urin und Speichel sowie Gewebebiopsien (MÜLLER et al. 2004;
32 Literaturübersicht
BRUNNER et al. 2005). Sollen Rückschlüsse aus der Plasma- auf die
Gewebekonzentrationen gezogen werden, so ist zu beachten, dass die wenigsten
Substanzen ihre Wirkung im Plasmakompartiment, sondern in definierten
Zielgeweben entfalten (MÜLLER et al. 2004). Diese Tatsache trifft in besonderem
Maße auf Antiinfektiva zu (Kap. 2.3.1).
Es wird davon ausgegangen, dass in Geweben ohne spezielle Barrieren oder aktive
Transportmechanismen während eines pharmakologischen Gleichgewichtzustandes
(Steady State) ein Äquilibrium zwischen der freien, pharmakologisch aktiven
Konzentration im Plasma und jener der ISF mittels Diffusion eintritt (BARZA 1993a;
BARZA 1993b). In diesen Fällen wäre die Konzentration des ungebundenen
Wirkstoffs im Plasma als Ersatzparameter für die Konzentration in der ISF geeignet
(THEURETZBACHER 2007). In der praktischen Anwendung aber haben sich
während des Wirkstoffverteilungsprozesses im Körper große Schwankungen sowohl
zwischen verschiedenen Geweben als auch innerhalb von Geweben gezeigt
(JOUKHADAR et al. 2001). Teilweise wurden MHK-überschreitende Plasmaspiegel
bei gleichzeitig subinhibitorischen Gewebekonzentrationen nachgewiesen
(JOUKHADAR et al. 2001; STEINER et al. 2004). Ein komplettes und andauerndes
Gleichgewicht zwischen den beiden Kompartimenten Plasma und Gewebe kann
daher nicht vorausgesetzt werden (MÜLLER et al. 2004).
Eine Behinderung der Zielgewebspenetration wurde bisher für einige Organe
(zentrales Nervensystem, Auge, Prostata) (BARZA 1993a; STEINER et al. 2004),
aber auch im Verlauf entzündlicher Erkrankungen (JOUKHADAR et al. 2001), u. a.
bei der Sinusitis des Menschen (EKEDAHL et al. 1978), beschrieben. Im Falle akuter
Entzündungen führt eine Dilatation der Kapillaren zu einer erhöhten Durchblutung
des entzündeten Gewebes. Entsprechend wird davon ausgegangen, dass zeitgleich
mehr Wirkstoff in das Gewebe gelangt. Chronische Entzündungen hingegen neigen
eher zur Bildung von Granulationsgewebe, welches eine verminderte Durchblutung
zur Folge hat (RYAN 1993). Darüber hinaus beeinflusst auch ein veränderter pH-
Wert in entzündeten Geweben die Penetrationsfähigkeit von Antiinfektiva
(Kap. 2.3.2). Abseits dieser theoretischen Überlegungen erbrachten Untersuchungen
Literaturübersicht 33
zu der Fragestellung, ob sich die Gewebespiegel in gesunden und entzündeten
Geweben unterscheiden, keine einheitlichen Ergebnisse (MÜLLER et al. 1996;
JOUKHADAR et al. 2001; STEINER et al. 2004).
Abschließend lässt sich festhalten, dass das Konzentrationsprofil im Zielgewebe
besser geeignet ist, den klinischen Erfolg einer Therapie vorherzusagen, als die
Plasmakonzentration (MÜLLER et al. 2004; BRUNNER et al. 2005). Daher sollte die
Konzentrationsbestimmung der ungebundenen Wirkstofffraktion direkt am Wirkort,
d. h. im interstitiellen Raum, erfolgen (JOUKHADAR et al. 2001; MÜLLER et al.
2004).
2.3.4 Methoden zur Bestimmung von Antiinfektiva-Konzentrationen in Zielgeweben
Im Folgenden werden die verschiedenen Methoden vorgestellt, die zur Bestimmung
von Antiinfektiva-Konzentrationen in Zielgeweben geeignet sind (Tab. 2.5).
Gewebebiopsie
Die Entnahme einer Gewebeprobe ist im Allgemeinen ein einfach durchzuführendes,
aber invasives Verfahren (BRUNNER u. LANGER 2006), wobei die Invasivität für
Gewebeentnahmen aus den NNH durch die Notwendigkeit der chirurgischen
Eröffnung der Sinus erhöht ist. Die Aufbereitung einer Gewebebiopsie beinhaltet eine
Homogenisierung des Gewebes. Die damit einhergehende Zelllyse führt zu einer
Vermischung der Flüssigkeitsanteile der verschiedenen Gewebekompartimente (Blut,
extra- und intrazelluläre Anteile) (MÜLLER et al. 2004; PLOCK u. KLOFT 2005;
BRUNNER u. LANGER 2006), in denen sich der untersuchte Wirkstoff nicht
notwendigerweise gleichmäßig verteilt hat (MÜLLER et al. 2004; MOUTON et al.
2008). Entsprechend erlaubt die Analyse des Homogenates lediglich eine Aussage
über die Gesamtwirkstoffkonzentration, jedoch nicht über die Wirkstoffgehalte in
einem bestimmten Kompartiment. In Bezug auf Antiinfektiva, die ihre Wirkung
zumeist in der ISF entfalten, kann dieser Umstand dazu führen, dass die tatsächlich
am Ort der Infektion zur Verfügung stehende Wirkstoffkonzentration falsch
eingeschätzt wird: Die Konzentrationen von Substanzen, die sich ausschließlich in
34 Literaturübersicht
der ISF aufhalten (z. B. β-Laktam-Antibiotika), werden durch das beschriebene
Verfahren verdünnt und erscheinen niedriger als sie tatsächlich sind. Im Gegensatz
dazu werden die Wirkort-Konzentrationen von vorrangig intrazellulär
akkumulierenden Wirkstoffen (z. B. Chinolone und Makrolide) zu hoch eingeschätzt
(MÜLLER et al. 1996). Weiterhin ist es bei dieser Methode nicht möglich, zwischen
der proteingebundenen, unwirksamen und der ungebundenen, pharmakologisch
wirksamen Form zu unterscheiden (MÜLLER et al. 2004).
Die Notwendigkeit der wiederholten Probenentnahme ist mit einer erhöhten
Infektionsgefahr und Narbenbildung sowie damit einhergehenden ethischen
Limitationen behaftet. Daher sind Gewebebiopsien nicht bzw. nur in begrenztem Maß
für Konzentrations-Zeit-Verläufe im Rahmen von pharmakokinetischen
Untersuchungen geeignet (PLOCK u. KLOFT 2005; BRUNNER u. LANGER 2006)
Hautblasenversuch
Die Technik des Hautblasenversuches (skin blister) beruht auf der Trennung von
Epidermis und Dermis durch das Aufbringen von negativem Druck oder chemischen
Irritantien auf die Oberfläche der äußeren Haut (BRUNNER u. LANGER 2006). Es
wurde ursprünglich davon ausgegangen, dass die sich in der Blase ansammelnde
Flüssigkeit den interstitiellen Raum der peripheren Kompartimente repräsentiert
(BRUNNER et al. 1998). Diese Annahme wird jedoch inzwischen kontrovers
diskutiert: Erstens bedingt die entzündliche Reaktion bei chemisch induzierten
Hautblasen eine veränderte Zusammensetzung der Blasenflüssigkeit im Vergleich zu
der regulären ISF (DAY et al. 2001). Zweitens können gerade diese entzündlichen
Veränderungen zur Folge haben, dass bestimmte Wirkstoffe bevorzugt in der Blase
akkumulieren und es zu einer Überschätzung der Konzentration kommt (MÜLLER et
al. 1999; BRUNNER et al. 2002). Drittens ist davon auszugehen, dass die
Wirkstoffkonzentration in der Blase durch die Veränderung des physiologischen
Verhältnisses der Kapillaroberfläche zum Volumen des interstitiellen Raums
beeinflusst wird (RYAN 1985). Zu guter Letzt gilt es inzwischen als unwahrscheinlich,
dass die mittels dieser Methode erhaltenen Ergebnisse tatsächlich die ISF in
anderen peripheren Kompartimenten als der Haut widerspiegeln (MÜLLER et al.
Literaturübersicht 35
2004). Aufgrund der begrenzten Probenanzahl ist der Hautblasenversuch darüber
hinaus nicht für die Erstellung von Konzentrations-Zeit-Profilen geeignet (PLOCK u.
KLOFT 2005; BRUNNER u. LANGER 2006).
Saliva-Beprobung
Die Konzentrationsbestimmung von Wirkstoffen im Speichel galt ursprünglich als
geeignet, um Rückschlüsse auf die Wirkstoffkonzentrationen in peripheren
Kompartimenten zu ziehen. Die Entnahmetechnik ist einfach und nicht-invasiv und
erlaubt die Erstellung kontinuierlicher Konzentrations-Zeit-Profile (BRUNNER u.
LANGER 2006). Die Aussagekraft der Methodik wurde jedoch inzwischen
angezweifelt, da die gemessene Wirkstoffkonzentration im Speichel kontinuierlich
höher war als die korrespondierende Serumkonzentration (BRUNNER et al. 1998).
Bildgebende Verfahren
In den letzten Jahren erwiesen sich einige ursprünglich in der klinischen Diagnostik
eingesetzten, bildgebenden Verfahren wie die Positronen-Emissionstomographie und
die Magnetresonanzspektroskopie als wertvolle Methoden für pharmakokinetische
Untersuchungen (BRUNNER u. LANGER 2006). Die Positronen-Emissions-
tomographie beispielsweise ermöglicht sowohl die Visualisierung der
Wirkstoffverteilung aus dem Plasmakompartiment in die peripheren Organe
(BRUNNER et al. 2004) als auch die Konzentrationsbestimmung in einzelnen
Organen (FISCHMAN et al. 1998). Der größte Vorteil der bildgebenden Methoden
liegt in ihrer nicht-invasiven Natur. Als nachteilig anzusehen ist, dass diese Verfahren
keine Rückschlüsse auf einzelne Kompartimente erlauben und teilweise keine
Unterscheidung zwischen Muttersubstanz und Metaboliten ermöglichen (BRUNNER
u. LANGER 2006).
36 Literaturübersicht
Ultrafiltration
Bei der Ultrafiltration wird eine spezielle Sonde in das zu untersuchende Gewebe
eingebracht. Durch den Aufbau eines negativen Drucks wird die ISF aus dem
umliegenden Gewebe durch eine semipermeable Membran in den Katheter
“gezogen” und ermöglicht so die Entnahme proteinfreier ISF-Proben, in denen der
ungebundene Wirkstoffanteil analysiert werden kann. Eine Kalibration, wie sie bei der
später beschriebenen Mikrodialyse (MD) notwendig ist, entfällt bei dieser Methode.
Nachteilig ist der (wenn auch geringe) Volumenverlust der ISF, der die
kontinuierliche Beprobung im Rahmen pharmakokinetischer Studien einschränkt
(PLOCK u. KLOFT 2005).
Mikrodialyse
Die MD ermöglicht die direkte Bestimmung der ungebundenen, pharmakologischen
Wirkstoffanteile am Ort der Infektion und ist in dieser Hinsicht derzeit die einzige
Methode, die die Ansprüche regulativer Behörden erfüllt (Kap. 2.4.3) (MÜLLER et al.
2004). Sie wird im folgenden Kapitel (2.4) ausführlich dargestellt.
Tab. 2.5: Methoden zur Bestimmung der Zielgewebskonzentration (nach PLOCK u. KLOFT 2005; BRUNNER u. LANGER 2006).
Mikro-
dialyse
Gewebe-
biopsie
Hautblasen-
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Beprobung
Ultra-
filtration
Bildgebende
Verfahren
Beprobte Matrix ISF Gesamt-
gewebe
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flüssigkeit
Saliva ISF Gesamt-
gewebe
Beprobung des Zielgewebes + + - - + +
Bestimmung der ungebundenen
Wirkstoffkonzentration
+ - - - + +/-
Kontinuierliche Beprobung + - - + - +
Nicht- oder minimalinvasiv + - + + + +
Kein oder minimaler Flüssigkeitsverlust + - - + - -
Gewinnung proteinfreier Proben + - - - +
Keine Größenlimitation für den Wirkstoff - + + + - -
Einfache technische Durchführung - + - + - -
Keine Kalibration notwendig - + + + + +
Kostengünstig + + + + + -
(+): Ja, (-): Nein; ISF: interstitielle Flüssigkeit
Literaturübersicht 37
2.4 Mikrodialyse
2.4.1 Grundprinzip der Mikrodialyse
Die MD beruht auf dem Prinzip der Dialyse (von griechisch dialysis, Auflösung;
CHAURASIA 1999). Sie geht in ihrer heutigen Form zurück auf Untersuchungen von
Prof. Ungerstedt (UNGERSTEDT u. PYCOCK 1974; UNGERSTEDT 1991). Die MD
findet Einsatz in In-vitro-Experimenten und bei der In-vivo-Bestimmung von endo-
und exogenen Substanzen in Körperflüssigkeiten oder in der ISF von Geweben
(PLOCK u. KLOFT 2005).
Das MD-System (Abb. 2.6 - A) besteht aus einer Mikroperfusionspumpe, einem MD-
Katheter und einem Probensammelgefäß (Microvial). Es gibt verschiedene Modelle
von MD-Kathetern (CHAURASIA 1999; PLOCK u. KLOFT 2005), die folgenden
Ausführungen beziehen sich auf den in der vorliegenden Arbeit verwendeten
konzentrischen Kathetertyp (Abb. 2.6 - B). Zur Anwendung der Methode in vivo wird
der MD-Katheter in ein Gewebe oder in eine Körperflüssigkeit eingebracht und über
die Pumpe kontinuierlich mit einer Perfusionslösung gespült. Bei dieser handelt es
sich i. d. R. um eine wässrige Lösung, die der umgebenden Flüssigkeit in ihrer
Zusammensetzung möglichst ähnlich sein sollte, um unerwünschte, auf osmotischen
Prozessen beruhende, Molekülbewegungen zwischen Perfusionslösung und
umgebender Flüssigkeit zu verhindern (PLOCK u. KLOFT 2005). Der MD-Katheter
besitzt am distalen Ende seines Schaftes eine semipermeable Membran, die eine
Diffusion von Substanzen zwischen der Perfusionslösung und der den Katheter
umgebenden Flüssigkeit erlaubt. Die Größe der Poren (Cut-off, üblicherweise 5.000 -
50.000 Dalton) gibt dabei vor, welche Substanzen die Membran passieren können
(i. d. R. Wasser und niedermolekulare Substanzen), während der Konzentrations-
gradient zwischen den beiden Lösungen die Richtung der Diffusion bestimmt (DE
LANGE et al. 2000). Es ist sowohl der Übertritt von Stoffen aus der Perfusionslösung
in die ISF (delivery) als auch von Substanzen aus der ISF in die Perfusionslösung
(recovery) möglich. Die Mikroperfusionspumpe hält den Flüssigkeitsstrom innerhalb
des Katheters bei niedrigen Flussraten (0,5 - 5 µl/Min) konstant und befördert die
38 Literaturübersicht
Perfusionsflüssigkeit (nach dem Kontakt an der Membran: Dialysat) schließlich weiter
bis in das Probensammelgefäß (PLOCK u. KLOFT 2005).
Abb. 2.6: (A) Verwendetes MD-System bestehend aus Mikroperfusionspumpe (a), MD-Spritze (b), MD-Katheter (zuführender Schlauch [c], Katheterschaft [d] mit semipermeabler Membran [e], abführender Schlauch [f], Probensammelgefäßhalter [g]) und Probensammelgefäß (h); (B) Schematischer Aufbau eines konzentrischen MD-Katheters (CHAURASIA et al. 2007).
2.4.2 Berechnung der Wiederfindung
Der Begriff der Wiederfindung beschreibt das Verhältnis des Wirkstoffanteils im
Dialysat zu jenem in der Katheterumgebung. Es werden die absolute und die relative
Wiederfindung unterschieden:
Absolute Wiederfindung: im Dialysat nachgewiesene Wirkstoffkonzentration
pro Zeiteinheit
Relative Wiederfindung (RR, relative recovery): im Dialysat nachgewiesene
Wirkstoffkonzentration im Verhältnis zu der Wirkstoffkonzentration der
Katheterumgebung
Beim Einsatz der MD zum Nachweis exogener Substanzen steht die Frage nach der
tatsächlichen Gewebekonzentration im Vordergrund (DE LANGE et al. 2000). Die im
a
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A B
Literaturübersicht 39
Dialysat ermittelte Konzentration (CDialysat) spiegelt, aufgrund der Tatsache, dass der
konstante Fluss der Perfusionslösung einen vollkommenen Konzentrationsausgleich
zwischen den beiden Lösungen verhindert, nur eine Fraktion der Konzentration in der
ISF (CISF) wider (CHAURASIA 1999; PLOCK u. KLOFT 2005; CHAURASIA et al.
2007):
Eine quantitative Aussage über die Wirkstoffkonzentration in der ISF des Gewebes
ist erst unter Einbeziehung der RR möglich (PLOCK u. KLOFT 2005).
Die RR ist abhängig von der Diffusionsgeschwindigkeit, welche ihrerseits von der
Temperatur, der Beschaffenheit der Membran (Material, Cut-off, Oberfläche) und
dem Konzentrationsgradienten abhängig ist sowie weiterhin von der
Zusammensetzung der Perfusionslösung, der Flussrate und der Tortuosität
(Diffusionsweg im Gewebe) des untersuchten Gewebes (PLOCK u. KLOFT 2005;
CHAURASIA et al. 2007). Idealerweise würde die RR 100 % betragen, jedoch wird
diese Größenordnung in tierexperimentellen Studien selten erreicht (CHAURASIA et
al. 2007) und so erfordert die Berechnung der tatsächlichen Gewebekonzentration
aufwendige Kalibrationsschritte.
Kalibration
Die Bestimmung der RR eines Katheters kann sowohl in vitro als auch in vivo
erfolgen (Tab. 2.6). Die bei der In-vitro-Kalibration erhaltenen RR-Werte wurden
lange Zeit als Bezugsgröße für die RR unter In-vivo-Bedingungen genutzt. Jedoch
wurde in der Vergangenheit festgestellt, dass diese Vorgehensweise nicht sinnvoll ist
(CHAURASIA 1999). Die Diffusionsrate in vivo ist im Allgemeinen geringer als in
vitro, was auf den verlängerten Diffusionsweg und den geringeren Volumenanteil der
ISF im Gewebe im Vergleich zu einer wässrigen Lösung zurückzuführen ist (KOVAR
et al. 1997). Eine In-vitro-Kalibration führt damit zu einer Überschätzung der
40 Literaturübersicht
Wiederfindung und zu einer Unterschätzung der Gewebekonzentration (KOVAR et
al. 1997; CHAURASIA 1999). Damit kann eine In-vitro-Kalibration die Kalibration
unter In-vivo-Bedingungen nicht ersetzen, wohl aber dazu herangezogen werden, die
Eignung der eingesetzten Komponenten auf einer Vorversuchsebene zu überprüfen
(DE LANGE et al. 2000; CHAURASIA et al. 2007; HOLMGAARD et al. 2010).
Für die In-vivo-Kalibration stehen verschiedene Methoden zur Verfügung (Tab. 2.6).
Für einige der Methoden ist ein Gleichgewichtszustand der Gewebekonzentration
notwendig, welcher durch kontinuierliche intravenöse Infusion mit der gesuchten
Substanz erreicht wird (KOVAR et al. 1997). Andere Methoden erfordern den Einsatz
sehr langsamer Perfusionsraten. Die daraus resultierenden langen
Probennahmezeiten führen zu einer entsprechend geringen zeitlichen Auflösung,
während die gleichzeitig geringen Probenvolumina hohe Ansprüche an die Analytik
stellen. Die genannten Umstände schließen den Einsatz der entsprechenden
Methoden für Verlaufsuntersuchungen aus, so dass diese eine geringe Bedeutung
für den Einsatz in pharmakokinetischen Studien haben (CHAURASIA 1999; PLOCK
u. KLOFT 2005).
Für die In-vivo-Kalibration im Rahmen pharmakokinetischer Studien ist in besonderer
Weise die Retrodialyse geeignet (THALLINGER u. JOUKHADAR 2005). Der Begriff
Retrodialyse beschreibt die Umkehr des MD-Prinzips durch den Zusatz einer
Substanz zur Perfusionslösung (KOVAR et al. 1997; DE LANGE et al. 2000). Dabei
kann es sich einerseits um die gesuchte Substanz (SI, substance of interest) selbst
oder um eine Eichsubstanz (IS, internal standard) handeln (LARSSON 1991).
Beruhend auf der Annahme, dass die Diffusion einer Substanz gleichwertig in beide
Richtungen stattfinden kann, wird bei der Retrodialyse der relative Verlust (RL,
relative loss) einer Substanz aus der Perfusionslösung in das umgebende Medium
als Maß für die RR genutzt (SCHELLER u. KOLB 1991):
Literaturübersicht 41
Bei der Retrodialyse mittels gesuchter Substanz wird die SI der Perfusionslösung
zugesetzt und der Katheter (in situ) in einer vorgeschalteten Referenzphase damit
gespült. Der ermittelte RL wird der RR im weiteren Versuchsverlauf gleichgesetzt
und zur Berechnung der Gewebekonzentration herangezogen. Wichtig dabei ist,
dass die Retrodialyse zu einem Zeitpunkt durchgeführt wird, an dem sich noch keine
SI im Gewebe befindet (DE LANGE et al. 2000). Weiterhin muss zwischen dem Ende
der Kalibrationsphase und dem eigentlichen Versuchsbeginn eine angemessene
Auswaschperiode (washout period) eingehalten werden, sodass zu Beginn des
eigentlichen Versuchs keine Rückstände der SI aus der Perfusionslösung im
Gewebe vorhanden sind; i. d. R. wird ein Zeitraum von ca. einer Stunde als
ausreichend angesehen (BOUW u. HAMMARLUND-UDENAES 1998; CLEMENT et
al. 1998). Vorteilhaft an dieser Methode ist, dass die SI selbst zur Kalibration genutzt
wird, allerdings können keine Veränderungen der Wiederfindung über die Zeit
(BOUW u. HAMMARLUND-UDENAES 1998; CHAURASIA et al. 2007) festgestellt
werden.
Bei der Retrodialyse mittels Eichsubstanz wird der Perfusionslösung über die
gesamte Versuchsdauer ein IS zugesetzt (LARSSON 1991). Dieser sollte der SI in
ihren physikalischen (Diffusion, Analysemethode) und biologischen (Metabolismus,
Proteinbindung) Eigenschaften möglichst ähnlich sein (CHAURASIA et al. 2007), da
der RLIS mit der RRSI gleichgesetzt wird (DE LANGE et al. 2000). Vorteilhaft an
dieser Methode ist, dass Veränderungen der Wiederfindung über die gesamte
Versuchsdauer (z. B. durch Veränderungen an der Membran oder Luftblasen in der
Perfusionslösung) wahrgenommen werden können und bei der Berechnung der
Gewebekonzentration berücksichtigt werden können (DE LANGE et al. 2000). Die
Eichsubstanz dient somit als Qualitätskontrolle für die Katheterfunktion (BOUW u.
HAMMARLUND-UDENAES 1998). Als nachteilig ist zu bewerten, dass nicht die
gesuchte Substanz selbst eingesetzt wird und Unterschiede in dem biologischen
Verhalten der Substanzen häufig nicht berücksichtigt werden (CHAURASIA 1999).
Der von BOUW und HAMMARLUND-UDENAES (1998) beschriebene Ansatz der
kombinierten Retrodialyse verbindet die Vorteile der beiden zuvor genannten
42 Literaturübersicht
Methoden: Der Perfusionslösung werden vor Versuchsbeginn in einer
Referenzphase sowohl die gesuchte Substanz als auch die Eichsubstanz zugesetzt.
Es wird jeweils der RL der beiden Substanzen bestimmt, das Verhältnis dieser
beiden wird als „K-Faktor“ beschrieben (LARSSON 1991; CLEMENT et al. 1998).
In der folgenden Auswaschperiode und dem eigentlichen Versuch enthält die
Perfusionslösung nur noch die Eichsubstanz. Die Gewebekonzentration wird über
den RLIS (in jeder einzelnen Probe der Versuchsphase oder als gleitender
Durchschnitt) und den K-Faktor (aus der Referenzphase) errechnet (BOUW u.
HAMMARLUND-UDENAES 1998).
In der vorliegenden Arbeit wurde die kombinierte Retrodialyse mit SDM als gesuchte
Substanz und SDZ als Eichsubstanz angewandt.
Literaturübersicht 43
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44 Literaturübersicht
2.4.3 Anwendung der Mikrodialyse
Einsatz in der Antiinfektiva-Forschung
Die MD wurde erstmals 1995 zur Erforschung der Gewebepenetration von
antimikrobiellen Wirkstoffen eingesetzt (MÜLLER et al. 1995). Diese und weitere
Studien belegten, dass die Methode geeignet ist, reproduzierbare Ergebnisse für die
PK-Charakterisierung von Antiinfektiva bereitzustellen (MÜLLER et al. 1995;
MÜLLER 2000; JOUKHADAR et al. 2001). In Kombination mit anderweitig
bestimmten PD-Daten können die mittels MD bestimmten PK-Daten dazu genutzt
werden, bestehende Dosierungsschemata und Therapiekonzepte zu reevaluieren
(MÜLLER et al. 1996; BRUNNER et al. 2005).
Regulative Behörden in Europa (European Agency for the Evaluation of Medicinal
Products, EMEA) und in den Vereinigten Staaten (U. S. Food and Drug
Administration, FDA) befürworten die Bestimmung von PK- und PD-Daten
antimikrobieller Wirkstoffe im Zielgewebe (FDA 1998; EMEA 2000). Die MD wird als
die derzeit einzig verfügbare wissenschaftliche Methode angesehen, welche die
Anforderungen der regulativen Behörden an klinische PK-Studien mit anti-
mikrobiellen Wirkstoffen erfüllt (JOUKHADAR et al. 2001; MÜLLER et al. 2004).
Einsatz im Bereich der Atemwege
Die MD ist für den Einsatz in nahezu allen Geweben geeignet (DE LA PENA et al.
2000; CHOU et al. 2001; PLOCK u. KLOFT 2005) und wurde Anfang der 1990er
Jahre erstmals im Bereich der Lunge angewandt (LARSSON 1991; INGVAST-
LARSSON et al. 1992). Weitere Untersuchungen belegen, dass die MD-Technik eine
geeignete Methode darstellt, um exogene Substanzen (u. a. Antiinfektiva) in der ISF
des Lungengewebes (DE LA PENA et al. 2001; HERKNER et al. 2002; TOMASELLI
et al. 2003) und im Sekret des Bronchialepithels (EISENBERG et al. 1993; TYVOLD
et al. 2007) nachzuweisen.
Im Bereich der oberen Atemwege ist die MD bisher lediglich an der nasalen
Schleimhaut erfolgt. GRUBB et al. untersuchten die Unterschiede der
Literaturübersicht 45
Ionenzusammensetzung des Nasensekrets (2002) und der mukoziliären Aktivität
(2004) von normalen und an zystischer Fibrose erkrankten Mäusen auf der
Nasenschleimhaut. Bisher beschreibt lediglich eine Studie den Einsatz der MD in der
Nasenschleimhaut: LEE et al. (2005) platzierten einen MD-Katheter in der Lamina
propia der unteren Nasenmuschel und spülten ihn dort über 180 Minuten mit steriler
Kochsalzlösung. Das Ziel dieser Studie war es, Konzentrationsunterschiede von
bestimmten Aminosäuren bei gesunden und an allergischer Rhinitis erkrankten
Menschen zu bestimmen. Die Autoren schlussfolgerten, dass die MD-Technik,
welche große Vorteile für die Erhebung von pharmakokinetischen Wirkstoffdaten in
der Nasenschleimhaut bietet, auch zur Konzentrationsbestimmung von Wirkstoffen
eingesetzt werden könnte, die der Therapie von entzündlichen Erkrankungen der
Nase oder der NNH dienen (LEE et al. 2005). Eine ausführliche Literaturrecherche
erbrachte keine Hinweise darauf, dass die MD-Technik bereits in den NNH
eingesetzt worden ist.
Einsatz am Pferd
Die MD ist bereits erfolgreich bei Pferden eingesetzt worden (INGVAST-LARSSON
et al. 1992; WAELCHLI et al. 2000; CHOU et al. 2001; EDNER et al. 2005;
MURCHIE et al. 2006; VICKROY et al. 2008; EDNER et al. 2009; NOURIAN et al.
2010a; NOURIAN et al. 2010b). Die Herausforderungen des In-vivo-Einsatzes bei
den großen Haussäugetieren sind deutlich komplexer als bei Kleintieren. Bei der
Anwendung am wachen, unsedierten Tier muss das gesamte MD-Equipment so am
Tier angebracht werden, dass einerseits dessen Bewegungsfreiheit nicht zu stark
eingeschränkt wird und andererseits die Ausrüstung ausreichend geschützt wird.
Weiterhin sollten bei der Anbringung am Tier die relative Lage der Komponenten
zueinander und deren Auswirkungen auf die Flussrate beachtet werden.
Höhenunterschiede > 30 cm zwischen der Kathetermembran, der MD-Pumpe und
dem Probensammelgefäß können den hydrostatischen Druck im System erhöhen,
während lange Schlauchsysteme (> 1,5 m) zu einem erhöhten Fließwiderstand
führen können (CHOU et al. 2001). EDNER et at. (2009) implantierten MD-Katheter
in die Glutealmuskulatur von Pferden. Nur ein kleiner Teil der Katheter konnte über
46 Literaturübersicht
die gesamte Versuchsdauer von 24 Stunden genutzt werden, der Großteil der
Katheter wurde während des Versuchs beschädigt oder war – vermutlich durch die
natürliche Bewegung der Pferde – aus der Muskulatur herausgerutscht.
2.4.4 Vor- und Nachteile der Mikrodialyse
Die MD ermöglicht die kontinuierliche In-vivo-Konzentrationsbestimmung
ungebundener, exogener Substanzen in der ISF von Geweben (ELMQUIST u.
SAWCHUK 1997) und ist damit anderen Methoden zur Konzentrationsbestimmung
überlegen (JOUKHADAR et al. 2001). Die Bestimmung der ungebundenen
Wirkstofffraktion in der ISF ist v. a. bei Antiinfektiva von großer Bedeutung (DE LA
PENA et al. 2000; BRUNNER u. LANGER 2006).
Darüber hinaus ist die MD am wachen Tier durchführbar und erlaubt damit die
dynamische und kontinuierliche Probennahme über einen längeren Zeitraum
(Stunden bis Tage) ohne den möglicherweise negativen Einfluss von Anästhetika
(CHAURASIA et al. 2007). Die Möglichkeit an einem Tier mehrere Proben über einen
längeren Zeitraum zu nehmen, trägt dazu bei die Anzahl der Versuchstiere zu
reduzieren (DE LANGE et al. 2000). Weiterhin vorteilhaft ist, dass durch die
Dialysetechnik proteinfreie Proben entstehen und eine Probenaufarbeitung entfällt
(CHAURASIA et al. 2007).
Gleichzeitig jedoch stellt die Methode sehr hohe Ansprüche an die Analytik, da im
Allgemeinen nur sehr kleine Probenvolumina mit geringen Konzentrationen erreicht
werden (DE LANGE et al. 2000; CHAURASIA et al. 2007). Die Berechnung absoluter
Gewebekonzentrationen setzt eine In-vivo-Kalibration voraus, die sehr zeitaufwendig
sein kann (DE LANGE et al. 2000). Trotz der Tatsache, dass es sich bei der MD um
eine semiinvasive Technik handelt, wird durch die Katheterimplantation ein
Gewebetrauma gesetzt (DE LANGE et al. 2000; PLOCK u. KLOFT 2005). Das
Trauma ist i. d. R. gering, dennoch besteht die Möglichkeit, dass dieses die
Ergebnisse der MD beeinflusst (CHAURASIA et al. 2007).
Material und Methoden 47
3 Material und Methoden
3.1 Vorversuche
3.1.1 Implantation des Mikrodialysekatheters
Die nachfolgend beschriebenen Untersuchungen dienten der Entwicklung einer
Methode, welche es ermöglicht einen MD-Katheter im Bereich der NNH von Pferden
zu implantieren. Das primäre Ziel war es, die Membran des MD-Katheters in der
NNH-Schleimhaut zu platzieren ohne diese zu perforieren oder die Membran des
Katheters zu beschädigen. Weiterhin sollte es die Methode ermöglichen den
Katheter auch unter In-vivo-Bedingungen am sedierten Pferd kontrolliert und
minimalinvasiv in der gewünschten Position zu platzieren.
Die Versuche zur Methodenentwicklung wurden an isolierten Pferdeköpfen (n = 20)
durchgeführt. Dabei handelte es sich um adulte Warmblutpferde, die aufgrund
anderer Erkrankungen als der NNH euthanasiert worden waren. Zwischen dem
Zeitpunkt der Euthanasie und den Versuchen lagen drei Stunden bis maximal drei
Tage. Zur Durchführung der Versuche wurden die abgetrennten Köpfe so gelagert,
dass sie mit den Unterkieferästen einer geraden Oberfläche auflagen. Bei den ersten
Tieren wurden zur besseren Übersicht Haut und Unterhaut auf Stirn und
Nasenrücken mithilfe eines Skalpells entfernt, so dass nur noch das Periost dem
Knochen auflag. Im späteren Stadium der Vorversuche wurde der Knochen nur im
Bereich der benötigten Zugänge freigelegt. Die Durchführung der Versuche erfolgte
jeweils auf beiden Angesichtshälften.
Als mögliche Lokalisationen wurden die Bereiche des Sinus frontalis und des Sinus
maxillaris caudalis in Betracht gezogen, da diese Sinus von außen gut zugänglich
sind. Für den Bereich des Sinus maxillaris caudalis wurden die Zugänge im Bereich
der üblichen Lokalisation für Trepanationen dieses Sinuskompartiments gewählt
(Kap. 2.1.5). Für den Sinus frontalis wurden verschiedene Positionen in einem
Bereich ca. 2 cm lateral der Mittellinie des Nasenrückens bis 2,5 cm medial des
Orbitarandes (mediolaterale Ausdehnung) sowie zwischen den Verbindungslinien der
48 Material und Methoden
Foramina supraorbitalia und der medialen Augenwinkel (rostrokaudale Ausdehnung)
genutzt.
Als Instrumentarium zur schleimhautschonenden Perforation des Knochens dienten
im frühen Stadium der Vorversuche Handbohrer und Druckluftbohrer mit
Bohraufsätzen von 1,5 bis 2,5 mm Durchmesser. Im weiteren Verlauf wurde eine
elektrische Fräse (Model 398 Professional; Dremel®, Breda, Niederlande) in
Kombination mit einem ovalen Fräskopf (4 x 8 mm, Ultrapower Bur; ConMedTM
Linvatech, Largo, Florida, USA) verwendet. Zur visuellen Kontrolle der
Katheterplatzierung wurden in den ersten Versuchen mithilfe einer oszillierender
Säge Knochenfenster in den Bereich von Sinus maxillaris caudalis bzw. Sinus
frontalis eingebracht. Diese ermöglichten den Zugang für einen Handspiegel und
somit die visuelle Kontrolle innerhalb des jeweils anderen Sinuskompartiments.
Später erfolgte die Kontrolle videoendoskopisch (GIF Type N180, Evis Exera II video
gastroscope; Olympus®, Tokyo, Japan) über ein Portal im Sinus maxillaris caudalis
(Kap. 2.1.5). Zur Simulation des MD-Katheters wurde zunächst ein dünner Draht
(Durchmesser 0,9 mm) mit abgerundeter Spitze verwendet; später wurde ein original
MD-Katheter (CMA 70 Brain Microdialysis Catheter; CMA Microdialysis AB, Solna,
Schweden) verwendet. Beurteilt und dokumentiert wurden neben dem Gelingen der
schleimhautschonenden Perforation des Knochens und der Insertion (von lateinisch
inserere, hineinstecken) des Katheters auch positive und negative Einflussfaktoren
auf das Gelingen der Kathetherimplantation.
3.1.2 In-vitro-Kalibration der Mikrodialysekatheter
Ziel der folgenden Untersuchung war die Funktionsüberprüfung und die Bestimmung
der Wiederfindungsparameter der einzelnen MD-Katheter vor dem In-vivo-Einsatz.
Mikrodialysezubehör
Das verwendete MD-System besteht aus einem MD-Katheter, einer Mikroperfusions-
pumpe, Perfusorspritzen und Probensammelgefäßen. Die verwendeten Materialen
wurden von der Firma CMA Microdialysis AB (Solna, Schweden) bezogen.
Material und Methoden 49
Bei dem verwendeten MD-Katheter (CMA 70 Brain Microdialysis Catheter) handelt
es sich um ein konzentrisches Kathetermodell. Der Katheter besteht aus einem
zuführenden Schlauch (Länge: 600 mm, Außendurchmesser: 1 mm, Material:
Polyurethan), einem Katheterschaft (60 mm, 0,9 mm, Polyurethan) und einem
abführenden Schlauch (220 mm, 1 mm, Polyurethan), an dessen Ende sich eine
Halterung für das Probensammelgefäß befindet. Der distale Abschnitt des äußeren
Katheterschaftes beinhaltet die semipermeable Membran (10 mm, 0,6 mm,
Polyamid), welche eine Porengröße von 20.000 Dalton (Cut-off) hat.
Zur Inbetriebnahme des Systems wird das proximale Ende des zuführenden
Schlauchs mit einer flüssigkeitsgefüllten Perfusorspritze (CMA 106 Syringe)
verbunden. Die batteriebetriebene Mikroperfusionspumpe (CMA 107 Microdialysis
Pump) ermöglicht die Perfusion des Katheters mit Flussraten von 0,1 bis 5 µl/Min.
Lediglich der Spülzyklus, welcher durch das Öffnen und Schließen der
Pumpenverschlussklappe bei eingelegter Perfusorspritze ausgelöst wird, erlaubt
kurzfristig (fünf Minuten) eine höhere Flussrate von 15 µl/Min. Das entstehende
Dialysat wird in einem austauschbaren Probensammelgefäß (Microvial,
Fassungsvermögen jeweils 200 µl) am Ende des abführenden Schlauches
aufgefangen.
Ansetzen der Lösungen
Es wurden separate Stammlösungen für SDM und SDZ mit einer
Wirkstoffkonzentration von 1 mg/ml PBS hergestellt. Ausgehend von diesen
Stammlösungen wurden folgende Arbeitslösungen erstellt:
SDM: 0,1 µg SDM/ml PBS; 0,5 µg SDM/ml PBS; 1 µg SDM/ml PBS
SDZ: 1 µg SDZ/ml PBS
SDM und SDZ: 1 µg SDM und 1 µg SDZ/ml PBS
50 Material und Methoden
Die Lösungen wurden bis zu ihrer Verwendung in geschlossenen Glasgefäßen bei
2 - 8 °C aufbewahrt. Der Wirkstoffgehalt der angesetzten Lösungen wurde in
Kontrollproben ermittelt.
Bestimmung der Wiederfindungsparameter
Die Funktion und die Wiederfindungsparameter jedes einzelnen MD-Katheters
wurden vor dem In-vivo-Einsatz in Form eines In-vitro-Experiments überprüft. Für
jedes Pferd wurde ein neuer Katheter verwendet, dementsprechend wurden die im
Folgenden beschriebenen In-vitro-Versuche an insgesamt zwölf Kathetern
durchgeführt.
Jeder MD-Katheter wurde erst unmittelbar vor der Durchführung des In-vitro-
Versuchs aus seiner Verpackung (einzeln steril verpackt) entnommen. Im folgenden
Versuchsaufbau wurde die Membran des Katheters jeweils zentral in ein mit ca.
30 ml Flüssigkeit gefülltes Becherglas (Außendurchmesser: 35 mm, Höhe: 60 mm)
getaucht. Die enthaltene Flüssigkeit wurde mithilfe eines Magnetrührers langsam
umgerührt und mittels eines Wasserbades konstant auf 37 °C gehalten (Abb. 3.1).
Zunächst wurde der Katheter in PBS getaucht und ca. 20 Minuten lang mit PBS
gespült (Flussrate: 15 µl/Min). Das gewonnene Dialysat wurde gesammelt und als
Leerprobe verwendet. Anschließend wurde die Wiederfindung von SDM aus dem
umgebenden Medium bei drei verschiedenen SDM-Konzentrationen (0,1, 0,5,
1 µg/ml PBS) bestimmt. Dafür wurde die Kathetermembran in die Lösung der
entsprechenden Konzentrationsstufe (beginnend mit der niedrigsten und endend mit
der höchsten) getaucht; gleichzeitig wurde der Katheter mit einer SDZ-Lösung
(1 µg/ml PBS) und einer Flussrate von 2 µl/Min perfundiert. Die Probenintervalle
betrugen jeweils 90 Minuten. Nach dem Wechsel der Konzentrationsstufe wurde
jeweils eine Äquilibrierungszeit von zehn Minuten eingehalten. In dieser Zeit wurde
der Katheter wie bereits beschrieben perfundiert, während die Membran in die neue
SDM-Lösung getaucht wurde. Das während dieser Phase gesammelte Dialysat
wurde verworfen. Abschließend wurde die Membran des Katheters in PBS getaucht
und mit einer Perfusionslösung, welche jeweils 1 µg SDM und 1 µg SDZ pro ml PBS
Material und Methoden 51
enthielt, durchspült (Referenzphase). Die Flussrate von 2 µl/Min sowie die Länge des
Probenintervalls wurden beibehalten.
Abb. 3.1: Versuchsanordnung des MD-Systems im Rahmen der In-vitro-Kalibration: (a) Stoppuhr, (b) Mikroperfusionspumpe, (c) Microvial, (d) Thermometer, (e) Wasserbad, (f) Heizplatte mit Magnetrührer: Die Membran des MD-Katheters befindet sich in einem flüssigkeitsgefüllten Becherglas. Der Inhalt dieses Becherglases wird mittels eines Magnetrührers umgerührt, ein Wasserbad hält die Temperatur konstant bei 37 °C.
Der beschriebene Untersuchungsgang wurde für jeden Katheter an drei
aufeinanderfolgenden Tagen wiederholt. Nach jedem Versuchstag wurde der
Katheter 30 Minuten mit Aqua bidestillata und einer Flussrate von 15 µl/Min gespült,
a
b
c
d
e
f
52 Material und Methoden
die Membran wurde dabei in ein Becherglas mit Aqua bidestillata getaucht. Nach
Beendigung des Spüldurchgangs wurde der Katheterschaft in die mitgelieferte
Schutzhülse eingeführt und der zuführende Schlauch mit einer Luer-Lock-Kappe
verschlossen. Die Aufbewahrung des Katheters erfolgte in einem mit Aqua
bidestillata gefüllten wiederverschließbaren Kunststoffgefäß bei 2 - 8 °C.
Das Dialysat jeder Probe wurde mithilfe einer Pipette aus den Microvials in HPLC-
Vials transferiert. Dabei wurde das überführte Volumen gemessen und dokumentiert.
Anschließend wurde jede Probe mit PBS auf jeweils 290 µl aufgefüllt. Die Proben
wurden bis zur Analyse bei − 20 °C gelagert.
Berechnung der Wiederfindungsparameter
Die relative Wiederfindung (RR) von SDM wurde für jeweils drei unterschiedliche
SDM-Konzentrationen an drei aufeinanderfolgenden Tagen bestimmt. Die exakte
SDM-Konzentration der jeweiligen Arbeitslösung wurden mittels der entnommenen
Kontrollproben bestimmt. Die RR wurde mit Hilfe der SDM-Konzentrationen in den
Arbeitslösungen (CSDM, Arbeitslösung) und den SDM-Konzentrationen im Dialysat
(CSDM, Dialysat) wie folgt berechnet:
Der relative Verlust von SDM (RLSDM, Ref.) und SDZ (RLSDZ, Ref.) während der
Referenzphase sowie der relative Verlust von SDZ während des restlichen In-vitro-
Versuchs ergab sich aus der folgenden Gleichung:
Der K-Faktor beschreibt das Verhältnis des relativen Verlusts von zwei Substanzen
aus der Perfusionslösung (Referenzphase) und wurde wie folgt berechnet:
Material und Methoden 53
Analytische Methode
Die Quantifizierung der Sulfonamidkonzentrationen erfolgte mittels Hochleistungs-
flüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Einbeziehung der Methode des externen
Standards. Die HPLC-Anlage enthielt folgende Elemente: Pumpe (126 Solvent
Module Pump), Probeninjektor (507 Autosampler), Detektor (168 Detector) und die
Computersoftware 24 Karat 5.0 (Beckmann, München). Die Trennsäule (LichroCART
25-4, C18, 5 µm) und die Vorsäule (LichroCART 4-A, 5 µm, Merck, Darmstadt)
wurden gemeinsam in einer Säulenheizung (40 °C, Spark Holland, Emmen,
Niederlande) platziert. Der verwendete Eluent bestand zu 15 % aus Methanol und zu
85 % aus McIlvaine Zitratpuffer (pH 2,2; 20,8 g Zitronensäure, 0,4 g Na2HPO4 x H2O
in 1 l destilliertem Wasser). Es wurden jeweils 100 µl/Probe injiziert. Die
anschließende Analyse erfolgte bei einer Wellenlänge von 254 nm und einer
Flussrate von 1 ml/Min.
Die Nachweisgrenze betrug 0,07 µg/ml (SDM) bzw. 0,08 µg/ml (SDZ). Die
Quantifizierungsgrenze lag bei 0,14 µg/ml (SDM) bzw. bei 0,15 µg/ml (SDZ).
3.2 Hauptversuch Die Ziele des Hauptversuchs waren die Etablierung der Implantation des MD-
Katheters in die NNH-Schleimhaut von Pferden unter In-vivo-Bedingungen sowie die
nachfolgende Konzentrationsbestimmung des Antiinfektivums SDM in der NNH-
Schleimhaut nach dessen systemischer Applikation.
Die Angaben zu Material und Methoden dieser Versuche sind detailliert in den
Kapiteln 5.3 und 6.3 aufgeführt.
54
Ergebnisse 55
4 Ergebnisse
4.1 Vorversuche
4.1.1 Implantation des Mikrodialysekatheters
Der Sinus frontalis erwies sich, wie im Folgenden beschrieben, als für die
Katheterinsertion geeignet. Die konkrete Lokalisation des Insertionsortes wurde
durch die anatomischen Gegebenheiten des Sinus frontalis vorgegeben: Das
Septum nasi sowie die Orbita stellten die medialen und lateralen Begrenzungen dar,
während die kaudale Begrenzung durch das vermehrte Auftreten von
Knochenspangen kaudal der Verbindungslinie der beiden Foramina supraorbitale
vorgegeben wurde. Die Ausdehnung nach rostral wurde durch den Sinus conchae
dorsalis begrenzt. Innerhalb der genannten Grenzen war die Kathetherinsertion
grundsätzlich möglich, wobei die Auswahl der Katheterinsertionsstelle im Einzelfall
zu erfolgen hatte und maßgeblich von dem individuellen Verlauf und der Ausdehnung
der Knochenspangen entlang der Lamina externa des Os frontale bestimmt wurde.
Bei der Knochenperforation mittels Handbohrer und Druckluftbohrer wurde zunächst
eine kleine Vertiefung in den Knochen gebohrt, welche es im Folgenden ermöglichte
den Bohrkopf von kaudal kommend in einem Winkel von 15 bis 45° auf dem
Stirnbein aufzusetzen. Nachteilig an beiden Instrumenten (Handbohrer und
Druckluftbohrer) war die fehlende Möglichkeit zur Regulation des Drucks.
Dementsprechend gelang die schleimhautschonende Perforation des Knochens und
die anschließende Katheterinsertion nur in wenigen Fällen.
Eine geeignete Technik der Knochenperforation wurde mit einer elektrischen Fräse
(Model 398 Professional; Dremel®, Breda, Niederlande) in Kombination mit einem
ovalen Fräskopf (4 x 8 mm, Ultrapower Bur; ConMedTM Linvatech, Largo, FL, USA)
erarbeitet. Der Fräsaufsatz wurde zunächst senkrecht auf den Knochen aufgesetzt.
Dabei wurden punktuell und sukzessive die oberen Knochenschichten abgetragen,
bis der Knochen augenscheinlich sehr dünn, aber noch nicht vollständig perforiert
war. Der Perforation der Schleimhaut wurde vorgebeugt, indem eine
56 Ergebnisse
flüssigkeitsgefüllte Blase zwischen Knochen und paranasaler Schleimhaut
geschaffen wurde. Zu diesem Zweck wurde der Konus einer mit Wasser gefüllten
20 ml Spritze fest auf das Fräsloch aufgesetzt. Mikrorisse im Bereich des dünn
gefrästen Knochens ermöglichten das Eindringen von Flüssigkeit in die
subepithelialen Schichten der Mukosa. Durch das wiederholte Fräsen und
Applizieren von Flüssigkeit bildete sich eine flüssigkeitsgefüllte Blase unterhalb des
Fräsloches, welche durch die weitere Applikation von Wasser schließlich auf eine
Größe von 20 bis 30 mm Durchmesser vergrößert wurde. Die Lösung der
Schleimhaut unterhalb des Fräsloches ermöglichte schließlich die finale Perforation
des Knochens mit der Fräse ohne dabei die Schleimhaut zu verletzen. Der MD-
Katheter musste von kaudal in die geschaffene Blase inseriert werden, da im
Folgenden das gesamte MD-System im kaudalen Bereich des Pferdekopfes (Schopf
und Genick) angebracht wurde. Daher erforderte die Insertion des Katheters eine
Ausdehnung der Flüssigkeitsblase von mindestens 1,5 cm nach rostral. Darüber
hinaus erwies sich ein flacher Insertionswinkel des Katethers insofern als günstig, als
dass der Katheter parallel zur Schleimhaut und damit schonend in die Blase
eingeführt werden konnte. Aus diesem Grund wurde abschließend eine ca. 1 cm
lange Vertiefung in den kaudalen Rand der Knochenöffnung gefräst. Darin wurde
später der Katheterschaft positioniert. Insgesamt ermöglichte die beschriebene
Technik die zuverlässige, schleimhautschonende Perforation des Os frontale und die
anschließende Katheterinsertion. Dennoch waren zum Teil mehrere Versuche bis zur
erfolgreichen Katheterinsertion notwendig. Diese konnten zwar auf derselben
Kopfseite durchgeführt werden, aufgrund des Flüssigkeitsverlustes über die
bestehenden Perforationen sollte jedoch ein Mindestabstand von 10 bis 15 mm zu
den vorherigen Fräslöchern eingehalten werden. Wichtig ist weiterhin, dass die für
die Vorversuche verwendeten Köpfe möglichst nicht älter als 24 Stunden sein sollten.
Die Austrocknung der Schleimhautauskleidung war nach Ablauf dieser Zeit so stark
fortgeschritten, dass sie die Blasenbildung maßgeblich erschwerte.
Abschließend soll erwähnt werden, dass auch der Sinus maxillaris caudalis als
mögliche Katheterinsertionsstelle erprobt wurde. Jedoch erwies sich die kontrollierte
und schleimhautschonende Perforation der vergleichsweise dünnen Knochen (Os
Ergebnisse 57
lacrimale, Os zygomaticum und Maxilla) als problematisch. Darüber hinaus erwies
sich das Anbringen des MD-Systems am Pferdekopf als schwierig, da die zu- und
abführenden Schläuche über eine vergleichsweise lange Strecke über das Angesicht
des Pferdes geleitet werden mussten. Der Sinus maxillaris caudalis wurde damit als
ungeeignet für die Katheterimplantation betrachtet. Jedoch wurde er im Folgenden
gemäß der für seine Trepanation beschriebenen Lokalisation (RUGGLES et al. 1991;
BERTONE et al. 1993) als endoskopischer Zugang in die Stirnhöhle genutzt (Kap. 5).
4.1.2 In-vitro-Kalibration der Mikrodialysekatheter
Die In-vitro-Anwendung der MD-Katheter diente einerseits der Sicherung ihrer
Funktionsfähigkeit vor dem In-vivo-Einsatz sowie der orientierenden Bestimmung der
Wiederfindungsparameter unter In-vitro-Bedingungen. Zwei der verwendeten
Katheter produzierten nach einem bzw. zwei unauffälligen Versuchsdurchgängen
kein Dialysat. Bei einem der Katheter erschien die MD-Membran gestaucht, an dem
zweiten Katheter waren keine Veränderungen erkennbar, die einen Ausfall hätten
erklären können; beide Katheter wurden ersetzt.
Die Tab. 4.1 gibt einen Überblick über die In-vitro-Wiederfindungsparameter jener
MD-Katheter, die im Rahmen des 48-stündigen MD-Versuchs an zehn Pferden
eingesetzt wurden (Kap. 6). Die angegebenen Katheternummern entsprechen dabei
den Tieren, an denen der jeweilige In-vivo-Einsatz erfolgte. Die angegebenen
Wiederfindungsparameter stellen den Mittelwert aus drei Versuchstagen dar.
Die entnommenen Leerproben ergaben keinerlei Hinweise auf Sulfonamidrückstände
im MD-Katheter. Die Wiederfindung von SDM aus den niedrig-konzentrierten SDM-
Medien (0,1 und 0,5 µg/ml) weisen hohe Standardabweichungen auf. Für die
Konzentrationsstufe 0,1 µg/ml waren die Werte von vier Kathetern (Nr. 2 bis 5)
aufgrund zu geringer SDM-Konzentrationen in den Dialysaten nicht auswertbar.
Sowohl die RRSDM-Werte aus dem höher konzentrierten Medium (1 µg/ml) sowie die
Werte für RLSDM, Ref. wiesen deutlich geringere Standardabweichungen auf. Bei der
Kalibration der Katheter 7 und 8 war die RLSDM, Ref. nicht auswertbar, da die
Perfusionslösung zu hohe SDM-Konzentrationen enthielt (Kontrollprobe).
58 Ergebnisse
Der relative Verlust des internen Standards SDZ zeigte sowohl innerhalb einer SDM-
Konzentrationsstufe als auch während der Referenzphase keine großen
Schwankungen. Die RLSDZ-Werte weisen bei steigenden SDM-Konzentrationen im
Medium eine sinkende Tendenz auf. Der durchschnittliche relative Verlust von SDZ
für die SDM-Wiederfindungsversuche beträgt 58,0 % und ist damit übereinstimmend
mit dem RLSDZ-Wert der Referenzphase (57,5 %).
Der errechnete K-Faktor, welcher das Verhältnis von RLSDZ, Ref. zu RLSDM, Ref.
beschreibt, konnte bei zwei Kathetern (7 und 8) aufgrund der fehlenden RLSDM, Ref.
nicht berechnet werden.
4.2 Hauptversuch Die Ziele des Hauptversuchs waren die Etablierung der Implantation des MD-
Katheters in die NNH-Schleimhaut von Pferden unter In-vivo-Bedingungen sowie die
nachfolgende Konzentrationsbestimmung des Antiinfektivums SDM in der NNH-
Schleimhaut nach dessen systemischer Applikation.
Die Angaben zu den Ergebnissen dieser Versuche sind detailliert in den Kapiteln 5.4
und 6.4 aufgeführt.
Ergebnisse 59
SD
0,0
69,0
31,5
31,8
20,6
12,2
10,9
9,1
10,0
0,3
MW
0,0
74,7
34,6
60,2
68,3
63,1
58,9
51,9
57,5
0,9
10 0
75,5
43,3
38,0
85,8
80,9
71,7
60,4
72,4
0,8
9 0
70,1
34,0
36,0
75,6
78,2
75,7
63,6
61,4
0,8
8 0
18,3
5,4
81,8 -
63,9
60,1
53,8
58,7 -
7 0
80,3
17,2
137,0
-
63,0
61,0
54,2
59,7 -
6 0 4,3
17,7
69,1
64,0
63,7
58,1
54,9
56,7
0,9
5 0 NQ
24,5
37,2
80,7
65,3
60,4
53,4
66,1
0,8
4 0 NQ
11,6
45,9
83,7
70,7
65,4
53,7
66,0
0,8
3 0 NQ
24,2
32,0
81,2
46,5
44,1
36,0
41,8
0,5
2 0 NQ
113,9
67,2
28,1
56,4
51,5
52,9
47,5
1,7
1 0
199,7
54,5
58,0
47,6
42,8
41,6
35,9
45,0
0,9
Perf
usat
PB
S
SD
Z (
1,0
)
SD
Z (
1,0
)
SD
Z (
1,0
)
SD
M (
1,0
)
SD
Z (
1,0
)
SD
Z (
1,0
)
SD
Z (
1,0
)
SD
Z (
1,0
)
SD
M (
1,0
)
SD
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1,0
)
Mediu
m
PB
S
SD
M (
0,1
)
SD
M (
0,5
)
SD
M (
1,0
)
PB
S
SD
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0,1
)
SD
M (
0,5
)
SD
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1,0
)
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0.
60
Manuscript I 61
5 Manuscript I
Application of in vivo microdialysis for investigation of unbound drug
concentrations in the paranasal sinus mucosa of adult horses.
5.1 Abstract Microdialysis (MD) has been used to investigate concentrations of exogenous
substances in the interstitial fluid of various tissues, but it has apparently not been
used within the paranasal cavity of any species. The objective of the present study
was to establish a novel method of inserting a MD probe into the paranasal mucous
membrane of horses.
A MD probe was implanted into the frontal sinus (FS) of healthy horses (n = 12; age
5 - 23 y; 410 - 675 kg). Implantation was done in standing, sedated horses under
endoscopic guidance (caudal maxillary sinus portal). A skin flap (~ 3 x 3 cm),
centered at the FS, was created; next, an opening (diameter: ~ 3 mm) was drilled into
the frontal bone (4 x 8 mm bur, attached to a corded drill), without lacerating the
underlying paranasal sinus mucosa. Using the bore hole, sterile fluid (PBS) was
forced between the frontal bone and the underlying mucosa, creating a fluid-filled
blister within the subepithelial layers of the sinus mucosa (histologically approved).
The MD probe was inserted into the fluid-filled blister, and the complete MD system
(tubing, microperfusion pump, sampling vial) was affixed to the horse (forehead, poll).
Complications during probe implantation were perforation of the mucous membrane
during drilling or probe placement, or rupture of the blister while applying PBS; the
mean procedure time was 295 min (SD ± 106 min). Subsequent in vivo MD was
performed in 10 horses for 52 h (4 h calibration, 48 h sample collection). These
horses were administered a trimethoprim-sulfadimidine formulation (30 mg/kg, IV)
twice (t0, t24); dialysate samples were continuously collected every 90 min for 48 h,
revealing consistent dialysate levels in most horses. Horses displayed minimal signs
of discomfort (headshaking, rubbing heads: n = 3). Short-term complications
associated with the surgery were mild and only of temporary nature (nasal discharge
62 Manuscript I
n = 5; lymphadenopathy n = 5; emphysema n = 6; swelling of portals n = 12;
incisional infection n = 2), whereas long-term results were excellent.
This study demonstrates the feasibility of placing a MD probe within the paranasal
sinus mucosa in standing, sedated horses, and performance of subsequent in vivo
MD over 52 h in horses with minimal restraint. The results of the present study
therefore lay the foundations for continuous monitoring of substances of interest
within the paranasal sinus mucosa in unsedated horses.
Keywords: equine, microdialysis, pharmacokinetic, trimethoprim-sulfonamide,
paranasal sinus mucosa
5.2 Introduction Sinusitis is the most frequent disorder of the paranasal sinuses in horses (NICKELS
2006). It may be caused by infections of the upper respiratory tract (primary sinusitis)
or by dental disease, facial trauma, sinus cysts, progressive ethmoid hematoma,
sinonasal mycosis or neoplasia (secondary sinusitis) (TREMAINE u. DIXON 2001a;
O'LEARY u. DIXON 2011). Clinical significance of equine sinonasal disorders derives
from their chronicity and the fact that they are usually difficult to treat (TREMAINE et
al. 1999; TREMAINE u. DIXON 2001a). Anti-infective drugs are frequently used in
treatment of equine sinusitis, although poor response to antimicrobial therapy has
been reported repeatedly (MASON 1975; BOULTON 1985; TROTTER 1993;
TREMAINE u. DIXON 2001b; DIXON u. O'LEARY 2012). Unfortunately, critical
information on antimicrobial therapy in sinusitis of horses is rare.
For most bacterial infections, the infection site is the interstitial fluid (RYAN 1993),
making this compartment the target site for anti-infective drugs. In absence of
detailed information, choice of anti-infective substances is often based on the
assumption – contrary to scientific evidence – that these drugs reach the infection
site (BRUNNER et al. 2005). If this is not the case, subinhibitory drug concentrations
may cause treatment failure by persistence of the causative organisms and bacterial
resistance (MÜLLER et al. 2004; STEINER et al. 2004). Therefore, concentration
Manuscript I 63
profiles of anti-infective drugs should be obtained directly from their target site, e. g.
the interstitial fluid (JOUKHADAR et al. 2001; MÜLLER et al. 2004). Microdialysis
(MD) has been reported to be a suitable technique for continuous monitoring of
unbound, pharmacologically active drug concentrations in the interstitium (MÜLLER
et al. 1996; JOUKHADAR et al. 2001; BRUNNER et al. 2005; CHAURASIA et al.
2007). MD has been utilized for various tissues (DE LA PENA et al. 2000; PLOCK u.
KLOFT 2005), but it has apparently not been used in the paranasal sinuses of any
species.
Information presented below is part of an investigation using in vivo MD to
characterize the pharmacokinetics of an anti-infective drug within the paranasal
cavity of horses. The primary objective of the present work was to establish and
evaluate a method for inserting a MD probe into the paranasal mucosal lining of
horses. Subsequently, MD was used to detect local concentrations of a systemically
administered trimethoprim-sulfadimidine formulation within the paranasal mucous
membrane; those results are presented in a second publication (Ch. 6).
5.3 Materials and Methods
5.3.1 Horses
Adult, university-owned horses (n = 12) of various breeds, 11 mares and one stallion,
were used. Horses weighed from 410 to 675 kg (mean 557.9 kg) and were from 5 to
23 y of age (mean 13.9 y). All horses were considered healthy based on a general
physical examination, routine hematology, and blood chemistry. None of the horses
had a history or clinical signs of paranasal sinus disease. Lateral and dorsoventral
radiographs (done prior to the study) of the paranasal sinuses revealed no
abnormalities. The horses had not received any medical treatment for at least 3 wk
before enrollment. Horses were housed in individual stalls, fed hay and mixed feed
twice daily, and had ad libitum access to water.
64 Manuscript I
All procedures were performed under a protocol approved by the Ethical Committee
of the Lower Saxony State Office for Consumer Protection and Food Safety
(No. 33.9-42502-04-10/0227).
5.3.2 Microdialysis equipment
Concentric MD probes (CMA 70 Brain Microdialysis Catheter; CMA Microdialysis AB,
Solna, Sweden) were used for both preliminary investigations and in vivo studies.
The probe system (Fig. 5.1) consisted of polyurethane inlet (length: 600 mm, outer
diameter: 1 mm) and outlet tubes (220 mm, 1 mm). The probe shaft (60 mm, 0.9 mm)
was made from polyurethane, whereas the MD membrane (10 mm, 0.6 mm) was
polyamide. When the equipment was in use, the inlet tube was connected to a CMA
106 Syringe (CMA Microdialysis AB), which in turn was placed in a CMA 107
Microdialysis Pump (CMA Microdialysis AB).
Prior to installation, each probe was tested under in vitro conditions to ensure
function. After testing, probes were stored in aqua bidestillata. Before in vivo
application, probes were flushed with sterile-filtered phosphate buffered solution
(PBS, pH 7.4) and kept in PBS until immediately prior to implantation.
5.3.3 Microdialysis probe implantation
Preliminary studies were done to establish the surgical procedure of implanting a MD
probe into the paranasal cavity of horses (data not shown). These studies used
isolated equine heads (n = 20), euthanized for reasons other than disorders of the
paranasal sinuses.
The in vivo surgical procedure was carried out at the Clinic for Horses of the
University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Germany. The horses were
restrained in stocks. A 12-gauge indwelling intravenous catheter (EquiCathTM
Fastflow; B. Braun Vet Care GmbH, Tuttlingen, Germany) was aseptically inserted
into one of the jugular veins. Horses were sedated with IV injections of detomidine
hydrochloride (0.015 - 0.03 mg/kg; Cepesedan® RP; CP-Pharma Handelsgesellschaft
mbH, Burgdorf, Germany) and butorphanol tartrate (0.1 mg/kg, Alvegesic® PH; CP-
Manuscript I 65
Pharma), with additional injections given as needed. The dorsolateral aspect of the
head was prepared for aseptic surgery. The proposed incision lines were infiltrated
subcutaneously with 2 % lidocaine hydrochloride (Lidocainhydrochlorid 2 %®; bela-
pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Germany).
The implantation of the MD probe required two points of access into the skull
(Fig. 5.2). Firstly, a sinoscopy portal was created to allow endoscopic guidance for
implantation of the MD probe. The portal was located at the caudal maxillary sinus
(CMS), approximately 2 cm rostral and 2 cm ventral to the medial canthus of the eye
(RUGGLES et al. 1991; BERTONE et al. 1993). A 25 to 30 mm longitudinal incision
was made through skin and subcutaneous tissues. Tissues were retracted (Weitlaner
retractor) and the underlying periosteum was reflected (periosteal elevator). An oval
bur (4 x 8 mm, Ultrapower Bur; ConMedTM Linvatech, Largo, FL, USA; Fig. 5.3)
attached to a high-speed, corded drill (Model 398 Professional; Dremel®, Breda,
Netherlands) was used for creating the opening. The hole was sequentially expanded
by gently rotating the sharp edges of the bony margins. The shortened and rounded
end of a 2 mL syringe (outer diameter: 10 mm) was inserted into the CMS portal to
provide protection of the endoscope.
A flexible video endoscope with an outer diameter of 4.9 mm (GIF Type N180, Evis
Exera II video gastroscope; Olympus®, Tokyo, Japan) was inserted into the CMS and
advanced into the FS via the fronto-maxillary aperture. The FS and the lamina
externa of the frontal bone were assessed for the appearance of the sinus mucosa
and potential bony lamellae to determine the location of the MD portal (the second
opening into the skull). A second incision was made to create a three-sided
rectangular skin flap (~ 3 x 3 cm), located over the centre of the FS (Fig. 5.2). The
caudal edge of the flap was on a line connecting the dorsal midline of the skull
perpendicularly with the surpraorbital foramen. The ventral edge was applied at the
level of the medial canthus of the eye, parallel to the caudal edge. The lateral edge
connected both lines. The periosteum was incised and reflected towards the medial
border of the flap.
66 Manuscript I
The objective was to create an opening (~ 1 to 2 mm) in the frontal bone for probe
placement inside the FS, without perforation of the underlying paranasal mucosa.
Firstly, the bur was positioned perpendicularly on the frontal bone and used to
remove the outermost layers of the frontal bone and create a depression of
approximately 3 mm diameter. Drilling was done intermittently for brief intervals,
intermixed with firm application of gauze swabs (soaked in cold sterile saline), for
hemostasis and tissue cooling. Sinoscopy was used to monitor drilling; when the
remaining bone appeared thin, the luer tip of a 20 mL syringe, filled with sterile-
filtered PBS, was positioned on the depression, and light pressure was applied.
Smallest fissures in the bone (caused by drilling) enabled PBS to be forced between
bone and mucosa. By alternating drilling (brief) and application of PBS (extensive)
over a prolonged interval, a fluid-filled blister was established within the subepithelial
layers of the sinus mucosa (Fig. 5.4 - A). The blister was eventually expanded to a
diameter of approximately 20 to 30 mm by applying further PBS (Fig. 5.4 - B). Since
the majority of PBS did not penetrate the area under the bone, on average,
approximately 0.5 to 1.0 L of PBS was necessary to create the blister. Finally, the
opening in the bone (overlying the blister) was enlarged to approximately 2 mm, and
the caudal edge of the hole was beveled. A non-functional test probe was inserted
through the opening from the caudal direction and advanced until its membrane was
completely positioned within the blister (Fig. 5.4 - C). Only when the test probe was
inserted far enough and without resistance, the functional probe was used (otherwise
the blister, the opening, or both, was enlarged).
The shaft of the probe was secured to the skin of the horse’s forehead with tissue
glue (Dermabond®; Ethicon Products, Norderstedt, Germany) (Fig. 5.5 - a). Next, the
dermal flap was repositioned and the skin of both incisions was closed with
disposable skin staples or simple interrupted stitches (Dafilon® 1 USP; B. Braun Vet
Care GmbH). The tubing of the MD system was directed caudally and sutured to the
forehead with one or two simple interrupted stitches; the vial holder was taped to the
forelock (overflow valve of the vial upwards; Fig. 5.5 - b). The inlet tube was
connected to the MD syringe, which in turn was placed inside the MD pump. The
latter was secured in a metal box (120 x 85 x 40 mm), and stowed in a small bag
Manuscript I 67
(Fig. 5.6 - A). The bag (total weight, including contents, ~ 400 g) was placed at the
poll and taped to the horse’s halter (Fig. 5.6 - B).
5.3.4 In vivo microdialysis study
Horses 2 to 12 participated in the in vivo MD study, described in detail in the
companion publication (Ch. 6). These studies were initiated by an in vivo calibration
period (~ 4 h) immediately after probe placement. Then, horses were given a
trimethoprim-sulfadimidine formulation (30 mg/kg, IV, Bigram®; CP-Pharma), defining
the start of the MD study (t0). The MD system was continuously perfused with
perfusion solution containing 1 µg sulfadiazine/mL PBS at a flow rate of 2 µL/min.
The study was performed for 28 h (4 h in vivo calibration and 24 h sample collection;
Horse 2) or 52 h (4 h in vivo calibration and 48 h sample collection; Horses 3 to 12),
respectively. The operation of the MD system was closely monitored and the vials of
collected dialysate were changed every 90 min. Horses 3 to 12 received a second
trimethoprim-sulfadimidine treatment after 24 h (t24). After collection of the last
sample, MD system and IV catheter were removed.
Horse 1 served for preliminary investigations: it had a MD probe implanted into its FS
and left in situ for 12 h, but no MD was performed.
5.3.5 Post-surgical treatment
After successful installation of the MD system, horses were returned to individual
stalls. Packed cell volume and total protein were determined on the day of probe
implantation and daily on the following 2 d. A routine physical examination was done
once daily for 2 wk, or until euthanasia due to enrollment in an unrelated study
(n = 8). Furthermore, at each examination, specific assessments were done to detect
discomfort, nasal discharge or epistaxis, swollen mandibular lymph nodes, and
incisional complications. Follow-up sinoscopy was performed in Horses 2 (d 1),
5 (d 4), and 9 (d 2 and 4) reusing the existing CMS portals. Staples or stitches were
removed 14 d after surgery or the last follow-up sinoscopy, respectively, and the
cosmetic outcome was assessed 30, 60, and 90 d after surgery (n = 4).
68 Manuscript I
5.3.6 Histological analysis
Horse 12 was euthanized 5 d after MD probe implantation and subsequent
performance of in vivo MD for 52 h. After collection of the last sample, the inlet and
outlet tubes of the probe were cut and the MD system was removed; only the probe
membrane and shaft were left in situ. After the horse was humanely euthanized, the
head was detached and perfused with Bouin’s solution via the common carotid
arteries. Subsequently, samples were obtained from: (1) the central area of the
blister including the MD probe, (2) the transition region between blister and blister
margin, (3) the area of the drilled hole, and (4) from the lateral and ventral walls of
the FS (control tissues). Samples were decalcified in a solution of 25 %
ethylendiamintetraacetic acid (EDTA), pH 7.8, at 37 °C for 28 d, routinely embedded
in paraffin, sectioned (6 µm), and stained with toluidine blue. Sections were
examined under light microscopy.
5.4 Results
5.4.1 Microdialysis probe implantation
Implantation of a MD probe into the FS was successfully performed in all 12 horses.
The duration of the procedure ranged from 180 to 480 min (mean ± SD,
295 ± 106 min). Sedation provided excellent chemical restraint in all horses. Neither
of the two surgical interventions (CMS portal incision and SF skin flap creation)
resulted in substantial hemorrhage.
The sinoscopy portal provided direct access to the CMS in 12 of 14 cases (Tab. 5.1).
In two cases, the rostral maxillary sinus was entered inadvertently, so a second
portal was created caudal to the first. In all horses, the endoscope was easily
directed through the fronto-maxillary aperture into the FS. Exploration of the CMS
and FS revealed healthy sinus mucosa in all horses. Each horse had a unique
configuration of bony lamellae within its FS. Detection of presence and extent of bony
lamellae was assisted by the endoscope light visible through the frontal bone.
Manuscript I 69
Creation of an efficient MD portal, using the selected side of the head, was
successful in 10 horses. In these horses, one to three attempts (mean ± SD,
1.7 ± 0.8) had to be made until successful probe implantation. In two horses (3 and
6), creation of a MD portal on the initially chosen side of the head failed and a second
approach was successfully created on the contralateral side.
Appropriate blisters for probe implantation were established at first trial in six horses
(Tab. 5.1). In four horses (3, 4, 6, and 11), the mucous membrane was perforated by
the bur while drilling (Fig. 5.7 - A). In two horses (11 and 12), the mucous membrane
ruptured while applying pressure with the PBS syringe. In two horses (8 and 12), the
blister underlined the hole safely, but expanded in a caudal direction (Fig. 5.7 - B);
consequently, the probes could not be inserted far enough to place the MD
membrane area completely within the blister. In these cases, a second hole was
created caudal to the first one under protection of the blister and was used for probe
insertion. In one horse (3, second side of the head), the readily established blister
was perforated by the MD probe (Fig. 5.7 - C), when the horse suddenly moved its
head during probe insertion. This probe produced no dialysate after implantation and
had to be replaced. Replacement of a MD probe due to lacking dialysate production
was necessary in one other case (Horse 8).
During blister establishment, mild hemorrhage into the blister occurred in all horses.
However, this blood accumulated slowly, and appeared to dissipate evenly within the
blister. Hemorrhage did not apparently influence the size of the blister and no
retrograde flow through the drilled hole was detected at any point of time. Follow-up
sinoscopy (Horses 2, 5, and 9) revealed no differences in size, configuration, and
appearance of the blister compared to the situation during surgery. No signs for
mucosal inflammation were noticed.
5.4.2 In vivo microdialysis study
Horses appeared comfortable throughout the entire in vivo MD experiment. However,
headshaking (mild to moderate) and rubbing heads on forelegs or solid objects in the
stall (mild) was observed in three horses (3, 5, and 9). Rubbing or headshaking had
70 Manuscript I
no influence on the position of the MD probe or the remainder of the MD system.
Horses tolerated handling of the MD system well: vial retrieval and replacement was
possible by one person from the outset in eight horses. In two horses, assistance by
a second person was necessary for the first replacements. In these horses a
habituation was noticed within 24 h, and horses could be handled by one person for
the remaining experiment. One horse was adversed to handling throughout the entire
study, consistently requiring two persons to retrieve and replace vials.
The performance of the MD system was fully satisfactory. However, the amount of
dialysate collected was not consistent in Horse 3, apparently due to loss of fluid
through the overflow protection of the vial during headshaking. All probes remained
functional until the end of the intended study period (28 and 52 h after probe
placement) and consistent amounts of dialysate were collected.
5.4.3 Post-surgical outcome
Horses had their vital parameters (pulse, respiratory rate, rectal temperature) within
normal limits up to 14 d after surgery or until euthanasia, respectively. Packed cell
volume and total protein were determined within normal limits in all horses until the
end of the in vivo MD study. Scant serosanguineous nasal discharge from the
ipsilateral nostril was observed for the first 24 h in four horses and for the first 4 d in
one horse. Reactions of the mandibular lymph nodes were detected in five horses
(Tab. 5.1).
Six horses developed subcutaneous emphysema originating from the CMS portal.
Emphysema remained cool and non-painful in all affected horses. The soft tissue
surrounding the CMS and MD portals was mildly to moderately swollen in all horses.
However, swellings remained unobtrusive and resolved between 1 to 2 wk post-
surgery in 6 horses (the other 6 horses were euthanized before resolution).
Cutaneous portions of skin flaps and incisions healed by first intention in all horses
but Horse 3. This horse developed a minor incisional complication at the MD skin
flap. Furthermore, the ipsilateral mandibular lymph node was painful on palpation and
mucopurulent nasal discharge was evident at the same time. Another horse (9)
Manuscript I 71
developed multiple, superficial white plaques (diameter: ~ 1 mm) covering the FS flap
starting 2 wk post surgery. The suspected diagnosis of cutaneous fungus could not
be approved by laboratory examinations. Both horses were locally treated with
povidone-iodine soap (Iodosept®; Chassot GmbH/ Vétoquinol GmbH, Ravensburg,
Germany).
Eight horses were euthanized for reasons unrelated to the present study. They were
euthanized between d 1 and 28 post surgery. The mean observation period was 9 d
in these horses. In the horses observed for 3 months or longer (n = 4), hair had
regrown and scars were difficult to detect. Cosmetic results at d 90 were judged to be
excellent.
5.4.4 Histological analysis
In the periphery of the blister, the mucosa retained its physiological tissue structure
(Fig. 5.8 - B). The epithelial layer consistently appeared continuous, both
macroscopically and microscopically in all sections. The subepithelial connective
tissue contained numerous intact blood vessels, with moderate infiltration of
neutrophilic granulocytes and occasional macrophages at the periphery of the blister.
Approaching the latter, the subepithelial layers diverged and enclosed the blister,
which contained coagulated blood (Fig. 5.8 - C). The MD probe was lost during
sectioning, but a clearly definable, circular area within the coagulated material
indicated its previous position (Fig. 5.8 - D). This area was mainly infiltrated with
neutrophilic granulocytes and fewer macrophages. Sections of the ventral and lateral
walls of the FS contained intact mucosa. In summary, there was a moderate, focal,
purulent to histiocytic, acute inflammation indicating a resorptive inflammatory
process restricted to the direct vicinity of the blister.
Sections of the bony margin of the bore hole revealed a regular, non-ragged cutting
edge. Starting approximately 50 µm from the edge, there was intact bone. Adjacent
to the cutting edge, rebuilding was apparent (newly formed osteoid).
72 Manuscript I
5.5 Discussion The present study describes the implantation of a MD probe into the FS of adult
horses and its subsequent use. This procedure enables in vivo MD to be humanely
conducted in the absence of anti-inflammatory products and with minimal restraint.
The MD probe was implanted in standing, sedated horses. Horses tolerated the
procedure well and there was easy anatomical orientation and a comfortable working
height. Similar observations were previously reported in the context of surgical
exploration of the paranasal sinus in standing, sedated horses (LANE 1993a;
RUGGLES et al. 1993; SCHUMACHER et al. 2000; QUINN et al. 2005). The site
selected for the sinoscopy portal was that recommended for trephination of the CMS
(RUGGLES et al. 1991; BERTONE et al. 1993). This approach facilitated admission
of the endoscope into the FS and subsequent visualization of the probe implantation
procedure. The site of probe placement was chosen based on the presence and
extent of bony lamellae within the FS. Creation of the CMS and MD portals caused
only mild hemorrhage, which might be due to conducting the surgery in standing
versus recumbent horses (SCHUMACHER et al. 2000; QUINN et al. 2005). The
drilling system worked well, enabling variations in speed and applied pressure.
Although only the bur, but not the Dremel®, could be rendered sterile, there were no
increased rates of incisional complications in comparison to other reports (GREET
1992; HART u. SULLINS 2011).
The limiting factor for probe implantation was successful creation of a fluid-filled
blister within the subepithelial layers of the sinus mucosa. Establishment of the blister
was most successful when drilling and applying of PBS were alternated repetitively
over a prolonged interval, with only brief and cautious drilling. Blister development
was accentuated by flushing, but it was not possible to control the extent to which the
blister underlined the drilled hole, nor the direction in which it expanded.
Requirements for appropriate probe placement were a rostral expanding blister of
appropriate size (~ 20 to 30 mm) and a shallow insertion angle, achieved by beveling
the caudal portal edge. These precautions were essential for protection of the
delicate MD membrane and the mucous membrane. Complications during blister
Manuscript I 73
establishment were perforation of the mucous membrane during drilling or probe
placement, or rupture of the blister while applying PBS. If required, three holes could
be made within a single FS skin flap. However, to minimize fluid loss via the mucosa
perforation(s), additional holes should be placed at least 10 mm from previous
hole(s). Overall, there was an obvious learning process; successive procedures
resulted in greater ease in conducting the probe implantation process. Regardless, a
minimum interval of approximately 3 h was needed for the entire procedure of probe
implantation.
Microdialysis membranes were inherently fragile; despite careful handling, two
probes broke during in vitro preparations. In vivo application, including insertion along
the bony margin of the portal and final placement within the blister, was challenging.
Therefore, a non-functional probe was used for all test purposes. Furthermore,
excellent sedation was required while inserting the probe, as even minor movements
of the horse’s head could damage the probe, the mucous membrane, or both. When
the same probe model was implanted in the gluteal muscles of horses that were not
restrained after probe placement, most probes had been pulled out or damaged in
< 24 h, probably due to the horses rubbing stall walls (EDNER et al. 2009). In the
present study, the probe was implanted in an area with no or minimal muscular
activity. Once the probes have successfully been inserted, we were able to collect
dialysate for the complete anticipated period of time (28 to 52 h) in all horses.
However, minor problems with variable dialysate levels occurred in one horse (3),
probably associated with headshaking. Another possible reason for variable dialysate
volume might be an increased resistance within the tubing system, caused by the
elevated position of the sampling vial compared to the sampling site. Long tubes
(> 1.5 m) and positioning of the MD-pump above the probe (> 30 cm) may provide an
increase of resistance to flow and hydrostatic pressure, respectively, and therefore
reduce flow rates (CHOU et al. 2001). In the present study, the inlet and outlet tubes
were only 600 and 200 mm long, respectively, and the vertical displacement of the
pump relative to the probe (~ 20 cm) did not affect dialysate volume in preliminary in
vitro studies (data not shown). Nonetheless, the membrane length (10 mm) facilitated
appropriate positioning of the delicate probe part within the blister. Length and
74 Manuscript I
flexibility of the inlet and outlet tubes allowed the vial holder and MD pump to be
stored in a secure and readily accessible location.
The MD probe was located within the subepithelial layers, but it was not surrounded
by naturally occurring interstitial fluid or other body fluids as usually applied in in vivo
MD (DE LANGE et al. 2000). However, that the FS mucosa of horses is only 110 to
120 µm thick (JLLIG 1910) precluded direct placement of the MD probe in the
subepithelial layers without the means of blister establishment. Although the blister
was filled with PBS and coagulated blood, there was less blood in the direct vicinity
of the MD probe, presumably due to the frequent flow of perfusion solution.
In the present study, use of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAID) was
omitted in order to avoid potential effects on the pharmacokinetic (PK) properties of
the substance of interest (SDM), as reported by EL-BANNA (1999). Nevertheless,
the horses’ behavior was normal, with minor exceptions (headshaking, rubbing).
Some horses rejected being touched at their heads during parts of the sampling
period, and changing of the vials had to be performed by two persons. Selection of
docile, well-mannered horses, accustomed to handling, is recommended.
Microdialysis is a semi-invasive technique with minimal impact on tissues
(BRUNNER u. LANGER 2006). Tissue trauma is usually caused by probe
implantation, rather than by the probe itself (DE LANGE et al. 2000; PLOCK u.
KLOFT 2005). In the present study, the frontal bone was perforated to provide
access to the interior of the FS. The bore hole (diameter: ~ 3 mm) was relatively
small compared to similar procedures, e. g. frontonasal flaps (FREEMAN et al. 1990;
SCHUMACHER et al. 2000). Based on histological evaluation, the bone was healthy
and functional. Moreover, probe implantation caused minor damage to the mucous
membrane, including separation of the subepithelial layers and rupture of arterioles
and venules (the subepithelial layers are well vascularized; TREMAINE et al. 1999);
the concomitant minor hemorrhage was limited by coagulation. However, the blister
was embedded within the subepithelial layers with an intact blood supply and
covered by a continuous epithelial layer. Infiltration of neutrophils and histiocyts was
consistent with focal resorptive inflammation (5 d after surgery). In general, complete
Manuscript I 75
healing of the sinus mucosa is possible; however, it depends on the severity of the
damage (NEGUS 1958). Only an excessive damage would result in formation of
fibrous scar tissue with non-ciliated epithelial lining and, therewith, loss of ability for
mucociliary clearance (TREMAINE u. DIXON 2001b). However, in the present study
the blister was consistently covered with an intact epithelial layer and suchlike
consequences were not to be expected.
Complications associated with the surgical procedure were rare and included mild
reactions of the mandibular lymph nodes and mild to moderate local subcutaneous
emphysema originating from the CMS portal. Such complications have been
described following similar surgical interventions and can be regarded as inoffensive
(RUGGLES et al. 1991; BERTONE et al. 1993; CHAN u. MUNROE 1995). Post
surgical nasal discharge, seen in five horses, presumably consisted of a mixture of
blood and rinsing fluid from the sinoscopy; it resolved without treatment within 1 to
4 d. Incidence of incisional complications in the present study (16.7 %) was lower
than commonly reported for surgical exploration of the paranasal cavities of horses
(39 %, GREET 1992; 29 %, HART u. SULLINS 2011). This might be due to
enrollment of horses without disease of the paranasal cavities, application of
trimethoprim-SDM at a therapeutic dosage (30 mg/kg, IV), and early euthanasia
(≤ d 5) of three horses. Nevertheless, in horses with long-term follow-up (n = 4), all
incisions healed by first intention and cosmetic outcomes were excellent.
5.6 Conclusion The present study describes the development and evaluation of a novel method for
implanting a MD probe into the FS of healthy horses. Both surgical implantation and
the subsequent in vivo trial were well tolerated, with minimal complications, and
excellent long-term cosmetic recovery. Therefore, we conclude that this method is
suitable for in vivo MD in adult horses using minimal restraint. Moreover, this
approach facilitates continuous monitoring of substances of interest within the
paranasal mucosal lining without usage of NSAIDs, which may alter PK properties of
the substances of interest.
76 Manuscript I
5.7 Tables and Figures
Fig. 5.1: Applied MD system, consisting of MD pump (a), MD syringe (b), MD probe (inlet tubing [c], probe shaft [d] with membrane area [e], outlet tubing [f], and vial holder [g]), and microvial (h).
Fig. 5.2: Portal locations. Sinoscopy portal at CMS (●); MD portal at FS (▲).
a
b
c
d e
f
g
h
Manuscript I 77
Fig. 5.3: 4 x 8 mm oval bur used for drilling the portals (both, sinoscopy and MD).
Fig. 5.4: Sinoscopic images of the frontal sinus during probe implantation (view onto sinus mucosa and lamina externa of the frontal bone from ventrally). (A) Bur hole (arrow) visible under intact paranasal mucosa. Small blister filled with externally applied PBS and mild hemorrhage, both dissipate evenly within the blister; (B) Blister increasing in size by administration of PBS, and covering the bur hole (circle); (C) Blister at its final size, MD probe (arrow) at its final position.
Fig. 5.5: Fixation of MD system. MD probe shaft (a) is affixed to the forehead, the vial holder (b) to the forelock (bottom-side up).
A B C
a
b
78 Manuscript I
Fig. 5.6: Fixation of MD system. (A) MD pump placed inside metal box, and bag; (B) Bag positioned at the poll and taped to halter.
Fig. 5.7: Sinoscopic images of the frontal sinus showing typical complications during blister establishment and probe implantation (view onto sinus mucosa and external lamina of the frontal bone from ventrally). (A) Perforation of mucosa during drilling (a), necessitating a second hole (b; Horse 4); (B) Distance between rostral blister edge (top left corner) and bur hole (circle) not leaving enough space to allow correct probe-positioning within the blister. Further administration of PBS did not lead to blister expansion in a rostral, but a caudal direction (arrow; Horse 8); (C) Perforation of mucosa by MD probe (arrow). Perforation was caused by an unexpected movement of the horse’s head during probe insertion.
A B
A B
b aAnderes Bild !!
B C
Manuscript I 79
Fig. 5.8: Histological examination of frontal sinus mucosa (5 d after probe implantation; Horse 12; stain: toluidine blue). (A) Blister and MD probe at its final position, sectional planes for B, C, and D; (B) Intact paranasal mucosa (consisting of Lamina epithelialis [a] and subepithelial layers [b]) and underlying bone (c) (bar = 100 µm); (C) Diverging subepithelial layers enclose the coagulated blister material (d) (bar = 100 µm); (D) Circular area (e) indicates the former position of the MD probe inside the coagulated material. The probe itself is not suitable to be visualized in histological, paraffin embedded sections (bar = 1 mm).
80 Manuscript I
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Manuscript II 81
6 Manuscript II
Detection of intravenously administered sulfadimidine in the paranasal mucous
membrane of horses: A microdialysis study.
6.1 Abstract Concentrations of sulfadimidine (SDM) were determined in the paranasal mucous
membrane of healthy horses by means of continuous in vivo microdialysis (MD).
Concentric MD probes were implanted into the frontal sinus mucosa of healthy
horses (n = 10). Probes were placed within a surgically created fluid-filled blister
(phosphate buffered solution) located within the subepithelial layers of the mucosa.
Following administration of trimethoprim-SDM (30 mg/kg, IV, q 24 h), dialysate and
plasma samples were collected continuously for 48 h. Both plasma and dialysate
samples were analyzed for concentrations of SDM by high-performance liquid
chromatography. Concentrations of SDM in the paranasal mucosa were estimated
from recovery rates of SDM accomplished prior to the study. Furthermore,
sulfadiazine (SDZ) was applied as an internal standard for in vivo MD in order to
monitor potential changes of recovery over time. Average peak concentrations of
SDM were 55.3 ± 10.3 and 51.5 ± 8.7 µg/mL for plasma, and 9.6 ± 4.5 and
7.0 ± 3.3 µg/mL for the paranasal mucosa (t0-24 and t24-48, respectively). SDM peak
concentrations in the paranasal mucosa were reached at 5.9 ± 2.7 and 5.4 ± 2.3 h
following the first and second treatment, respectively. The average SDM
concentration in the mucosa remained above the breakpoint of susceptibility
(0.25/4.75 µg/mL for trimethoprim/sulfonamid-combinations) for 12 h. Relative loss of
SDZ indicated an average reduction of 24 % for recovery rates during the
experimental period of 48 h.
In conclusion, this study demonstrates the feasibility of in vivo MD for continuous
monitoring of SDM concentrations within the paranasal mucosal lining of adult
horses. Furthermore, these results indicate that the combination of TMP and SDM
(25 mg/kg SDM, 5 mg/kg TMP, IV) is likely to be efficient for treating equine sinusitis
82 Manuscript II
caused by highly susceptible pathogens providing an adaption of the dosage interval
to q 12 h.
Keywords: equine, microdialysis, pharmacokinetic, trimethoprim-sulfonamide,
paranasal sinus mucosa
6.2 Introduction Sinusitis is the most frequent disorder of the paranasal sinuses in horses (NICKELS
2006). It may be caused by infections of the upper respiratory tract (primary sinusitis)
or by dental disease, facial trauma, sinus cysts, progressive ethmoid hematoma,
sinonasal mycosis, or neoplasia (secondary sinusitis) (TREMAINE u. DIXON 2001a;
O'LEARY u. DIXON 2011). Clinical significance of equine sinonasal disorders derives
from their chronicity and the fact that they are usually difficult to treat (TREMAINE et
al. 1999; TREMAINE u. DIXON 2001a). Anti-infective drugs are frequently used in
treatment of equine sinusitis, although poor response to antimicrobial therapy has
been reported repeatedly (MASON 1975; BOULTON 1985; TROTTER 1993;
TREMAINE u. DIXON 2001b). It was suggested that failure of anti-infective treatment
is caused by accumulation of inspissated pus within individual sinus compartments
(primary sinusitis) as well as by persistence of underlying conditions in secondary
sinusitis (SCHUMACHER et al. 1987; TREMAINE u. DIXON 2001b; DIXON et al.
2011). However, as treatment failure of anti-infective agents in general might occur
due to subinhibitory concentrations within the infected tissue (MÜLLER et al. 2004;
STEINER et al. 2004), this aspect should be taken into account for equine sinusitis
as well.
Trimethoprim-sulfonamide (TMS) combinations are frequently used in equine
medicine and are furthermore considered to be appropriate for treatment of infections
of the equine respiratory tract (PRESCOTT 2006; HAGGETT u. WILSON 2008).
Thus far, trimethoprim (TMP) and sulfonamide concentrations have been detected in
various body fluids and tissues of horses including blood, urine, synovia,
endometrium, and cerebrospinal and peritoneal fluid (BROWN et al. 1983; BROWN
et al. 1988), bronchial epithelial lining fluid (WINTHER et al. 2011), and
Manuscript II 83
subcutaneous tissue chamber fluid (VAN DUIJKEREN et al. 2002; ENSINK et al.
2005). However, there is apparently no data available on drug concentrations of
either TMP or sulfonamides within the paranasal sinuses of horses. However, it is not
appropriate to extrapolate drug concentrations from the plasma compartment or a
different peripheral tissue, as concentrations of anti-infective agents can vary
considerably between different tissues (MÜLLER et al. 2004). Moreover, the clinical
outcome of an anti-infective treatment closely correlates with achievement and
duration of effective drug concentrations at the infection site (MCKENZIE 2009),
which is the interstitial fluid (ISF) in most bacterial infections (RYAN 1993).
Therefore, drug concentrations of anti-infective agents should be obtained not only
from the tissue in question but also directly from the ISF of the respective tissue
(JOUKHADAR et al. 2001; MÜLLER et al. 2004).
Microdialysis (MD) is considered to be a suitable technique for continuous monitoring
of endo- and exogenous compounds in body fluids and in the ISF of tissues in human
beings and animals (UNGERSTEDT 1991; MÜLLER et al. 1996; JOUKHADAR et al.
2001; BRUNNER et al. 2005); however, it has apparently not been used in the
paranasal sinuses of any species. Several reports have addressed the principles of
MD (DE LANGE et al. 2000; PLOCK u. KLOFT 2005; CHAURASIA et al. 2007).
Briefly, the tip of a MD probe (containing a semipermeable membrane) is introduced
into a tissue or body fluid. The probe is perfused with a perfusion solution and an
exchange of substances from the perfusion solution into the periprobe fluid and vice
versa takes place. The bidirectional mass transport across the membrane pores is
driven by a concentration gradient. Analysis of the resulting sample (= dialysate)
indicates gain or loss of substances from or to the perfusion solution. The term
recovery has been applied to describe the relation of substances in the periprobe
fluid and the dialysate (DE LANGE et al. 2000).
The objective of the present study was to develop and evaluate a technique that
allows continuous monitoring of anti-infective drug concentrations within the
paranasal mucous membrane of unsedated horses. A specific goal of the present
study was to determine concentrations of sulfadimidine (SDM) in the paranasal
84 Manuscript II
mucosa of horses. We hypothesized that in vivo MD was a suitable technique to
detect concentrations of SDM within the paranasal mucosal lining of horses following
IV drug administration.
6.3 Materials and Methods
6.3.1 Horses
Adult, university-owned horses (n = 10) of various breeds, nine mares and one
stallion, were used. Horses weighed from 410 to 675 kg (mean 558.2 kg) and were
from 5 to 23 y of age (mean 13.5 y). All horses were considered healthy based on a
general physical examination, routine hematology, and blood chemistry. None of the
horses had a history or clinical signs of paranasal sinus disease. Lateral and
dorsoventral radiographs (done prior to the study) of the paranasal sinuses revealed
no abnormalities. The horses had not received any medical treatment for at least
3 wk before enrollment. Horses were housed in individual stalls, fed hay and mixed
feed twice daily, and had ad libitum access to water.
All procedures were performed under a protocol approved by the Ethical Committee
of the Lower Saxony State Office for Consumer Protection and Food Safety
(No. 33.9-42502-04-10/0227). The trials were carried out at the Clinic for Horses of
the University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Germany.
6.3.2 Microdialysis equipment and probe implantation
Highly flexible, concentric MD probes (CMA 70 Brain Microdialysis Catheter; CMA
Microdialysis AB, Solna, Sweden) were utilized in the current study. Prior to in vivo
installation, every probe was tested under in vitro conditions to verify probe integrity
and performance parameters (data not presented). After testing, probes were stored
in aqua bidestillata. Before in vivo application, probes were flushed with sterile-
filtered phosphate buffered solution (PBS, pH 7.4) and kept in PBS until immediately
prior to implantation.
Manuscript II 85
Horses received a 12-gauge indwelling intravenous catheter (EquiCathTM Fastflow;
B. Braun Vet Care GmbH, Tuttlingen, Germany) that was placed in one of the jugular
veins using aseptic technique. The technique of probe implantation into the mucosal
lining of the frontal sinus in standing, sedated horses has been described before
(Ch. 5). Briefly, access to the mucosa of the frontal sinus was achieved by drilling an
opening (diameter: 1 - 2 mm) into the frontal bone. Subsequently, a fluid-filled blister
(sterile-filtered PBS, diameter: 20 - 30 mm) was created within the subepithelial
layers of the underlying sinus mucosa. The tip of a MD probe (including the
semipermeable membrane, length: 10 mm, outer diameter: 0.6 mm) was placed in
the blister and the complete MD system was affixed to the horse: the outlet tube
(220 mm, 1 mm) with the vial holder was taped to the horses forelock, whereas the
inlet tube (600 mm, 1 mm) was connected to a CMA 106 Syringe (CMA Microdialysis
AB). The latter was placed in a battery-powered CMA 107 Microdialysis Pump (CMA
Microdialysis AB) which in turn was secured in a light-weighted metal box taped to
the horse’s halter (poll).
6.3.3 Reagents
SDM sodium salt and SDZ sodium salt were provided by Sigma-Aldrich (Steinheim,
Germany). Perchloric acid, potassium carbonate, and sodium chloride were
purchased from Merck (Darmstadt, Germany).
6.3.4 In vivo experiment
Prior to each in vivo experiment, the respective MD probe was subjected to an in vivo
calibration that was subdivided into three successive phases as described by BOUW
and HAMMARLUND-UDENAES (1998). Firstly, the probe was perfused with PBS in
order to obtain a blank sample (duration: 90 min, flow rate: 2 µL/min). Secondly, the
probe was perfused with PBS containing each 1 µg/mL of SDM (substance of
interest) and sulfadiazine (SDZ; internal standard; 90 min, 2 µL/min); this period is
referred to as reference period. Thirdly, a washout period of 60 min was allowed to
ensure removal of SDM from the MD probe and the periprobe fluid. During the
86 Manuscript II
washout period and the following experimental period, the probe was continuously
perfused with PBS containing 1 µg/mL SDZ at a flow rate of 2 µL/min.
Horses were administered a TMP-SDM formulation (30 mg/kg, IV, Bigram®; CP-
Pharma, Burgdorf, Germany) twice: administration of the first dosage at t0 determined
the start of the 48 h experimental period, the second dosage was administered after
24 h (t24). During the experimental period dialysate fractions (180 µL) were collected
in 90 min intervals. The volume of each dialysate fraction was measured and the
maximum available aliquot was transferred from the microvial to a glass vial and
diluted to 290 µL (PBS). Samples were then frozen and kept at − 20 °C until analysis.
Blood samples were collected prior to each drug administration (t0 and t24) and at
predetermined intervals after each drug administration (0.5, 1, 1.5, 3, 6, 12, 18, and
24 h). Prior to blood sample collection aliquots of 10 mL blood were collected from
the jugular vein catheter and discarded. After that, whole blood samples (10 mL)
were collected into EDTA-vacutainer tubes (Vacuette®; Greiner Bio-One,
Kremsmünster, Austria). Immediately after sample collection, the catheter was
flushed with 10 mL of heparinized saline. The blood samples were centrifuged at
3 000 rpm for 6 min; plasma was then transferred to plastic tubes and frozen at
− 20 °C until analysis.
6.3.5 Drug analysis
The thawed dialysate fractions were directly subjected to high-performance liquid
chromatography (HPLC), whereas the plasma samples were subjected to an
extraction procedure prior to drug analysis (adapted from NOUWS et al. 1985). An
aliquot of 500 µL plasma was transferred to an extraction tube and spiked with the
internal standard SDZ (10 µg/mL). To all samples 1000 µL of 0.66 mol/L perchloric
acid was added. After mixing for 10 s, 12 µL of saturated K2CO3 solution and 10 µL
of 4 % NaCl solution were added. The tubes were placed inside a vibrating shaker for
30 min. Subsequently, samples were centrifuged at 15 000 rpm for 10 min. An aliquot
of 300 µL of the resulting supernatant was transferred into a HPLC glass vial,
whereas the residue was dissolved in 1000 µL perchloric acid and processed
following the described scheme for a second time. HPLC samples were stored at
Manuscript II 87
− 20 °C until analysis. Following HPLC performance, results for the two extraction
stages were added.
All test compounds were quantified with the following HPLC system by using the
external standard method: 126 Solvent Module Pump, 507 Autosampler, 168
Detector, and Software 24 Karat 5.0 (Beckmann, Munich, Germany). The
LichroCART 25-4 column (C18, 5 µm) and a LichroCART 4-A guard column (5 µm,
both Merck, Darmstadt, Germany) were placed in a column heater at 40 °C (Spark
Holland, Emmen, Netherlands). The eluent consisted of 15 % methanol (HPLC
grade) and 85 % McIlvaine citrate buffer (pH 2.2; 20.8 g citric acid and 0.4 g
Na2HPO4 x H2O in 1 L purified water). Aliquots of 100 µL were injected and analyzed
at 254 nm with a flow rate of 1.0 mL/min. The limit of detection was 0.07 µg/mL for
SDM and 0.08 µg/mL for SDZ. The limit of quantification was 0.14 µg/mL for SDM
and 0.15 µg/mL for SDZ. The average recovery of SDZ from plasma samples was
74.1 ± 11.9 % (mean ± SD).
6.3.6 Calculation of recovery values and paranasal mucosa concentrations
Recovery rates of SDM and SDZ were assessed according to the retrodialysis
method (BOUW u. HAMMARLUND-UDENAES 1998). Thus, relative loss (RL) from
the perfusion solution to the periprobe fluid was determined for the reference period
(SDM and SDZ) and the experimental period (SDZ) according to:
Cperfusate was the concentration of either SDM or SDZ in the perfusion solution and
Cdialysate was the concentration of either SDM or SDZ in the dialysate.
The relative loss of SDZ (RLSDZ) during the experimental period was calculated in
order to evaluate potential alterations of recovery rates for the remainder of the
experiment (retrodialysis by calibrator). The relative loss of SDM (RLSDM) during the
reference period was used to estimate the unbound SDM concentrations in the
periprobe fluid during the experimental period (retrodialysis by drug). In the present
88 Manuscript II
study, the periprobe fluid was the content of the paranasal sinus blister within the
subepithelial layers of the mucosa and is hereafter referred to as the paranasal
mucosa. In order to determine the unbound SDM concentration within the paranasal
mucosa (CSDM, mucosa), the analyzed SDM concentration of each dialysate fraction
(CSDM, dialysate) during the experimental period was related to the determined relative
loss of SDM during the reference period (RLSDM, Ref.):
The estimated mucosa concentrations reflected the temporal average over the
sampling interval of 90 min.
6.3.7 Data analysis
Pharmacokinetic (PK) parameters of SDM in plasma and paranasal mucosa were
determined for each horse by noncompartmental analysis (WinNonlin Professional
Edition Version 5.3; Pharsight, Mountain View, CA, USA). The calculated values
included maximum concentration (Cmax), time of maximum concentration (tmax), drug
concentration at the last observation of the respective dosing interval (Clast),
elimination half-life (t1/2), elimination rate constant (λz), area under the curve (AUC),
area under the first moment curve (AUMC), mean residence time (MRT), volume of
distribution at steady state (Vss), volume of distribution based on the terminal phase
(Vz), and total plasma clearence (Cl). Data are reported as mean ± SD.
6.4 Results Plasma samples contained SDM peak concentrations of 55.3 ± 10.3 and
51.5 ± 8.7 µg/mL following the first (t0) and second (t24) treatment, respectively
(Fig. 6.1). Average PK parameters for plasma concentrations are presented in
Tab. 6.1.
The average volume of the dialysate fractions available for analytical purposes was
122.7 ± 26.8 µL (mean ± SD) per sample. In Horse 1, the volume of most dialysate
Manuscript II 89
fractions was reduced, most probably due to loss of dialysate through the overflow
valves of the microvials when this horse was headshaking.
Results for RLSDM during the reference period were available for 8/10 horses and
averaged 45.9 ± 8.8 % (Tab. 6.2); reference samples of Horses 1 and 6 were not
evaluable due to analytical difficulties. Unbound SDM concentrations in the paranasal
sinus mucosa were estimated from the determined dialysate concentrations during
the experiment in relation to RLSDM from the reference period. In Horses 1 and 6 the
mean of RLSDM of the other eight horses was applied. Corrected dialysate fractions,
representing temporally averaged estimates of the mucosa concentration for the
respective sample interval, contained mean peak concentrations of 9.6 ± 4.5 and
7.0 ± 3.3 µg/mL following the first (t0) and second (t24) treatment, respectively
(Fig. 6.2). However, substantial differences were evident in the mucosa concentration
of individual horses (Fig. 6.3), exemplified by peak concentrations ranging from 2.7 to
15.3 µg/mL. Average PK parameters for the mucosa concentrations are presented in
Tab. 6.1.
Results for RLSDZ during both the reference and experimental periods were
calculated according to the equation RL = (Cperfusate - Cdialysate)/Cperfusate. In Horse 1,
SDZ was not quantifiable in most dialysate fractions; in Horses 2 and 5, calculations
of RLSDZ revealed no loss, but gain of SDZ in reference samples as well as only
minimal loss or gain of SDZ in most of the dialysate fractions during the experimental
period (Tab. 6.2). As these difficulties were probably due to analytical issues, values
of Horses 1, 2, and 5 were not included into the following calculations. Thus, the
average RLSDZ of 7/10 horses was 40.0 ± 17.7 % during the reference period and
22.0 ± 11.9 % during the experimental period. In all horses, considerable variations in
RLSDZ (experimental period) were evident, as well as a mild negative tendency of
relative loss over the experimental duration of 48 h (Fig. 6.4).
90 Manuscript II
6.5 Discussion Apparently, this is the first study to describe the application of the MD technique in
the paranasal sinus mucosa of horses. Furthermore, concentrations of intravenously
administered SDM could be detected within the paranasal mucosal lining in horses
by the means of continuous in vivo MD.
Potentiated sulfonamides are frequently used in equine medicine in general and they
are furthermore considered to be appropriate for treatment of infections of the equine
respiratory tract (PRESCOTT 2006; HAGGETT u. WILSON 2008). Unlike TMP which
exhibits a short half-life and low tissue concentration in horses (VAN DUIJKEREN et
al. 1994b) and thus requires considerable analytical effort due to expected low TMP
concentrations in dialysate, SDM could be detected without significant problems by
HPLC.
MD is considered to be a semi-invasive technique with minimal impact on the
affected tissue (BRUNNER u. LANGER 2006). Tissue trauma is usually caused by
probe implantation, rather than by the probe itself (DE LANGE et al. 2000; PLOCK u.
KLOFT 2005). In the present study, probe implantation required surgical access to
the frontal sinus mucosa. The fact that the mucosa of the equine frontal sinus only
measures 110 to 120 µm in thickness (JLLIG 1910) precluded direct probe
placement (outer diameter of membrane area: 0.6 mm) in the subepithelial layers of
the paranasal mucosa and creation of a fluid-filled blister was required.
Consequently, the MD probe was not surrounded by naturally occurring ISF or other
body fluids as usually applied in in vivo MD (DE LANGE et al. 2000). The estimated
drug concentration within the paranasal sinus blister may therefore vary from
effective concentrations in unaffected ISF due to several reasons. Firstly, blister
creation might cause dilution to the drug concentration within the blister. As the
definite blister size could neither be measured nor influenced during blister creation,
the factor of dilution was unknown and may vary between individual horses due to
variations in blister size. Secondly, blister creation provided an altered ratio of the
capillary surface area to the volume of the tissue and may therefore influence the
drug delivery into the paranasal mucosa (RYAN 1985). Thirdly, separation of the well
Manuscript II 91
vascularized subepithelial layers of the paranasal mucosa (TREMAINE et al. 1999)
led to rupture of arterioles and venules and subsequent minor hemorrhage within the
blister. Although hemorrhage was apparently limited by coagulation, it cannot be
excluded that drug delivery to the paranasal mucosa was altered by microbleeding
and temporary alterations in capillary permeability. Furthermore, it is possible that
drug levels within the mucosa were diminished due to the fact that sulfadimidine
(weak acid) might not enter an area of reduced pH (inflammatory response) in the
same extent as it would passage into unaffected ISF.
As shown in Fig. 6.1, concentrations of SDM could be detected both in plasma and in
dialysate fractions following IV injection of TMS. The obtained plasma levels and PK
parameters of SDM in plasma are in accordance with previous reports on
sulfonamides in horses (VAN DUIJKEREN et al. 1994a; VAN DUIJKEREN et al.
1995; WINTHER et al. 2011). The average SDM peak concentration in the paranasal
sinus mucosa, estimated from the dialysate fractions, ranged around 8 µg/mL. The
concentration-time profile of SDM concentrations in the paranasal mucosa and in
plasma revealed a delay of approximately 5 h in achievement of tmax in the mucosa
compared to tmax in plasma. Furthermore, average drug concentrations within the
mucosa only achieved 17.4 % and 13.6 % of the peak concentration in plasma (t0-24
and t24-48, respectively). Both a prolonged half-life and MRT in the paranasal mucosa
compared to plasma indicated a temporary accumulation of SDM within the mucosa.
Despite a gradual decrease of SDM concentrations in plasma and in the mucosa
over 24 h, there were average concentrations of ~ 5 µg/mL in plasma and ~ 2 µg/mL
in the mucosa during the last sampling intervals.
SDM concentrations in the paranasal mucosa of individual horses exhibited
considerable interindividual differences. Assessing these differences, it is important
not only to take into account biological reasons, but also potential sources of error
due to technical issues (see below). However, similar variations have been reported
by VAN DUIJKEREN et al. (2002) and ENSINK et al. (2005) who investigated the
distribution of SDZ and TMP into noninfected or infected subcutaneous tissue
chamber fluid of ponies. These authors reported SDZ concentrations of
92 Manuscript II
approximately 20 µg/mL in the tissue chamber fluid following IV or oral SDZ
administration (25 mg/mL). Further authors investigated concentrations of
sulfonamides within various tissues and body fluids including synovia, peritoneal
fluid, pulmonary epithelial lining fluid, and endometrium. Following administration of
dosage regimens comparable to the present study, peak concentrations ranging from
5 to 25 µg/mL depending on the tissue or body fluid were received (BROWN et al.
1983; BERTONE et al. 1988; BROWN et al. 1988; WINTHER et al. 2011). Those
reports confirm the plausibility of the mucosa concentrations estimated by the means
of in vivo MD. However, it is important to keep in mind that the presented study
investigated drug concentrations within the paranasal mucosal lining of healthy
horses in order to evaluate the feasibility of in vivo MD within the paranasal sinus of
horses. Drug distribution patterns for diseased horses might differ from the presented
results (EKEDAHL et al. 1978; RYAN 1993). Nevertheless, this study underscores
the fact that relying on plasma concentrations alone results in an overestimation of
the drug concentrations achieved within the paranasal mucosa and therefore in an
overestimation of the efficacy of the presented SDM treatment in terms of sinusitis
therapy.
The estimated mucosa concentrations were evaluated relative to minimum inhibitory
concentrations (MIC) of potentiated sulfonamides (Fig. 6.3). A MIC of
≤ 0.25/4.75 µg/mL was recommended as a guideline for susceptibility for organisms
of equine origin for TMP/SDZ (BERTONE et al. 1988). The same MIC was given for
bacterial isolates from equine lower airway infections (Strept. equi ssp.
zooepidemicus, Staph. aureus) for TMP/sulfamethoxazole in a 1:19 ratio (WINTHER
et al. 2011). The average mucosal SDM concentration exceeded this MIC for
approximately 12 h. However, in view of the large variations of Cmax between
individual horses, SDM concentrations only exceeded the contemplated MIC for 12 h
in the paranasal mucosa in 5/10 horses. Other authors recommended a higher MIC
(≤ 0.5/9.5 µg/mL) for equine bacterial isolates for TMP/SDZ (ADAMSON et al. 1985)
and TMP/sulfamethoxazole (HIRSH u. JANG 1987) combinations; in the present
study, mean peak concentrations of SDM would have exceeded this MIC only
temporarily in 5/10 horses. Even higher MIC breakpoints as given by ENSINK et al.
Manuscript II 93
(1993; 1/20 µg/mL) and by FEY and SCHMID (1995; 0.5/32 µg/mL) would have not
been attained at all. Based on average SDM concentrations within the paranasal
mucosa and providing effective TMP concentrations, we conclude that the IV
treatment of 25 mg/kg SDM in combination with 5 mg/kg TMP is likely to be efficient
for treating equine sinusitis caused by highly susceptible pathogens. However, the
dosing interval should be adapted to 12 h to ensure long-lasting effective drug
concentrations; similar observations have been made by WINTHER et al. (2011) with
regard to infections of the equine lower respiratory tract. However, it is important to
keep in mind the considerable variations in drug levels between individual horses,
demonstrating that effective drug concentrations cannot be taken as granted.
The major issue for accurate estimations of true tissue concentrations from
microdialysate samples is the reliability of the applied recovery method
(UNGERSTEDT 1991). In the present study, recovery rates of SDM were estimated
by the method of retrodialysis by drug (BOUW u. HAMMARLUND-UDENAES 1998).
Recovery rates of SDM from the reference period were relatively constant in eight
horses (45.9 ± 8.8 %). Consequently, we were able to use the mean of RLSDM as a
measure of recovery in those two horses (1 and 6) in which we could not use the
actual recovery rate of the particular probe due to analytical issues. The substance of
interest itself is considered to be the ideal calibrator in MD experiments (BOUW u.
HAMMARLUND-UDENAES 1998). However, retrodialysis by drug needs to be
performed prior to the actual in vivo experiment and cannot take into account
changes of recovery rates over time. Therefore, additional application of an internal
standard is recommended in order to observe changes in the recovery rate during
the entire in vivo experiment (DE LANGE et al. 2000). In the current study, SDZ was
used as an internal standard as it appeared as a suitable internal standard in
preliminary in vitro experiments. However, some difficulties were encountered during
the in vivo application of SDZ. Firstly, calculations of RLSDZ revealed only minimal
loss or even gain of SDZ in dialysate fractions of Horses 2 and 5. While the reasons
for the reduced recovery rates are not entirely clear, we assumed bioanalytical
concerns due to working with low drug concentrations in all utilized solutions and
samples (BOUW u. HAMMARLUND-UDENAES 1998). In the present study, this
94 Manuscript II
effect might have been increased by the need of diluting the dialysate samples for
HPLC analysis. Secondly, in vivo results of RLSDZ exhibited considerable fluctuations
in values obtained from the experimental period in single probes (SD up to 20.7 %);
however these fluctuations were not evident in the concentration-time profile of SDM.
Similar observations have been reported by BOUW and HAMMARLUND-UDENAES
(1998) who concluded that high coefficients of variation are associated with low
recovery rates. Thirdly, a negative regression slope (Fig. 6.4) indicated a reduction of
RLSDZ values during experimental period of 48 h. Considering the mean of the first
and the last five dialysate fractions of the experimental period (7/10 horses), RLSDZ
decreased by 24 %. Furthermore, considerable variations between RLSDZ from the
reference period (40 %) and the experimental period (22 %) were evident. One
possible reason for the reduction of recovery rates is a progressive occlusion of the
probe membrane pores (DE LANGE et al. 2000). Furthermore, it is possible that
microbleeding (caused by blister creation) was still present at the beginning of the in
vivo experiment and caused an initial increase of recovery rates. This circumstance
would also affect the recovery rates of SDM, meaning that the final SDM
concentrations would be approximately 24 % higher than estimated in above stated.
With regard to increased surgical interventions in the presented study and in order to
prevent alterations of recovery values and estimated drug concentrations, we
recommend to extend the lag time between blister creation and performance of the in
vivo experiment from 1 h to 12 - 24 h, which is in accordance with DE LANGE et al.
(2000) and CHAURASIA et al. (2007). In conclusion, several difficulties were
encountered during the in vivo application of SDZ as an internal standard.
Consequently, further application of RLSDZ, e. g. for estimations of mucosa drug
concentrations (BOUW u. HAMMARLUND-UDENAES 1998), were omitted. In fact,
further studies are necessary to either prove the suitability of SDZ as an internal
standard for the presented study design under different conditions (e. g. higher
concentrations in the perfusion solution) or to find a more suitable substance for
continuous monitoring of recovery values.
Manuscript II 95
6.6 Conclusion The current study demonstrates the suitability of in vivo MD for continuous monitoring
of unbound drug concentrations within the paranasal sinus mucosa in horses for a
period of 48 h. Furthermore, this study provides the first data on concentrations of
SDM in the paranasal mucosa of healthy horses following intravenous drug
administration. Based on our results, we conclude that the combination of TMP and
SDM concentrations following IV treatment (25 mg/kg SDM, 5 mg/kg TMP, IV,
q 12 h) is likely to be efficient for treating equine sinusitis caused by highly
susceptible pathogens.
96 Manuscript II
6.7 Figures and Tables
0 6 12 18 24 30 36 42 480
20
40
60
80
Time (h)
Su
lfad
imid
ine (
µg
/mL
)
Fig. 6.1: Comparison of concentration-time profiles of plasma (squares) and paranasal mucosa (circles) SDM concentrations following IV administration of SDM (25 mg/kg) at t0 and t24 (arrows). Symbols depict the mean ± SD concentration of ten horses.
0 6 12 18 24 30 36 42 480
5
10
15
Time (h)
Su
lfad
imid
ine (
µg
/mL
)
Fig. 6.2: SDM concentrations in the paranasal sinus mucosa of ten horses (mean ± SD) following IV administration of SDM (25 mg/kg) at t0 and t24 (arrows).
Manuscript II 97
6 12 18 24 30 36 42 480
5
10
15
Time (h)
Su
lfad
imid
ine (
µg
/mL
)
Fig. 6.3: SDM concentrations of the paranasal sinus mucosa determined by in vivo MD for 48 h following IV administration of SDM (25 mg/kg) at t0 and t24 (arrows). Boxplots demonstrate variations of SDM concentrations within the paranasal mucosa of ten horses.
MIC breakpoints for susceptibility: 4.75 µg/mL (––) (BERTONE et al. 1988; WINTHER et al. 2011) and 9.5 µg/mL ( ) (ADAMSON et al. 1985; HIRSH u. JANG 1987).
0 6 12 18 24 30 36 42 481
10
100
Slope = -14.29 0.05
r2 = 0.18
Time (h)
RL
SD
Z(%
)
Fig. 6.4: Relative loss (RL) of the internal standard SDZ during in vivo MD study. Data represent the average RL of independent trials in seven horses. Values indicate fluctuations and a reduction of RLSDZ during the experimental period of 48 h.
98 Manuscript II
Tab. 6.1: Pharmacokinetics of SDM following IV administration of 25 mg/kg to ten horses.
t0 - t24 t24 - t48 t0 - t24 t24 - t48
Unity Mean ± SD Mean ± SD Mean ± SD Mean ± SD
Cmax µg/mL 55.3 ± 10.5 51.5 ± 8.7 9.6 ± 4.5 7.0 ± 3.3
Clast µg/mL 5.0 ± 2.6 4.6 ± 2.3 1.9 ± 1.2 2.2 ± 1.3
tmax h - - 5.9 ± 2.7 5.4 ± 2.3
t1/2 h 7.7 ± 2.0 7.7 ± 1.5 8.4 ± 2.5 10.9 ± 4.4
λz 1/h 0.10 ± 0.03 0.09 ± 0.02 0.08 ± 0.04 0.07 ± 0.04
AUC µg/mL*h 373.2 ± 105.6 419.4 ± 101.5 110.7 ± 56.7 103.8 ± 51.2
AUMC h*h*µg/mL 2726.3 ± 1185.2 3163.0 ± 1022.0 1126.6 ± 701.7 1129.8 ± 613.6
MRT h 7.0 ± 1.4 7.4 ± 0.7 10.0 ± 1.7 10.8 ± 1.1
Cl mL/h/kg 63.6 ± 21.9 56.6 ± 17.7 217.9 ± 115.1 218.3 ± 137.6
Vss mL/kg 633.2 ± 160.3 567.3 ± 72.9 - -
Vz mL/kg 673.1 ± 178.7 602.2 ± 87.3 3387.9 ± 2649.8 3388.8 ± 1608.6
Plasma Blister
AUC: area under the curve, AUMC: area under the first moment curve, C last: drug concentration at
last observation, Cmax: maximum drug concentration, Cl: clearence, MRT: mean residence time,
tmax: time of maximum drug concentration, t1/2: elimination half-life, Vs: volume of distribution at
steady state, Vz: volume of distribution based on the terminal phase, λz: elimination rate constant
Tab. 6.2: Comparison of in vivo retrodialysis recoveries of SDM and SDZ for individual
horses (n = 10).
Experimental period
(dialysate fractions, n = 32)
Horse RLSDM RLSDZ RLSDZ
(%) (%) Mean ± SD (%)
1 - - -
2 44.9 - 2.1* - 14.9 ± 28.9*
3 47.3 23.7 14.2 ± 5.7
4 34.4 73.0 43.5 ± 20.7
5 35.9 - 6.9* 1.6 ± 9.7*
6 - 35.4 17.3 ± 12.8
7 45.7 18.3 9.6 ± 8.9
8 43.5 40.3 27.8 ± 7.9
9 54.0 44.2 17.6 ± 9.8
10 61.2 44.8 24.2 ± 17.6
Mean ± SD (%) 45.9 ± 8.8 40.0 ± 17.7 22.0 ± 11.9
Reference period
(dialysate fractions, n = 1)
* values not included into calculations of mean ± SD
Übergreifende Diskussion 99
7 Übergreifende Diskussion
7.1 Implantation des Mikrodialysekatheters
7.1.1 Methodisches Vorgehen
Die Methode zur Implantation eines MD-Katheters in die NNH von Pferden wurde an
isolierten Pferdeköpfen (n = 20) erarbeitet. Entsprechend der daraus resultierenden
Vorgehensweise wurde jeweils ein MD-Katheter in einen der beiden Sinus frontalis
von zwölf klinisch gesunden Pferden implantiert.
Das Einsetzen des Katheters erfolgte am stehenden, sedierten Pferd, so dass das
allgemeine Narkoserisiko und damit der deutlich erhöhte Zeitdruck im Vergleich zur
Durchführung des Eingriffs am allgemeinanästhesierten Pferd entfielen. Gleiches gilt
für das mit der Aufstehphase verbundene Verletzungsrisiko und die Gefahr des
Verrutschens oder der Beschädigung von MD-Katheter und/oder Equipment während
dieser Phase. Darüber hinaus ermöglichte die Arbeit am stehenden Pferd eine gute
anatomische Orientierung im Bereich der NNH und führte zu einer geringeren
Ausprägung von Blutungen beim Anbringen der Hautinzisionen als es beim
liegenden Pferd in Allgemeinanästhesie zu erwarten gewesen wäre (SCHUMACHER
et al. 2000; QUINN et al. 2005).
Die Anwendung der elektrischen Fräse ermöglichte durch das geringe Gewicht und
die Möglichkeit zur Regulierung der Drehgeschwindigkeit ein vorsichtiges Arbeiten.
Als Nachteil des verwendeten Systems ist die Tatsache zu werten, dass lediglich der
Fräskopf, nicht aber die gesamte Fräse sterilisiert werden konnten. Unter
Berücksichtigung der vergleichsweise niedrigen Inzidenz von Wundheilungs-
störungen in der vorliegenden Arbeit (16,7 %), schien dieser Umstand jedoch keine
erhöhte Infektionsgefahr nach sich zu ziehen (Kap. 7.4.1).
Der gesamte Vorgang der Katheterimplantation erfolgte unter endoskopischer
Kontrolle. Das Endoskopieportal im Bereich des Sinus maxillaris caudalis
ermöglichte den Zugang in den ipsilateralen Sinus frontalis. Die endoskopische
Visualisierung war essentiell für die Auswahl einer geeigneten
100 Übergreifende Diskussion
Katheterinsertionsstelle, welche in erster Linie von dem Vorhandensein und der
Ausdehnung knöcherner Lamellen innerhalb des Sinus frontalis abhängig war.
Weiterhin war die Sinuskopie wichtiger Bestandteil der Kontrolle sämtlicher
Arbeitsschritte während der Knochenperforation, der Blasenbildung und der
Katheterinsertion.
Das primäre Ziel der Katheterimplantation war es die Membran des MD-Katheters in
der Schleimhaut zu platzieren ohne letztere dabei zu perforieren. Die Relation von
Außendurchmesser der MD-Membran (600 µm) und Dicke der Schleimhaut (ca. 120
µm, JLLIG 1910) erforderte die Bildung einer flüssigkeitsgefüllten Blase in den
subepithelialen Schichten der Mukosa. Aufgrund der Empfindlichkeit der Schleimhaut
stellte die Blasenbildung stets den limitierenden Faktor für die erfolgreiche
Implantation des MD-Katheters dar. Neben einer grundsätzlich äußerst vorsichtigen
Vorgehensweise mit Fräse und Katheter konnte das Risiko der Schleimhaut-
perforation durch eine ausreichende Größe der Blase (Ausdehnung nach rostral
mindestens 1,5 cm) und einen flachen Insertionswinkel des Katheters (Anschrägen
des kaudalen Fräsrandes) minimiert werden.
Abschließend bleibt festzuhalten, dass sich über die Vorversuche an den isolierten
Pferdeköpfen hinaus ein Lernprozess einstellte, welcher sich vor allem auf die
gezieltere Auswahl einer geeigneten Katheterinsertionsstelle und auf die praktische
Durchführung von Knochenperforation und Katheterinsertion erstreckte. Die
durchschnittliche Dauer des gesamten Implantationsvorgangs konnte dennoch nicht
nennenswert verkürzt werden und blieb mit 295 ± 106 Min relativ lang.
7.1.2 Auswirkungen der Katheterimplantation auf Knochen und Schleimhaut
Die MD gilt als semiinvasive Technik, bei der ein Gewebetrauma weniger durch den
Katheter selbst als durch den Vorgang der Katheterimplantation auftritt (DE LANGE
et al. 2000; PLOCK u. KLOFT 2005; BRUNNER u. LANGER 2006). In der
vorliegenden Arbeit war für die Implantation des MD-Katheters in die
Stirnhöhlenschleimhaut ein Zugang in den Sinus frontalis und damit die Perforation
Übergreifende Diskussion 101
des Os frontale notwendig. Dieser Zugang erforderte einen erhöhten chirurgischen
Aufwand im Vergleich zu der Anwendung der MD in leichter zugänglichen
Weichgeweben (z. B. Haut, Muskulatur). Verglichen mit der Eröffnung der NNH im
Rahmen diagnostischer und therapeutischer Maßnahmen (z. B. Trepanation,
frontonasaler Flap) stellte das hier angebrachte Fräsloch jedoch einen
minimalinvasiven Eingriff dar. Eine histologische Untersuchung der knöchernen
Fräskanten (Tag 5 nach Katheterimplantation) ergab keine Hinweise auf eine
Schädigung des angrenzenden Knochens.
Die Katheterimplantation in die NHH-Schleimhaut erforderte aus methodischen
Gründen das Erstellen einer flüssigkeitsgefüllten Blase. Die Bildung dieser Blase
führte zu einem Auseinanderweichen der subepithelialen Schleimhautschichten und
damit zum Zerreißen feinster Blutgefäße in der reich vaskularisierten Mukosa
(TREMAINE et al. 1999) und schließlich zum Austritt von Blut in das Blaseninnere.
Trotz der Vermischung des Blutes mit dem extern zugeführten PBS, kam es zu einer
augenscheinlich schnellen Koagulation innerhalb der Blase.
Die histologische Untersuchung des Implantationsbereiches bestätigte die Lage der
Blase innerhalb der subepithelialen Schichten und deren Einbettung in ein
kapillarreiches Gewebe mit intakter Blutversorgung. Weiterhin war die Blase bei den
endoskopischen Nachkontrollen (2 - 4 Tage nach Katheterimplantation) bzw. bei der
histologischen Untersuchung (Tag 5 nach Katheterimplantation) sowohl makro- als
auch mikroskopisch von einer intakten Lamina epithelialis bedeckt, so dass eine
bakterielle Infektion des Implantationsbereiches unwahrscheinlich erscheint. Die
Infiltration des Blaseninhalts und der Blasenumgebung mit neutrophilen
Granulozyten und (vereinzelten) Makrophagen deutet auf eine fokale, resorptive
Entzündung hin. Grundsätzlich ist eine vollständige Heilung der NNH-Schleimhaut
möglich, allerdings ist sie maßgeblich vom Grad der Schädigung abhängig (NEGUS
1958). Lediglich eine massive Schädigung würde zur Ausbildung eines fibrösen
Narbengewebes ohne Zilien und damit zu einem Verlust der Fähigkeit zur
mukoziliären Clearence führen (TREMAINE u. DIXON 2001b). Eine solche
Schädigung ist hier aufgrund der intakten Lamina epithelialis nicht zu erwarten, und
102 Übergreifende Diskussion
selbst wenn ein Verlust der Zilien im Bereich der Blase auftreten würde, so hätte dies
aufgrund des vergleichsweise kleinen Bereich und der dorsalen Lage der Blase mit
hoher Wahrscheinlichkeit keinen bedeutenden Einfluss auf die Gesamtheit der
mukoziliären Clearence des Sinus frontalis bzw. des NNH-Systems. Eine
abschließende Aussage zum langfristigen Heilungsverlauf der Schleimhaut ist in der
vorliegenden Arbeit aufgrund der kurzen Beobachtungdauer nicht möglich.
7.1.3 Eignung des verwendeten Mikrodialysesystems für die Anwendung in der Nasennebenhöhle des Pferdes
Das verwendete MD-System, bestehend aus MD-Katheter, Mikroperfusionspumpe,
Perfusorspritzen und Probensammelgefäßen, war aufgrund seiner Dimensionen sehr
gut für die Anwendung am lebenden, unsedierten Pferd geeignet. Die MD-Membran
war mit einer Länge von 10 mm gut in der angebrachten Blase zu platzieren. Die
Befestigung des Katheterschafts auf der angrenzenden Haut sicherte die Lage der
Membran in der Blase. Die Flexibilität und Abmessung der zu- und abführenden
Schläuche erlaubten die Positionierung des Probensammelgefäßes am Schopf und
die Sicherung der Mikroperfusionspumpe im Genick des Pferdes. Damit konnten
diese Komponenten sicher am Pferd befestigt werden ohne dessen
Bewegungsfreiheit einzuschränken und waren gleichzeitig gut für den Wechsel der
Probengefäße und der Perfusionsspritzen zugänglich.
Die Membran des verwendeten Kathetermodells war überaus empfindlich. Bereits
unter In-vitro-Bedingungen wurden zwei der Katheter trotz vorsichtiger Handhabung
beschädigt. Das Einführen des Katheters entlang der Fräskanten stellte
dementsprechend eine besondere Herausforderung für die empfindliche
Kathetermembran dar und führte schließlich zur Beschädigung zwei weiterer
Katheter. Zur Minimierung des bestehenden Risikos unter In-vivo-Bedingungen
wurden sämtliche Parameter (Passieren des Fräsloches ohne Widerstand,
Einführtiefe, etc.) vor der Insertion des einzusetzenden Katheters mittels eines
Testkatheters überprüft. Weiterhin erwies sich die Befestigung des Katheterschaftes
auf der angrenzenden Haut mittels Gewebekleber als sehr hilfreich, um den Katheter
in seiner finalen Position zu fixieren. Die Möglichkeit zur Fixierung in diesem wenig
Übergreifende Diskussion 103
bemuskelten und daher wenig motilen Bereich ist vermutlich der Grund dafür, dass
im Rahmen dieser Arbeit keine Katheter im Verlauf des eigentlichen Versuches
beschädigt wurden. EDNER et al. (2009) hingegen berichteten von Ausfällen eines
Großteils der Katheter während der 24-stündigen Anwendung desselben
Kathetertyps in der Muskulatur von Pferden und vermuteten die Muskelaktivität der
sich frei bewegenden Pferde sowie das Scheuern der Tiere an Stallwänden als
mögliche Gründe.
7.2 Mikrodialyse
7.2.1 Kalibration des Mikrodialysesystems
Die Kalibration des MD-Systems stellt für In-vivo-MD-Experimente die Grundlage für
die quantitative Bestimmung von Wirkstoffkonzentrationen in der interstitiellen
Flüssigkeit dar. In der vorliegenden Arbeit wurde jeder einzelne MD-Katheter sowohl
unter In-vitro- als auch unter In-vivo-Bedingungen kalibriert. Die In-vitro-Kalibration
diente dabei vor allem der Funktionsüberprüfung der Katheter vor dem eigentlichen
In-vivo-Einsatz sowie der orientierenden Bestimmung der Wiederfindungsparameter
unter In-vitro-Bedingungen. Im Allgemeinen ist die Diffusionsrate in vivo geringer als
unter In-vitro-Bedingungen. Als Gründe dafür werden eine erhöhte Tortuosität
(Diffusionsweg im Gewebe) sowie ein geringer Volumenanteil der ISF des Gewebes
im Vergleich zu einer wässrigen Lösung angesehen (KOVAR et al. 1997).
Demzufolge wurden in der vorliegenden Arbeit ausschließlich die unter In-vivo-
Bedingungen ermittelten Wiederfindungsparameter von SDM für die quantitative
Bestimmung der Sulfonamidkonzentration in der NNH-Schleimhaut der
Versuchspferde herangezogen.
In dieser Arbeit wurde die gesuchte Substanz SDM selbst zur Kalibration des
Systems herangezogen. Unter In-vitro-Bedingungen zeigten sich im unteren
Kalibrationsbereich (Medium: 0,1 und 0,5 µg SDM/ml PBS) große Schwankungen in
der Höhe der Wiederfindung. Wie sich im Laufe der Untersuchungen herausstellte,
befand sich die niedrigste Konzentrationsstufe (0,1 µg/ml) bereits unterhalb der
Quantifizierungsgrenze von SDM (0,15 µg/ml), sodass diese Ergebnisse nicht
104 Übergreifende Diskussion
ausgewertet werden konnten. Im Konzentrationsbereich von 1 µg SDM/ml PBS
waren die Schwankungen sowohl für die Bestimmung von RRSDM als auch von
RLSDM, Ref. wesentlich geringer. Eine Anpassung der Konzentrationsstufen für die In-
vitro-Kalibration ist in dieser Arbeit nicht vorgenommen worden, um den bestehenden
Untersuchungsgang nicht in einem fortgeschrittenen Versuchsstadium zu verändern.
Für mögliche Folgearbeiten ist eine derartige Anpassung jedoch anzuraten.
Die unter In-vivo-Bedingungen ermittelten Werte für RLSDM, Ref. waren zwischen den
einzelnen Experimenten relativ konstant. Der Vergleich der SDM-Verlustraten unter
In-vivo- (RLSDM, Ref. 45,9 %) und In-vitro-Bedingungen (RLSDM, Ref. 68,3 %) ergibt einen
geringeren Verlust unter In-vivo-Bedingungen und steht damit im Einklang mit den
Aussagen von KOVAR et al. (1997). Die Tatsache, dass in den entnommenen
Leerproben (in vitro und in vivo) keinerlei Sulfonamidkonzentrationen nachgewiesen
werden konnten, bestätigt zum einen, dass die Spülung mit Aqua bidestillata bei
einer Flussrate von 15 µl/Min über 30 Minuten ausreichend ist, um
Sulfonamidrückstände aus dem MD-Katheter zu entfernen und zum anderen, dass
keine Verfälschungen der Sulfonamidkonzentrationen in den nachfolgend
entnommenen Proben (in vitro und in vivo) durch die vorhergehenden In-vitro-
Versuche zu erwarten sind.
Grundsätzlich gilt in MD-Experimenten die gesuchte Substanz selbst als die ideale
Kalibrationssubstanz (BOUW u. HAMMARLUND-UDENAES 1998). Jedoch erfordert
deren Zusatz zur Perfusionslösung die Durchführung der Kalibration vor dem
eigentlichen Versuchsbeginn und bietet damit nicht die Möglichkeit, Veränderungen
der Wiederfindung über die Zeit zu untersuchen. Aus diesem Grund wird die
Verwendung eines internen Standards empfohlen, welcher der Perfusionslösung
über die gesamte Versuchsdauer zugesetzt werden kann (DE LANGE et al. 2000). In
der vorliegenden Arbeit wurde SDZ als interner Standard eingesetzt, welches dem
SDM strukturell sehr ähnlich ist, sich jedoch mithilfe der HPLC eindeutig von diesem
differenzieren lässt.
Die In-vitro-Untersuchungen vom RLSDZ ergaben relativ konstante Ergebnisse
während der einzelnen SDM-Konzentrationsstufen (Medium) und der
Übergreifende Diskussion 105
Referenzphase. Auch der durchschnittliche Verlust von SDZ während der SDM-
Wiederfindungsversuche (58,0 %) war vergleichbar mit den entsprechenden Werten
aus der Referenzphase (57,5 %). Allerdings wiesen die RLSDZ-Werte bei steigenden
SDM-Konzentrationen im Medium eine sinkende Tendenz auf. Die Gründe hierfür
sind unbekannt.
Der Einsatz von SDZ unter In-vivo-Bedingungen war mit verschiedenen Problemen
assoziiert, welche aufgrund der relativ konstanten In-vitro-Ergebnisse nicht
vorhersehbar waren. Es wurden teilweise sehr geringe Verluste von SDZ aus der
Perfusionslösung (RLSDZ) bzw. sogar Zugewinne von SDZ im Dialysat beobachtet.
Die Gründe für diese Beobachtung waren nicht abschließend zu klären, jedoch ist
davon auszugehen, dass geringe Konzentrationsschwankungen in der Perfusions-
lösung diese Unregelmäßigkeiten verursacht haben. Es ist möglich, dass dieses
Problem im Rahmen der vorliegenden Arbeit durch die Verdünnung der Dialysate im
Zuge der analytischen Aufarbeitung verstärkt wurde (Kap. 7.2.2). Weiterhin traten
große Schwankungen des RLSDZ während der einzelnen In-vivo-Experimente auf.
Vergleichbare Schwankungen sind weder unter In-vitro-Bedingungen aufgetreten
noch ließen sie sich an den zugehörigen In-vivo-SDM-Konzentrationsprofilen
erkennen. Auch BOUW und HAMMARLUND-UDENAES (1998) beobachteten unter
In-vivo-Bedingungen Schwankungen, welche lediglich den internen Standard, nicht
aber die gesuchte Substanz betrafen. Bei der Untersuchung dieses Zusammenhangs
stellten sie fest, dass die von ihnen beobachteten hohen Variationskoeffizienten vor
allem mit geringen Wiederfindungsraten assoziiert waren. In der Versuchsphase der
vorliegenden Arbeit wurde die von BOUW und HAMMARLUND-UDENAES (1998) für
den Einsatz eines internen Standards zu Kalibrationszwecken empfohlene
Wiederfindungsrate von mindestens 20 % lediglich bei drei Pferden erreicht
(Tab. 6.2). Des Weiteren wurde ausgehend von der Referenzphase eine Abnahme
von RLSDZ über die gesamte Versuchsdauer von 48 h beobachtet. Ein möglicher
Grund hierfür wäre eine fortschreitende Ablagerung von Zellen und damit der
Verschluss der Poren der semipermeablen Membran (DE LANGE et al. 2000).
Weiterhin ist ein Zusammenhang mit der für die Katheterinsertion notwendigen
Blasenbildung denkbar: möglicherweise führen über die beobachtete Koagulation
106 Übergreifende Diskussion
hinausgehende Mikroblutungen in den subepithelialen Schichten der paranasalen
Mukosa zu erhöhten Wiederfindungsraten zu Beginn des Versuchs (Kap. 7.3.5).
Abschließend bleibt festzuhalten, dass SDZ für das vorgestellte Studiendesign nicht
als interner Standard geeignet war, dementsprechend wurde von der Verwendung
der in vivo ermittelten Ergebnisse zur weiteren Berechnung von
Gewebekonzentrationen abgesehen. Diese erfolgte, wie bereits beschrieben,
ausschließlich mittels der unter In-vivo-Bedingungen ermittelten Werte des RL von
SDM in der Referenzphase (RLSDM, Ref.).
7.2.2 Schwankungen der Dialysatvolumina
Dank der Mikroperfusionspumpe wurde kontinuierlich Dialysat produziert und die
regelmäßig entnommenen Probengefäße enthielten weitgehend das erwartete
Dialysatvolumen von 180 µl. Lediglich bei einem Pferd schwankte das Volumen der
Dialysate erheblich. Ein möglicher Grund dafür könnten verminderte Flussraten sein,
welche als Folge langer Schlauchsysteme (> 1,5 m) und einer erhöhten vertikalen
Position der Mikroperfusionspumpe im Vergleich zur Kathetermembran (> 30 cm)
auftreten können (CHOU et al. 2001). Jedoch wurden die genannten Parameter
weder bei besagtem Pferd noch in den anderen In-vivo-Versuchen überschritten.
Darüber hinaus konnten diese Veränderungen auch unter vergleichbaren In-vitro-
Bedingungen nicht reproduziert werden. Insgesamt erscheint es demnach
wahrscheinlicher, dass die reduzierten Dialysatvolumina auf das vermehrte
Kopfschütteln dieses Pferdes (Kap. 7.4.2) und den damit einhergehenden Verlust
des Dialysats durch das Überflussventil des Probengefäßes zurückzuführen waren.
Die Differenz des erwarteten Dialysatvolumens (180 µl) und dem tatsächlich für die
Analytik zur Verfügung stehenden Volumen (122,7 ± 26,8 µl) ist auf den Verlust
während des Umfüllens aus dem Microvial in das HPLC-Vial zurückzuführen.
Übergreifende Diskussion 107
7.3 Sulfadimidinkonzentration
7.3.1 Nachweis von Sulfadimidin im Mikrodialysat und Berechnung der Sulfadimidinkonzentrationen in der Nasennebenhöhlenschleimhaut
Die Methode der In-vivo-MD ermöglichte den Nachweis von SDM in den
Mikrodialysaten und damit die Berechnung der Wirkstoffkonzentration in der NNH-
Schleimhaut von Pferden. Anhand der erstellten Konzentrations-Zeit-Profile ließ sich
nach beiden Applikationszeitpunkten (t0, t24) die An- und Abflutung des Wirkstoffes in
der NNH-Schleimhaut über den gesamten Untersuchungszeitraum von 48 h
darstellen. Die maximale Wirkstoffkonzentrationen in der NNH-Schleimhaut betrugen
durchschnittlich 9,6 µg/ml nach der ersten und 7,0 µg/ml nach der zweiten
Wirkstoffapplikation. Die erreichten Gewebespiegel lagen damit in einem
Konzentrationsbereich, der auch von anderen Autoren für verschiedenste Gewebe
und Körperflüssigkeiten nach der Applikation ähnlicher Sulfonamidkonzentrationen
beim Pferd angegeben wurden (BROWN et al. 1983; BERTONE et al. 1988;
BROWN et al. 1988; WINTHER et al. 2011). Dennoch lagen die im Rahmen dieser
Arbeit bestimmen Werte unter jenen, die von VAN DUIJKEREN et al. (2002) und
ENSINK et al. (2005) für die Verteilung von SDZ in die Flüssigkeit chirurgisch
erstellter Gewebekammern (TCF, tissue chamber fluid) bei Ponys angegeben
wurden: dort wurden nach der Gabe von TMS (30 mg/kg, oral, zweimal täglich über
zwei Tage) maximale SDZ-Wirkstoffspiegel von 23,5 µg/ml in der TCF gemessen
(VAN DUIJKEREN et al. 2002) bzw. jeweils drei Stunden nach der Gabe von TMS
(30 mg/kg, Tag 0: einmal täglich intravenös und oral bzw. Tag 1 - 5: zweimal täglich
oral) SDZ-Wirkstoffspiegel von ca. 20 µg/ml (ENSINK et al. 2005). Weiterhin wurden
sowohl im Rahmen der vorliegenden Arbeit als auch in den Studien von VAN
DUIJKEREN et al. (2002) und ENSINK et al. (2005) erhebliche Schwankungen in
den Gewebekonzentrationen zwischen den einzelnen Probanden beobachtet. Diese
Schwankungen sind wahrscheinlich auf die häufig zu beobachtende hohe
interindividuelle Variabilität der Gewebeverteilung von Antiinfektiva zurückzuführen
(MÜLLER et al. 2004).
108 Übergreifende Diskussion
7.3.2 Beziehung zwischen den Wirkstoffkonzentrationen im Plasma und in der Nasennebenhöhlenschleimhaut
Die Höhe der im Rahmen dieser Studie erreichten Wirkstoffkonzentrationen und die
errechneten PK-Parameter für SDM im Plasma stehen im Einklang mit
vorhergehenden Berichten für Sulfonamidkonzentrationen bei Pferden (VAN
DUIJKEREN et al. 1994a; VAN DUIJKEREN et al. 1995; WINTHER et al. 2011). Die
maximalen Plasmakonzentrationen wurden 0,5 h nach der systemischen
Verabreichung des SDM und damit in der ersten entnommenen Blutprobe bestimmt.
Das Maximum der SDM-Konzentration in der NNH-Schleimhaut trat mit einer
zeitlichen Verzögerung von ca. sechs Stunden auf. Die durchschnittlichen maximalen
Gewebekonzentrationen betrugen lediglich 17,4 % und 13,6 % (t0-24 bzw. t24-48) der
entsprechenden Plasmakonzentrationen und unterstreichen die Beobachtung, dass
die Ableitung von Gewebe- aus Plasmakonzentration zu einer Überschätzung der
Gewebekonzentration führt (MÜLLER et al. 2004).
7.3.3 Pharmakokinetische Simulation
Die theoretisch mögliche Wirkstoffkonzentration in einem Gewebe nach der
intravenösen Applikation des zu untersuchenden Wirkstoffes SDM wurde anhand
eines PK-Modells simuliert.
Dazu wird der Körper gemäß eines Zwei-Kompartiment-Modells mit intravenöser
Wirkstoffapplikation in ein zentrales Kompartiment (Blut) und ein peripheres
Kompartiment (Gewebe) aufgeteilt (Abb. 7.1). Der Wirkstoffaustausch zwischen dem
Blut- und dem Gewebekompartiment wird mithilfe der Geschwindigkeitskonstanten
erster Ordnung, den sog. Mikrokonstanten, beschrieben. Dabei beschreibt k12 den
Transport vom Blut in das Gewebe und k21 die Rückverteilung vom Gewebe ins Blut.
Die Elimination des Wirkstoffes aus dem Blut wird mit ke beschrieben.
Übergreifende Diskussion 109
Abb. 7.1: Zwei-Kompartiment-Modell mit intravenöser (i. v.) Wirkstoffapplikation (nach DERENDORF et al. 2010).
Die Berechnung der Wirkstoffkonzentrationen in Blut und Gewebe sowie des
eliminierten Wirkstoffanteils erfolgte entsprechend den folgenden Formeln
(modifiziert nach CHAMBERLAIN 2003):
Die Berechnung der Wirkstoffkonzentrationen zum jeweils aktuellen Simulationszeit-
punkt erfolgte unter Einbeziehung der entsprechenden Konzentrationen des
vorherigen Simulationszeitpunktes (Cx, -1). Die Mikrokonstanten k12, k21 und ke
wurden analog zu DERENDORF et al. (2010) anhand der im Rahmen des
Hauptversuchs erhaltenen PK-Daten errechnet (Kap. 6). Als Anfangskonzentration
des Blutplasmas wurde der Mittelwert der ebenfalls im Rahmen der PK-
Berechnungen ermittelten fiktiven Anfangskonzentration (C0) eingesetzt (Tab. 7.1).
Tab. 7.1: Parameter und Werte, welche für die pharmakokinetische Simulation genutzt wurden.
Parameter Wert
k12 0,8
k21 0,71
ke 0,24
Co (µg/ml) 77,42
Blut
1
Gewebe
2Elimination
k12
k21
ke
i. v.
110 Übergreifende Diskussion
Abb. 7.2: Zeitlicher Verlauf der SDM-Konzentration in Blut, Gewebe sowie der eliminierten SDM-Konzentration über ein Dosierungsintervall (24 h).
Die simulierten Blutkonzentrationen sind sowohl in der Konzentrationshöhe als auch
in ihrem Verlauf nahezu deckungsgleich zu den unter In-vivo-Bedingungen
gemessenen Plasmakonzentrationen (Abb. 6.1 und 7.2). Die simulierte SDM-
Wirkstoffanflutung im Gewebe erreicht bereits nach 1,5 h die Maximalkonzentration
und findet damit schneller statt als unter In-vivo-Bedingungen (tmax ~ 6 h). Die
simulierte maximale SDM-Gewebekonzentration liegt mit 17,9 µg/ml höher als die
durchschnittliche SDM-Konzentration, die in der vorliegenden Arbeit in der NNH-
Schleimhaut mittels der MD bestimmt wurde. Dieser Umstand kann einerseits darauf
hindeuten, dass in der NNH-Schleimhaut eine Beeinträchtigung der Zielgewebs-
konzentration (Kap. 2.3.3) vorliegt und somit niedrigere Gewebekonzentrationen
erzielt werden als es für ein peripheres Gewebe zu erwarten wäre.
Dementsprechend ist es wichtig die Bestimmung von Antiinfektiva-Konzentrationen
direkt im Zielgewebe vorzunehmen (MÜLLER et al. 2004; BRUNNER et al. 2005). Es
gilt jedoch zu beachten, dass letztlich nicht auszuschließen ist, dass die reduzierte
Wirkstoffkonzentration in der Schleimhaut auf technische Gegebenheiten des
Versuchsdesigns (Bestimmung der Wiederfindung, Lage des MD-Katheters in der
Blase) zurückzuführen ist (Kap. 7.3.5).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 6 12 18 24
Su
lfa
dim
idin
(µ
g/m
l)
Zeit (h)
Blut
Gewebe
Elimination
Übergreifende Diskussion 111
7.3.4 Gewebekonzentration im Verhältnis zu MHK-Werten
Die ermittelten Wirkstoffkonzentrationen in der NNH-Schleimhaut wurden in
Beziehung zu MHK-Werten für potenzierte Sulfonamide gesetzt. Aufgrund des
Studiendesigns standen lediglich SDM-Konzentrationen zur Verfügung und die
folgenden Aussagen basieren auf der Annahme, dass gleichzeitig wirksame TMP-
Konzentrationen vorlagen.
Beim Vergleich der durchschnittlichen SDM-Konzentrationen in der NNH-
Schleimhaut mit einem MHK-Wert von ≤ 0,25/4,75 µg/ml (BERTONE et al. 1988;
WINTHER et al. 2011) überschreiten diese den genannten MHK-Wert für ca. 12 h. In
Anbetracht der großen Streuung zwischen den einzelnen Tieren ist jedoch zu
bedenken, dass dieser Wert bei einem Pferd überhaupt nicht sowie bei zwei Pferden
nur während eines Applikationsintervalls erreicht wurde. Bei Ansetzen eines höheren
MHK-Werts von ≤ 0,5/9,5 µg/ml (ADAMSON et al. 1985; HIRSH u. JANG 1987; CLSI
2008) wäre die notwendige Gewebekonzentration lediglich bei fünf Pferden erreicht
worden, davon bei drei Pferden nur während eines Applikationsintervalls. Noch
höhere Grenzwerte anderer Autoren (1/20 µg/ml, ENSINK et al. 1993; 0,5/32 µg/ml,
FEY u. SCHMID 1995) wurden in der vorliegenden Studie nicht erreicht. Basierend
auf den genannten Ergebnissen ist davon auszugehen, dass die intravenöse
Therapie mit 25 mg/kg SDM in Kombination mit 5 mg/kg TMP lediglich geeignet ist,
equine Sinusitiden mit hoch empfänglichen bakteriellen Erregern zu therapieren. Um
wirksame Konzentrationen aufrechtzuerhalten, sollte eine Anpassung des
Dosierungsintervalls auf 12 h erfolgen. Diese Ergebnisse stehen in Hinblick auf die
Erregerempfindlichkeit und das Dosierungsintervall im Einklang mit Ergebnissen für
den unteren Respirationstrakt des Pferdes (WINTHER et al. 2011).
7.3.5 Mögliche Einflussfaktoren auf die Gewebekonzentration
Um die Implantation des MD-Katheters in die NNH-Schleimhaut zu ermöglichen,
wurde eine flüssigkeitsgefüllte Blase in den subepithelialen Schichten geschaffen.
Somit befand sich der Katheter nicht wie normalerweise bei der In-vivo-MD üblich in
der ISF eines Gewebes oder einer anderen Körperflüssigkeit (DE LANGE et al.
112 Übergreifende Diskussion
2000) und es besteht die Möglichkeit, dass sich die Wirkstoffkonzentration in der
Blase von jener in der unbehandelten ISF unterscheidet.
Die Bildung der Blase führte zu Einblutungen in das Blaseninnere, diese kamen zwar
augenscheinlich schnell durch Koagulation zum Erliegen, jedoch können länger
anhaltende Mikroblutungen oder Veränderungen der kapillaren Permeabilität nicht
sicher ausgeschlossen werden. Derartige Veränderungen könnten zu einer
abweichenden Wirkstoffverteilung im Gewebe oder zu veränderten
Wiederfindungsraten der untersuchten Substanzen führen. Die Tatsache, dass der
Verlust des internen Standards SDZ (RLSDZ) zu Beginn der Versuche höhere
Verlustraten als am Ende der Versuchsperiode anzeigt, könnte ein Hinweis auf
anhaltende Mikroblutungen zu Beginn der Versuche sein (Kap. 7.2.1). Dieser
Umstand beträfe auch die Wiederfindung des SDM und die auf Basis des RLSDM, Ref.
errechneten Gewebekonzentrationen mit der Folge, dass diese höher wären, als die
in Kap. 6.4 angegebenen Werte. Um diese Fehlerquelle für potentielle Folge-
untersuchungen auszuschließen, sollte die Zeitspanne zwischen der Blasenbildung
bzw. Katheterimplantation und der Durchführung der eigentlichen MD-Versuche
verlängert werden. Laut DE LANGE et al. (2000) liegt der optimale Zeitpunkt für den
Beginn der Untersuchungen zwischen dem Abklingen früher und dem Auftreten
später Gewebereaktionen auf die Katheterimplantation, d. h. ein bis zwei Tage nach
der Implantation.
Weiterhin ist es möglich, dass die Blasenbildung durch die Veränderung des
Verhältnisses der kapillaren Oberfläche zum Gewebevolumen den Grad der
Wirkstoffpenetration in den betroffenen Bereich beeinflusst (RYAN 1985). Ferner
könnte die Ansammlung von PBS und koagulierendem Blut in der Blase eine
Verdünnung der Wirkstoffkonzentration zur Folge haben. Der Grad der Verdünnung
zwischen den einzelnen Pferden kann variieren, da die Größe der Blase weder
beeinflusst noch gemessen werden konnte. Jedoch gab es makroskopisch keine
Hinweise darauf, dass sich die Größe der Blase bei den einzelnen Individuen
während des MD-Versuchs veränderte (Kap. 5.4.1). Zu guter Letzt könnte auch ein
Übergreifende Diskussion 113
entzündungsbedingt erniedrigter pH-Wert im Blaseninneren dazu führen, dass SDM
als schwache Säure diesen Bereich weniger stark penetriert als die normale ISF.
Abschließend ist es wichtig anzumerken, dass im Sinne des primären Ziels der
Methodenetablierung in dieser Arbeit ausschließlich gesunde Pferde untersucht
wurden. Die erhaltenen Gewebekonzentrationen entsprechen daher nicht
notwendigerweise jenen Konzentrationen, welche an sinusitiserkrankten Pferden zu
erheben wären. Die Frage, ob sich die Wirkstoffverteilung und die resultierende
Gewebekonzentration im gesunden und erkrankten Gewebe unterscheidet, gilt als
umstritten (MÜLLER et al. 1996; JOUKHADAR et al. 2001; STEINER et al. 2004).
Die Untersuchung von Antibiotikakonzentrationen in der Schleimhaut bei der
Sinusitis des Menschen ergab Hinweise darauf, dass in der entzündeten
Schleimhaut geringere Wirkstoffkonzentrationen erreicht werden als in der gesunden
Schleimhaut (EKEDAHL et al. 1978).
7.4 Auswirkungen der Mikrodialyse-Studie auf die Pferde
7.4.1 Postoperative Auswirkungen der Katheterimplantation
Komplikationen im Zusammenhang mit dem chirurgischen Eingriff der
Katheterimplantation umfassten das temporäre und selbstlimitierende Auftreten von
Nasenausfluss, subkutanen Emphysemen (ausgehend vom Sinuskopieportal) und
geringgradige Reaktionen der mandibularen Lymphknoten. Komplikationen dieser Art
sind bei vergleichbaren Eingriffen nicht ungewöhnlich (RUGGLES et al. 1991;
BERTONE et al. 1993; CHAN u. MUNROE 1995). Das Auftreten von kurzfristigen
Wundheilungsstörungen bei 2/12 Pferden (= 16,7 %) war im Vergleich zu den
Angaben anderer Autoren nach chirurgischer Eröffnung der NNH gering (39 %,
GREET 1992; 29 %, HART u. SULLINS 2011). Mögliche Gründe hierfür sind die
ausschließliche Verwendung von Pferden ohne Vorerkrankungen der NNH sowie die
Gabe von potenzierten Sulfonamiden in therapeutischer Dosierung. Darüber hinaus
standen nicht alle Pferde über einen ausreichend langen Beobachtungszeitraum,
d. h. bis zum kompletten Abheilen der Portale, zur Verfügung. Bei jenen Pferden, die
114 Übergreifende Diskussion
für eine Langzeitbeobachtung zur Verfügung standen (n = 4), fand eine primäre
Wundheilung mit gutem Heilungserfolg statt.
Aufgrund des ungestörten Allgemeinbefindens der Probanden wurde – wie im
Tierversuchsantrag dargestellt und entsprechend genehmigt – auf die Applikation
von nicht-steroidalen Antiphlogistika verzichtet. So konnten Interaktionen zwischen
den verschiedenen Wirkstoffen und Auswirkungen auf die Pharmakokinetik, wie sie
für SDM und Flunixin-Meglumin beschrieben worden sind (EL-BANNA 1999),
vermieden werden.
7.4.2 Durchführung In-vivo-Mikrodialyse-Studie
Die Durchführung der In-vivo-MD-Studie beinhaltete die Befestigung des gesamten
MD-Systems im Bereich des Pferdekopfes. Einige Pferde reagierten darauf mit
gelegentlichem Kopfschütteln, lediglich ein Pferd reagierte mit vermehrtem
Kopfschütteln. Auslöser für das Kopfschütteln war wahrscheinlich die Befestigung
der Tasche mit dem MD-Zubehör (Pumpe in Metallbox) im Genick des Pferdes und
damit in unmittelbarer Nähe zu den Ohren.
Sowohl der Wechsel der Probengefäße als auch jener der Perfusorspritzen wurde
von den Pferden allgemein gut toleriert. Lediglich ein kleiner Teil der Pferde
widersetzte sich am Anfang der Versuchsperiode diesen Wechseln, so dass sie
zunächst nur unter Mithilfe einer zweiten Person durchgeführt werden konnten; nur
bei einem Pferd war es über die gesamte Versuchsperiode nicht möglich die
Wechsel alleine vorzunehmen. Grundsätzlich empfiehlt sich jedoch die Auswahl von
Pferden, die den Umgang mit Menschen gewöhnt sind und keinerlei Anzeichen von
Kopfscheue zeigen.
Übergreifende Diskussion 115
7.5 Schlussfolgerungen Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass die Methode der Mikrodialyse
grundsätzlich geeignet ist, um Wirkstoffkonzentrationen eines systemisch
applizierten Antiinfektivums in der NNH-Schleimhaut von Pferden zu bestimmen.
Das Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war es, einen MD-Katheter direkt in der NNH-
Schleimhaut von Pferden zu platzieren. Letztlich konnte der Katheter zwar in den
subepithelialen Schichten der Mukosa platziert werden, jedoch nur unter
Zuhilfenahme der Bildung einer flüssigkeitsgefüllten Blase. Insgesamt war der
Eingriff der Katheterimplantation ein vergleichsweise aufwendiger Eingriff, der vor
allem durch die Fragilität der Schleimhaut erschwert wurde.
Die In-vivo-Anwendung der MD erlaubte den Nachweis von SDM im Dialysat und
bildete damit die Grundlage für die Erstellung kontinuierlicher Konzentrations-Zeit-
Profile von SDM in der NNH-Schleimhaut. Die Tatsache, dass die MD-Katheter sich
nicht unmittelbar in der ISF der Schleimhaut, sondern in der Blase befanden, kann
Abweichungen der hier ermittelten von den tatsächlichen Konzentrationen in der ISF
bedingen. Darüber hinaus gilt es bei der Auswertung der Gewebekonzentrationen zu
berücksichtigen, dass sie an klinisch gesunden Pferden ermittelt wurden und nicht
notwendigerweise mit den Gewebekonzentrationen sinusitiserkrankter Pferde
übereinstimmen. Die Verwendung des internen Standards SDZ war unter In-vivo-
Bedingungen mit methodischen Problemen behaftet, jedoch erlaubte seine
Anwendung die Vermutung, dass eine Veränderung der Wiederfindung über die Zeit
aufgetreten ist. Zur Abklärung der jeweiligen Gründe sind weitere Untersuchungen
erforderlich.
Ein Vergleich der Sulfonamidkonzentrationen in der NNH-Schleimhaut und dem
Blutplasma zeigte erwartungsgemäß deutliche Unterschiede in der Höhe der
erreichten Wirkstoffkonzentrationen. Dieses Ergebnis unterstreicht die Notwendigkeit
der Konzentrationsbestimmung von antimikrobiellen Wirkstoffen direkt am Ort der
Infektion und somit in der ISF des jeweils zu untersuchenden Gewebes. Unter der
Annahme, dass die gemessenen Sulfadimidinkonzentrationen in der Schleimhaut
116 Übergreifende Diskussion
zutreffend sind, erscheint es zweifelhaft, dass die bisher verwendeten Dosierungen
von potenzierten Sulfonamiden geeignet sind, um einen ausreichenden antiinfektiven
Effekt in der Nasennebenhöhlenschleimhaut zu erzielen.
Zusammenfassung 117
8 Zusammenfassung
Caroline Gietz (2012)
Etablierung der Mikrodialyse zur Bestimmung von Sulfonamidkonzentrationen
in der Nasennebenhöhlenschleimhaut des Pferdes
In der Therapie equiner Sinusitiden werden vielfach antimikrobielle Wirkstoffe
eingesetzt, obwohl nicht hinreichend bekannt ist, ob diese das Zielgewebe in
ausreichenden Konzentrationen erreichen oder ob ggf. subinhibitorische
Wirkstoffkonzentrationen der Grund für das häufig berichtete Therapieversagen bei
dieser Erkrankung sind. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die
Konzentrationsbestimmung des systemisch applizierten Antiinfektivums Sulfadimidin
in der Nasennebenhöhlenschleimhaut von Pferden mittels der In-vivo-Mikrodialyse.
Im ersten Teil der Arbeit wurde eine Methode zur Implantation eines Mikrodialyse-
katheters in die Nasennebenhöhlenschleimhaut von Pferden entwickelt. Die Technik
wurde zunächst an isolierten Pferdeköpfen (n = 20) erarbeitet und nachfolgend unter
In-vivo-Bedingungen an zwölf allgemeingesunden Pferden angewendet. Der Eingriff
der Katheterimplantation erfolgte an stehenden, sedierten Pferden. Der Katheter
wurde unter endoskopischer Kontrolle (Portal: Sinus maxillaris caudalis) in der
Schleimhautauskleidung des Sinus frontalis platziert. Die Insertion erfolgte nach
schleimhautschonender Perforation des Stirnbeins (elektrische Fräse) und Bildung
einer flüssigkeitsgefüllten Blase (Phosphat-gepufferte Salzlösung, Durchmesser der
Blase: 20 - 30 mm) in den subepithelialen Schichten der Mukosa. Nach Insertion der
Kathetermembran (Länge: 10 mm, Außendurchmesser: 0,6 mm) in diese Blase
wurde das komplette Mikrodialysesystem, bestehend aus Mikrodialysekatheter und
-pumpe, Perfusorspritze und Probensammelgefäß am Pferd fixiert und bis zu 52 h
dort belassen. Der Eingriff der Katheterimplantation dauerte durchschnittlich 295 Min.
Komplikationen während der Implantation umfassten die Perforation der Mukosa
während der Knochenperforation oder der Katheterinsertion sowie das Einreißen der
118 Zusammenfassung
Mukosa bei der Erstellung der Blase. Postoperative Komplikationen traten nur
vereinzelt und in geringgradiger Ausprägung auf.
Das Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war die kontinuierliche Konzentrations-
bestimmung eines systemisch applizierten Antiinfektivums (Sulfadimidin) in der
Nasennebenhöhlenschleimhaut von Pferden mittels der In-vivo-Mikrodialyse. Zu
diesem Zweck erhielten 10/12 Pferde aus dem ersten Versuchsteil nach der
erfolgreichen Katheterimplantation und dem Einhalten einer vierstündigen
Kalibrationsphase zweimalig ein Trimethoprim-Sulfadimidin-Kombinationspräparat
(30 mg/kg KGW, intravenös). Die Wirkstoffapplikation erfolgte zum Zeitpunkt 0 (t0)
und nach 24 h (t24), die kontinuierlichen Probenentnahmen (Dialysat und Blut)
erfolgten über 48 h. Die Quantifizierung der Sulfadimidinkonzentrationen in Dialysat
und Blutplasma erfolgte mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Die
maximalen Sulfadimidinkonzentrationen im Blutplasma betrugen 55,3 ± 10,3 nach
der ersten und 51,5 ± 8,7 µg/ml nach der zweiten Wirkstoffapplikation. Die
maximalen Sulfadimidinkonzentrationen in der Schleimhaut betrugen 9,6 ± 4,5 und
7,0 ± 3,3 µg/ml im ersten bzw. zweiten Dosierungsintervall; sie wurden 5,9 ± 2,7 bzw.
5,4 ± 2,3 h nach der jeweiligen Wirkstoffgabe erreicht.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Mikrodialyse eine geeignete Methode
für die kontinuierliche Konzentrationsbestimmung eines systemisch applizierten
Antiinfektivums in der Nasennebenhöhlenschleimhaut von Pferden darstellt. Unter
der Annahme, dass die gemessenen Sulfadimidinkonzentrationen in der Schleimhaut
zutreffend sind, erscheint es zweifelhaft, dass die bisher verwendeten Dosierungen
von potenzierten Sulfonamiden geeignet sind, um einen ausreichenden antiinfektiven
Effekt in der Nasennebenhöhlenschleimhaut zu erzielen. Dementsprechend können
die erhaltenen pharmakokinetischen Daten dazu herangezogen werden, bekannte
Sulfadimidin-Dosierungsschemata zu überarbeiten und so eine verbesserte
Sinusitistherapie zu ermöglichen. Weiterhin steht die vorgestellte Methode der
Mikrodialyse auch zur Ermittlung pharmakokinetischer Daten anderer Wirkstoffe im
Bereich der Nasennebenhöhle des Pferdes zur Verfügung.
Summary 119
9 Summary
Caroline Gietz (2012)
Establishment of microdialysis for investigation of sulfonamide concentrations
within the paranasal mucous membrane of horses
Equine sinusitis is often treated with anti-infective agents. However, there is only
insufficient knowledge if adequate drug concentrations are reached at the target sites
or if subinhibitory drug concentrations may be causative for the frequently
encountered treatment failure in this disease. The objective of the present work was
to determine concentrations of the systemically administered anti-infective agent
sulfadimidine within the paranasal mucosal lining of horses by means of in vivo
microdialysis.
Firstly, a method for implantation of a microdialysis probe into the paranasal mucous
membrane of horses was developed in isolated equine heads (n = 20). This method
was subsequently applied under in vivo conditions in 12 healthy horses. Implantation
of the microdialysis probe into the paranasal mucosal lining of the frontal sinus was
done in standing, sedated horses under endoscopic guidance (caudal maxillary sinus
portal). Therefore, the frontal bone was perforated (corded drill) without lacerating the
underlying mucosal lining and a fluid-filled blister (phosphate-buffered saline,
diameter: 20 - 30 mm) was created within the subepithelial layers of the mucosa. The
probe membrane (length: 10 mm, outer diameter: 0,6 mm) was inserted into the fluid-
filled blister and the complete microdialysis system (probe, microperfusion pump,
perfusion syringe, sampling vial) was affixed to the horse and left in situ up to 52 h.
Complications during probe implantation were perforation of the mucous membrane
during drilling or probe placement, or rupture of the blister while applying phosphate-
buffered saline; the mean procedure time was 295 min. Post-surgical complications
were mild and only of temporary nature.
Secondly, in vivo microdialysis was performed in 10/12 horses for 52 h (4 h
calibration, 48 h sample collection). These horses were administered a trimethoprim-
120 Summary
sulfadimidine formulation (30 mg/kg, intravenously) twice (t0, t24); samples (plasma
and dialysate) were collected for 48 h. Both plasma and dialysate samples were
analyzed for concentrations of sulfadimidine by high-performance liquid
chromatography. Average peak concentrations of sulfadimidine in the paranasal
mucosa were 9.6 ± 4.5 and 7.0 ± 3.3 µg/mL following the first and second treatment;
peak concentrations were reached 5.9 ± 2.7 and 5.4 ± 2.3 h following the respective
treatment. Average sulfadimidine peak concentrations in the plasma were
55.3 ± 10.3 µg/mL following the first and 51.5 ± 8.7 µg/mL following the second
treatment.
This study demonstrates the feasibility of in vivo microdialysis for continuous
monitoring of sulfadimidine concentrations within the paranasal mucosal lining of
horses following its systemic administration. Assuming the accuracy of the
determined concentrations of sulfadimidine within the paranasal sinus mucosa, it
seems questionable if established dosage regimens for potentiated sulfonamides
enable a sufficient antimicrobial effect. The obtained pharmacokinetic data can be
used to revise existing sulfadimidine dosage schedules and improve therapy of
equine sinusitis. Furthermore, the presented method of in vivo microdialysis may be
used for investigation of pharmacokinetic data of further drugs within the paranasal
mucosal lining of horses.
Literaturverzeichnis 121
10 Literaturverzeichnis ADAMSON, P. J., W. D. WILSON, D. C. HIRSH, J. D. BAGGOT u. L. D. MARTIN (1985): Susceptibility of equine bacterial isolates to antimicrobial agents. Am J Vet Res 46, 447-450
ARENCIBIA, A., J. M. VAZQUEZ, R. JABER, F. GIL, J. A. RAMIREZ, M. RIVERO, N. GONZALEZ u. E. R. WISNER (2000): Magnetic resonance imaging and cross sectional anatomy of the normal equine sinuses and nasal passages. Vet Radiol Ultrasound 41, 313-319
BARAKZAI, S. Z. (2004): The equine paranasal sinuses Part 1: Anatomy. UK Vet 9, 5-8
BARAKZAI, S. Z. u. H. MCALLISTER (2007): Radiography and Radiology of the Respiratory Tract. In: B. C. MCGORUM, P. DIXON, N. E. ROBINSON und J. SCHUMACHER (Hrsg.): Equine Respiratory Medicine and Surgery. Saunders/Elsevier, Edinburgh, S. 151-174
BARAKZAI, S. Z., H. TREMAINE u. P. DIXON (2006): Use of scintigraphy for diagnosis of equine paranasal sinus disorders. Vet Surg 35, 94-101
BARZA, M. (1993a): Anatomical barriers for antimicrobial agents. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 12 Suppl 1, S31-35
BARZA, M. (1993b): Pharmacokinetics of antibiotics in shallow and deep compartments. J Antimicrob Chemother 31 Suppl D, 17-27
BEARD, W. L. u. J. HARDY (2001): Diagnosis of conditions of the paranasal sinuses in the horse. Equine vet Educ 13, 265-273
BERTONE, A. L., R. L. JONES u. C. W. MCILWRAITH (1988): Serum and synovial fluid steady-state concentrations of trimethoprim and sulfadiazine in horses with experimentally induced infectious arthritis. Am J Vet Res 49, 1681-1687
122 Literaturverzeichnis
BERTONE, J. J., D. S. BILLER u. A. RUGGLES (1993): Diagnostic techniques for evaluation of the paranasal sinuses. Vet Clin North Am Equine Pract 9, 75-91
BIENERT, A. (2002): Digitalradiographische, computertomographische und mikrobiologische Untersuchungen bei Backenzahnerkrankungen des Pferdes. Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss
BÖTTNER, A., A. DE JONG, P. SCHMID, S. SCHULLER, W. TRAEDER u. S. WEISKOPF (2000): Zur Festlegung von Grenzwertkonzentrationen (breakpoints) für veterinärmedizinisch relevante Antibiotika zur Resistenzbeurteilung bei tierpathogenen Erregern. Berl Munch Tierarztl Wochenschr 113, 344-347
BOULTON, C. H. (1985): Equine nasal cavity and paranasal sinus disease: A review of 85 cases. J Equine Vet Sci 5, 268-275
BOUW, M. R. u. M. HAMMARLUND-UDENAES (1998): Methodological aspects of the use of a calibrator in in vivo microdialysis-further development of the retrodialysis method. Pharm Res 15, 1673-1679
BRANDT, K. (1993): Unerwünschte Arzneimittelwirkungen im Zusammenhang mit der intravenösen Injektion beim Pferd. Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss.
BROWN, M. P., R. GRONWALL u. L. CASTRO (1988): Pharmacokinetics and body fluid and endometrial concentrations of trimethoprim-sulfamethoxazole in mares. Am J Vet Res 49, 918-922
BROWN, M. P., R. H. KELLY, S. M. STOVER u. R. GRONWALL (1983): Trimethoprim-sulfadiazine in the horse: serum, synovial, peritoneal, and urine concentrations after single-dose intravenous administration. Am J Vet Res 44, 540-543
BRUNNER, M., H. DERENDORF u. M. MÜLLER (2005): Microdialysis for in vivo pharmacokinetic/pharmacodynamic characterization of anti-infective drugs. Curr Opin Pharmacol 5, 495-499
Literaturverzeichnis 123
BRUNNER, M. u. O. LANGER (2006): Microdialysis versus other techniques for the clinical assessment of in vivo tissue drug distribution. AAPS J 8, E263-271
BRUNNER, M., O. LANGER, G. DOBROZEMSKY, U. MÜLLER, M. ZEITLINGER, M. MITTERHAUSER, W. WADSAK, R. DUDCZAK, K. KLETTER u. M. MÜLLER (2004): [18F]Ciprofloxacin, a new positron emission tomography tracer for noninvasive assessment of the tissue distribution and pharmacokinetics of ciprofloxacin in humans. Antimicrob Agents Chemother 48, 3850-3857
BRUNNER, M., A. SCHMIEDBERGER, R. SCHMID, D. JAGER, E. PIEGLER, H. G. EICHLER u. M. MÜLLER (1998): Direct assessment of peripheral pharmacokinetics in humans: comparison between cantharides blister fluid sampling, in vivo microdialysis and saliva sampling. Br J Clin Pharmacol 46, 425-431
BRUNNER, M., H. STABETA, J. G. MOLLER, C. SCHROLNBERGER, B. EROVIC, U. HOLLENSTEIN, M. ZEITLINGER, H. G. EICHLER u. M. MÜLLER (2002): Target site concentrations of ciprofloxacin after single intravenous and oral doses. Antimicrob Agents Chemother 46, 3724-3730
BTK u. AGTAM (2010): Leitlinien für den sorgfältigen Umgang mit antibakteriell wirksamen Tierarzneimitteln. BUNDESTIERÄRZTEKAMMER (BTK). ARBEITSGRUPPE TIERARZNEIMITTEL (AGTAM) DER LÄNDERARBEITSGEMEINSCHAFT VERBRAUCHERSCHUTZ. [Internet: URL: http://www.bundestieraerztekammer.de/datei.htm?filename=ab-leitlinie-2010.pdf&themen_id=4868; Stand: 05.12.2011]
BUSHBY, S. R. (1980): Sulfonamide and trimethoprim combinations. J Am Vet Med Assoc 176, 1049-1053
CARON, J. P. (1999): Diseases of the Nasal Cavity and Paranasal Sinuses. In: P. T. COLAHAN, A. M. MERRIT, J. N. MOORE und I. G. MAYHEW (Hrsg.): Equine Medicine and Surgery. 5. Aufl., Bd. 1, Mosby, St. Louis, Mo.; London, S.
CHAMBERLAIN, J. (2003): The use of spreadsheets for pharmacokinetic simulations. ScientifcWorldJournal 3, 265-278
124 Literaturverzeichnis
CHAN, C. u. G. MUNROE (1995): Endoscopic examination of the equine paranasal sinuses. In Practice 17, 419-422
CHAURASIA, C. S. (1999): In vivo microdialysis sampling: theory and applications. Biomed Chromatogr 13, 317-332
CHAURASIA, C. S., M. MÜLLER, E. D. BASHAW, E. BENFELDT, J. BOLINDER, R. BULLOCK, P. M. BUNGAY, E. C. DELANGE, H. DERENDORF, W. F. ELMQUIST, M. HAMMARLUND-UDENAES, C. JOUKHADAR, D. L. KELLOGG, JR., C. E. LUNTE, C. H. NORDSTROM, H. ROLLEMA, R. J. SAWCHUK, B. W. CHEUNG, V. P. SHAH, L. STAHLE, U. UNGERSTEDT, D. F. WELTY u. H. YEO (2007): AAPS-FDA Workshop White Paper: microdialysis principles, application, and regulatory perspectives. J Clin Pharmacol 47, 589-603
CHOU, C. C., A. I. WEBB, M. P. BROWN, R. R. GRONWALL u. T. W. VICKROY (2001): Continuous measurement of caffeine and two metabolites in blood and skeletal muscle of unrestrained adult horses by semi-automated in vivo microdialysis. J Vet Pharmacol Ther 24, 405-414
CLEMENT, R., J. M. MALINOVSKY, G. DOLLO, P. LE CORRE, F. CHEVANNE u. R. LE VERGE (1998): In vitro and in vivo microdialysis calibration using retrodialysis for the study of the cerebrospinal distribution of bupivacaine. J Pharm Biomed Anal 17, 665-670
CLSI (2008): Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals; Approved standard - third edition. CLSI document M31-A3. CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE (CLSI), Wayne, PA.
COOK, W. R. u. M. C. LITTLEWORT (1974): Progressive haematoma of the ethmoid region in the horse. Equine Vet J 6, 101-108
CP-PHARMA (2010): Fachinformation Bigram®. CP-PHARMA HANDELSGESELLSCHAFT MBH, Burgdorf, Deutschland
Literaturverzeichnis 125
DAY, R. M., M. HARBORD, A. FORBES u. A. W. SEGAL (2001): Cantharidin blisters: a technique for investigating leukocyte trafficking and cytokine production at sites of inflammation in humans. J Immunol Methods 257, 213-220
DE LA PENA, A., T. DALLA COSTA, J. D. TALTON, E. REHAK, J. GROSS, U. THYROFF-FRIESINGER, A. I. WEBB, M. MÜLLER u. H. DERENDORF (2001): Penetration of cefaclor into the interstitial space fluid of skeletal muscle and lung tissue in rats. Pharm Res 18, 1310-1314
DE LA PENA, A., P. LIU u. H. DERENDORF (2000): Microdialysis in peripheral tissues. Adv Drug Deliv Rev 45, 189-216
DE LANGE, E. C., A. G. DE BOER u. D. D. BREIMER (2000): Methodological issues in microdialysis sampling for pharmacokinetic studies. Adv Drug Deliv Rev 45, 125-148
DERENDORF, H., T. GRAMATTÉ, H. G. SCHÄFER u. A. STAAB (2010): Pharmakokinetik. Einführung in die Theorie und Relevanz für die Arzneimitteltherapie. 3. Aufl., Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart
DIXON, P. M. u. K. W. HEAD (1999): Equine nasal and paranasal sinus tumours: part 2: a contribution of 28 case reports. Vet J 157, 279-294
DIXON, P. M. u. J. M. O'LEARY (2012): A review of equine paranasal sinusitis: Medical and surgical treatments. Equine vet Educ 24, 148-159
DIXON, P. M., T. D. PARKIN, N. COLLINS, C. HAWKES, N. TOWNSEND, W. H. TREMAINE, G. FISHER, R. EALEY u. S. Z. BARAKZAI (2011): Equine paranasal sinus disease: A long-term study of 200 cases (1997-2009): Treatments and long-term results of treatments. Equine Vet J, (im Druck)
EASLEY, J. (1998): Dental care and instrumentation. Vet Clin North Am Equine Pract 14, 309-332, vi-vii
126 Literaturverzeichnis
EDNER, A. H., B. ESSEN-GUSTAVSSON u. G. C. NYMAN (2005): Muscle metabolic changes associated with long-term inhalation anaesthesia in the horse analysed by muscle biopsy and microdialysis techniques. J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med 52, 99-107
EDNER, A. H., B. ESSEN-GUSTAVSSON u. G. C. NYMAN (2009): Metabolism during anaesthesia and recovery in colic and healthy horses: a microdialysis study. Acta Vet Scand 51, 10
EISENBERG, E. J., P. CONZENTINO, W. M. EICKHOFF u. K. C. CUNDY (1993): Pharmacokinetic measurement of drugs in lung epithelial lining fluid by microdialysis: aminoglycoside antibiotics in rat bronchi. J Pharmacol Toxicol Methods 29, 93-98
EKEDAHL, C., S. E. HOLM u. A. M. BERGHOLM (1978): Penetration of antibiotics into the normal and diseased maxillary sinus mucosa. Scand J Infect Dis Suppl, 279-284
EL-BANNA, H. A. (1999): Pharmacokinetic interactions between flunixin and sulphadimidine in horses. Dtsch Tierarztl Wochenschr 106, 400-403
ELMQUIST, W. F. u. R. J. SAWCHUK (1997): Application of microdialysis in pharmacokinetic studies. Pharm Res 14, 267-288
EMEA (2000): Evaluation of medicines for human use. Points to consider on pharmacokinetics and pharmacodynamics in the development of antibacterial medicinal products. CPMP/EWP/2655/99. THE EUROPEAN AGENCY FOR THE EVALUATION OF MEDICINAL PRODUCTS (EMEA). COMMITTEE FOR PROPRIETARY MEDICINAL PRODUCTS (CPMP). [Internet: URL: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500003420.pdf; Stand: 01.12.2011]
Literaturverzeichnis 127
EMEA (2002): Veterinary medicines and inspections. Guideline for the demonstation of efficacy for veterinary medicinal products containing antimicrobial substances. EMEA/CVMP/627/01-Final. THE EUROPEAN AGENCY FOR THE EVALUATION OF MEDICINAL PRODUCTS (EMEA). COMMITTEE FOR VETERINARY MEDICINAL PRODUCTS (CVMP). [Internet: URL: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/10/WC500004492.pdf; Stand: 01.12.2011]
ENSINK, J. M., G. BOSCH u. E. VAN DUIJKEREN (2005): Clinical efficacy of prophylactic administration of trimethoprim/sulfadiazine in a Streptococcus equi subsp. zooepidemicus infection model in ponies. J Vet Pharmacol Ther 28, 45-49
ENSINK, J. M., J. A. SMIT u. E. VAN DUIJKEREN (2003): Clinical efficacy of trimethoprim/sulfadiazine and procaine penicillin G in a Streptococcus equi subsp. zooepidemicus infection model in ponies. J Vet Pharmacol Ther 26, 247-252
ENSINK, J. M., B. VAN KLINGEREN, D. J. HOUWERS, W. R. KLEIN u. A. G. VULTO (1993): In-vitro susceptibility to antimicrobial drugs of bacterial isolates from horses in The Netherlands. Equine Vet J 25, 309-313
FDA (1998): Guidance for industry. Developing antimicrobial drugs - general considerations for clinical trials. U. S. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION (FDA). [Internet: URL: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM070983.pdf; Stand: 01.12.2011]
FEIGE, K., U. GEISSBÜHLER, A. FÜRST, F. EHRAT u. C. SCHWARZWALD (2000): Sinusitis beim Pferd: Eine retrospektive Untersuchung anhand von 55 Fällen. Pferdeheilkd 16, 495-501
FEY, K. u. P. SCHMID (1995): Empfindlichkeit bakterieller Krankheitserreger aus dem Respirationstrakt von Pferden gegenüber Trimethoprim, Sulfadoxin, Sulfadimethoxin und Kombinationen dieser Wirkstoffe. Tierarztl Prax 23, 148-154
128 Literaturverzeichnis
FISCHMAN, A. J., J. W. BABICH, A. A. BONAB, N. M. ALPERT, J. VINCENT, R. J. CALLAHAN, J. A. CORREIA u. R. H. RUBIN (1998): Pharmacokinetics of [18F]trovafloxacin in healthy human subjects studied with positron emission tomography. Antimicrob Agents Chemother 42, 2048-2054
FREEMAN, D. E. (1991): Paranasal Sinuses. In: J. BEECH (Hrsg.): Equine Respiratory Disorders. Lea & Febinger, Philadelphia, Pa., S. 276-303
FREEMAN, D. E. (2003): Sinus disease. Vet Clin North Am Equine Pract 19, 209-243, viii
FREEMAN, D. E., P. G. ORSINI, M. W. ROSS u. J. B. MADISON (1990): A large frontonasal bone flap for sinus surgery in the horse. Vet Surg 19, 122-130
FREY, H.-H. (2002): Allgemeine Pharmakologie. In: H.-H. FREY und W. LÖSCHER (Hrsg.): Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie für die Veterinärmedizin. 2. Aufl., Enke Verlag, Stuttgart, S. 1
GÄBEL, G. (2005): Wasser- und Elektrolythaushalt. In: W. VON ENGELHARDT und G. BREVES (Hrsg.): Physiologie der Haustiere. 2. Aufl., Enke Verlag, Stuttgart, S. 307-312
GLITZ, F. u. E. DEEGEN (2010): Allgemeine Untersuchung. In: H. WISSDORF, G. GERHARDS, B. HUSKAMP und E. DEEGEN (Hrsg.): Praxisorientierte Anatomie und Propädeutik des Pferdes. 3. Aufl., Schaper Verlag, Hannover, S. 856-859
Literaturverzeichnis 129
GPM, BTK, BPT u. DVG (2006): Anmerkungen zum Antibiotikaeinsatz beim Pferd. GESELLSCHAFT FÜR PFERDEMEDIZIN (GPM). BUNDESTIERÄRZTEKAMMER (BTK). BUNDESVERBAND PRAKTIZIERENDER TIERÄRZTE (BPT). DEUTSCHE VETERINÄRMEDIZINISCHE GESELLSCHAFT (DVG). [Internet: URL: http://www.bundestieraerztekammer.de/datei.htm?filename=antibiotika_pferd_07.pdf&themen_id=5124&PHPSESSID=350e7c5b7f7a8f5f77d5e8948e75c0e7; Stand: 05.12.2011]
GREET, T. R. (1981): Nasal aspergillosis in three horses. Vet Rec 109, 487-489
GREET, T. R. (1992): Outcome of treatment in 23 horses with progressive ethmoidal haematoma. Equine Vet J 24, 468-471
GRUBB, B. R., J. L. CHADBURN u. R. C. BOUCHER (2002): In vivo microdialysis for determination of nasal liquid ion composition. Am J Physiol Cell Physiol 282, C1423-1431
GRUBB, B. R., J. H. JONES u. R. C. BOUCHER (2004): Mucociliary transport determined by in vivo microdialysis in the airways of normal and CF mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 286, L588-595
GUSTAFSSON, A., V. BAVERUD, A. FRANKLIN, A. GUNNARSSON, G. OGREN u. C. INGVAST-LARSSON (1999): Repeated administration of trimethoprim/sulfadiazine in the horse--pharmacokinetics, plasma protein binding and influence on the intestinal microflora. J Vet Pharmacol Ther 22, 20-26
HAGGETT, E. F. u. W. D. WILSON (2008): Overview of the use of antimicrobials for the treatment of bacterial infections in horses. Equine vet Educ 20, 433-448
HART, S. K. u. K. E. SULLINS (2011): Evaluation of a novel post operative treatment for sinonasal disease in the horse (1996-2007). Equine Vet J 43, 24-29
130 Literaturverzeichnis
HEAD, K. W. u. P. M. DIXON (1999): Equine nasal and paranasal sinus tumours. Part 1: review of the literature and tumour classification. Vet J 157, 261-278
HENNINGER, W., E. M. FRAME, M. WILLMANN, H. SIMHOFER, D. MALLECZEK, S. M. KNEISSL u. E. MAYRHOFER (2003): CT features of alveolitis and sinusitis in horses. Vet Radiol Ultrasound 44, 269-276
HERKNER, H., M. R. MÜLLER, N. KREISCHITZ, B. X. MAYER, M. FROSSARD, C. JOUKHADAR, N. KLEIN, E. LACKNER u. M. MÜLLER (2002): Closed-chest microdialysis to measure antibiotic penetration into human lung tissue. Am J Respir Crit Care Med 165, 273-276
HIRSH, D. C. u. S. S. JANG (1987): Antimicrobic susceptibility of bacterial pathogens from horses. Vet Clin North Am Equine Pract 3, 181-190
HOLMGAARD, R., J. B. NIELSEN u. E. BENFELDT (2010): Microdialysis sampling for investigations of bioavailability and bioequivalence of topically administered drugs: current state and future perspectives. Skin Pharmacol Physiol 23, 225-243
INGVAST-LARSSON, C., L. E. APPELGREN u. G. NYMAN (1992): Distribution studies of theophylline: microdialysis in rat and horse and whole body autoradiography in rat. J Vet Pharmacol Ther 15, 386-394
JACOBSON, I., M. SANDBERG u. A. HAMBERGER (1985): Mass transfer in brain dialysis devices--a new method for the estimation of extracellular amino acids concentration. J Neurosci Methods 15, 263-268
JLLIG, H. (1910): Beitrag zur Kenntnis der Nebenhöhlen der Nase der Haussäuger. Über den histologischen Aufbau der Nebenhöhlen der Nase bei den Haussäugetieren. Die Entwicklung der Nebenhöhlen-Systeme beim Rind. Gießen, Univ., med. Fak., Diss.
JOUKHADAR, C., H. DERENDORF u. M. MÜLLER (2001): Microdialysis. A novel tool for clinical studies of anti-infective agents. Eur J Clin Pharmacol 57, 211-219
Literaturverzeichnis 131
KIETZMANN, M. (2000): Pharmakokinetik. In: E. WIESNER und R. RIBBECK (Hrsg.): Lexikon der Veterinärmedizin. 4. Aufl., Enke Verlag, Stuttgart, S. 1118
KÖNIG, H. E. u. H.-G. LIEBICH (2009): Atmungsapparat. In: H. E. KÖNIG und H.-G. LIEBICH (Hrsg.): Anatomie der Haussäugetiere. 4. Aufl., Bd. 2, Schattauer Verlag, Stuttgart, S. 367-388
KOVAR, A., A. NOLTING u. H. DERENDORF (1997): Mikrodialyse zur Bestimmung freier Arzneistoffe in Geweben. Pharm Unserer Zeit 26, 17-23
KROKER, R., R. SCHERKL u. F. R. UNGEMACH (2002): Chemotherapie bakterieller Infektionen. In: H.-H. FREY und W. LÖSCHER (Hrsg.): Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie für die Veterinärmedizin. 2. Aufl., Enke Verlag, Stuttgart, S. 353-387
LANE, J. G. (1993a): The management of sinus disorders of horses - Part 1. Equine vet Educ 5, 5-9
LANE, J. G. (1993b): The management of sinus disorders of horses - Part 2. Equine vet Educ 5, 69-73
LARSSON, C. I. (1991): The use of an "internal standard" for control of the recovery in microdialysis. Life Sci 49, PL73-78
LEE, H. S., E. K. GOH, S. G. WANG, K. M. CHON, H. K. KIM u. H. J. ROH (2005): Detection of amino acids in human nasal mucosa using microdialysis technique: increased glutamate in allergic rhinitis. Asian Pac J Allergy Immunol 23, 213-219
LONNROTH, P., P. A. JANSSON u. U. SMITH (1987): A microdialysis method allowing characterization of intercellular water space in humans. Am J Physiol. 253, E228-231
132 Literaturverzeichnis
LÖSCHER, W. (1984): Kritische Anmerkungen zu Trimethoprim/Sulfonamid-Kombinationen in der Veterinärmedizin. Dtsch Tierarztl Wochenschr 91, 135-139
MASON, B. J. (1975): Empyema of the equine paranasal sinuses. J Am Vet Med Assoc 167, 727-731
MCKELLAR, Q. A., S. F. SANCHEZ BRUNI u. D. G. JONES (2004): Pharmacokinetic/pharmacodynamic relationships of antimicrobial drugs used in veterinary medicine. J Vet Pharmacol Ther 27, 503-514
MCKENZIE, H. C. (2009): Antimicrobial Therapy of the Respiratory System. In: N. E. ROBINSON und K. A. SPRAYBERRY (Hrsg.): Current Therapy in Equine Medicine. 6. Aufl., Saunders, St. Louis, Mo., S. 274-278
MILLER, E. P., G. R. GUNDERSON u. M. A. COLLIER (1984): Clinical field evaluation of a sulfadiazine-trimethoprim combination in horses. Vet Med Small Anim Clin 79, 227-232
MOUTON, J. W., U. THEURETZBACHER, W. A. CRAIG, P. M. TULKENS, H. DERENDORF u. O. CARS (2008): Tissue concentrations: do we ever learn? J Antimicrob Chemother 61, 235-237
MÜLLER, M. (2000): Microdialysis in clinical drug delivery studies. Adv Drug Deliv Rev 45, 255-269
MÜLLER, M., A. DE LA PENA u. H. DERENDORF (2004): Issues in pharmacokinetics and pharmacodynamics of anti-infective agents: distribution in tissue. Antimicrob Agents Chemother 48, 1441-1453
MÜLLER, M., O. HAAG, T. BURGDORFF, A. GEORGOPOULOS, W. WENINGER, B. JANSEN, G. STANEK, H. PEHAMBERGER, E. AGNETER u. H. G. EICHLER (1996): Characterization of peripheral-compartment kinetics of antibiotics by in vivo microdialysis in humans. Antimicrob Agents Chemother 40, 2703-2709
Literaturverzeichnis 133
MÜLLER, M., R. SCHMID, A. GEORGOPOULOS, A. BUXBAUM, C. WASICEK u. H. G. EICHLER (1995): Application of microdialysis to clinical pharmacokinetics in humans. Clin Pharmacol Ther 57, 371-380
MÜLLER, M., H. STASS, M. BRUNNER, J. G. MOLLER, E. LACKNER u. H. G. EICHLER (1999): Penetration of moxifloxacin into peripheral compartments in humans. Antimicrob Agents Chemother 43, 2345-2349
MURCHIE, T. A., M. L. MACPHERSON, M. M. LEBLANC, S. LUZNAR u. T. W. VICKROY (2006): Continuous monitoring of penicillin G and gentamicin in allantoic fluid of pregnant pony mares by in vivo microdialysis. Equine Vet J 38, 520-525
NEGUS, V. (1958): The Comparative Anatomy and Physiology of the Nose and Paranasal Sinuses. Livingstone, Edinburgh u. London
NICKEL, R., A. SCHUMMER, K.-H. WILLE u. H. WILKENS (2001): Passiver Bewegungsapparat, Skelettsystem. In: J. FREWEIN, K.-H. WILLE und H. WILKENS (Hrsg.): Lehrbuch der Anatomie der Haustiere. 7. Aufl., Bd. 1, Parey Verlag, Berlin, S. 177, 209
NICKELS, F. A. (2006): Nasal Passages and Paranasal Sinuses. In: J. A. AUER und J. A. STICK (Hrsg.): Equine Surgery. 3. Aufl., Saunders/Elsevier, St. Louis, Mo., S. 533-544
NOURIAN, A. R., P. C. MILLS u. C. C. POLLITT (2010a): Development of an intra-lamellar microdialysis method for laminitis investigations in horses. Vet J 183, 22-26
NOURIAN, A. R., P. C. MILLS u. C. C. POLLITT (2010b): Development of intraosseous infusion of the distal phalanx to access the foot lamellar circulation in the standing, conscious horse. Vet J 183, 273-277
134 Literaturverzeichnis
NOUWS, J. F., T. B. VREE, M. BAAKMAN, F. DRIESSENS, A. SMULDERS u. J. HOLTKAMP (1985): Disposition of sulfadimidine and its N4-acetyl and hydroxy metabolites in horse plasma. J Vet Pharmacol Ther 8, 303-311
O'LEARY, J. M. u. P. M. DIXON (2011): A review of equine paranasal sinusitis. Aetiopathogenesis, clinical signs and ancillary diagnostic techniques. Equine vet Educ 23, 148-159
OH-ISHI, S. (1968): Tissue distribution of sulfadimethoxine and sulfamonomethoxine in horses after intravenous injection. Jap J vet Sci 30, 21-23
OLSON, R. J. u. J. B. JUSTICE (1993): Quantitative microdialysis under transient conditions. Anal Chem. 65, 1017-1022
PAPICH, M. G. u. J. E. RIVIERE (2009): Sulfonamides and Potentiated Sulfonamides. In: J. E. RIVIERE und M. G. PAPICH (Hrsg.): Veterinary Pharmacology and Therapeutics. 9. Aufl., Wiley-Blackwell, Ames, Iowa, S. 835-864
PERKINS, J. D. u. S. Z. BARAKZAI (2005): The equine paranasal sinuses Part 4. UK Vet 10, 5-8
PLOCK, N. u. C. KLOFT (2005): Microdialysis--theoretical background and recent implementation in applied life-sciences. Eur J Pharm Sci 25, 1-24
PRESCOTT, J. F. (2006): Sulfonamides, Diaminopyrimidines, and Their Combinations. In: S. GIGUÈRE, J. F. PRESCOTT, J. D. BAGGOT, R. D. WALKER und P. M. DOWLING (Hrsg.): Antimicrobial Therapy in Veterinary Medicine. 4. Aufl., Blackwell, Ames, Iowa, S. 249-262
Literaturverzeichnis 135
QUINN, G. C., J. A. KIDD u. J. G. LANE (2005): Modified frontonasal sinus flap surgery in standing horses: surgical findings and outcomes of 60 cases. Equine Vet J 37, 138-142
REIMER, A., C. VON MECKLENBURG u. N. G. TOREMALM (1978): The mucociliary activity of the upper respiratory tract. III. A functional and morphological study on human and animal material with special reference to maxillary sinus diseases. Acta Otolaryngol Suppl 356, 1-20
RUGGLES, A. J., M. W. ROSS u. D. E. FREEMAN (1991): Endoscopic examination of normal paranasal sinuses in horses. Vet Surg 20, 418-423
RUGGLES, A. J., M. W. ROSS u. D. E. FREEMAN (1993): Endoscopic examination and treatment of paranasal sinus disease in 16 horses. Vet Surg 22, 508-514
RUSH, B. u. T. S. MAIR (2004): Equine Respiratory Diseases. Blackwell Science, Oxford, Malden, MA, S. 41-55
RYAN, D. M. (1985): Influence of surface area/volume ratio on the kinetics of antibiotics in different tissues and tissue fluids. Scand J Infect Dis Suppl 44, 24-33
RYAN, D. M. (1993): Pharmacokinetics of antibiotics in natural and experimental superficial compartments in animals and humans. J Antimicrob Chemother 31 Suppl D, 1-16
SCHELLER, D. u. J. KOLB (1991): The internal reference technique in microdialysis: a practical approach to monitoring dialysis efficiency and to calculating tissue concentration from dialysate samples. J Neurosci Methods 40, 31-38
SCHUMACHER, J., D. M. DUTTON, D. J. MURPHY, B. A. HAGUE u. T. S. TAYLOR (2000): Paranasal sinus surgery through a frontonasal flap in sedated, standing horses. Vet Surg 29, 173-177
136 Literaturverzeichnis
SCHUMACHER, J., C. HONNAS u. B. SMITH (1987): Paranasal sinusitis complicated by inspissated exudate in the ventral conchal sinus. Vet Surg 16, 373-377
SCOTT, E. A. (1987): Sinusitis. In: N. E. ROBINSON (Hrsg.): Current Therapy in Equine Medicine. 2. Aufl., Saunders, Philadelphia (u. a.), S. 605-607
SIMHOFER, H. u. K. ZETNER (2003): Erkrankungen bei der Nasennebenhöhle - Diagnostik und Therapie. pferde spiegel 6, 33-39
SKOLD, O. (2001): Resistance to trimethoprim and sulfonamides. Vet Res 32, 261-273
STACK, A. u. H. C. SCHOTT (2011): Suspect novel adverse drug reactions to trimethoprim-sulphonamide combinations in horses: a case series. Equine Vet J 43, 117-120
STEINER, I., M. MÜLLER u. C. JOUKHADAR (2004): Antibiotika im schwer erreichbaren Kompartiment - Grundlagen und Klinik. Chemother J 13, 195-202
STENKEN, J. A. (1999): Methods and issues in microdialysis calibration. Analytica Chimica Acta 379, 337-358
STOIAN, C., H. SIMHOFER u. K. ZETNER (2006): Retrospektive Studie über sekundäre dental bedingte Sinusitis bei 22 Pferden: Diagnose, Behandlung und Langzeitergebnisse. Prakt Tierarzt 87, 26-31
THALLINGER, C. u. C. JOUKHADAR (2005): Mikrodialyse - Eine Revolution auf dem Gebiet der Pharmakologie. Antibiotika Monitor 21, 91-95
THEURETZBACHER, U. (2007): Tissue penetration of antibacterial agents: how should this be incorporated into pharmacodynamic analyses? Curr Opin Pharmacol 7, 498-504
Literaturverzeichnis 137
TOMASELLI, F., P. DITTRICH, A. MAIER, M. WOLTSCHE, V. MATZI, J. PINTER, S. NUHSBAUMER, H. PINTER, J. SMOLLE u. F. M. SMOLLE-JUTTNER (2003): Penetration of piperacillin and tazobactam into pneumonic human lung tissue measured by in vivo microdialysis. Br J Clin Pharmacol 55, 620-624
TOPPOZADA, H. H. u. M. A. TALAAT (1980): The normal human maxillary sinus mucosa. An electron microscopic study. Acta Otolaryngol 89, 204-213
TREMAINE, W. H., C. J. CLARKE u. P. M. DIXON (1999): Histopathological findings in equine sinonasal disorders. Equine Vet J 31, 296-303
TREMAINE, W. H. u. P. M. DIXON (2001a): A long-term study of 277 cases of equine sinonasal disease. Part 1: details of horses, historical, clinical and ancillary diagnostic findings. Equine Vet J 33, 274-282
TREMAINE, W. H. u. P. M. DIXON (2001b): A long-term study of 277 cases of equine sinonasal disease. Part 2: treatments and results of treatments. Equine Vet J 33, 283-289
TREMAINE, W. H. u. D. E. FREEMAN (2007): Disorders of the Paranasal Sinuses. In: B. C. MCGORUM, P. DIXON, N. E. ROBINSON und J. SCHUMACHER (Hrsg.): Equine Respiratory Medicine and Surgery. Saunders/Elsevier, Edinburgh, S. 393-407
TROLLDENIER, H. (2000): Resistenz. In: E. WIESNER und R. RIBBECK (Hrsg.): Lexikon der Veterinärmedizin. 4. Aufl., Enke Verlag, Stuttgart, S. 1234
TROLLDENIER, H. u. F. R. UNGEMACH (2000): Chemotherapeutikum. In: E. WIESNER und R. RIBBECK (Hrsg.): Lexikon der Veterinärmedizin. 4. Aufl., Enke Verlag, Stuttgart, S. 256
138 Literaturverzeichnis
TROTTER, G. W. (1993): Paranasal sinuses. Vet Clin North Am Equine Pract 9, 153-169
TYVOLD, S. S., E. SOLLIGARD, O. LYNG, S. L. STEINSHAMN, S. GUNNES u. P. AADAHL (2007): Continuous monitoring of the bronchial epithelial lining fluid by microdialysis. Respir Res 8, 78
UNGERSTEDT, U. (1991): Microdialysis--principles and applications for studies in animals and man. J Intern Med 230, 365-373
UNGERSTEDT, U. u. C. PYCOCK (1974): Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss 30, 44-55
VAN DUIJKEREN, E., J. M. ENSINK u. L. A. MEIJER (2002): Distribution of orally administered trimethoprim and sulfadiazine into noninfected subcutaneous tissue chambers in adult ponies. J Vet Pharmacol Ther 25, 273-277
VAN DUIJKEREN, E., A. G. VULTO, M. M. SLOET VAN OLDRUITENBORGH-OOSTERBAAN, B. G. KESSELS, A. S. VAN MIERT u. H. J. BREUKINK (1995): Pharmacokinetics of trimethoprim/sulphachlorpyridazine in horses after oral, nasogastric and intravenous administration. J Vet Pharmacol Ther 18, 47-53
VAN DUIJKEREN, E., A. G. VULTO, M. M. SLOET VAN OLDRUITENBORGHOOSTERBAAN, D. J. MEVIUS, B. G. KESSELS, H. J. BREUKINK u. A. S. VAN MIERT (1994a): A comparative study of the pharmacokinetics of intravenous and oral trimethoprim/sulfadiazine formulations in the horse. J Vet Pharmacol Ther 17, 440-446
VAN DUIJKEREN, E., A. G. VULTO u. A. S. VAN MIERT (1994b): Trimethoprim/sulfonamide combinations in the horse: a review. J Vet Pharmacol Ther 17, 64-73
VICKROY, T. W., S. K. CHANG u. C. C. CHOU (2008): Caffeine-induced hyperactivity in the horse: comparisons of drug and metabolite concentrations in blood and cerebrospinal fluid. J Vet Pharmacol Ther 31, 156-166
Literaturverzeichnis 139
WAELCHLI, R. O., T. JAWORSKI, W. D. RUDDOCK u. K. J. BETTERIDGE (2000): Estimation of sodium and potassium concentrations in the uterine fluid of mares by microdialysis and ion chromatography. J Reprod Fertil Suppl, 327-332
WILSON, D. A., K. E. MACFADDEN, E. M. GREEN, M. CRABILL, R. L. FRANKENY u. J. G. THORNE (1996): Case control and historical cohort study of diarrhea associated with administration of trimethoprim-potentiated sulphonamides to horses and ponies. J Vet Intern Med 10, 258-264
WINTHER, L., L. GUARDABASSI, K. E. BAPTISTE u. C. FRIIS (2011): Antimicrobial disposition in pulmonary epithelial lining fluid of horses. Part I. Sulfadiazine and trimethoprim. J Vet Pharmacol Ther 34, 277-284
ZELLER, W., U. SCHATZMANN, R. MEIER u. P. TSCHUDI (1988): Wirkungen von Na-Penicillin G, Sulfadimidin, Sulfadimethoxin und Flunixin-Meglumin auf Atmung und Kreislauf nach intravenöser Applikation am anästhesierten Pferd. Schweiz Arch Tierheilkd 130, 329-340
140
Danksagung 141
11 Danksagung
Mein erster Dank gilt Herrn Prof. Dr. Bernhard Ohnesorge für die Überlassung des
interessanten Dissertationsthemas sowie für die jederzeit freundliche und konstruktive
Unterstützung dieser Arbeit.
Weiterhin danke ich Herrn Prof. Dr. Manfred Kietzmann für die Möglichkeit die
analytischen Untersuchungen am Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
durchzuführen sowie für die stets freundliche und unkomplizierte Unterstützung.
Mein ganz besonderer Dank gilt Frau Dr. Astrid Bienert-Zeit für die ausgezeichnete
Betreuung und ihr unermüdliches Engagement bei der Anfertigung dieser Dissertation.
Liebe Astrid, vielen Dank für Deine Unterstützung, Motivation und Dein Vertrauen!!
Frau Dr. Jessica Stahl danke ich ganz herzlich für die Durchführung der HPLC-
Untersuchungen sowie für ihre Ratschläge, Bemühungen und die nette
Zusammenarbeit.
Mein Dank gilt weiterhin Herrn Prof. Dr. Carsten Staszyk für die Unterstützung bei der
Entnahme und Aufarbeitung der histologischen Proben sowie für die sehr angenehme
Zusammenarbeit. An dieser Stelle danke ich auch Frau Gudrun Wirth sehr herzlich für
die Anfertigung der histologischen Schnitte.
Frau Dr. Verena Haist danke ich für ihre Hilfsbereitschaft und ihren fachlichen Rat bei
der Auswertung der histologischen Schnitte.
Ein ganz großes Dankeschön gebührt meinen freiwilligen Helfern Filip Batkowski,
Markus Brinkschulte, Joachim Kaminski, Isabelle Kern, Tanja Pudert, Caroline
Schöngart, Monika Siroka, Tanja Tesch, Tobias Warnken und Liza Wittenberg, die
durch ihre unermüdliche Hilfs- und Einsatzbereitschaft zu allen Tages- und Nachtzeiten
die praktische Durchführung der Versuche erst möglich gemacht haben.
Mein herzlicher Dank gilt weiter allen Mitarbeitern der Klinik für Pferde, die mich mit Rat
und Tat bei der Vorbereitung und Durchführung meiner Versuche unterstützt haben.
142 Danksagung
Meinen Mitdoktoranden danke ich für ihre Hilfsbereitschaft bei kleinen und großen
Problemen und die nette Zusammenarbeit.
Ebenso gilt mein Dank den Mitarbeitern und Mitdoktoranden in der Pharmakologie für
die freundliche Aufnahme, die Hilfsbereitschaft und Unterstützung bei der Durchführung
meiner Versuche, die konstruktiven Gespräche und nicht zuletzt für den anderen netten
Plausch bei einem Käffchen.
Ein ganz besonderer Dank gilt meiner Mitdoktorandin und Mikrodialyse-Leidensgenossin
Amelie Teepe für den regen Austausch über Freud und Leid der Mikrodialyse und für
die nette gemeinsame Zeit – nicht nur im Labor.
Der CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH danke ich für die finanzielle Unterstützung
dieser Arbeit und für das stetige Interesse am Fortgang dieser Arbeit.
Mein Dank gilt auch Dr. John Kastelic und Rose Kastelic für die Anleitung zum
wissenschaftlichen Schreiben und die sprachliche Korrektur der beiden Manuskripte.
Ich danke Stephan Zeit für die freundliche Unterstützung bei der Bildbearbeitung.
Meinen Freunden danke ich für die vielen schönen Erlebnisse neben dem Studium und
der Doktorarbeit und dafür, dass sie in allen Lebenslagen für mich da sind!! Mela und
Stefan danke ich besonders für ihre Gesellschaft und die kulinarische Verpflegung
während des einen oder anderen Versuchs, für diverse PC-Rettungsaktionen und nicht
zuletzt fürs gelegentliche „Hundis-Leihen“. Liebe Nene, Dir vielen Dank für die
Fehlersuche!!
Von ganzem Herzen danke ich meinem Freund Peter für seine liebevolle Unterstützung,
seine unermüdliche Geduld und sein Verständnis in allen Höhen und Tiefen der
Doktorarbeitszeit. Vielen Dank, dass Du immer für mich da bist, mH!!
Mein abschließender und zugleich größter Dank gilt meinen Eltern für ihre moralische
und auch finanzielle Unterstützung während des gesamten Studiums und der
Anfertigung der Dissertation. Ebenso danke ich meinen Großeltern für ihren Beistand
und ihre Unterstützung während meiner gesamten Ausbildung.