TierärztlicheHochschuleHannover Entwicklung und ... · eitgehende w Standardisierung hiedener ersc v aktoren, F z. B. Genetik, Haltungs-b edingungen, Mikrobiom, sollen b ei hstieren

Tierärztliche Hochschule Hannover

Entwicklung und Validierung einer sensitiven und

spezifischen Multiplex-Serologie zum Nachweis von

Antikörpern gegen 27 Viren bei Maus und Ratte

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der

Veterinärmedizin

– Doctor medicinæ veterinariæ –

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Eva Klaessen (geb. Neuhäuser)

Frankfurt am Main

Hannover 2013

Wissens haftli he Betreuung:

Dr.Mi hael Pawlita (Deuts hes Krebsfors hungszentrum)

Dr.med. vet.Werner Ni klas (Deuts hes Krebsfors hungszentrum)

Apl.-Prof. Dr.med. vet. Ludwig Haas (Tierärztli he Ho hs hule Hannover)

Prof.Dr. Lutz Gissmann (Deuts hes Krebsfors hungszentrum)

1.Guta hter: Apl.-Prof. Dr.med. vet. Ludwig Haas

2.Guta hter: Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand

Tag der mündli hen Prüfung: 26. Februar 2013

Gefördert dur h: Deuts hes Krebsfors hungszentrum (DKFZ)

ii

Für Rita, Christian und Rufus

iii

Vorab öentli h präsentierte Teilergebnisse dieser Arbeit:

47.Wissens haftli he Tagung der Gesells haft für Versu hstierkunde GV-Solas

13.-15. September 2009 in Wien,Österrei h

Eva Neuhäuser, Ludwig Haas, Petra Mauter, Angelika Mi hel, Mi hael Pawlita, Klaus

Vogel, Werner Ni klas

Vortrag: Development of multiplex serology for the dete tion of viral infe tions in

laboratory rodents

11thFELASA and 40th S and-LAS jointMeeting

14.-17. Juni 2010 in Helsinki, Finnland

Eva Neuhäuser, Angelika Mi hel, Petra Mauter, Klaus Vogel, Mi hael Mähler, Ludwig

Haas, Tim Waterboer, Mi hael Pawlita, Werner Ni klas

Poster: Multiplex serology for the dete tion of viral infe tions in rodents

iv

Inhaltsverzeichnis

1. Abkürzungsverzeichnis 1

2. Einleitung 5

3. Literaturübersicht 7

3.1. Standardisierung von Versu hstieren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

3.2. Bedeutung von Virusinfektionen bei Maus und Ratte . . . . . . . . . . . 7

3.3. Infektionsüberwa hung von Versu hstierbeständen . . . . . . . . . . . . . 10

3.3.1. Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

3.3.2. Multiplex-Serologie (MS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3.4. Viren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3.4.1. DNA-Viren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

3.4.2. RNA-Viren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

4. Material 45

4.1. Allgemeine Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

4.2. Puer und Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

4.3. Verbrau hsmaterial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

4.4. Bakterienstämme und Vektoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

4.5. Gröÿenmarker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

4.5.1. DNA-Marker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

4.5.2. Protein-Marker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

4.6. Templates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

4.7. Serumsammlungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

4.8. Antikörper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

4.9. Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

4.9.1. Restriktionsenzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

4.9.2. Sonstige Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

v

Inhaltsverzei hnis

4.10. Oligonukleotide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

4.11. Sequenzanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

4.12. Lysate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

4.13. Referenztests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

4.14. Laborgeräte und Hilfsmaterialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

4.15. Software und OnlineRessour en . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

5. Methoden 63

5.1. Proteinauswahl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

5.2. Molekulare Klonierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

5.2.1. Primerdesign . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

5.2.2. TemplateAufbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

5.2.3. Präparative PCR und Aufreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

5.2.4. VektorPräparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

5.2.5. Restriktionsverdau des PCRProdukts . . . . . . . . . . . . . . . . 72

5.2.6. Ligation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

5.2.7. Dialyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

5.2.8. Elektrotransformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

5.2.9. Sequenzierung und Überprüfung der Sequenzen . . . . . . . . . . 74

5.3. Umtransformierung und Proteinexpression in E. oli BL21Rosetta oder

E. oli BL21 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

5.3.1. Kultur zur Proteingewinnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

5.3.2. Lyse der Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

5.4. Proteinanalytik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

5.4.1. Proteinbestimmung na h Bradford . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

5.4.2. SDS-PAGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

5.4.3. Coomassie Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

5.4.4. WesternBlot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

5.4.5. Tag-titration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

5.5. Multiplex-Serologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

5.5.1. Beladung der Beads . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

5.5.2. Dur hführung des eigentli hen Assays . . . . . . . . . . . . . . . . 81

5.5.3. Denition von Seropositivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

6. Ergebnisse 87

6.1. Generierung der Expressionsklone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

vi

Inhaltsverzei hnis

6.2. Herstellung und Charakterisierung der Antigene . . . . . . . . . . . . . . 95

6.2.1. Immunbio hemis he Charakterisierung der Antigene . . . . . . . . 95

6.2.2. Quantitative Charakterisierung der Antigene . . . . . . . . . . . . 96

6.2.3. Antikörperreaktivität in ni ht exponierten Tieren Cut-o Ab-

leitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

6.3. Bestimmung der Reproduzierbarkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

6.4. Statistis he Bere hnungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

6.5. Validierung der MSAntigene für die Maus . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

6.5.1. DNA-Viren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116

6.5.2. RNA-Viren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201

6.6. Validierung der MSAntigene für die Ratte . . . . . . . . . . . . . . . . . 285

6.6.1. DNA-Viren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288

6.6.2. RNA-Viren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 322

7. Diskussion 377

7.1. Quantitative Charakterisierung der Antigene . . . . . . . . . . . . . . . . 377

7.2. Antikörperreaktivität in ni ht exponierten Tieren Cut-o Ableitung . . 378

7.3. Validierung für die Maus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 379

7.4. Validierung für die Ratte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 383

7.5. Anwendung im routinemäÿigen Healthmonitoring . . . . . . . . . . . . . 385

7.6. Ausbli k . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 386

8. Zusammenfassung 389

9. Danksagungen 393

A. Western Blots und Coomassie Gele 395

B. Literaturverzeichnis 417

vii

1. Abkürzungsverzeichnis

C Grad Celsius

µl Mikroliter

µm Mikrometer

A Adenin

Abb. Abbildung

APS Ammoniumperoxodisulfat

AS Aminosäure

ATCC Ameri anTypeCultureColle tion

ATP Adenosin-5′-Trisulfat

ATV Angewandte Tumorvirologie

bp Basenpaare

bzw. beziehungsweise

C Cytosin

CI Kondenzintervall ( onden e interval)

CR CharlesRiver (Laboratories)

-terminal arboxyterminal

C-Terminus Carboxyterminus

d. h. das heiÿt

DKFZ Deuts hesKrebsfors hugszentrum

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTPs Desoxyribonukleotidtriphosphate

DPI Dayspost infe tionem

dsDNA/RNA double strandedDNA/RNA

DTT 1,4-Dithiothreitol

E. oli Es heri hia oli

1

1. Abkürzungsverzei hnis

EC

50

mittlere eektive Konzentration, bei der 50% der maximalen Reak-

tivität errei ht wird (ee tive on entration)

ECL verstärkte Chemilumineszenz (enhan ed hemilumines en e)

EDTA Ethylendiamintetraa etat

ELISA EnzymeLinked ImmunoSorbentAssay (Enzymgebundener Immun-

adsorptionstest)

EtBr Etidiumbromid

EtOH Ethanol

FLI Friedri h-Loeer-Institut

g Gramm

G Guanin

GC Glutathion-Casein

GST Glutathion S-Transferase

h Stunde

HAH Haemagglutinationshemmtest

HRP Meerretti h-peroxidase (horse radish peroxidase)

ICTV Internationales Komitee für die Taxonomie von Viren (Internatio-

nalCommittee onTaxonomyofViruses)

ID genaue Bezei hnung, Identität

IFA Immunuoreszenztest

Ig Immunglobulin

IPTG Isopropyl-ÿ-D-thiogala tosid

kb Kilobasen

kDa Kilodalton

Klass. Klassikation

KS Kontrollserum

kV Kilovolt

L Liter

LB LuriaBertani

M molar

MFI mediane Fluoreszenzintensität (median uores en e intensity)

MFIA MultiplexedFluorimetri ImmunoAssay (Multiplex-Serologie von

CharlesRiver)

mg Milligramm

min Minute

2

ml Milliliter

mM Millimolar

MS Multiplex-Serologie

MW arithmetis hes Mittel (Mittelwert)

ng Nanogramm

Nr.; # Nummer

NT Nukleotid

OD Optis heDi hte

ORF oenes Leseraster (open reading frame)

PBS Phosphatbepuerte Salzlösung (Phosphate buered saline)

PBST Phosphatbepuerte Salzlösung (Phosphate buered saline) mit

Tween

p.i. post infe tionem

RMV Ratminute virus

RNA Ribonukleinsäure

RPM Runden proMinute (Rounds perminute)

RT Raumtemperatur

S . S ore

SD Standardabwei hung

SDS-PAGE Natriumdode ylsulfat

(sodiumdode yl sulfate polya rylamide gel ele trophoresis)

SeV Sendai virus

SPF speziziert pathogenfrei

ssDNA/RNA single strandedDNA/RNA

T Thymin

Tab. Tabelle

TMEV Theilers murine en ephalomyelitis virus

Überw. Population überwa hte Population

USA United States ofAmeri a

ZTL zentrales Tierlabor

3

2. Einleitung

Die biomedizinis he Fors hung ist bis heute auf Tierversu he angewiesen. Die dafür

laut Tiers hutzberi ht der Bundesregierung mit Abstand am meisten eingesetzten Ver-

su hstierspezies sind Maus und Ratte. Um aussagekräftige und reproduzierbare Versu he

dur hführen zu können, müssen die verwendeten Versu hstiere frei sein von Mikroorga-

nismen, wel he die Physiologie der Tiere und damit Ergebnisse von Tierversu hen beein-

ussen können. Neben der Auswahl geeigneter Haltungsformen, die eine Erregerübertra-

gung zwis hen vers hiedenen Populationen unterbinden sollen, kommt der regelmäÿigen

Überwa hung der Tiere (Health Monitoring) eine groÿe Bedeutung zu. Untersu hungen

zum Vorkommen von Virusinfektionen in einer Population erfolgen in der Regel indi-

rekt über den Na hweis von Antikörpern mit vers hiedenen klassis hen sehr arbeits-

aufwändigen serologis hen Methoden wie beispielsweise Immunuoreszenztest (IFA),

Enzymgebundener Immunadsorptionstest (ELISA) oder Haemagglutinationshemmtest

(HAH). Seit einigen Jahren sind vers hiedene Labors dazu übergegangen, hierfür au h

Multiplex-Serologie (HSU et al. 2007) zu nutzen. Multiplex-Serologie erlaubt die paralle-

le Antikörper-Analyse für unters hiedli he Antigene in einem einzigen Reaktionsansatz.

Dabei sind die zu untersu henden Antigene auf 5,6µmgroÿen Polystyrol-Mikrosphären,

den sog. Beads gebunden. Diese Beads sind in unters hiedli hen Sorten erhältli h, die

si h dur h eine unters hiedli he interne Fluoreszenzfärbung unters heiden. Pro Sorte

wird jeweils ein anderes Antigen auf die Beads geladen. Das zu untersu hende Serum

wird dann mit einer Mis hung der Beads (Beadmix) inkubiert. Na h Färbung über ein

uoreszierendes Sekundärreagenz (Reporteruoreszens) wird die Menge der gebundenen

Antikörper und die Beadsorte über ein Fluoreszenz-Detektionssystem in einem Zwei-

Kanal Dur husszytometer vermessen. Dur h die Verwendung unters hiedli h belade-

ner Beads können bis zu 100 vers hiedene Na hweise pro Ansatz dur hgeführt werden,

wodur h si h diese Te hnologie besonders eignet, mit relativ geringem Aufwand und ge-

ringem Serumverbrau h (0,4µl pro Reaktionsansatz) eine sehr groÿe Zahl an Proben auf

Antikörper gegen mehrere Erreger glei hzeitig zu testen. Ein Na hteil der bereits exis-

tierenden Multiplex-Serologie (MS), z. B. von Charles River (CR) ist, dass der Einkauf

5

2. Einleitung

der fertigen Reagenzien sehr teuer ist für ein verglei hbares Spektrum zu testender

Pathogene a. 95e/Serum. Die Bezei hnung von CR für die MS ist MFIA (Multiple-

xedFluorometri ImmunoAssay).

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein Ho hdur hsatzverfahren für das serologis he

S reening von Mäusen und Ratten im Rahmen der Routineüberwa hung der Versu hs-

tiere am DKFZ zu entwi keln. Es sollte eine am DKFZ vor wenigen Jahren entwi kelte

MS-Methodik (WATERBOER et al. 2005) verwendet werden, die es ermögli ht, rekom-

binant hergestellte Virusproteine selektiv über einen GST-Teil an Glutathion-Casein

bes hi htete Beads zu koppeln und dadur h eine hohe Sensitivität und Spezität zu

errei hen.

6

3. Literaturübersicht

3.1. Standardisierung von Versuchstieren

Dur h weitgehende Standardisierung vers hiedener Faktoren, z. B.Genetik, Haltungs-

bedingungen, Mikrobiom, sollen bei Versu hstieren Voraussetzungen ges haen werden,

die mögli hst geringe S hwankungen von Versu hsergebnissen zwis hen Tieren innerhalb

einer Versu hsgruppe oder Population zur Folge haben. Ziel ist es, mit einer mögli hst

kleinen Tierzahl Ergebnisse mit einer hohen statistis hen Signikanz zu errei hen. Stan-

dardisierung ndet bei der Art der Haltung (MERING et al. 2001), der Fütterung (RITS-

KES et al. 2001), der Genetik (GÓRSKA 2000) und der Mikrobiologie (NICKLAS et al.

2002) statt. Ein hoher Grad an Standardisierung si hert die Qualität wissens haftli her

Versu he.

Es gibt au h Hinweise darauf, dass Standardisierung der Umgebung der Reproduzier-

barkeit und damit der Aussagekraft von Versu hen abträgli h sein kann, au h wenn

dadur h im einzelnen Versu h Tiere eingespart werden können (S.H. RICHTER et al.

2009). Die Notwendigkeit einer mögli hst weitgehenden mikrobiologis hen Standardi-

sierung dürfte jedo h unumstritten sein, da dadur h ni ht nur dur h Mikroorganismen

bedingte Verfäls hungen von Versu hsergebnissen, sondern au h Ausfälle bei den Tieren

dur h Erkrankungen oder Todesfälle vermieden werden können.

3.2. Bedeutung von Virusinfektionen bei Maus und Ratte

Zurzeit sind 21 Viren für die Maus und 15 für die Ratte bekannt, die in Versu hstierhal-

tungen vorkommen können. Von diesen sind in den FELASAEmpfehlungen (NICKLAS

et al. 2002) 19 bzw. 13 nominell aufgeführt. Na h Fertigstellung dieser Empfehlung wur-

den das Ratminute virus (RMV) (WAN et al. 2002) für die Ratte und das Murine

7

3. Literaturübersi ht

norovirus (MNV) (KARST et al. 2003) für die Maus bes hrieben, die in Versu hstier-

haltungen heute no h verbreitet sind. Als weiteres Virus, das natürli herweise ni ht bei

der Hausmaus (Mus mus ulus) vorkommt, wird mouse herpesvirus strain 68 (MuHV-4)

(BLASKOVIC et al. 1980) häug als Modellinfektion zur Untersu hung der Pathoge-

nese von mens hli hen Gammaherpesvirusinfektionen bei Mäusen eingesetzt. Kürzli h

wurde bei Wildratten ein hepatitis E-like virus (HEV) gefunden (JOHNE et al. 2010),

über dessen Vorkommen in Versu hstierhaltungen bis heute no h ni hts bekannt ist.

Die Untersu hungen auf das Vorkommen dieser Viren in Labortierbeständen ist indirekt

ebenfalls von der FELASA empfohlen, da dort ausdrü kli h darauf hingewiesen wird,

dass au h auf neue oder ni ht gelistete Erreger untersu ht werden soll, wel he Ergebnisse

von Tierversu hen beeinussen können.

Die Viren, die bereits 2002 als Problem in Versu hstierhaltungen bekannt waren, sind

na h Häugkeit ihres Vorkommens in zwei Gruppen aufgeteilt. Die eine Gruppe umfasst

diejenigen Viren, wel he no h relativ häug in Versu htierhaltungen vorkommen. Hier

wird abhängig vom Risiko der Erregereins hleppung eine regelmäÿige Untersu hung

in kürzeren Abständen (z. B. alle drei Monate) empfohlen. Die Untersu hung auf Vi-

ren der anderen Gruppe wird in gröÿeren Abständen (z. B. jährli h) empfohlen, da eine

Eins hleppung in den Versu hstierbestand sehr unwahrs heinli h ist.

Die Relevanz der Viren für Versu hsergebnisse zeigt si h viels hi htig, beispielsweise

dur h Beeinussung physiologis her Parameter (D.G. BAKER 2003), wie der speziellen

Wa hstumshemmung von Tumoren dur h Parvoviren (TELERMAN et al. 1993), oder

der allgemeinen Veränderung von immunologis hen Parametern (KARST et al. 2003).

Die genauen We hselwirkungen zwis hen allen Viren mit allen Arten von Versu hen

sind ni ht vollständig erfors ht, weshalb ein Experimentator generell Versu he nur mit

Tieren dur hführen sollte, die frei sind von sämtli hen Virusinfektionen. Neben der Erhö-

hung der Varianz haben viele Infektionen Auswirkungen auf das Wohlbenden der Tiere

(GÓRSKA 2000). Ein infektionsfreier Status der Tiere ist also geboten zum S hutz des

Individuums. Einige der Virusinfektionen von Maus und Ratte haben zoonotis hes Po-

tential (z. B.Hantaviren und das Lympho yti horiomeningitis virus (LCMV)); bei

diesen Erregern ist zusätzli h der S hutz des Mens hen zu bea hten. Ist eine Infektion

in ein Tierhaus gelangt, so bleibt häug als einzige Mögli hkeit die Tierhaltung zu sa-

nieren, nur die Keulung des gesamten Bestands und der Wiederaufbau über Zukauf oder

Embryotransfer. Es ist immer wieder über Ausbrü he vers hiedener viraler Infektionen

beri htet worden, was deutli h ma ht, dass au h unter modernen Haltungsbedingung

8

3.2. Bedeutung von Virusinfektionen bei Maus und Ratte

Tabelle 3.1. Von der FELASA empfohlenes Untersu hungsspektrum

Virus FELASA

gelistet

Empfohlenes

Untersu hungs-

intervall

no h ni ht gelistet,

Relevanz allgemein

anerkannt

ni ht gelistet,

Relevanz un-

klar

Maus

TMEV X 3Monate

Sendai X 3Monate

PVM X 3Monate

MVM X 3Monate

MPV

*

X 3Monate

MHV X 3Monate

EDIM X 3Monate

Reo3 X 1 Jahr

MCMV X 1Jahr

MAdV-2 X 1 Jahr

MAdV-1 X 1 Jahr

LCMV X 1Jahr

Ektromelie X 1 Jahr

Polyoma X bei Verda ht

MTV X bei Verda ht

LDV X bei Verda ht

K-Virus X bei Verda ht

MNV X

1

Hantaviren

*

X

MHV68 X

Ratte

Sendai X 3Monate

RPV X 3Monate

RCV X 3Monate

PVM X 3Monate

KRV X 3Monate

H-1 X 3Monate

Reo3 X 1 Jahr

MAdV-2 X 1 Jahr

MAdV-1 X 1 Jahr

Hantaviren

*

X 1Jahr

TMEV X bei Verda ht

LCMV X bei Verda ht

RMV X

2

HEV X

*

Es gibt zwei Serogruppen, die relevant sein könnten

1

HSU 2009

2

WAN et al. 2002

9


die Eins hleppung von Krankheitserregern z. B. dur h biologis he Materialien, zugekauf-

te oder eingedrungene Tiere oder au h dur h das Personal immer no h mögli h sind

(NICKLAS et al. 2002).

3.3. Infektionsüberwachung von Versuchstierbeständen

Bei biologis hen Materialien oder bei Tieren, die neu in den Bestand kommen sollen,

wird in letzter Zeit verstärkt die PCR bzw. die Multiplex-PCR (REDIG u. BESSELSEN

2001; NICKLAS et al. 2002; SCHMITT et al. 2006) eingesetzt, weil es in diesen Fällen

auf das Vorhandensein von replikationsfähigem Virus ankommt und ni ht darauf, ob zu

einem früheren Zeitpunkt eine Infektion vorlag. Bei der eigentli hen Bestandsüberwa-

hung ist aber wi htiger, ob eine Infektion im Bestand kursiert. Deshalb ist hierfür der

Antikörperna hweis von ents heidender Bedeutung (NICKLAS et al. 2002).

3.3.1. Vorgehensweise

Es wird zur Bestandsüberwa hung in regelmäÿigen Abständen eine aussagekräftige An-

zahl von Sti hproben genommen, die auf das Vorhandensein von Antikörpern untersu ht

werden. Die FELASA empehlt eine Untersu hung von min. zehn Tieren pro Einheit.

Eine Einheit ist in diesem Fall ein in si h ges hlossener Haltungsberei h wie z. B. eine

Barriere.

Damit si h die Aussagekraft der Sti hprobe darstellt, wie in den unten stehenden Bei-

spielen gezeigt (Tab. 3.2), müssen vier Voraussetzungen erfüllt sein:

• Es muss eine ges hle htsunabhängige Verteilung der Infektion vorliegen.

• Die Verteilung der Infektion im Bestand muss zufällig sein.

• Die für die Sti hprobe bestimmten Tiere müssen zufällig ausgewählt werden.

• Die zu untersu hende Einheit muss min. 100 Tiere umfassen.

In Abhängigkeit von der Prävalenz des Agens kann si h bei dieser Sti hprobengröÿe das

Kondenzlevel für die Detektion der Infektion verändern (NICKLAS et al. 2002).

10

3.3. Infektionsüberwa hung von Versu hstierbeständen

Tabelle 3.2. Notwendige Sti hprobengröÿe in Abhängigkeit von Prävalenz und Kondenzle-

vel

Prävalenz [% Sti hprobengröÿe

bei unters hiedli hen

Kondenzlevels

95 99 99,90

10 29 44 66

20 14 21 31

30 10 13 20

40 6 10 14

50 5 7 10

3.3.2. Multiplex-Serologie (MS)

Die MS wird seit a. 12 Jahren für diagnostis he Zwe ke beim Mens hen eingesetzt

(TEMPLIN et al. 2004). Die Te hnologie ist besonders geeignet für das simultane Über-

prüfen des Serostatus für eine groÿe Erregeranzahl. Seroepidemiologis he Studien mit

groÿen Anzahlen zu testender Personen sind damit ezient dur hzuführen (WATER-

BOER et al. 2005).

Multiplex-Serologie in der Nagerdiagnostik

Au h für das Health monitoring von Nagerbeständen eignet si h die MS besonders gut.

Die Mögli hkeit, mit nur sehr geringen Serummengen zu arbeiten, ist hier besonders

von Vorteil, denn so werden au h serologis he Tests für lebende Tiere ermögli ht. In

diesem Berei h der MS-Anwendung wurde bislang wenig publiziert, da die entwi kelten

Systeme hauptsä hli h kommerziell zur Anwendung kommen (HSU et al. 2005; HSU et

al. 2007). Die zwei führenden Labors in diesem Berei h haben parallel jeweils eine MS für

die Viren aufgebaut (CHARLESRIVER 2007; RADIL 2011). Hierbei wiegt der Na hteil

s hwer, dass die Anwendung eines sol hen fertig gekauften Systems für kleine Labors

uners hwingli h ist. Dieses Verfahren amortisiert si h erst ab einer hohen Anzahl von

Proben; die Einsendung von Proben dagegen bleibt genau so teuer, wie es bisher für die

traditionellen serologis hen Tests war. Kleine Labors verblieben deshalb bisher bei den

sehr aufwändigen klassis hen Untersu hungsmethoden wie z. B. ELISA, IFA und HAH.

Zur Bestätigung wird häug trotz des hohen Aufwands der Immunoblot verwendet,

weil er sehr sensitiv und spezis h ist (NICKLAS et al. 2002).

11


Multiplex-Serologie mit GST-Fusionsproteinen

Bisherige MS-Systeme nutzen entweder ganze, aufgereinigte Viruspartikel oder rekom-

binante His-tagProteine, die kovalent an die Trägeroberä he gekoppelt werden (HSU

et al. 2007). Dieses Verfahren hat den Na hteil, dass die Aufreinigung der Viruspar-

tikel oder der Proteine sehr aufwändig ist. Deshalb wurde für diese Arbeit min. ein

GST-Fusionsprotein für jedes Virus hergestellt. Mittels des GST-Teils kann eine A-

nittätsbindung zu Glutathion für eine in situ-Aufreinigung genutzt werden (Abb. 3.1)

(WATERBOER et al. 2005).

Die Beads werden in groÿem Maÿstab kovalent mit Glutathion-Casein gekoppelt und

ans hlieÿend na h Bedarf mit dem Antigen beladen (WATERBOER et al. 2005). Diese

Vorgehensweise wurde bereits häug erfolgrei h für groÿe epidemiologis he Studien beim

Mens hen verwendet (MICHAEL et al. 2008; GAO et al. 2009; MICHEL et al. 2009).

Luminex AnalyzerBild von: www.luminexcorp.com

Polystyrolbeads (5.6 µm)

Serumantikörper

Biotinylierter Sekundärantikörper

GST-tag Fusionsprotein

Glutathion-Casein

Streptavidin-R-Phycoerythrin

Bead

Casein

Abbildung 3.1. Funktionsweise der MS mit GST-Fusionsproteinen

12

3.4. Viren

3.4. Viren

Die relevanten Viren bei Maus und Ratte umfassen ein breites Spektrum von vers hie-

denen DNA- und RNA-Viren (Abb. 3.2) (FRÖHLICH et al. 2001; BÜCHEN-OSMOND

2003; MODROW et al. 2010).

Viren

DNARNA

segmentiert nicht segmentiert

ReoviridaeReoviren (Reo)

Rotaviren (Rota A)

CoronaviridaeMHV

RCV/SDAV

ParamyxoviridaePVMSeV

ParvoviridaeRPVRMV

H-1 PVKRVMVM

MPV-1/2

HerpesviridaeMuHV-1 (MCMV)MuHV-3 (MTV)

MuHV-4 (MHV68)

ArteriviridaeLDV

ArenaviridaeLCMV

BunyaviridaeHantaviren

(PUUV, HTNV)

PicornaviridaeTMEVEMCV

CaliciviridaeMNV

PoxviridaeECTV

AdenoviridaeMAdV-1 (FL)MAdV-2 (K87)

PolyomaviridaeMPyV (Polyoma)MPtV (K-Virus

HepeviridaeHepatitis-E-likeVirus (rat HEV)

behüllt behüllt behülltunbehüllt unbehüllt unbehüllt unbehüllt

einzelsträngig doppelsträngig

Abbildung 3.2. Taxonomis he Einteilung der Viren, gegen die Antikörper in der inner-

halb dieserArbeit entwi kelten MS na hgewiesen werden können (mit Aus-

nahme von MuHV-3 und MAdV-2)

Die ozielle Nomenklatur der Viren ist der ICTVDatenbank (BÜCHEN-OSMOND

2003) entnommen. Sie steht im Folgenden immer in Anführungszei hen. In einigen Fäl-

len wird aus Gründen der Vereinfa hung und besseren Unters heidbarkeit im weiteren

Verlauf dieser Arbeit davon abgewi hen.

Auf die vers hiedenen viralen Proteine wird in dieser Arbeit nur eingegangen, wenn

sie für die Antigenauswahl eine Rolle spielten. Indirekt kann auf die Komplexität des

13


Proteoms über die stets angegebene Genomgröÿe ges hlossen werden.

14

3.4. Viren

3.4.1. DNA-Viren

Murine Polyomaviren

Die Polyomaviridae der Maus umfassen zwei Vertreter, die si h genetis h und serologis h

stark unters heiden (BOND et al. 1978). Das Murine polyomavirus (MpyV, im Folgen-

den Polyoma genannt zur besseren Abgrenzung gegenüber MPtV,) wurde 1953 erstmals

von Ludwik Gross bes hrieben (GROSS 1953). Das Murine pneumotropi virus (MPtV,

au h K-Virus genannt) wurde im glei hen Jahr bes hrieben (KILHAM u. MURPHY

1953). Namensgebend für die Polyomaviren war die Feststellung, dass na h Inokulation

von neugeborenen Mäusen mit Polyoma in vers hiedenen Organen Tumore entstehen

(GROSS 1953; STEWART et al. 1958). Das K-Virus wirkt jedo h ni ht tumorinduzie-

rend.

Das Polyomavirus-Genom (4700-5400 bp) liegt als zirkulärer DNA-Doppelstrang vor

(MODROW et al. 2010). Polyomaviren haben ein ikosaedris hes Kapsid ohne Hüll-

membran. Das Kapsid ist aus VP1, VP2 und VP3 zusammengesetzt, wobei VP1 die

Hauptkomponente darstellt. VP2 und VP3 kommen nur in sehr geringen Mengen vor

und sind wi htig für das geordnete Zusammenfügen der 72 penta- und hexavalenten

VP1-Pentamere (T. S. BAKER et al. 1989) zu intakten Kapsiden, die Bestandteil ei-

nes infektionsfähigen Virions sind. Es ist bereits ein VLPELISA (VISCIDI u. CLAY-

MAN 2006) und au h ein HAH (BACHMANN u. ZINKERNAGEL 1997) bes hrieben.

In Untersu hungen zur Pathologie von K-Virus wurden als Hauptort der Virusreplikati-

on pulmonale vaskuläre Endothelzellen und in geringerem Ausmaÿ Zellen, wel he die

Lebersinusoide umgeben, bes hrieben. Die Infektion mit K-Virus führt na h oraler, intra-

nasaler, intrakranialer und intraperitonealer Inokulation zu einer fatalen interstitiellen

Pneumonie. In Tieren, wel he die akute Phase der Infektion überleben, persistiert das

Virus trotz zirkulierenden Antikörpern in vers hiedenen Organen (GREENLEE 1979,

1983).

Zei hen einer Infektion dur h Polyoma sind Kümmern von Neugeborenen, Paralysen,

Polyarteritis, Hydro ephalus und Autoimmunerkrankungen (BENJAMIN 2007). Inter-

aktionen mit Versu hsergebnissen sind auf vielfältige Weise mögli h, aber in den letz-

ten Reviews ni ht mehr erwähnt (BAKER 1998; NICKLAS et al. 1999; D.G. BAKER

2003).

15


Als serologis he Tests nden jeweils für beide Viren getrennt der HAH, die IFA und der

ELISA Anwendung in der Diagnostik. K-Virus lässt si h nur s hwer kultivieren, deshalb

wird hier der HAH mit Virionen aus Organmaterial dur hgeführt.

In Mauskolonien wurden die beiden murinen Polyomaviren in den letzten Jahren kaum

no h na hgewiesen. In Nordamerika und Europa waren 0,02% der a. 80 000 unter-

su hten serologis hen Proben positiv für Polyoma und keine war positiv für K-Virus

(PRITCHETT-CORNING et al. 2009). In der letzten europäis hen Untersu hung konn-

te bei keinem der eingesendeten Seren Antikörper gegen eines der beiden Polyomaviren

na hgewiesen werden. (MÄHLER u. KÖHL 2009). Ebenso wurden keine Antikörper in

Mäusen aus dem Zoofa hhandel (DAMMANN et al. 2011) na hgewiesen. Bei der Un-

tersu hung von wilden Mus mus ulus in Nordengland wurden keine Antikörper gegen

Polyoma gefunden (BECKER et al. 2007), auf Antikörper gegen K-Virus wurde ni ht

getestet.

Die beiden Viren sind antigenetis h weit von einander entfernt. Bond bes hrieb fehlende

Kreuzreaktionen in IFA, Neutralisationstest oder HAH (BOND et al. 1978), die von

Tegerstedt in einem VP1VLPELISA aber ni ht beoba htet wurden. (TEGERSTEDT

et al. 2003). Polyoma und K-Virus umfassen jeweils nur einen Serotyp.

Experimentelle Infektionen von Ratten (VANDEPUTTE et al. 1970) sowie Infektionen

von Rattenzellen (SEIF u. CUZIN 1977; TREISMAN et al. 1981; ASSELIN u. BASTIN

1985) sind mögli h. Die einzigen Hinweise auf das Vorkommen von Polyomaviren bei der

Ratte als natürli he Infektion (WARD et al. 1984a) sind s hon sehr alt und betreen nur

immunsupprimierte Tiere. Weitere Hinweise auf Polyomaviren bei der Ratte gibt es ni ht.

Ratten werden deshalb übli herweise ni ht auf Polyomavirus-Infektionen untersu ht.

Murine Adenoviren

Die murinen Adenoviridae Murine adenovirus 1 (MAdV-1, MAdFL) und Muri-

ne adenovirus 2 (MAdV-2, MAdK87) (LUSSIER et al. 1987) gehören dem Genus Ma-

stadenovirus an (BÜCHEN-OSMOND 2003). In der versu hstierkundli hen Literatur

werden sie meist als MAdVFL und MAdVK87 bezei hnet (SPINDLER et al. 2007).

Adenoviren haben ein doppelsträngiges, lineares DNA-Genom (36 000-38 000 bp), wel-

hes von einem Kapsid ohne weitere Hülle umgeben ist. Die Flä hen des ikosaedris hen

Kapsids bestehen aus dem Hexon-Protein. Das Fiber-Protein bildet Projektionen an

den zwölf E ken (MODROW et al. 2010). Die bekannten Assays (IFA oder ELISA)

16

3.4. Viren

verwenden immer Virionen. Für die Adenoviren gibt es wenig Literatur bezügli h der

antigenetis hen Eigens haften vers hiedener Proteine. MAdV-1 wurde erstmals als Kon-

tamination in biologis hem Material bes hrieben (HARTLEY u. ROWE 1960). Wenig

später wurde in Japan MAdV-2 aus dem Kot einer gesunden Maus isoliert (HASHIMO-

TO et al. 1966).

Beide Viren werden oral aufgenommen. MAdV-1 wird hauptsä hli h über den Urin aus-

ges hieden (VANDERVEEN u. MES 1973). MAdV-2 hat einen Tropismus nur für Dar-

mepithel und wird über den Kot ausges hieden. Inzierte Tiere entwi keln intranukleäre

Eins hlüsse in Enterozyten (TAKEUCHI u. HASHIMOTO 1976).

MAdV-1 und -2 verursa hen keine klinis hen Symptome in adulten, immunkompetenten

Mäusen. Na h experimenteller Infektion von ni ht abgesetzten Mäusen entwi kelt si h

aber ein fataler Krankheitsverlauf (HECK et al. 1972; WIGAND 1980). Makroskopis he

pathologis he Veränderungen sind na h natürli her Infektion ni ht zu beoba hten.

Einüsse auf experimentelle Ergebnisse erstre ken si h vor allem auf Versu he, die das

ZNS, die Nieren und den Gastrointestinaltrakt betreen (BAKER 1998).

Die Prävalenz für MAdV-1 und MAdV-2 in den USA wurde 2009 mit 0,02% der in

ein kommerzielles Diagnostiklabor eingesendeten Proben angegeben. In Europa wurden

Antikörper in 0,22% der Proben gefunden (PRITCHETT-CORNING et al. 2009). 2007

bis 2008 wurden Antikörper gegen Adenoviren in Westeuropa in weniger als 1% der

eingesendeten Proben na hgewiesen (MÄHLER u. KÖHL 2009). Wel hes Antigen in

beiden Studien verwendet wurde, ist ni ht bekannt.

MAdV-1 und MAdV-2 umfassen jeweils einen Serotyp. Für serologis he Tests ist eine

einseitige Kreuzreaktion bes hrieben worden (WIGAND et al. 1977). Seren von Tieren,

die mit MAdV-1 inziert waren, reagieren au h mit MAdV-2, jedo h ni ht umgekehrt.

Allerdings wurde au h publiziert, dass die Seren inzierter Tiere in serologis hen Tests

entweder mit dem einen, dem anderen oder mit beiden Viren reagierten (SMITH et al.

1986), weshalb in der Regel beide Viren als Antigene eingesetzt werden. CR nutzt für

die Serologie mittels ELISA oder MFIA ein Mis hantigen (Rajeev Dhawan, persönli he

Kommunikation). Neben dem ELISA ist au h die IFA ein gängiger Test zum Na hweis

von Adenoviren. Murine und humane Adenoviren sind serologis h miteinander verwandt

(HARTLEY u. ROWE 1960).

17


Inzwis hen wurde ein weiteres murines Adenovirus in Apodemus argrarius gefunden

(MAdV-3) (KLEMPA et al. 2009), wel hes allerdings no h ni ht in Tierhaltungen na h-

gewiesen wurde. Experimentelle Infektionen von Mus mus ulus waren s hon erfolgrei h

(COMPTON 2010).

Adenovirus seropositive Ratten wurden mehrfa h beri htet (WARD u. YOUNG 1976;

FELDMANN u. EASTON 2006), obwohl die experimentelle Infektion von Ratten mit

MAdV-1 und MAdV-2 au h s hon fehlges hlagen ist (A.L. SMITH u. BARTHOLD

1987).

In der Vergangenheit wurden Antikörper gegen Adenoviren bei Ratten häuger na hge-

wiesen als bei Mäusen (SMITH et al. 1986). Die aktuellen Angaben zur Seropositivität

bei Maus und Ratte sind sehr ähnli h. In den USA waren 0,06% der eingesendeten Rat-

tenseren positiv, während es in Europa 0,16% waren (PRITCHETT-CORNING et al.

2009). In einer anderen Untersu hung wurden Antikörper gegen MAdV-1 und MAdV-2

ni ht gefunden (MÄHLER u. KÖHL 2009).

Murine Herpesviren

Insgesamt sind sieben murine Herpesviridae bekannt, wovon aber nur vier Mus mus u-

lus oder Rattus norwegi us inzieren (MuHV-1, MuHV-2, MuHV-3 und MmusRHV1).

Bei einem weiteren Virus (MuHV-4) ist das Wirtsspektrum no h unklar. Es sind viele

vers hiedene aus Wildmäusen und -ratten gewonnene Isolate der einzelnen Spezies be-

s hrieben, deren serologis hes Verhalten ungeklärt ist (EHLERS et al. 2007b). Herpesvi-

ridae verfügen über ein lineares, doppelsträngiges DNA-Genom (120 000 bis 230 000 bp)

in einem ikosaedris hen Kapsid und ist von einer Hüllmembran umgeben. Der Raum

zwis hen Hüllmembran und Kapsid wird vom Tegument ausgefüllt (MODROW et al.

2010).

Murid herpesvirus 1 (MuHV-1) Das Murid herpesvirus 1 (MuHV-1) häug au h

Mouse ytomegalovirus 1 (MCMV-1) genannt wurde erstmalig 1954 von Margaret

Smith isoliert (M. G. SMITH 1954). Es gehört innerhalb der Familie Herpesviridae zum

Genus Muromegalovirus und zur Unterfamilie Betaherpesvirinae (BÜCHEN-OSMOND

2003). Wegen des komplexen Proteoms sollen an dieser Stelle nur einige bekannte immu-

nogene Proteine aufgeführt werden. Das GlykoproteinH (UL75), das Phosphoprotein 150

(UL32) sowie das GlykoproteinB (UL55) von MuHV-1 sind als immunogen bekannt. Die

18

3.4. Viren

homologen Proteine des humanen Cytomegalievirus (HCMV) kommen als serologis he

Assays beim Mens hen zum Einsatz (MOCARSKI et al. 2007). UL55 ist zudem in ex-

perimentellen Subunit-Va inen für den Mens hen enthalten. Gegen das UL75 ri hten

si h therapeutis he monoklonale Antikörper (MOCARSKI et al. 2007, S. 2679). Die Be-

zei hnung mit den Bu hstaben UL (unique left) bezieht si h hierbei auf den Ort des

ORF im Genom. Aus Platzgründen wird im Folgenden diese Bezei hnung au h für das

Protein verwendet. Die beiden Glykoproteine gB (UL55) und gH (UL75) benden si h

in der Hülle des Virions, während die Phosphoproteine wie das pp150 (UL32) im Tegu-

ment oder andere in der Matrix als Strukturproteine fungieren (ROIZMAN et al. 2001,

S .2679).

MuHV-1 wird relativ intensiv erfors ht, da es viele Parallelen zu HCMV aufweist und

daher als Modell für mens hli he Infektionen dient. MuHV-1 zeigt einen sehr engen

Wirts- und Organotropismus; es inziert nur die Maus und bei dieser hauptsä hli h

die Spei heldrüse, insbes. die Glandula submandibularis (man hmal au h als Glandu-

la submaxillaris bezei hnet) (SHALLAM et al. 2007; KERCHER u. MITCHELL 2002;

LENZO et al. 2002). Hauptübertragungsweg ist virushaltiger Spei hel (BAKER 1998).

Die Infektionen sind persistent und latent in immunkompetenten Tieren. Neugeborene

dagegen sind anfälliger für eine klinis he Infektion, während der Organotropismus bei

ihnen weniger stark ausgeprägt ist (SHALLAM et al. 2007). Der Einuss des Virus auf

Experimente ist vielfältig: Antikörper- und Interferonproduktion werden verringert, die

MajorHisto ompatibilityComplex (MHC) Klasse 1-Antigenpräsentation ist verringert,

ebenso die Anzahl der CD4¯-Lymphozyten in bron hoalveolärer Lavageüssigkeit. Das

Virus verändert die Lymphozytenproliferation, die zytotoxis he Lymphozytenantwort

und die Abstoÿung allogener Hauttransplantate. Auÿerdem ist die Fru htbarkeit herab-

gesetzt. Es entwi kelt si h eine Thrombozytopenie, und die normale kardiale Verkalkung

bei BALB/ Mäusen kann si h vers hlimmern (BAKER 1998).

Die Prävalenz von MCMV in Versu htierhaltungen ist gering. Das Auftau hen des Vi-

rus in Versu hstierhaltungen ist sehr unwahrs heinli h, sofern Wildtiere keinen Zugang

nden. So sind in den letzten Jahren in Europa keine neuen Fälle mehr bekannt gewor-

denen (MÄHLER u. KÖHL 2009; PRITCHETT-CORNING et al. 2009). In den USA

waren ledigli h 0,04% der eingesendeten Proben seropositiv für MuHV-1 (PRITCHETT-

CORNING et al. 2009). Hingegen wurden in Australien bei annähernd 100% der Wild-

mäuse Antikörper gegen MuHV-1 gefunden (SMITH et al. 1993b; MORO et al. 1999),

in England bei immerhin 79% (BECKER et al. 2007). Es wurden bisher keine unter-

19


s hiedli hen Serotypen bes hrieben (SHALLAM et al. 2007).

Die übli hen Methoden zur serologis hen Diagnostik sind VirionELISA und IFA (MÄH-

LER u. KÖHL 2009; PRITCHETT-CORNING et al. 2009).

Murid herpesvirus 2 (MuHV-2) Das Murid herpesvirus 2 (MuHV-2) au h

Rat ytomegalovirus (RCMV) genannt ist 1982 bes hrieben worden (BRUGGE-

MAN et al. 1982). Es zählt zur Unterfamilie Betaherpesvirinae. Die Infektion von

Ratten mit diesem Virus ist von wissens haftli hem Interesse, da der Verlauf dem der

HCMV-Infektion ähnelt und für diese als weiteres Tiermodell dient (STALS et al.

1990). Seine Rolle als potentielle Kontamination in Versu htierhaltungen ist in der

Vergangenheit nie erwähnt worden. Aus diesem Grund untersu hen andere Labors na h

unserem Kenntnisstand ni ht auf dieses Virus, und es wurde au h in den bekannten

Prävalenzstudien ni ht aufgeführt (MÄHLER u. KÖHL 2009; PRITCHETT-CORNING

et al. 2009).

Diagnostis h wurde ein ELISA für experimentell inzierte Tiere als sehr sensitiv be-

s hrieben (KRINKE 2000).

Murid herpesvirus 3 (MuHV-3) Das Murid herpesvirus 3 (MuHV-3) häug au h

Mouse thymi virus (MTV) genannt ist keinem Genus zugeordnet (BÜCHEN-

OSMOND 2003). Von diesem Virus ist no h keine Sequenz publiziert worden. Es ist

ni ht in Zellkultur anzü htbar; die Vermehrung für serologis he Tests muss also in vivo

stattnden (SHALLAM et al. 2007). Ratten werden ni ht von MuHV-3 inziert (LIND-

SEY et al. 1991).

MuHV-3 umfasst einen einzigen Serotyp. Kreuzreaktionen mit anderen Herpesviren sind

ni ht bekannt. Serologis he Tests zum Na hweis von MuHV-3 sind IFA und ELISA

(MÄHLER u. KÖHL 2009; PRITCHETT-CORNING et al. 2009). In der letzten Unter-

su hung zur Prävalenz wurden keine positiven Seren für MuHV-3 in Europa gefunden

(MÄHLER u. KÖHL 2009).

Murid herpesvirus 4 (MuHV-4) Das Murid herpesvirus 4 (MuHV-4 häug au h Mu-

rid herpesvirus 68 (MHV-68) genannt ist der Prototyp einer Gruppe von eng miteinan-

der verwandten Gammherpesvirinae. Infektionen mit MuHV-4 werden als Stellvertreter

für diese Unterfamilie häug als Modell verwendet (BLASDELL et al. 2003). Trotzdem

20

3.4. Viren

ist bisher über Wirtsspektrum, Epizootiologie und Pathogenese bei natürli hen Infek-

tionen wenig bekannt.

Antigenetis hwi htige Proteine sind hier das GlykoproteinD (UL27) und das Hauptge-

rüstprotein für die Kapsidformation UL26.5.

Natürli he Wirte sind die Rötelmaus (Myodes glareolus) (FRANÇOIS et al. 2010) und

Apodemus spe . (BLASDELL et al. 2003; EHLERS et al. 2007a). Aus Mus mus ulus

oder Ratten wurde dieses Virus bisher no h ni ht isoliert (FRANÇOIS et al. 2010). Sys-

tematis he Untersu hungen zum Vorkommen dieses Virus in Labortierhaltungen wurden

bisher ni ht dur hgeführt (BIODOC 2011; CHARLESRIVER 2011; RADIL 2011). Se-

rologis he Tests für MuHV-4 sind IFA (BLASDELL et al. 2003) und ELISA (B.J. LEE

et al. 2000).

Mus musculus rhadinovirus 1 (MmusRHV1) Das zu den Gammaherpesvirinae gehö-

rende Virus Mus mus ulus rhadinovirus 1 (MmusRHV1) wurde 2007 bes hrieben (EH-

LERS et al. 2007a). Es wurde aus wildlebendenMus mus ulus isoliert. Die Bedeutung für

Labortiere ist unklar. Untersu hungen zum Vorkommen dieses Virus bei Labormäusen

sind ni ht bekannt (CHARLESRIVER 2007; BIODOC 2011; RADIL 2011).

Ectromelia virus

Das E tromelia virus (ECTV) gehört wie das Kuhpo kenvirus Cowpox virus, das

Va inia virus (VACV) und au h das mens hli he Po kenvirus Variola virus zur

Familie Poxviridae, zur Subfamilie Chordopoxvirinae und zum Genus Orthopoxvirus

(BÜCHEN-OSMOND 2003). Sie alle zählen zu den gröÿten bekannten Viren und haben

eine ziegelsteinförmige bis pleomorphe Gestalt. Sie bestehen aus einem linearen, doppels-

trägigen DNA-Genom (137 000 bis 139 000 bp), einer Core-Struktur und sind umgeben

von einer Hüllmembran, in die über zwölf vers hiedene Proteine eingelagert sind.

Antigenetis h bedeutsam sind zwei Hüllproteine: das immundominante p35 (ZINOV'EV

et al. 1994) und das major envelope Protein (maj. env.) (Genbank, A .No. AM

501 482).

Für die Maus ist der Na hweis von Antikörpern gegen ECTV relevant für das Health

monitoring (Ni klas et al. 2002). Mit der VACVMS können aufgrund der groÿen se-

21


rologis hen Ähnli hkeit vermutli h Antikörper gegen alle Orthopoxviren na hgewiesen

werden (DOWNIE u. MCCARTHY 1950).

ECTV wurde erstmals in England bes hrieben (MARCHAL 1930). Ektromelie ist die

Erkrankung, die dur h ECTV verursa ht wird. Ni ht bei allen Erkrankungsformen tritt

die namensgebende Gliedmaÿenverstümmelung auf. Das Virus ist relativ wenig konta-

giös. Die Infektion erfolgt entweder über defekte Haut (Verletzungen oder Applikation

biologis her Materialien) oder aber dur h den Verzehr verstorbener Käggenossen. An-

dere Infektionswege spielen eine untergeordnete Rolle. Die Erkrankung kann si h in der

sogenannten viszeralen Form oder einer kutanen Form äuÿern (BHATT u. JACOBY

1987). Infektionen mit ECTV kommen in Versu hstiereinri htungen sporadis h immer

no h vor und wurden bei den letzten Ausbrü hen über kontaminiertes Mausserum in

Tierhaltungen einges hleppt (E. J. DICK, JR. et al. 1996; LIPMAN et al. 2000; LA-

BELLE et al. 2009). Symptome sind bei immunkompetenten Tieren in Abhängigkeit

vom Mausstamm unters hiedli h ausgeprägt. Man he Stämme zeigen keinerlei Sympto-

me (z. B.C57BL/6 und C57BL/10) (LINDSEY et al. 1991), in anderen Stämmen, vor

allem in Immundezienten rei ht das klinis he Bild von typis hen Hautläsionen bis zu

S hwellungen und Spontanamputationen von Gliedmaÿen (MARCHAL 1930). Patho-

logis he Veränderungen umfassen Milz-, Lymphknoten-, Thymus- und Lebernekrosen,

Dünndarms hleimhauterosionen und eosinophile oder basophile zytoplasmatis he Ein-

s hlüsse in Haut und Leber (LINDSEY et al. 1991).

Eine Infektion mit ECTV hat s hwere Auswirkungen auf fast alle Versu he mit Mäusen

(BAKER 1998).

Es wurden in den letzten Jahren in europäis hen Labortierhaltungen keine Antikörper ge-

gen ECTV mehr gefunden (MÄHLER u. KÖHL 2009). Mit 0,02% vereinzelt positiv wa-

ren no h Tiere in nordamerikanis hen Versu hstierhaltungen (PRITCHETT-CORNING

et al. 2009).

Vertreter des Genus Orthopoxvirus zeigen untereinander eine starke Kreuzreaktivität

(KITAMOTO et al. 1986). Po kenviren bieten die Mögli hkeit für einen Hämaggluti-

nationshemmtest. Die Virusvermehrung für diesen Test erfolgt auf der Chorioallantois-

membran von Hühnerembryonen (NAGLER 1944). Die serologis he Unters heidung der

vers hiedenen Virusspezies ist mögli h dur h Titration von Hühnerimmunseren auf in-

zierten Chorioallantoismembranen. In diesem Fall gibt es unters hiedli h hohe Kreuz-

neutralisation für ECTV, Variola-, Va inia- und Kuhpo kenvirus (DOWNIE u. MC-

22

3.4. Viren

CARTHY 1950). Für die serologis he Infektionsüberwa hung werden heute ELISA oder

indirekte Immunuoreszenz eingesetzt (BIODOC 2011; CHARLESRIVER 2011; RA-

DIL 2011). Für das serologis he S reening bei Nagern wird übli herweise das Va inia-

Virus als Antigen verwendet. Wegen des teilweise akuten Krankheitsverlaufes ist es von

ents heidender Bedeutung, dass bei Vorliegen von Krankheitssymptomen direkte Erre-

gerna hweise (z. B. PCR, Immun-Histopathologie) dur hgeführt werden (LIPMAN et al.

2000).

Ratten werden ni ht auf natürli hem Wege mit dem Ektromelie-Virus inziert, expe-

rimentelle Infektionen sind aber mögli h (JANDASEK 1968; BULLER et al. 1986).

Es wurden jedo h Fälle von Kuhpo ken bei der Ratte bes hrieben, die im Gegensatz

zu ECTV ein groÿes Zoonosepotential bergen (WOLFS et al. 2002). In mehreren Fäl-

len inzierten si h Besitzer von Haustierratten mit dem Kuhpo kenvirus mit zum Teil

s hweren Folgen (WOLFS et al. 2002; CAMPE et al. 2009; NINOVE et al. 2009). Im

Rahmen der Infektionsüberwa hung werden Ratten übli herweise ni ht auf Antikörper

gegen Po kenviren getestet (MÄHLER u. KÖHL 2009; PRITCHETT-CORNING et al.

2009).

Murine Parvoviren

Parvoviridae sind sehr kleine Viren [lat.parvus = klein mit einem einzelsträngigen DNA-

Genom, wel hes nur a. 5000 Basen umfasst. Die beiden Parvovirusspezies der Maus

(MVM und MPV) und die vier Spezies der Ratte (RPV, KRV, RMV und H-1PV) gehö-

ren alle dem Genus Parvovirus der Familie Parvoviridae an (BÜCHEN-OSMOND 2003).

Das Genom ist von einem ikosaedris hen Kapsid umgeben, wel hes aus 60 Kapsomeren

besteht, die zu 95% aus VP2 und zu 5% aus VP1 bestehen. VP2 ist sequenziden-

tis h mit dem arboxyterminalen Berei h von VP1. Das wi htigste Ni htstrukturprotein

NS1 fungiert als Endonuklease, Heli ase und als Transaktivator. Das NS1Gen ist ho h-

konserviert. Mutationen in diesem Gen führen häug zu replikationsdezienten Viren

(MODROW et al. 2010).

Parvoviren zei hnen si h dur h eine hohe Tenazität und eine Abhängigkeit von mito-

tis h aktiven Zellen aus (ROLLE u. MAYR 2007). Aus diesem Grund haben sie einen

starken Einuss auf das Wa hstum von Tumoren, was sie besonders interessant für die

Krebsfors hung ma ht (ROMMELAERE u. CORNELIS 1991).

23


Grundsätzli h sind IFA, HAH, Partikel ELISA und rekombinanter ELISA zur Detek-

tion von antiparvoviralen Antikörpern geeignet. Die IFA detektiert Antikörper gegen

alle Virusproteine eins hlieÿli h des konservierten NS1Proteins. Sie ist wenig spezis h

und detektiert Antikörper gegen alle bei Nagern vorkommenden Parvoviren; Antikörper

gegen das homologe Virus werden allerdings mit höherer Sensitivität angezeigt (BES-

SELSEN et al. 2000). Da einige Parvoviren (MPV, RMV) in vitro ni ht oder nur s hwer

angezü htet werden können, war der Einsatz von ELISA-Tests auf der Basis aufgereinig-

ter Viruspartikel nur für einige Vertreter mögli h. ELISA mit rekombinanten NS1- und

VP2Proteinen als Antigenen sind kommerziell erhältli h (z. B. von CR). Diese Proteine

werden s hon länger erfolgrei h diagnostis h genutzt (L.K. RILEY et al. 1996; BALL-

GOODRICH et al. 2002; SELETSKAIA 2004). Bei der Verwendung von rekombinant

hergestelltem NS1 werden Antikörper gegen das konservierte Ni htstrukturprotein de-

tektiert und somit Infektionen mit allen Parvoviren na hgewiesen. Dieser Test ist daher

sehr unspezis h und häug weniger sensitiv als die IFA oder der HAH (BESSELSEN

et al. 2000). ELISA, die rekombinante VP2Proteine der einzelnen Parvovirusspezies als

Antigene verwenden, weisen eine höhere Spezität auf (BALL-GOODRICH et al. 2002).

Am spezis hsten ist der HAH, bei dem keine Kreuzreaktionen vorkommen (BESSEL-

SEN et al. 2000). Er benötigt jedo h groÿe Virusmengen und ist deshalb bes hränkt auf

Viren, die in ausrei henden Mengen in vitro angezü htet werden können.

Parvoviren zählen immer no h zu den bei Labormäusen häug vorkommenden Infek-

tionen. In Europa sind 1,01% ParvovirusAntikörper positive Seren gefunden worden

(MÄHLER u. KÖHL 2009). In einer anderen Studie waren 1,65% aller Seren in den USA

und 1,92% in Europa NS1Antikörper positiv (PRITCHETT-CORNING et al. 2009).

Au h bei der Ratte sind Parvoviren immer no h sehr häug. 12,1% der Einsendungen

waren in Europa Parvovirus-Antikörper positiv (MÄHLER u. KÖHL 2009). Eine andere

Untersu hung zeigte 2% Seropositivität für NS1 in den USA und 3,34% in Europa

(PRITCHETT-CORNING et al. 2009).

Minute virus of mice (MVM)

Das Minute virus ofmi e (MVM) wurde erstmals 1966 als Kontamination eines Ade-

novirussto ks bes hrieben (CRAWFORD 1966). Dieses erste Isolat wurde später als

Prototyp-Stamm bezei hnet (MVMp). Ein weiteres Isolat (MVMi) wurde aus einer Lym-

phomzelllinie isoliert und wurde wegen immunsuppressiver Eigens haften in vitro als

24

3.4. Viren

MVMi bezei hnet (BONNARD et al. 1976). Die Infektion verläuft in der Regel asym-

ptomatis h in adulten Tieren. Dur h den Tropismus des Virus für mitotis h aktive Zellen

sind Föten besonders anfällig für S häden, die bis zum Tod führen können. MVM ist un-

ter natürli hen Bedingungen nur für die Maus infektiös, aber beispielsweise au h Ratten

sind empfängli h für eine Infektion während der fötalen Entwi klung oder na h parente-

raler Applikation (JACOBY u. BALL-GOODRICH 2007). In Experimenten können das

Immunsystem, die Myelopoese und das Wa hstum von As itestumoren gehemmt werden

(BAKER 1998).

Die Prävalenzen von Seren mit Antikörpern gegen MVMVP2 lagen in Europa bei 0,33%

und in den USA bei 0,46% (PRITCHETT-CORNING et al. 2009).

Mouse parvovirus (MPV)

Das Mouse parvovirus (MPV) wurde entde kt, als Seren aus Versu htiereinri htun-

gen ein positives IFA-Ergebnis mit MVM als Antigen bra hten, aber im spezis hen

MVMHAH negativ waren. Die erste Bes hreibung von MPV erfolgte als Zellkulturkon-

tamination (MCKISIC et al. 1993). Inzwis hen wurden weitere MPVStämme (MPV2 bis

MPV5) isoliert, die aber no h ni ht oziell anerkannt sind (BÜCHEN-OSMOND 2003).

MPV verursa ht bei natürli hen oder experimentellen Infektionen sogar in neugeborenen

oder immunsupprimierten Mäusen keine Symptome (A.L. SMITH et al. 1993a) und ist

nur für Mäuse infektiös (BESSELSEN et al. 2006).

Obwohl das Virus als Zellkulturkontamination vorkommen kann, ist die Anzü htung

dieses Virus in ausrei henden Mengen als Antigen für die Serologie sehr s hwierig.

In Experimenten verändert MPV Zellproliferationsprozesse, beeinträ htigt das Immun-

system und verändert Abstoÿungsreaktionen von Haut- oder Tumortransplantaten (BA-

KER 1998).

Die Serokonversion ist Mausstammabhängig. Für eine Infektion und Serokonversion bei

C57BL/6 sind z. B. höhere Virusdosen notwendig als bei anderen Mäusestämmen (BES-

SELSEN et al. 2000). Die MPV IFA und der MPVHAH sind sensitiver für die Detektion

von Antikörpern gegen MPV als der NS1ELISA und die MVMIFA (BESSELSEN et al.

2000).

25


Kilham rat virus (KRV)

Das Kilham rat virus (KRV) häug au h rat virus (RV) genannt wurde bei Versu-

hen mit Rattentumoren entde kt (KILHAM u. OLIVIER 1959; BÜCHEN-OSMOND

2003). Die Ratte ist der natürli he Wirt für KRV, es können aber au h Hamster, Mäuse

und Katzenwelpen experimentell inziert werden (KRINKE 2000). Zur Pathogenese von

Infektionen mit KRV gibt es viele Daten. Viele Faktoren wie z. B. der involvierte Virus-

stamm, der betroene Wirtsstamm, der Immunstatus und das Alter haben Einuss auf

den Ablauf einer Infektion. Neonaten können beispielsweise Tremor, Ataxie, Gelbsu ht,

öliges Fell und verzögertes Wa hstum zeigen. Tiere mit einem Alter ab vier Wo hen ha-

ben dagegen einen latenten Krankheitsverlauf und zeigen allenfalls eine vorübergehende

Beeinträ htigung der Zu htezienz. Wenn latent inzierte Tiere immunsupprimiert wer-

den, kommt es zu Symptomen; ebenso bei Tieren, die neu in eine enzootis h inzierte

Population kommen (COLEMAN et al. 1983).

H-1 parvovirus (H-1 PV)

Das H-1 parvovirus (H-1PV) au h Toolan'sH1 parvovirus) genannt wurde eben-

falls bei Experimenten mit Rattentumoren entde kt (TOOLAN et al. 1960; BÜCHEN-

OSMOND 2003). Der natürli he Wirt von H-1PV ist unklar, da das Virus au h in

mens hli hen Tumoren gefunden wurde. Hamster und ni hthumane Primaten konnten

experimentell mit H-1PV inziert werden.

Rat parvovirus (RPV)

Das Rat parvovirus 1 (RPV-1) (BÜCHEN-OSMOND 2003) wurde anfängli h als

Rat orphan parvovirus bezei hnet (BALL-GOODRICH et al. 1998). Der natürli he

Wirt ist die Ratte. Hamster und Mäuse sind ni ht empfängli h (UENO et al. 1997).

Rat minute virus (RMV)

Das Ratminute virus 1 (RMV-1) (BÜCHEN-OSMOND 2003) ist das zuletzt entde kte

Parvovirus der Ratte (WAN et al. 2002).

26

3.4. Viren

3.4.2. RNA-Viren

Murine Picornaviren

Zwei Spezies der Pi ornaviridae inzieren Maus und Ratte. Sie gehören dem Genus Car-

diovirus an. Die Speziesbezei hnungen sind En ephalomyo arditis virus (EMCV) und

Theiler'smurine en ephalomyelitis virus (TMEV) (BÜCHEN-OSMOND 2003). Die Vi-

ruspartikel bestehen aus einem positiv orientierten RNA-Einzelstrang ( a. 7000 bis 8500

Basen) und einem unbehüllten ikosaedris hen Kapsid. Die 60 Kompartimente, aus denen

das Kapsid zusammengesetzt ist, bestehen zu glei hen Teilen aus VP1, VP2 und VP3

(MODROW et al. 2010). Das Ni htstrukturprotein 3ABC wird in vivo na h der Transla-

tion gespalten. Der ungespaltene Komplex hat si h als ELISA-Antigen in der Diagnostik

der Maul- und Klauenseu he (ebenfalls ein Pi ornavirus) bewährt (DEDIEGO et al.

1997).

Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV)

Erstmals wurde Theiler'smurine en ephalomyelitis virus (TMEV) au h Theilovirus

genannt als viraler Auslöser von Enzephalomyelitis bes hrieben (THEILER 1934).

Mus mus ulus ist der natürli he Wirt für TMEV (LIPTON et al. 2001). Der natürli he

Infektionsweg zwis hen Mäusen ist fäko-oral; Ratten sind empfängli h für intrazerebrale

Inokulation (RODRIGUES et al. 2005). Eine natürli he Infektion von Ratten kommt

ni ht vor, allerdings wurde ein ähnli hes Virus, das Theiler-like virus, au h von Rat-

ten isoliert (OHSAWA et al. 2003). Später wurde dieses Virus Rat theilovirus (RTV)

genannt (DRAKE et al. 2008). Im Gegensatz zu TMEV sind Mäuse und au h Ratten

aber von diesem ni ht experimentell intrazerebral inzierbar (HEMELT et al. 1974).

Die Symptomatik von TMEVInfektionen bei Mäusen ist meistens unauällig (PERCY

u. BARTHOLD 2007); Alter, Genetik und Inokulationsroute spielen hierbei eine ent-

s heidende Rolle. Typis he Symptome sind eine s hlae Lähmung der Hinterbeine. Die

TMEV induzierte Demyelinisierung wird als Modell in der Multiple Sklerose-Fors hung

häug verwendet (TSUNODA u. FUJINAMI 1996; MCMAHON et al. 2005). Die In-

fektion von Versu hstieren mit TMEV kann vielfältige Auswirkungen haben. Über die

Eekte auf das Immunsystems und damit au h auf Infektionsversu he mit anderen Vi-

ren hinaus (LINDSEY et al. 1991) wird die Ges hwindigkeit der Reizleitung in Nerven

27


herabgesetzt und das ZNSbetreende Versu he werden beeinträ htigt (IULIANO et al.

1994; BAKER 1998).

Das Vorkommen von TMEV bei Wildmäusen ist gering. So wurde in einer US-

amerikanis hen Untersu hung in 52 wilden Mäusen nur ein einziges seropositives Tier

gefunden (S. E. PARKER et al. 2009).

In einer europäis hen Untersu hung zur Seroprävalenz in Versu hstieren lag das Vor-

kommen von TMEVAntikörpern bei in ein kommerzielles Labor eingesendeten Proben

bei unter 1% (MÄHLER u. KÖHL 2009). Eine weitere Studie fand 0,26% Seropositivi-

tät in den USA und 0,27% in Europa (PRITCHETT-CORNING et al. 2009).

Theiler GDVII ist der Stamm, der übli herweise zur Diagnostik bei der Maus verwen-

det wird. Alle bisherigen Isolate können entweder GDVII oder TO (Theiler'sOriginal),

zugeordnet werden. Beide Stämme gehören einer gemeinsamen Serogruppe an, zei hnen

si h aber dur h unters hiedli he Neurovirulenz aus (OLESZAK et al. 2004).

In der Diagnostik wurde häug der HAH verwendet, da das Virus mens hli he Typ 0-

Erythrozyten bei 4

C agglutiniert. Inzwis hen haben IFA und ELISA eine vorherrs hen-

de Stellung als serologis he Tests für TMEV.

Die meisten TMEVStämme wurden aus Mäusen isoliert. Das Isolat MHG stammt aus

der Ratte (MCCONNELL et al. 1964) und wurde s hon sehr früh gefunden. 2003 wurde

ein weiteres Isolat aus Ratten gewonnen, wel hes eine verglei hsweise geringe Verwandt-

s haft mit dem MHGStamm hat. Das neue Isolat wurde Theiler-like virus benannt

(OHSAWA et al. 2003). In den letzten Untersu hungen zur Prävalenz sind in Euro-

pa 0,14% (MÄHLER u. KÖHL 2009) bzw. 1,32% der eingesendeten Rattenseren An-

tikörper positiv gefunden worden, während in den USA die Prävalenz bei 1,43% lag


Die TMEVStämme der Ratte sind so kreuzreaktiv, dass sie au h mit TMEVGD7 als

Antigen z. B. in der IFA na hgewiesen werden können (PRITCHETT-CORNING et al.

2009)

Encephalomyocarditisvirus (EMCV)

Zur Spezies En ephalomyo arditis virus (EMCV) zählen unter anderem die Stäm-

me R, Columbia SKVirus, MausElberfeldVirus und Mengovirus (RACANIELLO 2007,

28

3.4. Viren

S. 797).

Erstmals wurde EMCV zu Beginn der 1940er Jahre bes hrieben als infektiöses Agens

von Labornagern (JUNGEBLUT u. DALLDORF 1943). Bes hreibungen von EMCV

bei anderen Spezies wie Rhesusaen und S himpansen folgten bald darauf (HELWIG u.

SCHMIDT 1945; G. W. DICK et al. 1948).

Na h Infektion entwi keln die Tiere Enzephalomyelitis und/oder Myokarditis (BURCH

et al. 1971) in Abhängigkeit vom Infektionsweg (TESH u. WALLACE 1978). Symptome

der Enzephalitis sind struppiges Fell, gekrümmte Haltung und s hlae Lähmung, ge-

folgt vom Tod (CRAIGHEAD 1966). Die Infektion ndet au h Anwendung als Modell

für Myokarditis und Diabetesmellitus (CRAIGHEAD u. MCLANE 1968; NOTKINS

1977).

Es gibt eine ganze Reihe mögli her Wirtsspezies, darunter Ratte, S hwein und Mens h

(LIPTON et al. 2007, S. 312), wobei die Ratte für die Infektion etwas empfängli her

ist als die Maus. Na h experimenteller Infektion verläuft die Krankheit meist fatal. In

den letzten Publikationen, die von Auswirkungen der Pathogene auf Versu he beri hten,

ist EMCV ni ht mehr aufgeführt (BAKER 1998; NICKLAS et al. 1999). In neueren

Untersu hungen zur Seroprävalenz bei Wild- oder Labormäusen ist das EMCV ebenfalls

ni ht mehr erwähnt (MÄHLER u. KÖHL 2009; PRITCHETT-CORNING et al. 2009).

Es sind bisher keine Ausbrü he des Virus in Versu htierhaltungen bes hrieben worden

(LIPTON et al. 2007, S. 312). Über die Unters heidung dieser Viren in Serogruppen

wurde ni hts beri htet.

Es gibt keine kommerziell erhältli hen Tests für EMCV. Im VirionELISA kreuzreagieren

TMEV und EMCV so stark, dass eine Aussage über die tatsä hli h involvierte Viruss-

pezies ni ht mögli h ist (LIPTON et al. 2007, S. 319).

Da dieses Virus praktis h ni ht mehr vorkommt, sind für die Ratte keine weiteren In-

formationen hinzuzufügen.

Murine norovirus

Das Murine norovirus (gebräu hli hes Akronym: MNV) gehört zum Genus Norovirus

in der Familie Cali iviridae (BÜCHEN-OSMOND 2003). Cali iviren sind unbehüllte

RNA Viren mit einem einzelsträngigen, positiv orientierten RNA-Genom ( a. 7000 bis

8000 Basen) mit einem ikosaedris hen Kapsid (MODROW et al. 2010). Die Spezies

29


Norwalk virus ist dem Genus Norovirus untergeordnet. MNV ist no h ni ht weiter

klassiziert, es gehört aber au h zum Genus Norovirus und ein struktureller und funk-

tionaler Analogies hluss ist damit gere htfertigt.

Das HauptkapsidproteinVP1 des Norwalk virus ist alleine in der Lage VLP zu formen

(JIANG et al. 1992). VLP des NorwalkVirus wurden au h s hon in serologis hen Tests

und epidemiologis hen Studien verwendet (GREEN et al. 1993).

MNV wurde erstmals 2003 bes hrieben (KARST et al. 2003). Es hat keinerlei zoonoti-

s hes Potential und Infektionen von Ratten (mit einer mögli hen Ausnahme, siehe unten)

sind ni ht bekannt. Derzeit sind immer no h viele Berei he in Labortierhaltungen mit

MNV inziert. (HENDERSON 2008). Die von kommerziellen Zü htern erhältli hen Tiere

sind kontrolliert und frei von MNV. Das Virus ist ho h kontagiös, aber die Dur hseu-

hungsrate ist stark von der Art der Haltung abhängig. Die hohe Tenazität kann man

si h beim Einsatz von Sentineltieren

1

zunutze ma hen, da eine eektive Übertragung des

Virus über gebrau hte Einstreu mögli h ist (MANUEL et al. 2008). Cir a 30% der zu

BioDo

2

eingesendeten Seren waren Antikörper positiv (MÄHLER u. KÖHL 2009).

Es sind inzwis hen viele Norovirusisolate der Maus bekannt, wel he alle dem glei hen

Serotyp angehören (THACKRAY et al. 2007). Für die Infektionsdiagnostik stehen eine

IFA, ein in-houseVirionELISA und ein MNVVP1CRELISA zur Verfügung.

Es gibt ledigli h einen Hinweis auf Ratten, die in einer MNVVP1MS seropositiv waren

(18 von 5000 Seren), von denen ausgehend aber weder das Virus isoliert werden konnte,

no h der Na hweis von Nukleinsäure gelang (HSU 2009).

Rat Hepatitis E-like virus

Es sind keine Hepeviridae bei der Maus bes hrieben worden.

2010 wurde bei der Ratte ein neues Hepevirus bes hrieben, ratHEV (Hepatitis E-

like virus). Es wurde aus wildlebenden Rattus norwegi us isoliert (JOHNE et al. 2010).

Die Hepeviren haben ein unbehülltes ikosaedris hes Kapsid aus 180 dimeren Kapsidpro-

teinen. Die RNA ( a. 7200 Basen) ist positiv orientiert und liegt als Einzelstrang asso-

ziiert mit dem Nukleokapsidprotein (N) vor (MODROW et al. 2010). Antikörper gegen

1

Anzeigertiere, die anstelle der eigentli h zu untersu henden Tiere zur Diagnostik verwendet werden,

wenn die eigentli h interessanten Tiere ni ht untersu ht werden können

2

kommerzielles Diagnostiklabor in Hannover

30

3.4. Viren

Hepatitis-E-Proteine wurden in den USA au h in Ratten na hgewiesen (FAVOROV et

al. 2000). Die Bedeutung für Versu hstierpopulationen ist bisher ebenso unklar wie das

zoonotis he Potential. Daten zum Vorkommen bei Laborratten liegen bisher ni ht vor.

(CHARLESRIVER 2007; BIODOC 2011; RADIL 2011). Der serologis hen Diagnostik

können ELISA oder IFA dienen.

Lactate dehydrogenase-elevatingvirus

Das La tate dehydrogenase-elevating virus (LDV) hat ein umhülltes Kapsid in sphäri-

s her Form (BÜCHEN-OSMOND 2003). LDV wurde im Zusammenhang mit einem An-

stieg der Laktatdehydrogenase (LDH) na h der Applikation von Tumorzellen in Mäuse

identiziert (V. RILEY 1968). Es gehört zum Genus Arterivirus, wel hes gemeinsam mit

dem Genus Coronavirus und weiteren Genera zur Ordnung Nidovirales gehört.

Das Genom besteht aus einem positiv orientierten, linearen, einzelsträngigen RNA-

Molekül ( a. 13 000 bis 16 000 Basen), wel hes mit dem N-Protein zu einem Nukleokapsid

assoziiert ist. Dieses wiederum ist umhüllt (MODROW et al. 2010). Nidovirales zei hnen

si h dur h eine poly istronis he Transkriptionsstrategie aus.

Es gibt vers hiedene LDV-Varianten (Quasispezies), die dur h eine hohe Mutationsrate

in Viruspools entstehen. Auÿerdem gibt es neuropathogene (z. B. LDV-C und LDV-v)

und ni ht neuropathogene Stämme (LDV-P und LDV-vx), die in den meisten Viruspools

nebeneinander vorkommen. Bei glei hzeitiger Infektion einer Zelle mit zwei vers hie-

den Stämmen kann homologe Rekombination stattnden (COUTELIER u. BRINTON

2007).

Mus mus ulus ist der natürli he Wirt von LDV (ROWSON u. MAHY 1975; LI et al.

2000). Nur Mäuse und primäre Mauszellen sind für die Infektion empfängli h. Daten über

Arteriviridae bei der Ratte liegen ni ht vor. LDV repliziert nur in einer Subpopulation

von Makrophagen, die unter anderem für den Abbau der Serum-Laktatdehydrogenase

verantwortli h sind. Es persistiert in Lymphknoten, Milz, Leber und Hoden (ANDER-

SON et al. 1995). Trotz einer spezis hen Immunantwort des Wirts etabliert si h eine

lebenslange Virämie (VANDENBROEK et al. 1997). Weitere Symptome und makro-

skopis he pathologis he Veränderungen sind in der Regel weder in immundezienten,

no h in immunkompetenten Tieren vorhanden, neuropathogene Stämme lösen aber in

man hen Mausstämmen Polioenzephalomyelitis aus. Aufgrund der lebenslangen Virämie

31


sind alle von einer einzelnen inzierten Maus gewonnen Proben mit diesem Virus konta-

miniert und werden au h bei na hfolgenden Passagen übertragen. LDV ist der häugste

Kontaminant von murinen biologis hen Materialien vers hiedenster Art (COLLINS JR

u. PARKER 1972; NICKLAS et al. 1993). Es sind vielfältige Einüsse auf Versu h-

sergebnisse bekannt. Häug sind Funktionen des Immunsystems verändert. (BAKER

1998).

LDV gelangt wegen seiner extrem niedrigen Kontagiosität in der Regel nur über Inoku-

lation inzierter biologis her Materialien in Tierhaltungen. Es wird selbst unter Käg-

genossen nur sehr s hwer übertragen (BAKER 1998). Unters hiedli he Serotypen sind

ni ht bes hrieben.

Diagnostis h wird übli herweise der fast pathognomonis he a. 10fa he Anstieg des

Plasma- oder Serumspiegels der Laktatdehydrogenase drei bis vier Tage na h Infektion

verwendet (LINDSEY et al. 1991). Eine Erhöhung der Laktatdehydrogenaseaktivität

kann au h dur h Hämolyse verursa ht werden und zu fals h positiven Reaktionen füh-

ren.

Antikörper-Untersu hungen wurden bisher kaum zur Diagnostik eingesetzt, da die Pro-

duktion einer ausrei henden Menge an Virionen für ELISA oder IFA bei auss hlieÿli-

her Infektion primärer Mauszellen bzw. lebenden Mäusen sehr aufwändig ist und au-

ÿerdem die Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen die Serologie beeinträ htigen

kann (LUSSIER 1991). Die Komplexe führen allerdings ni ht zu späterer Immunkom-

plexkrankheit. Die Infektion mit LDV kann zu unspezis hen Antikörpern führen, die

im ELISA au h an unbes hi htete Platten binden (CAFRUNY et al. 1986; HU et al.

1992).

Für Arteriviren sind diagnostis he Proteine bisher ni ht publiziert worden. Na h der

hier bes hriebenen Entwi klung des Antigens für die MS wurde bekannt, dass ein kom-

merzielles Diagnostiklabor in den USA einen rekombinanten Test auf Serumantikörper

für LDVVP1 bzw. N etabliert, wel her au h in einem Multiplex-Testsystem Anwendung

ndet (RADIL 2010).

Murine Coronaviren

Das Murine hepatitis virus (MHV) gehört mit dem Rat orona virus (RCV) zum Ge-

nus Coronavirus der Familie Coronaviridae (BÜCHEN-OSMOND 2003). Dabei handelt

32

3.4. Viren

es si h um behüllte Viren mit einem Nukleokapsid (bestehend aus N-Protein und Nukle-

insäure) mit pleomorpher bis sphäris her Gestalt. Die Nukleinsäure (27 000 bis 32 000 Ba-

sen) besteht aus unsegmentierter, positiv orientierter einzelsträngiger RNA (MODROW

et al. 2010). Die wi htigsten Stämme, wel he bei der Maus vorkommen, sind MHV-A59,

MHV-3, MHV-S, und MHV-1.

Bei der Ratte wurden das Sialoda ryoadenitis virus (SDAV), Rat oronavirus (RCV)

und Causative agent of rat sialoadenitis (CARS) bes hrieben (KRINKE 2000), von

der ICTV ist aber ledigli h das Rat oronavirus mit dem Akronym RCV anerkannt

(BÜCHEN-OSMOND 2003).

Das N-Protein zeigte im experimentellen Ansatz vergli hen mit dem S- und dem M-

Protein die gröÿte Tendenz zur Induktion von Antikörpern. In der Untersu hung wurde

in einem adenoviralen Vektor das N-, S-, und M-Protein Mäusen intraperitoneal appli-

ziert. Ans hlieÿend wurden die Seren mit ELISA und IFA getestet. Dabei wurde festge-

stellt, dass die Tiere, die mit dem N-Protein immunisiert wurden, die stärkste Reaktion

zeigten (WESSELING et al. 1993).

Wie für einzelsträngige RNA-Viren typis h, unterliegt au h das MHV einer hohen

Mutations-, Rekombinations- und Deletionsrate. Dadur h entstehen viele Stämme und

Varianten, weshalb die serologis he Detektion aller Stämme mittels Proteinen nur eines

Stammes s hwierig sein kann. Das N-Protein von RCV hat mit MHV3 aber immerhin

eine Aminosäuresequenzidentität von 97,4% in den Referenzsequenzen der verwendeten

Stämme. Die wi htigsten Stämme der Maus zeigen min. 94% Aminosäuresequenzidenti-

tät innerhalb des N-Proteins (M.M. PARKER u. MASTERS 1990). Mögli he Tests zum

Antikörperna hweis sind die IFA mit MHV als Antigen, wel he au h zur Diagnose von

RCV bei der Ratte Verwendung ndet, und der MHV/RCVNCRELISA

3

.

Maus MHV ist ho hgradig infektiös und hat wegen seines hohen Potentials zur rapiden

Ausbreitung innerhalb eines Versu hstierbestands eine groÿe praktis he Bedeutung. In

ausgewa hsenen, immunkompetenten Tieren gibt es häug keine klinis hen Zei hen einer

Infektion. Aber Neonaten sind von Diarrhoe und einer hohen Sterbli hkeit betroen und

immundeziente Tiere kümmern (BRAYTON et al. 2012).

3

Mis hantigen von Coronaviren der Maus und der Ratte

33


Das Vorkommen in Laborbeständen ist mit einer Seropositivität von 5,5% bzw. 3,3%

in Europa und mit 1,6% in den USA no h sehr häug. (MÄHLER u. KÖHL 2009;

PRITCHETT-CORNING et al. 2009).

In der Literatur ist oft von unters hiedli hen Serotypen des MHV die Rede. Das Mus-

ter der antigenetis hen Verwandts haft ist aber komplex (SIDDELL et al. 1983). Die

Einüsse auf Ergebnisse von Tierversu hen sind vielgestaltig und gravierend. Beispiele

hierfür sind Auswirkungen auf das Immunsystem, auf Tumoren, auf die Leber und das

Kno henmark (BAKER 1998).

Ratte Die Coronaviren der Ratte sind, wie die der Mäuse, ebenfalls ho hgradig konta-

giös (THIGPEN u. ROSS 1983; WOJCINSKI u. PERCY 1986). Sie haben einen je na h

Isolat unters hiedli h stark ausgeprägten Tropismus für die Spei hel-, Tränen- und die

Harders henDrüsen (CARTHEW u. SLINGER 1981). Bei Infektion des Tränenapparats

ist die Produktion von Tränenüssigkeit verringert, was zu sekundären Symptomen am

Auge führt. Auÿerdem sondern die Harders henDrüsen eine erhöhte Menge an porphy-

rinhaltigem Sekret ab, was zu einer roten Ablagerung um das Auge herum führt.

Die Prävalenz unter Versu hstieren ist mit 0,28% in den USA und 0,61% bzw. 0,25% in

Europa immer no h relativ ho h (MÄHLER u. KÖHL 2009; PRITCHETT-CORNING

et al. 2009).

Infektionen mit Coronaviren der Ratte beeinussen Versu he, die den Tränenapparat, die

Spei heldrüsen, den Respirationstrakt, das Auge, den Geru hssinn, die Reproduktion,

das Immunsystem oder das Wa hstum von Jungtieren betreen (BAKER 1998).

Aufgrund der starken Kreuzreaktion werden au h die Coronaviren der Ratte häug mit

MHV als Antigen oder mit einem Mis hantigen aus MHV und RCV na hgewiesen.

Murine Paramyxoviren

Sendai virus (SeV) gehört zum Genus Respirovirus und Pneumonia virus ofmi e ge-

hört zum Genus Pneumovirus in der Familie der Paramyxoviridae (BÜCHEN-OSMOND

2003). Sie besitzen ein negativ orientiertes, einzelsträngiges RNA-Genom ( a. 15 000

Basen), wel hes an N-Protein (Nukleokapsidprotein) assoziiert und von einer Hül-

le umgeben ist. Die Ers heinung des Virus ist sphäris h; in die Membran sind HN-

(Hämagglutinin-Neuraminidase) und F-Proteine (Fusion) eingelagert. An der Innenseite

34

3.4. Viren

der Membran liegt das M-Protein (Matrix), wel hes au h eine Bindung zum Nukleokap-

sid vermittelt (MODROW et al. 2010).

Pneumonia Virus of Mice (PVM)

Innerhalb dieser Arbeit wird für das PneumoniaVirus ofMi e (PVM) im Gegensatz zur

oziellen Taxonomie Murine pneumonia virus (BÜCHEN-OSMOND 2003), na h der

es MPV heiÿen müsste, die allgemein gebräu hli he Abkürzung PVM verwendet, um

eine Verwe hslung mit dem Mouse parvovirus (MPV) auszus hlieÿen.

Es gibt einen ELISA für das humane Metapneumovirus (hMPV) auf der Basis des N-

Proteins (HAMELIN et al. 2004).

PVM wurde erstmals 1940 bes hrieben (HORSFALL u. HAHN 1940). Das Virus ist

streng pneumotrop (CARTHEW u. SPARROW 1980b; COOK et al. 1998) und entwi-

kelt eine Virulenz erst na h mehreren Lungenpassagen.

Bei natürli her Infektionen immunkompetenter Mäuse zeigen si h keine Symptome; in

immunsupprimierten Mäusen zeigen si h dagegen Dyspnoe, Zyanose und Gewi htsver-

lust (CB RICHTER et al. 1988; WEIR et al. 1988). Die Tiere sterben als Folge der

Pneumonie. Ähnli he Symptome entwi keln si h bei experimenteller Infektion von im-

munkompetenten Mäusen au h mit unpassagiertem Virus. Die pathologis hen Befunde

umfassen Veränderungen der Lunge und eine allgemeine Abmagerung der Tiere. Die

Übertragung des Virus ndet auss hlieÿli h über Aerosol oder direkten Kontakt statt

(JC PARKER u. RICHTER 1982). In Tierhaltungen entstehen meist kleine Infektions-

herde mit räumli her Begrenzung (BRAYTON et al. 2012). Die Infektion mit PVM wird

als Modell für die Erfors hung des Human respiratory syn ytial virus (HRSV) verwen-

det (DOMACHOWSKE et al. 2000).

PVM stellt immer no h ein Risiko für Versu htiereinri htungen dar. Die letzten Untersu-

hungen ergaben Prävalenzen von 0,01% bei den in denUSAundEuropa eingesendeten

Proben (PRITCHETT-CORNING et al. 2009). Die letzte europäis he Untersu hung er-

gab keine PVMpositiven Funde mehr (MÄHLER u. KÖHL 2009). Vers hiedene PVM-

Isolate zählen alle zur glei hen Serogruppe (HORSFALL u. HAHN 1940; PEARSON u.

EATON 1940). Gebräu hli he serologis he Tests sind ELISA und HAH (DESCOTEAUX

u. PAYMENT 1981), aber au h die IFA ist gebräu hli h (MÄHLER u. KÖHL 2009).

35


Die Prävalenz bei Ratten lag in den USA bei 0,06% und in Europa bei 1,25% bzw.

< 1,0% der eingesendeten Proben (MÄHLER u. KÖHL 2009; PRITCHETT-CORNING

et al. 2009).

Sendai virus (SeV)

Das Virus wurde in Japan in den 1950er Jahren aus Mäusen isoliert, die mit Lungen-

homogenat von Kindern mit Lungenentzündung inokuliert worden waren (KUROYA u.

ISHIDA 1953; KUROYA et al. 1953; NODA 1953b, a; R. SANO et al. 1953a; T. SA-

NO et al. 1953b). Kurze Zeit später stellte si h aber heraus, dass dieses Virus au h aus

ni ht inokulierten Mäusen isoliert werden konnte (ISHIDA u. HOMMA 1978).

Das Virus zei hnet si h dur h eine hohe Kontagiosität aus (PARKER u. REYNOLDS

1968). Denno h ist eine Anste kung von Sentineltieren über gebrau hte Einstreu ni ht

zuverlässig mögli h (ARTWOHL et al. 1994).

Es gibt zwei mögli he Krankheitsverläufe: (I) den enzootis hen, subklinis hen Verlauf

bei Tieren, die bereits dur h eigene oder no h dur h maternale Antikörper ges hützt

sind und (II) den epizootis hen, klinis h apparenten Verlauf bei Neuinfektion (JC PAR-

KER u. RICHTER 1982; LINDSEY et al. 1991, S. 37)). Symptome der epizootis hen

Form sind gesträubtes Fell, verstärkte Atmung, s hneller Gewi htsverlust, Apathie, fe-

tale Resorption, verlängerte Trä htigkeit und Tod bei Neonaten, bei no h saugenden

und bei alten Tieren. Die Infektion wird in immunkompetenten Tieren für gewöhnli h

eliminiert. Au h der genetis he Hintergrund spielt bei der Ausbildung von Symptomen

eine groÿe Rolle. Immunsupprimierte Tiere entwi keln einen hronis hen Krankheitsver-

lauf (WARD et al. 1976). Versu hsergebnisse können dur h SeV auf vielfältige Weise

verfäls ht werden; am stärksten werden immunologis he Parameter beeinusst und es

nden We hselwirkungen mit Tumoren statt (BAKER 1998; NICKLAS et al. 1999).

SeV-Infektionen von Mäusen und Ratten sind weltweit verbreitet, heute jedo h in Lab-

ortierhaltungen sehr selten. Biologis he Materialien können mit SeV kontaminiert sein

(COLLINS JR u. PARKER 1972), und mit diesen kann das Virus in eine Tierhaltung

gelangen. Au h über Kontakt mit Wildnagern ist eine Eins hleppung in ein Tierhaus

mögli h. Die letzten Angaben zum Vorkommen bei Einsendungen in kommerzielle Dia-

gnostiklabors sind sehr unters hiedli h. Die europäis he Untersu hung von 2009 wies

weder bei der Maus, no h bei der Ratte positive Seren na h (MÄHLER u. KÖHL 2009).

Glei hes gilt für Mäuse in einer Untersu hung in Europa und USA. Für Ratten gab es

36

3.4. Viren

jedo h Seroprävalenzen von 0,01% in den USA und von 0,51% in Europa (PRITCHETT-

CORNING et al. 2009). FürWildratten in den USA ist eine Prävalenz von 4,2% beri htet

worden (EASTERBROOK et al. 2008). Alle SeV-Isolate gehören mit lei hten Variatio-

nen innerhalb der Epitope dem glei hen Serotyp an. Diese Unters hiede wurden unter

Verwendung monoklonaler Antikörper gezeigt, sie haben aber auf die Unters heidung in

Serotypen keinen Einuss (BROWNSTEIN 2007).

Mögli he serologis he Tests sind VirionELISA und IFA (MÄHLER u. KÖHL 2009;

PRITCHETT-CORNING et al. 2009); au h ein HAH ist mögli h (PORTNER 1981).

SeV-Infektionen der Ratte verlaufen übli herweise asymptomatis h (BUREK et al. 1977).

Bei experimentellen Infektionen sind respiratoris he Symptome bes hrieben worden

(CARTHEW u. SPARROW 1980a). Andere Symptome bei natürli her Infektion sind

Kümmern, Gewi htsverlust, verringerte Zu htrate und verringerte Aktivität (COID u.

WARDMAN 1971, 1972; CASTLEMAN 1983; CARTHEW u. ALDRED 1988). Die Mor-

talität ist sehr gering (BUREK et al. 1977; CASTLEMAN 1983).

SeVAntikörper in Rattenseren wurden in den USA zu 0,01% und in Europa zu 0,51%

in eingesendeten Proben gefunden (PRITCHETT-CORNING et al. 2009). Eine weitere

europäis he Untersu hung ergab keine seropositiven Ratten in eingesendeten Proben

(MÄHLER u. KÖHL 2009).

Lymphocytic choriomeningitis virus

Das Lympho yti horiomeningitis virus (LCMV) gehört zum Genus Arenavirus, wel-

hes als einziges zur Familie Arenaviridae gehört (BÜCHEN-OSMOND 2003). Arenavi-

ridae haben ein ambisense orientiertes, einzelsträngiges RNA-Genom (10 000 bis 12 000

Basen), wel hes in zwei Segmenten vorliegt. Diese Besonderheit ermögli ht bei Dop-

pelinfektion einer Zelle mit zwei Virusstämmen die Bildung von Reassortanten. Der

Virion-Aufbau ist pleomorph, überwiegend sphäris h, mit zwei Nukleokapsidsegmen-

ten, bestehend aus NP-Protein und Nukleinsäure, die von einer Hüllmembran umgeben

sind. Auf der Hüllmembran benden si h keulenförmige Projektionen (MODROW et al.

2010).

Für das Lassavirus, wel hes ebenfalls zu den Arenaviren zählt, ist bereits ein ELISA auf

der Basis des Nukleoproteins (NP) entwi kelt worden (SAIJO et al. 2007).

37


Das Virus wurde zuerst bes hrieben im Zusammenhang mit einer Enzephalitis, die in

St. Louis (USA) auftrat (ARMSTRONG u. LILLIE 1934), stellte si h aber später als

ni ht ursä hli h heraus. Der Name des Virus leitet si h von jenem Krankheitsbild ab,

wel hes si h na h intrazerebraler Inokulation zeigt, und steht in keinem Zusammenhang

mit der Symptomatik einer natürli hen Infektion (BRAYTON et al. 2012).

Ungeborene oder Mäuse, die in der ersten Lebenswo he inziert wurden, entwi keln

eine persistierende Infektion mit niedrigen Antikörpertitern. Bei sol hen hronis hen

Infektionen bilden si h häug Immunkomplexe (Chronis he Immunkomplexkrankheit),

wel he für u. a.Nierenversagen verantwortli h sind (BRAYTON et al. 2012). Mäuse,

die na h der ersten Lebenswo he inziert werden, entwi keln für gewöhnli h keinerlei

Symptome, allerdings hängt die Symptomatik stark vom Infektionsweg, dem Alter der

Tiere und dem Mausstamm ab (LEHMANN-GRUBE 1971). Die akute Form führt zur

Bildung neutralisierender Antikörper, wel he die Infektion na h einigen Wo hen der

Viruspersistenz eliminieren.

Für die Verbreitung des Virus im Bestand sind in erster Linie hro-

nis h (tolerant) inzierte Tiere von Bedeutung, da sie permanent groÿe Mengen

infektiöser Partikel auss heiden. Akut inzierte Tiere hingegen s heiden kein Virus aus

(BRAYTON et al. 2012). Auÿer dem natürli hen Wirt Mus mus ulus (BUCHMEIER

et al. 2007) können weitere Spezies inziert werden; zu den wi htigsten gehören der Sy-

ris heGoldhamster, die Ratte und der Mens h, der dur h Wildmäuse (ACKERMANN

et al. 1964) mit LCMV inziert werden kann (CHILDS et al. 1991). Au h können

die Auswirkungen auf experimentell gewonnene Ergebnisse erhebli h sein (BAKER

1998).

Die Häugkeit von LCMV in Labortierhaltungen ist stark rü kläug; so waren 1996

no h a. 5% der ni ht SPFHaltungen in den USA positiv (JACOBY u. LINDSEY 1998),

wohingegen zuletzt die Häugkeit bei 0,01% der eingesandten Proben in den USA und

bei 0,02% in Europa lag (PRITCHETT-CORNING et al. 2009). Mähler und Köhl fanden

keine positiven Seren (MÄHLER u. KÖHL 2009). Denno h ist die Eins hleppung über

biologis hes Material, wie z. B. inzierte transplantierbare Tumoren jederzeit mögli h

(NICKLAS et al. 1993). In Wildmäusen in England sind Antikörper gegen LCMV in 31%

na hgewiesen worden (BAKER 1998). Es gibt vers hiedene Stämme des LCMV. Diese

teilen ihre antigenetis hen Eigens haften allerdings ni ht nur untereinander, sondern

au h mit anderen Arenaviren (M. J. BUCHMEIER et al. 1980).

38

3.4. Viren

Da LCMV zoonotis hes Potential hat (BLEICH u. NICKLAS 2008) und die Erkran-

kung beim Mens hen statt dem übli hen, sehr milden Verlauf in immunkompetenten

Erwa hsenen au h einen s hweren Verlauf in Immunsupprimierten und Ungeborenen

nehmen kann, ist na hwie vor die regelmäÿige Überwa hung von Versu hstierbeständen

auf dieses Virus erforderli h.

Übli he serologis he Na hweismethoden sind ELISA und IFA (LINDSEY et al. 1991;

MÄHLER u. KÖHL 2009; PRITCHETT-CORNING et al. 2009).

Die Infektion verbreitet si h ni ht auf natürli hem Wege unter Ratten. Sie werden ent-

weder über biologis he Materialen oder experimentell inziert (LINDSEY et al. 1991).

Antikörper gegen LCMV wurden dementspre hend in den letzten Prävalenzstudien ni ht

gefunden (MÄHLER u. KÖHL 2009; PRITCHETT-CORNING et al. 2009).

Murine Hantaviren

Das Genus Hantavirus umfasst unter anderem Hantaan virus (HTNV), Puuma-

la virus (PUUV), Seoul virus (SEOV), Dobrava virus (DOBV), Tula virus (TULV)

und Sin Nombre virus (SNV) und gehört zur Familie Bunyaviridae. Hantaviren besit-

zen ein segmentiertes, einzelsträngiges RNA-Genom ( a. 12 000 Basen) mit negativer

Orientierung (BÜCHEN-OSMOND 2003). Die RNA ist mit dem Nukleokapsidprotein

(N) assoziiert und von einer Hülle umgeben. Die Gestalt des Virions ist pleomorph mit

einer überwiegend sphäris hen Ers heinung. Wi htige Strukturproteine sind die Hüll-

membran assoziierten Proteine Gn und G und die RNA-assoziierten Proteine L und N

(MODROW et al. 2010).

Das N-Protein ist s hon länger in rekombinanten ELISA zur Hantavirus-Diagnostik im

Einsatz (PADULA et al. 2000) und ist bekannt für eine starke Antikörperantwort in so-

wohl natürli hen als au h experimentellen Infektionen (LUNDKVIST et al. 1993; ELGH

et al. 1995; ELGH et al. 1996).

Hantaviren inzieren neben Nagern au h Mens hen. Ho Wang Lee gelang es als Erstem,

mit HTNV ein Virus aus der Gruppe der Hantaviren zu isolieren, wel hes das sogenannte

Koreaeber verursa ht hatte (LEE et al. 1978).

Die Stämme der Hantaviren sind geogras h unters hiedli h verteilt; PUUV kommt in

Europa und Asien vor, HTNV und SEOV in Asien. DOBV und TULV sind in Europa,

SNV ist in Amerika heimis h (SCHMALJOHN u. NICHOL 2007, S. 1745). Es wurde

39


aber au h s hon vom Auftau hen von SEOV in Mitteleuropa beri htet (HEYMAN et al.

2004). In Deuts hland s hwanken die Anzahlen der na hgewiesenen PUUV- und DOBV-

Infektionen beim Mens hen stark (ULRICH et al. 2004). Im Jahr 2010 sind 2017 Fälle

von Hantaviruserkrankungen beim Mens hen gemeldet worden, wobei Infektionen mit

PUUV mit 1874 Fällen den mit Abstand gröÿten Teil ausma hen. Von Infektionen mit

SEOV wurde ni ht beri htet (ROBERT-KOCH-INSTITUT 2011). Die humanpathoge-

nen Hantaviren lassen si h auf der Basis des N-Proteins in zwei Serogruppen unterteilen:

die eine Serogruppe umfasst die Spezies HTNV, DOBV und SEOV, die andere SNV und

PUUV (ELGH et al. 1997).

Die einzelnen Virusspezies sind stark an ihren natürli hen Wirt, also an jeweils eine

bestimmte Nagergruppe oder sogar nur an eine bestimmte Spezies angepasst und in

diesen apathogen. Beim Mens hen allerdings lösen sie als Zoonose in Abhängigkeit von

der Spezies hämorrhagis hes Fieber, Lungenentzündung oder akutes Nierenversagen aus.

Überträger für PUUV ist die Familie Arvi ulinae (Wühlmäuse). Die Rötelmaus (Myo-

des glareolus) ist der häugste Überträger in Deuts hland. Sie ernährt si h u. a. von

Bu he kern, weshalb sie vor allem in bu henrei hen Gegenden vorkommt. DOBV zeigt

einen no h stärkeren Wirtstropismus als das PUUV, indem es nur die Gelbhalsmaus

(Apodemus avi ollis) und die Brandmaus (Apodemus agrarius) inziert (SIBOLD et

al. 2001). TULV wurde 1994 erstmals bes hrieben (PLYUSNIN et al. 1994) und ist eher

ni ht humanpathogen (KRAUS et al. 2004). Sein Hauptwirt ist die Feldmaus (Mi rotus

spe .).

Keines der bekannten Hantaviren ist speziell an die Hausmaus angepasst, Mus mus ulus

kann aber ni ht als Träger von Hantaviren ausges hlossen werden, da saugende Tiere

von HTNV inziert werden können (HART u. BENNETT 1999) und inzwis hen au h

Hantaviren in wild lebenden Mus mus ulus in Europa na hgewiesen werden konnten

(Weidmann et. al. 2005). In den USA wurde aus einer Mus mus ulus das Leakey virus

isoliert, wel hes vermeintli h einer weiteren Serogruppe angehörte (BAEK et al. 1988).

Kurze Zeit später (PUTHAVATHANA et al. 1992) fanden si h molekularbiologis he

Ähnli hkeiten sowohl zum PUUV als au h zu SEOV, wofür vers hiedene Erklärungen

vorges hlagen wurden, darunter au h die Mögli hkeit der Kontamination dur h Labor-

stämme. Weitere Na hweise von Hantaviren in Mäusen sind ni ht bekannt.

Die mögli hen Wege von Hantaviren in einen Versu hstierbestand sind: (I) über konta-

minierte biologis he Materialien, die in Tieren angewendet werden und von dort aus zu

einer Verbreitung des Virus führen (YAMANISHI et al. 1983). (II) si h in den Bestand

40

3.4. Viren

eins hlei hende wildlebende und inzierte Nager, was au h in modernen Anlagen immer

no h ni ht völlig ausges hlossen ist. In diesem Fall ist aber dur h Kägisolierung eine An-

ste kung über direkten Kontakt unter den Tieren ni ht mögli h. Au h über den Staub,

der von kontaminierten Fäkalien ausgeht, sollte eine Anste kung nur in einer oenen

Haltung mögli h sein. Häug sind die Käge mit Filterde keln versehen, oder gehören

gar zu einer IVC (Individually Ventilated Cages) Anlage. Bei Labormäusen spielen Han-

tavirusinfektionen keine Rolle (MÄHLER u. KÖHL 2009; PRITCHETT-CORNING et

al. 2009). Mögli he Tests sind IFA oder ELISA, z. B.mit PUUV als Antigen, oder aber

rekombinante ELISA.

Die Ratte ist der natürli he Wirt für das SEOV (SCHMALJOHN u. NICHOL 2007).

Es wurde wiederholt von Ausbrü hen von SEOV in Labortierhaltungen beri htet. Ist

das Virus erst einmal in die Laborrattenpopulation gelangt, so inziert si h au h häu-

g das Personal und entwi kelt das Hämolytis h-urämis he Syndrom (HUS) mit zum

Teil s hwerwiegenden Folgen. Dies ges hah z. B. in Japan (UMENAI et al. 1979; KA-

WAMATA et al. 1987), in Belgien (DESMYTER et al. 1983), im Vereinigten Königrei h

(LLOYD et al. 1984), in Frankrei h (DOURON et al. 1984) und in Korea (H.W. LEE u.

JOHNSON 1982). Au h neuere Beri hte unterstrei hen, dass die Gefahr für Personal in

Versu hstiereinri htungen dur h Hantaviren no h ni ht komplett gebannt ist. In China

wurden 2006 a ht Studenten über Laborratten mit SEOV inziert. Die isolierten Stäm-

me entspra hen denen, die au h bei wilden Ratten in der Region vorkamen (ZHANG et

al. 2009).

In einer aktuellen Prävalenzstudie wurden keine Antikörper positiven Seren in Europa

gefunden (MÄHLER u. KÖHL 2009). Allerdings ergab eine andere Studie bea htli he

Prävalenzen von 0,01% bzw. 1,09% in eingesendeten Proben in den USA bzw. in Europa


Murine Reoviren

Die Familie Reoviridae umfasst in unters hiedli hen Subfamilien sowohl die Spe-

zies RotavirusA (RV-A, im Folgenden RotaA) als au h die Spezies Mammali-

an orthoreovirus 3Dearing (MRV-3De) im Genus Orthoreovirus (BÜCHEN-OSMOND

2003). Die Reoviridae haben ein doppelsträngiges, segmentiertes RNA-Genom (>18 200

Basen) in einem ikosaedris hen Kapsid ohne Hülle (MODROW et al. 2010).

41


Mammalian orthoreovirus

Die Spezies des Genus Orthoreovirus haben ein Core, der von zwei Kapsids hi hten um-

s hlossen ist. Wi htige Strukturproteine sind (I) das Sigma1-Protein (äuÿeres Kapsid),

(II) das Sigma2-Protein, wel hes den Core bildet und (III) das Sigma3-Protein, weil es

das Hauptkapsidprotein in der äuÿeren S hi ht darstellt (MODROW et al. 2010).

Die Spezies Mammalian orthoreovirus umfasst drei Serotypen: Serotyp 1 (Stamm

Lang), Serotyp 2 (Stamm D5/Jones) und Serotyp 3 (Stamm Dearing) (RAMIG et al.

1977). Traditionell wird das Mammalian orthoreovirus 3Dearing (MRV-3De) als dia-

gnostis her Referenzstamm verwendet, wel hes ursprüngli h vom Mens hen isoliert wur-

de (RAMOS-ALVAREZ u. SABIN 1954) und für Nager der pathogenste der drei Se-

rotypen ist (PARKER u. RICHTER 1982). DerEinfa hheit halber wird MRV-3De im

Folgenden nur no h als Reo bezei hnet. Reoviren haben im Gegensatz zu den meis-

ten anderen Viren, die Nager inzieren, einen sehr breiten Wirtstropismus. Klinis he

Zei hen einer Reovirusinfektion bei Jungtieren sind Kümmern, Diarrhoe, öliges Fell, ab-

dominale Alopezie und Ikterus. Pathologis he Veränderungen betreen vor allem Leber

und Nieren. Bei adulten Tieren zeigen si h selten klinis he Zei hen. Dur h das Fehlen

von klinis hen Symptomen können sie sogar unbemerkt Versu hergebnisse verfäls hen

(PARKER u. RICHTER 1982).

Häug sind Seren im VirionELISA negativ, aber in der IFA positiv (WRIGHT et al.

2004). Im Kot der Tiere, von denen diese Seren stammen, konnte RNA von Reoviren

na hgewiesen werden, die aber ni ht den klassis hen Stämmen ähnelt, sondern mehr

Homologie zu den Stämmen RVH und RVG zeigt. Diese relativ neuen Isolate (SPIN-

NER u. DIGIOVANNI 2001) sind in der Datenbank der ICTV no h ni ht gelistet, und

es ist au h nur eine kleine Teilsequenz in der Datenbank GenBank zu nden (RVH:

EF029 088, RVG: AY494 858). Ob es si h hier um neue Serotypen handelt, ist ni ht ein-

deutig bes hrieben. Aufgrund der Nukleotidsequenzidentität von weniger als 86,3% zu

den Serotypen 1, 2 und 3 in einem Berei h des L3-Gens, in dem die Serotypen 1 bis

3 78,7 bis 97,5% identis h sind, ist zu vermuten, dass es si h bei den neuen Isolaten

um eigene Serotypen handelt (SPINNER u. DIGIOVANNI 2001). Untersu hungen auf

weitere Serotypen werden von keinem der gröÿeren Diagnostiklabors für Versu hstiere

dur hgeführt (CHARLESRIVER 2007; BIODOC 2011; RADIL 2011).

Die Prävalenz von Reo unter Versu hstieren in Europa lag bei 0,05% (PRITCHETT-

CORNING et al. 2009).

42

3.4. Viren

Ratten werden ebenso von Reoviren inziert wie Mäuse. Das Vorkommen von Reoviren

wurde nur no h in den USA beri htet (0,01%) (PRITCHETT-CORNING et al. 2009).

Rotavirus A

Das Genus Rotavirus gehört ebenso wie das Genus Orthoreovirus zur FamilieReoviridae.

Rotaviren umfassen sieben Serogruppen bzw. Spezies, die mit A bis G bezei hnet werden,

wobei die Serogruppen F und G no h vorläug sind (BÜCHEN-OSMOND 2003). Die bei

Mäusen vorkommenden Rotaviren gehören der SerogruppeA an. Der Aufbau setzt si h

aus innerem Core (VP1, VP3), Core-S hale (VP2), innerem Kapsid (VP6) und äuÿerem

Kapsid (VP4, VP7) zusammen (MODROW et al. 2010).

Das VP6-Protein ist Hauptbestandteil des inneren Kapsids und ist als ELISAAntigen ge-

eignet (TSUNEMITSU et al. 2005). Glei he Serogruppen können unters hiedli he Stäm-

me beinhalten, die au h unters hiedli he Wirtsspezies inzieren. So ist ein bovines Ro-

tavirus genau so zur SerogruppeA gehörig, wie die vers hiedenen Stämme der murinen

Rotaviren.

Früher wurde die Bezei hnung EDIM (Epizooti Diarrhea of InfantMi e) als Krankheits-

bezei hnung synonym für eine RotavirusA-Infektion verwendet, heute bezei hnet das

Akronym ledigli h einen von vielen Virusstämmen (BAKER 1998; MCNEAL et al.

2004). Murine Rotaviren verursa hen bei Jungtieren Diarrhoe in der ersten Lebenswo he

(CHEEVER u. MUELLER 1947; PAPPENHEIMER u. ENDERS 1947; EYDELLOTH

et al. 1984). RotavirusA ist insbes. bei Jungtieren ho h kontagiös. Serumantikörper sind

in niedrigen Dosen am 5.DPI vorhanden (EYDELLOTH et al. 1984). Murine Rotavi-

ren können Experimente mit anderen Pathogenen und Experimente zur Intestinal- und

Ernährungsphysiologie beeinussen (BAKER 1998). Das Vorkommen von RotavirusA

in Labortieren ist selten (in Europa 0,35% eingesendeter Serumproben) (PRITCHETT-

CORNING et al. 2009), es zählt aber immer no h zu den prävalenteren Virusinfektionen.

In der serologis hen Diagnostik nden IFA und ELISA Anwendung (MÄHLER u. KÖHL

2009; PRITCHETT-CORNING et al. 2009). Hinweise auf einen rekombinanten ELISA

sind in der Literatur ni ht zu nden.

Die Rotaviren der Ratte unters heiden si h deutli h von denen der Mäuse. So gehört das

Rotavirus der Ratte Rat rotavirus-like agent (RVLA) der SerogruppeB an (VONDER-

FECHT u. SCHEMMER 1993). Au h Mens hen gehören zu den natürli hen Wirten von

Rotaviren der SerogruppeB und sind deshalb potentielle Vektoren (EIDEN et al. 1985).

43


Die Symptome sind denen der Rotaviren der SerogruppeA bei Mäusen sehr ähnli h und

sind hauptsä hli h dur h Diarrhoe, s hle htes Wa hstum und perianale Dermatitis ge-

kennzei hnet. Aus diesem Grunde kam die Bezei hnung infe tious diarrhea of infant

rats (IDIR) auf (VONDERFECHT et al. 1984).

Infektionen mit RVLA führen wahrs heinli h zur Beeinträ htigung von Versu hen, die

den Gastrointestinaltrakt betreen (BAKER 1998).

Zur Prävalenz der Rotaviren bei der Ratte gibt es keine Daten, da in den entspre henden

Untersu hungen dieses Virus ni ht berü ksi htigt wurde (MÄHLER u. KÖHL 2009;

PRITCHETT-CORNING et al. 2009).

44

4. Material

4.1. Allgemeine Chemikalien

Folgende Chemikalien kamen zur Anwendung:

A rylamid (RotiphoreseGel 30)

(30%A rylamid, 0,8%Bisa ylamid)

Carl Roth,Karlsruhe

Agarose GIBCO, Invitrogen,Karlsruhe

5-Amino-2,3-Dihydro-1,4-Phthal-Azinedion Sigma-Aldri h, Steinheim

Ammoniumperoxodissulfat (APS) Carl Roth,Karlsruhe

Ampi illin Ro he,Mannheim

Adenosin-5'-triphosphat (ATP) Carl Roth,Karlsruhe

Ba to-Agar DIFCO Be ton Di kinson, Sparks (MD,USA)

Ba to-Hefeextrakt GIBCO, lnvitrogen,Karlsruhe

Ba to-Trypton DIFCO Be ton Di kinson, Sparks (MD,USA)

Bradford-Reagenz (Roti-Quant) Carl Roth,Karlsruhe

Broad Range Protein MW Marker PROMEGA,Madison (Wl,USA)

Bromphenolblau Mer k,Darmstadt

Casein (Best.-Nr. C-5890) Sigma-Aldri h, Steinheim

Chlorampheni ol Ro he,Mannheim

Coomassie-Lösung

(Gel Code BlueStain Reagent)

Pier e, Ro kford (lL,USA)

Desoxribonu leosidtriphosphate (dNTPs) Carl Roth,Karlsruhe

1,4-Dithiothreitol (DTT) Carl Roth,Karlsruhe

Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldri h, Steinheim

Dinatriumhydrogenphosphat (Na

2

HPO4) Mer k,Darmstadt

Essigsäure 100% (Eisessig) Mer k,Darmstadt

45

4. Material

Ethylendiamintetraa etat (EDTA) GIBCO, lnvitrogen,Karlsruhe

Ethanol absolut Riedel-de Haën, Seelze

Ethidiumbromid (EtBr) Sigma-Aldri h, Steinheim

Ethanol vergällt DKFZ,Heidelberg

Glutathion-Casein TimWaterboer, DKFZ,Heidelberg

Gly erin, 100%, wasserfrei Carl Roth,Karlsruhe

Gly in AppliChem,Darmstadt

H

2

O, DNase/RNase-frei GIBCO, Invitrogen,Karlsruhe

Isopropanol J.T Baker, Deventer (Niederlande)

lsopropyl-ÿ-DThiogala tosid (lPTG)

(dioxanfrei)

Carl Roth,Karlsruhe

Kaliumhydrogenphosphat (KH

2

PO

4

) Mer k,Darmstadt

Magnesium hlorid (hexahydrat)

(MgCl

2

* 6 H

2

O)

Mer k,Darmstadt

2-Mer aptoethanol Mer k,Darmstadt

Methanol DKFZ,Heidelberg

Mil hpulver Carl Roth,Karlsruhe

Monothioethylene gly ol Mer k,Darmstadt

Natriuma etat (wasserfrei) (C

2

H

3

NaO

2

) ThomasChemikalien,Heidelberg

Natriumazid (NaN

3

) Mer k,Darmstadt

Natrium hlorid (NaCl) Sigma-Aldri h, Steinheim

Natriumhydrogen arbonat (NaHCO3) Mer k,Darmstadt

Natriumdode ylsulfat (sodium dode yl

sulfate, SDS)

Gerbu,Gaiberg

Natriumhypo hloritlösung, 12% Cl

(NaClO)

Carl Roth,Karlsruhe

Natriumhydroxid (NaOH), 1M J.T. Baker, Deventer (Niederlande)

Polyvinylalkohol mit einem mittleren

Molekulargewi ht von 30-70 kD (PVA)

Sigma-Aldri h, Steinheim

Polyvinylpyrrolidon mit einem mitt-

leren Molekulargewi ht von 360 kD

(PVP)


Pre isionPlusProtein

TM

AllBlue StandardMarker

BioRadLaboratories, Her ules (CA,USA)

46

4.2. Puer und Lösungen

PrestainedProtein Ladder, BroadRange NewEnglandBiolabs, Frankfurt

Proteaseinhibitor Complete, EDTA-frei Ro he,Mannheim

DNA-Gröÿenmarker (Smart Ladder) Eurogente , Seraing (Belgien)

Salzsäure (HCl), 37% Riedel-deHaën, Seelze

S hwefelsäure (H

2

SO

4

), 95-97% AppliChem,Darmstadt

Streptavidin-R-Phy oerythrin

(Strep-PE) mit BSA

Moss In ., Pasadena (MD,USA)

Sa harose Mer k,Darmstadt

Super hemiblo k (CBS-K) Chemi on,Teme ula (CA,USA)

Tetramethylbenzidin (TMB) Sigma-Aldri h, Steinheim

Tetramethylethylendiamin (TEMED) Mer k,Darmstadt

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) Sigma-Aldri h, Steinheim

Tween 20 (Polyoxyethylen-Sorbitan

Monolaureat)


Wasserstoperoxid, 30% (H

2

O

2

) Mer k,Darmstadt

Ni ht näher bes hriebene Chemikalien wurden von einer der folgenden Firmen bezogen:

Carl Roth,Karlsruhe

Mer k,Darmstadt

Ro he,Mannheim


4.2. Puffer und Lösungen

10x PBS: 124mM NaCl, 22mM Na

2

HPO

4

, 10mM KH

2

PO

4

, ph 7,4, Lagerung bei

RT

PBS-T: PBS, 0,05% Tween 20, Lagerung maximal eine Wo he bei RT

100x Ampi illin: 10mg/ml, in H

2

O sterilltriert, Lagerung bei −20 C

dNTP Sto klösung: jeweils 2,5mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP in H

2

O, Lage-

rung bei −20 C

47

4. Material

6x DNA-Pobenpuer: 0,25% Bromphenolblau, 40% Sa harose, Lagerung bei

−20 C

50x Elektrophorese-Puer (EP-Puer): 2M Tris (pH7,8), 0,25M Natriuma etat

(wasserfrei), 0,05M EDTA, ad 8L H

2

O, Lagerung bei RT

Ethidiumbromid-Stammlösung: 10mg/ml, Lagerung li htges hützt bei 4 C

LB-Medium: 10 g (1%) Ba to-Trypton, 5 g (0,5%) Ba to-Hefeextrakt, 10 g (1%)

NaCl, pH7,5 (mit NaOH eingestellt), Lagerung bei 4 C

Nährboden für Agarplatten: LB-Medium, 1,5%Ba to-Agar, Lagerung bei 4 C

1000x Chlorampheni ol: 20mg/ml in Ethanol absolut, Lagerung bei −20 C

Blo kpuer für die MS: PBS, 1mg/ml Casein, pH7,4, Lagerung bei −20 C

Casein-Blo kpuer für den GST-ELISA: PBS-T, 0,2% Casein, Lagerung bei 4 C

maximal über Na ht

EMBL-Transferpuer: 58 g Tris (48mM), 29,3 g Gly in (39mM), 34,5ml 10% SDS

(0,0345%), 2 L Methanol (20%), ad 10 L H

2

O, Lagerung bei RT

Enhan er: 1mg/ml p-Hydroxy umarsäure in DMSO, Lagerung li htges hützt bei RT

Garçea-Puer: 40mM Tris, 200mM NaCl, 1mM EDTA, Lagerung bei 4

C

10x Laufpuer (für SDS-PAGE): 151,5 g Tris (250mM), 720 g Gly in (14,4%), 50 g

SDS oder 500ml 10% SDS (1%), ad 5L H

2

O, Lagerung bei RT

Luminol-Lösung: 200ml 0,1M Tris/HCl, pH8,6, 50mg 5-Amino-2,3-Dihydro-1,4-

Phthal-Azinedion, 62µl 30% H

2

O

2

, Lagerung li htges hützt bei 4

C

4x SDS-Probenpuer: 160mM Tris, pH6,8, 10% Gly erin, 2% SDS, 5% 2-Mer ap-

toethanol, 0,25% Bromphenolblau, Lagerung bei −20 C

Bes hi htungspuer (Coating-Puer): 50mM Carbonatpuer pH9,6, (50mM

Na

2

CO

3

, 50mM NaHCO

3

im Verhältnis 1 : 4), Lagerung bei 4 C

Substratpuer: 100mM Natriuma etat ph 6,0 (pH mit Essigsäure eingestellt), Lage-

rung bei 4 C

TMB: 10mg/ml in DMSO, Lagerung li htges hützt bei −20 C

48

4.3. Verbrau hsmaterial

Lagerungspuer für die MS: Blo kpuer, 0,05% Natriumazid, Lagerung bei

−20 C

PVX-Blo kpuer: Blo kpuer, 2mg/ml GST-tag Lysat, 0,5% Polyvinylalkohol, 0,8%

Polyvinylpyrrolidon, (für Humanseren wurde auÿerdem 2,5% CBS-K zugesetzt), Lage-

rung bei −20 C

4.3. Verbrauchsmaterial

Neben laborübli hem Verbrau hsmaterial wie beispielsweise Reaktionsgefäÿen, Petri-

s halen, Pipettenspitzen sowie Hands huhen wurden folgende Materialien verwendet:

GC-Beads: Mit Glutathion-Casein gekoppelte SeroMAP

TM

Mi rospheres (COOH-

Beads) wurden von Monika Oppenländer (DKFZ,Heidelberg) hergestellt.

Geltro knungsfolie (GelDryingFilm): Promega,Mannheim

Aufreinigungs und Extraktionskits

PCR-Aufreinigung: QIAqui kPCR QIAGEN,Hilden

Gelextraktion: QIAqui kGel Extra tionKit QIAGEN,Hilden

Minipräparation: QIAprep Spin QIAGEN,Hilden

Midipräparation: QIAGENPlasmid QIAGEN,Hilden

DNAAufreinigung aus Zellkulturüberstand

QIAampDNAMiniKit: QIAGEN,Hilden

Multis reen-BV Filterplatten (Was hplatten): MilliporeGmbH, S hwal-

ba h/Ts.

Millipore VSeriesMembranes: MilliporeGmbH, S hwalba h/Ts.

96-Lo h-Mikrotiterplatten mit De kel (Polysorb 96F, #456 529):

Nun ,Wiesbaden

Nitro elluloseTransferMembran(Porengröÿe 0,2µm) PROTRAN

R©:

S hlei her&S huell, Dassel

96-Lo hPolystyrolplatten: Greiner bio-one, Fri kenhausen

49

4. Material

1,6ml HighSpeed Reaktionsgefäÿe DNase/RNase-frei (für MS-Arbeiten):

Biozym,Hessis hOldendorf

Röntgenlme X-Omat

TM

BlueXB-1: Kodak,Ro hester (NY,USA)

SeroMAP

TM

Mi rospheres: Luminex Corp., Austin (TX, USA)

Whatman 3MMPapier: S hlei her&S huell, Dassel

4.4. Bakterienstämme und Vektoren

E. oliDH5a Invitrogen,Karlsruhe

E. oliBL21wildtyp GEHealth are, Freiburg

E. oliBL21Rosetta Novagen (Mer k),Darmstadt

pGEX4T3tag GEHealth are, Freiburg, modiziert (SEHR et al. 2001)

4.5. Größenmarker

4.5.1. DNA-Marker

Für die Analyse von PCRProdukten auf Agarosegelen:

Smart Ladder: Eurogente , Seraing (Belgien) (Abb. 4.1)

50

4.5. Gröÿenmarker

Abbildung 4.1. Smart LadderDNA-Marker

Abbildung 4.2. Pre isionPlusProtein

TM

All Blue StandardMarker

Abbildung 4.3. PrestainedProtein Ladder, BroadRange

51

4. Material

4.5.2. Protein-Marker

Für Coomassie gefärbte SDS-Gele:

Pre isionPlusProtein

TM

AllBlueStandardMarker:

BioRadLaboratories, Her ules (CA,USA) (Abb. 4.2)

Für WesternBlots:

PrestainedProteinLadder, BroadRange: NewEnglandBiolabs, Frankfurt

(Abb. 4.3)

4.6. Templates

Die innerhalb dieser Arbeit verwendeten, sehr vers hiedenartigen Templates stammten

aus unters hiedli hen Quellen (Tab. 4.1).

52

4.6.Templates

Tabelle 4.1. Verwendete Templates

Nukleinsäure Familie Spezies Material Quelle

dsDNA linear Adenoviridae Mouse adenovirus typ 1 Zellkulturüberstand ATCC

1

(VR-550)

(MAdV-1)

dsDNA linear Herpesviridae Mouse ytomegalovirus Zellkulturüberstand Mi hael Mähler,

(MuHV-1) BioDo Hannover

dsDNA linear Herpesviridae Murine herpesvirus 68 Ba mid Sebastian Voigt,

(MHV68) Charité Berlin

(+/−) ssDNA linear Parvoviridae Kilham rat virus Zellkulturüberstand ATCC

1

(VR-235)

(KRV)

(+/−) ssDNA linear Parvoviridae Minute virus of mi e i Zellkulturüberstand ATCC

1

(VR-663)

(MVM i)

(+/−) ssDNA linear Parvoviridae Mouse Parvovirus typ 1 aufgereinigtes Plasmid Feldisolat aus Tierhaltung,

(MPV-1) (DKFZ, TV01/2008)

(+/−) ssDNA linear Parvoviridae Mouse Parvovirus typ 2a aufgereinigtes Plasmid synthetisiert von

(MPV-2) Gens ript

(+/−) ssDNA linear Parvoviridae Rat minute virus Gewebe DS-Sarkom,

(RMV) Universität Mainz

(+/−) ssDNA linear Parvoviridae Rat parvovirus Zellkulturüberstand Jan Cornelis,

(RPV) DKFZ

(+/−) ssDNA linear Parvoviridae Toolan`s H1 Virus aufgereinigtes Plasmid Christiane Dinsart,

(H1-PV) DKFZ

dsDNAzirkulär Polyomaviridae Murine pneumotropi virus 10% Leberhomogenat Kristina Dörries, JMU

4

,

(K-Virus) Würzburg

53

4.Material



dsDNAzirkulär Polyomaviridae Murine polyomavirus Zellkulturüberstand ATV

3

,

(Polyoma) DKFZ Heidelberg

dsDNA linear Poxviridae Va inia Virus Zellkulturüberstand ni ht mehr na hvollziebar

(VACV)

(+/−) ssRNA segmentiert Arenaviridae Lympho yti horiomeningitis Zellkulturüberstand ATCC

1

(VR-134)

virus(LCMV)

(+) ssRNA linear Arteriviridae La tate dehydrogenase- Plasma ATCC

1

(VR-695)

elevating virus (LDV)

(−) ssRNA segmentiert Bunyaviridae Hantaan-Virus aufgereinigtes Plasmid Rainer Ulri h

2

(HTNV)

(−) ssRNA segmentiert Bunyaviridae Puumala-Virus aufgereinigtes Plasmid Rainer Ulri h, FLI

2

(PUUV)

(−) ssRNA segmentiert Bunyaviridae Seoul-Virus aufgereinigtes Plasmid Rainer Ulri h, FLI

2

(SEOV)

(+) ssRNA linear Cali iviridae Murine norovirus Typ 1 aufgereinigtes Plasmid Martin Müller,

(MNV) DKFZ

(+) ssRNA linear Coronaviridae Rat oronavirus, Sialoda ryo- Zellkulturüberstand ATCC

1

(VR-1410)

adenitis virus (SDAV)

(+) ssRNA linear Coronaviridae Mouse hepatitis virus Typ 3, Zellkulturüberstand Volker Kraft,

an L-Zellen adaptiert (MHV) BioDo , Hannover

(+) ssRNA linear Hepeviridae Hepatitis-E-like virus aufgereinigtes Plasmid Rainer Ulri h, FLI

2

(ratHEV)

54

4.6.Templates



(−) ssRNA linear Paramyxoviridae Pneumonia Virus of mi e Zellkulturüberstand ATCC

1

(VR-25)

(PVM)

(−) ssRNA linear Paramyxoviridae Sendaivirus Allantoisüssigkeit ATCC

1

(VR-105)

(SeV)

(+) ssRNA liear Pi ornaviridae En ephalomyo arditis virus Zellkulturüberstand Jos van der Logt,

(EMCV) Uni Nijmegen

(+) ssRNA liear Pi ornaviridae Murine en ephalomyelitis Zellkulturüberstand ATCC

1

(VR-995)

virus

dsRNAsegmentiert Reoviridae Reo virus type 3 Zellkulturüberstand ATCC

1

(VR-824)

(TMEV)

dsRNAsegmentiert Reoviridae Mouse rota virus Zellkulturüberstand Frank Bootz,

(Rota A) Universität Züri h

1

Ameri anTypeCultureColle tion

2

Friedri h Loeer Institut, Insel Riems,Greifswald

3

Angewandte Tumorvirologie

4

JuliusMaximiliansUniversität,Würzburg

55

4. Material

4.7. Serumsammlungen

Die im DKFZ zur Validierung verwendeten Seren sind aus vers hiedenen Herkünften,

die jeweils unters hiedli he Interpretationsmögli hkeiten für die ermittelten Versu hser-

gebnisse bieten. Die Serumgruppen lassen si h in folgende gröÿere Gruppen einteilen.

Die Seren der überwa hten Population stammten aus der Tierhaltung des DKFZs

und dort aus einer Haltungseinheit, in der bisher keine Virusinfektionen festgestellt wur-

den. Regelmäÿig werden diese Tiere den FELASA-Empfehlungen entspre hend auf Anti-

körper gegen bekannte Nagerviren getestet (Maus: MHV, ECTV, Hantaviren, K-Virus,

LCMV, MVM MAdV-1, MAdV-2, MCMV, MPV-1, MPV-2, Polyoma, MTV, PVM,

Reo, SeV, TMEV, murine Rotaviren und MNV; Ratte: RCV, Hantaviren, KRV, LCMV,

MAdV-1, MAdV-2, PVM, RPV, Reo, SeV, TMEV, H-1PV und RMV).

Die Kontrollseren (KS) stammten aus unters hiedli hen Quellen. Ein Serum wird

dann als Kontrollserum bezei hnet, wenn es gegen min. ein Virus mit min. einem Re-

ferenztest positiv getestet wurde. Unter Kontrollseren können beispielsweise au h Re-

ferenzseren fallen. Referenzseren wurden entweder dur h experimentelle Immunisierung

mit einem denierten Virusstamm in der mikrobiologis hen Diagnostik des DKFZs her-

gestellt, als kommerzielles Referenzserum erworben oder freundli herweise von BioDo

zur Verfügung gestellt. Genaueres zur Serumherstellung ist von den externen Quellen

ni ht bekannt.

Die Seren der Wildtiere stammten von in Lebendfallen gefangenen Mus mus ulus

oder Rattus norvegi us. Die Serumgewinnung erfolgte dur h Herzpunktion unter CO

2

-

Narkose. Fang und Serumgewinnung erfolgten dur h das Team der mikrobiologis hen

Diagnostik.

Die Seren der Zoohandlungstiere wurden im Rahmen dieses Projekts dur h Entblu-

tung speziell dafür erworbener Tiere gewonnen. Man he Virusinfektionen sind in Ver-

su hstierhaltungen sehr selten geworden und nahezu ausgerottet. Die Zoohandlungstiere

bieten dur h ihre Zu ht mit wenig strengen Hygienemaÿnahmen und dur h die Einbrin-

gung von Tieren aus unters hiedli hen Herkünften die Mögli hkeit, diagnostis he Tests

no h an Feldinfektionen zu erproben.

Die Seren aus Konversionsstudien wurden von Tieren gewonnen, die bei CR am 0.DPI

mit einem Virus inziert wurden. Zu bestimmten Zeitpunkten, wel he von Virus zu Virus

56

4.7. Serumsammlungen

unters hiedli h sein können, wurden jeweils vier Tiere zur Serumgewinnung getötet.

Diese Konversionsstudien dienen bei CR ebenfalls zur Validierung neuer Tests.

Tabelle 4.2. Seren, die für die Validierung im DKFZ verwendet wurden

N

Mäuse:

297 überwa hte Population

264 Kontrollseren

27 Wildtiere

41 Zoohandlungstiere

629 Gesamt

Ratten:

161 überwa hte Population

110 Kontrollseren

18 Wildtiere

14 Zoohandlungstiere

303 Gesamt

Mens hen:

29 Seren mit Vorberi ht vom FLI

1

1

Friedri hLöer Institut, Insel Riems,Greifswald

Des Weiteren wurden verwendet:

• 14 monoklonale Antikörper gegen PolyomaVP1 (im ELISA und Immunoblot ge-

testet) (MARRIOTT u. CONSIGLI 1985)

• Ein LDVN immunisiertes Kanin henserum von Sebastian Ulbert, Fraunho-

fer Institut für Zelltherapie und Immunologie IZI, Leipzig

Folgende Seren wurden uns vom FLI bereitgestellt:

• 9 Humanseren, vorberi htli h seropositiv für DobravaVirus

• 10 Humanseren, vorberi htli h seropositiv für PuumalaVirus

• 10 Pleurallavagen von Apodemus spe . (adspektoris he Bestimmung), vorberi ht-

li h seropositiv für DobravaVirus

• 10 Pleurallavagen von Myodes spe . (adspektoris he Bestimmung), vorberi htli h

seropositiv für PuumalaVirus

57

4. Material

Tabelle 4.3. Seren, die für die Validierung bei CR verwendet wurden

N

Mäuse:

262 negativ getetstete Seren mit CR MFIA

5 Pools aus Referenzseren

16 monovalente Referenzeren für Titration

150 Seren aus fünf Serokonversionsstudien

433 Gesamt

Ratten:

240 negativ getetstete Seren mit CR MFIA

5 Pools aus Referenzseren

8 monovalente Referenzeren für Titration

120 Seren aus fünf Serokonversionsstudien

373 Gesamt

4.8. Antikörper

Kanin hen-anti-GST Sigma-Aldri h, Steinheim

Maus-anti-tag aus KT3-Zellen (MACARTHUR u. WALTER

1984)

Ziege-anti-Human lgA+lgG+lgM (H+L)-Biotin Dianova,Hamburg

Ziege-anti-Maus lgA+lgG+lgM (H+L)-Biotin Dianova,Hamburg

Ziege-Anti-Ratte lgA+lgG+lgM (H+L)-Biotin Dianova,Hamburg

Ziege-anti-Kanin hen lgA+lgG+lgM (H+L)-Biotin Dianova,Hamburg

Ziege-anti-Kanin hen lg-Peroxidasekonjugat Dianova,Hamburg

Ziege-anti-Maus Ig-Peroxidasekonjugat Dianova,Hamburg

4.9. Enzyme

4.9.1. Restriktionsenzyme

Es wurden Restriktionsenzyme von NewEnglandBiolabs (NEB,Frankfurt amMain) ver-

wendet (Tab. 4.4). Soweit erhältli h wurde die HighFidelity-Version der Enzyme benutzt.

58

4.10. Oligonukleotide

Diese Enzyme haben eine verringerte Sternaktivität, eine höhere Ges hwindigkeit und

sind für einen optimalen Verdau in NEB4Puer bei 37

C eingestellt.

Tabelle 4.4. Verwendete Restriktionsenzyme

Enzym S hnittstelle empfohlener Puer Temp. [

C

BamH IHF 5

′- G

′GATCC - 3

′1xNEB4 37

Sal IHF 5

′- G

′TCGAC - 3

′1xNEB4 37

Xma I 5

′- C

′CCGGG - 3

′1x NEB4+ 100µg/µl BSA 37

E oR IHF 5

′- GAA

′TTC - 3

′1xNEB4 37

HF: HighFidelityVersion

BSA: Bovines Serumalbumin

4.9.2. Sonstige Enzyme

T4DNALigase (1WeissU/µl) und Puer MBIFermentas, St. Leon-Rot

PhusionHigh-FidelityPCRKit Finnzymes, Vantaa (Finnland)

4.10. Oligonukleotide

Die Oligonukleotide wurden bei EuronsMWGBiote hAG (Ebersberg) in Auftrag ge-

geben.

4.11. Sequenzanalyse

Die Sequenzierungen wurden entweder von Andreas Hunziker (DKFZ,Heidelberg) oder

von einer der beiden Firmen MWG (Ebersberg) und GATC (Konstanz) dur hgeführt.

4.12. Lysate

Das GST-tag Lysat wurde ursprüngli h von Peter Sehr,DKFZ zur Verfügung gestellt.

Die Herstellung erfolgte dur h Ute Ko h,DKFZ.

59

4. Material

4.13. Referenztests

Die Referenztests umfassen alle Tests, die zur Bestätigung oder Widerlegung von

MSErgebnissen verwendet wurden. Sie lassen si h in folgende Kategorien einteilen:

CRELISA: Hierbei handelt es si h um kommerzielle ELISA mit rekombinanten

Proteinen oder kompletten Viruspartikeln als Antigen. Die Bezei hnung beinhal-

tet alle uns bekannten Informationen na h dem S hema: Virus [evtl. rekombinantes

Antigen CR [evtl. Virion ELISA. Verwendete Bezei hnungen sind beispielswei-

se RotaACRVirionELISA oder MNVVP1CRELISA. Die CRELISA wurden von

Elsbeth S hneider oder Klaus Vogel na h dem Protokoll des Herstellers

CharlesRiver Laboratories,Wilmington (MA,USA) dur hgeführt. Das Ergebnis wird

entweder als Klassikation (positiv bzw. negativ) oder als S ore-Wert angegeben. Die

S ore-Werte bere hnen si h aus der OD des Reaktionswells abzügli h eines Platten-

Leerwerts dividiert dur h 0,13. Der netto S ore-Wert resultiert dann aus der Subtrakti-

on des S ore-Wertes eines Wells ohne Antigen (mit leerem Expressionssystem und zu

testendem Serum zur Detektion von Reaktionen gegen das Expressionssystem) von dem

S ore-Wert eines Wells, in dem die tatsä hli he Reaktion zwis hen zu testendem Serum

und Antigen stattgefunden hat. Die netto S ore-Werte werden im Folgenden nur kurz

als S ore-Werte bezei hnet. Beurteilt werden sie bis S ore 2,5 als negativ, von 2,5 bis

3,0 als in der Grauzone und über 3,0 als positiv.

IFA: Die Immunuoreszenzen wurden mit dem jeweiligen Virusstamm dur hgeführt,

der au h als Template für das MS-Antigen diente. Die IFAs wurden na h publizierten

Protokollen dur hgeführt von Elsbeth S hneider oder PetraMauter.

HAH: Die Hämagglutinationshemmtests wurden ebenfalls mit den jeweiligen Virus-

stamm dur hgeführt, der au h als Template für die MSAntigene diente. Die Protokolle

sind ebenfalls publiziert; dur hgeführt wurden sie von PetraMauter.

In-house ELISA: Als Antigen der in-houseELISA diente ebenfalls der Virusstamm,

der als Template für die MSAntigene verwendet wurde. Bei den ELISA wurden über

Di htegradienten aufgereinigte Virionen verwendet. Die präsentierte Antigenstuktur um-

fasst daher alle oberä hli hen Proteine in ihrer natürli hen Konformation. Die in-

houseELISA wurden von KlausVogel dur hgeführt.

60

4.14. Laborgeräte und Hilfsmaterialien

CR ELISA CharlesRiver Laboratories, Wilmington (MA,USA)

IFA mikrobiologis he Diagnostik, DKFZ,Heidelberg

HAH mikrobiologis he Diagnostik, DKFZ,Heidelberg

In-house ELISA mikrobiologis he Diagnostik, DKFZ,Heidelberg

4.14. Laborgeräte und Hilfsmaterialien

Neben laborübli hen Geräten wie beispielsweise Zentrifugen, Heizblö ken, Vortexern,

S hüttlern, Wasserbädern, sowie Elektrophoreseapparaturen und Hilfsmaterialien wie

Pipetten und Erlenmeyerkolben wurden folgende Spezialgeräte und Materialien verwen-

det:

Elektroporationsgerät Gene PulserM

und PulseController

BioRad,Mün hen

Entwi klermas hine Curix 60 Agfa,Köln

Expositionskassette DIN6832 Dr.Goos-Suprema,Heidelberg

Geldokumentationsapparatur Herolab,Wieslo h

50µl Hamilton-Spritze Carl Roth,Karlsruhe

Ho hdru khomogenisator EmulsiFlex-

C5 (Fren hPress)

Avestin, (Ottawa,Kanada)

8-Kanal-Was hkamm Nun ,Wiesbaden

Küvetten für die Elektroporation Invitrogen,Karlsruhe

Luminex 100-Analyzer LuminexCorp., Austin (TX,USA)

Luminex SD (Puer-Reservoir) LuminexCorp., Austin (TX,USA)

LuminexXYP (xy-Rastertis h für

Was hplatten)

LuminexCorp., Austin (TX,USA)

MultiskanPLUSMKll (ELISAReader) Titertek, Huntsville (AL,USA)

Thermo y ler: PTC-200 Pel-

tierThermalCy ler

MJResear h In ., Bruno (Quebe ,Kanada

pH-Meter inoLab

R©, WTW,Weilheim

Plexiglasrahmen DKFZ,Heidelberg

SpeedVa Va uumCon entrator Ba hofer, Reutlingen

61

4. Material

Spektrophotometer HITACHI,Tokyo (Japan)

Transfer-Blot-Apparatur (Mini-

PROTEAN

R© ll)

BioRad,Mün hen

Ultras hallbad Bandelin (Sonorex), Berlin

Vakuum-Absaug-Einri htung für

Was hplatten

Millipore (MA,USA)

4.15. Software und Online Ressourcen

Mi rosoftWindowsVista, XP, 7 Mi rosoftCorp., Unters hleiÿheim

Mi rosoftO e 2003, 2000 Mi rosoftCorp., Unters hleiÿheim

Labordatenbank (Mi rosoftA ess) Rheinhard Merx, DKFZ

Ma OSX Apple ln ., Cupertino (CA, USA)

AdobeReader 8 Adobe Systems ln ., San Jose (CA, USA)

SigmaPlot 10 Systat Software, ln ., San Jose (CA, USA)

CloneManager Suite 7 S i-Ed Software, S ienti & Edu atio-

nal Software, Cary (NC, USA)

Luminex 100 lS 23 SP1Software LuminexCorp., Austin (TX, USA)

Heidelberg Unix Sequen e Analysis DKFZ, Heidelberg

Resour es (HUSAR) https://www.dkfz-heidelberg.de/menu/husar

GATCViewer GATC, Konstanz

NCBI www.n bi.nlm.nih.gov

PubMed www.n bi.nlm.nih.gov/pubmed

NEBDoubleDigestionFinder www.neb. om/nebe omm/doubledigest al ulator.asp

Kappa-Re hner www.graphpad. om/qui k al s/kappa1. fm

GraphPadPrism GraphPadSoftware, La Jolla (CA, USA)

DNASequenzkonverter http://www.bioinformati s.org/sms/rev_ omp.html

WinEdt 6.0 WinEdt In .

MiKTeX2.9 Christian S henk

62

5. Methoden

5.1. Proteinauswahl

Es wurden potentiell als diagnostis he Antigene geeignete Proteine anhand von Literatur

oder falls dies ni ht mögli h war der Funktion (Strukturproteine mit einem hohen

Anteil im Virion) ausgewählt (Tab. 5.1). Von Beginn des Projekts an war bekannt, dass

CR und andere kommerzielle Anbieter für die Parvovirusdiagnostik rekombinante NS1

und VP2Proteine verwenden. Wel he weiteren Proteine CR verwendet, ist erst in der

Validierungsphase des Projekts dur h persönli he Kommunikation in Erfahrung gebra ht

worden.

63

5.Methoden

Tabelle 5.1. Begründung für die Antigenauswahl in der Übersi ht

Virus Antigen Referenz weiterer Hinweis

Polyoma VP1 VISCIDI u. CLAYMAN 2006 KJÆRHEIM et al. 2007

K-Virus VP1 VISCIDI u. CLAYMAN 2006 Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

MadV-1 Fib. keine Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

MadV-1 Hex. keine Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

MuHV-1 UL55 PASS 2001 Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

MuHV-2 UL75 PASS 2001 Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

MuHV-1 pp150 PASS 2001 Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

MuHV-4 UL26.5 keine Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

MuHV-4 UL27 keine Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

VACV P35 ZINOV'EV et al. 1992 Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

VACV maj. env. keine Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

Parvovirus NS1 RILEY et al. 1996 SELETSKAIA 2004

Parvovirus VP2 BALL-GOODRICH et al. 2002 Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

TMEV 3ABC DEDIEGO et al. 1997

TMEV VP1 keine Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

EMCV 3ABC DEDIEGO et al. 1997

EMCV VP1 keine Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

MNV VP1 GREEN et al. 1993 JIANG et al. 1992

ratHEV N persönli he Kommunikation Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

Rainer Ulri h

FLI,Greifswald

LDV N persönli he Kommunikation Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

Sebastian Ulbert*,

64

5.1.Proteinauswahl

Tabelle 5.1. Begründung für die Antigenauswahl in der Übersi ht

Virus Antigen Referenz weiterer Hinweis

LDV M keine Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

MHV N WESSELING et al. 1993 Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

RCV N WESSELING et al. 1993 Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

SeV N keine Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

PVM N keine Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

LCMV NP SAIJO et al. 2007 Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

HTNV N PADULA et al. 2000 LUNDKVIST et al. 1993; ELGH et al. 1995; 1996

PUUV N PADULA et al. 2000 LUNDKVIST et al. 1993; ELGH et al. 1995; 1996

SEOV N PADULA et al. 2000 LUNDKVIST et al. 1993; ELGH et al. 1995; 1996

Reo Sigma1 keine Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion



RotaA VP6 FIELDS 2007 Strukturprotein mit hohem Anteil im Virion

*

Fraunhofer Institut für Zelltherapie und Immunologie IZI, Leipzig

65

5. Methoden

5.2. Molekulare Klonierung

5.2.1. Primerdesign

Die Primer wurden bis auf wenige Ausnahmen so ausgewählt, dass das gewüns hte Pro-

tein in voller Länge ampliziert werden konnte und auÿerdem die S hnittstellen für den

Restriktionsverdau und damit für die Klonierung enthalten waren (Tab. 5.2). Ausnah-

men bildeten hier sehr groÿe Proteine mit hydrophoben Transmembrandomänen (Zusatz:

trun für trun ated). Diese und Leadersequenzen wurden ausgespart und nur die Tei-

le, wel he vom Virion na h auÿen präsentiert werden, wurden ampliziert. Die Primer

wurden in 5′ → 3′-Ri htung generiert.

Ob der ORF im Vektor mit den Primern und den S hnittstellen gewährleistet war,

wurde mittels virtueller Klonierung mit Hilfe der CloneManager Software überprüft.

Gegebenenfalls wurden ein oder zwei Nukleotide willkürli h ausgewählt und zwis hen

der eigentli hen Primersequenz und der Restriktionss hnittstelle eingefügt.

Die Primer bestanden aus

• dem Beginn bzw. dem Ende komplementär zum gewüns hten Amplikationsstrang

des ORF plus ggf. bis zu drei Nukleotide zum Errei hen eines 3′-Ende mit G oder

C, für das gewüns hte Protein (min. 21 Nukleotide, die Primer, die zu Beginn des

Projekts verwendet wurden, weisen zum Teil weniger Nukleotide auf),

• einer Restriktionsstelle für die enzymatis he Spaltung zur Klonierung,

• falls nötig zusätzli h eingefügten Nukleotiden, um den ORF im Vektor zu gewähr-

leisten,

• einem Überhang von se hs willkürli h gewählten Nukleotiden zum S hutz vor Exo-

nukleaseaktivität.

66


Tabelle 5.2. Klonierungsprimer

S hnittstelle Klonierungsprimer Sequenz

BamH l PolyomaVP1 s CGA GTC G

′GA TCC ATG GCC CCC AAA AGA AAA AGC

Sal l PolyomaVP1 as GCA TGA G

′TC GAC ATT TCC AGG AAA TAC AGT CTT TG

BamH1 K-VirusVP1 s GCA TGA G

′GA TCC ATG GCT CCC ACA GTC AAA AAG

Sal l K-VirusVP1 as GCA TGA G

′TC GAC TGC CTC ATT GCT GGG AAT ATC

BamH l MAdV-1Fib. s GCA GTC G

′GA TCC ATG GTA GAG GCG CTA AAT GC

Sal l MAdV-1Fib. as GCA TGA G

′TC GAC ATA GTC TTC AGC ATA GTA CC

BamH l MAdV-1Hex. s CGA GTC G

′GA TCC ATG ACG ACG CCT TCA ATG CAG CC

Sal l MAdV-1Hex. as GCA TGA G

′TC GAC GGT GGT TGC GTT GCC GGC TG

BamH l MuHV-1UL55 s GCA GTC G

′GA TCC ACA CCAGGT ACT ACT CCG AAA G

Xma I MuHV-1UL55 long as GCA TGA CCC GGG AT GGG CGT GTT GTC GTT GAC TTT G

Sal l MuHV-1UL55sh as GCA TGA G

′TC GAC AGA AGC AGC AGT GGT ACC ATT TTC

BamH l MuHV-1 pp150 -ter. s GCA GTC G

′GA TCC ATG TCC CTC CAC GAC GAC ACC

Sal l MuHV-1 pp150 -ter. as GCA TGA G

′TC GAC GTG AGA CGA CGA CGA TTT TTT TAC

BamH l MuHV-1 pp150 n-ter. s GCA GTC G

′GA TCC ATG TCC GCT CGA GGG CGC GCG

Xma l MuHV-1 pp150 n-ter. as GCA TGA C

′CC GGG A CTC ATC GTC TCC CCC TAT GAG

BamH1 MuHV-1 UL75 trun s GCA GTC G

′GA TCC CGG ATC TCC AGA AAC ACC GTC

Xma I MuHV-1 UL75 trun as GCA TGA C

′CC GGG A GTT TTC GGG GTC CGT CAG GTA C

Bam MuHV-4UL26.5 s GCA GTC G

′GA TCC ATG ACA ACT GTG ACA GCT GGA ATG

Sal MuHV-4UL26.5 as GCA TGA G

′TC GAC TTT GGA GAG CTC TTC GCA AAA GAG

E oR l MuHV-4 UL27 trun s GCA GTC G

′AA TTC C ACT CTG AGG CAG CCA TCA GAC

Sal MuHV-4 UL27 trun as GCA TGA G

′TC GAC TCC AAT GTC TCC CAG ATC AGC

BamH l VACVp35 s GCA GTC G

′GA TCC ATG GCG GCG GTG AAA ACT CC

Sal l VACVp35 as GCA TGA G

′TC GAC GAT AAA TGC GGT AAC GAA TG

BamH l VACVp35sh s GCA GTC G

′GA TCC AAT GTT CAT GAG CAT ATT AAT G

Sal l VACVp35sh as GCA TGA G

′TC GAC AT CAA TCC AAA AAA TGA AAT CAG

BamH l VACVmaj. env. s CGA GTC G

′GA TCC ATG TGG CCA TTT GCA CCG GTA C

E oR l VACVmaj. env. as GCA TGA G

′AA TTC CA AAT TTT TAA CGA TTT ACT GTG G

BamH l KRVNS1 s CGA GTC G

′GA TCC ATG GCT GGA AAC GCT TAC TCC

Sal l KRVNS1 as GCA TGA G

′TC GAC GTC CAA TGT CAG TGA ATC GCT G

BamH l KRVVP2 s CGA GTC G

′GA TCC ATG AGT AAT GAC GCC AAT ACC

Sal l KRVVP2 as GCA TGA G

′TC GAC GTA TGT GTT GCG AGG TAC AGG

BamH l MVMNS1 s CGA GTC G

′GA TCC ATG GCT GGA AAT GCT TAC

Sal l MVMNS1 as GCA TGA G

′TC GAC GTC CAA GTT CAG CGG CT

BamH l RPVNS1 s CGA GTC G

′GA TCC ATG GCA GGC AAC CAG TAT TCC

Sal l RPVNS1 as GCA TGA G

′TC GAC GTC CAA GGT CAG CTC CTC GTT GAA G

67

5. Methoden



BamH l MPV-1VP2 s CGA GTC G

′GA TCC ATG AGT GAT GGC GCC GAG CAA CC

Sal l MPV-1VP2 as GCA TGA G

′TC GAC GTA AGT ATT TCT AGC AAC AGG

BamH l MPV-2VP2 s CGA GTC G

′GA TCC ATG AGT GAT GGC GCC GAG CAA TC

Sal l MPV-2VP2 as GCA TGA G

′TC GAC GTA AGT ATT TCT AGC AAC AGG TC

BamH l MVMVP2 s CGA GTC G

′GA TCC ATG AGT GAT GGC ACC AGC CAA C

Sal l MVMVP2as GCA TGA G

′TC GAC GTA AGT ATT TCT AGC AAC AGG

BamH l RPVVP2 s CGA GTC G

′GA TCC ATG AGT GAT GGA GGC

Sal l RPVVP2 as GCA TGA G

′TC GAC GTA GAT GTT TCT AGC

BamH l RMVVP2 s CGA GTC G

′GA TCC ATG AGT GAT GGC GCC AGC CAA TC

Sal l RMVVP2 as GCA TGA G

′TC GAC GTA TGT GTT GCG AGC TAC AGG

BamH l H-1PVVP2 s CGA GTC G

′GA TCC ATG AGT GAT GGC ACC G

Sal l H-1PVVP2 as GCA TGA G

′TC GAC GTA TGT CAT GTG AGG C

BamH l TMEV3ABC s CGA GTC G

′GA TCC TCC CCA CCA GAC TGG CAA CAC

Sal l TMEV3ABCas GCA TGA G

′TC GAC TTG CGG TTC CAG CGC CAA CAT AG

BamH l TMEVVP1 s CGA GTC G

′GA TCC GGA ATT GAC AAT GCT GAG AAG

Sal l TMEVVP1 as GCA TGA G

′TC GAC CTC AAG CTC AAG AAT GGG GAC

BamH l EMCV3ABCs CGA GTC G

′GA TCC GGG CCT GTT GAT GAA GTT AGC

Sal l EMCV3ABCas GCA TGA G

′TC GAC CTG GGG CTC GAA GGC CTG CAC

BamH l EMCVVP1 s CGA GTC G

′GA TCC GGC GTA GAA AAT GCA GAG AAG

Sal l EMCVVP1 as GCA TGA G

′TC GAC TTC AAG CAT AAG AAC TCC TGC

BamH l MNVVP1 s CGA GTC G

′GA TCC ATG AGG ATG AGT GAT GGC GCA

E oR l MNVVP1 as GCA TGA G

′AA TTC CA TTG TTT GAG CAT TCG GCC TGT TGC

BamH l ratHEVNCs GCA GTC G

′GA TCC ATG GTC GCT CTC GTG CTC GTG C

Sal l ratHEVNCas GCA TGA G

′TC GAC ACT ATC GGC GGC TGC TGC TGA C

BamH l LDVNCs CGA GTC G

′GA TCC ATG TCT CAA AAT AAG AAG AAA AGC

Sal l LDVNCas GCA TGA G

′TC GAC AGC AGA AGA ATT AGC AGA AGC

BamH l LDV Ms CGA GTC G

′GA TCC ATG GGA GGC CTA GAA TTT TGT G

Sal l LDV Mas GCA TGA G

′TC GAC TTT TGA GAC ATA CTT CAA AAG G

BamH l MHVNs CGA GTC G

′GA TCC ATG TCT TTT GTT CCT GGG CAA G

Sal l MHVNas GCA TGA G

′TC GAC CAC ATT AGA GTC ATC TTC TAA CC

BamH l RCVNs CGA GTC G

′GA TCC ATG TCT TTT GTT CCC GGA CAA G

Sal l RCVNas GCA TGA G

′TC GAC CAC ATT AGA GTC ATC TAA CCC

BamH l SeVNC s CGA GTC G

′GA TCC ATG GCC GGG TTG TTG AGC ACC

Sal l SeVNCas GCA TGA G

′TC GAC GAT TCC TCC TAT CCC AGC TAC

BamH l PVMNCs CGA GTC G

′GA TCC ATG TCT CTA GAC AGA TTG AAG C

68




Sal l PVMNCas GCA TGA G

′TC GAC AAT ATC ATC ATC AGG AGT GTC

BamH l LCMVNCs GCA GTC G

′GA TCC ATG TCT CTG TCC AAG GAG GTT AA

Sal l LCMVNCas GCA TGA G

′TC GAC AAG TGT CAC AAC ATT TGG TCC TC

Xma I HTNVNCs GCA GTC CCC

′GGG CA ATG GCA ACT ATG GAA GAA TTG

Sal l HTNVNCas GCA TGA G

′TC GAC TAA TTT TAA AGG TTC TTG GTT TG

Xma l PUUVNCs GCA TGA CCC

′GGG CA ATG AGT GAT CTG ACA GAT ATC

Sal l PUUVNCas GCA TGA G

′TC GAC TAT CTT AAG TGG ATC CTG ATT AG

E oR l SEOVNCs GCA TGA G

′AA TTC C ATG GCA ACT ATG GAA GAA ATC

Sal l SEOVNCas GCA TGA G

′TC GAC TAA TTT CAT AGG TTC CTG GTT TG

E oR l s Reo sigma1 s GCA TGA G

′AA TTC C ATG GAT CCT CGC CTA CGT GAA G

Sal l Reo sigma1 as GCA TGA G

′TC GAC CGT GAA ACT ACG CGG GTA CGA AAC

BamH1 Reo Sigma2 s GCA GTC G

′GA TCC ATG GCT CGC GCT GCG TTC CTA TTC

Sal l Reo Sigma2 as GCA TGA G

′TC GAC GAT AAG AGC TGC AAT TGC GGC AC

BamH l Reo Sigma3 s CGA GTC G

′GA TCC ATG GAG GTG TGC TTG CCC AAC

Sal l Reo Sigma3 as GCA TGA G

′TC GAC GCC AAG AAT CAT CGG ATC GCC

BamH l RotaAVP6 s GCA GTC G

′GA TCC ATG GAT GTG CTG TAC TCT ATT TC

Sal l RotaAVP6 as GCA TGA G

′TC GAC CTT TAC CAG CAT GCT TCT AAT G

5.2.2. Template Aufbereitung

Für die meisten Viren lag Zellkulturüberstand vor, wel her mit dem

QIAampDNAMiniKit aufgereinigt und dann als Template in die PCR eingesetzt

wurde. Für einige Viren wurden Plasmide oder Ba mide zur Verfügung gestellt

(Tab. 4.1). Lagen Plasmide/Ba mide als Template vor, so wurden sie auf 10 ng

pro PCR-Reaktionsansatz eingestellt, um eine Inhibition der PCR dur h zu viel

TemplateDNA zu vermeiden.

5.2.3. Präparative PCR und Aufreinigung

Es wurde ein 18fa her PCRAnsatz für jedes neue Template dur hgeführt

(Tab. 5.2,Tab. 5.3). Diese Maÿnahme erwies si h na h vielen erfolglosen Amplikations-

69

5. Methoden

versu hen aus unters hiedli hen Templates als notwendig. Die Art der dur hgeführten

PCR ist, bedingt dur h die einges hränkte Primerauswahl und die Templates, sehr we-

nig sensitiv. Deshalb wurde ein Ansatz erarbeitet, in dem zwei vers hiedene Puer, ein

MgCl

2

Gradient und au h ein DMSOGradient simultan verwendet wurden. Die Gradi-

enten sind in den 7µl variabler Zusammensetzung (Tab. 5.4) zu nden.

Tabelle 5.3. Variable Bestandteile der PCRAnsätze

Ansatz Nr. DMSO [µl MgCl

2

[µl Puer Puer [µl H

2

O [µl

1 3 4 GC 10 0

2 1,5 4 GC 10 1,5

3 3 2 GC 10 2

4 0 4 GC 10 3

5 1,5 2 GC 10 3,5

6 3 0 GC 10 4

7 0 2 GC 10 5

8 1,5 0 GC 10 5,5

9 0 0 GC 10 7

10 3 4 HF 10 0

11 1,5 4 HF 10 1,5

12 3 2 HF 10 2

13 0 4 HF 10 3

14 1,5 2 HF 10 3,5

15 3 0 HF 10 4

16 0 2 HF 10 5

17 1,5 0 HF 10 5,5

18 0 0 HF 10 7

Die AnnealingTemperatur wurde auf das niedrigste Niveau, wel hes no h mit dem Ther-

mo y ler mögli h ist, herabgesenkt (47

C) (Tab. 5.5). Hatte das zu amplizierende Gen

eine Länge von mehr als 2500 Basen, so wurde die Elongationszeit entspre hend verlän-

gert.

Die Analyse fand na h AgaroseGel-Elektrophorese (1,5% Agarose-Gel, 1µl EtBr/10ml

Gel, EP-Puer, 130V) statt. Unspezis he Banden wurden kaum beoba htet. Produkte,

die ni ht der erwarteten Gröÿe entspra hen, wurden beim Aufreinigen über ein Aga-

rosegel entfernt. Hierzu wurde das gesamte PCR-Produkt über ein Agarosegel (1,5%,

60V) aufgetrennt und die Bande mit der erwarteten Laufweite ausges hnitten und über

das QIAqui kGel Extra tionKit aufgereinigt. Diese Aufreinigung wurde au h in den

Fällen dur hgeführt, wo nur ein si htbares PCRProdukt vorhanden war, um au h kleine

70


Tabelle 5.4. Konstante Bestandteile der PCRAnsätze

Volumen [µl Komponente

2 Primer s (10µmol)

2 Primer as (10µmol)

2 dNTPs (10µmol)

10 Puer

0,5 Phusion Polymerase

0,5 aufgereinigte DNA

7 Variable Zusammenstzung

26 H

2

O

Tabelle 5.5. PCRProgramm

Reaktionss hritt Dauer [s Temperatur [

C

1 Initiale Denaturierung 30 98

2 Denaturierung 10 98

3 Annealing 75 47

4 Elongation 30 75

5 gehe zu S hritt 2 (35mal)

6 Finale Elongation 420 75

7 Reaktionsstop ∞ 4

71

5. Methoden

Mengen an fals hen Produkten zu vermeiden.

5.2.4. Vektor Präparation

Der Vektor pGEX4T3tag wurde für sämtli he Klonierungen und Expressionen dieser

Arbeit verwendet. Hierbei handelt es si h um einen kommerziellen Vektor, in den von

Peter Sehr, DKFZ zusätzli h zum vorhandenen GST als aminoterminale Fusionskompo-

nente des Inserts au h eine C-terminale Fusionskomponente das tag eingefügt wurde.

Bei dem tag handelt es si h um die 11 aminoterminalen Aminosäuren des SV40 groÿ-

TAntigens.

Die optimalen Reaktionsbedingungen der verwendeten Restriktionsenzyme wurden über

den double digest nder von NEB in Erfahrung gebra ht.

Tabelle 5.6. Reaktionsansatz zum Restriktionsverdau des Vektors

eingesetztes Material [µg bzw. µl Komponente

5µg Vektor

1µl Restriktionsenzym 1

1µl Restriktionsenzym 2

4µl vom Hersteller empfohlener Puer

ad 40µl H

2

O

Der Ansatz wurde bei der empfohlenen Temperatur (NEB, double digest nder) über

Na ht oder bei der HF-Version (HighFidelity-Version) 60min inkubiert und ans hlieÿend

über ein Agarose-Gel aufgereinigt.

5.2.5. Restriktionsverdau des PCR Produkts

Das PCRProdukt wurde auf die glei he Weise einem Restriktionsverdau unterzogen.

Ans hlieÿend wurden die Restriktionsenzyme sofern mögli h na h den Herstelleran-

gaben (NEB) inaktiviert.

72


5.2.6. Ligation

Die Ligation wurde mit variierenden Volumina (Vektor : Insert = 1 : 3), je na h verfügba-

rer Konzentration, dur hgeführt (Tab. 5.7). Sofern mögli h, wurden 100 ng Vektor und

300 ng Insert eingesetzt.

Tabelle 5.7. Reaktionsansatz zur Ligation

eingesetzte Menge [µl Komponente

Xµl Vektor

*

2,5µl Ligasepuer

1µl T4-DNALigase

Xµl Insert

*

ad 25µl H

2

O

X: variable Menge, zur Annäherung

ans Verhältnis Vektor : Insert = 1 : 3*

angepasst an das Verhältnis 1 : 3

Die Inkubation erfolgte bei RT 1h oder bei 16

C über Na ht. Die Ligation bei 16

C er-

zielt einen höheren Anteil des gewüns hten Produkts, während die Ligation bei RT mehr

Religationen des Vektors oder Fehlligationen der Komponenten untereinander enthalten

kann. In den meisten Fällen führte eine Ligation bei RT zum gewüns hten Ergebnis.

Die Ligase wurde für eine bessere Klonierungsezienz für 10min bei 65

C inaktiviert.

5.2.7. Dialyse

In Zellkulturs halen mit 4ml destilliertem Wasser und dem Reaktionsansatz auf einer

Nitrozellulosemembran (MilliporeDrop dialysis) wurde für 30min dialysiert.

5.2.8. Elektrotransformation

Das Plasmid wurde in E. oli DH5alpha transformiert. Mit Hilfe einer plasmid odier-

ten Ampi illinresistenz konnte eine Selektion dur h Zugabe von Ampi illin (100µg/ml)

dur hgeführt werden. Dur h zeitweise auftretende Probleme bei der Klonierung insbes.

am Anfang der praktis hen Arbeiten, deren Ursa he ni ht abs hlieÿend geklärt wur-

de, sind einige Plasmide abwei hend vom Standardprotokoll in E. oli BL21 (ebenfalls

73

5. Methoden

Ampi illin resistent) transformiert worden. E. oli BL21 ist ein proteasedezienter Bak-

terienstamm zur Expression rekombinanter Proteine. Auÿerdem fehlen diesem Stamm

vers hiedene Restriktionsenzyme, die zur Veränderung des eingebra hten Plasmids füh-

ren könnten. Aus diesem Stamm lassen si h ebenfalls gröÿere Mengen Plasmid aufrei-

nigen, aber au h die Gewinnung von gröÿeren Mengen an rekombinantem Protein ist

mögli h.

Zu a. 40µl Bakteriensuspension wurden 1-2µl Ligationsansatz hinzugegeben und in

eine vorgekühlte, tro kene Küvette pipettiert.

Einstellung des Elektroporationsgeräts

Spannung (U) = 2,3 kV

Kapazität (C) = 25µF

Widerstand (R) = 200Ω

Sofort na h dem Impuls wurden 200µl LB-Medium ohne Antibiotika hinzugegeben und

der Ansatz wurde 1 h bei 37

C inkubiert.

30-80µl dieser Suspension wurden auf LB-Agarplatten mit Ampi illin (100µg/ml) aus-

plattiert.

Na h einer Inkubation über Na ht bei 37

C wurden Einzelkolonien gepi kt und in 5ml

LB-Medium mit den entspre henden Antibiotika über eine weitere Na ht bei 37

C ver-

mehrt. Ans hlieÿend wurde eine Plasmid-Minipräparation dur hgeführt und zum Se-

quenzieren an Andreas Hunziker, MWG oder GATC vers hi kt.

5.2.9. Sequenzierung und Überprüfung der Sequenzen

Die Sequenzdaten-Fragmente wurden zum kompletten Insert zusammengefügt und auf

das Vorhandensein von Primersequenzen und Restriktionss hnittstellen überprüft. An-

s hlieÿend wurde mittels der BlastN2-Su he in HUSAR die ambesten übereinstimmende

Sequenz in der Datenbank Genbank ermittelt und mit dieser ein Sequenzabglei h (Clu-

stal) dur hgeführt.

74

5.3. Umtransformierung und Proteinexpression in E. oli BL21Rosetta oder E. oli BL21

5.3. Umtransformierung und Proteinexpression in

E.coli BL21 Rosetta oder E.coli BL21

Die überprüften Plasmide wurden na h dem obigen Transformationsprotokoll in E. oli

BL21Rosetta transformiert.

Um Einzelkolonien zu erhalten, wurde hier 1µl einer 1 : 100Verdünnung der Plasmid-

präparation transformiert und nur 10µl der Suspension ausplattiert.

E. oli BL21Rosetta besitzt zusätzli h im Verglei h zu E. oli BL21 ein weiteres Plasmid,

wel hes eine Resistenz gegen Chlorampheni ol (20µg/ml) enthält. Auÿerdem stellt dieser

Stamm se hs t-RNAs mit inE. oli selten verwendeten Codons zur Verfügung, wel he

besonders bei der Translation von eukaryotis hen Genen Verwendung nden.

Standardmäÿig wurde in E. oli BL21Rosetta umtransformiert. Wenn die Expression

des volle-LängeProteins in der tag-Titration kein Plateau auf der glei hen Höhe wie

das GST-tag Lysat zeigte, wurde überprüft, ob eine Expression in BL21 ein besseres

Ergebnis erzielt.

5.3.1. Kultur zur Proteingewinnung

Zur Gewinnung gröÿerer Proteinmengen wurde morgens 5ml LB-Medium inkl. der ent-

spre henden Antibiotikazusätze (BL21: Ampi illin; BL21Rosetta: Chlorampheni ol und

Ampi illin) mit den Bakterien angeimpft und bei 37

C unter S hütteln inkubiert. Am

Abend des glei hen Tages wurde die Vorkultur komplett in 200ml des glei hen Mediums

überführt und weiter inkubiert. Am nä hsten Morgen wurden die 200ml zu einem Liter

des Mediums hinzugegeben. Die weiteren S hritte erfolgten bei RT. Bei einer optis hen

Di hte bei 600 nm (OD

600

) von a. 0,5 wurden 200µM IPTG zur Bakteriensuspension

hinzugegeben und unter S hütteln für a. 6 h inkubiert. Das IPTG bindet an den la -

Repressor, der den Promoter reguliert, bewirkt dort eine allosteris he Konformationsän-

derung und ermögli ht damit das Ablesen des Gens für die Translation.

Na h den 6 h wurde die Suspension bei 6000RPM für 10min bei 4

C zentrifugiert,

das Bakterienpellet in 10ml Puer aufgenommen und der Überstand verworfen. Für

Strukturproteine wurde Garçea-Puer verwendet und für Ni htstrukturproteine PBS.

Das in Puer resuspendierte Bakterienpellet wurde bei 20

C bis zur Lyse gelagert.

75

5. Methoden

5.3.2. Lyse der Bakterien

Die Bakterienpellets wurden im Wasserbad bei 37

C aufgetaut. Ans hlieÿend wurde

2mM DTT zur Verhinderung der Oxidation von Sulfhydrylgruppen zu Disuldbrü ken

sowie 0,5ml Proteaseinhibitor pro Liter ursprüngli he Kultur (1 Tablette auf 1ml H

2

O)

zugesetzt. Die Lyse fand bei 10 000-15 000 kPa in der Fren hPress einem Ho hdru kho-

mogenisator (mit Eis vorgekühlt) statt. Es wurden maximal 5 Dur hläufe dur hgeführt.

Alle weiteren S hritte erfolgten unter permanenter Kühlung mit Eis. Die Strukturprotei-

ne, wel he in Garçea-Puer aufgenommen wurden, wurden im Ans hluss an die Behand-

lung mit der Fren hPress einer Spezialbehandlung mit 2mM ATP und 5mM Magne-

sium hlorid unterzogen. Mit diesen Zusätzen wurde das Lysat für 1 h unter S hwenken

bei RT inkubiert, um eine mögli hst natürli he Proteinfaltung zu ermögli hen.

Ans hlieÿend wurden alle Lysate 30min bei 14 000RPM bei 4

C zentrifugiert, um Zell-

trümmer abzutrennen. Na hdem die Proteinbestimmung na h Bradford und SDS-Proben

(s.u.) dur hgeführt bzw. angefertigt wurden, wurde zu dem Lysat das glei he Volumen

wasserfreies Gly erin hinzugegeben. Die Lagerung erfolgte bei 20

C.

5.4. Proteinanalytik

5.4.1. Proteinbestimmung nach Bradford

Die Bestimmung der enthaltenen Proteinmenge erfolgte mit der Methode na h Bradford

(BRADFORD 1976).

Bestandteile

• 200µl Roti-Quant Reagenz

• 800µl H

2

O

• 0,5µl Probe (Lysat na h Zentrifugation)

Das Reagenz wurde mit dem Wasser vermis ht, gevortext, und na h 5min wurde das

Lysat hinzugegeben. Na h erneutem Vortexen wurde na h weiteren 5min die Mis hung in

eine Küvette umgefüllt und im Photometer bei 595 nm gegen einen Leerwert gemessen.

76

5.4. Proteinanalytik

Das Ergebnis wurde na h einer früher erstellten Ei hkurve mit 44 multipliziert. Das

Ergebnis entspri ht der Proteinkonzentration inµg/µl.

5.4.2. SDS-PAGE

Für die SDS-PAGE wurden Proben der Lysate mit SDS-Probenpuer versetzt. SDS

zerstört ni htkovalente Bindungen; Tertiär- und Quartärstrukturen der Proteine werden

damit aufgebro hen. Es wurde jeweils eine Probe vor und na h der Zentrifugation im

Ans hluss an die Behandlung mit der Fren hPress verwendet. Es kann vorkommen, dass

das gewüns hte Protein unlösli h ist und mit den Zelltrümmern abzentrifugiert wird. Um

dies auszus hlieÿen, wurde au h die Probe vor der Zentrifugation überprüft. Die Proben

wurden auf 1µg Protein/µl eingestellt, und es wurden jeweils 10µl in eine Tas he des

A rylamid-Gels appliziert. Die Elektrophorese fand bei 200V und 400mA 50min lang

statt. Es wurde Laufpuer verwendet.

Bei der Gelelektrophorese dur hläuft die Probe zuerst das Sammelgel, in wel hem sie

si h auf einer einheitli hen Laufweite sammeln kann. Dadur h können im Trenngel klar

abgegrenzte Banden entstehen. Die Gele wurden 13,5%ig angefertigt.

Tabelle 5.8. Zusammensetzung von Trenn- und Sammelgel

Trenngel: Sammelgel:

3,2ml H

2

O 7,35ml H

2

O

7,5ml Tris 1MpH8,8 1,25ml 1MTris pH6,8

9ml A rylamid 1,33ml A rylamid

200µl 10%SDS 100µl 10%SDS

10µl Temed 10µl Temed

100µl 10%APS 50µl 10%APS

5.4.3. Coomassie Färbung

Zur Darstellung der Überexpression eines Proteins der erwarteten Gröÿe wurde die

Coomassie Färbung dur hgeführt. Hierzu wurde das PAGE-Gel 3mal für 15min lei ht

s hwenkend in H

2

Obidest gewas hen, um übers hüssiges Protein zu entfernen. Der Coo-

massie Farbsto (20ml) wurde 1 h bei RT unter lei htem S hwenken inkubiert. Ans hlie-

ÿend wurde 3mal 15min wie oben der überüssige Farbsto entfernt, so dass klare blaue

77

5. Methoden

Banden ohne Hintergrundfärbung entstanden. Das Gel wurde 3Tage bei RT zwis hen

Geltro knungsfolie getro knet.

5.4.4. Western Blot

Um darzustellen, dass im Lysat ein Protein in der erwarteten Gröÿe mit einem GST-

und einem tag-Teil enthalten ist, wurde ein Anti-GST bzw. ein anti-tagWestern Blot

dur hgeführt.

Aufbau der Blotapparatur

• Kathode (s hwarz)

• S hwamm

• Whatman 3MM Papier

• A rylamidgel

• Nitrozellulosemembran

• Whatman 3MM Papier

• S hwamm

• Anode (rot)

Zum Blotten wurde der Aufbau mit EMBL-Puer für 1 h bei 100V und 350mA mit

Eiskühlung unter Spannung gesetzt.

Na h dem Blotten wurde die Nitrozellulosemembran mit Mil hpulver in PBST (1 : 10)

zum Blo ken unspezis her Bindungsstellen s hwenkend für 1 h inkubiert. Na h dem

Blo ken wurde 3mal 10min mit PBST gespült. Die eine Membran wurde mit Maus-anti-

tag Antikörper 1 : 5000 in 5% Mil hpulver in PBST für 1 h bei RT inkubiert, die ande-

re Membran wurde analog mit Kanin hen-anti-GST 1 : 10 000 behandelt. Ans hlieÿend

wurde wie oben mit PBS-T gewas hen. Der Sekundärantikörper Ziege-anti-Kanin hen

bzw. Ziege-anti-Maus Ig-Peroxidasekonjugat wurde in 5% Mil hpulver in PBST 1 : 10 000

verdünnt und die Membran 1 h lang auf dem S hüttler inkubiert. Ans hlieÿend wurde

wieder wie oben mit PBST gewas hen. Zum Si htbarma hen wurde Luminol mit 0,2%

Enhan er 1min auf der Membran inkubiert. Damit wurde ein Röntgenlm beli htet und

ans hlieÿend entwi kelt.

78

5.5. Multiplex-Serologie

5.4.5. Tag-titration

Die tag-Titration bietet die Mögli hkeit, den relativen Gehalt des Lysats an volle-

LängeProtein abzus hätzen. Hierbei wird in einem GST-CaptureELISA das Lysat im

Verglei h zum StandardGST-tag Lysat mit dem Maus-anti-tag Antikörper titriert. Mit

dem Ergebnis ist es mögli h, die EC

50

anzugeben. Das ist die Lysatkonzentration, bei

der die Hälfte der maximalen OD des GST-tag Lysats errei ht wird. In dem Beispiel lag

die halbmaximale Konzentration von GST-tag bei 0,3mg/ml und die des zu testenden

Lysats bei 0,8mg/ml (5.1). Die tag-Reaktivität des zu testenden Lysats ist damit 2,7fa h

s hle hter als der Referenzwert des GST-tag Lysats.

96-Well-Mikrotiterplatten wurden mit 100µl Bes hi htungspuer pro Well vorbereitet,

damit si h Glutathion-Casein an die Oberä he bindet. Es wurde über Na ht bei 4

C

inkubiert. Dann wurde die Platte entleert und tro kengeklopft. Es wurden 180µl Blo k-

puer in jedes Well pipettiert und 1 h bei 37

C inkubiert. In Polystyrolplatten wurden

die Lysate in Blo kpuer vorverdünnt. Die hö hste Proteinkonzentration war 2µg/µl.

Die Verdünnung wurde in 1 : 3-S hritten in Duplikaten dur hgeführt. GST-tag Lysat

wurde auf die glei he Weise verdünnt und auf jeder Platte als Referenz verwendet. Die

bereits geblo kte Mikrotiterplatte wurde wieder entleert und tro kengeklopft und je

100µl der Vorverdünnung wurde übertragen, um 1h bei RT unter lei htem S hütteln

inkubiert zu werden. Die Platten wurden 5mal mit PBST gewas hen und ans hlieÿend

tro ken geklopft. Der Maus anti-tag Antikörper wurde in einer 1 : 5000 Verdünnung in

Blo kpuer mit 100µl pro Well verteilt und 1 h unter S hütteln bei RT inkubiert. Na h

erneutem Was hen wurde jedes Well mit 100µl Ziege-anti-Maus Ig-Peroxidasekonjugat

1 : 10 000 in Blo kpuer 1 h bei RT inkubiert. Na h erneutem Was hen wurde 100µl

Substratpuer mit 0,1mg/ml TMB und 0,006% H

2

O

2

in jedes Well hinzugegeben und

je na h si h entwi kelnder Farbintensität wurde na h 2 bis 8min die Reaktion mit 50µl

1M S hwefelsäure gestoppt. Die Messung fand im ELISAReader bei 450 nm statt.


Der Assay wurde in seinem grundlegenden Aufbau so übernommen, wie er von Tim Wa-

terboer für den Mens hen entwi kelt wurde (WATERBOER et al. 2005; WATERBOER

et al. 2006). VondiesemAufbau abwei hend wurden die neu entwi kelten nagerspezi-

s hen Antigene verwendet. Auÿerdem wurde für Maus und Ratte si h jeweils eines

79

5. Methoden

Lysatkonzentration[mg

ml

]

OD

450[%

]

GST

Rota A VP6

120

100

80

60

40

20

00.01 0.1 1 10 100 1000 10000

Abbildung 5.1. Exemplaris he tag-Titration

speziesspezis hen Zweitantikörpers bedient. Auf die Anwendung von CBS-K wurde

verzi htet. Es wird in der MS für Humanseren verwendet, um unspezis he Bindungen

unmittelbar an das Polystyrol der Beads zu blo ken.

Auÿerdem wurde neben der fürHumanseren verwendeten Verdünnung von 1 : 100 au h

eine Verdünnung von 1 : 500 getestet. Es stellte si h heraus, dass diese Verdünnung für

die Serologie von Maus und Ratte ebenso hohe MFI-Werte für positive Seren erbra hte,

aber insgesamt einen niedrigeren Ba kground erzielte (ni ht gezeigt). Deshalb wurden

alle weiteren Versu he in der Verdünnung 1 : 500 dur hgeführt.

5.5.1. Beladung der Beads

Die Lysate wurden auf 1µg/µl in Blo kpuer verdünnt. Es wurden 3000Beads pro Se-

rum hinzugegeben und 1 h unter S hütteln bei RT im Dunkeln inkubiert. Dabei wurde

alle 20min zusätzli h gevortext. Na h der Inkubation wurde 2min bei 13 000RPM zen-

triugiert und der Überstand verworfen. Mit 1ml Blo kpuer wurde das Beadpellet

resuspendiert. Es wurde gevortext und erneut zentrifugiert. Dieser Was hs hritt wurde

insgesamt 3mal wiederholt. Na h dem Verwerfen des letzten Überstandes kamen 200µl

Lagerungspuer hinzu, und die Beads wurden über Na ht bei 4

C dunkel gelagert.

80


5.5.2. Durchführung des eigentlichen Assays

2µl von 1 : 5 vorverdünnten, zu untersu henden Seren und 2µl Serumpools (Positivkon-

trolle) wurden in einer Polystyrolplatte 1 h lang in 98µl PVX-Blo kpuer inkubiert, um

unspezis he Bindungen zu blo kieren. Die Serumpools wurden so zusammengestellt,

dass gegen alle Viren, für die ein positives Serum verfügbar war, messbare Antikörper

vertreten waren. Ein Well wurde ohne Serum belassen, um die Ba kgroundreaktivi-

tät zu ermitteln. Ein weiteres Well wurde leer belassen, um in einem späteren S hritt

den Maus-anti-tag Antikörper zur Beadbeladungskontrolle aufzunehmen. Ans hlieÿend

wurden 50µl der vorinkubierten Seren zu 50µl Beadmix in einer Was hplatte gegeben

und 1 h lang unter lei htem S hwenken bei RT im Dunklen inkubiert. Das Was hen

der Beads erfolgte auf einer Was hstation, mittels wel her der Puer per Unterdru k

dur h die Filterböden abgezogen wird. Der Puer wurde 4mal entfernt und 3mal mit

100µl/Well Blo kpuer aufgefüllt. Na h dem Was hen wurden 100µl /Well des Tier-

art spezis hen biotinylierten Sekundärantikörpers (1 : 1000 in Blo kpuer) auf die Beads

gegeben. In ein Well ohne Serum und ohne Sekundärantikörper wurde der Maus-anti-

tag Antikörper (1 : 100 in Blo kpuer) hinzugefügt. Dieser Antikörper dient als Kontrolle,

darob in diesem Versu h ausrei hend volle-LängeProtein an die Beads gebunden war.

Wieder wurde 1 h bei RT im Dunkeln inkubiert. Es folgte ein weiterer Was hs hritt

mit der ans hlieÿenden Zugabe von 100µl/Well Strep-PE (1 : 700 in Blo kpuer). Na h

einem abs hlieÿenden Was hs hritt und der Wiederbefüllung der Wells mit je 100µl

Blo kpuer (oder Lagerungspuer bei Messung am nä hsten Tag) fand die Messung im

Luminex 100-Analyzer statt. Der Output wird in MFI (medianer Fluoreszenz-Intensität)

von min. 100 gemessenen Beads angegeben. Die Versu he, die bei CR dur hgeführt wur-

den haben min. 50Beads zur Grundlage. Der Median ma ht die Werte besonders robust

gegenüber eventuell vers hleppten Beads.

5.5.3. Definition von Seropositivität

Es wurden zwei groÿe Versu he dur hgeführt, deren Ergebnisse Grundlage dieser Arbeit

sind. Am DKFZ wurde mit allen zur Verfügung stehenden Seren ein Versu h dur hge-

führt. Bei CR in Wilmington,MA wurde ein zweiter groÿer Versu h dur hgeführt, wofür

Seren von CR zur Verfügung gestellt wurden. Für beide groÿen Versu he wurde jeweils

ein Cut-o bestimmt. Die Ergebnisse der Cut-o Bestimmung unters hieden si h lei ht,

da lei hte Ergebniss hwankungen zwis hen zwei Labors bei jeder Art von Versu hen zu

81

5. Methoden

erwarten sind. Die negativ denierten Seren, die jeweils zur Verfügung standen, waren

aus unters hiedli hen Quellen. Die Lysate mussten für den Transport auf Tro keneis auf

80

C gekühlt werden, weil eine zuverlässige Kühlung auf 20

C im Paket ni ht mög-

li h war. Bei diesen Temperaturen gefrieren die Lysate trotz des Gly erinanteils und die

Proteinstruktur könnte dur h den Gefrier-Tau-Zyklus S haden nehmen, und damit die

Ergebnisse beeinussen.

Grundsätzli h ist die MS in niedrigen MFI-Berei hen ni ht so präzise wie in höheren

MFI-Berei hen. Te hnis h ist es daher ni ht sinnvoll, für einen Assay, der in der Routi-

ne Anwendung nden soll, einen Cut-o < 100 zu wählen. Für einen routinetaugli hen

Su htest ist es auÿerdem wi htig, nur ein übers haubares Maÿ an positiven Ergebnis-

sen innerhalb einer überwa hten Population zu produzieren. Deshalb wurde als weite-

res Kriterium für die Wahl des Cut-os die Spezität gewählt. Alle einzelnen Cut-os

sind so gewählt, dass in der überwa hten Population min. 98% der Seren negativ sind

(Tab. 5.10, Tab. 5.9). Lag dieser mit Hilfe des Re eiver Operating Chara teristi (ROC)

Makros von SigmaPlot erre hnete Cut-o unter 100MFI, so gilt der Mindest-Cut-o von

100MFI. Mit dem na h diesen Kriterien festgelegten Cut-o wurde dann überprüft, ob

die Sensitivität für einen Su htest ausrei ht. Hatte die MS eine höhere Sensitivität als

der Referenztest, lieÿ si h dies nur mit Hilfe von anderen positiven Ergebnissen unter-

mauern. Zum einen konnten andersartige Referenztests eine positive Bestätigung des

Ergebnisses erbringen. Zum anderen konnten aber au h Käggenossen, die wahrs hein-

li h den glei hen Viren ausgesetzt waren, positive Ergebnisse zeigen. Lag der erre hnete

Cut-o über 500MFI, was bei den Ratten häuger der Fall war, so wurde der Cut-o

auf 500 festgelegt.

Zu den Spezitäten, die mit Hilfe von Vierfeldertafeln im Validierungsteil erre hnet wur-

den, ist anzumerken, dass sie in der überwa hten Population na h der Denition immer

bei 98% lagen, mit Ausnahme der Antigene, deren erre hneter Cut-o über 500MFI lag.

Spezitäten im Validierungsteil unter 98% lieÿen si h häug auf eine höhere Sensitivität

in der MS zurü kführen.

82


Tabelle 5.9. Cut-os bei der Maus

DKFZ CR

Maus Cut-o

erre hnet

Cut-o an-

gewendet

Cut-o

erre hnet

Cut-o an-

gewendet

[MFI [MFI [MFI [MFI

PolyomaVP1 57

*

45

*

K-VirusVP1 55

*

62

*

MAdV-1Fib. 62

*

52

*

MAdV-1Hex. 37

*

21

*

MuHV-1UL55sh 25

*

7

*

MuHV-1 pp150 -ter 79

* −

MuHV-4UL26.5 56

*

153 153

MuHV-4UL27 65

*

39

*

ECTVp35 28

*

8

*

ECTVmaj. env. 53

*

29

*

KRVNS1 74

*

29

*

MVMNS1 96

* −

RPVNS1 89

* −

MPV-1VP2 42

*

239

*

MPV-2VP2 49

*

26

*

MVMVP2 66

*

24

*

H-1PVVP2 105 105 54

*

KRVVP2 43

*

51

*

RMVVP2 62

*

23

*

RPVVP2 66

*

21

*

TMEV3ABC 116 116 106 106

TMEVVP1 34

*

22

*

EMCV3ABC 48

*

34

*

EMCVVP1 89

* −

MNVVP1 63

*

101 101

ratHEVN 28

*

6

*

LDVN 45

*

21

*

MHVN 108 108 37

*

RCV/SDAVN 79

* −

SeVN 65

*

94

*

LCMVN 209 209 83

*

83

5. Methoden

Tabelle 5.9. Cut-os bei der Maus

DKFZ CR

Maus Cut-o

erre hnet

Cut-o an-

gewendet

Cut-o

erre hnet

Cut-o an-

gewendet

[MFI [MFI [MFI [MFI

PVMN 60

*

81

*

HTNVN 412 412 336 336

PUUVN 136 136 67

*

SEOVN 438 438 584 584

Reo Sigma1 156 156 54

*

RotaAVP6 96

*

50

*

* Mindest-Cut-o 100MFI

−: ni ht verwendet

Grau hinterlegt: spezis he Antikörper sind bei Mäusen ni ht zu erwarten

Tabelle 5.10. Cut-os bei der Ratte

DKFZ CR

Ratte Cut-o

erre hnet

Cut-o an-

gewendet

Cut-o

erre hnet

Cut-o an-

gewendet

[MFI [MFI [MFI [MFI

PolyomaVP1 279 279 117 117

K-VirusVP1 272 272 108 108

MAdV-1Fib. 70

*

55

*

MAdV-1Hex. 94

*

44

*

MuHV-1UL55sh 26

*

33

*

MuHV-1 pp150 -ter 43

* −

MuHV-4UL26.5 272 272 230 230

MuHV-4UL27 200 200 103 103

ECTVp35 89

*

30

*

ECTVmaj. env. 132 132 74

*

KRVNS1 96

*

56

*

MVMNS1 99

* −

RPVNS1 85

* −

MPV-1VP2 275 275 77

*

84


Tabelle 5.10. Cut-os bei der Ratte

DKFZ CR

Ratte Cut-o

erre hnet

Cut-o an-

gewendet

Cut-o

erre hnet

Cut-o an-

gewendet

[MFI [MFI [MFI [MFI

MPV-2VP2 264 264 74

*

MVMVP2 204 204 111 111

H-1PVVP2 228 228 207 207

KRVVP2 112 112 70

*

RMVVP2 140 140 45

*

RPVVP2 107 107 55

*

TMEV3ABC 135 135 118 118

TMEVVP1 80

*

212 212

EMCV3ABC 490 490 138 138

EMCVVP1 97

* −

MNVVP1 68

*

84

*

ratHEVN 16

*

10

*

LDVN 33

*

24

*

MHVN 793 500 185 185

RCVN 159 159 −

SeVN 60

*

134 134

LCMVN 605 500 63

*

PVMN 2179 500 449 449

HTNVN 2014 500 176 176

PUUVN 2437 500 117 117

SEOVN 1561 500 389 389

Reo Sigma1 212 212 44

*

RotaAVP6 203 203 84

*

*

Mindest-Cut-o 100MFI

−: ni ht verwendet

Grau hinterlegt: spezis he Antikörper sind bei Ratten ni ht zu erwarten

85

6. Ergebnisse

6.1. Generierung der Expressionsklone

Im Sequenzverglei h war in den meisten Fällen die Übereinstimmung zu den dur h

BlastN2 ermittelten Datenbankeinträgen der Referenzsequenzen sehr groÿ (Tab. 6.1).

In 13 von 41 Fällen stimmten die Nukleotidsequenzen vollständig überein. Auf Amino-

säuresequenzebene zeigten 18 Klone eine vollständige Übereinstimmung zur publizierten

Sequenz. LCMVNP zeigte 106 Abwei hungen zur Referenzsequenz auf NTEbene, aber

nur 5 Abwei hungen auf AS Ebene. Die Wahrs heinli hkeit, dass relevante Abwei hun-

gen in den antigenetis hen Eigens haften vorlagen, ist in allen Fällen gering.

87

6.Ergebnisse

Tabelle 6.1. Identität der klonierten Sequenzen

Virus Antigen Referenzsequenz Lokation in

der Referenzse-

quenz

Nukleotidabwei hungen

gezählt von Beginn des

klonierten Gens/Teils

Aminosäurenabwei hungen

gezählt von Beginn des klo-

nierten Gens/Teils

Polyoma VP1 AF442959.1 2932..4086

omplement

− −

K-Virus VP1 EF186666.1 2847..3947

omplement

493 G→C 165 E→Q

MadV-1 Fib. M30594.1 1790..3631 − −

MadV-1 Hex. M81889.1 273..3002 526 G→C; 581 A→C 176 A→P; 194 K→T

MuHV-1 UL55long U68299.1 85696..83597 − −

MuHV-1 UL55short U68299.1 85696..84341 − −

MuHV-1 pp150 -ter GU305914.1 40389..39286 − −

MuHV-4 UL26.5 U97553.2 28324..29193

omplement

846 C→A −

MuHV-4 UL27 U97553.2 16506..19055

(von die-

sem Teil

103. . . 2109)

17 T→G 6 I→S

VACV p35 AM501482.1 88570..89544

omplement

− −

VACV maj. env. AY678276.1 41075..42193

omplement

689 G→A −

KRV

1

NS1 AF321230.1 220..2238 1721 T→A 574 I→N

RPV NS1 AF036710.1 254..2269 − −

88

6.1.GenerierungderExpressionsklone



der Referenzse-

quenz






nierten Gens/Teils

MVM

1

NS1 V01115.1 261..2276 383 G→T; 1721 A→C 128 C→F; 574 N→T

KRV

1

VP2 AF321230.1 2749..4494 1292 G→A 431 R→K

RPV VP2 AF036710.1 2784..4553 − −

RMV VP2 AF332884.1 2742..4502 633 C →T; 696 C→T;

714 G→A; 774 A→G;

1075 T→A; 1386 C→T;

1496 A→G; 1734 T→C

359 S→T

H-1PV VP2 X01457.1 2797..4575 311 Insertion TGA; 881

Insertion G; 893 Deleti-

on G; 1514 A→G

105 Insertion D; 295-299

ACLQG→GMPPR; 506

H→R

MVM

1

VP2 X02481.1 2795..4555 38 G→C 13 G→A

MPV-1

1

VP2 U12469.1 2798..4558 509 A→G; 730 T→G;

1258 T→C

170 N→S; 244 S→P; 420

S→P

MPV-2 VP2 DQ196319.1 2665..4428 − −

TMEV 3ABC X56019.1 5619..6593 − −

TMEV VP1 X56019.1 3006..3833 − −

EMCV 3ABC DQ294633.1 5313..6251 25 T→G; 49 G→A; 71

G→A; 532 A→C; 672

C→T

9 Y→H; 17 A→T; 78 I→L

EMCV VP1 M88547.1 1962..2792 187 C→A; 455 A→C;

637 T→G

63 Q→K; 152 N→T; 213

Y→D

89

6.Ergebnisse



der Referenzse-

quenz






nierten Gens/Teils

MNV VP1 DQ285629.1 5056..6681 − −

ratHEV N GQ504009.1 2006..3940 4-6 Deletion CTG; 102

C→T; 252 C→T; 351

T→C; 771 G→A; 810

C→T; 885 T→C; 1044

T→C; 1195 G→A; 1153

T→G; 1161 T→C; 1264

T→C; 1286 C→T; 1930

del GTC

2 Deletion R; 385 F→V;

429 P→L; 644 del V

LDV N S50060.1 51..398 68 A→G; 129 C→T;

156 A→G; 162 T→C;

165 C→T; 183 T→A;

204 A→G; 240 A→G;

252 A→G; 258 C→T;

267 G→A; 312 T→C

23 N→S

90

6.1.GenerierungderExpressionsklone



der Referenzse-

quenz






nierten Gens/Teils

LDV M U15146.1 13175..13690 40 C→A; 46 C→T;

84 C→T; 87 C→T; 77

C→T; 187 G→C; 195

C→T; 219 T→A; 225

T→A; 231 C→T; 252

C→T; 264 A→G; 393

T→G; 474 A→G

14 Q→K; 63 V→L

MHV N FJ647224.1 29791..31164 113 C→T; 387 C→T;

723 C→T

38 P→L

RCV/

SDAV

N D10760.1 30..1394 397 A→G; 888 T→C;

894 C→T; 1053 A→C

133 T→A; 351 Q→H

SeV N X17218.1 65..1639 378 G→A; 449 T→A;

450 A→T; 1060 G→A;

1228 G→A

150 V→D; 354 G→R; 410

E→K

PVM N AY743910.1 1068..2249 235 A→G 79 S→G

LCMV NP DQ868487.1 1621..3297

omplement


siehe Zusatztabelle

429 V→A; 442 V→M; 460

I→V; 481 K→R; 530 T→S

91

6.Ergebnisse



der Referenzse-

quenz






nierten Gens/Teils

HTNV N M14626.1 37..1326 15 G→A; 21 A→G;

1130 G→A; 1266

C→A; 1275 G→A;

1281 G→A; 1285

C→T; 1287 C→A

262 N→X; 377 G→D

PUUV N U14137.1 43..1344 468 del G; 473 G→A;

474 ins T; 1237 T→C

157 Y→I; 158 R→I

SEOV N EF536376.1 1..1290 15 G→A; 1266 G→A;

1275 G→A

−

Reo Sigma1 GU991665.1 13..1380 65 C→T; 487 A-T; 492

G→A; 746 C→T; 757

T→G

22 A→V; 163 T→S; 249

T→I; 253 Y→D

Reo Sigma2 GU991666.1 19..1275 1239 G→A; 1248 C→T −

Reo Sigma3 GU991668.1 33..1130 − −

RotaA VP6 GQ479952.1 24..1217 21 C→T; 384 C→T −

1

Kloniert von Angelika Mi hel

−fand keine Anwendung

92

6.1. Generierung der Expressionsklone

Tabelle 6.2. Identität der klonierten Sequenzen (Zusatz)

Nukleotidabwei hungen für LCMVN:

15 A→G; 18 A→G; 21 C→T; 30 T→C; 33 G→A; 39 C→T; 42 A→G; 51 A→G; 63 G→A; 75

A→T; 84 G→A; 96 C→T; 129 T→C; 141 G→A; 144 C→T; 147 C→T; 168 G→A; 177 G→A;

190 T→C; 195 G→A; 234 G→A; 276 G→A; 303 T→C; 315 T→C; 348 T→C; 366 T→C; 381

G→A; 384 T→C; 417 A→G; 468 G→A; 502 C→T; 507 T→C; 519 C→A; 531 C→T; 537 A→G;

546 T→C; 555 A→G; 561 A→G; 588 G→A; 634 C→T; 648 G→A; 652 C→T; 657 A→G; 663

G→A; 678 A→G; 693 A→G; 699 T→C; 708 C→T; 720 T→C; 729 T→C; 765 G→A; 774 C→T;

781 T→C; 792 C→T; 795 A→G; 798 T→C; 807 C→T; 867 T→C; 876 A→G; 882 G→A; 903

C→T; 954 T→C; 957 A→G; 975 A→G; 978 G→A; 1035 A→G; 1053 A→C; 1065 A→G; 1071

T→C; 1074 A→G; 1086 A→G; 1107 T→C; 1113 A→G; 1173 A→G; 1221 T→C; 1236 C→T;

1286 T→C; 1296 C→T; 1317 A→G; 1320 C→T; 1323 G→A; 1327 G→A; 1329 A→G; 1344

G→A; 1354 T→C; 1378 A→G; 1380 C→T; 1390 C→T; 1398 A→G; 1431 C→A; 1442 A→G;

1443 A→G; 1452 A→G; 1482 A→G; 1527 G→A; 1584 C→T; 1587 C→T; 1588 A→T; 1590

C→T; 1608 C→T; 1

Für ECTV stand kein Template zur Verfügung. Daher wurde VACV verwendet, wel hes

ebenfalls ein Orthopoxvirus ist und mit dem starke Kreuzreaktionen zu erwarten sind

(siehe 3.4.1, S. 21). Unter den ausgewählten Antigenen waren au h Membranproteine.

Diese zei hnen si h dur h eine Leadersequenz

1

und hydrophobe Transmembrananteile

aus. Bei MuHV-1,UL55long und short (sh), und VACVp35sh wurden diese bei der Klo-

nierung ausgelassen (Tab. 6.3). Diese Teile besitzen keine antigenetis hen Eigens haften

und ma hen das Protein sehr groÿ (und ers hweren damit die Expression). Die hydro-

phoben Eigens haften können auÿerdem die Lösli hkeit beeinträ htigen. MuHV-1 pp150

ist ein groÿes Protein (105,9 kDa). Um S hwierigkeiten bei Amplikation und Expression

dur h die Gröÿe zu vermeiden, wurde es in ein n- und ein -terminales Stü k aufgeteilt.

Die Amplikation des n-terminalen Stü kes ist aus ungeklärten Gründen ges heitert,

ebenso wie der initiale Versu h, das Gen in voller Länge zu amplizieren. Das -terminale

Stü k zeigte in initialen Versu hen keine Reaktivität mit Referenzseren und wurde daher

ni ht weiter validiert.

1

hierüber wird das Protein in der Wirtszelle an seinen Bestimmungsort in der Membran geführt

93

6.Ergebnisse

Tabelle 6.3. Modizierte Proteine

Virus

Antigen

alternativer

Nam

e

Lokalisation

im

Virion

Lösli hkeit

des

Prote-

ins

volle-L

änge

2

[A

S

exprim

ierter

Teil

[A

S

exprim

iertes

Protein

2

[kD

a

Grund

für

Kürzung

MuHV-1 UL55 long GlykoproteinB Envelope unlösli h 938 40-740 104 Leadersequenz und

Transmembrandomäne

MuHV-1 UL55 short GlykoproteinB Envelope unlösli h 938 40-492 76,72 Leadersequenz und

Transmembrandomäne

MuHV-1 pp150 -ter 150 kDa Phosphoprotein Tegument lösli h 718 350-718 67,48 Gröÿe

MuHV-4 UL27 GlykoproteinB Envelope unlösli h 850 34-703 100,59 Leadersequenz und

Transmembrandomäne

VACV p35sh immunodominant

enveolpe protein

Envelope unlösli h 325 23-286 55,93 Leadersequenz und

Transmembrandomäne

Die Bezei hnungen mit UL beziehen si h auf den ORF des Gens

1

ohne GST und tag

2

mit GST-tag

94

6.2. Herstellung und Charakterisierung der Antigene


6.2.1. Immunbiochemische Charakterisierung der Antigene

Der Anti-tagWesternBlot (WB) zeigte bei vielen Proteinen eine Bande in einer erwar-

teten Laufweite, die stärker ausgeprägt war als die Nebenbanden (Tab. 6.4). Tag-haltige

Bru hstü ke des Proteins waren meist ebenfalls zu sehen (siehe Abbildungen im An-

hang). Die quantitative Ausprägung der Bru hstü ke war sehr unters hiedli h und ist

subjektiv beurteilt worden. Traten Banden mit geringerer Laufweite als erwartet auf, so

kann es si h hier um Polymere handeln, die trotz der SDSBehandlung ni ht dissoziiert

sind.

Der Anti-GSTWB lieferte zusammen mit dem Anti-tagWB Informationen darüber, ob

es bei der Translation zum Abbru h des Proteins kam und damit nur GST und kein tag

na hweisbar war. Auÿerdem zeigte si h hier, ob viele GST-haltige Bru hstü ke vorhan-

den waren, die um die Bindungsstellen am Glutathion konkurrierten. Diese Bru hstü ke

würden dann au h zu einem niedrigen Signal in der tag-Titration führen.

Die Färbung na h Coomassie zeigte nur in man hen Fällen eine deutli he Überexpression

eines bestimmten Proteins (siehe CoomassieGele, S. 395). In der Anwendung im Assay

aber zeigten Lysate mit gering ausgeprägter Überexpression sensitive und spezis he

Reaktionen mit positiven Referenzseren, sodass die na h Coomassie gefärbten Gele nur

bedingt zur Qualitätsbeurteilung der Proteine geeignet waren und hier nur exemplaris h

aufgeführt werden.

95

6. Ergebnisse

6.2.2. Quantitative Charakterisierung der Antigene

Zur Eins hätzung, wieviel volle-LängeProtein im Verglei h zu GST-haltigen Bru h-

stü ken im Lysat vorhanden war, wurde die Anti-tag Titration dur hgeführt.

Alle Lysate zeigten eine Reaktivität mit dem Maus-anti-tag Antikörper. In wenigen Fäl-

len wurde das Plateau, wel hes si h bei Sättigung einstellt, ni ht auf der glei hen Höhe

errei ht, wie es vom GST-tag Lysat errei ht wurde (Abb. 6.1). Als Gröÿe zur Beurtei-

lung wurde der absolute EC

50

-Wert herangezogen, wie zusammenfassend dargestellt ist

(Tab. 6.4). Der relative EC

50

-Wert rei hte von Faktor 0 bei Proteinen, die eine höhere

tag-Aktivität zeigten als GST-tag Lysat, bis zu Faktor 1143 bei VACVp35.

Im Folgenden soll auf Proteine näher eingegangen werden, die mit ihren Reaktionen in

der Anti-tag Titration niedrige Reaktivitäten zeigten.

MAdV-1Hexon und MAdV-1Fiber zeigten relativ wenig tag-Reaktivität im Verglei h

zum GST-tag Lysat ohne virales Protein (Abb. 6.1). Beide Proteine sind relativ groÿ

(Fib. 94 kDa und Hex. 127 kDa), was die Expression besonders für Hexon wahrs heinli h

ers hwert hat.

MuHV-1UL55long zeigte nur wenig Reaktion mit dem Anti-tag Antikörper, bei einem

hohen Ba kground (Abb. 6.1). Den glei hen Ba kground zeigte au h die gekürzte Versi-

on des Proteins MuHV-1UL55sh. UL55sh zeigte aber eine Reaktionskurve verglei hbar

mit anderen, gut exprimierten Proteinen. UL55long war oensi htli h wie au h s hon

der WesternBlot zeigte nur sehr wenig mit dem -terminalen tag ausgestattet. Eine

Anwendung in der MS entel aufgrund der sehr s hle hten Ergebnisse. UL55sh wurde

in der MS mit Referenzseren getestet und validiert.

VACVp35 hatte ebenfalls eine geringe tag-Reaktivität (Abb. 6.1). Dieses Protein ent-

hält hydrophobe Transmembrandomänen, wel he bei p35sh entfernt wurden. In der

Anti-tag Titration hatte dies einen positiven Eekt auf die relative Menge des volle-

LängeProteins. In Vorversu hen wurden beide Proteine in der MS gestestet, und es

stellte si h heraus, dass p35sh im Gegensatz zu der längeren Variante p35 nur eine

sehr geringe Reaktivität mit Referenzseren zeigte, weshalb p35sh im Rahmen dieser Ar-

beit ni ht weiter validiert wurde. Dur h die fehlenden Sequenzabs hnitte, die selbst keine

antigenetis hen Eigens haften haben, können si h aber die Konformation des Proteins

und somit au h konformationelle Epitope verändern oder lineare Epitope innerhalb des

Proteins unzugängli h werden.

96


Die vers hiedenen NS1Proteine verhielten si h in der Anti-tag Titration miteinander

verglei hbar, wie es aufgrund der Ähnli hkeit zu erwarten war. Sie zeigten hohe Reakti-

vitäten mit dem Anti-tag Antikörper (relative EC

50

1-9) (Abb. 6.1).

Ebenso verhielten si h die vers hiedenen ParvovirusVP2Proteine für die Ratte im

Verglei h untereinander sehr ähnli h. Sie zeigten deutli he Reaktionen mit dem Anti-

tag Antikörper (relative EC

50

2-11) (Abb. 6.1).

Die ParvovirusVP2Proteine für die Mäuse zeigten aber deutli he Unters hiede zueinan-

der (EC

50

6-86). MPV-1VP2 war das Lysat mit der geringsten Reaktion (Abb. 6.1).

Das 3ABCProtein der Pi ornaviren, wel hes si h im WesternBlot ni ht als volle-

LängeProtein zeigte, hatte aber ein hohes Anti-tag Signal in der Titration. Dies könnte

an einer Reassemblierung unter ni ht denaturierenden Bedingungen liegen. Das Protein

wurde womögli h gespalten, lagerte si h aber unter den Bedingungen, wie sie im ELISA

herrs hen, wieder zusammen. Unter diesen Umständen wäre eine Nutzbarkeit in der MS

ni ht beeinträ htigt (Abb. 6.1).

Das NAntigen von ratHEV errei hte das Plateau der tag Reaktion ni ht auf einem

ähnli hen Level, wie die anderen Proteine. Au h der EC

50

-Wert dieses relativ groÿen

Proteins war um das 86fa he niedriger als der von GST-tag (Abb. 6.1). In der MS wurde

dieses Protein trotzdem validiert.

RCVN und MHVN sehen si h in der Sequenz sehr ähnli h (92,6%

ASÜbereinstimmung). In der Anti-tag Titration hatte RCVN jedo h eine deut-

li h höhere EC

50

als MHVN (0 vs. 26) (Abb. 6.1).

LCMVNP hatte einen sehr hohen relativen EC

50

Wert (286fa h höhere Proteinkonzen-

tration als für GST-tag alleine) (Abb. 6.1). Eine Erklärung hierfür ist ni ht oensi htli h.

Eine Validierung in der MS fand aber statt.

Reo Sigma2 hatte ebenfalls eine sehr niedrige Reaktivität in der Anti-tag Titration

(Abb. 6.1). Hier kam hinzu, dass die Proteinkonzentration im Lysat so gering war, dass

ein Einsatz in der MS aus te hnis hen Gründen ni ht mögli h war. Reo Sigma3 ex-

primierte zwar deutli h besser als Sigma2, zeigte aber in Vorversu hen kaum erhöhte

MFI-Werte mit Referenzseren. Au h dieses Antigen wurde im Rahmen der vorliegenden

Arbeit ni ht weiter validiert.

97

6. Ergebnisse

Abbildung 6.1. Anti-tag Titrationen und Ermittlung der EC

50

-Werte für die einzelnen An-

tigene

0.01 0.1 1 10 100 1000 100000

20

40

60

80

100

120GST-tag

MAdV-1 Fib.

MAdV-1 Hex.

Polyoma VP1

K-Virus VP1

Lysatkonzentration[mgml

]

OD

450[%

]

0.01 0.1 1 10 100 1000 100000

20

40

60

80

100

120

GST-tag

MuHV-1 UL55sh

MuHV-4 UL26.5

MuHV-4 UL27

MuHV-1 UL55long

MuHV-1 pp150 c-ter.


]

OD

450[%

]

98


0.01 0.1 1 10 100 1000 100000

20

40

60

80

100

120

GST-tag

VACV maj. env.

VACV p35sh

VACV p35


]

OD

450[%

]

0.01 0.1 1 10 100 1000 100000

20

40

60

80

100

120

GST-tag

KRV NS1

MVM NS1

RPV NS1


]

OD

450[%

]

99

6. Ergebnisse

0.01 0.1 1 10 100 1000 100000

20

40

60

80

100

120

GST-tag

H-1 PV VP2

KRV VP2

RPV VP2

RMV VP2


]

OD

450[%

]

0.01 0.1 1 10 100 1000 100000

20

40

60

80

100

120

GST-tag

MPV-2 VP2

MVM VP2

MPV-1 VP2


]

OD

450[%

]

100


0.01 0.1 1 10 100 1000 100000

20

40

60

80

100

120

GST-tag

EMCV 3ABC

EMCV VP1

TMEV 3ABC

TMEV VP1


]

OD

450[%

]

0.01 0.1 1 10 100 1000 100000

20

40

60

80

100

120

GST-tag

rat HEV NC

LDV N

MNV VP1


]

OD

450[%

]

101

6. Ergebnisse

0.01 0.1 1 10 100 1000 100000

20

40

60

80

100

120

GST-tag

MHV N

PVM N

RCV N

SeV N


]

OD

450[%

]

0.01 0.1 1 10 100 1000 100000

20

40

60

80

100

120

GST-tag

HTNV NC

PUUV N

SEOV N

LCMV NC


]

OD

450[%

]

102


0.01 0.1 1 10 100 1000 100000

20

40

60

80

100

120

GST-tag

Reo Sigma2

Reo Sigma3

Reo Sigma1

Rota A VP6


]

OD

450[%

]

6.2.3. Antikörperreaktivität in nicht exponierten Tieren — Cut-off

Ableitung

Zur Cut-oDenition wurde eine Population herangezogen, die mit hoher Wahrs hein-

li hkeit ni ht exponiert war (überwa hte Population).

Ratten zeigten au h in der überwa hten Population sehr viele hohe MFI-Werte. Um

ni ht an Sensitivität zu verlieren, wurde maximal ein Cut-o von 500MFI akzeptiert. In

diesem Fall wurde nur eine geringere Spezität errei ht.

Die erre hneten Cut-os auf der Basis der negativen Population im DKFZ unters hieden

si h deutli h zwis hen Maus und Ratte (Tab. 6.4).

103

6.Ergebnisse

Tabelle 6.4. Charakterisierung der exprimierten Proteine

Virus

Antigen

erre hnete

Gröÿe

des

Fusionsproteins

[kD

a

beoba htete

Gröÿe

des

Fusionsproteins

[kD

a

viele

Neb

enbanden

[ja/nein

EC

50

[ng

Protein/m

l

relativer

EC

50

[F

aktor

Cut-o

Maus

erre hnet

[M

FI

Cut-o

Maus

angew

en-

det

[M

FI

Cut-o

Ratte

erre hnet

[M

FI

Cut-o

Ratte

angew

en-

det

[M

FI

Polyoma VP1 69,24 60 ja 0,05 0 57 * 279 279

K-Virus VP1 67,26 50 ja 0,07 0 55 * 272 272

MadV-1 Fib. 94,43 55 nein 60 171 62 * 70 *

MadV-1 Hex. 126,99 120 nein 100 286 37 * 94 *

MuHV-1 UL55long 104 30 nein − − − − − −

MuHV-1 UL55short 76,72 60 nein 0,3 1 25 * 26 *

MuHV-1 pp150 −ter 67,48 80 nein 0,75 2 79 * 43 *

MuHV-1 UL26.5 58,79 75 nein 0,2 1 56 * 272 272

MuHV-1 UL27 100,59 100 nein 3 9 65 * 200 200

VACV p35 62,64 60 nein 400 1143 28 * 89 *

VACV maj. env. 67,92 55 nein 4 11 53 * 132 132

KRV1 NS1 100,92 60 ja 3 9 74 * 96 *

RPV NS1 100,81 65 ja 1,5 4 89 * 85 *

MVM1 NS1 100,92 80 ja 0,5 1 96 * 99 *

KRV1 VP2 91,02 100 nein 4 11 43 * 112 112

RPV VP2 91,79 55 nein 0,7 2 66 * 107 107

RMV VP2 91,46 55 nein 2 6 62 * 140 140

104

6.2.HerstellungundCharakterisierungderAntigene


Virus

Antigen

erre hnete

Gröÿe

des

Fusionsproteins

[kD

a

beoba htete

Gröÿe

des

Fusionsproteins

[kD

a

viele

Neb

enbanden

[ja/nein

EC

50

[ng

Protein/m

l

relativer

EC

50

[F

aktor

Cut-o

Maus

erre hnet

[M

FI

Cut-o

Maus

angew

en-

det

[M

FI

Cut-o

Ratte

erre hnet

[M

FI

Cut-o

Ratte

angew

en-

det

[M

FI

H-1 PV VP2 92,23 55 nein 0,6 2 105 105 228 228

MVM1 VP2 91,57 55 nein 10 29 66 * 204 204

MPV-11 VP2 91,57 55 nein 30 86 42 * 275 275

MPV-2 VP2 91,57 80 nein 2 6 49 * 264 264

TMEV 3ABC 62,75 30 nein 5 14 116 116 135 135

TMEV VP1 57,36 55 nein 0,7 2 34 * 80 *

EMCV 3ABC 61,43 30 nein 6 17 48 * 490 490

EMCV VP1 57,47 60 nein 2 6 89 * 97 *

MNV VP1 86,51 80 nein 1,5 4 63 * 68 *

rat HEV N 97,62 90 nein 30 86 28 * 16 *

LDV N 39,65 40 nein 0,3 1 45 * 33 *

LDV M 45,81 − nein 150 429 − − − −

MHV N 77,27 80 nein 0,1 0 108 108 793 500

RCV N 76,94 100 nein 9 26 79 * 159 159

SeV N 84,64 100 nein 3 9 65 * 60 *

PVM N 70,23 70 nein 0,2 1 60 * 2179 500

LCMV NP 88,38 65 nein 300 857 209 209 605 500

105

6.Ergebnisse


Virus

Antigen

erre hnete

Gröÿe

des

Fusionsproteins

[kD

a

beoba htete

Gröÿe

des

Fusionsproteins

[kD

a

viele

Neb

enbanden

[ja/nein

EC

50

[ng

Protein/m

l

relativer

EC

50

[F

aktor

Cut-o

Maus

erre hnet

[M

FI

Cut-o

Maus

angew

en-

det

[M

FI

Cut-o

Ratte

erre hnet

[M

FI

Cut-o

Ratte

angew

en-

det

[M

FI

HTNV N 74,19 60 nein 4 11 412 412 2014 500

PUUV N 74,63 70 nein 4 11 136 136 2437 500

SEOV N 74,19 70 nein 3 9 438 438 1561 500

Reo Sigma1 77,05 50 nein 2 6 156 156 212 212

Reo Sigma2 72,98 55 nein 100 286 − − − −

Reo Sigma3 67,15 55 nein 20 57 − − − −

Rota A VP6 70,67 65 nein 0,75 2 96 * 203 203

1

Kloniert von Angelika Mi hel −fand keine Anwendung

106

6.3. Bestimmung der Reproduzierbarkeit


Die Reproduzierbarkeit eines diagnostis hen Tests ist ein essentieller Parameter, um den

Wert des Tests in der Anwendung zu beurteilen. Als Maÿ für die Übereinstimmung wurde

das Bestimmtheitsmaÿ R2herangezogen. Bei R2

= 1 war die Übereinstimmung perfekt.

Je stärker der Wert si h an 0 näherte, desto s hle hter war die Übereinstimmung.

Als Ausdru k für systematis he Vers hiebungen in der Höhe der MFI-Werte wurde die

Glei hung der Ausglei hsgeraden in einem graphis hen Verglei h der MFI-Werte der bei-

den Versu hstage beurteilt. Die Glei hung, die eine Gerade eindeutig bes hreibt, lautet

y = mx + n, wobei m den Faktor der Steigung bezei hnet und n ein Maÿ für die Ver-

s hiebung im Koordinatensystem ist. Anhand von m und n kann abges hätzt werden,

wel her der beiden Messtage systematis h höhere MFI-Werte erbra hte.

Es wurden die glei hen Seren an vers hiedenen Tagen unter Verwendung der glei hen

Reagenz hargen getestet.

Es wurden Messwerte verwendet von

• 15 Rattenseren, positiv für min. ein Antigen,

• 14 negative Rattenseren,

• 25 Mausseren, positiv für min. ein Antigen,

• 15 negative Mausseren,

• 1 Maus-anti-tag Kontrolle,

• 1 Leerwert ohne Serum.

R2rei hte für die einzelnen Antigene von 0,79 bis 1,00 (Tab. 6.5) und errei hte im arith-

metis hen Mittel 0,94.

Bei den meisten Antigenen war der zweite Versu hstag mit höheren MFI-Werten ver-

treten, was si h dur h m > 1 zeigt. Au h der bei höheren Werten weniger ins Gewi ht

fallende Summand n lag meist im positiven Berei h, was dur h höhere MFI-Werte des

zweiten Testtages bedingt war.

Insgesamt war die Reproduzierbarkeit ho h und die MS damit geeignet, in der Routine

Anwendung zu nden.

107

6. Ergebnisse

Tabelle 6.5. Reproduzierbarkeitsparameter der vers hiedenen Antigene

Antigen R

2

Steigung der Aus-

glei hsgeraden

KRVNS1 0,99 y = 1, 15x+102

KRVVP2 0,93 y = 1, 52x+31

RMVVP2 0,80 y = 1, 79x+150

RPVVP2 0,86 y = 1, 99x+4

PVH1VP2 0,97 y = 1, 33x+44

MPV-1VP2 0,98 y = 1, 48x+17

MPV-2VP2 0,96 y = 1, 61x+34

MVMVP2 0,88 y = 1, 60x+140

MHVN 0,79 y = 1, 09x+241

Reo Sigma1 0,98 y = 1, 27x − 1

EDIMVP6 0,80 y = 1, 77x+110

EMCV3ABC 0,97 y = 1, 51x+41

TMEVVP1 0,97 y = 1, 55x+52

TMEV3ABC 0,95 y = 1, 72x+28

MNVVP1 0,89 y = 1, 45x+97

MPtVVP1 0,82 y = 0, 92x+80

MPyVVP1 0,92 y = 1, 13x+125

VACVmaj. env. 0,95 y = 1, 37x − 21

VACVp35 0,93 y = 1, 27x − 48

LCMVNP 0,98 y = 1, 56x − 24

LDVN 0,99 y = 1, 21x+30

HEVN 0,99 y = 1, 33x − 14

HTNN 1,00 y = 1, 14x+59

PUUVN 0,98 y = 1, 11x+64

SEOVN 0,99 y = 1, 40x+81

MadFLFib. 0,90 y = 1, 42x+1

MadFLHex. 0,98 y = 1, 31x+16

PVMN 0,98 y = 1, 28x+114

108


Tabelle 6.5. Reproduzierbarkeitsparameter der vers hiedenen Antigene

Antigen R

2

Steigung der Aus-

glei hsgeraden

Sendai N 0,98 y = 1, 31x+38

MCMVUL55sh 0,98 y = 1, 39x+19

MHV68UL26.5 1,00 y = 1, 36x+25

MHV68UL27 1,00 y = 1, 33x+18

GST-tag 0,99 y = 1, 38x+12

Das Antigen mit der s hle htesten Übereinstimmung wurde exemplaris h als direkter

Verglei h der beiden Versu hstage dargestellt (Abb. 6.2). Die Cut-oLinien sind nur

gültig für die Mausseren in diesem Experiment. Der Cut-o für die Ratte lag höher.

Deutli h zeigte si h hier wenn au h nur optis h die gute Reproduzierbarkeit ab

mittleren MFI-Berei hen (ab 1000MFI), während unter 100MFI die S hwankungen im

Verhältnis relativ groÿ waren. Damit wurde gezeigt, dass ein te hnis her Mindest-Cut-o

von 100MFI sinnvoll ist. Da dieses Antigen die untere Marke der Reproduzierbarkeit

darstellt, ist diese insgesamt als ho h und damit als zufriedenstellend zu beurteilen.

109

6. Ergebnisse

Abbildung 6.2. Reproduzierbarkeit des Antigens mit dem niedrigsten R2-Wert im direkten

Verglei h der beiden Testtage

MHV N

Tag 1

Tag

2100000

100000

10000

100001000

1000

100

10010

10

11

6.4. Statistische Berechnungen

Zur Analyse des Zusammenhangs zwis hen zwei Tests wurden das Bestimmtheitsmaÿ

(R2) und seine Signikanz (p) herangezogen (beide wurden mit GraphPad ermittelt).

R2gibt Auskunft darüber, wie gut die lineare Abhängigkeit der Werte ist. Bei R2 = 1

ist die Abhängigkeit perfekt, bei R2 = 0 ist keine Abhängigkeit vorhanden. Das Signi-

kanzniveau a wurde bei 5% festgelegt. Bei p < 0,05 wurde die Nullhypothese abgelehnt

und das Ergebnis als signikant betra htet.

Auÿerdem wurde der κ-Wert bere hnet, der ein Maÿ für die Übereinstimmung zwis hen

den beiden Tests ist. κ = 1 entspri ht einer perfekten Übereinstimmung, κ = 0 bedeutet

keinerlei Übereinstimmung und κ = −1 bedeutet, dass alle Positiven mit der MS negativ

110

6.4. Statistis he Bere hnungen

waren und umgekehrt. Das 95% Kondenzintervall s hlieÿt den Berei h ein, in dem mit

95%iger Wahrs heinli hkeit der wahre κ-Wert liegt. Es lässt damit eine Aussage über

die Si herheit des Ergebnisses unter Berü ksi htigung der Streuung und der Sti hpro-

bengröÿe zu. Je kleiner das Intervall ist, desto si herer ist die Aussage des κ-Wertes.

Auÿerdem fand eine Bewertung des κ-Wertes statt. Er wurde klassiziert als perfekt

(κ = 1, 0), sehr gut (1, 0 > κ ≥ 0, 8), gut (0, 8 > κ ≥ 0, 6), moderat (0, 6 > κ ≥ 0, 4),

mäÿig (0, 4 > κ ≥ 0, 2) oder s hle ht (κ < 0, 2).

111

6. Ergebnisse

6.5. Validierung der MS Antigene für die Maus

Zur Bestimmung der Qualität der einzelnen Antigene in der MS und ihrer Taugli hkeit

für einen diagnostis hen Su htest wurden folgende Untersu hungen angestellt:

• Reaktivität mit Referenzseren

Bei den Referenzseren handelt es si h um Antikörper positive Seren. Sie wurden entweder

von der mikrobiologis hen Diagnostik des DKFZs dur h Immunisierung selbst hergestellt

oder waren kommerziell (zumeist CR) erhältli h oder wurden von BioDo zur Verfügung

gestellt. Zur Herstellung der beiden letztgenannten Gruppen ist ni hts Näheres bekannt.

Für jeden Erreger wurde jeweils eines der Referenzseren zur Endpunktbestimmung ti-

triert. Dieses Ergebnis lieÿ eine Eins hätzung der analytis hen Sensitivität zu. Die für

die Titrationen verwendeten Seren stammten entweder von DKFZ, oder wurden wäh-

rend des Aufenthalts in Wilmington von Rajeev Dhawan zur Verfügung gestellt und

dort titriert (Benennung: CRReferenzserumSXXX). Aufgrund der lei ht variierenden

Versu hsumstände in Wilmington kann es hier zu Abwei hungen im Cut-o kommen.

Auÿerdem sind diese Seren von CR (SXXX) ni ht in der Tabelle mit Referenzseren zu

nden, da sie ni ht innerhalb desselben Versu hs gemessen wurden. Die Referenzseren

sind nur teilweise in den Verglei h der CRELISAErgebnisse mit eingeossen. Sie dienen

in der Routinediagnostik als Positivkontrollen für die vers hiedenen Assays und sollten

daher zwingend mit einem guten MSAntigen hohe MFI-Werte erbringen.

• Verglei h mit Referenztests

Für Referenztests ohne quantitative Daten wurden ledigli h Vierfeldertafeln angefertigt

und daraus Sensitivität und Spezität im Verglei h zur Klassikation im jeweiligen Refe-

renztest erre hnet. Die hierbei verwendeten Begrie fals h positiv oder fals h negativ

beziehen si h immer auf den Referenztest und bezei hnen nur die Positionierung eines

Kontrollserums mit diskordanter Klassikation innerhalb der Vierfeldertafel. Wenn net-

to S ore-Werte aus CRELISA verfügbar waren, wurden sie mit den MFI Werten der

MS vergli hen. Der gemeinhin gebräu hli he Ausdru k Goldstandard wird hier ni ht

verwendet, da es keine Tests gibt, die 100% sensitiv und spezis h sind, wie es der

Ausdru k suggeriert.

112

6.5. Validierung der MSAntigene für die Maus

• Analyse der Diskordanten Seren

Diskordante Seren wurden aufgrund ihrer Herkunft und den Ergebnissen aller verfügba-

ren Referenztests für jedes einzelne Antigen beurteilt.

• Analyse der Zoohandlungstiergruppen

Die Zoohandlungstiergruppen lassen aufgrund ihrer besonderen Herkunft weitere Ana-

lysen zu. Zoohandlungstiere sind häug mit vers hiedenen Viren (und au h anderen

Pathogenen) in Kontakt gekommen, da ihre Haltung und Zu ht im Gegensatz zu Lab-

ortieren in derRegel unter weniger strikten hygienis hen Maÿnahmen (z. B. Desinfektion

der Umgebung und der Hände des Personals oder Haltung in Barrieren) erfolgt. Die

Zoohandlungstiere wurden in Gruppen von zwei oder fünf Tieren eingekauft. Unter der

Annahme, dass diese Tiere bereits zusammen gezü htet und zusammen gehalten wur-

den, ist es mögli h, ni ht nur ein einzelnes Serum zu betra hten, sondern au h einen,

Bestandsstatus zu beurteilen.

Es wurden folgende Serumzahlen für die einzelnen Verglei he mit CRELISA, in-

house (Virion)ELISA, IFA und HAH herangezogen (Tab. 6.6). Es wurden no h weitere

Verglei he dur hgeführt in Fällen, in denen ni ht genügend Referenztests oder positive

Seren zur Verfügung standen. Darauf wird erst in den einzelnen Kapiteln zu den Viren

eingegangen.

113

6.Ergebnisse

Tabelle 6.6. Seren und Referenztests zur Validierung der Multiplex-Serologie für die Maus

Kontrollseren

Virus

Maus

em

pfängli h

für

natürli he

In-

fektion

Referenzseren

Seren

aus

Konver-

sionsstudien

CR

EL

ISA

+

CR

EL

ISA

−

IFA

+

IFA

−

in-house

EL

ISA

+

in-house

EL

ISA

−

HA

H

+

HA

H

−

Ausrei hend

Seren

für

Validie-

rung

vorhanden

[ja/nein [N [N [N [N [N [N [N [N [N [N [ja/nein

Polyoma ja 4 9 41 4 297 ja

K-Virus ja 4 9 41 1 331 ja

MAdV-1 ja 4 24 26 27 3 334 ja

MuHV-1 ja 3 8 38 ja

MuHV-4 ja 0 nein

VACV ja

1

4 6 41 4 38 ja

MVM ja 6 11 31 19 ja

MPV ja 3 23 58 237 ja

KRV nein 0 nein

RPV nein 0 nein

RMV nein 0 nein

H-1PV nein 0 nein

TMEV ja 4 26 18 30 317 ja

EMCV ja 1 nein

MNV ja 3 42 26 6 227 13 301 ja

ratHEV nein 0 nein

LDV ja 7 ja

114

6.5.ValidierungderMSAntigenefürdieMaus

Tabelle 6.6. Seren und Referenztests zur Validierung der Multiplex-Serologie für die Maus

Kontrollseren

Virus

Maus

em

pfängli h

für

natürli he

In-

fektion

Referenzseren

Seren

aus

Konver-

sionsstudien

CR

EL

ISA

+

CR

EL

ISA

−

IFA

+

IFA

−

in-house

EL

ISA

+

in-house

EL

ISA

−

HA

H

+

HA

H

−

Ausrei hend

Seren

für

Validie-

rung

vorhanden

[ja/nein [N [N [N [N [N [N [N [N [N [N [ja/nein

MHV ja 5 93 8 67 301 ja

PVM ja 4 23 19 35 ja

SeV ja 4 5 46 7 334 ja

LCMV ja 4 4 44 3 339 ja

HTNV/SEOV

*

2 23 2 41 ja

Reo ja 5 24 5 43 12 249 15 104 ja

RotaA ja 3 18 35 9 334 ja

*

vereinzelt Hinweise vorhanden

1

ECTV

115

6. Ergebnisse

6.5.1. DNA-Viren

Murine Polyomaviren

Als Referenztests standen der murine Polyoma (PolyomaHAH) und der K-Virus Hämag-

glutinationshemmtest (K-VirusHAH) als Su htests und der Polyoma- und der K-

VirusVP1CRELISA als Bestätigungstests zur Verfügung. Der HAH lässt eine Unter-

s heidung zwis hen den beiden Polyomaviren zu.

Es wurden vier Referenzseren, neun PolyomaVP1CRELISApositive (drei Referenzse-

ren enthalten), 41 PolyomaVP1CRELISAnegative, vier PolyomaHAHpositive und 297

PolyomaHAHnegative Seren verwendet.

Es wurden jeweils 4 Referenzseren für Polyoma und K-Virus auf ihre Kreuzreaktion

mit den beiden MSAntigenen überprüft. Alle vier K-VirusReferenzseren reagierten 45

bis 486fa h stärker mit K-VirusVP1 als mit PolyomaVP1 (Abb. 6.3) und drei der vier

Polyoma Referenzseren reagierten 58- bis 77fa h stärker mit PolyomaVP1 als mit K-

VirusVP1. Das vierte Polyoma Referenzserum, dur h eine experimentelle Polyomavi-

rusinfektion im DKFZ hergestellt, zeigte nur eine 1,6fa h stärkere Reaktion mit Polyo-

maVP1 als mit K-VirusVP1.

1 10 100 1000 10000 1000001

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

40fache MFI Differenz

Polyoma ReferenzserenK-Virus Referenzseren

Polyoma VP1 MS [MFI]

K-V

irus

VP

1M

S[M

FI]

Abbildung 6.3. Kreuzreaktionen zwis hen PolyomaVP1MS und K-VirusVP1MS (N=8)

116


Murines Polyomavirus Die vier Referenzseren hatten alle MFI-Werte über 9000 (MW

18 140MFI, SD 6245) (Tab. 6.7).

Tabelle 6.7. Reaktivitäten von PolyomaReferenzseren in der Polyoma- und K-VirusVP1MS

Herkunft Serum ID PolyomaVP1MS [MFI K-VirusVP1MS [MFI

DKFZ TV02/2006 24144 15053

CR Polyoma high 18283 239

A lad Polyoma 9498 164

BioDo 200940108 20635 268

Die Titration des Referenzserums TV02/2006 errei hte in der PolyomaVP1MS den

Endpunkt bei einer Verdünnung von 1 : 984 000 ni ht (Abb. 6.4). Der EC

50

-Wert

2

mit

K-VirusVP1 war 100fa h geringer als mit PolyomaVP1 (K-Virus: 1 : 350, Polyoma:

1 : 35 000).

2

hier: Verdünnung bei halbmaximaler Reaktivität

117

6. Ergebnisse

101 102 103 104 105 106 107

1

10

100

1000

10000

100000

K-Virus VP1 MS

Polyoma VP1 MS

Verdünnung[1

x

]

Pol

yom

aviru

sM

S[M

FI]

Cut-off

Abbildung 6.4. Titration des PolyomaReferenzserums TV02/2006

Von 14 Zellkulturüberständen mit monoklonalen Antikörpern gegen PolyomaVirionen

lagen 12 bei einer Verdünnung von 1 : 5 über dem minimalen Cut-o von 100MFI

(Abb. 6.5). Zehn von davon zeigten min. Reaktivitäten im mittleren Berei h (über

1000MFI). Diese Antikörper sind ni ht mit K-VirusVP1 getestet worden, da dieses

erst später in den Assay integriert wurde.

118


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Antikörper Nr.

Pol

yom

aV

P1

MS

[MF

I]

Abbildung 6.5. MFI-Werte monoklonaler Antikörper gegen PolyomaVP1

Von zehn im PolyomaVP1CRELISApositiven Seren reagierten a ht in der Polyo-

maVP1MS mit sehr hohen MFI-Werten (> 9400) aber zwei zeigten keine Reaktion

(Abb. 6.6). Von 41 im PolyomaVP1CRELISAnegativen Seren reagierten neun in der

MS positiv mit MFI-Werten von 149 bis a. 5600MFI.

119

6. Ergebnisse

neg. pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch Polyoma VP1 CR ELISA

Pol

yom

aV

P1

[MF

I]

Abbildung 6.6. PolyomaVP1MSReaktivitäten PolyomaVP1CRELISAnegativer (N=41)

und -positiver Seren (N=9)

Sieben von neun ELISApositiven Seren zeigten sehr hohe MFI-Werte > 10 000 unab-

hängig vom S ore-Wert, und zwei Seren mit S ore-Werten nahe dem Cut-o waren in

der MS komplett negativ (Abb. 6.6). Die Korrelation von S ore- und MFI-Werten hat-

te einen Koezienten von R2 = 0, 50 (Abb. 6.7). Der p-Wert lag bei 0, 0331, und die

Korrelation ist damit als signikant anzusehen.

120


0 5 10 15 20 25

1

10

100

1000

10000

100000

3

Cut-off

Polyoma VP1 CR ELISA [Score]

Pol

yom

aV

P1

[MF

I]

Abbildung 6.7. PolyomaVP1MSReaktivitäten und ihre Korrelation zu Polyo-

maVP1CRELISAS ore-Werten (N=9)

PolyomaVP1MS zeigte gegenüber dem PolyomaVP1CRELISA eine Sensitivität von

78% und eine Spezität von 78% (Tab. 6.8). Die Übereinstimmung war moderat (κ =

0, 43).

121

6. Ergebnisse

Tabelle 6.8. PolyomaVP1MS im Verglei h mit dem PolyomaVP1CRELISA (N=50)

PolyomaVP1CRELISA Sens.: 78%

+ − Spez.: 78%

PolyomaVP1MS + 7 9 κ: 0,43

− 2 32 95% CI: 0,16 bis 0,70

Übereinst.: moderat

Im Verglei h mit dem PolyomaHAH lagen die Sensitivität mit 100% und die Spezität

mit 99% sehr ho h (Tab. 6.9). Die Übereinstimmung war gut (κ = 0, 80).

Tabelle 6.9. PolyomaVP1MS im Verglei h mit dem PolyomaHAH (N=301)

PolyomaHAH Sens.: 100%

+ − Spez.: 99%

PolyomaVP1MS + 4 2 κ: 0,80

− 0 295 95% CI: 0,52 bis 1,07

Übereinst.: gut

Die zwei Seren, die im Verglei h zum HAH fals h positiv waren, zeigten niedrige MFI-

Werte von 597 bzw. 150MFI und stammten aus der überwa hten Population (Tab. 6.10,

Seren Nr. 7 und 8). Se hs der neun gegenüber dem ELISA fals h positiven Seren kamen

aus der Gruppe der Kontrollseren und hatten mit 149 bis 5588MFI niedrige bis mittlere

Reaktivitäten. Die Seren Nr. 4 und 5 waren Referenzseren für K-Virus. Die erhöhten

MFI-Werte für Polyoma sind damit wahrs heinli h Kreuzreaktionen zuzus hreiben.

Die drei übrigen diskordanten Seren stammten von den Zoohandlungstieren und werden

später mit dieser Gruppe diskutiert.

122


Tabelle 6.10. Diskordante Seren in der PolyomaMS (ohne Zoohandlungstiere)

# Serum ID Serumgruppe

PolyomaVP1 K-VirusVP1 PolyomaVP1 Polyoma

MS MS CRELISA HAH

[MFI [MFI [Kl. [Kl.

1 200940109 KS 5588 8 neg.

2 TV03/2002 KS 2111 26 neg.

3 TV10/2000 KS 934 33 neg.

4 TV10/2008 KS 461 22445 neg.

5 TV11/2000 KS 237 20431 neg.

6 201023610 KS 149 1 neg.

7 200617612 überw. Pop. 597 30 neg.

8 200603510 überw. Pop. 150 370 neg.

Grau hinterlegt: Ergebnis ist positiv

Murines pneumotropes Polyomavirus (K-Virus, MptV) Es wurden vier Referenzseren,

neun K-VirusVP1CRELISApositive (vier Referenzseren enthalten), 41 K-VirusVP1

CRELISAnegative, ein K-VirusHAHpositives und 331 K-VirusHAHnegative Seren

verwendet.

Alle vier K-VirusReferenzseren errei hten MFI-Werte über 12 000 (MW 16 818MFI, SD

5398) und reagierten gar ni ht oder nur sehr s hwa h mit PolyomaVP1 (Tab. 6.11).

Tabelle 6.11. Reaktivitäten von K-VirusReferenzseren in der K-VirusVP1- und Polyo-

maVP1MS

Herkunft Serum ID K-VirusVP1MS [MFI PolyomaVP1MS [MFI

DKFZ TV10/2008 22445 461

DKFZ TV11/2000 20431 237

CR K-Virus "high" 12090 25

A lad K-Virus 12306 271

Referenzserum TV10/2008 errei hte mit K-VirusVP1 bei der gröÿten Verdünnung von

1 : 984 000 no h keinen Endpunkt, der EC

50

-Wert lag bei einer Verdünnung von 1 : 20 000.

Das Serum zeigte s hwa he Kreuzreaktion mit PolyomaVP1 bis zu einer Verdünnung

von 1 : 450 (Abb. 6.8).

123

6. Ergebnisse

101 102 103 104 105 106 107

1

10

100

1000

10000

100000

K-Virus VP1

Polyoma VP1

Verdünnung[1

x

]

Pol

yom

aviru

sM

S[M

FI]

Cut-off

Abbildung 6.8. Titration des K-VirusReferenzserums TV10/2008

Alle neun K-VirusVP1CRELISApositiven Seren waren konkordant MSpositiv, se hs

von neun Seren mit über 10 000MFI (Abb. 6.9). Von 41 CRELISAnegativen Seren

zeigten vier fals h positive Reaktionen ni ht weit über Cut-o (MW 351MFI, SD

301MFI).

124


neg. pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch K-Virus VP1 CR ELISA

K-V

irus

VP

1M

S[M

FI]

Abbildung 6.9. K-VirusVP1MSReaktivitäten K-VirusVP1CRELISAnegativer (N=41)


Bei CRELISAS ores von 5 bis 6 zeigten si h geringere MFI-Werte (580 bis 5000) als

bei S ores von > 10 (> 10 000MFI) (Abb. 6.10). Jenseits von S ore 10 war keine weitere

Erhöhung des MFI-Wertes mehr feststellbar. ELISA S ores und MFI-Werte korrelierten

gut mit einen Koezienten von R2 = 0,7 (p = 0,005).

125

6. Ergebnisse

0 5 10 15 20 25

1

10

100

1000

10000

100000

3

Cut-off

K-Virus VP1 CR ELISA [Score]

K-V

irus

VP

1M

S[M

FI]

Abbildung 6.10. K-VirusVP1MSReaktivitäten und ihre Korrelation zu K-

VirusVP1ELISAS ore-Werten bei ELISApositiven Seren (N=9)

Die Übereinstimmung der K-VirusVP1MS mit dem K-VirusVP1CRELISA war gut

(κ = 0,77) mit einer Sensitivität von 100% und einer Spezität von 90% (Tab. 6.12).

126


Tabelle 6.12. K-VirusVP1MS im Verglei h mit dem K-VirusVP1CRELISA (N=50)

K-VirusVP1CRELISA Sens.: 100%

+ − Spez.: 90%

K-VirusVP1MS

+ 9 4 κ: 0,77

− 0 37 95% CI: 0,56 bis 0,98

Übereinst.: gut

Im Verglei h mit dem K-VirusHAH lag die Sensitivität bei allerdings nur einem po-

sitiven Serum ebenfalls bei 100% und au h die Spezität war mit 99% sehr ho h

(Tab. 6.13). Aufgrund des nur einen positiven Serums war die Übereinstimmung nur

mäÿig (κ = 0,40) mit einem sehr groÿen 95% CI (−0,16− 0,94).

Tabelle 6.13. K-VirusVP1MS im Verglei h mit dem K-VirusHAH (N=332)

K-VirusVP1HAH Sens.: 100%

+ − Spez.: 99%

K-VirusVP1MS + 1 3 κ: 0,40

− 0 328 95% CI: -0,15 bis 0,94

Übereinst.: mäÿig

Drei der im Verglei h zu den Referenztests fals h positiven Seren zeigten nur niedrige

MFI-Werte zwis hen 268 und 794 (Tab. 6.14). Serum Nr. 3 stammte aus einer überwa h-

ten Population, was eine tatsä hli he Infektion unwahrs heinli h ma ht. Serum Nr. 2 war

ein Referenzserum für Polyoma. Der lei ht erhöhte MFI-Wert für K-Virus ist somit auf

eine Kreuzreaktion mit K-Virus zurü kzuführen.

Tabelle 6.14. Diskordante Seren in der K-VirusMS (ohne Zoohandlungstiere)


K-VirusVP1 PolyomaVP1 K-VirusVP1 K-Virus

MS MS CRELISA HAH

[MFI [MFI [Kl. [Kl.

1 201001548 KS 794 7 neg.

2 200940108 KS 268 20635 neg.

3 200603510 überw. Pop. 370 150 neg.


127

6. Ergebnisse

Polyoma und K-Virus Antikörper bei Zoohandlungstiergrupp en Drei Seren aus Hal-

tungsgruppeE waren in allen drei Tests konkordant positiv für PolyomaAntikörper

(Tab. 6.15). Drei weitere MSpositiven Seren mit niedrigen bis mittleren Reaktivitäten

(max. 3000MFI) konnten ni ht dur h den CRELISA bestätigt werden. Zwei Seren wa-

ren fals h negativ (jeweils 1MFI) gegenüber dem PolyomaVP1CRELISA mit jeweils

niedrig positiven S ore-Werten im CRELISA (3,8 bzw. 3,6).

Für das K-Virus waren nur zwei Seren aus HaltungsgruppeE konkordant MS und

CRELISApositiv. Wegen der glei hzeitig sehr hohen MFI-Werte für PolyomaAntikörper

handelte es si h hier vermutli h eher um Kreuzreaktionen als um tatsä hli he K-

Virus Infektionen. Zwei weitere Seren waren mit Werten < 210MFI fals h positiv

(Tab. 6.15).

128


Tabelle 6.15. Antikörper gegen Polyoma und K-Virus in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

Polyoma K-Virus

VP1MS VP1CRELISA HAH VP1MS VP1CRELISA HAH

[MFI [Kl./S . [Kl. [MFI [Kl./S . [Kl.

A 1 201038501 9 neg. 11 neg.

A 2 201038502 7 neg. 18 neg.

B 3 201040101 24 neg. 206 neg. neg.

B 4 201040102 28 neg. 17 neg. neg.

C 5 201043801 1 neg. 1 neg. neg.

C 6 201043802 354 neg. 1 neg. neg.

D 7 201046101 1 neg. 1 neg. neg.

D 8 201046102 59 neg. 1 neg. neg.

D 9 201046103 1 neg. 1 neg. neg.

D 10 201046104 1 neg. 1 neg. neg.

D 11 201046105 1 3,8 1 neg. neg.

E 12 201047701 10166 3,0 pos. 2030 5,7

E 13 201047702 17166 12,2 pos. 587 5,6

E 14 201047703 17386 13,6 pos. 1 neg.

E 15 201047704 1 neg. 1 neg.

E 16 201047705 24 neg. 1 neg.

129

6.Ergebnisse


Gruppe # Serum ID

Polyoma K-Virus



F 17 201050101 1 neg. 1 neg. neg.

F 18 201050102 1 neg. 1 neg. neg.

F 19 201050103 1 neg. 1 neg. neg.

F 20 201050104 1 neg. 1 neg. neg.

F 21 201050105 1 unsp. 1 unsp. neg.

G 22 201051701 1 neg. 1 neg. neg.

G 23 201051702 1 neg. 1 neg. neg.

G 24 201051703 1 neg. 1 neg. neg.

G 25 201051704 1 neg. 1 neg. neg.

G 26 201051705 1 neg. 1 neg. neg.

H 27 201053801 1080 neg. 134 neg. neg.

H 28 201053802 1 neg. 1 neg. neg.

H 29 201053803 1 neg. 1 neg. neg.

H 30 201053804 1 neg. 1 neg. neg.

H 31 201053805 1 neg. 1 neg. neg.

130



Gruppe # Serum ID

Polyoma K-Virus



I 32 201056101 1 neg. 1 neg. neg.

I 33 201056102 1 3,6 1 neg. neg.

I 34 201056103 2879 neg. 1 neg. neg.

I 35 201056104 1 neg. 1 neg. neg.

I 36 201056105 1 neg. 1 neg. neg.

J 37 201057501 10 neg. 27 neg. neg.

J 38 201057502 1 neg. 1 neg. neg.

J 39 201057503 4 neg. 1 neg. neg.

J 40 201057504 1 neg. 1 neg. neg.

J 41 201057505 8 neg. 10 neg. neg.

Grau hinterlegt: Ergebnis ist positiv unsp.: Unspezis he Reaktion

131

6. Ergebnisse

Fazit Alle Referenzseren wurden zuverlässig mit hohen MFI-Werten in der MS er-

kannt. Auÿerdem reagierten 12 von 14 monoklonalen Antikörperpräparationen gegen

PolyomaVP1 positiv. Dur h die rekombinante Herstellung des MSAntigens kann es zu

Abwei hungen in der Epitopstruktur kommen. Es können lineare Epitope, dur h eine

alternative Faltung im Inneren des Proteins verste kt sein und sind damit ni ht zu-

gängli h für Antikörper. Konformationelle Epitope sind von einer alternativen Faltung

no h stärker betroen und gehen bei lei hten Abwei hungen s hon verloren. Dadur h

könnte erklärt werden, warum zwei der monoklonalen Antikörper ein negatives Ergebnis

bra hten.

Gegenüber dem PolyomaVP1CRELISA ist die Sensitivität niedriger, da zwei von sieben

positiven Seren ni ht erkannt wurden. Es ist aber ni ht unwahrs heinli h, dass es si h

in beiden Fällen um fals h positive Ergebnisse des CRELISA handelt, da die S ore-

Werte im niedrigen Berei h lagen. Für K-VirusVP1 wurden keine fals h negativen Se-

ren gefunden. Die Ursa he für niedrige fals h positive Reaktionen konnte ni ht geklärt

werden.

Bei sehr starken Antikörperreaktionen gegen eines der Maus-Polyomaviridae kann es zu

s hwa hen Kreuzreaktionen mit dem anderen Virus kommen. Bei zwei Titrationsexpe-

rimenten wurden Titerunters hiede > 500 und > 5000 beoba htet.

Die beiden Polyomaviren zeigten dur h ihre geringe Kontagiosität weniger einheitli he

MFI-Werte innerhalb der einzelnen Zoohandlungstiergruppen als z. B. das MNV (3422

Murine norovirus). Auÿerdem sind diese Viren au h in den Zoohandlungen oenbar sehr

selten geworden.

Für die Routinediagnostik sind PolyomaVP1 und K-VirusVP1 als MSAntigene sehr gut

geeignet. Bei glei hzeitig vorliegenden hohen MFI-Werten für ein Virus und niedrigen

für das zweite Virus ist eine Kreuzreaktion wahrs heinli h.

132


Murine Adenoviren

Die AdenovirusMS verwendet das Fiber- und das Hexonprotein von MAdV-1. Als Re-

ferenztests standen die Su htests MAdV-1 und MAdV-2 IFA und der Bestätigungstest

MAdV-1/2CRELISA zur Verfügung. Allerdings wurden nur die Zoohandlungstiere mit

MAdV-2 IFA untersu ht. Der CRELISA verwendet ein Mis hantigen und erlaubt keine

MAdV-Dierenzierung.

Es wurden vier Referenzseren, 26 MAdV-1CRVirionELISApositive (vier Referenzse-

ren enthalten), 27MAdV-1CRVirionELISAnegative, drei MAdV-1 IFApositive und 334

MAdV-1 IFAnegative Seren verwendet. Auÿerdem stand eine Serokonversionsstudie mit

24 Seren zur Verfügung.

Von den vier MAdV-1 spezis hen Referenzseren reagierten zwei stark mit Fiber und

s hwä her mit Hexon, die anderen beiden reagierten nur s hwa h mit Fiber und waren

negativ mit Hexon (Tab. 6.16).

Tabelle 6.16. Reaktivitäten von MAdV-1Referenzseren in der MAdV-1Hex.- und -Fib.MS

Herkunft Serum ID MAdV-1Hex.MS [MFI MAdV-1Fib.MS [MFI

DKFZ TV10/2000 4605 16687

BioDo 200940107 1372 10817

A lad MadV-1 26 1254

CR MadV-1 "high" 52 1883

133

6. Ergebnisse

101 102 103 104 105 106 107

1

10

100

1000

10000

100000MAdV-1 Fib.

MAdV-1 Hex.

Verdünnung[1

x

]

MA

dV-1

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.11. Titration des MAdV-1Referenzserums TV10/2000

Die Endpunkttiter des DKFZs Referenzserums, waren 12 000 für Hexon und 109 000 für

Fiber, die EC

50

-Werte lagen bei 1 : 150 für Hexon und 1 : 200 für Fiber (Abb. 6.11).

134


1 7 10 14 28 351

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

DPI

MA

dV-1

Fib

.MS

[MF

I]

Abbildung 6.12. Serokonversionsstudie mit 24 MAdV-1 inzierten Mäusen Reaktionen

mit MAdV-1Fiber

Eine Serokonversionsstudie von CR, für wel he 24 Tiere mit MAdV-1 inziert wurden

und an festgelegten Tagen na h der Infektion von jeweils vier Tieren Serum gewonnen

wurde, zeigte mit Fiber am 7.DPI eine Antikörperreaktion, die bei 50% der Tiere bereits

in Serokonversion resultierte (Abb. 6.12). Ab dem 10.DPI waren alle Tiere positiv. Bis

zum 35.DPI stiegen die MFI-Werte weiter lei ht an und hatten dann 2918, 6817, 9297

bzw. 10 027MFI errei ht. Mit Hexon zeigten die Seren deutli h niedrigere und verzögerte

Reaktionen (Abb. 6.13). Am 10.DPI war erstmals ein sehr lei hter Reaktivitätsanstieg

si htbar, aber erst am 35.DPI hatten 2 der 4 Seren den Cut-o übers hritten.

135

6. Ergebnisse

0 7 10 14 28 351

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

DPI

MA

dV-1

Hex

.MS

[MF

I]

Abbildung 6.13. Serokonversionsstudie mit 24 MAdV-1 inzierten Mäusen Reaktionen

mit MAdV-1Hexon

Die Reaktionen der MAdV-1/2CRVirionELISApositiv oder negativ klassizierten Se-

ren mit Fiber unters hieden si h deutli h voneinander (Abb. 6.14). Unter den 27 ELI-

SAnegativen Seren waren vier fals h positiv, allerdings alle mit MFI-Werten < 200.

Von den 26 ELISApositiven reagierten aber nur 7 in der MS mit Fiber mit MFI-

Werten zwis hen < 200 und > 10 000. Die niedrige Sensitität könnte dur h einen ho-

hen Anteil MAdV-2 reaktiver Seren bei glei hzeitig geringer Kreuzreaktion der Antikör-

per gegen MAdV-2-Fiber mit MAdV-1-Fiber begründet sein (17,4%AS Identität). Mit

dem HexonProtein sind zwis hen MAdV-1 und 2 höhere Kreuzreaktionen zu erwarten

(64,1%AS Identität).

136


neg. Grauzone pos.1

10

100

1000

10000

100000

Klassifikation durch MAdV-1/2 CR ELISA

MA

dV-1

Fib

.MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.14. MAdV-1Fib.MSReaktivitäten MAdV-1/2CRELISAnegativer (N=27),

in derGrauzone liegender (N=2) und -positiver Seren (N=26)

Die MFI-Werte der 7MS Fiber positiven Seren korrelierten ni ht mit den ELISA-

S oreWerten (R2 = 0,0, p = 0,8030) (Abb. 6.15).

137

6. Ergebnisse

0 5 10 15 20 251

10

100

1000

10000

100000

32

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3

MAdV-1/2 CR Virion ELISA [Score]

MA

dV-1

Fib

.MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.15. MAdV-1Fib.MSReaktivitäten und ihre Korrelation zu MAdV-

1/2CRVirionELISAS ore-Werten (N=29)

Wie bereits für die Referenzseren beoba htet, waren die Reaktionen mit MAdV-1Hexon

insgesamt niedriger als mit Fiber (Abb. 6.16). Die MFIUnters hiede zwis hen den Grup-

pen ELISAnegativer und positiver Seren waren nur gering. Die MFI-Werte der 18 kon-

kordantMSHexon und CRELISApositiven Seren korrelierten ni ht mit den ELISA-

S oreWerten (R2 = 0,0; p = 0,9274) (Abb. 6.17).

138


neg. Grauzone pos.1

10

100

1000

10000

100000

Klassifikation durch MAdV-1/2 CR Virion ELISA

MA

dV-1

Hex

.MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.16. MAdV-1HexonReaktivitäten MAdV-1/2CRVirionELISAnegativer

(N=27), in derGrauzone liegender (N=2) und -positiver Seren (N=26)

139

6. Ergebnisse

0 5 10 15 20 251

10

100

1000

10000

100000

23

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3

MAdV-1/2 CR Virion ELISA [Score]

MA

dV-1

Hex

.MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.17. MAdV-1HexonMSReaktivitäten und ihre Korrelation zu MAdV-

1/2CRVirionELISA S ore-Werten (N=29)

Im Verglei h mit dem MAdV-1/2CRVirionELISA war die Sensitivität der MS mit Fiber

mit nur 27% niedrig und die Spezität mit 85% mäÿig (Tab. 6.17). Die Übereinstimmung

war s hle ht (κ = 0,12).

140


Tabelle 6.17. MAdV-1Fib.MS im Verglei h mit dem MAdV-1/2CRVirionELISA (N=53)

MAdV-1/2CRVirionELISA Sens.: 27%

+ − Spez.: 85%

MAdV-1Fib.MS + 7 4 κ: 0,12

− 19 23 95% CI: -0,10 bis 0,34

Übereinst.: s hle ht

Für die HexonMS war die Sensitivität mit 69% trotz der insgesamt niedrigen MFI-

Werte höher, aber die Spezität war mit nur 41% niedrig (Tab. 6.18). Wiederum war

die Übereinstimmung s hle ht (κ = 0,10).

Tabelle 6.18. MAdV-1Hex.MS im Verglei h mit dem MAdV-1/2CR VirionELISA (N=53)


+ − Spez.: 41%

MAdV-1Hex.MS + 18 16 κ: 0,10

− 8 11 95% CI: -0,16 bis 0,35


Wenn Seren, die mit min. einem der beiden Antigene reagierten, als MAdVpositiv ge-

wertet wurden, lag die Sensitivität bei 85% und die Spezität bei 41% (Tab. 6.19). Die

Übereinstimmung war weiterhin nur mäÿig (κ = 0,25).

Tabelle 6.19. MAdV-1Fib./Hex.MS im Verglei h mit dem MAdV-1/2CRVirionELISA

(N=53)


+ − Spez.: 41%

MAdV-1Fib./

Hex.MS

+ 22 16 κ: 0,25

− 4 11 95% CI: 0,02 bis 0,48


Gegenüber der MAdV-1 IFA waren die Sensitivität der FiberMS mit 100% und ihre

Spezität mit 99% sehr ho h (Tab. 6.20). Wegen der nur geringen Zahl IFApositiver

Seren war die Übereinstimmung nur moderat (κ = 0,6).

141

6. Ergebnisse

Tabelle 6.20. MAdV-1Fib.MS im Verglei h mit der MAdV-1 IFA (N=337)

MAdV-1 IFA Sens.: 100%

+ − Spez.: 99%

MAdV-1Fib.MS + 3 4 κ: 0,60

− 0 330 95% CI: 0,23 bis 0,96


Die Sensitivität der HexonMS gegenüber der MAdV-1 IFA mit 100% und ihre Spezi-

tät mit 93% waren ho h (Tab. 6.21). Wegen der geringen Zahl positiver Seren war die

Übereinstimmung wiederum s hle ht (κ = 0,19).

Tabelle 6.21. MAdV-1Hex.MS im Verglei h mit der MAdV-1 IFA (N=337)


+ − Spez.: 93%

MAdV-1Hex.MS + 3 23 κ: 0,19

− 0 311 95% CI: 0,01 bis 0,38


Wenn Seren, die mit min. einem der beiden Antigene reagierten, als MAdVpositiv ge-

wertet wurden, lag die Sensitivität gegenüber dem CRELISA mit 100% sehr ho h und

die Spezität mit 92% niedriger (Tab. 6.22), bei insgesamt s hle hter Übereinstimmung

(κ = 0,17).

Tabelle 6.22. MAdV-1Fib./Hex.MS im Verglei h mit der MAdV-1 IFA (N=337)


+ − Spez.: 92%

MAdV-1Fib./

Hex.MS

+ 3 27 κ: 0,17

− 0 307 95% CI: 0,00 bis 0,34


In den 41 Seren, die mit min. einem der beiden MS-Antigene reagierten, waren nur vier

positiv mit beiden Antigenen, zehn weitere reagierten nur mit Fiber, während der gröÿere

Teil nur mit Hexon reagierte, dabei mit auallend homogen fehlender Fiber-Reaktion

(Abb. 6.18).

142


MAdV-1 Fib. MS [MFI]

MA

dV-1

Hex

.MS

[MF

I]

Cut-off

100000

10000010000

10000

1000

1000100

100

10

101

1

Abbildung 6.18. Korrelation der MFI-Werte für Fib. und Hex. von Seren, bei denen min-

destens ein Antigen über Cut-o lag (N=41)

Fals h positiv mit Fiber (7 Seren) war die häugste Ursa he für die 13 diskor-

danten Seren (diskordante Zootiere werden unten diskutiert), während Hexon mit 6

fals h negativen Reaktionen beteiligt war (Tab. 6.23). Se hs der sieben mit Fiber

fals h positiven Seren waren nur sehr s hwa h positiv (MFI < 275). Die mäÿig starke

fals h positive Reaktion eines Serums aus der überwa hten Population, für die eine

MAdV-Infektion unwahrs heinli h ist und das in 3 Referenztests negativ reagierte, bleibt

unklar.

143

6.Ergebnisse

Tabelle 6.23. Diskordante Seren in der MAdV-1MS (ohne Zoohandlungstiere)


MAdV-1Fib. MAdV-1Hex. MAdV-1/2 MAdV-1 MAdV-2

MS MS CRVirionELISA IFA IFA

[MFI [MFI [Kl./S . [Kl. [Kl.

1 200603510 überw. Pop. 2369 11 neg. neg. neg.

2 CRMadFLhi KS 1883 52 13,1

3 A ladMadFL KS 1254 26 20,1

4 KS 3/Reihe1/5 KS 322 29 4,4

5 200843801 KS 274 29 neg.

6 200501902 KS 171 38 neg.

7 200940104 KS 162 75 neg.

8 200940106 KS 158 9 neg.

9 200904302 überw. Pop. 132 7 neg. neg.

10 200940108 KS 108 5 neg.

11 201002401 KS 98 15 3,2

12 201002404 KS 20 13 16,0

13 201002405 KS 12 7 6,8


144


Zoohandlungstiergruppen Die Seren der Tiere aus Zoohandlungen wurden au h

mit MAdV-2 IFA untersu ht und erlaubten neben einer Analyse der Haltungsgrup-

pen au h eine Untersu hung mögli her MAdV-1- und MAdV-2Kreuzreaktionen in der

Fiber- und HexonMS. Während nur ein Serum mit Fiber sehr s hwa h positiv rea-

gierte, war in se hs der zehn Haltungsgruppen die Mehrzahl der Tiere nur mit He-

xonMSpositiv. (Tab. 6.24, Gruppen D bis I). In fünf dieser Gruppen waren Tiere au h

MAdV-2 IFApositiv und in vier Gruppen war min. ein Tier au h positiv mit dem MAdV-

1/2CRVirionELISA. Es zeigte si h also ein deutli her Zusammenhang zwis hen Posi-

tivität in MAdV-1HexonMS, MAdV-2 IFA und MAdV-1/2CRVirionELISA bei glei h-

zeitiger Negativität in FiberMS. Dieses serologis he Muster zeigt, dass MAdV-1Hexon,

aber ni ht MAdV-1Fiber mit MAdV-2Antikörpern kreuzreagiert. Diese Spezitätsver-

halten der beiden MAdV-1Proteine korreliert gut mit den unters hiedli hen Sequenz-

homologien dieser Proteine. Die in der Gruppe häugen, aber sehr s hwa hen positi-

ven MAdV-1HexonReaktionen, zusammen mit positiven MAdV-2 IFA und negativen

MAdV-1/2CRVirionELISA Reaktionen weisen darauf hin, dass MSHexon sensitiver

ist in der Entde kung von MAdV-2Antikörpern, oder dass ein weiteres MAdV exis-

tiert, dass mit MAdV-1Hexon und in der MAdV-2 IFA kreuzreagiert, aber ni ht mit

den MAdV-1- und MAdV-2 Virionen im CRELISA.

145

6.Ergebnisse

Tabelle 6.24. Antikörper gegen MAdV in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

MAdV-1Fib. MAdV-1Hex. MAdV-1/2 MAdV-1 MAdV-2

MS MS CRVirionELISA IFA IFA

[MFI [MFI [Kl./S . [Kl. [Kl.

A 1 201038501 10 5 neg. neg. neg.

A 2 201038502 11 11 neg. neg. neg.

B 3 201040101 134 65 10,6 neg. pos.

B 4 201040102 14 10 neg. neg. neg.

C 5 201043801 1 58 3,5 neg. neg.

C 6 201043802 13 96 neg. neg. neg.

D 7 201046101 1 187 neg. neg. neg.

D 8 201046102 55 108 neg. neg. neg.

D 9 201046103 1 221 neg. neg. unsp.

D 10 201046104 1 250 neg. neg. unsp.

D 11 201046105 1 381 neg. neg. unsp.

E 12 201047701 2 49 2,8 neg. pos.

E 13 201047702 1 137 4,2 neg. pos.

E 14 201047703 1 444 5,1 neg. pos.

E 15 201047704 1 315 6,2 neg. pos.

E 16 201047705 1 46 1,7 neg. pos.

F 17 201050101 1 190 4 neg. pos.

F 18 201050102 1 619 16,4 neg. pos.

F 19 201050103 1 257 6,9 neg. pos.

F 20 201050104 1 1969 8,6 neg. pos.

F 21 201050105 1 246 5,8 neg. pos.

146


G 22 201051701 1 156 neg. neg. neg.

G 23 201051702 1 33 neg. neg. neg.

G 24 201051703 1 138 neg. neg. pos.

G 25 201051704 1 113 neg. neg. pos.

G 26 201051705 1 546 neg. neg. pos.

H 27 201053801 83 61 2,7 unsp. unsp.

H 28 201053802 1 1065 17,9 unsp. unsp.

H 29 201053803 1 433 8,4 unsp. unsp.

H 30 201053804 1 762 10,3 unsp. unsp.

H 31 201053805 1 342 11,7 unsp. pos.

I 32 201056101 1 482 10,7 neg. neg.

I 33 201056102 1 384 4,7 neg. pos.

I 34 201056103 47 112 neg. neg. pos.

I 35 201056104 1 172 5,7 neg. pos.

I 36 201056105 1 325 neg. neg. neg.

J 37 201057501 17 8 neg. neg. neg.

J 38 201057502 1 196 neg. neg. neg.

J 39 201057503 17 18 neg. neg. neg.

J 40 201057504 1 38 neg. neg. neg.

J 41 201057505 21 6 neg. neg. neg.


147

6. Ergebnisse

Fazit Alle MAdV-1Referenzseren wurden mit dem MAdV-1Fiber-Protein in der MS

erkannt. Die Serokonversion gegen Fiber war in der MS s hon am 7.DPI na hweisbar.

MAdV-1Fiber bindet nur MAdV-1, aber keine MAdV-2 spezis hen Antikörper. Der

Verglei h von FiberMSReaktionen mit dem MAdV-1/2VirionCRELISA lieÿ keine si-

heren Rü ks hlüsse auf die Sensitivität zu, da CRELISApositive Seren ebenso von

MAdV-2 inzierten Tieren stammen könnten. Beide Proteine zusammen verwendet, ver-

besserten die Sensitivität. MAdV-1Hexon ist ein stark kreuzreaktives, aber vergli hen

mit Fiber weniger immunogenes Protein. Trotz der geringen Antikörper-Reaktivitäten

war die Sensitivität von Hexon gegenüber dem CRELISA und dem MAdV-1 IFA und

basierend auf den Daten mit den Zoohandlungstieren au h gegenüber der MAdV-

2 IFA sehr gut. Hier kann gemutmaÿt werden, dass MAdV-1Hexon ein mögli herweise

mit Hexon-Proteinen anderer MAdVTypen kreuzreaktives Protein ist, während MAdV-

1FiberAntikörper streng typ-spezis h sind. Die hohe Homologie der Hexonproteine

zwis hen MAdV1 und -2 und die niedrige Homologie der Fiberproteine unterstützen

diese Hypothese ebenso wie MAdV-2 IFAErgebnisse der Zoohandlungstiere. Beide Pro-

teine sind für die Routineserologie geeignet und sollten gemeinsam verwendet werden,

um einen mögli hst sensitiven Test für MAdV-1 zu erhalten. Ein positiver MAdV-1MS

Hexon- und negativer MAdV-1Fiber-Befund sind als Hinweis auf eine MAdV-2 Infekti-

on zu werten. Für einen sensitiveren MAdV-2Antikörper-Test sollte au h MAdV-2Fiber

und MAdV-2Hexon mit in die MS aufgenommen werden.

148


Murine Herpesviren

Als Referenztests standen der MuHV-1CRVirionELISA und die MuHV-1 IFA zur Ver-

fügung. In der Routine wird der ELISA als Su htest und die IFA als Bestätigungstest

verwendet. Das MSAntigen ist MuHV-1UL55sh.

Es wurden drei Referenzseren, a ht MuHV-1CRVirionELISApositive (drei Referenzse-

ren enthalten) und 38 MuHV-1CRVirionELISAnegative Seren verwendet.

Alle drei MuHV-Referenzseren reagierten positiv mit MuHV-1UL55sh mit MFI-Werten

zwis hen 150 und 2200 (MW1432, SD1117) (Tab. 6.25).

Tabelle 6.25. Reaktivitäten von MuHV-1Referenzseren in der MuHV-1UL55shMS

Herkunft Serum ID MuHV-1UL55shMS

[MFI

DKFZ TV09/2008 2227

CR MuHV-1 "high" 1912

CR MuHV-1 "low" 155

Das Referenzserum TV09/2008 hatte einen Endpunkttiter von 4000, der EC

50

-Wert lag

bei 1 : 150 (Abb. 6.19).

149

6. Ergebnisse

101 102 103 104 105 106 107

1

10

100

1000

10000

100000

Verdünnung[1

x

]

MuH

V-1

UL5

5sh

Cut-off

Abbildung 6.19. Titration des MuHV-1Referenzserums TV09/2008

Die MFI-Werte der MuHV-1CRVirionELISApositiven und -negativen Seren unter-

s hieden si h stark voneinander (Abb. 6.20). Drei Seren regierten fals h positiv mit

MFI-Werten zwis hen 155 und 763MFI, das CRpositive Serum mit dem niedrigsten

MFI-Wert hatte 1781MFI.

150


neg. Grauzone pos.1

10

100

1000

10000

100000

MuHV-1 CR Virion ELISA [Klassifikation]

MuH

V-1

UL5

5sh

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.20. MuHV-1UL55shReaktivitäten MuHV-1CRVirionELISAnegativer

(N=38), in derGrauzone liegender (N=2) und -positiver Seren (N=8)

Die CRELISAS ore-Werte und die MSMFI-Werte zeigten keine Korrelation (p = 0,40)

(Abb. 6.21).

151

6. Ergebnisse

0 5 10 151

10

100

1000

10000

100000

23

Gra

uzon

ezw

.Sco

re2

und

3

Cut-off

MuHV-1 CR Virion ELISA [Score]

MuH

V-1

UL5

5sh

MS

[MF

I]

Abbildung 6.21. MuHV-1UL55shReaktivitäten und ihre Korrelation zu MuHV-

1CRVirionELISAS ore-Werten (N=10)

Die Sensitivität der MuHV-1UL55shMS gegenüber dem MuHV-1CRELISA lag mit

100% sehr ho h und die Spezität mit 92% ho h (Tab. 6.26). Die Übereinstimmung war

sehr gut (κ = 0,80).

Tabelle 6.26. MuHV-1UL55shMS im Verglei h mit MuHV-1CR VirionELISA (N=48)

MuHV-1CRVirionELISA Sens.: 100%

+ − Spez.: 92%

MuHV-1UL55

MS

+ 8 3 κ: 0,80

− 0 35 95% CI: 0,59 bis 1,01

Übereinst.: sehr gut

152


Nur für 2 Seren lagen Daten aus der MuHV-1 IFA vor. Sie waren mit der MS konkor-

dant negativ.

Eines der diskordanten, fals h positiven Seren war das MuHV-1 low Referenzserum

des CRELISA, das in der MS mit 155MFI sehr s hwa h reagierte, aber entgegen der

Denition im CRELISAnegativ war (Tab. 6.27). Das zweite diskordante Serum war mit

763MFI mäÿig positiv. Eine tatsä hli he MuHV-1 Infektion ist damit ni ht unwahr-

s heinli h. Das dritte diskordante Seren wird bei den Zoohandlungstieren diskutiert.

Tabelle 6.27. Diskordante Seren in der MuHV-1MS (ohne Zoohandlungstiere)


MuHV-1UL55sh MuHV-1

MS CRVirionELISA

[MFI [Kl.

1 CRMCMV"low" KS 155 neg.

2 KS 3/Reihe1/6 KS 763 neg.


Zoohandlungstiergruppen Unter den Zoohandlungstieren waren in ledigli h zwei

Gruppen Seren mit erhöhten MFI-Werten zu nden (Tab. 6.28, Gruppen D und H). Da-

bei war in GruppeH nur ein Serum s hwa h positiv (210MFI) und CRELISAnegativ.

Dagegen zeigte GruppeD dur hweg hohe MFI-Werte über 2500 (MW6538, SD4239).

Drei dieser fünf Seren waren au h CRELISApositiv und die restli hen zwei in der Grau-

zone.

153

6. Ergebnisse

Tabelle 6.28. Antikörper gegen MuHV-1 in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

MuHV-1UL55sh MuHV-1

MS CRVirionELISA

[MFI [S ./Kl.

D 7 201046101 2554 2,9

D 8 201046102 11746 2,6

D 9 201046103 1781 4,7

D 10 201046104 8224 6,6

D 11 201046105 8386 3,6

H 27 201053801 210 neg.

H 28 201053802 1 neg.

H 29 201053803 1 neg.

H 30 201053804 1 neg.

H 31 201053805 1 neg.


Tabelle ist gekürzt: Gruppen mit konkordant negativen Ergebnissen ni ht enthalten

S . 2-3: Grauzone

Fazit Alle drei Referenzseren reagierten in der MS positiv. Im Verglei h mit dem

CRELISA gab es keine fals h negativen Seren. Die MS mit MuHV-1UL55sh ist als

serologis hes Verfahren für die Überwa hung von Versu htierbeständen gut geeignet, da

die Detektion positiver Seren zuverlässiger funktionierte als mit dem MuHV-1CR Viri-

onELISA, wie in den Zoohandlungstiergruppen gezeigt. Auÿerdem hat der CRELISA

in dieser Arbeit die CR low Kontrolle ni ht als positiv erkannt und au h in der basie-

rend auf den MS-Daten komplett MuHV-1 dur hseu hten HaltungsgruppeD nur drei

der fünf Seren als eindeutig positiv detektiert.

154


Ectromelia virus

Als Referenztests standen VACV IFA und ECTVCRVirionELISA zur Verfügung, die

in der Routinediagnostik als Su htest bzw. als Bestätigungstest eingesetzt werden. Für

die MS wurden die Antigene VACVp35 und VACVmajor envelopeProtein (maj. env.)

verwendet.

Es wurden vier Referenzseren, se hs ECTVCRVirionELISApositive (vier Refe-

renzseren enthalten), 41ECTVCRVirionELISAnegative, vier VACV IFApositive und

38VACV IFAnegative Seren verwendet.

Alle vier ECTV/VACVReferenzseren reagierten in der MS mit beiden VACVAntigenen

stark positiv (MFI > 4000), VACVp35 über 4800MFI (MW7165MFI, SD2839) und

mit major envelope über 4300MFI (MW7165MFI, SD3841) (Tab. 6.29).

Tabelle 6.29. Reaktivitäten der vier ECTV/VACVReferenzseren in der VACVp35- und

VACVmajor envelopeMS

Herkunft Serum ID VACVp35MS VACVmaj. env.MS

[MFI [MFI

CR ECTV"high" 4816 4929

DKFZ TV01/2005 11129 6578

BioDo 200940106 7268 12756

A lad ECTV 5449 4399

Das Referenzserum TV01/2005 zeigte Endpunkt-Titer von 12 000 mit major envelope

und 36 000 mit p35, die EC

50

-Werte lagen bei 1 : 250 für major envelope und bei 1 : 700

für p35 (Abb. 6.22).

155

6. Ergebnisse

101 102 103 104 105 106 107

1

10

100

1000

10000

100000 VACV maj. env.

VACV p35

Verdünnung[1

x

]

VA

CV

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.22. Titration des VACVReferenzserums TV01/2005

Alle se hs CRELISApositiven Seren reagierten stark mit beiden MSAntigenen mit MFI-

Werten zwis hen knapp 5000 und über 11 000 (Abb. 6.23). Die CRELISAnegative Grup-

pe zeigte insgesamt niedrige MFI-Werte, und es waren nur drei von 41 Seren mit einem

der beiden Antigene fals h positiv.

156


neg. pos.1

10

100

1000

10000

100000VACV p35

VACV maj. env.

ECTV CR Virion ELISA [Klassifikation]

VA

CV

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.23. VACVp35 und major envelopeReaktionen ECTVCRELISAnegatvier

(N=41) und -positiver Seren (N=6)

Bei den se hs positiven Seren zeigten die ELISAS ore-Werte mit den MFI-Werten beider

Antigene keine Korrelation (p35: p = 0,44 und maj. env.: p = 0,51) (Abb. 6.24).

157

6. Ergebnisse

0 5 10 15 20 25

1

10

100

1000

10000

100000

3

Cut-off

VACV p35 MS

VACV maj. env. MS

ECTV CR Virion ELISA [Score]

VA

CV

MS

[MF

I]

Abbildung 6.24. VACVp53 und -major envelope Reaktivitäten und ihre Korrelation zu

CRELISA S ore-Werten (N=6)

Stark positive Seren in der MS (MFI > 4000, CRELISApositiv) reagierten konkor-

dant stark mit beiden MSAntigenen (Abb. 6.25). Die niedrigen bis mittleren Reakti-

vitäten der drei fals h positiven Seren bes hränkten si h jeweils auf nur ein Antigen.

158


Cut-off

ECTV CR Virion ELISA neg.

ECTV CR Virion ELISA pos.

VACV p35 MS [MFI]

VA

CV

maj

.env

.MS

[MF

I]

100000

10000

1000

100

10

10

1

1 100 1000 10000 100000

Abbildung 6.25. Korrelation von MSReaktivitäten mit VACVp35 und

VACVmajor envelope in ECTVCRVirionELISAklassizierten Se-

ren (N=47). Die doppelt negativen Seren (N=38) sind ni ht dargestellt.

Gegenüber der ECTVCRVirionELISAKlassikation zeigte die MS mit beiden Antige-

nen hohe Sensitivität mit jeweils 100% und hohe Spezität mit 95% (major envelope)

bzw. 98% (p35) (Tab. 6.30, Tab. 6.31). Die Übereinstimmung war sehr gut (κ = 0,83

bzw. κ = 0,91).

159

6. Ergebnisse

Tabelle 6.30. VACVmajor envelopeMS im Verglei h mit ECTVCRVirionELISA (N=47)

ECTV

CRVirionELISA Sens.: 100%

+ − Spez.: 95%

VACVmaj. env.

MS

+ 6 2 κ: 0,83

− 0 39 95% CI: 0,61 bis 1,06


Tabelle 6.31. VACVp35MS im Verglei h mit dem ECTVCRVirionELISA (N=47)

ECTVCRVirionELISA Sens.: 100%

+ − Spez.: 98%

VACVp35MS

+ 6 1 κ: 0,91

− 0 40 95% CI: 0,74 bis 1,08


Gegenüber der VACV IFA zeigte die MS mit beiden Antigenen mit jeweils 75% niedrigere

Sensitivität und mit 100% (major envelope) bzw. 97% (p35) hohe Spezität (Tab. 6.32,

Tab. 6.33). Die Übereinstimmung war sehr gut bzw. gut (κ = 0,84 bzw. κ = 0,72).

Tabelle 6.32. VACVmajor envelopeMS im Verglei h mit VACV IFA (N=42)

VACV IFA Sens.: 75%

+ − Spez.: 100%

VACVmaj. env.

MS

+ 3 0 κ: 0,84

− 1 38 95% CI: 0,55 bis 1,14


Tabelle 6.33. VACVp35MS im Verglei h mit VACV IFA (N=42)

VACV IFA Sens.: 75%

+ − Spez.: 97%

VACVp35MS

+ 3 1 κ: 0,72

− 1 37 95% CI: 0,36 bis 1,09

Übereinst.: gut

160


Zwei diskordante Seren waren mit major envelope s hwa h und mäÿig positiv, und nega-

tiv mit p35 und au h im CRELISA (Tab. 6.34). Zwei weitere diskordante Seren werden

bei den Zoohandlungstieren diskutiert.

Tabelle 6.34. Diskordante Seren in der VACVMS (ohne Zoohandlungstiere)


VACVp35 VACVmaj. env. ECTV

MS MS CRELISA

[MFI [MFI [Kl.

1 201023601 KS 1 222 neg.

2 TVLDV/10 KS 1 1722 neg.


Zoohandlungstiergruppen Nur in drei der a ht Zoohandlungstiergruppen wurden

positive Reaktionen beoba htet. Die beiden Seren der GruppeC waren in allen vier

Tests konkordant positiv und damit beweisend für eine ECTV-Infektion (Tab. 6.35).

Dagegen war in den GruppenG und H nur jeweils ein Serum aus hlieÿli h mit ei-

nem einzigen Test positiv (VACVp35MS bzw. VACV IFA) und zeigte vermutli h

fals h positiveReaktionen an. Allerdings könnte in dem s hwa h p35 positiven Serum

Nr. 27 die knapp unter Cut-o liegende Reaktion (75MFI) mit major envelope au h eine

sehr frühe Phase der Serokonversion anzeigen.

Tabelle 6.35. Antikörper gegen VACV und ECTV in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

VACVp35 VACVmaj. env. VACV ECTV

MS MS IFA CRELISA

[MFI [MFI [Kl. [Kl./S .

C 5 201043801 11044 10856 pos. 15,0

C 6 201043802 14496 14102 pos. 20,1

G 22 201051701 1 1 neg. neg.

G 23 201051702 1 1 neg. neg.

G 24 201051703 1 1 pos. neg.

G 25 201051704 1 1 neg. neg.

G 26 201051705 1 1 neg. neg.

H 27 201053801 153 75 neg. neg.

H 28 201053802 1 1 neg. neg.

H 29 201053803 1 1 neg. neg.

161

6. Ergebnisse

Tabelle 6.35. Antikörper gegen VACV und ECTV in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

VACVp35 VACVmaj. env. VACV ECTV

MS MS IFA CRELISA


H 30 201053804 1 1 neg. neg.

H 31 201053805 1 1 neg. neg.


Fazit MS mit VACVp35 und mit major enevelope erkannte alle vier

ECTV/VACVReferenzseren als doppelt positiv, und gegenüber dem CRELISA

gab es keine fals h negativen Seren. Das gegenüber der IFA mit beiden Antigenen

fals h negative Zoohandlungstier hatte vermutli h keine ECTV Infektion, da es

als einziges Tier der Gruppe und mit nur einem Test positiv war. Beide Antigene

sind für die Routineserologie sehr gut geeignet. Das major envelopeProtein war zwar

genauso sensitiv, aber die Spezität war etwas geringer. Major envelope und p35 sollten

zusammen in der Routineserologie verwendet werden. Wenn beide Antigene positiv

sind, wird die Spezität erhöht.

162


Murine Parvoviren

Die Parvovirus-Proteine NS1 von KRV, MVM und RPV sowie die VP2Proteine von

MPV1, MPV2 und MVM wurden für die MS validiert. Als Referenztests wurden ein

MVMHAH, drei ELISA (auf VP2- oder NS1Ebene) und eine MVMIFA verwendet.

In der Routine werden IFA und CRNS1ELISA als Su htests, CRVP2ELISA als Bestä-

tigungstest und die vers hiedenen HAH zur Speziesbestimmung verwendet.

Es wurden für MVM se hs Referenzseren, 31 MVMVP2CRELISApositive (keine Refe-

renzseren enthalten) und 19 MVMVP2CRELISAnegative Seren verwendet. Auÿerdem

stand eine Konversionsstudie mit elf Seren zur Verfügung.

Für MPV wurden drei Referenzseren, 58 MPVVP2CRELISApositive (keine Referenz-

seren enthalten) und 237 MPVVP2CRELISAnegative Seren verwendet. Auÿerdem

stand eine Konversionsstudie mit 23 Seren zur Verfügung.

Alle sieben Referenzseren für murine Parvoviren reagierten mit min. einem der se hs

Parvovirus-Antigene, zeigten aber teilweise deutli h unters hiedli he Muster (Tab. 6.36).

Das DKFZ-Serum TV01/2004 reagierte auss hlieÿli h mit MVMVP2. Die anderen

vier Referenzseren reagierten deutli h stärker mit NS1 als mit VP2 und zeigten keine

MVMSpezität. Obwohl sie als MVM-Referenzseren deklariert sind, waren die Reak-

tionen mit KRVNS1 und au h mit RPVNS1 stärker als mit nur s hwa h reaktivem

MVMNS1. Die VP2Reaktionen waren insgesamt s hwä her als NS1Reaktionen und

stärker mit VP2 von MPV-1 und MPV-2 als mit MVMVP2. Das MPVspezis he Re-

ferenzserum des DKFZs (TV01/08 #1-9) dur h experimentelle Infektion mit einem

MPV-1Feldisolat hergestellt zeigte die gröÿte MPV-1VP2Spezität, au h hier war die

Reaktion mit KRVNS1 stärker als mit den NS1 von MVM und RPV.

163

6. Ergebnisse

Tabelle 6.36. Reaktivitäten von ParvovirusReferenzseren in der murinenParvovirusMS

KRV MVM RPV MPV-1 MPV-2 MVM

Herkunft Serum ID NS1MS NS1MS NS1MS VP2MS VP2MS VP2MS

[MFI [MFI [MFI [MFI [MFI [MFI

CR NS1 "high" 14434 1964 9722 1698 1009 851

CR MVM"low" 7873 788 4380 523 806 816

CR MVM"high" 1753 10 527 59 12 156

A lad MVM 8181 824 6709 322 153 107

DKFZ MVMTV01/2004 151 1 55 13 34 1519

CR MPV high 4368 24 1598 316 201 33

CR NS1 high 14434 1964 9722 1698 1009 851

DKFZ MPVTV01/08 #1-9 15038 1146 10676 8327 919 650

Ein weiteres MVMReferenzserum CRS1055, in Wilmington gemessen zeigte mit

KRVNS1 einen Endpunkttiter von 300 000 (EC

50

1 : 1000), 20 000 (EC

50

1 : 150) mit

MVMVP2 und 3- bis 9fa h geringer mit VP2 von MPV-1 und MPV-2 (Abb. 6.26,

Tab. 6.37).

164


101 102 103 104 105 106 107 108

1

10

100

1000

10000

100000KRV NS1

MPV-1 VP2

MPV-2 VP2

MVM VP2

Verdünnung[1

x

]

Par

vovi

rus

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.26. Titration eines weiteren MVMRerenzserums (CRS1055)

Das DKFZMPVReferenzserum (TV01/2008) zeigte mit NS1 einen Titer von 110 000

(EC

50

1 : 1000). Der MPV-1VP2Endpunktiter von 36 000 (EC

50

1 : 400) lag 9- (MPV-2)

bis 40fa h (MVM) höher als mit den anderen VP2Proteinen (Abb. 6.27, Tab. 6.37).

165

6. Ergebnisse

101 102 103 104 105 106 107

1

10

100

1000

10000

100000KRV NS1

MPV-1 VP2

MPV-2 VP2

MVM VP2

Verdünnung[1

x

]

Par

vovi

rus

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.27. Titration des MPVReferenzserums TV01/2008

Das MPV-1Referenzserum CRS1416 errei hte mit KRVNS1 einen Titer von 40 000

(EC

50

1 : 200) und mit VP2 5000 (EC

50

1 : 35) bei MPV-1, 1250 bei MPV-2 und nur 80

bei MVM (Abb. 6.28, Tab. 6.37).

166


101 102 103 104 105 106 107 108

1

10

100

1000

10000

100000KRV NS1

MPV-1 VP2

MPV-2 VP2

MVM VP2

Verdünnung[1

x

]

Par

vovi

rus

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.28. Titration eines weiteren MPV-1Referenzserums (CRS1416)

Trotz der ausgeprägten Multi-Reaktivität der Referenzseren für VP2 der drei Parvoviren

der Maus, zeigten die Endpunktitrationen do h eine wenn au h begrenzte Virus-

Spezität auf. Die sehr starken NS1Reaktivitäten der Seren mit Endpunktitern von

40 000 bis 600 000 zeigten au h, dass bei hohen Serumkonzentrationen (> 1000fa h über

dem Endpunkttiter) Antigen-Saturierung in der MS stattndet, in den Titrationskur-

ven si htbar dur h MFI-Plateaus bei niedrigen Verdünnungen (Abb. 6.26 bis Abb. 6.29).

Daraus kann für die MS eine dynamis he Breite (lineare Dosis-Wirkungsbeziehung) von

etwa drei Gröÿenordnungen abgeleitet werden.

Das MPV-2Referenzserum CRS1474 zeigte mit 600 000 den hö hsten KRVNS1Titer

(EC

50

1 : 2000) aller titrierten Referenzseren, au h mit 10 000 den hö hsten MPV-

2VP2Titer (EC

50

1 : 70) (Abb. 6.29, Tab. 6.37).

167

6. Ergebnisse

101 102 103 104 105 106 107 108

1

10

100

1000

10000

100000KRV NS1

MPV-1 VP2

MPV-2 VP2

MVM VP2

Verdünnung[1

x

]

Par

vovi

rus

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.29. Titration eines weiteren MPV-2Referenzserums (CRS1474)

Tabelle 6.37. Spezität (Endpunkttiter) von Parvovirus-Referenzseren mit VP2Proteinen

R

e

f

e

r

e

n

z

s

e

r

u

m

S

p

e

z

i

t

ä

t

K

R

V

N

S

1

M

V

M

V

P

2

M

P

V

-

1

V

P

2

M

P

V

-

2

V

P

2

A

b

b

i

l

d

u

n

g

CRS 1055 MVM 300 000 20 000 6600 2200 6.26

TV01/2008 MPV 110 000 1000 36 000 4000 6.27

CRS1416 MPV-1 40 000 80 5000 1250 6.28

CRS1474 MPV-1 600 000 600 2500 10 000 6.29

Für Serokonversionsstudien standen Seren zur Verfügung, die zwis hen dem 0. und dem

35.DPI von Mäusen mit MVM und MPV-1 gewonnen worden waren.

168


Zehn Tage na h MVMInfektion waren bereits s hwa he Antikörperreaktionen erkenn-

bar, sowohl mit KRVNS1 au h wenn ni ht alle Reaktionen über Cut-o lagen als

au h in etwas stärkerem Maÿe mit MVMVP2. In den folgenden drei bis vier Wo hen

stiegen die Werte langsam weiter an, errei hten aber kein sehr hohes Niveau (Abb. 6.30,

Abb. 6.31).

0 10 14 28 351

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

DPI

KR

VN

S1

MS

[MF

I]

Abbildung 6.30. Serokonversionsstudie gegen KRVNS1 in MVM inzierten Mäusen

(N=11)

169

6. Ergebnisse

0 10 14 28 351

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

DPI

MV

MV

P2

MS

[MF

I]

Abbildung 6.31. Serokonversion gegen MVMVP2 in MVM inzierten Mäusen (N=11)

Ein ähnli hes Serokonversionsbild zeigte si h au h in den MPV-1 inzierten Mäusen mit

ersten für KRVNS1 no h unter Cut-o liegenden und für MPV-1VP2 etwas ausgepräg-

teren Reaktionen am 7.DPI und langsamen Anstiegen für VP2 in den folgenden vier

Wo hen (Abb. 6.32, Abb. 6.33), aber für NS1 wurde mit MFI-Werten um 10 000 bereits

Antikörpersättigung errei ht.

170


0 7 14 28 351

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

DPI

KR

VN

S1

MS

[MF

I]

Abbildung 6.32. Serokonversion gegen KRVNS1 in MPV-1 inzierten Mäusen (N=23)

0 7 14 28 351

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

DPI

MP

V-1

VP

2M

S[M

FI]

Abbildung 6.33. Serokonversion gegen MPV-1VP2 in MPV-1 inzierten (N=23)

171

6. Ergebnisse

Bei MPV-1/2 oder MVMVP2 CRELISApositiven Seren zeigte si h eine hohe Kreuzre-

aktivität zwis hen MVM und MPV-1 VP2 in der MS (R2 = 0, 76) (Abb. 6.34).

MPV-1 VP2 [MFI]

MV

MV

P2

[MF

I]

100000

10000

1000

100

10

11 10 100 1000 10000 100000

Cut-off

Abbildung 6.34. Reaktivitäten in der MVM und MPV-1VP2MS von MPV-1/2 oder

MVMVP2CRELISApositiven Seren (N=57) (ohne a ht in der MVM

und MPV-1VP2MSnegative Seren, ohne Konversionsstudien)

Sogar no h höher war die Korrelation zwis hen MPV-1 und MPV-2VP2 in der MS

(R2 = 0,83) (Abb. 6.35).

172


MPV-1 VP2 [MFI]

MP

V-2

VP

2[M

FI]

100000

10000

1000

100

10

1

1 10 100 1000 10000 100000

Cut-off

Abbildung 6.35. Reaktivitäten in der MPV-2 und MPV-1VP2MS von MPV-1/2 oder

MVMVP2CRELISApositiven Seren (N=60) (ohne fünf in der MPV-2

und MPV-1VP2MSnegative Seren, ohne Konversionsstudien)

Bei der experimentellen Parvovirus-Infektion wurden deutli h s hwä her kreuzreagie-

rende VP2Antikörper induziert (Abb. 6.36). Unter den 20 VP2positiven Seren waren

insgesamt fünf doppelt positiv, die anderen Kreuzreaktivitäten waren im Verglei h zu

den Seren vom 0.DPI si htbar, blieben aber unter Cut-o. Die Stärke der Kreuzreak-

tivität s heint ni ht mit der Stärke der spezis hen Reaktion zu korrelieren, allerdings

war mit einer einzigen Ausnahme die spezis he VP2Reaktion immer stärker als die

VP2Kreuzreaktion.

173

6. Ergebnisse

1 10 100 1000 10000 1000001

10

100

1000

10000

100000

MPV-1 immunisiertMVM immunisiert

Diagonale

MVM VP2 MS [MFI]

MP

V-1

VP

2M

S[M

FI]

Cut-off

Abbildung 6.36. Kreuzreaktivität zwis hen Serumantikörpern gegen die Parvoviren der

Maus am Beispiel der CR-Konversionsstudien (N=23)

MVMNS1 zeigte in 13 von 44 Seren eine deutli h s hwä here Reaktivität im Verglei h

zu KRVNS1 (> Faktor 10), während RPVNS1 deutli h besser korrelierte (R2 = 0,8) als

MVMNS1 (R2 = 0,2) (Abb. 6.37, Abb. 6.38). Da alle Kontroll- und Zoohandlungstier-

seren, die in KRVNS1CRELISA positiv waren und alle Referenzseren unabhängig von

ihrer deklarierten Spezität mit NS1 von KRV am stärksten reagiert hatten, wurde im

Folgenden nur KRVNS1 weiter untersu ht.

174


KRV NS1 [MFI]

MV

MN

S1[

MF

I]

100000

10000

1000

100

10

1

1 10 100 1000 10000 100000

Cut-off

Abbildung 6.37. Reaktivitäten in der MVM und KRVNS1MS von

KRVNS1CRELISApositiven Seren (N=44)

175

6. Ergebnisse

KRV NS1 [MFI]

RP

VN

S1

[MF

I]

100000

10000

1000

100

10

11 10 100 1000 10000 100000

Cut-off

Abbildung 6.38. Reaktivitäten in der RPV und KRVNS1MS von

KRVNS1CRELISApositiven Seren (N=44)

Vergleich mit Referenztests NS1

KRVNS1CRELISApositiv und -negativ klassizierte Seren zeigten deutli h unter-

s hiedli he Reaktionen in der MS mit KRVNS1 (Abb. 6.39). Alle 39 ELISApositiven

Seren lagen in der MS deutli h über Cut-o, davon 29 mit über 10 000MFI. Von den

42 ELISAnegativen Seren lagen dagegen in der MS nur 9 unter Cut-o und a ht der

33 fals h positiven Seren zeigten ebenfalls mehr als 10 000MFI. Au h die drei ELISA

Seren, errei hten mehr als 10 000MFI.

176


neg. Grauzone pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch KRV NS1 CR ELISA

KR

VN

S1

MS

[MF

I]

Abbildung 6.39. KRVNS1MSReaktivitäten KRVNS1CRELISAnegativer (N=41),


Zwis hen ELISAS ore-Werten und MSMFI-Werten war keine lineare Beziehung oen-

si htli h (Abb. 6.40). Zwar zeigten die drei Seren mit den niedrigsten MS-Reaktionen (<

10 000MFI) S ore-Werte unter 8, aber glei hzeitig zeigten 15 andere Seren mit diesen

niedrigen S ore-Werten sehr hohe MFI-Werte > 10 000. Die MSReaktionen der meisten

Seren lagen bei der gewählten Verdünnung von 1 : 500 über 10 000MFI und damit

wohl im Antikörper-Sättigungsberei h, der hohe von sehr hohen Antworten ni ht wei-

ter dienzieren kann . Das Bestimmtheitsmaÿ R2betrug nur 0,29 und war signikant

(p = 0,0001).

177

6. Ergebnisse

0 5 10 15 20 25

1

10

100

1000

10000

100000

3

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3

Cut-off

KRV NS1 CR ELISA [Score]

KR

VN

S1

MS

[MF

I]

Abbildung 6.40. KRVNS1MSReaktivitäten und ihre Korrelation zu

KRVNS1CRELISAS ore-Werten (N=45)

S hon bei den Referenzseren war beoba htet worden, dass NS1Antikörper in der MS die

NS1Proteine vers hiedener Parvoviren kaum dierenzieren können, und dass die Reakti-

on mit MVMNS1 viel s hwä her waren als die mit KRVNS1. Das glei he Muster wurde

au h bei den Kontrollseren und Zoohandlungstierseren, die mit dem KRVNS1CRELISA

klassiziert sind, beoba htet. Die MSReaktionen der KRVNS1CRELISAklassizierten

Seren mit MVMNS1 (Abb. 6.41) waren deutli h s hwä her als zuvor (Abb. 6.40) mit

KRVNS1 beoba htet. Vier der ELISApositiven Seren waren negativ mit MVMNS1

(Abb. 6.41). Es zeigte si h eine lei hte Dosis-Wirkungsbeziehung der MSReaktionen mit

den ELISAS ore-Werten mit einer sehr breiten Streuung, aber au h mit einer hohen

Signikanz (Bestimmtheitsmaÿ R2 = 0,51; p < 0,0001) (Abb. 6.42).

178


neg. Grauzone pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off


MV

MN

S1

MS

[MF

I]

Abbildung 6.41. MVMNS1MSReaktivitäten KRVNS1CRELISAnegativer (N=41),


179

6. Ergebnisse

0 5 10 15 20 25

1

10

100

1000

10000

100000

3

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3

Cut-off


MV

MN

S1

MS

[MF

I]

Abbildung 6.42. MVMNS1MSReaktivitäten und ihre Korrelation zu


Die MSReaktionen mit RPVNS1 waren bei den Referenzseren nur wenig s hwä-

her als mit KRVNS1 gewesen. Au h dieses Muster wurde hier bei den

CRELISAklassizierten Seren wieder beoba htet (Abb. 6.43). Eine sehr s hwa he linea-

re Dosis-Wirkungsbeziehung der MSReaktionen war nur für ELISAS ore-Werte unter

7 s hwa h si htbar (Abb. 6.44). Das Bestimmtheitsmaÿ (R2 = 0,38; p < 0,0001) war

s hwä her als mit MVMNS1 und etwas stärker als mit KRVNS1.

180


neg. Grauzone pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off


RP

VN

S1

MS

[MF

I]

Abbildung 6.43. RPVNS1MSReaktivitäten KRVNS1CRELISAnegativer (N=41),


181

6. Ergebnisse

0 5 10 15 20 251

10

100

1000

10000

100000

3

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3

Cut-off


RP

VN

S1

MS

[MF

I]

Abbildung 6.44. RPVNS1MSReaktivitäten und ihre Korrelation zu


Die Sensitivität der KRVNS1MS gegenüber dem KRVNS1CRELISA lag mit 100% sehr

ho h, die Spezität mit nur 22% aber war sehr niedrig, womit die Übereinstimmung nur

mäÿig war (κ = 0,23) (Tab. 6.38).

Tabelle 6.38. KRVNS1MS im Verglei h mit dem KRVNS1CRELISA (N=85)

KRVNS1CRELISA Sens.: 100%

+ − Spez.: 22%

KRVNS1MS + 44 32 κ: 0,23

− 0 9 95% CI: 0,09 bis 0,36


Für die insgesamt weniger sensitive MVMNS1MS sank die Sensitivität auf 91%, die Spe-

zität stieg auf 68% und die Übereinstimmung wurde moderat (κ = 0,60) (Tab. 6.39).

182


Tabelle 6.39. MVMNS1MS im Verglei h mit dem KRVNS1CRELISA (N=85)


+ − Spez.: 68%

MVMNS1MS + 40 13 κ: 0,60

− 4 28 95% CI: 0,43 bis 0,76


Für RPV NS1 MS war die Sensitivität wieder 100% und die Spezität mit 33% wieder

sehr niedrig bei nur mäÿiger Übereinstimmung (κ = 0,33) (Tab. 6.40).

Tabelle 6.40. RPVNS1MS im Verglei h mit KRVNS1CRELISA (N=85)


+ − Spez.: 32%

RPVNS1MS

+ 44 28 κ: 0,33

− 0 13 95% CI: 0,17 bis 0,48


VP2

Unter 31MVMVP2CRELISApositiven Seren waren zwei in der MVMVP2MS

fals h negativ (Abb. 6.45, Tab. 6.41). Die Reaktionen der ri htig positiven Seren

streuten breit, aber errei hten ni ht die bei den NS1Reaktionen häug beoba htete

Antikörper Sättigung. Von den 19 ELISAnegativen Seren waren zehn fals h positiv.

Eine lineare Dosis-Wirkungsbeziehung der MSReaktionen mit den ELISAS ore-Werten

fehlte (Bestimmtheitsmaÿ R2 = 0,09; p = 0,0947, ni ht signikant) (Abb. 6.45). Die MS

Sensitivität lag mit 97% ho h, die Spezität aber nur bei 47% und die Übereinstimmung

war nur moderat (κ = 0,45) (Abb. 6.46).

Tabelle 6.41. MVMVP2MS im Verglei h mit dem MVMVP2CRELISA (N=50)

MVMVP2CRELISA Sens.: 94%

+ − Spez.: 47%

MVMVP2MS + 29 10 κ: 0,45

− 2 9 95% CI: 0,20 bis 0,70


183

6. Ergebnisse

neg. Grauzone pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch MVM VP2 CR ELISA

MV

MV

P2

MS

[MF

I]

Abbildung 6.45. MVMVP2MSReaktivitäten MVMVP2CRELISAnegativer (N=19),


184


0 5 10 15 20 251

10

100

1000

10000

100000

3

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3

Cut-off

MVM VP2 CR ELISA [Score]

MV

MV

P2

MS

[MF

I]

Abbildung 6.46. MVMVP2MSReaktivitäten und ihre Korrelation zu

MVMVP2CRELISAS ore-Werten (N=33)

Die Verglei he von MPV-1 und MPV-2VP2MS mit dem kombinierten MPV-

1/2VP2CRELISA zeigten sehr ähnli he Muster. ELISApositive und -negative konnten

au h in den beiden MS sehr gut dierenziert werden (Abb. 6.47, Abb. 6.49, Tab. 6.42,

Tab. 6.43) mit insgesamt nur wenigen fals h positiven und fals h negativen Seren.

185

6. Ergebnisse

neg. pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch MPV-1/2 VP2 CR ELISA

MP

V-1

VP

2M

S[M

FI]

Abbildung 6.47. MPV-1VP2MSReaktivitäten MPV-1/2VP2CRELISAnegativer


186


0 5 10 15 20 251

10

100

1000

10000

100000

3

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3

Cut-off

MPV-1/2 VP2 CR ELISA [Score]

MP

V-1

VP

2M

S[M

FI]

Abbildung 6.48. MPV-1VP2MSReaktivitäten und ihre Korrelation zu MPV-

1/2VP2CRELISAS ore-Werten (N=58)

Dosis-Wirkungsbeziehungen zeigten si h weder für MPV-1 (Bestimmtheitsmaÿ R2 =

0,06; p = 0,0556, ni ht signikant), no h für MPV-2 (Bestimmtheitsmaÿ R2 = 0,07;

p = 0,0402) (Abb. 6.48, Abb. 6.50).

187

6. Ergebnisse

neg. pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch MPV-1/2 VP2 CR ELISA

MP

V-2

VP

2M

S[M

FI]

Abbildung 6.49. MPV-2VP2MSReaktivitäten MPV-1/2VP2CRELISAnegativer


188


0 5 10 15 20 251

10

100

1000

10000

100000

3

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3

Cut-off

MPV-1/2 VP2 CR ELISA [Score]

MP

V-2

VP

2M

S[M

FI]

Abbildung 6.50. MPV-2VP2MSReaktivitäten und ihre Korrelation zu MPV-

1/2VP2CRELISAS ore-Werten (N=58)

Die Sensitiväten von MPV-1 und MPV-2VP2MS mit jeweils 90% und die Spezitäten

mit 98% und 100% lagen ho h und ergaben sehr gute Übereinstimmungen (κ = 0,89

bzw. κ = 0,92) (Tab. 6.42, Tab. 6.43).

Tabelle 6.42. MPV1VP2MS im Verglei h MS mit dem MPV1/2CRVirionELISA

(N=295)

MPV-1/2VP2CRVirionELISA Sens.: 90%

+ − Spez.: 98%

MPV-1VP2MS + 52 4 κ: 0,89

− 6 233 95% CI: 0,83 bis 0,96


189

6. Ergebnisse

Tabelle 6.43. MPV2VP2MS im Verglei h mit dem MPV1/2CRVirionELISA (N=295)

MPV-1/2VP2CRELISA Sens.: 90%

+ − Spez.: 100%

MPV-2VP2MS + 52 1 κ: 0,92

− 6 236 95% CI: 0,87 bis 0,98


Die hohen Übereinstimmungen der beiden VP2MS mit dem kombinierten VP2ELISA

legten nahe, dass beide MSReaktionen imWesentli hen die glei hen Antikörper detektie-

ren. Deshalb wurde au h die Konkordanz einer kombinierten MSAnalyse (VP2 positiv,

wenn min. eine MSReaktion positiv) untersu ht, die eine Sensitivität von 95%, eine

Spezität von 98% und eine sehr gute Übereinstimmung zeigte (Tab. 6.44). Damit lieÿ

si h gegenüber den Einzelanalysen ohne Verlust der Spezität die Sensitivität um 5%

erhöhen.

Tabelle 6.44. Kombinierte MPV-1 und MPV-2VP2MS (MPV-1/2, mindestens eine Reak-

tion positiv) im Verglei h mit MPV1/2CRVLPELISA (N=295)

MPV-1/2VP2CRVirionELISA Sens.: 95%

+ − Spez.: 98%

MPV-1/2VP2

MS

+ 55 4 κ: 0,93

− 3 233 95% CI: 0,87 bis 0,98


Wurden im Sinne eines S reening-Ansatzes für die MS vier parvovirale MSAntigene

(KRVNS1 und VP2 von MVM, MPV-1 und MPV-2) zusammengefasst (Parvovi-

rusMSpositiv, wenn mit min. einem Antigen positiv) und mit Positivität in min. ei-

nem der drei CRELISA (MVMVP2, MPV-1/2 VP2 und KRVNS1) vergli hen, errei hte

die MS 99% Sensitivität, 100% Spezität und sehr gute Übereinstimmung (κ = 0,94)

(Tab. 6.45).

190


Tabelle 6.45. ParvovirusMS im Verglei h mit ParvovirusCRELISAKombination (N=82)

KRVNS1,

MPV-1/2VP2,

MVMVP2CRELISA

Sens.: 99%

+ − Spez.: 100%

KRVNS1,

MPV-1/2VP2,

MVMVP2MS

+ 72 0 κ: 0,94

− 1 9 95% CI: 0,83 bis 1,06


1

ParvovirusPositivität ist deniert als Positivität

mit min. einem MSAntigen bzw. min. einem ELISA

Diskordante Seren NS1

Die Analyse der diskordanten Seren für NS1MS bes hränkt si h hier auf KRVNS1

Diskordante, da dieses Antigen na h bisheriger Analyse gröÿere Sensitivität aufweist als

MVM und RPVNS1. Die 21 (unter Auss hluÿ der später diskutierten Zoohandlungs-

tiere) in der KRVNS1MS gegenüber dem NS1ELISA diskordanten Seren, waren alle

fals h positiv. Dabei reagierten aber 14 Seren (Nummer 1 bis 13 und 15; Tab. 6.46)

mit min. einem ParvovirusVP2Antikörper-Assay positiv, was eher als Indiz für

mangelnde Sensitivität des NS1ELISA, denn für Unspezität der NS1MS zu werten

ist. Ein weiteres Serum (Nr. 14) mit mittlerer NS1Reaktivität zeigte mit allen drei

MSVP2Proteinen erhöhte MFIWerte (16 bis 86MFI), die aber unter Cut-o lagen. Die

verbliebenen 6 Seren (Nr. 16-21) reagierten nur s hwa h mit KRVNS1 und überhaupt

ni ht mit den MSVP2Proteinen. Für die Seren 13 bis 21 lagen leider keine weiteren

Daten aus Referenztests vor, die eine nähere Charakterisierung erlaubt hätten.

191

6.Ergebnisse

Tabelle 6.46. Diskordante Seren in der KRVNS1MS (ohne Zoohandlungstiere)

NS1 basierte Assays VP2basierte Assays

# Serum

ID

Serum

grupp

e

KR

VN

S1

CR

EL

ISA

[K

lass

KR

VN

S1

MS

[M

FI

RP

VN

S1

MS

[M

FI

MV

MN

S1

MS

[M

FI

MV

MIFA

(B

iodo )

[K

l.

MV

MV

P2

MS

[M

FI

MP

V-1

VP

2M

S[M

FI

MP

V-2

VP

2M

S[M

FI

MV

MV

P2

CR

EL

ISA

[M

FI

MV

MV

P2

CR

EL

ISA

(B

iodo )

[K

l.

MP

V-1/2

VP

2

CR

EL

ISA

(B

ioD

o )

[K

l.

MP

V1/2

VP

2C

R

EL

ISA

[S ./K

l.

MV

MH

I[T

iter

1 201001514 KS neg. 10906 7618 104 pos. 2 9 1295 neg. pos. 22

2 201001510 KS neg. 3069 1245 55 pos. 5 319 12 neg. pos. 17,9

3 201001509 KS neg. 773 353 123 pos. 2 37 20 neg. pos. 6,5

4 201001505 KS neg. 1423 493 3 pos. 1 1 18 pos. neg.

5 201001560 KS neg. 7341 2758 815 pos. 5308 1432 1391 pos. neg.

6 200617101 KS neg. 6349 925 254 15 13 114 22,5

7 200617102 KS neg. 5262 2724 131 54 82 2861 22,5

8 200606101 KS neg. 14524 8442 1809 423 1134 2362 18,3

9 200606104 KS neg. 5582 3452 1 2187 1219 2715 15,3

10 200606105 KS neg. 530 221 1 118 1505 1128 12,6

11 200753701 KS neg. 238 172 9 367 24 36 19 1:160

12 200849701 KS neg. 1136 339 20 7976 109 260 18,8 >1:640

13 200206402 KS neg. 8870 8000 61 983 2185 838

14 200940107 KS neg. 3221 6691 399 69 86 16

15 200940105 KS neg. 3172 1761 21 181 99 80

16 200206301 KS neg. 1481 931 4 1 1 1

17 KS3/Reihe 8/1,2 KS neg. 540 220 1 1 1 9

192


Tabelle 6.46. Diskordante Seren in der KRVNS1MS (ohne Zoohandlungstiere)


# Serum

ID

Serum

grupp

e

KR

VN

S1

CR

EL

ISA

[K

lass

KR

VN

S1

MS

[M

FI

RP

VN

S1

MS

[M

FI

MV

MN

S1

MS

[M

FI

MV

MIFA

(B

iodo )

[K

l.

MV

MV

P2

MS

[M

FI

MP

V-1

VP

2M

S[M

FI

MP

V-2

VP

2M

S[M

FI

MV

MV

P2

CR

EL

ISA

[M

FI

MV

MV

P2

CR

EL

ISA

(B

iodo )

[K

l.

MP

V-1/2

VP

2

CR

EL

ISA

(B

ioD

o )

[K

l.

MP

V1/2

VP

2C

R

EL

ISA

[S ./K

l.

MV

MH

I[T

iter

18 KS1/Reihe 1-3 KS neg. 414 82 1 1 1 1

19 201025804 KS neg. 363 1 1 1 1 1

20 200203701 KS neg. 202 1 1 1 1 1

21 200940110 KS neg. 109 51 5 3 2 5

Bei fehlender Angabe zur dur hführenden Institution fand der Test im DKFZ statt

Grau hinterlegt: Ergebnis liegt über Cut-o

193

6. Ergebnisse

VP2

Se hs der zehn fürVP2diskordanten Seren waren fals h positiv (Tab. 6.47; Nr. 1-6), weil

sie in min. einem VP2ELISAnegativ waren. Zwei dieser Seren waren in einem anderen

VP2ELISApositiv und fünf zeigten in der KRVNS1MS Antikörper. Nur für ein Serum

(Nr. 5) mit VP2MFI-Werten nahe dem Cut-o lagen keine weiteren positiven Daten vor,

allerdings sehr s hwa he NS1Reaktionen unter Cut-o. Drei (Nr. 2, 4 und 5) der se hs

fals h positiven Seren, die alle nur mit der MS positiv getestet wurden, stammten aus

der überwa hten Population, was gegen eine Parvovirus-Infektion gewertet werden kann.

Allerdings hatte Serum Nr. 2 2426MFI mit MPV-1VP2 s hwa h positive Reaktionen mit

NS1. Es sind also ledigli h die Seren Nr.4 und 5 glaubwürdig fals h positiv.

Drei (Nr. 7, 8 und 10) der vier fals h negativen Seren für VP2 hatten für NS1 erhöhte

MFI-Werte und wurden deshalb von der MS als Parvovirus positiv detektiert. Nur ein

Serum (Nr. 9) lag mit allen NS1 und VP2MFI-Werten unter Cut-o und wäre mit der

MS alleine ni ht detektiert worden.

194


Tabelle 6.47. Diskordante Seren in der ParvovirusVP2MS (ohne Zoohandlungstiere)


# Serum

ID

Serum

grupp

e

KR

VN

S1

CR

EL

ISA

[K

l.

KR

VN

S1

MS

[M

FI

RP

VN

S1

MS

[M

FI

MV

MN

S1

MS

[M

FI

MV

MIFA

[K

l.

MV

MV

P2

MS

[M

FI

MP

V-1

VP

2M

S[M

FI

MP

V-2

VP

2M

S[M

FI

MV

MV

P2

CR

EL

ISA

[M

FI

MV

MV

P2

CR

EL

ISA

(B

iodo )

[K

l.

MP

V-1/2

VP

2

CR

EL

ISA

(B

ioD

o )

[K

l.

MP

V1/2

VP

2

CR

EL

ISA

[S ./K

l.

MV

MH

I[T

iter

1 201001521 KS 13022 6374 236 pos.

1

12848 11288 9708 neg. pos. neg.

2 200603510 üb. Pop. 233 382 66 neg.

2

1134 2426 36 neg. neg.

3 201001555 KS 2052 522 137 pos.

1

1070 226 209 pos. neg. neg.

4 200618613 üb. Pop. 74 96 167 neg.

2

138 128 123 neg. neg.

5 200618612 üb. Pop. 36 40 56 neg.

2

90 180 80 neg. neg.

6 TV06/2006#11 KS 5834 4390 12 12 134 15 neg.

7 201001509 KS neg. 773 353 123 pos.

1

2 37 20 6,5 neg. pos.

8 201001523 KS 3834 1876 51 pos.

1

24 1 1 pos. neg. 15,4

9 200914102 KS 1 1 1 1 1 1 13,8

10 200914101 KS 5796 2971 512 1 1 1 15,7


1

BioDo

2

DKFZ

195

6. Ergebnisse

Es gab drei Seren, die mit dem sehr spezis hen MVMHAH positiv waren (Tab. 6.48).

Alle drei Seren zeigten au h in der MS mit dem MVMVP2Antigen die hö hsten Werte.

Au h wenn eine Speziesunters heidung in der MS ni ht zuverlässig mögli h ist, so gibt

es do h Hinweise auf das beteiligte Agens.

Tabelle 6.48. Serologis he Ergebnisse MVMHAH positiver Seren

# S

e

r

u

m

I

D

S

e

r

u

m

g

r

u

p

p

e

K

R

V

N

S

1

M

S

[

M

F

I

R

P

V

N

S

1

M

S

[

M

F

I

M

V

M

N

S

1

M

S

[

M

F

I

M

V

M

V

P

2

M

S

[

M

F

I

M

P

V

-

1

V

P

2

M

S

[

M

F

I

M

P

V

-

1

V

P

2

M

S

[

M

F

I

M

V

M

V

P

2

C

R

E

L

I

S

A

M

V

M

H

A

H

[

T

i

t

e

r

1 200849701 KS 1136 339 20 7976 109 260 19 >1:640

2 200753701 KS 238 172 9 367 24 36 19 1:160

3 200352724 KS 51 17 15 238 119 93 4 >1:40


Zoohandlungstiergruppen NS1- und VP2MS entde kten Parvovirusinfektionen in

33 Tieren in a ht der zehn Zoohandlungstiergruppen (Tab. 6.49). MVMNS1 das

NS1Antigen mit der geringsten Sensivität konnte fünf und MVMVP2 vier dieser

33 Seren ni ht erkennen. Serum Nr. 3 in GruppeB, zeigte mit allen se hs NS1- und

VP2Proteinen hohe Werte aber keine positiven ELISAReaktionen, während das zweite

Serum dieser Gruppe keinerlei positive Reaktionen zeigte. In GruppeC reagierte eines

der beiden Seren mittel oder s hwa h mit den NS1Proteinen und s hwa h mit den bei-

den MPVVP2Proteinen, dabei no h am stärksten mit MPV-2VP2. Das zweite Serum

reagierte nur s hwa h mit zwei NS1Proteinen und sehr s hwa h mit nur einem (MPV-2)

VP2Protein. Diese Muster könnten auf eine erst kürzli h in die Haltungsgruppe einge-

bra hte MPV-2 Infektion hindeuten. Der KRVNS1CRELISA verpasste insgesamt a ht

dieser 33 kreuzvalidierten positiven Seren, und die KRV IFA zwei dieser Seren inter-

essanterweise beide in den GruppenB und C mit vermutli h no h re ht fris hen Infektio-

nen. Diese Befunde weisen auf eine gegenüber derNS1MSniedrigere Sensititivität dieser

beiden Referenztests hin.

Alle in der MS VP2positiven Seren wurden au h von min. einem der beiden VP2ELISA

erkannt und kein Serum war fals h negativ.

196


Tabelle 6.49. Antikörper gegen Parvoviren in Zoohandlungstiergruppen


Grupp

e

# Serum

ID

KR

VN

S1

MS

[M

FI

MV

MN

S1

MS

[M

FI

RP

VN

S1

MS

[M

FI

KR

VIFA

[K

l.

KR

VN

S1

CR

EL

ISA

[S ./K

l.

NS1

PC

R[K

l.

MV

MV

P2

MS

[M

FI

MV

MV

P2

CR

EL

ISA

[S ./K

l.

MP

V-1

VP

2M

S

[M

FI

MP

V-2

VP

2M

S

[M

FI

MP

V-

1/2

VP

2C

RE

LISA

[S .

VP

2P

CR

[K

l.

A 1 201038501 5 5 6 neg. neg. 4 neg. 3 4 neg.

A 2 201038502 10 6 5 neg. neg. 8 neg. 11 6 neg.

B 3 201040101 8769 157 3193 pos. neg. 1385 neg. 4207 6726 16,5

B 4 201040102 15 23 19 neg. neg. 22 neg. 10 9 neg.

C 5 201043801 771 1 104 neg. neg. 1 5,5 39 104 14,7

C 6 201043802 5257 123 2957 neg. 1,7 1 neg. 188 280 10,9

D 7 201046101 15948 2968 12054 pos. 10,7 1791 10,7 898 333 16,4

D 8 201046102 16682 5507 14136 pos. 11,6 255 7,3 1008 4527 19,7

D 9 201046103 15913 8214 14855 pos. 17 4852 11,7 4249 2929 19,5

D 10 201046104 15492 10629 13730 pos. 16,5 6708 6,8 8291 6436 19,9

D 11 201046105 15236 5714 14471 pos. 13,9 2297 15,0 2414 5973 17,2

E 12 201047701 3498 219 2255 pos. neg. 338 13,1 235 140 9,9

E 13 201047702 11990 1529 9924 pos. 5,1 1651 13,4 531 1285 18,9

E 14 201047703 5240 1 407 pos. neg. 1514 12,4 1062 731 16,6

E 15 201047704 9839 636 4754 pos. 6,1 85 2,7 946 812 13,5

E 16 201047705 10807 1917 7385 pos. 2,1 22 18,6 1601 76 10,2

F 17 201050101 14297 1 7793 pos. neg. pos. 10511 neg. 6540 6770 13,8 pos.

197

6.Ergebnisse



Grupp

e

# Serum

ID

KR

VN

S1

MS

[M

FI

MV

MN

S1

MS

[M

FI

RP

VN

S1

MS

[M

FI

KR

VIFA

[K

l.

KR

VN

S1

CR

EL

ISA

[S ./K

l.

NS1

PC

R[K

l.

MV

MV

P2

MS

[M

FI

MV

MV

P2

CR

EL

ISA

[S ./K

l.

MP

V-1

VP

2M

S

[M

FI

MP

V-2

VP

2M

S

[M

FI

MP

V-

1/2

VP

2C

RE

LISA

[S .

VP

2P

CR

[K

l.

F 18 201050102 16386 2910 12486 pos. 2,6 pos. 15687 1,8 14296 13999 19,4 pos.

F 19 201050103 14904 5379 13875 pos. 15,1 pos. 15796 10,3 13478 14757 19,5 pos.

F 20 201050104 12746 2006 4122 pos. 1,5 pos. 860 neg. 3796 6866 12,9 pos.

F 21 201050105 15921 8743 15864 pos. 13,9 pos. 12063 8,8 12347 10925 18,5 pos.

G 22 201051701 17033 5127 15165 pos. 6,8 8879 6,8 10719 9156 19,3

G 23 201051702 15154 2590 11981 pos. 1,6 2030 neg. 3996 2556 18,3

G 24 201051703 19124 5042 18152 pos. 12,8 4728 11,7 7740 8194 19,8

G 25 201051704 15665 5733 13572 pos. 3,9 13955 5,3 11530 10086 16,0

G 26 201051705 11734 1 6487 pos. neg. 3216 6,4 4726 3566 9,3

H 27 201053801 15411 7978 13603 pos. 20,2 1875 14,1 6220 1333 20,4 pos.

H 28 201053802 10410 6315 8907 pos. 11 1941 14,1 5979 4614 20,6 pos.

H 29 201053803 15128 2052 14269 pos. 4,1 5241 16,4 5050 3389 18,1 pos.

H 30 201053804 19157 1110 8996 pos. 11,8 2241 15,4 2894 3152 20,4 pos.

H 31 201053805 15887 13202 15022 pos. 16,1 13778 15,9 10393 10514 20,8 pos.

198




Grupp

e

# Serum

ID

KR

VN

S1

MS

[M

FI

MV

MN

S1

MS

[M

FI

RP

VN

S1

MS

[M

FI

KR

VIFA

[K

l.

KR

VN

S1

CR

EL

ISA

[S ./K

l.

NS1

PC

R[K

l.

MV

MV

P2

MS

[M

FI

MV

MV

P2

CR

EL

ISA

[S ./K

l.

MP

V-1

VP

2M

S

[M

FI

MP

V-2

VP

2M

S

[M

FI

MP

V-

1/2

VP

2C

RE

LISA

[S .

VP

2P

CR

[K

l.

I 32 201056101 11888 4585 9456 pos. neg. 356 neg. 3819 5263 16,2

I 33 201056102 9126 26 4013 pos. neg. 2801 neg. 4121 4907 18,0

I 34 201056103 17763 5980 16178 pos. 19,7 1933 6,3 2569 1689 19,8

I 35 201056104 13738 1009 11146 pos. 8,4 1326 7,4 4760 4366 21,3

I 36 201056105 12919 2600 9264 pos. 8,4 265 neg. 282 1999 16,0

J 37 201057501 11 22 18 neg. neg. 12 neg. 3 10 neg.

J 38 201057502 1 1 1 neg. neg. 1 neg. 1 1 neg.

J 39 201057503 2 7 6 neg. neg. 2 neg. 1 1 neg.

J 40 201057504 1 3 1 neg. neg. 17 neg. 8 2 neg.

J 41 201057505 6 31 14 neg. neg. 32 neg. 2 12 neg.


199

6. Ergebnisse

Fazit Die Referenztests weisen folgende Eigenheiten auf: Der HAH besitzt die hö hste

Spezität (Erfahrung im DKFZ). Bei den CRVP2ELISA sind na h den Erfahrungen

im DKFZ lei hte Kreuzreaktionen zu erwarten. Die IFA detektiert neben speziesspe-

zis hen Antikörpern gegen Proteine, die zwis hen den Spezies einer hohen Variation

unterliegen, au h genusspezis he Antikörper gegen ho hkonservierte Proteine und ist

deshalb geeignet, um eine Infektion mit beliebigen Parvoviren na hzuweisen. Deshalb

lässt die IFA keine Rü ks hlüsse auf das beteiligte Virus zu. Der CRNS1ELISA basiert

auf dem ho hkonservierten NS1 und ist ni ht geeignet die beteiligte Parvovirusspezies

zu ermitteln. Den gesamten Referenztests ist gemein, dass sie für Parvovirus-Infektionen

eine hohe Spezität haben. Es wurden unter Einbeziehung aller MSParovirusAntigene

alle Referenzseren als positiv erkannt.

Die KRVNS1MS eignet si h wegen der gröÿten NS1Antikörper Sensitivität als Su htest

für Parvovirusinfektionen.

Die VP2Proteine der drei murinen Parvoviren waren in der MS deutli h stärker kreuz-

reaktiv als na h Studium der Literatur (BALL-GOODRICH et al. 2002) angenommen.

Denno h sind für eine maximale Sensitivität alle drei VP2Antigene hilfrei h. Darüber-

hinaus weist das am stärksten reagierende VP2Antigen auf die inzierende Virusspezies

hin, ist aber ni ht beweisend, und ebensowenig kann eine Doppelinfektion ausges hlossen

werden.

Parvoviren werden generell unabhängig von der Spezies von den meisten Institutionen

ohnehin ni ht toleriert, sodass bereits eine zuverlässige Diagnose Parvovirus positiv oder

-negativ von groÿem Nutzen ist. Die Ermittlung der Spezies/Serogruppe könnte aber

Infektionsketten besser aufklären.

200


6.5.2. RNA-Viren

Murine Picornaviren

TMEV Als Referenztests standen ein TMEV (GD7) IFA und der TMEV (GD7)

CRVirionELISA zur Verfügung, die im DKFZ als Su htest bzw. als Bestätigungstest

benutzt werden. Die TMEVProteine VP1 und 3ABC des Stammes GD7 wurden als

MSAntigene verwendet.

Es wurden vier Referenzseren, 26 TMEVCRVirionELISApositive (zwei Referenzse-

ren enthalten), 18 TMEVCRVirionELISAnegative, 30 TMEV IFApositive und 317

IFAnegative Seren verwendet. Auÿerdem stand eine Konversionsstudie mit 24 Seren

zur Verfügung.

Von den drei TMEVReferenzseren reagierten nur zwei in der MS (Tab. 6.50). Die Reak-

tivitäten waren insgesamt s hwa h, insbes. mit 3ABC.

Tabelle 6.50. Reaktivitäten von TMEVReferenzseren in der TMEVMS

Herkunft Serum ID TMEV3ABCMS [MFI TMEVVP1MS [MFI

DKFZ TV06/1999 83 417

BioDo 200940103 12 2

A lad TMEV 150 2848

Dagegen zeigte das PositivKontrollserum S906 von CR sehr starke Reaktionen mit bei-

den TMEVAntigenen mit Endpunkttitern von 2500 für 3ABC (EC

50

1 : 80) und 10 000

für VP1 (EC

50

1 : 80) (Abb. 6.51).

201

6. Ergebnisse

101 102 103 104 105 106 107 108

1

10

100

1000

10000

100000 TMEV VP1

TMEV 3ABC

Verdünnung[1

x

]

TM

EV

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.51. Titration eines weiteren TMEVReferenzserums (S 906)

Mit TMEVCRELISA in vers hiedene Gruppen klassizierte Seren reagierten mit star-

ken gruppenspezis hen Unters hieden mit beiden MSAntigenen (Abb. 6.52), denno h

gab es insgesamt drei fals h positive Reaktionen (darunter zwei starke mit VP1) und

eine groÿe Zahl fals h negativer Reaktionen.

Es gab keinen Hinweis auf eine Korrelation zwis he ELISAS ore- und MFI-Werten

(3ABC: R2 = 0, 01 und VP1: R2 = 0, 06; beide ni ht signikant) (Abb. 6.53).

202


neg. Grauzone pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

TMEV CR Virion ELISA [Klassifizierung]

TM

EV

3AB

CM

S[M

FI]

3ABC

VP1

Abbildung 6.52. TMEVMSReaktivitäten TMEVCRVirionELISAnegativer (N=18),

in derGrauzone liegender (N=6) und -positiver (N=26) Seren

203

6. Ergebnisse

0 5 10 151

10

100

1000

10000

1000003ABC

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3

Cut-off

23

TMEV CR Virion ELISA [Score]

TM

EV

3AB

CM

S[M

FI]

VP1

Abbildung 6.53. TMEVVP1- und 3ABCMSReaktivitäten und ihre Korrelationen mit

TMEVCRVirionELISAS ore-Werten (N=36)

Die Sensitität der TMEV3ABCMS gegenüber dem TMEVCRVirionELISA war mit

35% sehr niedrig und die Spezität mit 94% mäÿig ho h (Tab. 6.51). Die Übereinstim-

mung war mäÿig (κ = 0,26).

Tabelle 6.51. TMEV3ABCMS im Verglei h mit TMEVCRVirionELISA (N = 44)

TMEVCRVirionELISA Sens.: 35%

+ − Spez.: 94%

TMEV3ABCMS

+ 9 1 κ: 0,26

− 17 17 95% CI: 0,05 bis 0,46


204


Für die VP1MS lagen die Sensitivität mit 69% und die Spezität mit 89% im mittleren

Berei h (Tab. 6.52). Die Übereinstimmung war moderat (κ = 0,55).

Tabelle 6.52. TMEVVP1MS im Verglei h mit TMEVCRVirionELISA (N = 44)


+ − Spez.: 89%

TMEVVP1MS

+ 18 2 κ: 0,55

− 8 16 95% CI: 0,32 bis 0,79


Wurde Positivität mit min. einem der beiden TMEVMSAntigene als Kriterium für

TMEVPositivität gewertet, lag die Sensitivität gegenüber dem ELISA mit 83% deut-

li h höher, aber die Spezität lag mit 73% niedriger als in beiden Einzelverglei hen

(Tab. 6.53). Die Übereinstimmung war gut (κ = 0,63).

Tabelle 6.53. TMEV3ABC/VP1MS im Verglei h mit TMEVCRVirionELISA (N=44)


+ − Spez.: 83%

TMEV3ABC/

VP1MS

+ 21 3 κ: 0,63

− 5 15 95% CI: 0,40 bis 0,86

Übereinst.: gut

Gegenüber der TMEV IFA lag die Sensitivität der 3ABCMS mit 30% sehr niedrig und

die Spezität mit 97% ho h (Tab. 6.54). Die Übereinstimmung war mäÿig (κ = 0,09).

Tabelle 6.54. TMEV3ABCMS im Verglei h mit TMEV IFA (N=347)

TMEV IFA Sens.: 30%

+ − Spez.: 97%

TMEV3ABCMS

+ 9 9 κ: 0,09

− 21 308 95% CI: 0,15 bis 0,51


205

6. Ergebnisse

Für die VP1MS lag die Sensitivität mit 57% deutli h höher, aber immer no h im sehr

niedrigen Berei h und die Spezität lag mit 99% sehr ho h (Tab. 6.55). Die Überein-

stimmung war gut (κ = 0,66).

Tabelle 6.55. TMEVVP1MS im Verglei h mit TMEV IFA (N=347)

TMEV IFA Sens.: 57%

+ − Spez.: 99%

TMEVVP1MS

+ 17 3 κ: 0,66

− 13 314 95% CI: 0,50 bis 0,81

Übereinst.: gut

Wurde Positivität mit min. einem der beiden TMEVMSAntigene als Kriterium für

TMEVPositivität gewertet, lag die Sensitivität gegenüber der IFA mit 67% etwas hö-

her und die Spezität mit 97% etwas niedriger bzw. glei h ho h wie im Einzelverglei h

(Tab. 6.56). Die Übereinstimmung war gut (κ = 0,62).

Tabelle 6.56. TMEV 3ABC/VP1 MS im Verglei h mit TMEV IFA (N = 347)

TMEV IFA Sens.: 67%

+ − Spez.: 97%

TMEV3ABC/

VP1MS

+ 20 11 κ: 0,62

− 10 306 95% CI: 0,47 bis 0,77

Übereinst.: gut

Im Verglei h von beiden Referenztests errei hte die TMEV IFA gegen den

TMEVCRVirionELISA au h nur eine Sensitivität von 83% und eine Spezität von

73% (Tab. 6.57). Die Übereinstimmung wurde hier als moderat eingestuft (κ = 0,57).

Tabelle 6.57. TMEV IFA im Verglei h mit TMEVCRVirionELISA (N=39)


+ − Spez.: 73%

TMEVIFA

+ 20 4 κ: 0,57

− 4 11 95% CI: 0,30 bis 0,83


206


Die 14 diskordanten Seren (ohne Zoohhandlungstiere) zeigten kein einheitli hes Mus-

ter. Am häugsten waren 6 fals h positive 3ABCReaktionen bei IFAnegativen Seren

(Tab. 6.58, Nr. 9-14) und vier fals h negative 3ABCReaktionen bei ELISApositiven

Seren (Nr. 1-4).

207

6.Ergebnisse

Tabelle 6.58. Diskordante Seren in der TMEVMS (ohne Zoohandlungstiere)


TMEV3ABC TMEVVP1 TMEV TMEV

MS MS CRVirionELISA IFA

[MFI [MFI [Kl./S . [Kl.

1 201015402 KS 1 3875 neg.

2 201015401 KS 1 3499 neg.

3 201001516 KS 17 1985 pos.

4 TV 06/1999 KS 83 417 13,2

5 201002404 KS 19 9 7,5 pos.

6 200940103 KS 12 2 neg. pos.

7 201001519 KS 365 1 pos.

8 201001518 KS 1 1 8,9 pos.

9 200617706 überw. Pop. 620 381 neg.

10 200929302 überw. Pop. 522 71 neg.

11 200602004 überw. Pop. 268 42 neg.

12 200618602 überw. Pop. 203 30 neg.

13 200911502 überw. Pop. 196 6 neg.

14 200938302 überw. Pop. 119 9 neg.


208


Zoohandlungstiergruppen Unter den Zoohandlungstieren zeigten drei Haltungsgrup-

pen (Tab. 6.59, GruppeA, B und J) keinerlei positiven Reaktionen. Die positiven Re-

aktionen in den 7 anderen Gruppen zeigten ein sehr heterogenes Bild. Die IFA bra hte

die einheitli hsten Ergebnisse für die einzelnen Haltungsgruppen und s heint daher am

sensitivsten zu sein. Der CRELISA war nur bei GruppeC und D einheitli h positiv,

die IFA dagegen au h in GruppenF und G. Die MS war in der Mehrzahl der Fälle nur

mit einem Antigen positiv und zeigte insgesamt eine s hle hte Konkordanz zu den ande-

ren Tests. Aus allen Gruppen, die Seren enthielten, wel he mit einem der Referenztests

positiv waren, wurden in der MS min. zwei von fünf Seren positiv gefunden. Unter Rou-

tinebedingungen würde dies eine sehr groÿe Sti hprobe bedeuten, die notwendig wäre,

um eine Infektion im Bestand zu erkennen.

209

6.Ergebnisse

Tabelle 6.59. Antikörper gegen TMEV in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID



[MFI [MFI [S ./Kl. [Kl.

A 1 201038501 6 4 neg. neg.

A 2 201038502 23 5 neg. neg.

B 3 201040101 85 15 neg. neg.

B 4 201040102 13 1 neg. neg.

C 5 201043801 1449 1 5,4 pos.

C 6 201043802 1759 1 4,8 pos.

D 7 201046101 9 303 9,6 pos.

D 8 201046102 21 4052 11,5 pos.

D 9 201046103 1378 603 10,2 pos.

D 10 201046104 136 564 8,2 pos.

D 11 201046105 1 2088 13,6 pos.

E 12 201047701 49 923 2,4 pos.

E 13 201047702 7085 5947 7,5 pos.

E 14 201047703 1 1 2,9 neg.

E 15 201047704 1 1 2,5 neg.

E 16 201047705 3287 936 5,5 pos.

210



Gruppe # Serum ID




F 17 201050101 1 4157 3,6 pos.

F 18 201050102 1 1 2,2 pos.

F 19 201050103 1 2916 5,9 pos.

F 20 201050104 1 1 neg. pos.

F 21 201050105 1 1 2,8 pos.

G 22 201051701 1 613 4,1 pos.

G 23 201051702 1 1 3,3 pos.

G 24 201051703 1 1 neg. pos.

G 25 201051704 1 300 3,4 pos.

G 26 201051705 1 1 neg. pos.

H 27 201053801 141 22 2,4 neg.

H 28 201053802 368 1 9,3 neg.

H 29 201053803 13 1212 4,4 neg.

H 30 201053804 1 1 7,3 neg.

H 31 201053805 1 249 7,6 neg.

211

6.Ergebnisse


Gruppe # Serum ID




I 32 201056101 1 1489 10,4 pos.

I 33 201056102 1 1 6,0 pos.

I 34 201056103 1 1099 11,4 pos.

I 35 201056104 1 1 neg. neg.

I 36 201056105 295 1 neg. neg.

J 37 201057501 38 16 neg. neg.

J 38 201057502 1 1 neg. neg.

J 39 201057503 7 1 neg. neg.

J 40 201057504 31 1 neg. neg.

J 41 201057505 13 2 neg. neg.


212


Fazit Ni ht alle Referenzseren reagierten mit beiden Antigenen. In der Serokonversi-

onsstudie wurde keine Serokonversion gegen die MSAntigene beoba htet.

Grundsätzli h sind die beiden Antigene aber geeignet, um Serumantikörper na h einer

TMEV Infektion zu erkennen, wie mit der Titration des CRKontrollserums am deutli hs-

ten gezeigt wurde. Der TMEVCRVirionELISA und die TMEV IFA zeigten unterein-

ander keine optimale Übereinstimmung, was si h besonders bei den Zoohandlungstieren

zeigte. Umso wi htiger ist eine umfassende serologis he Untersu hung mit vers hiedenen

Tests, besonders, wenn die Tiere aus Quellen kommen, von denen der Infektionsstatus

ni ht bekannt ist bzw. ni ht regelmäÿig überwa ht wird.

EMCV Es gibt für EMCV keinen kommerziellen Referenztest. Die einzige Referenz zur

Validierung ist die IFA.

Für EMCV stand nur ein Referenzserum zur Verfügung.

Das Referenzserum (DKFZTV03/2009) errei hte 13 819MFI für 3ABC und mit 216MFI

für VP1 (ni ht gezeigt).

Die Titration des positiven Referenzserums ergab einen Endpunkt-Titer von 36 000 für

3ABC (EC

50

1 : 150), und 50 für VP1 (EC

50

1 : 80) (Abb. 6.54).

213

6. Ergebnisse

101 102 103 104 105 106 107

1

10

100

1000

10000

100000 EMCV 3ABC

EMCV VP1

Verdünnung[1

x

]

EM

CV

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.54. Titration des EMCVReferenzserums TV03/2009

Seren aus der überwa hten Population wurden ni ht gegen EMCV mit IFA getestet. Ein

Serum aus der überwa hten Population lag bei 216MFI für 3ABC.

Zoohandlungstiergruppen Es war nur ein Serum unter den Zoohandlungstieren, wel-

hes einen lei ht erhöhten MFI für EMCVVP1 in der MS hatte (Nr. 27, 158MFI)

(Tab. 6.60). Es ist sehr unwahrs heinli h, dass es si h hierbei tatsä hli h um eine vor-

ausgegangene Infektion handelt, da kein weiteres Tier einen erhöhtenen MFI zeigte, die

Erhöhung nur geringfügig war und nur eines der beiden Antigene reagiert hat.

214


Tabelle 6.60. Antikörper gegen EMCV in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

EMCV3ABC EMCV VP1

MS MS

[MFI [MFI

H 27 201053801 28 158

H 28 201053802 1 1

H 29 201053803 1 1

H 30 201053804 1 1

H 31 201053805 1 1


Konkordant negative Gruppen werden hier ni ht gezeigt.

Fazit Das Referenzserum wurde als positiv erkannt. Für die Routineserologie kann

das 3ABCProtein verwendet werden, da es einen sehr hohen MFI-Wert erbra hte. Die

Sensitivität dieses Tests kann anhand ledigli h eines Serums ni ht abges hätzt werden.

Es existiert allerdings au h kein besserer Test auf dem Markt. Das VP1Protein zeigte

mit 216MFI nur eine sehr s hwa he Reaktion und ist daher aller Wahrs heinli hkeit

na h für die Anwendung in der Diagnostik ni ht sensitiv genug.

215

6. Ergebnisse

Murine norovirus

Es standen der MNVCRVP1ELISA, eine IFA und ein in-houseVirionELISA zur Verfü-

gung. Alle drei Tests kamen regelmäÿig im DKFZ zur Anwendung. Eine Unters heidung

zwis hen Su htest und Bestätigungstest wird deshalb ni ht gema ht.

Es wurden drei Referenzseren, 42 MNVVP1CRELISApositive (keine Referenzseren

enthalten), 26 MNVVP1CRELISAnegative, se hs IFApositive, 227 IFAnegative, 13

in-HouseELISApositive und 301 in-houseELISAnegative Seren verwendet.

Bei drei Referenzseren lagen die MFI-Werte über 4084 (Mittelwert 11 942MFI, Stan-

dardabwei hung 6887) (Tab. 6.61).

Tabelle 6.61. Reaktivitäten von MNVReferenzseren in der MNVMS

Herkunft Serum ID MNVVP1MS [MFI

DKFZ TV3/2006 16930

CR MNV"high" 4084

Die Titration eines weiteren positiven Referenzserums von CR zeigte in der

MNVVP1MS einen Endpunkt-Titer von 655 000 (EC50 1 : 700) (Abb. 6.55).

216


101 102 103 104 105 106 107 108

1

10

100

1000

10000

100000

Verdünnung[1

x

]

MN

VV

P1

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.55. Titration eines weiteren MNVReferenzserums (S 1259)

36 von 41 (= 88%) der mit MNVVP1CRELISApositiv klassizierten Seren lagen in

der MS im deutli h positiven Berei h bei über 1000MFI (Abb. 6.56). 19 der nega-

tiv klassizierten Seren (N=26) waren eindeutig negativ mit unter 10MFI; die sieben

fals h positiven lagen zwis hen 100 und 2000MFI.

Es bestand eine lei hte positive Assoziation zwis hen MFI-Werten und CRELISAS ore-

Werten bei S ores zwis hen drei und 15 (Abb. 6.57). Bei den zwei Seren mit S ores unter

fünf lag au h die MFI nur zwis hen 1000 und 2000. Überstieg der S ore jedo h 15, so

lagen die MFI-Werte um rund 15 000.

Die Korrelation zwis hen S ore- und MFI-Wert war signikant (R2 = 0, 4202, p <

0,0001).

217

6. Ergebnisse

neg. Grauzone pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch MNV VP1 CR ELISA

MN

VV

P1

MS

[MF

I]

Abbildung 6.56. MNVVP1MSReaktivitäten MNVVP1CRELISAnegativer (N=26),


218


0 5 10 15 20

1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

23

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3

MNV VP1 CR ELISA [Score]

MN

VV

P1

MS

[MF

I]

Abbildung 6.57. MNVVP1MSReaktivitäten und ihre Korrelation zu

MNVVP1ELISAS ore-Werte (N=41)

Im Verglei h von der MNVVP1MS mit dem MNVVP1CRELISA lagen die Sensitivität

der MS mit 93% und die Spezität mit 73% eher niedrig (Tab. 6.62). Die Übereinstim-

mung war gut (κ = 0,68).

219

6. Ergebnisse

Tabelle 6.62. MNVVP1MS im Verglei h mit MNVVP1CRELISA (N=68)

MNVVP1CRELISA Sens.: 93%

+ − Spez.: 73%

MNVVP1MS + 39 7 κ: 0,68

− 3 19 95% CI: 0,50 bis 0,86

Übereinst.: gut

Im Verglei h von der MNVVP1MS mit dem MNV in-houseVirionELISA lagen die Sen-

sitivität mit 100% und die Spezität mit 97% sehr ho h (Tab. 6.63). Die Übereinstim-

mung war gut (κ = 0,75).

Tabelle 6.63. MNVVP1MS im Verglei h mit MNV in-houseVirion ELISA (N=314)

MNV in-house

VirionELISA Sens.: 100%

+ − Spez.: 97%

MNVVP1MS + 13 8 κ: 0,75

− 0 293 95% CI: 0,59 bis 0,92

Übereinst.: gut

Im Verglei h von der MNVVP1MS mit der MNV IFA lagen die Sensitivität mit 83%

und die Spezität mit 99% im mittleren bzw. hohen Berei h (Tab. 6.64). Die Überein-


Tabelle 6.64. MNVVP1MS im Verglei h mit MNV IFA (N=233)

MNV IFA

*

Sens.: 83%

+ − Spez.: 99%

MNVVP1MS + 5 2 κ: 0,76

− 1 225 95% CI: 0,50 bis 1,02

Übereinst.: gut

*

10 Ergebnisse stammten von BioDo

Insgesamt gab es bei den einzelnen Verglei hen 13 Seren mit diskordanten Ergebnissen.

Es waren deutli h mehr Seren fals h positiv (zehn) als fals h negativ (drei). Von den

220


fals h positiven stammten nur vier aus überwa hten Populationen (Tab. 6.65), die nur

maximal 565MFI hatten. Die restli hen Seren kamen alle aus der Gruppe der Kontroll-

seren, bei denen eine MNV Infektion ni ht unwahrs heinli h ist.

Die drei fals h negativen Seren waren jeweils nur in einem Test positiv. Weitere Un-

tersu hungen wurden aufgrund limitierter Serummengen ni ht dur hgeführt.

Tabelle 6.65. Diskordante Seren in der MNVMS (ohne Zoohandlungstiere)

# S

e

r

u

m

I

D

S

e

r

u

m

g

r

u

p

p

e

M

N

V

V

P

1

M

S

[

M

F

I

M

N

V

I

F

A

[

K

l

.

M

N

V

i

n

-

h

o

u

s

e

V

i

r

i

o

n

E

L

I

S

A

[

K

l

.

M

N

V

V

P

1

C

R

E

L

I

S

A

[

K

l

.

/

S

.

1 201001547 KS 8534 neg.

2 201001556 KS 2237 neg.

3 201001546 KS 739 neg. 8,3

4 200943402 überw. Pop. 565 neg.

5 200700902 überw. Pop. 442 neg. neg.

6 200943401 überw. Pop. 278 neg.

7 200208302 KS 196 neg.

8 200208301 KS 183 neg.

9 200618612 überw. Pop. 111 neg. neg.

10 201001514 KS 100 neg.

11 200843801 KS 15 pos.

12 201001502 KS 6 pos.

1

13 200851801 KS 1 pos.


1

Untersu hung wurde von BioDo dur hgeführt

Zoohandlungstiergruppen Für das stark kontagiöse Norovirus erlaubt die Beurteilung

von Haltungsgruppen, S hlüsse auf den tatsä hli hen Infektionsstatus der Tiere zu ziehen

(Tab. 6.66).

Vier Gruppen (A, F, G und J) waren in MS und CRELISA konkordant negativ und

vier Gruppen (C, D, E und H) konkordant positiv, abgesehen von einem Tier (Serum28,

221

6. Ergebnisse

GruppeH) mit einer unerklärten fals h negativen Reaktion in der MS. Dieses Serum

war im CRELISA mit einem S ore-Wert von 8,0 das s hwä hste Serum dieser Gruppe,

aber denno h eindeutig positiv.

In GruppeB reagierte ein Tier (Serum Nr. 3) nur in der Grauzone (S ore 2,3) im

MNVVP1CRELISA, das andere Serum war negativ. Beide Seren waren mit der MS ein-

deutig, wenn au h mit niedrigen MFI-Werten positiv. Ein Serum aus GruppeD (Nr. 10)

war als einziges im in-houseVirionELISA negativ.

In Gruppe I waren drei der fünf Seren in der MS, aber keines im MNVVP1CRELISA

positiv. Die positiven MSReaktionen zeigten sehr niedrige MFI-Werte, wie sie für einen

frühen Zeitpunkt p. i. erwartet werden. Der MNV in-house VirionELISA wurde nur für

die Gruppe D dur hgeführt. Hier gab es ein negatives Serum im in-houseELISA, wel hes

in der MS und im MNVVP1CRELISA den niedrigsten MFI- bzw. S ore-Wert hatte

(1573MFI; 4,0 S ore).

Tabelle 6.66. Antikörper gegen MNV in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

MNVVP1 MNV MNVVP1

MS in-houseVir. ELISA CRELISA

[MFI [Kl. [Kl./S .

A 1 201038501 5 neg.

A 2 201038502 9 neg.

B 3 201040101 1366 2,1

B 4 201040102 2226 neg.

C 5 201043801 11699 18,1

C 6 201043802 13470 16,0

D 7 201046101 3637 pos. 7,6

D 8 201046102 4760 pos. 6,8

D 9 201046103 8131 pos. 8,3

D 10 201046104 1573 neg. 4,0

D 11 201046105 6905 pos. 6,3

E 12 201047701 1445 7,0

E 13 201047702 2648 11,6

E 14 201047703 7149 10,5

E 15 201047704 6835 6,2

E 16 201047705 2478 6,8

F 17 201050101 1 neg.

222



Gruppe # Serum ID

MNVVP1 MNV MNVVP1

MS in-houseVir. ELISA CRELISA

[MFI [Kl. [Kl./S .

F 18 201050102 1 neg.

F 19 201050103 1 neg.

F 20 201050104 1 neg.

F 21 201050105 1 neg.

G 22 201051701 1 neg.

G 23 201051702 1 neg.

G 24 201051703 4 neg.

G 25 201051704 1 neg.

G 26 201051705 1 neg.

H 27 201053801 4026 12,1

H 28 201053802 1 8,1

H 29 201053803 5022 9,3

H 30 201053804 3140 13,9

H 31 201053805 3316 10,1

I 32 201056101 1633 neg.

I 33 201056102 394 neg.

I 34 201056103 267 neg.

I 35 201056104 1 neg.

I 36 201056105 1 neg.

J 37 201057501 4 neg.

J 38 201057502 1 neg.

J 39 201057503 1 neg.

J 40 201057504 1 neg.

J 41 201057505 1 neg.

Grau hinterlegt: Ergebnis ist positiv B: Grenzwertig (Borderline)

S . 2-3: Grauzone

Fazit Alle vier Referenzseren wurden als positiv erkannt. In den Verglei hen mit Re-

ferenztests gab es insgesamt vier fals h negative Seren. Diese konnten mit weiteren

Tests ni ht bestätigt werden, da die Serummenge ni ht ausrei hte. Sollten diese Seren

223

6. Ergebnisse

tatsä hli h von inzierten Tieren stammen, so fallen diese nur mäÿig ins Gewi ht, da es

au h Seren gab (Zoohandlungstiere 3, 4, 32, 33 und 34), die plausibel positiv in der MS

ers heinen, was aber ni ht mit Referenztests bestätigt werden konnte. Die MNVVP1MS

ist damit als Su htest für die Routinediagnostik gut geeignet.

224



Bei der Maus zeigten si h keine Hinweise für Infektionen mit dem ratHEV. Es lagen

keine Reaktivitäten von über 100MFI vor (ni ht gezeigt).


Ein Verglei h mit anderen Antikörpertests muss im Fall von LDV entfallen, da bei der

übli hen Untersu hung auf dieses Virus bereits na h drei Tagen eine Serumprobe zur

Bestimmung der Enzymaktivität genommen wird. Zu diesem Zeitpunkt können no h

keine Antikörper entwi kelt worden sein. Dieser Test wird im DKFZ nur im Rahmen

von MAPTests (Maus-Antikörper-Produktionstest) dur hgeführt, bei denen auf biologi-

s he Kontaminationen zu testendes Material den Mäusen inokuliert wird, und somit der

Enzymtest drei Tage später dur hgeführt werden kann.

Kommerzielle Referenzseren sind ni ht erhältli h.

Alle se hs positiven Referenzseren des DKFZs hatten einen MFI-Wert > 2400

(Tab. 6.67). Der MW lag bei 5443MFI bei einer SD von 3792.

Des Weiteren erhielten wir das Serum eines LDVN immunisierten Kanin hens von Sebas-

tian Ulbert (Fraunhofer Institut für Zelltherapie und Immunologie IZI, Leipzig), wel hes

in einer 1 : 50Verdünnung in der MS einen MFI-Wert von 25 846 erbra hte. Zwei negative

Referenzseren von Kanin hen hatten für LDVN in der MS einen MFI-Wert von 2 (ni ht

gezeigt).

Tabelle 6.67. Reaktivitäten von LDVReferenzseren in der LDVNMS

Herkunft Serum ID LDVNMS [MFI

DKFZ 1 3740

DKFZ 2 2420

DKFZ 3 3180

DKFZ 4 8948

DKFZ 5 2921

DKFZ 6 11450

225

6. Ergebnisse

Im Tierhaus des DKFZs wird ni ht routinemäÿig auf LDV untersu ht, da dur h dessen

biologis he Eigens haften in Kombination mit den Haltungsbedingungen eine selbststän-

dige Ausbreitung (ohne Inokulation dur h den Mens hen) sehr unwahrs heinli h ist.

Zoohandlungstiergruppen Unter den Gruppen gab es nur zwei, die dur h erhöhte

MFI-Werte aufelen (Tab. 6.68). Zwei von drei positiven Seren waren nur sehr niedrig

positiv (117 bzw. 107MFI). Ein weiteres Serum mit 1489MFI hingegen war deutli h

positiv. Anhaltspunkte für das Vorliegen einer tatsä hli hen Infektion fehlen.

Tabelle 6.68. Antikörper gegen LDV in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

LDVN

MS

[MFI

B 3 201040101 117

B 4 201040102 4

H 5 201053801 1489

H 6 201053802 1

H 7 201053803 107

H 8 201053804 1

H 9 201053805 1


Fazit Die LDVNMS ist eine sensitive Mögli hkeit, Infektionen mit LDV zu erkennen,

die mehrere Wo hen bestehen. Die Anwendung wird bedingt dur h die Biologie des

Virus von geringer Bedeutung sein. LDVNMS ist die einzige imDKFZetablierte Me-

thode, um Antikörper gegen dieses Virus na hzuweisen.

226


Murine Coronaviren

Für die Detektion von Antikörpern gegen MHV stehen als Su htest die MHV IFA und

als Bestätigungstest der MHV/RCVNCRELISA, der ein Mis hantigen aus den beiden

Coronaviren verwendet, zur Verfügung.

Es wurden fünf Referenzseren, 93 MHV/RCVNCRELISApositive (ein Referenzserum

enthalten), a ht CRELISAnegative, 67 MHV IFApositive und 301 IFAnegative Seren

verwendet.

Alle vier Seren aus experimentellen MHV Infektionen reagierten in der MS mit MHVN

zwis hen 3113 und 20 321MFI (SD7312, MW10 264) (Tab. 6.69).

Tabelle 6.69. Reaktivitäten von MHVReferenzseren in der MHVNMS

Herkunft Serum ID MHVNMS [MFI

DKFZ 17 20321

BioDo 200940101 7419

CR MHV"high" 10204

A lad MHV 3113

Die Titration eines weiteren Referenzserums ergab einen Endpunkt-Titer von 1 000 000

(EC

50

1 : 700) (Abb. 6.58).

227

6. Ergebnisse

101 102 103 104 105 106 107 108

1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Verdünnung[1

x

]

MH

VN

MS

[MF

I]

Abbildung 6.58. Titration eines weiteren MHVReferenzserums (S 585)

Gegenüber dem MHVNCRELISA zeigte si h eine deutli he Auftrennung der Grup-

pen anhand der MFI-Werte (Abb. 6.59). Es gab ledigli h vier fals h positive mit MFI-

Werten zwis hen 400 und 2000 und keine fals h negativen Seren.

Eine Dosis-Wirkungsbeziehung zwis hen S ore-Werten des MHV/RCVNCRELISA und

MFI-Werten der MS war kaum si htbar. Die 13 niedrigen MFI-Werte zwis hen 200 und

2000 korrespondierten mit einer Ausnahme mit niedrigem bis mittlerem S ore zwis hen

3 und 10 (Abb. 6.60). MFI-Werte > 2000 waren regellos mit S ores zwis hen 3 und 22

assoziiert. Eine signikante Korrelation lag vor (p < 0,0001; R2 = 0,2167).

228


CR ELISA neg. CR ELISA pos.

1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

MH

VN

MS

[MF

I]

Abbildung 6.59. MHVNMSReaktivitäten MHV/RCVNCRELISAnegativer (N=93)


229

6. Ergebnisse

0 5 10 15 20 25

1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

MHV/RCV N CR ELISA [Score]

MH

VN

MS

[MF

I]

Abbildung 6.60. MHVNMSReaktivitäten und MHV/RCVNELISAS ore bei

MHVELISApositiven Seren (N=101)

Im Verglei h von MHVNMS mit MHV/RCVNCRELISA lagen die Sensitivität der MS

mit 100% sehr ho h und die Spezität mit 50% sehr niedrig (Tab. 6.70). Die Überein-


230


Tabelle 6.70. MHVNMS im Verglei h mit MHC/RCVNELISA (N=101)

MHV/SDAVNCRELISA Sens.: 100%

+ − Spez.: 50%

MHVNMS + 93 4 κ: 0,65

− 0 4 95% CI: 0,33 bis 0,96

Übereinst.: gut

Im Verglei h von der MHVNMS mit der MHV IFA lagen die Sensitivität mit 99%

und die Spezität mit 99% sehr ho h (Tab. 6.71). Die Übereinstimmung war sehr gut

(κ = 0,97).

Tabelle 6.71. MHVNMS im Verglei h mit MHV IFA (N=368)

MHV IFA

*

Sens.: 99%

+ − Spez.: 99%

MHVNMS + 66 2 κ: 0,97

− 1 299 95% CI: 0,94 bis 1,00


*


Im Verglei h von MHVIFA mit MHV/RCVNCRELISA lagen die Sensitivität mit 96%

und die Spezität mit 60% ho h bzw. sehr niedrig (Tab. 6.72). Die Übereinstimmung

war moderat (κ = 0,56).

Tabelle 6.72. MHV IFA im Verglei h mit MHV/RCVNCRELISA (N=53)

MHV/SDAVNCRELISA Sens.: 96%

+ − Spez.: 60%

MHVIFA + 46 2 κ: 0,56

− 2 3 95% CI: 0,17 bis 0,95


Die diskordanten Seren unter Auss hluss der Zoohandlungstiere zeigten in drei Fällen

(Tab. 6.73, Seren 1 bis 3) niedrig positive MFI-Werte bei jeweils einem negativen Refe-

renztest. Ein Ergebnis wurde aber trotz negativer IFA mit dem CRELISA als positiv

231

6. Ergebnisse

bestätigt (Serum Nr. 2). Ein Serum wurde von BioDo als IFApositiv beri htet, war

aber in der MS negativ (Serum Nr. 4).

Tabelle 6.73. Diskordante Seren in der MHVMS (ohne Zoohandlungstiere)


MHVN MHV MHV/RCVN

MS IFA (BioDo ) CRELISA

[MFI [Kl. [S ./Kl.

1 200322601 KS 1231 neg.

2 201001530 KS 930 neg. 19

3 200315501 KS 477 neg.

4 201001520 KS 1 pos.


Zoohandlungstiergruppen Die Zoohandlungstiere waren zum gröÿten Teil kon-

kordant positiv, sowohl mit dem MHV/RCVNCRELISA, als au h der MHV IFA

(Tab. 6.74). In GruppeB war ein Serum mit beiden Tests negativ und das andere mit

beiden Tests positiv. Die anderen Gruppen waren entweder dur hgängig positiv oder

negativ in der MS klassiziert. In zwei Gruppen zeigte si h aber das jeweils in der MS

am s hwä hsten reaktive Serum als negativ im CRELISA (Gruppen E und J, Seren 16

und 37).

Tabelle 6.74. Antikörper gegen MHV in Zoohandlungstiergruppen

# Gruppe Serum ID

MHV MHVN MHV/RCVN

IFA [Kl. MS [MFI CRELISA [S ./Kl.

1 A 201038501 neg. 1 neg.

2 A 201038502 neg. 9 neg.

3 B 201040101 pos. 2335 17,7

4 B 201040102 neg. 38 neg.

5 C 201043801 pos. 3110 5,3

6 C 201043802 pos. 849 7,0

7 D 201046101 pos. 2926 12,0

8 D 201046102 pos. 1921 5,2

9 D 201046103 pos. 4671 7,9

10 D 201046104 pos. 3388 12,9

11 D 201046105 pos. 15722 17,4

232


Tabelle 6.74. Antikörper gegen MHV in Zoohandlungstiergruppen

# Gruppe Serum ID

MHV MHVN MHV/RCVN

IFA [Kl. MS [MFI CRELISA [S ./Kl.

12 E 201047701 pos. 4366 4,2

13 E 201047702 pos. 7357 10,9

14 E 201047703 pos. 11705 10,0

15 E 201047704 pos. 11594 9,8

16 E 201047705 pos. 1763 neg.

17 F 201050101 pos. 7775 4,1

18 F 201050102 pos. 13799 5,8

19 F 201050103 pos. 7088 13,4

20 F 201050104 pos. 12567 9,8

21 F 201050105 pos. 7043 6,0

22 G 201051701 pos. 5915 9,2

23 G 201051702 pos. 10117 19,5

24 G 201051703 pos. 6237 12,3

25 G 201051704 pos. 2877 8,7

26 G 201051705 pos. 13374 19,9

27 H 201053801 neg. 232 5,5

28 H 201053802 pos. 10122 21,0

29 H 201053803 pos. 10538 13,2

30 H 201053804 pos. 15098 21,1

31 H 201053805 pos. 5651 14,0

32 I 201056101 pos. 10780 15,1

33 I 201056102 pos. 10776 15,3

34 I 201056103 pos. 4556 7,8

35 I 201056104 pos. 9379 13,3

36 I 201056105 pos. 14174 13,4

37 J 201057501 pos. 563 neg.

38 J 201057502 pos. 7117 8,3

39 J 201057503 pos. 2611 6,7

40 J 201057504 pos. 5278 11,5

41 J 201057505 pos. 783 3,0


233

6. Ergebnisse

Fazit Es wurden alle 5 Referenzseren als positiv erkannt. Im Verglei h mit dem

CRELISA sind in der MS keine fals h negativen Seren aufgetreten. Im Verglei h mit

der IFA war ein Serum fals h negativ. Es konnte wegen der sehr geringen Serummenge

ni ht mit weiteren Tests bestätigt werden. Die Zoohandlungstiere waren laut MS in zwei

Fällen in einer Gruppe dur hgängig positiv, während der CRELISA in zwei Fällen und

die IFA in einem weiteren Fall ein Serum ni ht als positiv erkannten (Tab. 6.74, Seren

Nr. 16, 27 und 37). Dies ist ein Hinweis darauf, dass die MHVNMS zuverlässiger posi-

tive Seren erkennt als die beiden Referenztests. Die MHVNMS ist damit sehr gut als

Su htest geeignet.

234



PVM Als Referenztests standen für PVM der HAH als Su htest und der

PVMCRVirionELISA und die PVMIFA als Bestätigungstest zur Verfügung. Es exis-

tieren aber nur Daten für positive Seren im Verglei h mit dem CRELISA. Eine Analyse

des Verglei hs mit den beiden anderen Referenztests entfällt daher.

Es wurden vier Referenzseren, 19 PVMCRELISApositive (zwei Referenzseren enthal-

ten) und 35CRELISAnegative Seren verwendet. Auÿerdem stand eine Konversionsstu-

die mit 23 Seren zur Verfügung.

Alle drei Referenzseren aus experimentellen Infektionen waren in der PVMN MS positiv

(Tab. 6.75). Der MW lag bei 18 097MFI mit einer SD von 10 393 und einem Range von

16 669MFI.

Tabelle 6.75. Reaktivitäten von PVMReferenzseren in der PVMMS

Herkunft Serum ID PVMNMS [MFI

DKFZ TV07/2001 22847

BioDo PVM 25267

A lad PVM 6178

Bei der Titration eines weiteren positiven Kontrollserums von CR kam es bei einer

Verdünnung von 1 : 1 300 000 zum Endpunkt (EC

50

1 : 3500) (Abb. 6.61).

235

6. Ergebnisse

101 102 103 104 105 106 107 108

1

10

100

1000

10000

100000

Verdünnung[1

x

]

PV

MN

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.61. Titration eines weiteren PVMReferenzserums (S 623)

In einer experimentellen Infektion bei CR wurden 24 Tiere mit PVM inziert. Bis zum 35.

DPI wurde zu se hs Zeitpunkten der Serostatus von jeweils bis zu vier Tieren bestimmt.

Am 7.DPI na h der Infektion waren bereits zwei von vier Tieren positiv (Abb. 6.62) und

au h bei den beiden anderen Tieren waren erste Seroreaktivitäten erkennbar. Ab dem

10.DPI waren immer alle untersu hten Seren positiv und die Reaktionen stiegen weiter

an bis zum 35.DPI.

236


0 7 10 14 28 351

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

DPI

PV

MN

MS

[MF

I]

Abbildung 6.62. Serokonversionsstudie PVM-inzierter Mäuse (N=23)

Die MFI-Werte der beiden Gruppen, die dur h die positive oder negative Klassikation

per CRELISA entstanden sind, übers hnitten si h stark (Abb. 6.63). Es waren se hs

von 35 Seren fals h positiv, zum Teil au h mit hohen MFI-Werten (zwis hen 150 und

6900MFI). Neun von 17 konkordant positiven Seren lagen über 6900MFI.

237

6. Ergebnisse

neg. pos.1

10

100

1000

10000

100000

Klassifikation durch PVM CR Virion ELISA

PV

MN

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.63. PVMNMSReaktivitäten PVMCRVirionELISAnegativer (N=35) und

-positiver Seren (N=19)

Eine Dosis-Wirkungsbeziehung zwis hen den CRELISAS ores und der PVMNMS war

ni ht feststellbar (R2 = 0,00; p = 0,9433) (Abb. 6.64).

238


0 5 10 15 20

1

10

100

1000

10000

100000

3

Cut-off

2

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3

PVM CR Virion ELISA [Score]

PV

MN

MS

[MF

I]

Abbildung 6.64. PVMNMSReaktivitäten und ihre Korrelation zu

PVMCRVirionELISAS ore-Werte (N=18)

Im Verglei h von der PVMNMS mit dem PVMCRVirionELISA lag die Sensitivität

mit 89% und die Spezität mit 83% im mittleren bis niedrigen Berei h (Tab. 6.76). Die

Übereinstimmung war gut (κ = 0,69).

239

6. Ergebnisse

Tabelle 6.76. PVMNMS im Verglei h mit PVMCRVirionELISA (N=54)

PVMCRVirionELISA Sens.: 89%

+ − Spez.: 83%

PVMNMS + 17 6 κ: 0,69

− 2 29 95% CI: 0,50 bis 0,89

Übereinst.: gut

Auÿer den Seren der Zoohandlungstiere gab es zwei diskordante Seren, die beide im

CRELISA positiv waren, aber in der MS ni ht über Cut-o lagen (Tab. 6.77). Auÿer-

dem war ein Serum in der MS gegenüber dem CRELISA fals h positiv (Serum Nr. 3,

5328MFI).

Tabelle 6.77. Diskordante Seren in der PVMMS (ohne Zoohandlungstiere)

# Serum ID

Serumgruppe PVMN PVM

MS CRVirionELISA

[MFI [Kl./S .

1 201002401 KS 43 3,8

2 201002404 KS 17 14,9

3 201015402 KS 5328 neg.


Zoohandlungstiergruppen Zwei von zehn Gruppen (Gruppen D und H) hatten einen

dur hgängig erhöhten MFI-Wert für PVM (Tab. 6.78). Der niedrigste MFI-Wert der

Gruppe lag in beiden Fällen deutli h über 1000, der hö hste lag einmal bei 6900MFI

(GruppeD) und einmal bei 12 000MFI (GruppeH). In beiden Gruppen gab es nur je

vier (80%) positive CRVirionELISAErgebnisse.

Die drei IFAnegativen Seren, die in der MS positiv waren, wurden im CRELISA negativ

klassiziert, wobei es si h in zwei Fällen um Einzelbefunde innerhalb einer Gruppe han-

delt (Serum Nr. 3 und Nr. 24). Serum Nr. 27 war aber das einzige einer sonst dur hweg

CRELISA und MSpositiven Gruppe, wel hes aber au h CRELISAnegativ war.

240


Tabelle 6.78. Antikörper gegen PVM in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

PVMN PVM PVM

MS CRVirionELISA IFA

[MFI [S ./Kl. [Kl.

A 1 201038501 9 neg.

A 2 201038502 6 neg.

B 3 201040101 520 neg. neg.

B 4 201040102 18 neg.

C 5 201043801 1 neg.

C 6 201043802 50 neg.

D 7 201046101 6913 neg.

D 8 201046102 1198 4,9

D 9 201046103 6220 15,0

D 10 201046104 2708 10,2

D 11 201046105 3801 5,7

E 12 201047701 154 neg.

E 13 201047702 1 neg.

E 14 201047703 1 neg.

E 15 201047704 1 neg.

E 16 201047705 60 neg.

F 17 201050101 1 neg.

F 18 201050102 1 neg.

F 19 201050103 1 neg.

F 20 201050104 1 neg.

F 21 201050105 67 neg.

G 22 201051701 1 neg.

G 23 201051702 1 neg.

G 24 201051703 2935 neg. neg.

G 25 201051704 1 neg.

G 26 201051705 1 neg.

H 27 201053801 1330 neg. neg.

H 28 201053802 5681 16,8

H 29 201053803 12268 4,7

H 30 201053804 1344 14,0

H 31 201053805 12275 10,8

I 32 201056101 1 neg.

I 33 201056102 1 neg.

241

6. Ergebnisse


Gruppe # Serum ID

PVMN PVM PVM


[MFI [S ./Kl. [Kl.

I 34 201056103 10 neg.

I 35 201056104 1 neg.

I 36 201056105 1 neg.

J 37 201057501 53 neg.

J 38 201057502 1 neg.

J 39 201057503 6 neg.

J 40 201057504 1 neg.

J 41 201057505 41 neg.


Fazit Alle vier Referenzseren wurden dur h die PVMNMS als positiv erkannt. Die

Serokonversion war um den 7.DPI bis zum 10.DPI na h der Infektion messbar. Ab dem

14.DPI reagierten alle Seren positiv. Im Verglei h mit dem CRELISA zeigten si h zwei

Seren fals h negativ in der MS; dass sie tatsä hli h von PVM inzierten Tieren stamm-

ten ist ni ht unwahrs heinli h, da sie aus der Gruppe der Kontrollseren stammten. Die

Zoohandlungstiergruppen zeigten in den positiven Gruppen mit der MS ein einheitli hes

(positives) Bild, wärend der CRELISA jeweils ein Serum ni ht anzeigte (Tab. 6.78; Se-

ren Nr. 7 und 27). Die MS ist damit ähnli h sensitiv wie der CRELISA und deshalb als

Su htest geeignet.

Sendai virus Als Sendai virus (SeV) Referenztests standen im DKFZ ein SeV in-

houseVirionELISA als Su htest, ein CRVirionELISA und ein HAH als Bestätigungstest

zur Verfügung.

Es wurden vier Referenzseren, fünf SeVCRELISApositive (zwei Referenzseren ent-

halten), 46 CRELISAnegative, sieben SeV in-houseELISApositive und 334 in-

houseELISAnegative Seren verwendet.

Vier Referenzseren waren in der SeVNMS positiv und errei hten min. 3400MFI, der

MW lag bei 16 025 bei einer SD von 10 934 (Tab. 6.79).

242


Tabelle 6.79. Reaktivitäten von SeVReferenzseren in der SeVMS

Herkunft Serum ID SeVNMS [MFI

DKFZ TV05/2006 21133

BioDo Sendai 23471

CR Sendai "high" 12869

CR Sendai "low" 3473

Die hier gezeigten Seren sind ni ht in die

Auswertung für den CR ELISA eingeossen

Das DKFZ-Referenzserum hatte einen Endpunkt-Titer von 980 000 (EC

50

1 : 2000)

(Abb. 6.65).

101 102 103 104 105 106 107

1

10

100

1000

10000

100000

Verdünnung[1

x

]

SeV

NM

S[M

FI]

Cut-off

Abbildung 6.65. Titration des SeVReferenzserums TV05/2006

Die SeVCRVirionELISApositiv- bzw. negativ klassizierten Seren unters hieden si h in

ihren MFI-Werten deutli h (Abb. 6.66). Vier der fünf positiv klassizierten Seren zeigten

einen MFI-Wert über 3400MFI (MW 10 919MFI, SD7338). Eines war fals h negativ

243

6. Ergebnisse

und zeigte ledigli h 3MFI bei einem S ore-Wert von 3,4 (Tab. 6.82). Ein starker Zusam-

menhang zwis hen der Höhe des S ore-Wertes aus den SeVCRVirionELISA und dem

MFI-Wert war vorhanden (R2 = 0, 93; p = 0,0088) (Abb. 6.67).

neg. pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch SeV CR Virion ELISA

SeV

NM

S[M

FI]

Abbildung 6.66. SeVNMSReaktivitäten SeVCRVirionELISAnegativer (N=46) und


244


0 5 10 15 20 251

10

100

1000

10000

100000

3

Cut-off

2

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3

SeV CR Virion ELISA [Score]

SeV

NM

S[M

FI]

Abbildung 6.67. SeVNMSReaktivitäten und ihre Korrelation zu

SeVCRVirionELISAS ore-Werten (N=5)

Im Verglei h von SeVNMS mit SeVCRVirionELISA lagen die Sensitivität der MS mit

80% und die Spezität mit 74% im niedrigen Berei h (Tab. 6.80). Die Übereinstimmung

war mäÿig (κ = 0,27).

Tabelle 6.80. SeVNMS im Verglei h mit SeVCRVirionELISA (N=51)

SeVCRVirionELISA Sens.: 80%

+ − Spez.: 74%

SeVNMS

+ 4 12 κ: 0,27

− 1 34 95% CI: 0,02 bis 0,53


Im Verglei h von der SeVNMS mit dem SeV in-houseVirionELISA lagen die Sensitivität

245

6. Ergebnisse

mit 57% und die Spezität mit 96% sehr ho h (Tab. 6.81). Die Übereinstimmung war

mäÿig (κ = 0,33).

Tabelle 6.81. SeVNMS im Verglei h mit SeV in-houseVirionELISA (N=341)

SeV in-houseELISA Sens.: 57%

+ − Spez.: 96%

SeVNMS

+ 4 12 κ: 0,33

− 3 322 95% CI: 0,08 bis 0,58


Die MFI-Werte aller in der MS fals h positiven Seren waren niedrig, vergli hen mit

den experimentellen Seren, selbst gegenüber dem CR low Kontrollserum (Tab. 6.82,

vgl. Tab. 6.79).

Insgesamt gab es neun fals h positive Seren in der SeVNMS. Davon waren vier ge-

genüber dem SeVCRVirionELISA fals h positiv (Nr. 1, 2, 3 und 5) und se hs ge-

genüber dem in-houseVirionELISA (Nr. 2, 4 und 6 bis 9). Ein Serum von diesen

war mit beiden Referenztests negativ und mit der SeVNMSpositiv (Nr. 2). Die MFI-

Werte der fals h positiven aus der negativen Population rei hten von 141 bis 783MFI

(MW 361MFI, SD279), die der Kontrollseren lagen zwis hen 696 und 1935 (MW

1230MFI, SD521). Ein Serum (Nr. 10) war in der MS fals h negativ im Verglei h

zum SeVCRVirionELISA (S ore-Wert 3,4). Es hatte einen MFI-Wert von 3 bei einem

S ore-Wert von 3,4 und kam aus der Gruppe der Kontrollseren.

246


Tabelle 6.82. Diskordante Seren in der SeVNMS (ohne Zoohandlungstiere)


SeVN SeV SeV

MS CRVirionELISA in-houseVirionELISA

[MFI [Kl./S . [Kl.

1 201001521 KS 1935 neg.

2 201015402 KS 1238 neg. neg.


4 200617704 neg. Pop. 783 neg.

5 201015401 KS 696 neg.

6 200612904 neg. Pop. 508 neg.

7 200603504 neg. Pop. 226 neg.

8 200938302 neg. Pop. 149 neg.

9 201000301 neg. Pop. 141 neg.

10 200102702 KS 3 3,4


Zoohandlungstiergruppen Insgesamt gab es sieben in der MS niedrig positive Seren,

deren MFI-Werte allesamt unter dem des CR low Kontrollserums lagen (Tab. 6.83). Nur

ein Serum zeigte mit über 8000MFI eine auallend hohe Reaktivität. Es waren immer

nur maximal zwei Tiere einer Gruppe in der MS positiv. Der in-houseVirionELISA

war au h nur mit maximal drei Seren einer Gruppe positiv, insgesamt de kte si h das

Ergebnis allerdings nur zweimal mit einem erhöhten MFI-Wert in der MS. Auÿerdem

war die Gruppe, in der drei Seren im in-house VirionELISApositiv waren, in der MS

dur hgängig negativ.

Tabelle 6.83. Antikörper gegen SeV in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

SeVN SeV SeV SeV

MS CRVirionELISA in-houseVirionELISA HAH

[MFI [S ./Kl. [Kl. [Kl.

A 1 201038501 4 neg. neg.

A 2 201038502 10 neg. neg.

B 3 201040101 615 neg. pos. neg.

B 4 201040102 7 neg. neg.

C 5 201043801 1 neg. neg.

247

6. Ergebnisse


Gruppe # Serum ID

SeVN SeV SeV SeV



C 6 201043802 1 neg. neg.

D 7 201046101 1 neg. neg.

D 8 201046102 71 neg. neg.

D 9 201046103 8862 neg. neg. neg.

D 10 201046104 209 neg. neg. neg.

D 11 201046105 1 neg. pos.

E 12 201047701 92 neg. neg.

E 13 201047702 1 neg. neg.

E 14 201047703 1 neg. neg.

E 15 201047704 1 neg. neg.

E 16 201047705 1 neg. neg.

F 17 201050101 1 neg. neg.

F 18 201050102 1 neg. pos.

F 19 201050103 1 neg. pos.

F 20 201050104 1 neg. neg.

F 21 201050105 1 neg. pos.

G 22 201051701 814 neg. neg. neg.

G 23 201051702 1 neg. neg.

G 24 201051703 1 neg. neg.

G 25 201051704 1 neg. neg.

G 26 201051705 1 neg. neg.

H 27 201053801 322 neg. neg. neg.

H 28 201053802 1 neg. neg.

H 29 201053803 1 neg. neg.

H 30 201053804 1 neg. neg.

H 31 201053805 136 neg. neg. neg.

I 32 201056101 2258 neg. neg. neg.

I 33 201056102 123 neg. pos. neg.

I 34 201056103 1 neg. neg.

I 35 201056104 1 neg. neg.

I 36 201056105 1 neg. neg.

J 37 201057501 36 neg. neg.

J 38 201057502 1 neg. neg.

248



Gruppe # Serum ID

SeVN SeV SeV SeV



J 39 201057503 6 neg. neg.

J 40 201057504 85 neg. neg.

J 41 201057505 21 neg. neg.


Fazit Alle vier Referenzseren wurden als positiv erkannt.

Im Verglei h mit dem CRELISA gab es ein fals h negatives Serum. Sein S ore-Wert

lag mit 3,4 nur im niedrig positiven Berei h (Tab. 6.82; Serum Nr. 10). Weitere Tests zur

Bestätigung wurden aufgrund der limitierten Serummenge ni ht dur hgeführt.

Das Muster der positiven Reaktionen in den Zoohandlungsgruppen war wenig aufs hluss-

rei h, sodass Analysen zur Empndli hkeit des Tests anhand dieser Gruppe unterbleiben.

Weitere rekombinante SeVProteine könnten hergestellt werden, um zu überprüfen, ob

diese Proteine die Ergebnisse der MS mit dem NProtein bestätigen. Es könnten Viren

eine Rolle spielen, die die Bildung kreuzreaktiver Antikörper hervorrufen. Wüns hens-

wert wären weitere Daten, um die Zuverlässigkeit des SeVN Proteins als Su htest zu

bekräftigen, beispielsweise mittels einer Serokonversionsstudie. Mit den zur Verfügung

stehenden Daten kann eine Verwendung des Antigens als Su htest denno h gere htfer-

tigt werden, da alle Referenzseren sehr hohe MFI-Werte hatten und die beiden anderen

Referenztests in fragli hen Fällen widersprü hli he Ergebnisse erbra hten und somit eine

niedrige Spezität unterstellt werden kann.

249

6. Ergebnisse


Für LCMV stehen als Su htest die IFA und als Bestätigungstest der

LCMVNPCRELISA zur Verfügung.

Es wurden vier Referenzseren, für die au h positive CRELISA Ergebnisse vorlagen, 44

CRELISAnegative, drei IFApositive und 339 IFAnegative Seren verwendet.

Alle vier Referenzseren zeigten in der MS eine Reaktivität von mehr als 12 000MFI

(Mittelwert 15 591MFI, Standardabwei hung 3781) (Tab. 6.84).

Tabelle 6.84. Reaktivitäten von LCMVReferenzseren in der LCMVMS

Herkunft Serum ID LCMVNPMS [MFI

DKFZ TV03/2002 15635

CR LCMV"high" 13660

BioDo 200940109 20858

A lad LCMV 12213

Bei der Titration des Referenzserums TV03/2002 wurde der Endpunkt bei einer

1 000 000fa hen Verdünnung ni ht errei ht (EC

50

1 : 10 000) (Abb. 6.68).

250


101 102 103 104 105 106 107

1

10

100

1000

10000

100000

Verdünnung[1

x

]

LCM

VN

PM

S[M

FI]

Cut-off

Abbildung 6.68. Titration des LCMVReferenzserums TV03/2002

Von 44 im CRELISAnegativ klassizierten Seren reagierten sieben in der MS mitWerten

über dem Cut-o, und drei der Seren errei hten MFI-Werte zwis hen 1250 und 2350MFI

(Abb. 6.69). Bei den vier positiven Seren handelte es si h um die bereits oben gezeigten

Referenzseren. Die sieben fals h positiven Seren waren in der LCMVIFA negativ.

251

6. Ergebnisse

neg. pos.1

10

100

1000

10000

100000

Klassifikation durch LCMV NP CR ELISA

LCM

VN

P[M

FI]

Cut-off

Abbildung 6.69. LCMVNPMSReaktivitäten LCMVNPCRELISAnegativer (N=44) und


S ore-Werte ab 10 korrelierten mit sehr hohen MFI-Werten (10 000 bis 20 000) (R2 =

0,16; p = 0,6062) (Abb. 6.70); der Zusammenhang war jedo h ni ht signikant.

252


0 5 10 15 20 25

1

10

100

1000

10000

100000

3

LCMV NP CR ELISA [Score]

LCM

VN

PM

S[M

FI]

Abbildung 6.70. LCMVNPMSReaktivitäten und ihre Korrelation zu

LCMVNPCRELISAS ore-Werten (N=4)

Im Verglei h der LCMVNPMS mit dem LCMVNPCRELISA lagen die Sensitivität

der MS mit 100% sehr ho h und die Spezität mit 84% eher niedrig (Tab. 6.85). Die

Übereinstimmung war moderat (κ = 0,74).

253

6. Ergebnisse

Tabelle 6.85. LCMVNPMS im Verglei h mit LCMVNPCRELISA (N=48)

LCMVNPCRELISA Sens.: 100%

+ − Spez.: 84%

LCMVNPMS

+ 4 7 κ: 0,47

− 0 37 95% CI: 0,16 bis 0,78


Im Verglei h der LCMVNPMS mit der LCMVIFA lagen die Sensitivität mit 100%

und die Spezität mit 97% sehr ho h bzw. ho h (Tab. 6.86). Die Übereinstimmung war

mäÿig (κ = 0,37).

Tabelle 6.86. LCMVNPMS im Verglei h mit LCMVIFA (N=342)

LCMVIFA Sens.: 100%

+ − Spez.: 97%

LCMVNPMS

+ 3 11 κ: 0,34

− 0 328 95% CI: 0,06 bis 0,63


Im Verglei h von der LCMV IFA der mit dem LCMV NP CR ELISA lagen die Sensitivi-

tät mit 100% und die Spezität mit 100% sehr ho h (Tab. 6.87). Die Übereinstimmung

war perfekt (κ = 1,00).

Tabelle 6.87. LCMVIFA im Verglei h mit LCMVNPCRELISA (N=44)

LCMVNPCRELISA Sens.: 100%

+ − Spez.: 100%

LCMVIFA

+ 2 0 κ: 1,00

− 0 42 95% CI: 1,0 bis 1,0

Übereinst.: perfekt

Se hs der diskordanten Seren stammten aus der überwa hten Population und die MFI-

Werte hatten ein Maximum von 5222 (Tab. 6.88). Sie sind alle mit der IFA negativ ge-

testet worden. Die diskordanten Seren aus der Gruppe der Kontrollseren liegen zwis hen

560 und 1450MFI und sind mit dem LCMVNPCRELISAnegativ klassiziert worden.

Das Serum (Nr. 8) mit 560MFI wurde zusätzli h mit der IFA negativ getestet.

254


Tabelle 6.88. Diskordante Seren in der LCMVMS (ohne Zoohandlungstiere)


LCMVNP LCMVNP LCMV

MS CRELISA IFA

[MFI [Kl. [Kl.

1 200602001 überw. Pop. 5222 neg.

2 200615301 überw. Pop. 4927 neg.

3 200603508 überw. Pop. 2807 neg.

4 201015402 KS 2321 neg.

5 201001527 KS 1449 neg.

6 200603512 überw. Pop. 1102 neg.

7 200603507 überw. Pop. 740 neg.

8 201025806 KS 560 neg. neg.

9 200612910 überw. Pop. 284 neg.


Zoohandlungstiergruppen Die diskordanten Seren aus der Gruppe der Zoohandlungs-

tiere waren alle fals h positiv in der LCMVNPMS (Tab. 6.89, Seren Nr. 5, 27, 31

und 36). Die Reaktivitäten in der MS waren in diesen Fällen relativ niedrig (251 bis

1257MFI). Auÿerdem lieÿ si h keine eindeutige Häufung positiv getesteter Tiere inner-

halb der einzelnen Gruppen erkennen.

255

6. Ergebnisse

Tabelle 6.89. Antikörper gegen LCMV in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

LCMVNP LCMVNP LCMV

MS CRELISA IFA

[MFI [Kl. [Kl.

C 5 201043801 459 neg. neg.

C 6 201043802 1 neg. neg.

H 27 201053801 1257 neg. neg.

H 28 201053802 1 neg. neg.

H 29 201053803 1 neg. neg.

H 30 201053804 1 neg. neg.

H 31 201053805 251 neg. neg.

I 32 201056101 39 neg. neg.

I 33 201056102 1 neg. neg.

I 34 201056103 4 neg. neg.

I 35 201056104 104 neg. neg.

I 36 201056105 326 neg. neg.


Fazit Es wurden alle vier Referenzseren erkannt. In den Verglei hen mit den Referenz-

tests gab es keine fals h negativen Seren. Insgesamt war jedo h die Anzahl der zur

Verfügung stehenden positiven Seren sehr gering.

Die ermittelte Spezität in den Vierfeldertafeln war gering. Es zeigte si h aber zwis hen

fals h positiven und bestätigt positiven immer no h eine Dierenz von fast 7000MFI.

Es besteht ni ht der Verda ht, dass die fals h positiven Seren von Tieren stammen

könnten, die tatsä hli h eine Infektion dur hgema ht hatten, da es si h bei den hö hsten

MFI-Werten dieser Kategorie um Tiere aus der überwa hten Population handelt.

Insgesamt ist die Eignung der LCMVNPMS als Su htest gegeben.

256


Murine Hantaviren

Für die Hantaviren stehen ein HTNVNCRELISA im DKFZ zur Verfügung. In die

Auswertung sind zusätzli h Ergebnisse vom FLI mit eingeossen, die dort mit DOBV-

oder PUUVNELISA generiert wurden.

Es wurden zwei Referenzseren, die au h CRELISApositiv waren und 41

CRELISAnegative Seren verwendet. Auÿerdem stand eine Konversionsstudie mit 23

Seren zur Verfügung. Ergänzend wurden von anderen Spezies Seren bzw. Pleurallava-

gen mit einem vorberi htli hen Ergebnis als Referenz verwendet: 29 Humanseren (10

PUUVpositiv, 9 DOBVpositiv, 10 Hantavirus negativ), 20 Seren von Apodemus spe .

(10 DOBVpositiv, 10 negativ) und 20 Seren von Myodes spe . (10 DOBVpositiv, 10

negativ).

Das HTNV high Referenzserum von CR zeigte mit HTNV und SEOV die hö hsten

MFI-Werte (12 727 bzw. 7356), mit PUUVN zeigte si h in diesem Fall keine Kreuzreak-

tion (Tab. 6.90). Die Werte des low Referenzserums waren um das vier- bis füna he

niedriger, aber immer no h deutli h über Cut-o.

Tabelle 6.90. Reaktivitäten von HantaanReferenzseren in der HTNVN-, SEOVN- und PU-

UVNMS

Herkunft Serum ID HTNVNMS [MFI SEOVNMS [MFI PUUVNMS [MFI

CR HTNV"low" 3227 1464 5

CR HTNV"high" 12727 7356 64

Eine Serokonversionsstudie von CR zeigte bereits am 7.DPI zwei von vier Seren als

positiv an (Abb. 6.71). Zwei Seren, die am 7.DPI ni ht positiv reagierten, lagen nur

wenig unter Cut-o. Alle Seren, die ab dem 10.DPI gewonnen wurden, lagen im posi-

tiven Berei h. Alle Seren ab dem 14.DPI zeigten einen ähnli h hohen MFI-Wert von

a. 20000.

257

6. Ergebnisse

0 7 10 14 28 351

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

DPI

HT

NV

NM

S[M

FI]

Abbildung 6.71. Serokonversionsstudie Hantaan-Virus inzierter Mäuse (N=23)

Kreuzreaktion zwischen Hantaan Virus und Puumala Virus Zwis hen HTNVN und

SEOVN konnten keine Unters hiede in der Höhe der MFI-Werte von jeweils zehn vor-

beri htli h DOBV- und PUUVpositiven Pleurallavagen festgestellt werden (Abb. 6.72).

Die Korrelation errei hte mit R2 = 0,95 einen sehr hohen Wert. Deshalb und da HTNV

die Typspezies für Hantaviren ist, wurde in der weiteren Validierung auf die HTNVNMS

der S hwerpunkt gelegt.

258


1 10 100 1000 10000 1000001

10

100

1000

10000

100000

PUU pos.

Diagonale

DOBV pos.

SEOV N MS [MFI]

HT

NV

NM

S[M

FI]

Cut-off

Abbildung 6.72. Korrelation von MFI-Werten DOBVpos. (N=10) und PUUVpos.

(N=10) Pleurallavagen in der HTNVNMS mit der SEOVNMS

Vorberi htli h DOBVpositive Pleurallavagen reagierten in der MS in allen Fällen

mit HTNVN dem Antigen aus der glei hen Serogruppe höher als mit PUUVN

(Abb. 6.73).

259

6. Ergebnisse

1 10 100 1000 10000 1000001

10

100

1000

10000

100000

DOBV pos.

PUUV pos.

Diagonale

PUUV N MS [MS]

HT

NV

NM

S[M

FI]

Cut-off

Abbildung 6.73. Korrelation von MFI-Werten DOBVpos. (N=10) und PUUVpos.

(N=10) Pleurallavagen in der HTNVNMS mit der PUUVNMS

Die vorberi htli h PUUVpositiven Seren reagierten zum Teil (zwei von zehn) ähnli h

stark mit dem HTNVNAntigen wie mit dem PUUVNAntigen (Abb. 6.73). Die an-

deren a ht zeigten mit PUUV eine deutli h stärkere Reaktion als mit HTNVN. Die

DOBVpositiven Seren zeigten eine Korrelation zwis hen den Reaktivitäten der beiden

Antigene von R2 = 0,30, die PUUVpositiven Seren R2 = 0, 27. Die Korrelation war

damit in beiden Fällen sehr gering und ni ht signikant (p = 0,1040 für DOBVpositive

Seren und p = 0,1260 für PUUVpositive Seren).

260


Mus musculus Die zwei positiven Seren hatten MFI-Werte von 3227 und 12 727 in

der HTNVNMS. Das fals h positive Serum mit dem hö hsten MFI lag bei 2313

(Abb. 6.74).

neg. pos.1

10

100

1000

10000

100000

Klassifikation durch HTNV N CR ELISA

HT

NV

NM

S[M

FI]

Cut-off

Abbildung 6.74. HTNVNMSReaktivitäten HTNVNCRELISAnegativer (N=41) und


Im Verglei h von HTNVNMS mit dem HTNVNCRELISA lag die Sensitivität mit

100% sehr ho h und die Spezität mit 85% niedrig (Tab. 6.91). Die Übereinstimmung


261

6. Ergebnisse

Tabelle 6.91. HTNVNMS im Verglei h mit HTNVNCRELISA unter Verwendung von

Mus mus ulus Seren (N=43)

HTNVNCRELISA Sens.: 100%

+ − Spez.: 85%

HTNVNMS + 2 6 κ: 0,35

− 0 35 95% CI: -0,02 bis 0,72


Im Verglei h von SEOVNMS mit dem HTNVNCRELISA lag die Sensitivität mit 100%

sehr ho h und die Spezität mit 90% eher niedrig (Tab. 6.92). Die Übereinstimmung war

moderat (κ = 0,46).

Tabelle 6.92. SEOVNMS im Verglei h mit HTNVNCRELISA unter Verwendung von



+ − Spez.: 90%

SEOVNMS

+ 2 4 κ: 0,46

− 0 37 95% CI: 0,04 bis 0,89


*


Im Verglei h von PUUVNMS mit dem HTNVNCRELISA lag die Sensitivität bei

0% (Tab. 6.93). Das PUUVNAntigen in der MS ist damit ni ht geeignet, Hantaan-

VirusAntikörper na hzuweisen.

Tabelle 6.93. PUUVNMS im Verglei h mit HTNVNCRELISA unter Verwendung von



+ − Spez.: 90%

PUUVNMS + 0 4 κ: -0,07

− 2 37 95% CI: -0,13 bis -0,00


262


Zoohandlungstiergruppen Unter den Zoohandlungstierseren gab es keines, wel hes

mit dem HTNVCRELISApositiv war (Tab. 6.94). In der MS zeigten si h einige Seren

im niedrigen bis mittleren MFI-Berei h positiv. Es lieÿ si h hier aber keine eindeutige

Häufung von Positivitäten innerhalb einer Gruppe feststellen. Auÿerdem war eine Über-

einstimmung zwis hen HTNV und SEOVNMS ni ht gegeben, wie sie vorher bei den

bestätigt positiven Seren gezeigt wurde (siehe au h Abb. 6.72).

Tabelle 6.94. Antikörper gegen Hantaviren in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

HTNVN SEOVN PUUVN HTNVN

MS MS MS CRELISA

[MFI [MFI [MFI [Kl.

C 5 201043801 1 13 1 neg.

C 6 201043802 278 156 949 neg.

D 7 201046101 381 37 1 neg.

D 8 201046102 69 16 21 neg.

D 9 201046103 2313 1 1 neg.

D 10 201046104 14 187 1 neg.

D 11 201046105 1 1 1547 neg.

H 27 201053801 1534 1371 660 neg.

H 28 201053802 1 1 1 neg.

H 29 201053803 229 794 1 neg.

H 30 201053804 1 1 1 neg.

H 31 201053805 146 133 1 neg.

I 32 201056101 1774 12 112 neg.

I 33 201056102 770 113 1 neg.

I 34 201056103 765 172 371 neg.

I 35 201056104 1 667 1 neg.

I 36 201056105 634 1090 82 neg.


Apodemus spec. bzw. Myodes spec. Bei diesen Proben handelt es si h um Pleural-

lavagen, die uns von Rainer Ulri h, FLIGreifswald zur Verfügung gestellt wurden.

Im Verglei h von der HTNVNMS mit dem DOBVNFLIELISA lag die Sensitivität

mit 90% im mittleren Berei h und die Spezität mit 100% sehr ho h (Tab. 6.95). Die

Übereinstimmung war sehr gut (κ = 0,90).

263

6. Ergebnisse

Tabelle 6.95. HTNVNMS im Verglei h mit DOBVNFLIELISA unter Verwendung von

Apodemus spe .Pleurallavagen (N=20)

DOBVN FLI ELISA Sens.: 90%

+ − Spez.: 100%

HTNVNMS

+ 9 0 κ: 0,90

− 1 10 95% CI: 0,71 bis 1,09


Im Verglei h von der PUUVNMS mit dem PUUVNFLIELISA lag die Sensitivität mit

100% und die Spezität mit 100% sehr ho h (Tab. 6.96). Die Übereinstimmung war

perfekt (κ = 1,00).

Tabelle 6.96. PUUVNMS im Verglei h mit PUUVNFLIELISA unter Verwendung von

Myodes spe .Pleurallavagen (N=20)

PUUVN FLI ELISA Sens.: 100%

+ − Spez.: 100%

PUUVNMS

+ 10 0 κ: 1,00

− 0 10 95% CI: 1,0 bis 1,0

Übereinst.: perfekt

Es gab nur eine diskordante Lavage in diesem Verglei h. Sie war im

FLIDOBVNELISApositiv und errei hte in der MS für die drei HantavirusAntigene

nur MFI-Werte zwis hen 17 und 24 (ni ht gezeigt).

Humanseren Von 19 Seren, die vorberi htli h entweder im PUUVNFLIELISA

(N=10) oder im DOBVNFLIELISA (N=9) positiv waren, errei hten alle min. einen

MFI-Wert von 7800 für ein HantavirusAntigen aus der glei hen Serogruppe (Tab. 6.97).

Die negativen Seren haben einen maximalen MFI-Wert für eines der HantavirusAntigene

von 893. Der Vorberi ht der positiven Seren zeigte eine Übereinstimmung in 100%

der Fälle mit der maximalen Reaktion der unters hiedli hen Antigene. Für PU-

UVNFLIELISApositive Seren ist das PUUVNMSAntigen dasjenige mit der maxi-

malen Reaktion. In der MS ist kein DOBVAntigen enthalten, deshalb repräsentieren

die zwei Antigene aus der glei hen Serogruppe HTNV und SEOV dieses Virus. Wel hes

264


der beiden MSAntigene am hö hsten reagiert, ist ni ht konstant. In vier von neun Fäl-

len ist es das HTNVN, und in fünf von neun Fällen ist es SEOVN. Die Dierenz im

MFI-Wert zwis hen den beiden Antigenen beläuft si h aber maximal auf 16% (siehe

au h Abb. 6.72).

Tabelle 6.97. HantavirusMS Ergebnisse PUUV/DOBV-IgGELISAklassizierter Humanse-

ren

Nr. Vorberi ht HTNVN [MFI SEOVN [MFI PUUVN [MFI

1 neg. 1 5 10

2 neg. 45 62 24

3 neg. 1 11 56

4 neg. 1 1 26

5 neg. 30 81 9

6 neg. 26 90 103

7 neg. 515 409 96

8 neg. 18 47 87

9 neg. 65 893 1

10 neg. 1 10 1

11 PUUV-IgG-pos. 8933 8536 13042

12 PUUV-IgG-pos. 8163 6772 12028

13 PUUV-IgG-pos. 4692 2583 9755

14 PUUV-IgG-pos. 5700 9533 11205

15 PUUV-IgG-pos. 5623 4838 10640

16 PUUV-IgG-pos. 7297 5787 10651

17 PUUV-IgG-pos. 4011 3294 11610

18 PUUV-IgG-pos. 7025 5762 8879

19 PUUV-IgG-pos. 11097 11395 11484

20 PUUV-IgG-pos. 9124 8479 16347

21 DOBV-IgG-pos. 10471 11915 5374

22 DOBV-IgG-pos. 13558 12135 4595

23 DOBV-IgG-pos. 10529 10715 6912

24 DOBV-IgG-pos. 9126 10578 2844

25 DOBV-IgG-pos. 7855 8451 1261

26 DOBV-IgG-pos. 8825 8571 4856

27 DOBV-IgG-pos. 12324 10946 9113

28 DOBV-IgG-pos. 10748 11854 2698

29 DOBV-IgG-pos. 9871 8624 1369

Grau hinterlegt: Maximaler MFI-Wert der drei Antigene für dieses Serum

Fazit Zwei von zwei Referenzseren wurden mit der MS erkannt. Weitere positive Se-

ren von Mus mus ulus sind ni ht verfügbar, da sie na h aktuellem Kenntnisstand auf

265

6. Ergebnisse

natürli hem Weg ni ht von Hantaviren infziert werden. Das HTNV unterliegt auÿer-

dem den Si herheitsbestimmungen für L3Organismen und darf deshalb in den meisten

Labors ni ht gehandhabt werden. Proben anderer Spezies aus natürli hen Infektionen

lieferten sehr hohe Sensitivitätswerte, obwohl es si h zum Teil ni ht um Serum, sondern

um Pleurallavagen handelte. Die errei hten MFI-Werte waren ebenfalls sehr ho h. Des-

halb wird jeweils ein Antigen für jeden der beiden Serotypen als Su htest verwendet

werden. Die vielen positiven Ergebnisse unter den Zoohandlungstieren folgten keinem

Muster und lieÿen si h ni ht bestätigen. Hier lag die Vermutung nahe, dass der Cut-o

zu niedrig gewählt wurde. In Anbetra ht des zoonotis hen Potentials werden aber alle

positiven Ergebnisse mit dem CRELISA überprüft.

266


Murine Reoviren

Reovirus 3 Als Su htest für Reo-Infektionen wurden die Reo IFA oder der Reo in-

houseVirionELISA verwendet. Als Bestätigungstest fand der ReoCRELISA Anwen-

dung.

Es wurden fünf Referenzseren, fünf CRELISApositive (drei Referenzseren ent-

halten) und 43 CRELISAnegative, zwölf IFApositive, 249 IFAnegative, 15 in-

houseELISApositive und 104 in-houseELISAnegative Seren verwendet. Auÿerdem

stand eine Konversionsstudie mit 24 Seren zur Verfügung.

Vier Referenzseren zeigten Reaktivitäten in der MS von über 8000MFI (MW 16 861MFI,

SD6438) (Tab. 6.98).

Tabelle 6.98. Reaktivitäten von ReoReferenzseren in der ReoMS

Herkunft Serum ID Reo Sigma1MS [MFI

DKFZ TV5/2007 23824

BioDo 200940102 19014

A lad Reo 16153

CR Reo "high" 8452

Die Titration eines weiteren positiven Kontrollserums zeigte in der Reo Sigma1MS einen

Endpunkt-Titer von 10 500 000 (EC

50

1 : 6000) (Abb. 6.75).

267

6. Ergebnisse

101 102 103 104 105 106 107 108

1

10

100

1000

10000

100000

Verdünnung[1

x

]

Reo

Sig

ma1

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.75. Titration eines weiteren ReoReferenzserums (S 1099)

In einer Serokonversionsstudie, für die Tiere mit Reovirus inziert wurden, konnten An-

tikörper positive Tiere erstmals am 10.DPI na hgewiesen werden. Bei allen Tieren lagen

ab dem 14.DPI die MFI-Werte über dem Cut-o (Abb. 6.76). Maximale Antikörpertiter

wurden mit dem 28.DPI errei ht. Gegenüber den Werten vom 0.DPI waren bereits bei

7.DPI und 10.DPI bei je zwei Mäusen erhöhte Reaktivitäten vorhanden, die aber no h

unterhalb des Cut-o lagen.

268


1 7 10 14 28 351

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

DPI

Reo

Sig

ma1

MS

[MF

I]

Abbildung 6.76. Serokonversionsstudie Reovirus-inzierter Mäuse (N=24)

Von den 43 im CRELISAnegativ klassizierten Seren lagen 17 über Cut-o in der MS

(Abb. 6.77). Dies lag an dem hohen Anteil von Kontrollseren und Zoohandlungstierseren

in den hier untersu hten Proben. Bei diesen Seren ist es ni ht unwahrs heinli h, dass

au h wel he von Tieren stammten, die s hon Kontakt mit Reoviren hatten. Vier von

fünf CRELISApositiven Seren wurden mit einem sehr hohen MFI-Wert detektiert. Nur

eines lag mit 201MFI relativ nahe am Cut-o.

269

6. Ergebnisse

neg. pos.1

10

100

1000

10000

100000

Klassifikation durch Reo CR Virion ELISA

Reo

Sig

ma1

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.77. Reo Sigma1MSReaktivitäten ReoCRVirionELISAnegativer (N=43)


Die Korrelation zwis hen S ore-Werten und MFI-Werten war ni ht signikant

(Abb. 6.78).

270


0 5 10 15 201

10

100

1000

10000

100000

3

Cut-off

2

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3

Reo CR Virion ELISA [Score]

Reo

Sig

ma1

MS

[MF

I]

Abbildung 6.78. Reo Sigma1MSReaktivitäten und ihre Korrelation zu

ReoCRVirionELISAS ore-Werten (N=5)

Im Verglei h von der Reo Sigma 1MS mit den ReoCRVirionELISA lag die Sensitivität


stimmung war mäÿig (κ = 0,24).

Tabelle 6.99. Reo Sigma1MS im Verglei h mit ReoCRVirionELISA (N=48)

ReoCRVirionELISA Sens.: 100%

+ − Spez.: 60%

Reo Sig.1MS + 5 17 κ: 0,24

− 0 26 95% CI: -0,5 bis 0,43


Im Verglei h von der Reo Sigma1MS mit dem Reo in-houseVirionELISA lag die Sensi-

271

6. Ergebnisse

tivität mit 67% und die Spezität mit 90% niedrig (Tab. 6.100). Die Übereinstimmung


Tabelle 6.100. Reo Sigma1MS im Verglei h mit Reo in-houseVirionELISA (N=119)

Reo in-houseVirionELISA Sens.: 67%

+ − Spez.: 90%

Reo Sig. 1MS + 10 10 κ: 0,50

− 5 94 95% CI: 0,28 bis 0,672


Im Verglei h von Reo Sigma1MS mit der Reo IFA lag die Sensitivität mit 67% sehr

niedrig und die Spezität mit 95% re ht niedrig (Tab. 6.101). Die Übereinstimmung war

moderat (κ = 0,45).

Tabelle 6.101. Reo Sigma1MS im Verglei h mit Reo IFA (N=225)

Reo IFA Sens.: 67%

+ − Spez.: 95%

Reo Sig. 1MS + 8 13 κ: 0,45

− 4 236 95% CI: 0,24 bis 0,67


Im Verglei h vom Reo Virion in-houseELISA mit dem ReoVirionCRELISA lag die Sen-

sitivität mit 100% sehr ho h und die Spezität mit 73% sehr niedrig (Tab. 6.102). Die

Übereinstimmung war mäÿig (κ = 0,20).

Tabelle 6.102. Reo in-houseVirionELISA im Verglei h mit ReoCRVirionELISA (N=42)


+ − Spez.: 73%

Reo in-house

VirionELISA

+ 2 11 κ: 0,20

− 0 29 95% CI: -0,04 bis 0,45


Die meisten diskordanten Seren (se hs von a ht) sind fals h positiv und stammten aus

der überwa hten Population (Tab. 6.103). Sie zeigten aber nur geringe MFI-Werte (max.

272


317MFI). Auÿerdem stammte ein Serum aus der Gruppe der positiven Kontrollseren,

das aber ebenfalls nur einen sehr geringen MFI aufwies (157). Ein Kontrollserum war in

der IFA Reovirus positiv und in der MS damit fals h negativ (1MFI).

Tabelle 6.103. Diskordante Seren in der ReoMS (ohne Zoohandlungstiere)


Reo Sigma1 Reo Reo


[MFI [S ./Kl. [Kl.

1 200618612 überw. Pop. 317 neg.

2 200615306 überw. Pop. 211 neg.

3 200615308 überw. Pop. 176 neg.

4 200614111 überw. Pop. 164 neg.

5 200617612 überw. Pop. 164 neg.

6 200617706 überw. Pop. 158 neg.

7 32006 KS 157 neg.

8 200729807 KS 1 pos.

Grau hinterlegt: Das Ergebnis ist positiv

Zoohandlungstiergruppen Innerhalb der Zoohandlungstiergruppen gab es zwei Grup-

pen, die in der MS eindeutig positiv (1000 bis 5700MFI) für alle Seren waren (Tab. 6.104,

Gruppe E und F). GruppeE konnte mit keinem der Referenztests bestätigt werden.

GruppeF dagegen war in der Reo IFA komplett positiv. In den GruppenB, D und H

waren nur jeweils ein Teil der Seren in der MS positiv. Diese Ergebnisse konnten in

den meisten Fällen mit min. einem Referenztest bestätigt werden. Ledigli h GruppeH

zeigte dur hweg unspezis he Reaktionen in der IFA, weshalb eine Aussage hier ni ht

mögli h war. Die Referenztests untereinander stimmten bei den Zoohandlungstieren sehr

s hle ht überein. Der CRELISA war nur für ein Serum positiv. Der in-houseELISA und

die IFA waren für zwölf bzw. dreizehn Seren positiv, dabei waren aber nur drei Seren

konkordant.

273

6.Ergebnisse

Tabelle 6.104. Antikörper gegen Reo in Zoohandlungstiergruppen

# Gruppe Serum ID

Reo Sigma1 Reo Reo Reo

MS CRVirionELISA in-houseVirionELISA IFA


1 A 201038501 16 neg. neg. neg.

2 A 201038502 15 neg. neg. neg.

3 B 201040101 242 neg. 0,33 pos.

4 B 201040102 37 neg. neg. neg.

5 C 201043801 1 neg. neg. neg.

6 C 201043802 16 neg. neg. neg.

7 D 201046101 2511 neg. 1,43 neg.

8 D 201046102 5061 neg. 0,31 neg.

9 D 201046103 1 neg. 0,54 neg.

10 D 201046104 1 neg. 0,26 neg.

11 D 201046105 1 neg. 0,29 neg.

12 E 201047701 2045 neg. neg. neg.

13 E 201047702 5753 neg. neg. neg.

14 E 201047703 3934 neg. neg. neg.

15 E 201047704 4192 neg. neg. neg.

16 E 201047705 3349 neg. neg. neg.

274



# Gruppe Serum ID




17 F 201050101 5116 neg. neg. pos.

18 F 201050102 5045 neg. 0,64 pos.

19 F 201050103 1075 neg. neg. pos.

20 F 201050104 2748 neg. neg. pos.

21 F 201050105 4435 neg. 0,37 pos.

22 G 201051701 1 neg. neg. pos.

23 G 201051702 1 neg. neg. pos..

24 G 201051703 1 neg. neg. pos.

25 G 201051704 141 neg. neg. neg.

26 G 201051705 1 neg. neg. neg.

27 H 201053801 201 7,7 0,27 unsp.

28 H 201053802 805 neg. 0,31 unsp.

29 H 201053803 3193 neg. neg. unsp.

30 H 201053804 2012 neg. neg. unsp.

31 H 201053805 1 neg. 0,34 unsp.

275

6.Ergebnisse


# Gruppe Serum ID




32 I 201056101 1 neg. neg. neg.

33 I 201056102 1 neg. 0,44 neg.

34 I 201056103 1 neg. neg. neg.

35 I 201056104 1 neg. neg. neg.

36 I 201056105 1 neg. neg. neg.

37 J 201057501 23 neg. neg. neg.

38 J 201057502 1 neg. neg. neg.

39 J 201057503 29 neg. neg. neg.

40 J 201057504 23 neg. neg. neg.

41 J 201057505 22 neg. neg. neg.

Grau hinterlegt: Ergebnis ist positiv unsp.: Ergebnis ist unspezis h

276


Fazit Alle fünf Referenzseren wurden als positiv erkannt. Die Serokonversion wurde ab

dem 14.DPI mit hohen MFI-Werten detektiert. Im Verglei h mit dem CRELISA gab es

keine fals h negativen Seren. Im Verglei h zu den beiden anderen Referenztests zeigten

si h zwar fals h negative Seren mit der MS, für den in-houseELISA wurde aber au h

gezeigt, dass er im Verglei h zum CRELISA wenig spezis h ist. Die IFA lieferte inner-

halb der überwa hten Population viele positive Ergebnisse, weshalb vermutet wird, dass

die Spezität hier ebenfalls niedrig ist. Aus diesen Gründen können die fals h negativen

Ergebnisse etwas weniger stark gewi htet werden. In Anbetra ht der zuverlässigen Erken-

nung aller Referenzseren, der Serokonversionsstudie und aller CRELISApositiver Seren

kann die Reo Sigma1MS als Su htest verwendet werden.

Die Zoohandlungtiergruppen zeigten mit den vers hiedenen Tests auallend s hle hte

Übereinstimmungen. Hier wären Ergebnisse für weitere Antigene in der MS und weitere

Referenztests interessant, um die Ursa he dafür zu erklären.

Rotavirus A Für das murine RotavirusA (RotaA) stehen der RotaACRVirionELISA

als Su htest und die bovine (Bov.) RotaA IFA als Bestätigungstest zur Verfügung.

Es wurden drei Referenzseren, 18 CRELISApositive (ein Referenzserum enthalten) und

35 CRELISA negative, neun IFApositive und 334 IFAnegative Seren verwendet.

Für drei Referenzseren lagen die MFI-Werte alle über 4300 (MW 12 413, SD6963)

(Tab. 6.105).

Tabelle 6.105. Reaktivitäten von RotaAReferenzseren in der RotaAMS

Herkunft Serum ID RotaAVP6MS [MFI

DKFZ TV02/2005 16464

CR RotaA"high" 16402

BioDo RotaA 4373

Die Titration von Serum TV02/2005 zeigte in der RotaA VP6MS einen Endpunkt bei

einer 328 000fa hen Verdünnung (EC

50

1 : 600) (Abb. 6.79).

277

6. Ergebnisse

101 102 103 104 105 106 107

1

10

100

1000

10000

100000

Verdünnung[1

x

]

Rot

aA

VP

6M

S[M

FI]

Cut-off

Abbildung 6.79. Titration des RotaAReferenzserums TV2/2005

Von den 35 im CRELISA negativ klassizierten Seren lagen 20 über Cut-o in der MS

(Abb. 6.80). Dies lag au h hier an dem hohen Anteil von Kontrollseren und Zoohand-

lungstierseren in den hier untersu hten Proben. Bei diesen Seren ist es ni ht unwahr-

s heinli h, dass au h wel he von Tieren stammten, die s hon Kontakt mit Rotaviren

hatten. 17 von 18 CRELISApositiven Seren wurden mit einem sehr hohen MFI-Wert

detektiert. Nur eines lag mit 96MFI im negativen Berei h, wenn au h sehr nahe am

Cut-o.

278


neg. Grauzone pos.1

10

100

1000

10000

100000

Klassifikation durch Rota A CR Virion ELISA

Rot

aA

VP

6M

S[M

FI]

Cut-off

Abbildung 6.80. RotaA VP6MSReaktivitäten RotaACRVirionELISAnegativer (N= ),

in der Grauzone liegender (N=35) und -positiver Seren (N=18)

Die Korrelation zwis hen S ore-Werten und MFI-Werten war ni ht signikant

(Abb. 6.81).

279

6. Ergebnisse

0 5 10 15 201

10

100

1000

10000

100000

3

Cut-off

2

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3

Rota A CR Virion ELISA [Score]

Rot

aA

VP

6M

S[M

FI]

Abbildung 6.81. RotaA VP6MSReaktivitäten und ihre Korrelation zu Ro-

taACRVirionELISAS ore-Werten (N=19)

Im Verglei h von der RotaA VP6MS mit RotaA VP6CRELISA lag die Sensitivität

der MS mit 94% ho h und die Spezität mit 43% sehr niedrig (Tab. 6.106). Die Über-

einstimmung war mäÿig (κ = 0,30).

Tabelle 6.106. RotaAVP6MS im Verglei h mit RotaAVP6CRELISA (N=53)

RotaAVP6CRELISA Sens.: 94%

+ − Spez.: 43%

RotaAVP6MS + 17 20 κ: 0,30

− 1 15 95% CI: 0,11 bis 0,48


Im Verglei h von RotaA VP6MS mit der bov.Rota IFA lag die Sensitivität der MS mit

280


89% und die Spezität mit 92% niedrig (Tab. 6.107). Die Übereinstimmung war mäÿig

(κ = 0,33).

Tabelle 6.107. RotaAVP6MS im Verglei h mit bov.Rota IFA (N=343)

Bov.Rota IFA Sens.: 89%

+ − Spez.: 92%

RotaAVP6MS + 8 28 κ: 0,33

− 1 306 95% CI: 0,15 bis 0,50


Im Verglei h von bov.Rota IFA mit dem RotaA VP6CRELISA lag die Sensitivität

der IFA mit 8% extrem niedrig und die Spezität mit 86% niedrig (Tab. 6.108). Die

Übereinstimmung war s hle ht (κ = −0,05).

Tabelle 6.108. Bov.Rota IFA im Verglei h mit RotaAVP6CRELISA (N=41)

RotaVP6CRELISA Sens.: 8%

+ − Spez.: 86%

Bov.Rota IFA + 1 4 κ: -0,05

− 11 25 95% CI: -0,31 bis 0,22


Sieben der a ht fals h positiven Seren mit mittleren Reaktivitäten (> 1000 und <

10 000) in der MS stammten aus der Gruppe der positiven Kontrollseren (Tab. 6.109).

Ledigli h eines dieser Seren stammte aus der überwa hten Population (Nr. 3). Die beiden

Seren mit den hö hsten MFI-Werten (Nr. 1 und 2) waren au h im CRELISA positiv, nur

dur h die IFA wurden sie ni ht erfasst. Alle fals h positiven Seren aus der überwa hten

Population auÿer Serum Nr. 3 hatten nur niedrige MFI-Werte unter 209. Nur ein Serum

war fals h negativ in der MS. Es war in der IFA positiv getestet und errei hte nur 1MFI.

Dabei handelt es si h um ein Kontrollserum. Insgesamt gibt es wenig fals h negative

Seren, was auf einen sensitiven Test s hlieÿen lässt. Die fals h positiven Seren mit

mittleren Reaktivitäten in der MS sind alle aus ni ht überwa hten Populationen, weshalb

eine tatsä hli he Infektion ni ht unwahrs heinli h ist.

281

6. Ergebnisse

Tabelle 6.109. Diskordante Seren in der RotaAMS (ohne Zoohandlungstiere)


RotaAVP6 bov.Rota RotaA

MS IFA CRVirionELISA

[MFI [Kl. [Kl./S .

1 200947105 KS 6828 neg. 3,2

2 200914101 KS 6061 neg. 5,1

3 200644701 überw. Pop. 5457 neg.

4 201015401 KS 4086 neg.

5 201001557 KS 1955 neg.

6 201001517 KS 1511 neg.


8 201001505 KS 1200 neg.

9 200617706 überw. Pop. 209 neg.

10 200605007 überw. Pop. 138 neg.

11 200924003 überw. Pop. 133 neg.

12 200618613 überw. Pop. 128 neg.

13 200322601 KS 1 pos.

Grau hinterlegt: das Ergebnis ist positiv

Zoohandlungstiergruppen Das murine RotavirusA breitet si h vor allem unter jun-

gen Mäusen s hnell aus, und es ist von einer nahezu vollständigen Dur hseu hung einer

inzierten Zu htgruppe auszugehen. Es zeigte si h in neun von zehn Gruppen eine voll-

ständige Übereinstimmung des Serostatus aller Tiere in der MS (Tab. 6.110). Ein sol h

einheitli hes Bild ist mit keinem der beiden Referenztests errei ht worden. Allerdings

sind in allen Gruppen, die min. ein MSpositives Tier beinhalten, mit zumindest ei-

nem der Referenztests au h positive Tiere gefunden worden (Gruppen D bis I). Der

RotaA VP6CRELISA entde kte positive in fünf von se hs MSpositiven Gruppen, die

bov.Rota IFA de kte nur drei von se hs Gruppen als positiv auf. Nur eine Gruppe war in

der MS mit einem Serum von fünf positiv, dahingegen mit RotaA VP6CRELISA zwei

von fünf, mit der bov.Rota IFA aber kein einziges. Diese Gruppe könnte aus vers hie-

denen Gründen s hle ht serokonvertiert sein. Mögli herweise hatten die Tiere erst sehr

spät mit dem Virus Kontakt oder wurden erst kurz vor unserem Kauf beim Händler aus

vers hiedenen Zu htgruppen zusammengesetzt. Die dur hweg hohen MFI-Werte und die

vereinzelt bestätigten positiven Seren innerhalb der anderen Gruppen sind zusammen

mit der bekannten Biologie des Virus' ein starker Hinweis darauf, dass die diagnosti-

282


s he Sensitivität der MS für dieses Virus deutli h höher ist als die der zur Verfügung

stehenden Referenztests.

Tabelle 6.110. Antikörper gegen RotaA in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

RotaAVP6 bov.RotaA RotaA


[MFI [Kl. [Kl./S .

A 1 201038501 8 neg. neg.

A 2 201038502 22 neg. neg.

B 3 201040101 1 neg. neg.

B 4 201040102 41 neg. neg.

C 5 201043801 4 neg. neg.

C 6 201043802 1 neg. neg.

D 7 201046101 1694 neg. neg.

D 8 201046102 2924 neg. neg.

D 9 201046103 7876 neg. 5,5

D 10 201046104 129 neg. neg.

D 11 201046105 3988 neg. 4,0

E 12 201047701 3722 neg. neg.

E 13 201047702 1655 neg. neg.

E 14 201047703 1779 neg. neg.

E 15 201047704 4434 pos. neg.

E 16 201047705 2498 pos. neg.

F 17 201050101 4825 neg. neg.

F 18 201050102 10226 neg. 10,6

F 19 201050103 10066 neg. neg.

F 20 201050104 14595 pos. 3,2

F 21 201050105 3997 pos. neg.

G 22 201051701 3735 neg. neg.

G 23 201051702 5134 neg. 4,9

G 24 201051703 1318 neg. neg.

G 25 201051704 7907 neg. 3,7

G 26 201051705 1499 neg. 3,3

H 27 201053801 96 neg. 4,3

H 28 201053802 5052 neg. 7,4

H 29 201053803 70 neg. neg.

H 30 201053804 1 neg. neg.

283

6. Ergebnisse

Tabelle 6.110. Antikörper gegen RotaA in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

RotaAVP6 bov.RotaA RotaA


[MFI [Kl. [Kl./S .

H 31 201053805 1 neg. neg.

I 32 201056101 5742 pos. neg.

I 33 201056102 7818 neg. 4,7

I 34 201056103 3980 neg. 3,2

I 35 201056104 829 neg. 2,2

I 36 201056105 2784 neg. neg.

J 37 201057501 25 neg. neg.

J 38 201057502 1 neg. neg.

J 39 201057503 1 neg. neg.

J 40 201057504 1 neg. neg.

J 41 201057505 2 neg. neg.


Fazit Es wurden alle Referenzseren als positiv erkannt. Es gab nur jeweils ein

fals h negatives Serum im Verglei h zum CRELISA und der IFA. Diese beiden Re-

ferenztests zeigten aber au h untereinander eine s hle hte Übereinstimmung. Die Stärke

des Antigens zeigte si h besonders bei den Zoohandlungstiergruppen, wo die RotaA

VP6MS die plausibelsten Ergebnisse lieferte. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass

die RotaA VP6MS, trotz ihrer Abwei hungen von anderen Tests ho hgradig sensitiv

und spezis h und damit sehr gut als Su htest geeignet ist.

284

6.6. Validierung der MSAntigene für die Ratte

6.6. Validierung der MS Antigene für die Ratte

Die relevanten Viren der Ratte sind nur zum Teil identis h mit denen der Maus. Aus

Ezienzgründen wurden die Rattenseren mit dem glei hen Spektrum an Antigenen un-

tersu ht wie die Mäuseseren. Um erhöhte MFI-Werte für Viren zu analysieren, die na h

der Literatur ni ht oder nur mit unsi herem bzw. vereinzeltem Na hweis (wie Polyo-

maviren, Noroviren und Po kenviren) bei der Ratte vorkommen, wurde ein Grenzwert

von 300MFI gewählt (Tab. 6.111). Dieser Wert ist ni ht mit dem erre hneten Cut-o

zu verwe hseln (siehe Kapitel 5, S. 63). Er soll ledigli h die Betra htung von auälligen

Seren ermögli hen, ohne zu sehr ins Detail zu gehen. Für alle Viren, die natürli he In-

fektionen bei der Ratte verursa hen, lag min. ein Referenzserum vor. VACV bildete hier

eine Ausnahme, da die Ratte si h ni ht mit ECTV oder VACV inzieren kann, aber

mit Kuhpo kenvirus, wel hes mit VACV kreuzreagiert. Eine positive Beurteilung für die

Eignung als Routineantigen wurde vergeben, wenn min. 2 Referenzseren und/oder Seren

aus Konversionsstudien vorlagen. Auÿerdem wurde in Betra ht gezogen, wie ho h die

MFI-Werte dieser Seren lagen. Beispielsweise ist ein Antigen potenziell geeigneter als

Su hantigen, wenn zwei von zwei Seren sehr hohe MFI-Werte zeigten, als wenn drei Se-

ren nur im niedrigen oder mittleren MFI-Werte-Berei h lagen. Für die Hantaviren lagen

zwar nur zwei Referenzseren von der Ratte vor, es gab aber viele Seren von anderen

Spezies, die insgesamt eine positive Beurteilung zulassen.

285

6.Ergebnisse

Tabelle 6.111. Charakteristika der Rattenseren, wel he für die Validierung der einzelnen Viren zur Verfügung standen

Kontrollseren

Virus

Ratte

em

pfängli h

für

natürli he

In-

fektion

Referenzseren

Seren

aus

Konver-

sionsstudien

CR

EL

ISA

+

CR

EL

ISA

−

IFA

+

IFA

−

in-house

EL

ISA

+

in-house

EL

ISA

−

Ausrei hend

Seren

für

Validierung

vorhanden

[ja/nein [N [N [N [N [N [N [N [N [ja/nein

Polyoma nein

*

nein

K-Virus nein

*

nein

MAdV-1 nein 1 1 167 ja

MuHV-1 nein nein

MuHV-4 nein nein

VACV ja

1

nein

MVM nein nein

MPV nein nein

KRV ja 3 24 13 10 ja

RPV ja 3 24 12 6 ja

RMV ja 3 29 2 ja

H-1PV ja 4 23 10 ja

TMEV ja 2 24 6 15 7 167 ja

EMCV ja 1 nein

MNV nein

*

nein

ratHEV ja 1 nein

LDV nein nein

286

6.6.ValidierungderMSAntigenefürdieRatte

Tabelle 6.111. Charakteristika der Rattenseren, wel he für die Validierung der einzelnen Viren zur Verfügung standen

Kontrollseren

Virus

Ratte

em

pfängli h

für

natürli he

In-

fektion

Referenzseren

Seren

aus

Konver-

sionsstudien

CR

EL

ISA

+

CR

EL

ISA

−

IFA

+

IFA

−

in-house

EL

ISA

+

in-house

EL

ISA

−

Ausrei hend

Seren

für

Validierung

vorhanden

[ja/nein [N [N [N [N [N [N [N [N [ja/nein

MHV ja 5 27 9 17 161 ja

PVM ja 4 23 20 ja

SeV ja 3 10 22 7 165 ja

LCMV nein 2 1 17 ja

HTNV/SEOV ja 2 2 18 ja

Reo ja 3 24 5 24 ja

RotaA nein nein

*

vereinzelt Hinweise vorhanden

1

Kuhpo kenvirus

287

6. Ergebnisse

6.6.1. DNA-Viren

Murine Polyomaviren

Das Vorkommen von Polyomaviren bei der Ratte ist nur wenig bes hrieben (Ward et

al. 1984). Andere Labors untersu hen ebenso wie die mikrobiologis he Diagnostik des

DKFZs ni ht auf Polyomaviren bei der Ratte. Deshalb bes hränkt si h die Analyse auf

die Untersu hung von Zusammenhängen zwis hen hohen MFI-Werten und der Herkunft

der Seren.

Es fanden si h erhöhte MFI-Werte (> 300MFI) für PolyomaVP1 und/oder K-VirusVP1

bei 12 Seren. Zehn der Seren stammten aus der Gruppe der Kontrollseren. Bei drei Seren

errei hten beide Antigene über 300MFI (Tab. 6.112, Nr. 2, 3 und 6). Hier ist die Wahr-

s heinli hkeit groÿ, dass es si h um ein oder mehrere kreuzreaktive Viren handelt. Seren

mit besonders hohen MFI-Werten konnten aber ni ht einheitli hen Quellen zugeordnet

werden (Seren Nr. 1 und 2, und Seren Nr. 8-11).

Zwei der Seren stammten aus der überwa hten Population (Nr. 7 und 10) und diese

zeigten nur jeweils für ein Antigen gering bis mittelgradig erhöhte MFI-Werte. Es han-

delte si h hier um Einzelbefunde und deshalb ist es unwahrs heinli h, dass eine Infektion

diesen beiden erhöhten MFI-Werten zu Grunde lag. Für die überwa hte Population wer-

den viele Vorkehrungen getroen, damit für die Tiere ein geringes Risiko besteht, Viren

ausgesetzt zu sein.

In den Zoohandlungstiergruppen fanden si h keine Seren mit einem MFI über 300.

288


Tabelle 6.112. MFI-Werte > 300 für Polyomaviren der Maus


PolyomaVP1 K-Virus

MS MS

[MFI [MFI

1 200947102 KS 1 4489

2 HEV 2 KS 356 1397

3 HEV 0 KS 573 879

4 201041301 KS 36 654

5 200913201 KS 198 441

6 201040003 KS 442 403

7 200737501 überw. Pop. 34 305

8 200850601 KS 7534 11

9 200849601 KS 4368 1

10 200614901 überw. Pop. 1447 5

11 200914119 KS 1248 1

12 200850602 KS 662 34


Fazit Es lieÿ si h keine Aussage zur Eignung als Su htest treen, da weder Referenz-

tests etabliert, no h Referenzseren vorhanden waren. Es wurden hohe MFI-Werte (max.

7534MFI) bei der Ratte gefunden, obwohl der Na hweis von Polyomaviren bei der Ratte

in der Literatur unsi her ist. Da es si h in der Mehrzahl (zehn von zwölf) der erhöhtem

MFI-Werte um Seren aus ni ht überwa hten Populationen handelt, ist es wahrs hein-

li h, dass verwandte Polyomaviren zumindest für eine kreuzreaktive Erhöhung der MFI-

Werte verantwortli h sind. Solange ni ht mehr zu Polyomaviren bei der Ratte bekannt

ist, muss ein hoher MFI-Wert bei der Ratte ohne Konsequenzen für den Tierbestand

bleiben. Denno h sollten die MFI-Werte für Polyomaviren bei der Ratte registriert wer-

den, und bei vermehrten auälligen Befunden in der überwa hten Population könnte

eine gruppenspezis he Su h-PCR dur hgeführt werden, um den Nukleinsäurena hweis

für Polyomaviren bei der Ratten zu erbringen.

289

6. Ergebnisse

Murine Adenoviren

Es wurden MAdV-1 oder MAdV-2 IFA als Referenztest verwendet.

Es wurden ein Referenzserum, wel hes au h in der IFA positiv war, und 167 IFAnegative

Seren verwendet.

Das einzige Referenzserum (von CR, MAdV-1 high) lag mit 123MFI mit Fiber nur ge-

ringgradig über dem Cut-o von 100MFI und war negativ mit Hexon (Cut-o 100MFI)

(ni ht gezeigt). Dieses Serum ist ni ht in die Vierfeldertafeln eingeossen.

Für einen Verglei h mit demMAdV-1/2CRVirionELISA lag kein positives Serum vor.

Die Spezität lag mit 99 bzw. 96% ho h (Tab. 6.113, Tab. 6.114).

Tabelle 6.113. MAdV-1Fib.MS im Verglei h mit MadV-1 IFA (N=168)


+ − Spez.: 99%

MAdV-1Fib.MS + 0 2 κ: -0,01

− 1 165 95% CI: -0,02 bis 0,00


Tabelle 6.114. MAdV-1Hex.MS im Verglei h mit MadV-1 IFA (N=168)


+ − Spez.: 96%

MAdV-1Hex.MS + 1 7 κ: 0,21

− 0 160 95% CI: -0,14 bis 0,57


Abgesehen von den Zoohandlungstieren wurden fünf Seren mit einem der beiden

MSAntigene positiv getestet. Sie alle waren fals h positiv im Verglei h zur MAdV-

1 IFA. Alle fünf Seren zeigten nur einen geringgradig erhöhten MFI-Wert (< 1000).

(Tab. 6.115). Deshalb ist es unwahrs heinli h, dass die Seren tatsä hli h spezis he An-

tikörper gegen MAdV-1 enthielten.

290


Tabelle 6.115. Diskordante Seren in der MAdV-1MS (ohne Zoohandlungstiere)


MAdV-1Fib. MAdV-1Hex. MAdV-1

MS MS IFA

[MFI [MFI [Kl.

1 200607001 überw. Pop. 17 623 neg.

2 200853603 überw. Pop. 24 124 neg.

3 200650601 überw. Pop. 20 103 neg.

4 200746301 überw. Pop. 205 85 neg.

5 201015602 überw. Pop. 193 32 neg.


Zoohandlungstiergruppen

Alle Seren waren in der FiberMS negativ. Das HexonAntigen zeigte in a ht von 14

Fällen geringgradig erhöhte (< 1000) MFI-Werte. Die positiven Ergebnisse von MAdV-

1HexonMS (152MFI) und MAdV-1 IFA bestätigten si h nur in einem Fall gegenseitig

(Tab. 6.116, Serum Nr. 5). Alle Seren waren CRELISAnegativ.

Bei den Zoohandlungstieren erbra hte die MAdV-2 IFA sehr viele zweifelhafte die Posi-

tivität der Seren wurde vom Beurteiler ni ht als eindeutig eingestuft und unspezis he

die Fluoreszenzfärbung umfasste die gesamten Zellen und ni ht nur die individuell für

das Virus typis hen Organellen Ergebnisse, sodass eine Analyse der Kreuzreaktionen

zwis hen MAdV-1 und MAdV-2, wie sie für die Maus gezeigt wurden, hier entfallen

musste.

291

6. Ergebnisse

Tabelle 6.116. Antikörper gegen MAdV-1 in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

MAdV-1 Fib. MAdV-1Hex. MAdV-1/2 MAdV-1


[MFI [MFI [Kl. [Kl.

A 1 201059101 82 47 neg. unsp.

A 2 201059102 51 35 neg. unsp.

B 3 201059201 30 16 neg. neg.

B 4 201059202 18 17 neg. neg.

C 5 201059301 1 152 neg. pos.

C 6 201059302 1 420 neg. neg.

D 7 201059401 52 83 neg. unsp.

D 8 201059402 58 146 neg. unsp.

E 9 201059501 1 107 neg. neg.

E 10 201059502 1 49 neg. neg.

F 11 201059601 1 460 neg. neg.

F 12 201059602 1 668 neg. neg.

G 13 201059701 1 276 neg. unsp.

G 14 201059702 1 248 neg. unsp.


Fazit

Eine aussagekräftige Validierung der MAdV-1Fiber und HexonMSAntigene ist für die

Ratte ni ht mögli h. Es ist anzunehmen, dass keines der Seren der Zoohandlungstier-

gruppen tatsä hli h MAdV spezis he Antikörper enthielt.

292


Murine Herpesviren

Auf Herpesviren bei der Ratte wird im DKFZ ni ht standardmäÿig untersu ht. Die

Analyse bes hränkt si h also hier auf die MSErgebnisse. Die natürli hen Wirte sind

für MuHV-1 Mus mus ulus und für MuHV-4 Apodemus spe .. Für die Ratte sind keine

erhöhten MFI-Werte zu erwarten.

MuHV-1UL55sh zeigte für ein Serum aus der Gruppe der Kontrollseren einen gering-

gradig erhöhten MFI-Wert (Tab. 6.117, Serum Nr. 10, 697MFI).

Tabelle 6.117. MFI-Werte > 300 für MuHV-1 und -4 (ohne Zoohandlungstiere)


MuHV-1UL55sh MuHV-4UL26.5 MuHV-4UL27

MS MS MS

[MFI [MFI [MFI

1 200759604 überw. Pop. 1 3531 5

2 200849503 KS 1 1168 9

3 200914110 KS 12 881 74

4 200903401 überw. Pop. 8 394 19

5 200807201 überw. Pop. 15 340 37

6 200849501 KS 1 317 10

7 199734701 KS 4 4 484

8 200853502 überw. Pop. 23 44 463

9 200853501 überw. Pop. 13 28 307

10 200823904 KS 697 26 48


Für MuHV-4UL26.5 lagen se hs gering- bis mittelgradig (> 100MFI) erhöhte MFI-

Werte vor (Seren Nr. 1 bis 6). Für MuHV-4UL27 waren es nur drei Seren mit gering-

gradig erhöhten MFI-Werten (Seren Nr. 7 bis 9). Keines der Seren zeigte für mehr als

ein Antigen von MuHV-4 ein positives Ergebnis. Die Seren stammten aus der überwa h-

ten Population oder der Gruppe der Kontrollseren (jeweils 5 Stü k). Ein Zusammenhang

zwis hen den Herkünften und der Art der serologis hen Reaktion konnte ni ht hergestellt

werden.

Für MuHV-1 lag ein Serum der Zoohandlungstiere (UL55sh: 339MFI), für MuHV-4

keines über 300MFI (Tab. 6.118). Es wurde ni ht dur h das andere Antigen für das

293

6. Ergebnisse

glei he Virus bestätigt.

294

6.6.ValidierungderMSAntigenefürdieRatte

Tabelle 6.118. Antikörper gegen MuHV-1 in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe #

Serum ID MuHV-1UL55sh MuHV-1 pp150 -ter MuHV-4UL26.5 MuHV-4UL27

MS MS MS MS

[MFI [MFI [MFI [MFI

A 1 201059101 15 22 132 49

A 2 201059102 6 53 82 60

B 3 201059201 2 20 15 30

B 4 201059202 8 17 2 20

C 5 201059301 339 20 1 31

C 6 201059302 1 1 1 1

D 7 201059401 5 18 19 25

D 8 201059402 1 289 68 123

E 9 201059501 1 13 270 1

E 10 201059502 1 3 1 1

F 11 201059601 1 1 1 1

F 12 201059602 1 1 1 1

G 13 201059701 1 1 1 1

G 14 201059702 1 1 1 1


295

6. Ergebnisse

Fazit

Eine Validierung der MuHV-1 und MuHV-4MS war ni ht mögli h, da für MuHV-1 keine

Positivkontrolle vorhanden bzw. kein Test für die Ratte etabliert war und für MuHV-4

kein Referenztest zur Verfügung stand.

Für MuHV-1 ist aufgrund der niedrigen MFI-Werte eine tatsä hli h vorausgegangene

Infektion unwahrs heinli h. Für MuHV-4 lagen die Werte zwar höher, aber nur jeweils

eines der beiden MSAntigene zeigte einen erhöhten MFI-Wert. Ein Nutzen für die Rat-

tenserologie dur h diese Antigene ist vorerst ni ht zu erkennen. Au h hier könnte bei

gehäuften positiven Befunden in der überwa hten Population eine Su h-PCR dur hge-

führt werden, um ein verursa hendes Agens zu identizieren.

296


Ectromelia virus

Ratten werden in der mikrobiologis hen Diagnostik im DKFZ ni ht routinemäÿig auf

Antikörper gegen Po kenviren untersu ht. Die Ratte zählt ni ht zu den natürli hen Wir-

ten für das ECTV oder VACV. Andere Orthopoxviren wie das Kuhpo kenvirus können

Ratten inzieren.

Von insgesamt 303 untersu hten Rattenseren zeigte ein Serum aus der überwa h-

ten Population einen erhöhten MFI-Wert für das major envelope Protein (707MFI)

(Tab. 6.119). Für das p35Protein wurden bei diesem Serum nur 9MFI errei ht. Kein wei-

teres Serum aus der überwa hten Population überstieg 300MFI mit einem oder beiden

Antigenen. Aus der Gruppe der Kontrollseren lagen zwei für p35 im gering- (< 1000MFI)

bis mittelgradig (> 1000MFI) erhöhten MFI-Berei h (Nr. 1 und 2), für major envelope

lag ein Serum im mittelgradig erhöhten MFI-Berei h (Nr. 3). In allen Fällen lag das Er-

gebnis für das jeweilig andere Antigen für Orthopoxviren im Berei h des Ba kgrounds.

Tabelle 6.119. MFI-Werte > 300 für VACVp35 und major envelope (ohne Zoohandlungs-

tiere)

# Serumgruppe Serum ID

VACVp35 VACVmaj. env.

MS MS

[MFI [MFI

1 KS 200849601 2360 1

2 KS 199731302 685 1

3 KS 200914107 1 1474

4 überw. Pop. 200759604 9 707


Von den Zoohandlungstieren gab es zwei Seren aus unters hiedli hen Gruppen, die einen

MFI-Wert > 300 für p35 hatten (Tab. 6.120, Nr. 1 und 5). Beide waren mittelgradig

erhöht (> 1000), konnten aber weder mit der VACVmajor envelopeMS, no h mit den

Referenztests CRELISA oder IFA bestätigt werden. Für eine tatsä hli he Infektion,

die ursä hli h für die erhöhten MFI-Werte hätte sein können, gab es keine weiteren

Hinweise.

297

6. Ergebnisse

Tabelle 6.120. Antikörper gegen VACV in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

VACVp35 VACVmaj. env. ECTV VACV


[MFI [MFI [Kl. [Kl.

A 1 201059101 2291 26 neg. neg.

A 2 201059102 33 49 neg. neg.

B 3 201059201 7 23 neg. neg.

B 4 201059202 12 20 neg. neg.

C 5 201059301 1846 1 neg. neg.

C 6 201059302 1 1 neg. neg.

D 7 201059401 16 8 neg. neg.

D 8 201059402 18 23 neg. neg.

E 9 201059501 1 1 neg. neg.

E 10 201059502 1 1 neg. neg.

F 11 201059601 1 1 neg. neg.

F 12 201059602 1 1 neg. neg.

G 13 201059701 1 1 neg. neg.

G 14 201059702 1 1 neg. neg.


Fazit Eine ausrei hende Validierung der VACVMS für die Ratte zur Detektion von

Infektionen mit vers hiedenen Orthopoxviren war mangels Referenzseren oder Seren,

die im Referenztest positiv waren, ni ht mögli h. Die dur hgeführten Referenztests sind

von der Serologie für die Maus abgewandelt, ein positives Kontrollserum fehlte aber.

Somit sind au h die Ergebnisse der Referenztests nur als Anhaltspunkt und ni ht als

diagnostis he Aussage zu verstehen.

Besonders im Hinbli k auf die mit Kuhpo ken inzierten Heimtierratten, die vor weni-

gen Jahren für Infektionen beim Mens hen ursä hli h waren, sollten Zoohandlungstiere

besonders kritis h hinterfragt werden, wenn es um Antikörperpositivität gegen Po kenvi-

ren geht. Da die positiven Ergebnisse aber mit keinem Referenztest oder dem jeweiligen

Partnertier in der Haltungsgruppe bestätigt werden konnte, bleibt die Positivität unsi-

her. Au h hier könnte über PCR der Na hweis erbra ht werden.

298


Murine Parvoviren

KRV Für die Parvoviren bei der Ratte werden die glei hen bzw. analogen Referenztests

eingesetzt wie bei der Maus (Genusdetektion: MVMIFA und CRNS1ELISA; Spezies-

bestimmung: HAH oder CRVP2ELISA für die jeweiligen Viren). Für die VP2ELISA

werden jeweils die rattenspezis hen Proteine verwendet, ebenso wie die HAH mit den

rattenspezis hen Viren dur hgeführt werden. Für die IFA wird aber au h bei der Ratte

das MVM verwendet, da hier über das unter den Spezies ho hkonservierte NS1 au h

kreuzreaktive Antikörper erkannt werden.

• Für KRV wurden drei Referenzseren, 13 CRELISApositive und zehn

CRELISAnegative Seren verwendet. Auÿerdem stand eine Konversionsstudie mit


• Für RPV wurden drei Referenzseren, zwölf CRELISApositive und se hs

CRELISAnegative Seren verwendet. Auÿerdem stand eine Konversionsstudie mit


• Für RMV wurden drei Referenzseren, 29 CRELISApositive und zwei

CRELISAnegative Seren verwendet.

• Für H1-PV wurden vier Referenzseren, 23 CRELISApositive und zehn

CRELISAnegative Seren verwendet.

Zwölf Referenzseren für vers hiedene Parvoviren der Ratte waren in der MS posi-

tiv (Seren wurden wie bei der Maus als positiv gewertet, sobald der MFI-Wert für

ein Parvovirus-Antigen über Cut-o lag) (Tab. 6.121). Bei allen zwölf Seren hatte das

VP2Antigen für das betreende Virus den hö hsten MFI-Wert. Für ein Serum war ledig-

li h NS1 als reaktives Antigen (CRNS1 high) angegeben. Die MFI-Werte lagen alle im

mittleren bis hohen MFI-Berei h (> 1000) für die angegebenen Antigene. Ledigli h Se-

rum Nr. 11 zeigte für das spezis he Antigen (RPVVP2) einen MFI-Wert, der nur knapp

über dem Cut-o von 107MFI lag. Dieses Serum wird für den RPVVP2CRELISA als

niedrig positive Kontrolle eingesetzt.

299

6. Ergebnisse

Tabelle 6.121. Reaktivitäten von ParvovirusReferenzseren in den ParvovirusMS

# Herkunft Serum ID

KRV KRV H-1PV RMV RPV

NS1MS VP2MS VP2MS VP2MS VP2MS

[MFI [MFI [MFI [MFI [MFI

1 CR NS1 "high" 20529 1397 2149 1228 10706

2 CR KRV"high" 14532 5161 5111 1859 809

3 A lad KRV 16861 8985 7810 2849 1638

4 CR H-1PV"high" 10826 259 2808 179 150

5 A lad H-1PV 12435 3541 12234 2696 159

6 DKFZ 200849401 (H-1PV) 21012 11311 18589 10704 2645

7 CR RMV"low" 20579 3202 6361 8271 2422

8 CR RMV"high" 19414 2145 4612 5856 1687

9 DKFZ 200849601 (RMV) 22594 8873 11083 15309 2911

10 CR RPV"high" 15096 258 329 215 3309

11 CR RPV"low" 1535 8 10 9 161

12 DKFZ 200849501 (RPV) 17555 147 496 130 20378

Die Titration eines weiteren Referenzserums für KRV bei CR in Wilmington ergab einen

Endpunkt-Titer von 80 000 für KRVVP2 (EC

50

1 : 1000) (Abb. 6.82). Für NS1 wurde

kein Endpunkt errei ht (EC

50

1 : 15 000).

101 102 103 104 105 106 107 1081

10

1000

10000

100000

KRV VP2

KRV NS1

100

Cut-off (beide)

Verdünnung[1

x

]

KR

VN

S1

und

VP

2M

S[M

FI]

Abbildung 6.82. Titration eines weiteren KRVReferenzserums (S 1097)

300


Die Titration eines weiteren Referenzserums für H-1PV bei CR in Wilmington ergab

einen Endpunkt-Titer von 3 000 000 für KRVNS1 (EC

50

1 : 5000) und von 3 000 000 für

H-1PVVP2 (EC

50

1 : 10 000) (Abb. 6.83).

101 102 103 104 105 106 107 1081

10

100

1000

10000

100000 KRV NS1

H-1 PV VP2

Cut-off H-1 PV VP2

Cut-off KRV NS1

Verdünnung[1

x

]

KR

VN

S1

und

VP

2M

S[M

FI]

Abbildung 6.83. Titration eines weiteren H1-PVCRReferenzserums (S 1506)

Eine Serokonversionsstudie, für die 24 Tiere mit KRV inziert wurden, zeigte mit NS1

eine Konversion am 14.DPI (Abb. 6.84). Nur ein Serum zeigte hier no h keinen erhöhten

MFI-Wert, während alle anderen Seren ab dem 14.DPI sehr hohe Werte um 10 000 bis

20 000MFI zeigten.

301

6. Ergebnisse

Cut-off

DPI

KR

VN

S1

MS

[MF

I]

100000

10000

1000

100

10

10

1

0 7 14 28 35

Abbildung 6.84. Serokonversionsstudie KRV inzierter Ratten in der MS mit KRVNS1

(N=24)

Für VP2 trat die Konversion s hon am 10.DPI für 2 von 4 Seren ein (Abb. 6.85). Aber

au h am 14.DPI war dasselbe Serum, wel hes für NS1 negativ war, ebenfalls für VP2

negativ. Es ist daher mögli h, dass die Infektion oder die Bildung von Antikörpern ni ht

erfolgte. Die positiven Seren ab dem 14.DPI lagen zwis hen 3000 und 20 000MFI.

302


Cut-off

DPI

KR

VV

P2

MS

[MF

I]

100000

10000

1000

100

10

10

1

0 7 14 28 35

Abbildung 6.85. Serokonversionsstudie KRV inzierter Ratten in der MS mit KRVVP2

(N=24)

Eine Serokonversionsstudie für RPV inzierte Ratten zeigte s hon ab dem 10.DPI eine

vollständige Konversion für beide Antigene (KRVNS1 und RPVVP2), mit einer Aus-

nahme am 28.DPI, an dem ein Serum für VP2 ein negatives Ergebnis bra hte (Abb. 6.86,

Abb. 6.87). Dieses Serum zeigte au h für NS1 den niedrigsten MFI-Wert (NS1 493MFI;

VP2 88MFI).

303

6. Ergebnisse

0 7 10 14 28 351

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

DPI

KR

VN

S1

MS

[MF

I]

Abbildung 6.86. Serokonversionsstudie RPV inzierter Ratten in der MS mit KRVNS1

(N=24)

304


0 7 10 14 28 351

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

DPI

RP

VV

P2

MS

[MF

I]

Abbildung 6.87. Serokonversionsstudie RPV inzierter Ratten in der MS mit RPVVP2

(N=24)

Im KRVNS1CRELISA negativ klassizierte Seren unters hieden si h in ihren MFI-

Werten deutli h von den positiven Seren (Abb. 6.88). Die Gruppe der negativen Se-

ren war präselektiert für hohe MFI-Werte, da hier auällig hohe MFI-Werte mit dem

CRELISA überprüft wurden. Bei den NS1CRELISApositiven Seren zeigten 23 von 27

Seren sehr hohe MFI-Werte. Nur vier Seren lagen nahe bei oder unter dem Cut-o von

100MFI.

Die Korrelation zwis hen MFI-Wert und S ore-Wert war nur mäÿig (R2 = 0,43; p =

0,0009) (Abb. 6.89). Seren mit niedrigem S ore-Wert lagen au h mit dem MFI-Wert

sehr niedrig, zum Teil au h im negativen Berei h. Alle Seren mit einem S ore-Wert > 5

lagen um die 10 000 bis 20 000MFI, bis auf ein Serum, wel hes in der MS negativ war.

305

6. Ergebnisse

neg. Grauzone pos.1

10

100

1000

10000

100000


KR

VN

S1

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.88. KRVNS1MSReaktivitäten KRVNS1CRELISAnegativer (N=12), in der

Grauzone liegender (N=2) und -positiver Seren (N=27)

306


0 5 10 15 20

1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off


KR

VN

S1

MS

[MF

I]

Abbildung 6.89. KRVNS1MSReaktivitäten und ihre Korrelation zu

KRVNS1ELISAS ore-Werten (N=28)

Se hzehn der mit dem RMVVP2CRELISA positiv klassizierten Seren errei hten au h

mit der RMVVP2MS sehr hohe MFI-Werte (Abb. 6.90). Zehn Seren lagen aber na-

he um den Cut-o (140MFI) herum (29 - 286MFI) und 6 Seren waren negativ. Zwei

negativ klassizierte Seren zeigten 0MFI.

307

6. Ergebnisse

neg. Grauzone pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch RMV VP2 CR ELISA

RM

VV

P2

MS

[MF

I]

Abbildung 6.90. RMVVP2MSReaktivitäten RMVVP2CRELISAnegativer (N=2), in

der Grauzone liegender (N=1) und -positiver Seren (N=29)

Eine Korrelation zwis hen MFI- und S ore-Wert konnte ni ht gezeigt werden (R2 = 0,28;

ni ht signikant) (Abb. 6.91).

308


0 5 10 15 20

1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

23

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3

RMV VP2 CR ELISA [Score]

RM

VV

P2

MS

[MF

I]

Abbildung 6.91. RMVVP2MSReaktivitäten und ihre Korrelation zu

RMVVP2ELISAS ore-Werten (N=12)

Die positiv klassizierten Seren zeigten sehr unters hiedli he KRVNS1 MFI-Werte von 0

bis > 10 000MFI, die se hs negativ klassizierten Seren hingegen lagen unter bzw. eines

lag nur wenig über dem Cut-o von 107MFI (Abb. 6.92).

309

6. Ergebnisse

neg. Grauzone pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch RPV VP2 CR ELISA

RP

VV

P2

MS

[MF

I]

Abbildung 6.92. RPVVP2MSReaktivitäten RPVVP2CRELISAnegativer (N=6), in der

Grauzone liegender (N=1) und -positiver Seren (N=12)

Eine Korrelation zwis hen MFI- und S ore-Wert zeigte si h ni ht (R2 = 0,05; ni ht

signikant) (Abb. 6.93).

310


0 5 10 15

1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3

23

RPV VP2 CR ELISA [Score]

RP

VV

P2

MS

[MF

I]

Abbildung 6.93. RPVVP2MSReaktivitäten und ihre Korrelation zu

RPVVP2ELISAS ore-Werten (N=8)

Die H-1VP2CRELISA positiv bzw. negativ klassizierten Seren unters hieden si h

deutli h in ihren MFI-Werten (Abb. 6.94). Alle positiv klassizierten Seren hatten einen

MFI-Wert von über 1000. Von den negativ klassizierten Seren lag eines über dem Cut-

o (228) in der MS und errei hte 7354MFI.

311

6. Ergebnisse

neg. pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch H-1 PV VP2 CR ELISA

H-1

PV

VP

2M

S[M

FI]

Abbildung 6.94. H-1PVVP2MSReaktivitäten H-1PVVP2CRELISAnegativer (N=11)


Eine Korrelation zwis hen MFI- und S ore-Wert war deutli h (R2 = 0,82; p < 0,0001)

(Abb. 6.95).

312


0 5 10 15

1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

23

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3

H-1 PV VP2 CR ELISA [Score]

H-1

PV

VP

2M

S[M

FI]

Abbildung 6.95. H-1PVVP2MSReaktivitäten und ihre Korrelation zu H-

1PVVP2ELISAS ore-Werten (N=15)

Au h für KRVVP2 unters hieden si h die im CRELISA negativ bzw. posi-

tiv klassizierten Seren in der MS deutli h voneinander (Abb. 6.96). Alle im CRELISA

positiven Seren reagierten au h in der MS positiv, wobei die MFI-Werte in einem breiten

Berei h zwis hen 199 und 15 396 lagen (Cut-o 112MFI).

313

6. Ergebnisse

neg. pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch KRV VP2 CR ELISA

KR

VV

P2

MS

[MF

I]

Abbildung 6.96. KRVVP2MSReaktivitäten KRVVP2CRELISAnegativer (N=10) und


Eine Korrelation zwis hen MFI- und S ore-Wert konnte ni ht gezeigt werden (R2 = 0,07;

ni ht signikant) (Abb. 6.97).

314


0 5 10 15

1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

23

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3

KRV VP2 CR ELISA [Score]

KR

VV

P2

MS

[MF

I]

Abbildung 6.97. KRVVP2MSReaktivitäten und ihre Korrelation zu

KRVVP2ELISAS ore-Werten (N=4)

Im Verglei h von der KRVNS1MS mit dem KRVNS1CRELISA lag die Sensitivität mit

89% niedrig und die Spezität mit 58% sehr niedrig (Tab. 6.122). Die Übereinstimmung


315

6. Ergebnisse

Tabelle 6.122. KRVNS1MS im Verglei h mit KRVNS1CRELISA (N=39)


+ − Spez.: 58%

KRVNS1MS + 24 5 κ: 0,50

− 3 7 95% CI: 0,20 bis 0,80


Im Verglei h von der RMVVP2MS mit dem RMVVP2CRELISA lag die Sensitivität

mit 66% sehr niedrig und die Spezität mit 100% sehr ho h (Tab. 6.123). Die Überein-

stimmung war s hle ht (κ = 0,20).

Tabelle 6.123. RMVVP2MS im Verglei h mit RMVVP2CRELISA (N=31)

RMVVP2CRELISA Sens.: 66%

+ − Spez.: 100%

RMVVP2MS + 19 0 κ: 0,20

− 10 2 95% CI: -0.05 bis 0.44


Im Verglei h von der RPVVP2MS mit dem RPVVP2CRELISA lagen die Sensitivität

mit 50% und die Spezität mit 83% sehr niedrig (Tab. 6.124). Die Übereinstimmung


Tabelle 6.124. RPVVP2MS im Verglei h mit RPVVP2CRELISA (N=18)

RPVVP2CRELISA Sens.: 50%

+ − Spez.: 83%

RPVVP2MS + 6 1 κ: 0,28

− 6 5 95% CI: -0.09 bis 0.64


Im Verglei h von der H-1PVVP2MS mit dem H-1PVVP2CRELISA lag die Sensitivi-

tät mit 100% sehr ho h und die Spezität mit 91% im mäÿigen Berei h (Tab. 6.125).

Die Übereinstimmung war sehr gut (κ = 0,93).

316


Tabelle 6.125. H-1PVVP2MS im Verglei h mit H-1PVVP2CRELISA (N=34)

H-1PVVP2CRELISA Sens.: 100%

+ − Spez.: 91%

H-1PVVP2MS + 23 1 κ: 0, 93

− 0 10 95% CI: −0, 80 bis 1, 06


Im Verglei h von der KRVVP2MS mit KRVVP2CRELISA lag die Sensitivität mit

100% sehr ho h und die Spezität mit 90% im mäÿigen Berei h (Tab. 6.126). Die Über-

einstimmung war sehr gut (κ = 0,91).

Tabelle 6.126. KRVVP2MS im Verglei h mit KRVVP2CRELISA (N=23)

KRVVP2CRELISA Sens.: 100%

+ − Spez.: 90%

KRVVP2MS + 13 1 κ: 0,91

− 0 9 95% CI: 0,74 bis 1,08


Alle Seren, die in der KRVNS1MS im Verglei h mit dem KRVNS1CRELISA als

fals h positiv klassiziert wurden, wurden mit anderen ParvovirusAssays als posi-

tiv bestätigt (Tab. 6.127, Seren 1, 2 und 5). Die KRVNS1CRELISApositiven, in der

KRVNS1MS jedo h ni ht reagierenden Seren (Nr. 3 und 4) lagen mit anderen Parvovi-

rusAntigenen in der MS über Cut-o und wären somit in der Anwendung der Parvovi-

rusMS als Su htest ni ht übersehen worden. Die fals h negativen Seren für RMVVP2

(Nr. 3, 5, 6 und 7) lagen ebenfalls jeweils mit anderen Antigenen (zweimal mit NS1 und

zweimal mit RPVVP2) über Cut-o und wären somit ebenfalls im Su htest ni ht als

Parvovirus positiv übersehen worden.

317

6.Ergebnisse

Tabelle 6.127. Diskordante Seren in der ParvovirusMS (ohne Zoohandlungstiere)

# Serum

grupp

e

Diskordant

für

Serum

ID

KR

VN

S1

MS

KR

VN

S1

CR

EL

ISA

RM

VV

P2

MS

RM

VV

P2

CR

EL

ISA

RP

VV

P2

MS

RP

VV

P2

CR

EL

ISA

H-1

PV

VP

2

MS

H-1

PV

CR

EL

ISA

KR

VV

P2

MS

KR

VV

P2

CR

EL

ISA

[MFI [Kl./S . [MFI [Kl. [MFI [Kl. [MFI [Kl. [MFI [Kl.

1 KS KRVNS1 200515001 678 neg. 1119 1 3418 pos. 997 pos.

2 KS KRVNS1 200944403 176 neg. 302 37 10670 pos. 1262

3 KS KRVNS1 200914119 71 3,4 1 pos. 258 122 166

4 KS KRVNS1 201002407 8 7,6 19503 pos. 4012 pos. 21796 pos. 15396 pos.

5 KS

KRVNS1 u.

200914110 neg. 125 103 159 98

RMVVP2

221 pos.

6 KS RMVVP2 200823904 3422 75 pos. 50 84 26

7 KS RMVVP2 200914107 48 2,7 110 pos. 896 100 73


318


Zoohandlungstiergruppen Es gab in allen Gruppen Hinweise auf Parvovirusinfektio-

nen (Tab. 6.128). In GruppeE lag nur das Ergebnis des KRVNS1CRELISA geringgradig

über Cut-o (S ore 3). Das Ergebnis wurde dur h keinen weiteren Test (Referenztest oder

MSAntigen) bestätigt. GruppeB zeigte nur im RMVVP2CRELISA geringgradig posi-

tive Ergebnisse. Au h hier konnte kein anderer Referenztest die Positivität bestätigen.

In allen weiteren Gruppen war min. ein Serum mit einem der MSAntigene positiv.

319

6.Ergebnisse


Grupp

e

# Serum

ID

KR

VN

S1

MS

KR

VN

S1

CR

EL

ISA

RM

VV

P2

MS

RM

VV

P2

CR

EL

ISA

RP

VV

P2

MS

RP

VV

P2

CR

EL

ISA

H-1

PV

VP

2

MS

H-1

PV

CR

EL

ISA

KR

VV

P2

MS

KR

VV

P2

CR

EL

ISA

[MFI [Kl./S . [MFI [Kl./S . [MFI [Kl./S . [MFI [Kl./S . [MFI [Kl./S .

A 1 201059101 49 neg. 147 7 37 3 175 neg. 44 neg.

A 2 201059102 67 neg. 116 8,4 65 3 87 neg. 51 neg.

B 3 201059201 27 neg. 29 3,1 27 neg. 100 neg. 40 neg.

B 4 201059202 35 neg. 70 5,4 17 neg. 125 neg. 48 neg.

C 5 201059301 14393 4,4 4090 14,5 447 9 5603 6,6 3319 7,8

C 6 201059302 7010 neg. 1 7,6 1 2,9 1870 3,9 199 4,3

D 7 201059401 42 neg. 109 8,4 129 neg. 53 neg. 150 neg.

D 8 201059402 33 neg. 286 8 29 3,6 119 neg. 57 neg.

E 9 201059501 1 3,4 1 neg. 1 neg. 1 neg. 1 neg.

E 10 201059502 1 2,8 1 neg. 1 neg. 1 neg. 1 neg.

F 11 201059601 10198 3,7 1035 2,5 1 13,7 1 neg. 1 neg.

F 12 201059602 12550 6,7 1 4,6 1 6,3 1 neg. 1 neg.

G 13 201059701 13329 neg. 11724 15,6 1 7,5 8166 7,3 5051 4,2

G 14 201059702 12817 6,8 10313 5,7 1 neg. 7354 neg. 5173 6,5


320


Fazit Die MS ist für die Ratte grundsätzli h als Su htest für Parvovirusinfektionen

geeignet. Wie bei der Maus au h, sollten zur Maximierung der Sensitivität alle Parvovi-

rusantigene simultan als Su htest eingesetzt werden. Ein Serum sollte als positiv bzw. als

überprüfungswürdig beurteilt werden, wenn der MFI-Wert für eines der Antigene über

dem Cut-o lag. Au h wenn die einzelnen Übereinstimmungen zwis hen den vers hiede-

nen CRELISA und der MS mit den jeweilig homologen Antigenen ni ht sehr ho h waren,

so wurden do h insgesamt Parvovirus positive Seren sensitiv und spezis h erkannt. Die

Unters heidung, wel hes Virus genau beteiligt war, ist ni ht mit Si herheit zu treen,

da häug mehrere VP2Proteine positive Ergebnisse liefern; sowohl in der MS, als au h

in den CRELISA. Eine Doppelinfektion konnte ni ht ausges hlossen werden. Dur h die

Anzahl der unters hiedli hen MSAntigene für Parvoviren und dur h das Testen mehre-

rer Seren aus einer Haltungseinheit ist die Wahrs heinli hkeit, Parvovirusinfektionen zu

erkennen, ho h.

321

6. Ergebnisse

6.6.2. RNA-Viren

Murine Picornaviren

EMCV Für EMCV bei der Ratte gibt es im DKFZ keinen etablierten Referenztest.

Es lag im DKFZ kein Referenzserum für EMCV bei der Ratte vor.

Bei der Titration eines Referenzserums (S 1589) bei CR wurde der Endpunkt bei einer

Verdünnung von 1 : 100 000 errei ht (EC

50

1 : 600) (Abb. 6.98). Weitere Seren standen

ni ht zur Verfügung.

101 102 103 104 105 106 107 108

1

10

100

1000

10000

100000

Verdünnung[1

x

]

EM

CV

3AB

CM

S[M

FI]

Cut-off

Abbildung 6.98. Titration des EMCVCRReferenzserums S 1589

Es fanden si h zehn erhöhte MFI-Werte für EMCVVP1 und 19 für 3ABC (Tab. 6.129).

Für VP1 lagen alle Werte unter 1000MFI, während für 3ABC au h zwei Seren mehr

als 1000MFI zeigten (max. 2392MFI). Ein Serum stammte aus der überwa hten Popu-

lation, ein weiteres aus der Gruppe der Kontrollseren. Angesi hts der Seltenheit dieses

Virus ist eine tatsä hli h vorausgegangene Infektion besonders für das Serum aus der

überwa hten Population sehr unwahrs heinli h. Es ist jedo h ni ht auszus hlieÿen, dass

322


ein bisher unbekanntes, serologis h verwandtes virales Agens für die erhöhten MFI-Werte

verantwortli h war. Die MFI-Werte lagen in 22 von 24 Fällen unter 1000MFI, sodass

hier au h ungeri htete Antikörper, hervorgerufen dur h eine wie au h immer geartete

Stimulation des Immunsystems, ursä hli h dafür sein könnten.

Tabelle 6.129. MFI-Werte > 300 für EMCV


EMCV3ABC EMCVVP1

MS MS

[MFI [MFI

1 200928401 überw. Pop. 1391 27

2 200853603 überw. Pop. 581 33

3 201040002 überw. Pop. 580 19

4 200810601 überw. Pop. 399 76

5 200905701 überw. Pop. 399 44

6 200903401 überw. Pop. 336 22

7 200940005 KS 2392 1

8 199510001 KS 604 81

9 P1995B92 KS 568 766

10 199502101 KS 548 343

11 199922305 KS 510 351

12 199505901 KS 508 971

13 199501901 KS 463 24

14 200515003 KS 436 291

15 200914107 KS 435 1

16 199511901 KS 426 91

17 199505101 KS 419 999

18 199502601 KS 395 160

19 200823906 KS 303 16

20 199511201 KS 230 809

21 199504001 KS 149 668

22 199511101 KS 218 574

23 199511202 KS 187 519

24 199502501 KS 68 324


323

6. Ergebnisse

Zoohandlungstiergruppen Von den Zoohandlungstieren zeigte nur ein Serum einen

erhöhten MFI-Wert (Tab. 6.130, Serum Nr. 1, 3ABC: 1763MFI). Dieses Ergebnis konnte

ni ht mit dem zweiten Serum der Gruppe oder dem anderen Antigen (EMCVVP1)

bestätigt werden.

Tabelle 6.130. Antikörper gegen EMCV in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

EMCV3ABC EMCVVP1

MS MS

[MFI [MFI

A 1 201059101 1763 78

A 2 201059102 38 80

B 3 201059201 60 59

B 4 201059202 34 31

C 5 201059301 14 1

C 6 201059302 1 1

D 7 201059401 126 92

D 8 201059402 165 62

E 9 201059501 26 1

E 10 201059502 40 1

F 11 201059601 1 1

F 12 201059602 1 1

G 13 201059701 1 1

G 14 201059702 1 1


Fazit Für EMCV lieÿ si h aufgrund des Mangels an Seren und Referenztests nur die

grundsätzli he Funktion des Antigens zeigen. Für die Annahmen, dass erhöhte MFI-

Werte dur h kreuzreagierende, verwandte Viren oder dur h ungeri htete Antikörperant-

worten hervorgerufen wurden, lieÿen si h keine weiteren Hinweise nden. Dass hier tat-

sä hli h eine Infektion mit EMCV vorausgegangen ist, ist deshalb und weil das Virus sehr

selten geworden ist, sehr unwahrs heinli h. Zur genaueren Ergründung der Ursa he für

die erhöhten MFI-Werte kann au h hier auf eine Su h-PCR zurü kgegrien werden.

TMEV Für RTV bzw. TMEV bei der Ratte wurde die TMEV IFA als Su htest und der

TMEVCRVirionELISA als Bestätigungstest verwendet.

324


Es wurden zwei Referenzseren, se hs CRELISApositive und 15 CRELISAnegative, sie-

ben IFApositive und 167 IFAnegative Seren verwendet. Auÿerdem stand eine Konversi-

onsstudie mit 24 Seren zur Verfügung.

Beide Referenzseren waren mit VP1 im gering- bis mittelgradig erhöhten MFI-Berei h

und damit au h positiv (Tab. 6.131; 1388 bzw. 224MFI). Für TMEV3ABC wurden keine

erhöhten Werte festgestellt.

Tabelle 6.131. Reaktivitäten von TMEVReferenzseren in der TMEVMS

Herkunft Serum ID TMEV3ABCMS TMEVVP1MS

[MFI [MFI

DKFZ X19 14 1388

BioDo 200940003 27 224

Bei der Titration des TMEVReferenzserums X19 vom DKFZ wurde der Endpunkt

bei einer Verdünnung von 1 : 10 000 für VP1 errei ht (EC

50

1 : 100) (Abb. 6.99). Das

3ABCProtein erbra hte keinen erhöhten MFI-Wert.

101 102 103 104 105 106 107

1

10

100

1000

10000

100000TMEV 3ABC

TMEV VP1

Verdünnung[1

x

]

TM

EV

3AB

Cun

dV

P1

MS

[MF

I]

Cut-off(oben: 3ABC, unten: VP1)

Abbildung 6.99. Titration des TMEVReferenzserums X19

325

6. Ergebnisse

Eine Serokonversionsstudie von CR zeigte in der MS keine erhöhten MFI-Werte. Von CR

wurde sie in der IFA, im ELISA und in der MFIA (MS von CR) überprüft und zeigte

Antikörper. Eine Unters heidung zwis hen positiv und negativ anhand des MFI-Wertes

für TMEVVP1 war anhand der vorliegenden Daten für neun von 23 Seren ni ht mögli h

(Abb. 6.100). Die MFI-Hö hstwerte wurden von Seren errei ht, die im CRELISA negativ

klassiziert wurden.

neg. Grauzone pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch TMEV CR Virion ELISA

TM

EV

VP

1M

S[M

FI]

Abbildung 6.100. TMEVVP1MSReaktivitäten TMEVCRVirionELISAnegativer

(N=15), in der Grauzone liegender (N=2) und -positiver Seren (N=6)



326


0 5 10 15

1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

3


TM

EV

VP

1M

S[M

FI]

Abbildung 6.101. TMEVVP1MSReaktivitäten und ihre Korrelation zu


Eine Unters heidung zwis hen positiv und negativ mit dem MFI-Wert für TMEV3ABC

war anhand der vorliegenden Daten für neun Seren ni ht mögli h (Abb. 6.102). In der

negativ klassizierten Gruppe lag ebenso wie in der positiv klassizierten Gruppe ein

Serum über Cut-o (von 135MFI).

327

6. Ergebnisse

neg. Grauzone pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch TMEV CR Virion ELISA

TM

EV

3AB

CM

S[M

FI]

Abbildung 6.102. TMEV3ABCMSMFI-Werte TMEVCRVirionELISAnegativer

(N=15), in der Grauzone liegender (N=2) und -positiver Seren

(N=6)



328


0 5 10 15

1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

23

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3


TM

EV

3AB

CM

S[M

FI]

Abbildung 6.103. TMEV3ABCMSReaktivitäten und ihre Korrelation zu


Da die Sensitivität si h hier für beide Antigene s hon als sehr niedrig abzei hnete, wurde

in den folgenden Verglei hen ein Serum als positiv gewertet, sofern es mit einem der

beiden MSAntigene über Cut-o lag.

Im Verglei h von der TMEV3ABC/VP1MS mit dem TMEVCRVirionELISA lagen die

Sensitivität mit 67% und die Spezität mit 67% sehr niedrig (Tab. 6.132). Die Überein-

stimmung war mäÿig (κ = 0,29).

329

6. Ergebnisse

Tabelle 6.132. TMEV3ABC/VP1MS im Verglei h mit TMEVCRVirionELISA (N=21)


+ − Spez.: 67%

TMEV3ABC/

VP1MS

+ 4 5 κ: 0,29

− 2 10 95% CI: -0,11 bis 0,69


Im Verglei h von der TMEV3ABC/VP1MS mit der TMEV IFA lag die Sensitivität mit

43% sehr niedrig und die Spezität mit 96% ho h (Tab. 6.133). Die Übereinstimmung


Tabelle 6.133. TMEV3ABC/VP1MS im Verglei h mit TMEV IFA (N=174)

TMEV IFA Sens.: 43%

+ − Spez.: 96%

TMEV3ABC/

VP1MS

+ 3 7 κ: 0,32

− 4 160 95% CI: 0,02 bis 0,62


Im Verglei h von der TMEV IFA mit dem TMEVCRVirionELISA lag die Sensitivität



Tabelle 6.134. TMEV IFA im Verglei h mit TMEVCRVirionELISA (N=15)


+ − Spez.: 82%

TMEVIFA

+ 4 2 κ: 0,71

− 0 9 95% CI: 0,34 bis 1,01

Übereinst.: gut

Fünf von sieben fals h positiven Seren hatten MFI-Werte von unter 510MFI und lagen

somit im niedrig positiven Berei h (Tab. 6.135). Sie stammten zum Teil aus der Gruppe

der Kontrollseren und zum Teil aus der überwa hten Population. Die zwei im Verglei h

330


mit dem CRELISA fals h positiven, wel he mit einem oder beiden Antigenen mit-

telgradig erhöhte MFI-Werte (1000-10 000) errei hten, stammten aus der Gruppe der

Kontrollseren. Eines dieser Seren wurde au h mit der IFA als positiv bestätigt.

Zwei Seren (Nr. 8, 9), die in beiden Referenztests ein positives Ergebnis erbra hten,

waren in der MS mit beiden Antigenen fals h negativ.

Tabelle 6.135. Diskordante Seren in der TMEVMS (ohne Zoohandlungstiere)



MS MS IFA CRELISA


1 200605305 überw. Pop. 509 1 neg.

2 200834101 überw. Pop. 149 33 neg.

3 200905701 überw. Pop. 136 29 neg.

4 200749901 überw. Pop. 104 243 neg.

5 199542808 KS 88 112 neg.

6 200947102 KS 1 7630 neg.

7 199922305 KS 1316 1005 pos. neg.

8 200914115 KS 46 16 pos. 11,7

9 201002406 KS 40 74 pos. 3,9

10 199922306 KS 34 53 pos. neg.


Zoohandlungstiergruppen In den Zoohandlungstiergruppen gab es nur ein Serum,

wel hes in einem Referenztest (CRELISA) und au h in der 3ABCMSpositiv war

(Tab. 6.136; Nr. 1). Dieses wurde aber weder dur h den anderen Referenztest, no h dur h

das andere Serum aus der glei hen Haltung bestätigt. Der S ore-Wert des CRELISA lag

nur geringgradig über dem Cut-o von 3, ebenso wie der entspre hende MFI-Wert für

3ABC (224MFI).

Beide Seren der GruppeD waren auÿerdem positiv in der VP1MS, aber ebenfalls nur

im sehr niedrigen MFI-Berei h.

331

6. Ergebnisse


Gruppe # Serum ID


MS MS IFA CRELISA


A 1 201059101 224 48 neg. 3,4

A 2 201059102 48 40 neg. neg.

B 3 201059201 45 36 neg. neg.

B 4 201059202 19 7 neg. neg.

C 5 201059301 1 1 neg. neg.

C 6 201059302 1 1 neg. neg.

D 7 201059401 102 292 neg. neg.

D 8 201059402 33 117 neg. neg.

E 9 201059501 1 1 neg. neg.

E 10 201059502 1 1 neg. neg.

F 11 201059601 1 1 neg. neg.

F 12 201059602 1 1 neg. neg.

G 13 201059701 1 1 neg. 2,1

G 14 201059702 1 1 neg. 2,6


Fazit Die TMEVMS bei der Ratte funktioniert nur mit einer sehr niedrigen Sensiti-

vität und mit niedrigen MFI-Werten. Als Su htest ist sie damit ni ht geeignet. Beide

Referenztests stimmten untereinander gut überein. Dass in den Zoohandlungstieren tat-

sä hli h TMEV Infektionen vorlagen, ist mögli h, aber die Hinweise sind ni ht sehr stark.

Es ist auÿerdem mögli h, dass verwandte Viren die niedrig positiven Ergebnisse dur h

Kreuzreaktionen verursa hten.

Der verwendete Stamm für die Antigenentwi klung (TMEVGD7) hat für die Ratte

wenig Relevanz. Das RatTheiler-likeVirus (bzw. ratTheilovirus) kommt bei der Ratte

häuger vor. Ein spezis her Test auf dieses Virus könnte die Sensitivität erhöhen.

332


Murine norovirus

Es gibt keine Referenztests für Noroviren bei der Ratte, da diese bisher nur sporadis h

bes hrieben wurden (HSU 2009).

Aus der Gruppe der Kontrollseren lagen 19 Seren mit ihrem MFI-Wert über 300

(Tab. 6.137). Fünf Seren zeigten mit über 1000MFI einen mittelgradig erhöhten MFI-

Wert, während aus der überwa hten Population kein einziges Serum au h nur eine lei hte

Erhöhung von über 300MFI zeigte.

Tabelle 6.137. MFI-Werte > 300 für MNV bei der Ratte

Serumgruppe # Serum ID

MNVVP1

MS

[MFI

KS 1 1995P2 2348

KS 2 199504001 1978

KS 3 199502901 1914

KS 4 200515003 1505

KS 5 199505101 1366

KS 6 199511202 969

KS 7 199502501 958

KS 8 199511101 877

KS 9 200944403 752

KS 10 201059402 735

KS 11 199504401 620

KS 12 199503101 605

KS 13 P1995B92 579

KS 14 199511201 491

KS 15 199502101 483

KS 16 199505901 435

KS 17 200944404 410

KS 18 HTNVCR "high" 402

KS 19 199503201 302

Zoohandlungstiergruppen Unter den Zoohandlungstieren gab es drei mittelgradig (>

1000MFI) erhöhte MFI-Werte für das murine Norovirus (Tab. 6.138, Seren Nr. 6, 13 und

333

6. Ergebnisse

14). Die MFI-Werte im mittleren Berei h wurden jeweils dur h das andere Serum in

der Gruppe bestätigt. Nur ein weiteres Serum mit einem niedrigen MFI-Wert (Nr. 8;

735MFI wurde ni ht vom anderen Serum der glei hen Gruppe bestätigt.


Gruppe # Serum ID

MNVVP1

MS

[MFI

A 1 201059101 47

A 2 201059102 22

B 3 201059201 22

B 4 201059202 7

C 5 201059301 202

C 6 201059302 1795

D 7 201059401 36

D 8 201059402 735

E 9 201059501 1

E 10 201059502 1

F 11 201059601 1

F 12 201059602 1

G 13 201059701 1513

G 14 201059702 1699

Grau hinterlegt: Ergebnis > 300

Fazit Die Eignung als Su htest lieÿ si h ni ht beurteilen. Es fehlten Referenztests und

Referenzseren für die Ratte. Die Ergebnisse der Zoohandlungstiergruppen und der Kon-

trollseren lieferten Hinweise darauf, dass das Vorkommen von Noroviren bei der Ratte

wahrs heinli h ist.

Ein positives Ergebnis für MNVVP1 bleibt denno h vorerst bei der Ratte ohne Kon-

sequenzen, da eine Bestätigung ni ht mögli h ist. Es ist jedo h ni ht unwahrs heinli h,

dass bald ein Norovirus bei der Ratte bes hrieben wird (HSU 2009). In diesem Fall sollte

s hnellstmögli h ein spezis hes VP1 für die Ratte verwendet werden. Auÿerdem könnte

au h hier über eine Su h-PCR der Nukleinsäurena hweis versu ht werden.

334



Für das ratHEV gibt es keine kommerziellen Referenztests. Im Folgenden wird das Virus

kurz HEV genannt.

Ein Referenzserum verhielt si h in der MS gemäÿ seinem Vorberi ht am DKFZ wurde

kein bestätigender Test dur hgeführt und errei hte 8868MFI mit dem HEVNAntigen

in der MS (ni ht gezeigt).

Von den Seren aus der überwa hten Population wurde maximal 67MFI errei ht. Aus

der Gruppe der Kontrollseren lagen zwei Seren über 300MFI (Tab. 6.139).

Tabelle 6.139. MFI-Werte > 300 für HEV (ohne Zoohandlungstiere)

Serumgruppe Serum ID

HEV NC

MS

[MFI

KS 200515002 3904

KS 200515003 866

Grau hinterlegt: Ergebnis > 300

Von Seren aus den Zoohandlungstiergruppen wurden maximal 57MFI für HEVNMS

errei ht (ni ht gezeigt).

Fazit Das HEVNMSAntigen konnte ni ht ausrei hend validiert werden, um die Eig-

nung als Su htest beurteilen zu können. Das Antigen funktioniert grundsätzli h, da ein

Referenzserum mit 8868MFI erkannt wurde und die gesamte überwa hte Population

keine erhöhten MFI-Werte zeigte. Weil es wenig Seren mit erhöhten MFI-Werten gab,

s heint das Gefährdungspotential für Tierhaltungen gering. Es ist denno h gut die Mög-

li hkeit zu haben, auf dieses Virus zu testen. Andere Diagnostiklabors testen bei Mäusen

oder Ratten ni ht auf HEV.

335

6. Ergebnisse


Arteriviridae sind bei der Ratte bisher ni ht bes hrieben worden.

Ein Referenzserum von CR für HTNV zeigte in der LDVNMS 8754MFI. Sonst zeigten

si h keine weiteren Seren aus der Gruppe der Kontrollseren, der überwa hten Popu-

lation oder den Zoohandlungstiergruppen mit erhöhten MFI-Werten für LDVN (ni ht

gezeigt).

Fazit Mit Ausnahme des einen Referenzserums von CR ergaben si h keine Hinweise auf

die Relevanz von LDV oder kreuzreagierende Viren bei der Ratte. Deshalb ist der Nutzen

dieses Antigens für die Routinediagnostik bei der Ratte zur Zeit ni ht vorhanden.

336


Murine Coronaviren

Es standen die MHV IFA als Su htest und der MHV/RCVNCRELISA als Bestätigungs-

test zur Verfügung.

Es wurden fünf Referenzseren, 27 CRELISApositive und neun CRELISAnegative, 17

IFApositive und 161 IFAnegative Seren verwendet.

Vier von vier positiven Referenzseren zeigten mit dem MHVNMSAntigen einen deutli h

erhöhten MFI (Tab. 6.140). Das RCV low Serum lag als einziges unter 1000MFI. Bei

den CRELISA dienen die low Seren zur Überprüfung, ob das Detektionslimit und

damit die erwartete Sensitivität errei ht wurde. Mit dem MHVNAntigen wurde ein

MW von 5369MFI und eine SD von 4649 errei ht. Das RCVN Antigen zeigte dagegen

bei allen Seren nur lei ht erhöhte MFI-Werte. Deshalb wurde es au h bei der Messung

bei CR in Wilmington ni ht mehr einges hlossen (RCVS1392).

Tabelle 6.140. Reaktivitäten von RCVReferenzseren in der MHV- und RCVMS

Herkunft Serum ID MHVNMS [MFI RCVNMS [MFI

DKFZ 199036101 (RCVX) 10985 198

CR RCV"low" 814 20

CR RCV"high" 7286 232

A lad RCV 2392 132

Bei der Titration eines weiteren Referenzserums (S 1392) von CR bei den Messungen in

Wilmington wurde der Endpunkt bei 1 : 600 000 in der MHVNMS errei ht (EC

50

1 : 700)

(Abb. 6.104).

337

6. Ergebnisse

101 102 103 104 105 106 107 1081

10

100

1000

10000

100000

Verdünnung[1

x

]

MH

VN

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.104. Titration eines weiteren RCVReferenzserums (S1392)

Das MHVN zeigte bei den Referenzseren deutli h höhere MFI-Werte als das

RCVNAntigen. Deshalb wird im Folgenden dieses Antigen zuerst dargestellt.

MHV

24 von 27 Seren, die im MHV/RCVNCRELISA positiv waren, zeigten au h in der MS

positive Reaktionen (Abb. 6.105). Alle Seren, die im CRELISA negativ waren oder in

der Grauzone lagen, waren gering bis mittelgradig positiv in der MS (Cut-o 500MFI).

Ein Serum war konkordant negativ. Die hier gezeigten Seren stammten ni ht aus der

überwa hten Population. Die Wahrs heinli hkeit von tatsä hli h vorausgegangenen In-

fektionen mit Coronaviren ist ho h. Deshalb würde hier eine gröÿere Sensitivität der

MHVNMS gegenüber dem CRELISA eine geringere Spezität vortäus hen.

338


neg. Grauzone pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch MHV/RCV N CR ELISA

MH

VN

MS

[MF

I]

Abbildung 6.105. MHVNMSReaktivitäten MHV/RCVNCRELISAnegativer (N=9), in

der Grauzone liegender (N=2) und -positiver Seren (N=27)

Der S ore-Wert korrelierte sehr stark mit dem MFI-Wert (R2 = 0,75; p < 0,0001)

(Abb. 6.106).

339

6. Ergebnisse

0 5 10 15 20 25

1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

23

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3


MH

VN

MS

[MF

I]

Abbildung 6.106. MHVNMSReaktivitäten und ihre Korrelation zu

MHV/RCVNCRELISAS ore-Werten (N=21)

Im Verglei h von MHVNMS mit RCV/MHVNCRELISA lagen die Sensitivität mit

89% und die Spezität mit 89% niedrig (Tab. 6.141). Die Übereinstimmung war gut

(κ = 0,72).

340


Tabelle 6.141. MHVNMS im Verglei h mit RCV/MHVNCRELISA (N=36)

RCV/MHVNCRELISA Sens.: 89%

+ − Spez.: 89%

MHVNMS + 24 1 κ: 0,72

− 3 8 95% CI: 0,47 bis 0,98

Übereinst.: gut

Im Verglei h von MHVNMS mit MHV IFA lag die Sensitivität mit 71% sehr niedrig und

die Spezität mit 98% ho h (Tab. 6.142). Die Übereinstimmung war gut (κ = 0,70).

Tabelle 6.142. MHVNMS im Verglei h mit MHV IFA (N=178)

MHV IFA Sens.: 71%

+ − Spez.: 98%

MHVNMS + 12 4 κ: 0,70

− 5 157 95% CI: 0,51 bis 0,89

Übereinst.: gut

RCV

Alle mit dem MHVNCRELISA negativ und in der Grauzone klassizierte Seren wurden

mit der RCVNMS als negativ bewertet (Abb. 6.107). Allerdings wurden au h 19 der 28

positiv klassizierten Seren in der RCVNMS (Cut-o 159MFI) negativ bewertet.

341

6. Ergebnisse

neg. Grauzone pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch MHV/RCV N CR ELISA

RC

VN

MS

[MF

I]

Abbildung 6.107. RCVNMSReaktivitäten negativer (N=9), in der Grauzone liegender


Eine Korrelation zwis hen S ore-Werten und MFI-Werten stellte si h nur gering dar,

war aber signikant (R2 = 0,39; p = 0,0023) (Abb. 6.108)

342


0 5 10 15 20 25

1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

23

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3


RC

VN

MS

[MF

I]

Abbildung 6.108. RCVNMSReaktivitäten und ihre Korrelation zu

MHVNCRELISAS ore-Werten (N=21)

Im Verglei h von RCVNMS mit RCV/MHVNCRELISA lag die Sensitivität mit 33%

sehr niedrig und die Spezität mit 100% sehr ho h (Tab. 6.143). Die Übereinstimmung


343

6. Ergebnisse

Tabelle 6.143. RCVNMS im Verglei h mit RCV/MHVNCRELISA (N=36)

RCV/MHVNCRELISA Sens.: 33%

+ − Spez.: 100%

RCVNMS + 9 0 κ: 0,20

− 18 9 95% CI: 0,04 bis 0,36


Im Verglei h von RCVNMS mit MHV IFA lag die Sensitivität mit 24% sehr niedrig und

die Spezität mit 99% ho h (Tab. 6.144). Die Übereinstimmung war mäÿig (κ = 0,31).

Tabelle 6.144. RCVNMS im Verglei h mit MHV IFA (N=178)

MHV IFA Sens.: 24%

+ − Spez.: 99%

RCVNMS + 4 2 κ: 0,31

− 13 159 95% CI: 0,06 bis 0,56


Bei diesen diskordanten Seren handelt es si h in 17 von 23 Fällen um fals h negative

Seren in der MS mit einem oder beiden Antigenen (Tab. 6.145). In den meisten Fällen

bestätigten si h die beiden Referenztests gegenseitig, sodass die Seren wahrs heinli h tat-

sä hli h Antikörper gegen Coronaviren enthielten. Besonders im niedrigen bis mittleren

S ore- bzw. MFI-Berei h nden si h vermehrt Diskordanzen (Seren Nr. 10 bis 17) sowohl

zwis hen der MS und dem jeweiligen Referenztest, als au h zwis hen den Referenztests

untereinander (Nr. 10, 13 und 14).

Die fals h positiven Seren Nr. 18 bis 23 zeigten niedrige bis mittlere MFI-Werte.

Sie stammten alle aus der überwa hten Population. Eine tatsä hli h vorausgegange-

ne Coronavirus Infektion ist unwahrs heinli h. Zwei Seren (Nr. 22 und 23), die RCV

fals h positiv waren, zeigten mit MHV keine Erhöhung des MFI-Wertes.

344


Tabelle 6.145. Diskordante Seren in der MHV- und RCVMS (ohne Zoohandlungstiere)


MHVN RCVN MHV/RCVN MHV

MS MS ELISA IFA


KS 1 200842702 22178 1 pos.

KS 2 200842701 21088 52 pos.

KS 3 200515002 13224 84 pos.

KS 4 200940001 6475 67 18,0 pos.

KS 5 200914111 4040 31 6,0

KS 6 200940005 3055 99 10,6

KS 7 200947103 2774 108 10,8

KS 8 RCV A lad 2392 132 11,3

KS 9 KS 3/ Reihe 2/3 2138 9 pos.

KS 10 199542806 1073 1 neg. pos.

KS 11 199542805 633 5 4,0 pos.

KS 12 199542802 559 1 3,3 pos.

KS 13 199542807 405 5 2,9 pos.

KS 14 199542808 152 12 2,8 pos.

KS 15 199542810 142 1 5,6 pos.

KS 16 199542803 59 1 4,7 pos.

KS 17 199542809 30 2 3,2 pos.

überw. Pop. 18 200828201 2995 104 neg.

überw. Pop. 19 200847803 1796 54 neg.

überw. Pop. 20 200609501 1402 17 neg.

überw. Pop. 21 200749902 586 13 neg.

überw. Pop. 22 200746301 251 331 neg.

überw. Pop. 23 200903404 57 160 neg.


Zoohandlungstiergruppen Alle Gruppen hatten mit beiden Seren ein jeweils ein ein-

heitli hes Ergebnis (Tab. 6.146). Vier Gruppen waren in der MHVNMS und in den

beiden Referenztests positiv. Zwei dieser Gruppen waren au h mit RCVNMSpositiv.

Hier zeigte si h die Funktionsfähigkeit beider Antigene. Besonders deutli h zeigte si h

aber au h die verminderte Sensitivität von RCVNC.

345

6. Ergebnisse

Tabelle 6.146. Antikörper gegen MHV und RCV in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

MHVN RCVN MHV/RCVN MHV

MS MS CRELISA IFA


A 1 201059101 161 41 neg. neg.

A 2 201059102 83 95 neg. neg.

B 3 201059201 77 22 neg. neg.

B 4 201059202 34 16 neg. neg.

C 5 201059301 1296 60 9,5 pos.

C 6 201059302 5251 13 14,7 pos.

D 7 201059401 92 25 neg. neg.

D 8 201059402 62 25 neg. neg.

E 9 201059501 7239 16 6,0 pos.

E 10 201059502 1930 96 3,2 pos.

F 11 201059601 11778 1232 20,4 pos.

F 12 201059602 12659 410 18,4 pos.

G 13 201059701 8094 269 16,6 pos.

G 14 201059702 7121 204 12,2 pos.


Fazit Die MS für Coronaviren bei der Ratte war weniger sensitiv als die Referenz-

tests. Als Su htest ist die MS daher nur bedingt geeignet. Von den beiden entwi kelten

Antigenen eignet si h wegen der gröÿeren Sensitivität das MHVN deutli h besser als

das RCVNAntigen. Das RCVN hat eine Sequenzidentität mit MHVN von 92,8% auf

ASEbene. Warum genau die Sensitivität so viel geringer ist, wurde ni ht ergründet.

346



PVM Es stehen als Su htest der HAH und als Bestätigungstest der

PVMCRVirionELISA zur Verfügung.

Es wurden vier Referenzseren, 23 CRELISApositive und 20 CRELISAnegative Seren

verwendet.

Drei Referenzseren reagierten mit hohen bis sehr hohen MFI-Werten mit dem

PVMNAntigen (MW 6766MFI, SD 5376) (Tab. 6.147).

Tabelle 6.147. Reaktivitäten von PVMReferenzseren in der PVMMS

Herkunft Serum ID PVMNMS [MFI

DKFZ X7-9 2837

CR PVM"high" 12893

A lad PVM 4568

Die Titration eines weiteren Referenzserums bei CR in Wilmington zeigte den Endpunkt

bei einer Verdünnung von 1 : 2 000 000 (EC

50

1 : 15 000) (Abb. 6.109).

347

6. Ergebnisse

101 102 103 104 105 106 107 108

1

10

100

1000

10000

100000

Verdünnung[1

x

]

PV

MN

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.109. Titration eines weiteren PVMReferenzserums (S 689)

Die PVMNMSKlassikation (Cut-o 100MFI) stimmte wenig mit der Klassikation

dur h den CRELISA überein (Abb. 6.110). Au h hier wurden Seren, die in der MS

auällig waren, mit dem PVMCRVirionELISA na hgetestet und ossen dadur h erst

in den Verglei h ein. Deshalb ers hien hier die Spezität der PVMNMS niedrig. Posi-

tiv klassizierte Seren wurden in der MS mit MFI-Werten von > 1000 detektiert.

348


neg. pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch PVM CR Virion ELISA

PV

MN

MS

[MF

I]

Abbildung 6.110. PVMNMSReaktivitäten PVMCRVirionELISAnegativer (N=20) und


Die Korrelation zwis hen S ore- und MFI-Werten hatte einen Koezienten von (R2 =

0,54) und war statistis h signikant (p = 0,0003) (Abb. 6.111).

349

6. Ergebnisse

0 5 10 15 20 25

1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

23

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3


SeV

NM

S[M

FI]

Abbildung 6.111. PVMNMSReaktivitäten und ihre Korrelation zu

PVMCRVirionELISAS ore-Werten (N=19)

Im Verglei h von PVMNMS mit PVMCRVirionELISA lag die Sensitivität mit 100%

sehr ho h und die Spezität mit 50% sehr niedrig (Tab. 6.148). Die Übereinstimmung


350


Tabelle 6.148. PVMNMS im Verglei h mit PVMCRVirionELISA (N=43)

PVMCRVirionELISA Sens.: 100%

+ − Spez.: 50%

PVMNMS + 23 10 κ: 0,52

− 0 10 95% CI: 0,29 bis 0,75


148 Seren wurden mit dem HAH negativ getestet. Von diesen waren sieben Seren in der

MS fals h positiv (ni ht gezeigt). Dies entspri ht einer Spezität von nur 95%. HAH

positive Ergebnisse lagen ni ht vor.

Die diskordanten Seren waren fals h positiv, sowohl im Verglei h mit dem CRELISA

(N=8), als au h im Verglei h mit dem HAH (N=7). Zwölf von 15MFI-Werten lagen

dabei im mittleren Berei h (> 1000, < 10 000) (Tab. 6.149).

Tabelle 6.149. Diskordante Seren in der PVMMS (ohne Zoohandlungstiere)

# Serumgruppe Serum ID

PVMN PVM PVM

MS CRVirionELISA HAH

[MFI [Kl. [Kl.

1 KS 200947102 6937 neg.

2 KS KS 3/ Reihe 2/3 6120 neg.

3 KS 200515001 2451 neg.

4 KS 200940001 1481 neg.

5 KS P1995B92 1294 neg.

6 KS 1995P2 1148 neg.

7 KS 199511201 869 neg.

8 KS 199511101 797 neg.

9 überw. Pop. 200853602 3703 neg.

10 überw. Pop. 200954201 2348 neg.

11 überw. Pop. 200912901 2258 neg.

12 überw. Pop. 200707901 2099 neg.

13 überw. Pop. 200813602 1458 neg.

14 überw. Pop. 200737501 1457 neg.

15 überw. Pop. 200746301 556 neg.


351

6. Ergebnisse

Zoohandlungstiergruppen Au h unter den Zoohandlungstieren gab es keine

fals h negativen Seren im Verglei h mit dem CRELISA (Tab. 6.150). Die Übereinstim-

mung der Ergebnisse der beiden Seren der jeweiligen Gruppen untereinander war mit der

MS etwas höher. Die Seren Nr. 8 und 14 wurden vom CRELISA ni ht positiv klassi-

ziert. Eine Infektion beider Tiere einer Gruppe ist sehr wahrs heinli h, da die PVMNMS

beide Seren jeweils als positiv klassiziert hat. Ledigli h in GruppeC reagierte nur eines

von zwei Seren sowohl in der MS als au h im CRELISApositiv.


Gruppe # Serum ID

PVMN PVM

MS CRVirionELISA

[MFI [S ./Kl.

A 1 201059101 668 neg.

A 2 201059102 103 neg.

B 3 201059201 125 neg.

B 4 201059202 40 neg.

C 5 201059301 106 neg.

C 6 201059302 2632 3,5

D 7 201059401 4759 6,6

D 8 201059402 12214 neg.

E 9 201059501 4656 3,5

E 10 201059502 2221 5,2

F 11 201059601 7135 18,0

F 12 201059602 7889 17,6

G 13 201059701 7677 3,3

G 14 201059702 7789 neg.


Fazit Das PVMNAntigen war sehr sensitiv, aber etwas weniger spezis h. Für einen

Su htest ist es deshalb sehr gut geeignet. Es traten relativ viele fals h positive Seren mit

mittleren MFI-Werten in der überwa hten Population auf. Es könnte ein unbekanntes

kreuzreagierendes Virus dafür ursä hli h sein, wel hes von den anderen Tests ni ht er-

fasst wird. Der HAH, wel her als Su htest verwendet wurde, ist für seine hohe Spezität

bekannt. Dieser Test würde daher ähnli he Viren wahrs heinli h ni ht als positiv detek-

tieren. Au h hier bestünde die Mögli hkeit das Vorkommen eines genetis h verwandten

352


Virus über eine Su h-PCR zu überprüfen.

Sendai virus (SeV) Es standen als Su htest der SeV in-houseVirionELISA und als Be-

stätigungstest der SeVCRVirionELISA zur Verfügung.

Es wurden drei Referenzseren, zehn CRELISApositive, 22 CRELISAnegative, sieben

in-houseELISApositive und 165 in-houseELISAnegative Seren verwendet.

Zwei Referenzseren reagierten mit hohen bis sehr hohen MFI-Werten mit dem

SeVNAntigen (Tab. 6.151).

Tabelle 6.151. Reaktivitäten von SeVReferenzseren in der SeVMS

Herkunft Serum ID SeVN [MFI

A lad SeV 7866

CR SeV"high" 20350

Die Titration eines weiteren Referenzserums bei CR in Wilmington führte zu einem

Endpunkt bei einer Verdünnung von 1 : 40 000 000 (EC

50

1 : 45 000) (Abb. 6.112).

101 102 103 104 105 106 107 108

1

10

100

1000

10000

100000

Verdünnung[1

x

]

SeV

NM

S[M

FI]

Cut-off

Abbildung 6.112. Titration eines weiteren SeVReferenzserums (S 1094)

353

6. Ergebnisse

Die SeVNMSKlassikation (Cut-o 100MFI) de kte si h wenig mit der Klassikation

dur h den CRELISA (Abb. 6.113). Au h hier wurden Seren, die in der MS auällig wa-

ren, mit dem SeVCRVirionELISA na hgetestet und ossen deshalb erst in den Verglei h

mit ein. Aus diesem Grund ers hien hier die Spezität der SeVNMS niedrig.

neg. pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch SeV CR Virion ELISA

SeV

NM

S[M

FI]

Abbildung 6.113. SeVNMSReaktivitäten SeVCRVirionELISAnegativer (N=21) und


Die Korrelation zwis hen S ore- und MFI-Werten hatte einen Koezienten von (R2 =

0,46), war aber statistis h ni ht signikant (p = 0,0634) (Abb. 6.114).

354


0 5 10 15 20

1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

23

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3


SeV

NM

S[M

FI]

Abbildung 6.114. SeVNMSReaktivitäten und ihre Korrelation zu

SeVCRVirionELISAS ore-Werten (N=8)

Im Verglei h von SeVNMS mit SeVCRVirionELISA lag die Sensitivität der MS mit

100% sehr ho h und die Spezität mit 62% sehr niedrig (Tab. 6.152). Die Übereinstim-

mung war moderat (κ = 0,51).

355

6. Ergebnisse

Tabelle 6.152. SeVNMS im Verglei h mit SeVCRVirionELISA (N=32)

SeVCRVirionELISA Sens.: 100%

+ − Spez.: 62%

SeVNMS + 10 8 κ: 0,51

− 0 13 95% CI: 0,26 bis 0,77


Im Verglei h von SeVNMS mit SeV in-houseVirionELISA lag die Sensitivität der MS

mit 86% niedrig und die Spezität mit 97% ho h (Tab. 6.153). Die Übereinstimmung

war gut (κ = 0,65).

Tabelle 6.153. SeVNMS im Verglei h mit SeV in-houseVirionELISA (N=24)

SeV in-houseVirionELISA Sens.: 86%

+ − Spez.: 97%

SeVNMS + 6 5 κ: 0,65

− 1 160 95% CI: 0,39 bis 0,91

Übereinst.: gut

Die diskordanten Seren Nr. 1 bis 9 waren alle fals h positiv im Verglei h mit einem

Referenztest (Tab. 6.154). In vier Fällen wurde das positive MSErgebnis dur h den in-

houseVirionELISA bestätigt (Seren Nr. 5, 6, 8 und 9). Die MFI-Werte aller in der MS

fals h positiven Seren lagen im gering- bis mittelgradig erhöhten MFI-Berei h und

übers hritten 2500MFI ni ht. Ein Serum (Nr. 10) war im Verglei h zum in-houseELISA

fals h negativ, zeigte aber au h im CRELISA ein negatives Ergebnis.

356


Tabelle 6.154. Diskordante Seren in der SeVMS (ohne Zoohandlungstiere)


SeV N SeV SeV


[MFI [Kl. [Kl.

KS 1 Xblau 7-9 2149 neg.

KS 2 200850602 1271 neg.

überw. Pop. 3 200919701 1073 neg.

KS 4 199511201 387 neg.

KS 5 199501901 283 neg. pos.

KS 6 1995P2 262 neg. pos.

KS 7 199511901 225 neg.

KS 8 199502101 185 neg. pos.

KS 9 199511101 142 neg. pos.

KS 10 P1995B92 89 neg. pos.


Zoohandlungstiergruppen Unter den Zoohandlungstieren gab es nur zwei Seren, die

fals h positiv waren (Tab. 6.155; Nr. 1 und 3). Diese stammten ni ht aus der glei hen

Gruppe, lagen im niedrigen MFI-Berei h und wurden dur h keinen Referenztest bestä-

tigt. Eine tatsä hli h vorausgegangene SeV Infektion ist damit eher unwahrs heinli h.

357

6. Ergebnisse


Gruppe # Serum ID

SeVN SeV SeV


[MFI [Kl. [Kl.

A 1 201059101 305 neg. neg.

A 2 201059102 8 neg. neg.

B 3 201059201 252 neg. neg.

B 4 201059202 22 neg. neg.

C 5 201059301 46 neg. neg.

C 6 201059302 1 neg. neg.

D 7 201059401 10 neg. neg.

D 8 201059402 1 neg. neg.

E 9 201059501 1 neg. neg.

E 10 201059502 1 neg. neg.

F 11 201059601 1 neg. neg.

F 12 201059602 1 neg. neg.

G 13 201059701 1 neg. neg.

G 14 201059702 1 neg. neg.


Fazit Bei SeVN handelt es si h um ein sehr sensitives und spezis hes Antigen in der

MS, wel hes sehr gut als Su htest-Antigen geeignet ist. Insgesamt wurden drei Refe-

renzseren mit sehr hohen MFI-Werten erkannt. Es gab nur 1 fals h negatives Serum

(in-houseELISApos.), wel hes aber mit dem CRELISA als negativ bestätigt wurde.

358



Für LCMV standen die LCMVIFA und der LCMVNPCRELISA zur Verfügung.

Ein Referenzserum errei hte 19 772MFI in der LCMVNPMS.

Es wurden zwei Referenzseren, ein CRELISApositive und 17 CRELISAnegative Seren

verwendet.

Bei der Titration eines weiteren Referenzserums (S 1116) bei CR in Wilmington wurde

der Endpunkt bei 1 : 40 000 000 ni ht errei ht (EC

50

1 : 25 000) (Abb. 6.115).

101 102 103 104 105 106 107 108

1

10

100

1000

10000

100000

Verdünnung[1

x

]

LCM

VN

PM

S[M

FI]

Cut-off

Abbildung 6.115. Titration eines weiteren LCMVReferenzserums (S 1116)

Die Übereinstimmung der LCMVNPMSKlassikation mit der Klassikation dur h den

CRELISA konnte kaum beurteilt werden, da nur ein CRELISApositiv klassiziertes

Serum vorlag (Abb. 6.116). S ore-Werte zur Untersu hung einer Korrelation zu MFI-

Werten lagen ni ht vor.

359

6. Ergebnisse

neg. pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch LCMV NP CR ELISA

LCM

VN

PM

S[M

FI]

Abbildung 6.116. LCMVNPMSReaktivitäten LCMVNPCRELISAnegativer (N=17)


Für den Verglei h von LCMVNPMS mit LCMVNPCRELISA lagen zu wenige Se-

ren vor, um eine Beurteilung zuzulassen. Das Kondenzintervall ist hier sehr weit und

s hlieÿt eine sehr s hle hte Übereinstimmung ebenso ein, wie eine perfekte Übereinstim-

mung (Tab. 6.156).

360


Tabelle 6.156. LCMVNPMS im Verglei h mit LCMVNPCRELISA (N=18)

LCMVNCRELISA Sens.: 100%

+ − Spez.: 88%

LCMVNMS + 1 2 κ: 0,46

− 0 15 95% CI: -0,14 bis 1,05


Die zwei diskordanten Seren waren beide fals h positiv in der MS (Tab. 6.157). Ein

MFI-Wert lag sehr niedrig (525MFI bei einem Cut-o von 500MFI). Der andere Wert

lag im hohen MFI-Berei h und weist daher eher auf das tatsä hli he Vorhandensein von

Antikörpern gegen LCMV hin. Referenzseren von CR sind ni ht notwendigerweise nur

für das angegebene Virus positiv.

Tabelle 6.157. Diskordante Seren in der LCMVMS (ohne Zoohandlungstiere)


LCMVN LCMVN

MS CRELISA

[MFI [Kl.

KS 1 HTNVCR "high" 12426 neg.

KS 2 P1995B92 525 neg.


Zoohandlungstiergruppen Alle Zoohandlungstierseren waren mit den dur hgeführten

Tests negativ (Tab. 6.158).

361

6. Ergebnisse

Tabelle 6.158. Antikörper gegen LCMV in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

LCMVN LCMVN LCMV

MS CRELISA IFA

[MFI [Kl. [Kl.

A 1 201059101 119 neg. neg.

A 2 201059102 29 neg. neg.

B 3 201059201 21 neg. neg.

B 4 201059202 26 neg. neg.

C 5 201059301 39 neg. neg.

C 6 201059302 1 neg. neg.

D 7 201059401 30 neg. neg.

D 8 201059402 19 neg. neg.

E 9 201059501 1 neg. neg.

E 10 201059502 1 neg. neg.

F 11 201059601 1 neg. neg.

F 12 201059602 1 neg. neg.

G 13 201059701 1 neg. neg.

G 14 201059702 1 neg. neg.

Fazit Für eine aussagekräftige Validierung standen zu wenig positive Referenzseren zur

Verfügung. Es gab keine fals h negativen Seren, dafür aber ein fals h positives mit

einem sehr hohen MFI. Aufgrund der Höhe des MFI-Wertes ist es wahrs heinli h, dass es

si h um eine sensitive Reaktion in der MS mit LCMVAntikörpern handelte. Die Ratte

wird zwar ni ht auf natürli he Weise dur h LCMV inziert, es handelte si h hier aber um

ein Serum, wel hes bei CR dur h experimentelle Infektion (min. mit HTNV) hergestellt

wurde. In der MS elen häug mehrfa he Positivitäten für sol he Seren auf, die au h

zum Teil mit dem entspre henden CRELISA bestätigt werden konnten (ni ht gezeigt).

Es ist also dur haus mögli h, dass au h eine LCMVInfektion stattfand, die Antikörper

aber ni ht mit dem CRELISA detektierbar waren.

362


Murine Hantaviren

Als Referenztest stand der HTNVNCRELISA zur Verfügung.

Es wurden zwei Referenzseren, zwei CRELISApositive und 18 CRELISAnegative Seren

verwendet.

Die zwei Referenzseren für HTNV zeigten für alle HantavirusAntigene hohe bis sehr

hohe MFI-Werte (Tab. 6.159, Abb. 6.117). Die MFI-Werte für das SEOVNMSAntigen

lagen in beiden Fällen am hö hsten, aber ebenso wie die Werte für HTNV nahe dem

Sättigungsberei h. Werte um 20 000MFI sind das beoba htete Maximum in der MS für

Maus und Ratte (ni ht gezeigt).

Tabelle 6.159. Reaktivitäten von einem HTNVReferenzserum in der HTNV-, PUUV- und

SEOVMS

Herkunft Serum ID HTNVNMS [MFI PUUVNMS [MFI SEOVNMS [MFI

CR HTNV"high" 19711 5501 22234

Die Titration eines weiteren Referenzserums bei CR in Wilmington ergab Endpunkte

für PUUVN bei 1 : 20 000 (EC

50

1 : 100), für SEOVN bei 1 : 10 000 000 (EC

50

1 : 8000)

und für HTNVN bei 1 : 30 000 000 (EC

50

1 : 10 000) (Abb. 6.117).

363

6. Ergebnisse

101 102 103 104 105 106 107 108

1

10

100

1000

10000

100000

HTNV N

PUUV N

SEOV N

Verdünnung[1

x

]

Han

tavi

rus

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.117. Titration eines weiteren HTNVReferenzserums (S 1041)

Kreuzreaktionen Die Daten zur Analyse der Kreuzreaktionen wurden bereits bei der

Validierung für die Maus dargestellt (siehe 6.5.2, S. 257). Die SEOVNMS wird aufgrund

der Ergebnisse der Validierung für die Maus (und weiterer Spezies) für den weiteren Ver-

glei h mit Referenztests auÿen vor gelassen. Es gab keine Hinweise, dass si h die Dia-

gnostik mit Hilfe dieses Antigens verbessern lieÿe. In der mikrobiologis hen Diagnostik

wurde bisher ni ht regelmäÿig auf Hantavirusinfektionen untersu ht, daher lagen für die

überwa hte Population keine Ergebnisse vor.

Die mit dem HTNVNCRELISAklassizierten Seren stellten si h au h in der Höhe

ihrer MFI-Werte unters hiedli h dar (Abb. 6.118). Die sehr hohen MFI-Werte wurden

bei Seren gemessen, die au h im CRELISA positiv reagiert hatten. Allerdings waren

mit der HTNVNMS trotz des hohen Cut-os von 500MFI immer no h a ht Seren

fals h positiv. Eines von diesen a ht Seren hatte einen sehr hohen MFI-Wert von >

10 000.

364


neg. pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off


HT

NV

NM

S[M

FI]

Abbildung 6.118. HTNVNMSReaktivitäten HTNVNCRELISAnegativer (N=18) und


Im analogen Verglei h mit der PUUVNMS zeigten si h insgesamt niedrigere MFI-Werte

und nur zwei von 18 negativen Seren fals h positiv (Abb. 6.119).

365

6. Ergebnisse

neg. pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off


PU

UV

NM

S[M

FI]

Abbildung 6.119. PUUVNMSReaktivitäten HTNVNCRELISAnegativer (N=18) und


Im Verglei h von HTNVNMS mit HTNVNCRELISA lag die Sensitivität mit 100%


war s hle ht (κ = 0,20).

366


Tabelle 6.160. HTNVNMS im Verglei h mit dem HTNVNCRELISA (N=20)

HTNVCRELISA Sens.: 100%

+ − Spez.: 56%

HTNVNMS + 2 8 κ: 0,20

− 0 10 95% CI: -0,06 bis 0,46


Im Verglei h von PUUVNMS mit HTNVNCRELISA lag die Sensitivität mit 100%

sehr ho h und die Spezität mit 89% niedrig (Tab. 6.161). Die Übereinstimmung war

gut (κ = 0,62).

Tabelle 6.161. PUUVNMS im Verglei h mit dem HTNVNCRELISA (N=20)


+ − Spez.: 89%

PUUVNMS

+ 2 2 κ: 0,62

− 0 16 95% CI: 0,15 bis 1,08

Übereinst.: gut

Es gab nur fals h positive Seren in der MS (Tab. 6.162). Die MFI-Werte rei hten von

gering- bis ho hgradig (868 bis 22 920MFI) erhöht. Die Seren stammten alle aus der

Gruppe der Kontrollseren.

Tabelle 6.162. Diskordante Seren in der HantavirusMS (ohne Zoohandlungstiere)


HTNVN PUUVN HTNVN

MS MS CRELISA

[MFI [MFI [Kl.

KS 1 KS5/Reihe8/5+6 22920 386 neg.

KS 2 199734701 2480 2935 neg.

KS 3 200823908 1560 51 neg.

KS 4 200914108 868 1663 neg.


367

6. Ergebnisse

Zoohandlungstiergruppen Aus der Gruppe der Zoohandlungstiere zeigten si h vier

Seren als fals h positiv in der MS (Tab. 6.163; Nr.2, 6, 8 und 9). Hier lagen die MFI-

Werte jedo h im niedrigen bis mittleren MFI-Berei h (520 bis 1232MFI). Das PU-

UVNAntigen reagierte in keinem der Fälle über Cut-o (500MFI). Auÿerdem wurde das

positive Ergebnis in keinem der Fälle mit dem anderen Serum der Gruppe bestätigt.

Tabelle 6.163. Antikörper gegen Hantaviren in Zoohandlungstiergruppen

Gruppe # Serum ID

PUUVN HTNVN HTNVN

MS MS CRELISA

[MFI [MFI [Kl.

A 1 201059101 108 187 neg.

A 2 201059102 160 1232 neg.

B 3 201059201 122 139 neg.

B 4 201059202 245 71 neg.

C 5 201059301 46 57 neg.

C 6 201059302 1 520 neg.

D 7 201059401 63 358 neg.

D 8 201059402 231 1033 neg.

E 9 201059501 1 771 neg.

E 10 201059502 1 16 neg.

F 11 201059601 1 1 neg.

F 12 201059602 1 1 neg.

G 13 201059701 1 1 neg.

G 14 201059702 1 1 neg.


Fazit Die HantavirusMS mit PUUVN und HTNVN bei der Ratte funktionierte, da

zwei positive Referenzseren erkannt wurden. Eine Aussage zur Sensitivität des Antigens

lieÿ si h jedo h ni ht treen, da zu wenig Referenzseren vorlagen. Als Antigen für einen

Su htest ist es zumindest unter Vorbehalt geeignet, da viele Seren von anderen Spe-

zies erkannt wurden. Die Spezität war für die PUUVNMS deutli h besser. Da aber

ni ht immer mit einer ausrei henden Kreuzreaktion der beiden Serotypen zu re hnen

ist, sollten immer beide Antigene parallel als Su htest eingesetzt werden.

368


Murine Reoviren

Für die Ratte stand zur Validierung der ReoCRVirionELISA zur Verfügung.

Es wurden drei Referenzseren, fünf CRELISApositive und 24 CRELISAnegative Seren

verwendet. Auÿerdem stand eine Konversionsstudie mit 24 Seren zur Verfügung.

Drei Referenzseren für Reo zeigten hohe bis sehr hohe MFI-Werte (MW 11 562MFI, SD

3336) (Tab. 6.164).

Tabelle 6.164. Reaktivitäten von ReoReferenzseren in der ReoMS

Herkunft Serum ID Reo Sigma1MS [MFI

DKFZ X1984 13 14907

CR Reo "high" 11545

A lad Reo 8234

Bei der Titration eines Referenzserums wurde der Endpunkt bei 1 : 1 000 000 ni ht er-

rei ht (EC

50

1 : 3000) (Abb. 6.120).

101 102 103 104 105 106 107

1

10

100

1000

10000

100000

Verdünnung[1

x

]

Reo

Sig

ma1

MS

[MF

I]

Cut-off

Abbildung 6.120. Titration des ReoReferenzserums X1984 13

369

6. Ergebnisse

In einer Serokonversionsstudie mit 24 Ratten zeigte si h am 10.DPI eine Konversion bei

drei von vier Seren (Abb. 6.121). Eines lag genau beim Cut-o. Am 14.DPI waren alle

Seren oberhalb des Cut-o und errei hten ab dem 28.DPI einheitli h hohe MFI-Werte

um 10 000.

0 7 10 14 28 351

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

DPI

Reo

Sig

ma1

MS

[MF

I]

Abbildung 6.121. Serokonversionsstudie Reo inzierter Ratten in der Reo Sigma1MS

(N=24)

Die im ReoCRVirionELISA unters hiedli h klassizierten Seren unters hieden si h au h

in ihren MFI-Werten (Cut-o 212). Es gab elf Seren, die negativ mit dem CR klas-

siziert wurden, aber in der MS positiv waren. Von diesen zeigten fünf hohe MFI-

Werte (> 1000) (Abb. 6.122). Au h hier wurden Seren, die in der MS auällig waren,

mit dem ReoCRVirionELISA na hgetestet. Deshalb ers heint hier die Spezität der

Reo Sigma1MS niedrig.

370


neg. Grauzone pos.1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

Klassifikation durch Reo CR Virion ELISA

Reo

Sig

ma1

MS

[MF

I]

Abbildung 6.122. Reo Sigma1MSReaktivitäten ReoCRVirionELISAnegativer (N=24),

in der Grauzone liegender (N=2) und -positiver Seren (N=5)

Die Korrelation zwis hen S ore- und MFI-Werten zeigte si h sehr stark und signikant

mit einem Koezienten von R2 = 0, 98 bei p < 0, 0001 (Abb. 6.123).

371

6. Ergebnisse

0 5 10 15 20 25

1

10

100

1000

10000

100000

Cut-off

23

Gra

uzon

ezw

isch

enS

core

2un

d3

Reo CR Virion ELISA [Score]

Reo

Sig

ma1

MS

[MF

I]

Abbildung 6.123. Reo Sigma1MSReaktivitäten und ihre Korrelation zu

ReoCRVirionELISAS ore-Werten (N=7)

Im Verglei h von Reo Sigma1MS mit ReoCRVirionELISA lag die Sensitivität mit 100%



372


Tabelle 6.165. Reo Sigma1 MS im Verglei h mit Reo CR Virion ELISA (N=29)


+ − Spez.: 54%

Reo Sigma1MS + 5 11 κ: 0,29

− 0 13 95% CI: 0,06 bis 0,52


Alle zehn diskordanten Seren waren in der MS fals h positiv (Tab. 6.166). Seren Nr. 1

bis 5 zeigten mittel-, Seren se hs bis zehn geringgradig erhöhte MFI-Werte. Die Ne-

gativität wurde in se hs Fällen (je drei mittlere und niedrige MFI-Werte) dur h den

Reo in-houseVirionELISA bestätigt. Bei allen fals h positiven Seren handelte es si h

um Kontrollseren.

Tabelle 6.166. Diskordante Seren in der ReoMS (ohne Zoohandlungstiere)


Reo Sigma1 Reo Reo


[MFI [Kl. [Kl.

KS 1 199922305 8484 neg.

KS 2 199511301 3866 neg. neg.

KS 3 199511201 3361 neg. neg.

KS 4 199503101 2813 neg.

KS 5 199511901 2036 neg. neg.

KS 6 P1995B92 535 neg. neg.

KS 7 1995P2 535 neg. neg.

KS 8 200914108 409 neg.

KS 9 199511202 385 neg. neg.

KS 10 200515003 385 neg.


Zoohandlungstiergruppen

Unter den Zoohandlungstieren gab es nur ein Serum, wel hes einen lei ht erhöhten MFI-

Wert (559) hatte (Tab. 6.167). Alle Seren waren negativ im ReoCRVirionELISA.

373

6. Ergebnisse


Gruppe # Serum ID

Reo Sigma1 Reo

MS CRVirionELISA

[MFI [Kl.

A 1 201059101 97 neg.

A 2 201059102 559 neg.

B 3 201059201 48 neg.

B 4 201059202 37 neg.

C 5 201059301 68 neg.

C 6 201059302 1 neg.

D 7 201059401 50 neg.

D 8 201059402 96 neg.

E 9 201059501 1 neg.

E 10 201059502 1 neg.

F 11 201059601 1 neg.

F 12 201059602 1 neg.

G 13 201059701 1 neg.

G 14 201059702 1 neg.


Fazit

Eine zuverlässige Detektion von Reovirusantikörpern in Rattenseren ist gegeben. Vier

Referenzseren wurden mit hohen bis sehr hohen MFI-Werten erkannt. Der Ausbru h

einer Infektion ist zwis hen dem 10. und dem 14.DPI na h Infektion in Abhängigkeit

von der Probenzahl zuverlässig mögli h. Die MS mit Sigma1 ist daher als Su htest gut

geeignet.

Rotavirus A RotavirusA kommt bei der Ratte ni ht vor. Eine Kreuzreaktion mit dem

Rotavirus der Ratte dem RotavirusB ist unwahrs heinli h, da sie unters hiedli hen

Serogruppen angehören.

Es gibt keine Referenztests für RotavirusA bei der Ratte.

374


Drei Seren zeigten MFI-Werte > 300. Zwei davon stammten aus der überwa hten Po-

pulation und eines aus der Gruppe der Kontrollseren (Tab. 6.168). Die MFI-Werte lagen

im niedrigen bis mittleren Berei h (max. 6364MFI).

Tabelle 6.168. MFI-Werte > 300 für RotaA


RotaAVP6

MS

[MFI

1 200823904 KS 6364

2 201040001 überw. Pop. 1120

3 200805006 überw. Pop. 306

Die Seren der Zoohandlungstiere errei hten maximal 53MFI.

Fazit Es wurden nur drei erhöhte MFI-Werte für RotaA bei 303 untersu hten Ratten-

seren festgestellt. Der Grund könnte ein serologis h verwandtes virales Agens sein. Das

ist aber nur für das KS wahrs heinli h, da der MFI-Wert mit > 6000 relativ ho h liegt.

Bei den beiden niedrigeren Werten aus der überwa hten Population ist eine unspezis he

Reaktion wahrs heinli her. Eine Eignung als Su htest konnte ni ht beurteilt werden.

375

7. Diskussion

Innerhalb dieser interdisziplinären Arbeit, die am DKFZ in sowohl der mikrobiologi-

s hen Diagnostik als au h der molekularen Tumorvirologie unter Kollaboration mit

CR angefertigt wurde, sollte ein umfassender Su htest für alle bekannten und eradi-

zierbaren Viruserkrankungen bei Maus und Ratte als Multiplex-Serologie entwi kelt

werden. Die MS sollte umgehend im Diagnostiklabor (mikrobiologis he Diagnostik des

DKFZ) etabliert werden, um dort mit relativ geringem materiellen und personellen Auf-

wand die erste Instanz als Su htest für das Health monitoring des Nagerbestands des

DKFZs darzustellen. Dieses Ziel wurde für 16 Viren bei der Maus und a ht Viren bei

der Ratte errei ht. Gegen Ende der experimentellen Validierungsarbeit wurde Kontakt

zu Rajeev Dhawan (Dire tor, Diagnosti Reagents, Resear hAnimalDiagnosti Servi es,

CharlesRiver,Wilmington (MA,USA)) aufgenommen. Dur h die freundli he Erlaubnis,

Serokonversionsstudien in Wilmington zu testen, konnte die Validierung der MS für ei-

nige Viren aussagekräftiger gestaltet werden. Diese Mögli hkeit war besonders wertvoll,

da positive Seren für viele Viren s hwer erhältli h sind, was die Mögli hkeiten der Va-

lidierung eins hränkt. Auÿerdem wurde dur h den komplikationslosen Transfer der MS

in die USA die grundsätzli he Robustheit des Systems gezeigt.

7.1. Quantitative Charakterisierung der Antigene

Die Qualitätskontrolle der Antigene mittels Anti-tag Titration vermittelt einen Eindru k

vom relativen Anteil von volle-LängeProtein im Verhältnis zu Bru hstü ken im Lysat.

Ist nur eine niedrige oder gar keine tag-Reaktivität vorhanden, so kann dies vers hiedene

Gründe haben:

• Fehler in der Klonierung wie beispielsweise die Vers hiebung des Leserasters kön-

nen dazu führen, dass kein tag im Protein vorhanden ist. Dies wäre dur h die

vorausgehende Sequenzierung s hon überprüft worden.

377

7. Diskussion

• Eine proteolytis he Aktivität sollte dur h die Zugabe des Proteaseinhibitors stark

einges hränkt sein. Na h einer Spaltung würde der -Terminus ni ht mehr an die

feste Phase gebunden, da er ni ht mehr mit dem GST assoziiert ist.

• Dur h die Tertiärstruktur kann das tag im Inneren des Proteins liegen und ist

deshalb für den Maus-anti-tag Antikörper ni ht zugängli h.

• Bei sehr groÿen Proteinen kann es insbes. dazu kommen, dass ni ht die gesamte

Proteinsequenz korrekt exprimiert wird und damit das -terminale tag fehlt.

• Wenn die Proteine toxis h für die exprimierenden Bakterien sind, wird insgesamt

wenig Protein hergestellt und dementspre hend ist au h wenig bis kein tag na h-

weisbar.

• Das Protein kann auÿerdem s hle ht in Lösung gehen, wenn es zu viele hydrophobe

Bestandteile enthält.

Au h Proteine, die in der Anti-tag Titration einen relativ geringen Anteil am Gesamt-

protein im Lysat gezeigt haben, konnten sensitive MSAntigene sein (z. B. VACVp35).

Andererseits konnte mit einem Signal in der Anti-tag Titration ein Fehler in der Klo-

nierung (beispielsweise ein Frameshift) ausges hlossen werden. Das Protein lag unter

ähnli hen Bedingungen vor wie in der MS. Das Ergebnis der Anti-tag Titration ent-

spri ht daher mehr dem Zustand in der MS als beispielsweise das Ergebnis des Wes-

ternBlots, für den methodis h bedingt eine starke Denaturierung der Proteine vorliegt.

Liegt eine dem GST-tag Lysat ähnli he Kurve für das Protein von Interesse vor, kann

davon ausgegangen werden, dass die mögli he Bindung von volle-LängeProtein an die

Beads ausrei hend ist. In den einzelnen MSVersu hen wird dies no h einmal über die

Beladungskontrolle mit dem Maus Anti-tag Antikörper überprüft.

7.2. Antikörperreaktivität in nicht exponierten Tieren —

Cut-off Ableitung

Es ist notwendig, für die Routineanwendung einen Cut-o zu ermitteln, der unabhängig

von etwaigen S hwankungen im System seine Gültigkeit behält. Der Umfang der Rou-

tineanwendung umfasst wö hentli h a. 50-150 Seren. Im Infektionsfall ist davon auszu-

gehen, dass die Seren von den ersten betroenen Tieren höhere MFI-Werte zeigen als

378

7.3. Validierung für die Maus

der negative Rest der Population. Daher wird eine konstante Sensitivität gewahrt, wenn

jeweils die beiden am hö hsten reaktiven Seren pro Platte mit einem Referenztest na h-

getestet werden. Auf diese Weise wird eine hohe Si herheit errei ht. Zusätzli h zu dieser

Maÿname sind bereits na h der Übergabe der MS an die diagnostis he Routine nied-

rig positivKontrollen für die einzelnen Viren etabliert worden. Diese Kontrollseren sind

so verdünnt, dass sie im Berei h von 500 bis 800MFI liegen. Wird eine sol he Kontrolle

einmal ni ht detektiert oder nimmt ihr MFI-Wert rapide ab, so sind au h die restli hen

Ergebnisse für dieses Virus ni ht verwertbar und der Test muss wiederholt werden.

Da die Bere hnung des Cut-os in dieser Arbeit darauf basiert, dass eine Spezität von

98% innerhalb einer hö hstwahrs heinli h ni ht inzierten Population (überwa hte Po-

pulation) errei ht werden soll, ist der Cut-o au h ein Maÿ dafür, wie spezis h ein

Lysat in der Erkennung von Antikörpern ist. Die überwa hte Population, die der Be-

stimmung des Cut-os zugrunde lag, ist mit einer sehr hohen Wahrs heinli hkeit frei

von Antikörpern gegen die Viren, die in den Assay integriert sind, oder Viren, die mit

diesen kreuzreagieren. Die Tiere werden hinter physikalis hen Barrieren gehalten, die ei-

ne Neuinfektion unwahrs heinli h ma hen. Aufgebaut werden sol he Barrieren über Em-

bryotransfer, worüber die meisten Erreger zuverlässig eliminiert werden können. Deshalb

sind erhöhte MFI-Werte in der überwa hten Population anzunehmen als das Resultat

unspezis her Reaktionen mit dem viralen Antigen. Trotzdessen werden sol he Seren

natürli h immer mit Referenztests überprüft. Unspezis he Reaktionen gegen E. oli

werden dur h die Vorinkubation mit GST-tag lysathaltigem Vorinkubationspuer abge-

fangen (E. oli kommt häug in überwa hten Populationen vor). Je niedriger der bere h-

nete Cut-o liegt, desto spezis her ist das Antigen. Die erre hneten Cut-os für den

Ratten-Assay sind deutli h höher als die für den Mäuse-Assay.

7.3. Validierung für die Maus

Viele Seren konnten wegen ni ht ausrei henden Serumvolumens ni ht mehrfa h getestet

werden. Unerwartete Ergebnisse konnten in diesen Fällen also ni ht überprüft werden.

In Routineuntersu hungen sind mehrfa he Überprüfungen von unerwarteten Ergebnissen

mit allen zur Verfügung stehenden Tests und au h die Überprüfung dur h weitere Labors

selbstverständli h. Ein positives Ergebnis sollte abgesi hert sein, da die Konsequenzen

379

7. Diskussion

für die Tierhaltung weitrei hend sind. Der S haden ist in Abhängigkeit von der Gröÿe

der betroenen hygienis hen Einheit unters hiedli h groÿ.

Die Zusammenfassung aller Vierfeldertafeln für die Maus zeigt in Abhängigkeit von Re-

ferenztest und der Anzahl der getesteten Seren für die meisten Viren hohe Sensitivitäten

(Tab. 7.1). Da beim Testen der überwa hten Population die Spezität auf min. 98% fest-

gelegt wurde, sind alle darunter liegenden Spezitätswerte den Kontrollseren ges huldet,

deren Serostatus für die einzelnen Antigene nur dur h Referenztests, ni ht aber dur h

ho hgradig kontrollierte Haltungsbedingungen deniert ist. Hier kann z. B. dur h eine

höhere Sensitivität der MS im Verglei h zum Referenztest die erre hnete Spezität sin-

ken. Es wäre aber au h denkbar, dass diese Seren dur h andere hygienis he Bedingungen

der Tierhaltung, eine Tendenz zu unspezis hen serologis hen Reaktionen zeigen. An

dieser Stelle ist mit unspezis h gemeint, dass dur h Beeinussung des Immunsystems

zwar messbare interagierende Proteine produziert wurden, diese si h aber ni ht spezi-

s h gegen das Virus ri hten. Diese These könnte dur h eine Was hung der bereits mit

Serum inkubierten Beads mit Harnsto überprüft werden. Der Harnsto denaturiert vor-

übergehend die Antikörper, sodass die Bindung ni ht perfekt auf das Antigen passender

Antikörper gelöst wird, und diese weggewas hen werden können.

Von den 18 Viren, die natürli he Infektionen bei der Maus verursa hen können, wurde

für 16 Viren gezeigt, dass die verwendeten Antigene bei Einsatz in der MS als Su htest

geeignet sind (Tab. 7.1). Hantaviren verursa hen zwar na h dem aktuellen Kenntnis-

stand keine natürli hen Infektionen bei der Maus, die serologis he Untersu hung von

Versu htierbeständen ist aber wegen des zoonotis hen Potentials von der FELSA emp-

fohlen (NICKLAS et al. 2002). Hierfür konnte mit Seren von anderen Spezies (Apodemus

spe ., Myodes spe . und Homo sapiens) die zuverlässige Funktion gezeigt werden. Die

MS für MuHV-4 konnte ni ht validiert werden, weil keine Referenzseren und Kontrollse-

ren (in Referenztests positiv) vorlagen. Ähnli hes gilt für EMCV. Hier lag nur ein Serum

vor, wel hes zwar in der MS positiv war, zur Sensitivität kann aber auf dieser Grundlage

keine Aussage gema ht werden. Die MS für TMEV ist wegen geringer Sensitivität und

dem Ni hterkennen von Referenzseren als Su htest ni ht geeignet.

380

7.3.ValidierungfürdieMaus

Tabelle 7.1. Eignung der vers hiedenen MSAntigene als Su htest für die Maus

zu

bew

ertender

Test

Referenztest

Ref.T

est

+

MS

+

Sensitivität

Ref.T

est

−

MS

−

Sp

ezi

tät

κ 95%

CI

Virus

natürli he

Infekti-

on

bei

der

Maus

[ja/nein

Geeignet

als

Su htest

für

die

Maus

[ja/nein/keine

Aussage

PolyomaVP1MS PolyomaVP1CRELISA 9 7 78% 41 32 78% 0,43 0,16 bis 0,70 Polyoma ja ja

PolyomaVP1MS PolyomaHAH 4 4 100% 297 295 99% 0,80 0,52 bis 1,07

K-VirusVP1MS K-VirusVP1CRELISA 9 9 100% 41 37 90% 0,77 0,56 bis 0,98 K-Virus ja ja

K-VirusVP1MS K-VirusVP1HAH 1 1 100% 331 328 99% 0,40 -0,15 bis 0,94

MAdV-1Fib.MS MAdV-1/2 CRVirionELISA 26 7 27% 27 23 85% 0,12 -0,10 bis 0,34 MAdV-1 ja ja

*

MAdV-1Fib./Hex.MS MAdV-1/2 CRVirionELISA 26 22 85% 27 11 41% 0,25 0,02 bis 0,48

MAdV-1Fib./Hex.MS MAdV-1/2 CRVirionELISA 26 22 85% 27 11 41% 0,23 -0,00 bis 0,45

MAdV-1Fib. MS MAdV-1 IFA 3 3 100% 334 330 99% 0,60 0,23 bis 0,96

MAdV-1 Hex. MS MAdV-1 IFA 3 3 100% 334 311 93% 0,19 0,01 bis 0,38

MAdV-1Fib./Hex.MS MAdV-1 IFA 3 3 100% 334 307 92% 0,17 0,00 bis 0,34

MuHV-1UL55MS MuHV-1CRVirionELISA 8 8 100% 38 35 92% 0,80 0,59 bis 1,01 MuHV-1 ja ja

MuHV-4 ja keine Aussage

VACVmaj. env.MS ECTVCRVirionELISA 6 6 100% 41 39 95% 0,83 0,61 bis 1,06 VACV ja1 ja

VACVp35MS ECTVCRVirionELISA 6 6 100% 41 40 98% 0,91 0,74 bis 1,08

VACVmaj. env.MS VACVIFA 4 3 75% 38 38 100% 0,84 0,55 bis 1,14

VACVp35MS VACVIFA 4 3 75% 38 37 97% 0,72 0,36 bis 1,09

KRVNS1MS KRVNS1CRELISA 44 44 100% 41 9 22% 0,23 0,09 bis 0,36

MVMNS1MS KRVNS1CRELISA 44 40 91% 41 28 68% 0,60 0,43 bis 0,76

RPVNS1MS KRVNS1CRELISA 44 44 100% 41 13 32% 0,33 0,17 bis 0,48

MVMVP2MS MVMVP2CRELISA 31 29 94% 19 9 47% 0,45 0,20 bis 0,70 MVM ja ja

*

MPV-1VP2MS MPV-1/2VP2CRELISA 58 52 90% 237 233 98% 0,89 0,83 bis 0,96 MPV ja ja

*

MPV-2VP2MS MPV-1/2VP2CRELISA 58 52 90% 237 236 100% 0,92 0,87 bis 0,98

MPV-1/2VP2MS MPV-1/2VP2CRELISA 58 55 95% 237 233 98% 0,93 0,87 bis 0,98

KRVNS1,

MPV-1/2VP2,

MVMVP2MS

KRVNS1,

MPV-

1/2VP2,

MVMVP2CRELISA

73 72 99% 9 9 100% 0,94 0,83 bis 1,06

KRV nein

RPV nein

RMV nein

H-1PV nein

TMEV3ABCMS TMEVCRVirionELISA 26 9 35% 18 17 94% 0,26 0,05 bis 0,46 TMEV ja nein

TMEVVP1MS TMEVCRVirionELISA 26 18 69% 18 16 89% 0,55 0,32 bis 0,79

TMEV3ABC/VP1MS TMEVCRVirionELISA 26 21 81% 18 15 83% 0,63 0,40 bis 0,86

TMEV3ABCMS TMEVIFA 30 9 30% 317 308 97% 0,09 0,15 bis 0,51

TMEVVP1MS TMEV IFA 30 17 57% 317 314 99% 0,66 0,50 bis 0,81

TMEV3ABC/VP1MS TMEV IFA 30 20 67% 317 306 97% 0,62 0,47 bis 0,77

TMEV IFA TMEVCRVirionELISA 24 20 83% 15 11 73% 0,57 0,30 bis 0,83

EMCV ja keine Aussage

MNVVP1MS MNVVP1CRELISA 42 39 93% 26 19 73% 0,68 0,50 bis 0,86 MNV ja ja

MNVVP1MS MNVin-houseVirionELISA 13 13 100% 301 293 97% 0,75 0,59 bis 0,92

381

7.Diskussion

Tabelle 7.1. Eignung der vers hiedenen MSAntigene als Su htest für die Maus

zu

bew

ertender

Test

Referenztest

Ref.T

est

+

MS

+

Sensitivität

Ref.T

est

−

MS

−

Sp

ezi

tät

κ 95%

CI

Virus

natürli he

Infekti-

on

bei

der

Maus

[ja/nein

Geeignet

als

Su htest

für

die

Maus

[ja/nein/keine

Aussage

MNVVP1MS MNVIFA 6 5 83% 227 225 99% 0,76 0,50 bis 1,02

ratHEV nein

LDV ja ja

MHVNMS MHV/SDAVNCRELISA 93 93 100% 8 4 50% 0,65 0,33 bis 0,96 MHV ja ja

MHVNMS MHVIFA 67 66 99% 301 299 99% 0,97 0,94 bis 1,00

MHV IFA MHV/SDAVNCRELISA 48 46 96% 5 3 60% 0,56 0,17 bis 0,95

PVMNMS PVMCRVirionELISA 19 17 89% 35 29 83% 0,69 0,50 bis 0,89 PVM ja ja

SeVNMS SeV in-houseELISA 7 4 57% 334 322 96% 0,33 0,08 bis 0,58 SeV ja ja

SeVNMS SeVCRVirionELISA 5 4 80% 46 34 74% 0,27 0,02 bis 0,53

LCMVNPMS LCMVNPCRELISA 4 4 100% 44 37 84% 0,47 0,16 bis 0,78 LCMV ja ja

LCMVNPMS LCMVIFA 3 3 100% 339 328 97% 0,34 0,06 bis 0,63

LCMVIFA LCMVNPCRELISA 2 2 100% 42 42 100% 1,00 1,0 bis 1,0

HTNVNMS HTNVNCRELISA 2 2 100% 41 35 85% 0,35 -0,02 bis 0,72

SEOVNMS HTNVNCRELISA 2 2 100% 41 37 90% 0,46 0,04 bis 0,89 HTNV/SEOV

*

ja

*

PUUVNMS HTNVNCRELISA 2 0 0% 41 37 90% -0,07 -0,13 bis -0,00

HTNVNMS DOBVNFLIELISA 10 9 90% 10 10 100% 0,90 0,71 bis 1,09

PUUVNMS PUUVNFLIELISA 10 10 100% 10 10 100% 1,00 1,0 bis 1,0

Reo Sigma1MS ReoCRVirionELISA 5 5 100% 43 26 60% 0,24 -0,5 bis 0,43 Reo ja ja

Reo Sigma1MS Reo in-houseVirionELISA 15 10 67% 104 91 88% 0,44 0,23 bis 0,65

Reo Sigma1MS Reo IFA 12 8 67% 249 236 95% 0,45 0,24 bis 0,67

Reo in-houseVirionELISA ReoCRVirionELISA 2 2 100% 40 29 73% 0,20 -0,04 bis 0,45

RotaAVP6MS RotaAVP6CRELISA 18 17 94% 35 15 43% 0,30 0,11 bis 0,48 RotaA ja ja

RotaAVP6MS Bov. RotaA IFA 9 8 89% 334 306 92% 0,33 0,15 bis 0,50

Bov. RotaA IFA RotaAVP6CRELISA 12 1 8% 29 25 86% -0,05 -0,31 bis 0,22

Ref. Test: Referenztest

CI: Kondenzintervall

1

ni ht VACV selbst, aber kreuzreagierende Orthopoxviren

*

unter Bedingungen, die im jeweiligen Fazit ausgeführt wurden

382

7.4. Validierung für die Ratte

7.4. Validierung für die Ratte

Bei der Validierung der MS für die Ratte wurde für Viren, deren Vorkommen ni ht

oder nur sporadis h bei der Ratte bes hrieben wurde auÿer für die Parvoviren der

Maus, für die aufgrund von Kreuzreaktionen erhöhte MFI-Werte zu erwarten waren

ein Cut-o von 300MFI für die Betra htung auälliger Seren willkürli h festgelegt. Die-

se Vorgehensweise ers hien sinnvoll, na hdem auel, dass au h die MS mit Antigenen

für Viren, die eigentli h bei der Ratte ni ht vorkommen, zum Teil bis mittelgradig er-

höhte (1000 bis 10 000) MFI-Werte zeigten. Für das MNV wurde ein sol hes Phänomen

bereits bes hrieben (HSU 2009). Eine Virusisolation wurde aber bis heute ni ht publi-

ziert. Ebenso wurden mittelgradig erhöhte Werte für Polyomaviren gefunden. Es gibt

bis dato nur einen Hinweis in der Literatur auf Papovaviren bei der Ratte (WARD et al.

1984b). Diese beiden Beispiele zeigen, dass es wahrs heinli h ist, dass weitere Viren bei

der Ratte vorkommen, die no h ni ht bes hrieben wurden. Antikörper gegen diese Viren

zu nden, ist wiederum in den Seren am wahrs heinli hsten, die ni ht aus der über-

wa hten Population (ges hlossene Hygienis he Barriere, Aufbau dur h Embryotransfer)

stammten.

Es wurden für die Ratte MSAntigene für insgesamt 15 Viren validiert, deren Vorkommen

bei der Ratte bekannt ist (Tab. 7.2). Die MS für a ht Viren kann als Su htest eingesetzt

werden. Die beiden TMEVAntigene und MHVN ers hienen ni ht ausrei hend sensitiv,

und konventionelle Tests werden weiterhin empfohlen. Hier stimmen die Viren, die na-

türli he Infektionen bei der Ratte verursa hen, ni ht ganz mit den als Ausgangsmaterial

verwendeten Viren der Maus überein. (RTV: Sequenzidentität auf ASEbene mit den

verwendeten TMEV Antigenen 77,5% für 3ABC und 72,8% für VP1, RCV: Sequen-

zidentität auf ASEbene mit dem verwendeten MHV Antigen 92,8%). Für drei Viren

(VACV, EMCV und ratHEV) konnte aufgrund des Mangels von Referenzseren und/oder

Referenztests keine abs hlieÿende Validierung vorgenommen werden.

383

7.Diskussion

Tabelle 7.2. Eignung der vers hiedenen MSAntigene als Su htest für die Ratte

zu

bew

ertender

Test

Referenztest

Ref.T

est

+

MS

+

Sensitivität

Ref.T

est

−

MS

−

Sp

ezi

tät

κ 95%

CI

Virus

natürli he

Infekti-

on

bei

der

Ratte

[ja/nein

Geeignet

als

Su htest

für

die

Ratte

[ja/nein/keine

Aussage

Polyoma nein

*

K-Virus nein

*

MAdV-1Fib.MS MAdV-1 IFA 1 0 0% 148 147 99% -0,01 -0,02 bis 0,00 MAdV-1 nein

MAdV-1Hex.MS MAdV-1 IFA 1 1 100% 148 145 98% 0,39 -0,15 bis 0,93

MuHV-1 nein

MuHV-4 nein

VACV ja1 keine Aussage

MVM nein

MPV nein

KRVNS1MS KRVNS1CRELISA 27 24 89% 12 7 58% 0,50 0,20 bis 0,80 KRV ja ja

*

KRVVP2MS KRVVP2CRELISA 13 13 100% 10 9 90% 0,91 0,74 bis 1,08

RPVVP2MS RPVVP2CRELISA 12 6 50% 6 5 83% 0,28 -0.09 bis 0.64 RPV ja ja

*

RMVVP2MS RMVVP2CRELISA 29 19 66% 2 2 100% 0,20 -0.05 bis 0.44 RMV ja ja

*

H-1PVVP2MS H-1PVVP2CRELISA 23 23 100% 10 9 90% 0,93 -0.09 bis 0.64 H-1PV ja ja

*

TMEV3ABC/VP1MS TMEVCRVirionELISA 6 4 67% 15 10 67% 0,29 -0,11 bis 0,69 TMEV ja nein

TMEV IFA TMEVCRVirionELISA 4 4 100% 11 9 82% 0,71 0,34 bis 1,01

EMCV ja keine Aussage

MNV nein

*

rat HEV ja keine Aussage

LDV nein

MHVNMS RCV/MHVNCRELISA 27 24 89% 9 8 89% 0,72 0,47 bis 0,98 MHV ja nein

MHVNMS MHVIFA 17 12 71% 154 150 97% 0,70 0,51 bis 0,88

RCVNMS RCV/MHVNCRELISA 27 9 33% 9 9 100% 0,20 0,04 bis 0,36

RCVNMS MHVIFA 17 4 24% 154 152 99% 0,31 0,06 bis 0,56

PVMNMS PVMCRVirionELISA 23 23 100% 20 10 50% 0,52 0,29 bis 0,75 PVM ja ja

SeVNMS SeVCRVirionELISA 10 10 100% 21 13 62% 0,51 0,26 bis 0,77 SeV ja ja

SeVNMS SeV in-houseVirionELISA 7 6 86% 165 160 97% 0,65 0,39 bis 0,91

LCMVNMS LCMVNCRELISA 1 1 100% 17 15 88% 0,46 -0,14 bis 1,05 LCMV nein

HTNVNMS HTNVCRELISA 2 2 100% 18 10 56% 0,20 -0,06 bis 0,46 HTNV/SEOV ja ja

*

ReoSigma1MS ReoCRVirionELISA 5 5 100% 24 13 54% 0,29 0,06 bis 0,52 Reo ja ja

Reo Sigma1MS Reo in-houseVirionELISA 1 0 0% 15 7 47% -0,13 -0,36 bis 0,11

RotaA nein

Ref. Test: Referenztest

1

ni ht VACV selbst, aber kreuzreagierende Orthopoxviren

CI: Kondenzintervall

*

unter Bedingungen, die im jeweiligen Fazit ausgeführt wurden

384

7.5. Anwendung im routinemäÿigen Healthmonitoring

7.5. Anwendung im routinemäßigen Health monitoring

Die MS bietet den Vorteil, dass mit geringerem personellem und nanziellem Aufwand als

bei Verwendung von Einzeltests ein umfassendes serologis hes S reening dur hgeführt

werden kann. Die folgenden Zahlen vermitteln einen Eindru k vom Aufwand für die

MS.

• Ans haung eines Luminex-Analyzers a. 50000e

• Beads a. 0,04e pro Sorte und Serum

• Was hplatten 0,17e pro Serum

• Verbrau hsmaterial 0,18e pro Serum

Das Testen von 2000 Seren mit 20 Antigenen verursa ht insgesamt Materialkosten von

2300e, die Personalkosten liegen bei 9000e. Die Untersu hung könnte lei ht innerhalb

von einer Wo he dur hgeführt werden. An den hohen Personalkosten kann man sehen,

dass Zeitersparnis den gröÿten ökonomis hen Eekt hat. Die Dur hführung von konven-

tioneller Serologie für 2000 Seren und 20 Antigene würde mehrere Monate in Anspru h

nehmen, was die Personalkosten in immense Höhen triebe (WATERBOER et al. 2005).

Im Verglei h dazu liegen die Kosten für die MFIA von CR wenn sie im eigenen Labor

etabliert wird bei a. 95e pro Serum für die Reagentien. Die Höhe anderer Kosten-

punkte sind in beiden Testsystemen ähnli h. Je na h personeller und mas hineller Aus-

stattung des Labors ist ein maximaler Dur hsatz von 8000 Seren pro Wo he mit der MS

mögli h. Die Anwendung in der mikrobiologis hen Diagnostik des DKFZs bes hränkt

si h zurzeit auf maximal 150 Seren pro Wo he. Für die regelmäÿige Anwendung ist eine

hohe Reproduzierbarkeit und die Etablierung von niedrig positiven Kontrollen beson-

ders wi htig, um eine Verglei hbarkeit der Ergebnisse der unters hiedli hen Wo hen zu

gewährleisten.

Die groÿe Kostenersparnis ist für kleine, institutseigene Diagnostiklabors, die meist nur

ein geringes Budget zur Verfügung haben, besonders wi htig. Der groÿe Vorteil von je-

nen Labors, wel he Tiere aus dem eigenen Bestand untersu hen, ist die Mögli hkeit einer

dierenzierteren Interpretation der Resultate mithilfe der vorliegenden Information über

die Herkunft der Tiere. Bei besonders infektionsgefährdeten Tieren können beispielswei-

se paus hal mehrere Tests für eine Virusinfektion dur hgeführt werden. Referenztests

werden für gewöhnli h dann in kommerziellen Labors dur hgeführt, wenn ein positives

385

7. Diskussion

Ergebnis oder eines in der Grauzone vorliegt. Es ist in institutseigenen Labors auÿer-

dem mögli h, im Fall von unklaren Ergebnissen s hnell weitere Tiere aus der glei hen

Haltungseinheit zur Bestätigung der Ergebnisse anzufordern. Das kleine Budget in Kom-

bination mit der Notwendigkeit vers hiedener Tests für jeweils ein Virus führt dazu, dass

kleine Labors viele Tests selbst herstellen. Der Einkauf kommerzieller Tests lohnt si h

nur für wenige Anwendungen. Die Ans haung kommerzieller Kits für eine MS ist in

Relation besonders teuer. Aus diesem Grund ist die im Rahmen dieser Arbeit entwi kel-

te MS eine ideale Ergänzung zum bereits vorhandenen Repertoire an Tests. Sie ndet

Anwendung in der regelmäÿigen Überwa hung der Bestände als Su htest.

Zur Beurteilung der Ergebnisse für die einzelnen Antigene über einen längeren Zeitraum

wird immer jemand notwendig sein, der viel Erfahrung mit unters hiedli hen serologi-

s hen Tests hat, der erkennt, wenn S hwankungen im System auftreten und der die Ursa-

hen für diese S hwankungen analysieren und beheben kann. Aus diesem Grund wurden

die oben bes hriebenen niedrig positiven Kontrollen eingeführt. Diese Herangehensweise

ist au h bei anderen serologis hen Tests übli h. CR bietet z. B. low Referenzseren an,

die sofern vorhanden au h in der Validierung verwendet wurden.

Die Serologie für die stark kreuzreagierenden Parvoviren sollte der Literatur na h

(BALL-GOODRICH et al. 2002) in der Lage sein, die beteiligten Spezies zu unter-

s heiden. Die Stärke der Reaktion der vers hiedenen Antigene in der MS zeigte jedo h

nur bedingt das beteiligte Virus an. Zumindest eine Doppelinfektion kann anhand der

Ergebnisse ni ht ausges hlossen werden. Da Versu hstierpopulationen generell frei von

Parvoviren sein sollen, ist eine Dierenzierung der Spezies nur von akademis hem In-

teresse. Für die Ursa henfors hung ist die beteiligte Spezies eine wertvolle Information,

hierfür gibt es aber geeignetere Methoden, die au h genauer sind. Mittels PCR könnten

Teile des VP1 bzw. VP2 odierenden Gens ampliziert werden und über eine Sequenzie-

rung genaue Informationen darüber liefern, wel hes Isolat vorliegt.

7.6. Ausblick

In Zukunft soll der Dur hsatz an Seren insbes. dahingehend gesteigert werden, dass

au h Tiere getestet werden, die sonst ni ht zur Untersu hung gekommen wären. In der

MS können kleine Serumproben sol her Tiere getestet werden, ohne dass diese getötet

werden müssen. Dieser Vorteil betrit vor allem Tiere, die von anderen Instituten an das

386

7.6. Ausbli k

DKFZ gegeben wurden und si h no h in Quarantäne benden, sehr wertvolle Tiere, z. B.

transgene Tiere, oder au h Tiere, die si h in IVCHaltung benden. Die Überwa hung

von Tieren in der immer häuger verwendeten IVCHaltung stellen an die Diagnostik

eine besondere Herausforderung, weil die Haltungseinheiten und hygienis hen Barrieren

nur genau einen Käg groÿ sind. Bei sa hgere hter Handhabung sollte eine Übertragung

von Erregern zwis hen den Kägen ausges hlossen sein. Aus diesem Grund sollte aus

jedem Käg eine Sti hprobe untersu ht werden, was in dieser Form selbst mit der MS

ni ht konsequent dur hführbar ist. Die MS kann hier aber einen Beitrag dazu leisten, die

Überwa hung au h in IVCHaltung und damit die Complian e mit den Empfehlungen

der FELASA zu verbessern.

Verbesserungswürdig in der MS sind die Serologie für TMEV, RCV und diejenigen Viren,

die aufgrund von ni ht veröentli hten Sequenzdaten no h ni ht in den Assay integriert

werden konnten, wie MAdV-2 und MTV. Zur Vervollständigung wäre es hilfrei h, für

das ratTheilovirus ebenfalls Antigene zu entwi keln, besonders weil die Antigene für

TMEV (VP1 und 3ABC) selbst bei Seren, die mit dem glei hen Virusstamm inziert

waren eine niedrige Sensitivität zeigten. Für das rat Theilovirus lag kein Template zur

Entwi klung von Antigenen vor.

Von Interesse für das Health monitoring wäre auÿerdem eine MS für Bakterien. Hier be-

steht die Mögli hkeit, ebenfalls mit rekombinanten Proteinen zu arbeiten, wie es s hon

für Heli oba ter erfolgrei h entwi kelt wurde (MICHEL et. al. 2009). Ein anderer Ansatz

wäre, aus kompletten Bakterien Lysat herzustellen und dieses kovalent auf Beads zu brin-

gen, die ni ht vorher mit Glutathion-Casein beladen wurden. Initiale vielverspre hende

Experimente wurden dazu bereits von Klaus Vogel dur hgeführt.

Der Na hteil des Antikörperna hweises ist, dass ganz fris he Infektionen, Infektionen

von sehr jungen Tieren und Infektionen in immundezienten Tieren ni ht na hgewiesen

werden können. Deshalb wurde parallel zu der vorliegenden Arbeit eine MultiplexPCR

von Daniela Höer entwi kelt. Unter Verwendung beider Systeme ist es mögli h, den

direkten Erregerna hweis und den Antikörperna hweis für eine gröÿtmögli he Si herheit

zu kombinieren.

387

8. Zusammenfassung

Eva Klaessen: Entwicklung und Validierung einer

sensitiven und spezifischen Multiplex-Serologie zum

Nachweis von Antikörpern gegen 27 Viren bei Maus und

Ratte

Für tierexperimentelle Arbeiten sind Tiere, die von Infektionen jegli her Art frei sind,

essentiell. Um eine hohe mikrobiologis he Qualität der Tiere zu si hern, muss eine eng-

mas hige Gesundheitsüberwa hung (Health monitoring) dur hgeführt werden. Es erfor-

dert auf konventionelle Weise einen groÿen personellen und materiellen Aufwand. Neben

dem direkten Erregerna hweis, wie er vor allem für Bakterien und Parasiten genutzt

wird, steht für Viren der Na hweis von Serumantikörpern im Vordergrund. Es wurde ein

Ho hdur hsatzverfahren entwi kelt (Multiplex-Serologie), wel hes Serumantikörper ge-

gen 27 Viruserkrankungen (Polyomavirus der Maus, K-Virus, MAdV-1 (FL), MuHV-1,

Orthopoxviren, MVM, MPV, KRV, RPV, RMV, H-1PV, TMEV, EMCV, MNV, LDV,

Hepatitis-E-like Virus, MHV, RCV, PVM, SeV, LCMV, Hantaviren, Reovirus, Rotavi-

rusA) detektiert.

Virale Proteine wurden als potentielle Antigene ausgewählt und in E. oli als Glutathi-

on S-Transferase Fusionsproteine exprimiert. Serumantikörper werden in einem beadba-

sierten Suspensionsassay detektiert (WATERBOER et al. 2005). Bis zu 100 vers hiede-

ne Beadsorten können mit unters hiedli hen Antigenen beladen werden. In einer Art

Zwei-Farben-Dur husszytometer werden die Beadsorten unters hieden und die Flou-

ro hrommarkierten Serumantikörper quantiziert. Multiplex-Serologie (MS) wurde mit

961 unters hiedli h harakterisierten Seren von Maus und Ratte gegen die 40 Antigene

von 27 Viren validiert. Finale Cut-os wurden festgelegt und Sensitivitäten und Spezi-

täten bere hnet.

389

8. Zusammenfassung

Für ein Virus (TMEV) bei der Maus und für zwei Viren bei der Ratte (TMEV und

RCV) war die errei hte Sensitivität ni ht ausrei hend. Die MS für weitere zwei Viren bei

der Maus und fünf Viren bei der Ratte konnte ni ht beurteilt werden, da ni ht genügend

positive Seren und/oder Referenztests zur Validierung zur Verfügung standen. Für 16

Maus- und a ht Ratten-Viren erwies si h Multiplex-Serologie als geeignet für den Einsatz

als Su htest zur Infektionsüberwa hung von Nagerbeständen.

390

Eva Klaessen: Development and validation of a sensitive

and specific multiplex serology for the detection of

antibodies against 27 viruses in mice and rats

For in vivo experiments it is essential to use animals that are free of infe tious agents. To

ensure a high mi robiologi al quality of animals, lose health monitoring must be ondu -

ted. Conventionally, this requires great manual eort and material expense. Dete tion of

ba teria and parasites is often a hieved dire tly, whereas viruses are dete ted ommonly

through the orresponding serum antibodies. A high-throughput assay (multiplex serolo-

gy) for the s reening of serum antibodies has been developed that an dete t antibodies

of 27 viral infe tions (murine polyomavirus, K-virus, MAdV-1 (FL), MuHV-1, MuHV-4,

two orthopoxviruses, MVM, MPV, KRV, RPV, RMV, H-1PV, TMEV, EMCV, MNV,

LDV, hepatitis-E-like virus, MHV, RCV, PVM, SeV, LCMV, two hantaviruses, reovirus,

rotavirusA).

Viral proteins were sele ted as potential antigens and expressed in E. oli as glutathio-

ne S-transferase fusion proteins. Serum antibodies were dete ted in a bead-based suspen-

sion assay (WATERBOER et al. 2005). Up to 100 dierent bead sets an be loaded with

dierent antigens. The bead sets are being distinguished and uoro hrome-labelled se-

rum antibodies are being quantied in a modied two- olour ow ytometer. Multiplex-

serology was validated with 961 dierently hara terised sera of mi e and rats against

the 40 antigens of 27 viruses. The nal ut-os were set and sensitivities and spe i ities

were al ulated.

The experimental sensitivity was not su ient for the TMEV in mi e and for both

TMEV and RCV in rats. For two further viruses in mi e (MuHV-4 and EMCV) and

four viruses in rats (two orthopoxviruses, EMCV and hepatitis-E-like virus), assessment

was not possible, owing either to la k of referen e sera, referen e tests, or both. Multi-

plex serology was suitable for the monitoring of 16 viral infe tions in mi e and 8 viral

infe tions in rats.

391

9. Danksagungen

Besonders herzli h mö hte i h mi h bedanken bei:

Prof. Ludwig Haas für die akademis he Betreuung von Seiten der TiHo.

Prof. Lutz Gissmann für die akademis he Betreuung von Seiten des DKFZ.

Dr.Werner Ni klas und Dr.Mi hael Pawlita für das Erdenken und Bereitstellen des

interessanten Themas.

Werner Ni klas für das stets oene Ohr bei Problemen, akuten Erfolgserlebnissen und

allem was unter den Nägeln brennt!

Bei seinem diagnostis hen Gefolge Klaus Vogel, Petra Mauter, Elsbeth S hneider, Katrin

Kinader, Bernhard Berkus und Andrea Erles-Kemna für die besonders herzli he Aufnah-

me in die Gruppe, die fru htbare Zusammenarbeit und den Spra hkurs in Kurpfälzis h

mit seinen vers hiedenen Varianten.

Klaus, dem Herrn über Plato und Luminex, für die ambitionierte Übernahme des Assays

und die vielen praktis hen Lebensweisheiten!

Petra, die den Überbli k über alles bewahrt und immer einen guten Rat hat.

Elsbeth für den s hönen Herd und das eifrige Na htesten der Seren.

Anna Herner für die zahlrei hen Bestellungen.

Mi hael Pawlita für die engagierte wissens haftli he Betreuung, seine Motivation und

die stets erleu htenden Bespre hungen.

Bei seinem fors hendem Gefolge Angelika Mi hel, Tim Waterboer, Daniela Höer, Ute

Ko h, Monika Oppenländer, Markus S hmitt, Kristina Mi hael, Shumei Wang und allen

anderen, die weniger lang in dem Labor sein konnten, für die praktis hen Anleitungen,

Tipps zwis hen Tür und Angel und die gute Arbeitsatmosphäre.

393

9. Danksagungen

Angelika, die besonders in dringli hen Fällen immer bereit war zu helfen.

Ute, der Herrin über die Serumsammlungen für viele praktis he Tipps und Knie.

Madeleine Sporleder für das Einkaufen der Ratten.

Mi hael Mähler, Rajeev Dhawan, Christiane Dinsart, Rainer Ulri h und allen weiteren

Übermittlern von Referenzseren und Templates.

Den vielen kleinen Serumspendern.

Meiner WG und Ersatzfamilie, besonders bei Frédérik Blank, Andreas Heindl, Milly

Mille und Lois O'Leary für viele gesellige Abende und moralis he Unterstützung.

Christine Dolde und Anni Dier ks für die Mädelsabende, die mi h immer wieder auf den

Boden der Tatsa hen gebra ht haben.

Christine Dolde auÿerdem für die vielen wunderbaren Sa hen, die ni ht ein eine Zeile

passen.

Meinen Eltern für die unbedingte Unterstützung.

Meiner Mutter Rita für die Dauerleihgabe ihres Autos und das Mitebern.

Meinem Mann Christian für das Korrekturlesen, L

A

T

E

X-Formatieren und die Musik!

394

A. Western Blots und Coomassie Gele

395

A. WesternBlots und CoomassieGele

Tabelle A.1. PolyomaVP1

anti-GST anti-tag

Marker Rl Ü GST Marker Rl Ü GST

80

100

60

50

40

30

25

80

60

50

100

40

30

25

20

Rl = Rohlysat (vor der Zentrifugation)

Ü = Überstand (na h der Zentrifugation)

Tabelle A.2. K-VirusVP1

anti-GST anti-tag Coomassie

Marker Rl Ü GST Marker Rl Ü GST Marker Rl Ü GST

80

60

50

40

30

25

20

15

10

80

60

50

40

30

25

20

15

10

25

37

50

75

100

150

250

396

Tabelle A.3. MAdV-1Fib.

anti-GST anti-tag


80

100

150

60

50

40

30

25

20

15

10

80

60

50

40

30

25

20

15

10

100

Tabelle A.4. MAdV-1Hex.



15

20

25

30

40

50

60

80

100

150

230

25

20

15

10

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40

50

60

80

100

150

230

50

37

25

20

75

100

150

250

397


Tabelle A.5. MuHV-1UL55 long



80

60

50

40

30

25

20

15

10

80

60

50

40

30

25

20

15

10

25

37

50

75

100

150

250

Tabelle A.6. MuHV-1UL55 short



80

60

50

40

30

25

20

15

10

80

60

50

40

30

25

20

15

10

25

37

50

75

100

150

250

398

Tabelle A.7. MuHV-1 pp150 -ter

anti-GST anti-tag


80

60

50

40

30

25

20

15

10

80

60

50

40

30

25

Tabelle A.8. MuHV-4UL26.5

anti-GST anti-tag


80

60

50

40

30

25

20

15

10

80

60

50

40

30

25

399


Tabelle A.9. MuHV-4UL27

anti-GST anti-tag


80

60

50

40

30

25

20

15

10

80

60

50

40

30

25

Tabelle A.10. VACVp35

anti-GST anti-tag


80

60

50

40

30

25

20

15

60

50

40

30

25

20

15

10

400

Tabelle A.11. VACVp35 short



80

60

50

40

30

25

20

15

10

80

60

50

40

30

25

20

15

10

25

37

50

75

100

150

250

Tabelle A.12. VACVmaj env

anti-GST anti-tag


80

100

60

50

40

30

25

20

15

80

60

100

50

40

30

25

20

15

401


Tabelle A.13. KRVNS1

anti-GST anti-tag


80

60

100

50

40

30

25

100

80

60

50

40

30

25

Tabelle A.14. RPVNS1



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60

50

40

30

25

100

80

60

50

40

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100

250

150

100

75

50

37

25

20

402

Tabelle A.15. MVMNS1



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100

60

50

40

30

25

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60

50

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100

150

100

150

250

75

50

37

25

20

15

Tabelle A.16. KRVVP2

anti-GST anti-tag

Marker Ü GST Marker Ü GST

150

100

75

50

37

25

150

100

75

50

37

25

Blot von Angelika Mi hel

403


Tabelle A.17. RPVVP2



80

60

50

40

30

25

100

80

60

50

40

30

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100

250

150

100

75

50

37

25

20

Tabelle A.18. RMVVP2



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60

50

40

30

25

100

80

60

50

40

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25

100

250

150

100

75

50

37

25

20

404

Tabelle A.19. H-1PVVP2



80

60

50

40

30

25

100

80

60

50

40

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100

250

150

100

75

50

37

25

20

Tabelle A.20. MVMVP2

anti-GST anti-tag

Marker Ü GST Marker Rl Ü GST

80

60

100

50

40

30

25

100

80

60

50

40

30

25

405


Tabelle A.21. MPV-1VP2

anti-GST anti-tag

Marker Ü GST Marker Rl Ü GST

80

60

100

50

40

30

25

100

80

60

50

40

30

25

Tabelle A.22. MPV-2VP2

anti-GST anti-tag


80

100

60

50

40

30

25

20

15

80

100

60

50

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30

25

20

15

406

Tabelle A.23. TMEVVP1

anti-GST anti-tag


80

60

50

40

30

25

20

15

80

60

50

40

30

25

20

15

10

100

Tabelle A.24. TMEV3ABC

anti-GST anti-tag


80

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50

40

30

25

20

15

80

60

50

40

30

25

20

15

10

100

407


Tabelle A.25. EMCVVP1

anti-GST anti-tag


80

60

50

40

30

25

20

15

80

60

50

40

30

25

20

15

10

100

Tabelle A.26. EMCV3ABC

anti-GST anti-tag


80

60

50

40

30

25

20

15

80

60

50

40

30

25

20

15

10

100

408

Tabelle A.27. MNVVP1

anti-GST anti-tag


80

100

60

50

40

30

25

20

15

80

100

60

50

40

30

25

20

15

Tabelle A.28. ratHEVN

anti-GST anti-tag


80

100

60

50

40

30

25

20

15

80

60

100

50

40

30

25

20

15

409


Tabelle A.29. LDVN

anti-GST anti-tag


80

60

50

40

30

25

20

15

80

60

50

40

30

25

20

15

10

100

Tabelle A.30. LDVM

anti-GST anti-tag


80

60

50

40

30

25

20

15

80

60

50

40

30

25

20

15

10

100

410

Tabelle A.31. MHVN

anti-GST anti-tag


80

100

60

50

40

30

25

20

15

80

100

60

50

40

30

25

20

15

Tabelle A.32. RCVN



80

100

150

230

50

40

30

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20

80

50

40

30

25

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100

150

230

75

100

150

250

50

37

25

20

15

411


Tabelle A.33. SeVN



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100

150

230

50

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20

80

50

40

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25

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100

150

230

75

100

150

250

50

37

25

20

15

Tabelle A.34. PVM N

anti-GST anti-tag


80

100

60

50

40

30

25

20

15

80

100

60

50

40

30

25

20

15

412

Tabelle A.35. LCMVNP

anti-GST anti-tag


80

60

50

40

30

25

20

15

10

100

80

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50

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30

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15

10

Tabelle A.36. HTNVN

anti-GST anti-tag


80

60

50

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30

25

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15

10

100

80

60

50

40

30

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20

15

10

413


Tabelle A.37. PUUVN

anti-GST anti-tag


80

60

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40

30

25

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15

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100

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60

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10

Tabelle A.38. SEOVN

anti-GST anti-tag


80

60

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30

25

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15

10

80

60

50

40

30

25

414

Tabelle A.39. Reo Sigma1

anti-GST anti-tag


80

100

150

60

50

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30

25

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15

10

100


anti-GST anti-tag


80

100

60

50

40

30

25

20

15

80

60

100

50

40

30

25

20

15

415



anti-GST anti-tag

Marker Ü Rl GST Marker Ü Rl GST

80

100

60

50

40

30

25

80

60

50

100

40

30

25

20

Tabelle A.42. RotaAVP6

anti-GST anti-tag


80

60

50

40

30

25

20

15

60

50

40

30

25

20

15

10

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