A. Kromatografi Kromatografi pertama kali diberikan oleh Michel Tswett, seorang ahli dari Botani Rusia, yang menggunakan kromatografi untuk memisahkan klorofil dari pigmen - pigmen lain pada ekstrak tanaman. Kromatografi berasal dari bahasa Yunani yang terdiri dari dua kata yaituchromosyang berarti warna dangraphosyang berarti menulis. Meskipun kromatografi diturunkan dari katawarnadantulis, warna senyawa-senyawa tersebut jelas hanya kebetulan saja terjadi dalam proses pemisahan ini. Tswett sendiri mengantisipasi penerapan pada beraneka ragam sistem kimia. Seandainya karyanya segera ditanggapi dan diperluas, beberapa bidang sains mungkin akan lebih cepat maju. Demikianlah kromatografi tetap tersembunyi sampai sekitar tahun 1931, ketika pemisahan karotena tumbuhan dilaporkan oleh ahli sains organik terkemuka. Penelitian ini menarik lebih banyak perhatian dan kromatografi adsorsi menjadi meluas pemakaiannya dalam bidang kimia hasil alam.

Ada dua fase dalam kromatografi, yaitu:a. Fasa diam (adsorben atau lapisan penyerap)Bertindak sebagai pemisah campuran.Contoh pelrut yang digunakan adalah silika gel, alumunium oksida, selulosa. Namun yamg paling banyak digunakan adalah slika gel dan alumunium oksida karena kadar air yang digunakan berpengaruh nyata terhadap daya.b. Fasa gerak (Eluen)Bertindak sebagai pembawa campuran. Komponen-komponen campuran akan bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda akibat hambatan dari fase diam sehingga terjadi pemisahaan.

Seiring perkembangan zaman, terdapat 4 perkembangan utama yaitu :1. Kromatografi pertukaran ion dalam akhir dasawarsa 1930-an2. Kromatografi partisi dalam tahun 19413. Kromatografi gas pada tahun 19524. Kromatografi gel pada tahun 1959Selain kemajuan utama ini, yang memberi mekanisme tambahan pada adsorpsi untuk mendistribusikan zat terlarut antara fase - fase stationer dan mobil, muncul juga modifikasi dalam geometri sistem kromatografi, seperti dalam kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis.Perkembangan teoritis yang memungkinkan pemahaman tuntas akan proses kromatografi dan karenanya menjelaskan faktor - faktor yang menentukan penampilan kolom, pertama kali muncul dalam hubungan dengan kromatografi gas. Namun pandangan-pandangan tertentu diantaranya terbukti dengan penyesuaian yang cocok, sama menolongnya dengan memahami kromatografi dalam mana fase geraknya adalah cairan. Jadi sekitar tahun 1968 mulailah suatu revolusi dalam kromatografi cairan yang menjanjikan kecepatan dan efisiensi baru dalam memisahkan senyawa yang tak dapat dikerjakan dengan kromatografi gas ( Aphiin, 2012).Kromatografi adalah suatu metode pemisahan fisik, di mana komponen-komponen yang dipisahkan didistribusikan di antara dua fasa, salah satu fasa tersebut adalah suatu lapisan stasioner dengan permukaan yang luas, yang lainnya sebagai fluida yang mengalir lembut di sepanjang landasan stasioner. Fasa stasioner bisa serupa padatan maupun cairan, sedangkan fasa bergerak bisa berupa cairan maupun gas. Dalam semua teknik kromatografi, zat - zat terlarut yang dipisahkan bermigrasi sepanjang kolom (seperti dalam kromatografi kertas atau lapis tipis, ekivalen fisik kolom), dan tentu saja dasar pemisahan terletak dalam laju perpindahan yang berbeda.Metode kromatografi adalah teknik yang efektif dan dapat digunakan untuk memisahkan komponen yang sulit dipisahkan dengan metode lain. Berdasarkan proses terjadi, kromatografi dibedakan menjadi kromatografi partisi, ditemukan dalam kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis, kromatografi adsorpsi, ditemukan dalam kromatografi kolom, kromatografi pertukaran iondan kromatografi eklusi.Beberapa zat yang diteteskan pada kertas dapat bergerak pindah lebih cepat daripada yang lain. Kelarutan suatu partikel terhadap pelarutnya mempengaruhi kecepatan perpindahan tersebut. Semakin mudah suatu partikel larut, semakin cepat pula laju geraknya. Suatu campuran pewarna dapat dipisahkan dengan teknik kromatografi karena adanya perbedaan kelarutan antara zat penyusun campuran pewarna tersebut. Selain itu, kecepatan bergerak partikel penyusun sangat dipengaruhi oleh ukuran partikel penyusunnya. Partikel penyusun yang lebih akan bergerak lebih cepat daripada partikel penyusun yang berukuran lebih besar .Pengukuran uji kromatografi dapat dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Secara kuantitatif, perbandingan jarak yang ditempuh oleh suatu warna dengan jarak pelarut disebut dengan Rf. Variasi jumlah Rf menunjukkan banyaknya komponen penyusun campuran yang sedang kita pisahkan dengan metode kromatografi ini. Berbagai nilai Rf ini kita bandingkan satu sama lain. Nilai Rf yang terbesar dimiliki oleh komponen penyusun yang memiliki ukuran partikel terkecil dan sebaliknya nilai Rf yang terkecil adalah yang memiliki ukuran partikel penyusun terbesar (Rizki, 2010).

Secara umum, teknik kromatografi terbagi ke dalam beberapa jenis yaitu, Kromatografi gas dan Kromatografi cair

1. Kromatografi Cair ( Liquid Chromatography )Kromatografi Cair adalah kromatografi dengan fasa gerak berupa zat cair, Kromatografi cair merupakan teknik yang tepat untuk memisahkan ion atau molekul yang terlarut dalam suatu larutan. Jika larutan sampel berinteraksi dengan fase stasioner, maka molekul-molekul didalamnya berinteraksi dengan fase stasioner; namun interaksinya berbeda dikarenakan perbedaan daya serap (adsorption), pertukaran ion (ion exchange), partisi (partitioning), atau ukuran. Perbedaan ini membuat komponen terpisah satu dengan yang lain dan dapat dilihat perbedaannya dari lamanya waktu transit komponen tersebut melewati kolom. Terdapat beberapa jenis kromatografi cair, diantaranya :

Kromatografi KolomKromatografi kolom adalah suatu metode pemisahan yang di dasarkan pada pemisahan daya adsorbsi suatu adsorben terhadap suatu senyawa, baik pengotornya maupun hasil isolasinya

Kromatografi Kertas (Partisi)Kromatografi kertas adalah suatu metode pemisahan yang menggunakan media kertas (selulosa) sebagai fase diam, sedangkan untuk fase gerak menggunakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Kromatografi kertas termasuk pada kromatografi partisi cair-cair. Prinsip kromatografi partisi cair-cair adalah distribusi sampel antara fase caie diam dan fase cair bergerak dengan membatasi kemampuan pencampuran (contoh, pemisahan tinta, zat warna, klorofil, make up, dll )

Kromatografi Lapisan Tipis (Absorbsi)Kromatografi lapisan Tipis adalah suatu metode pemisahan yang menggunakan lempengan tipis yang terbalut gel silica atau alumina sebagai fase diam, sedangkan untuk fase gerak menggunakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai, digunakan untuk mengetahui jenis campuran asam amino

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)Kromatografi jenis ini sering juga dikenal dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Kromatografi penukar ion

Kromatografi pertukaran ionadalah salah satu teknik pemurnian senyawa spesifik di dalam larutan campuran.Prinsip utama dalam metode ini didasarkan pada interaksi muatan positif dan negatif antara molekul spesifik dengan matriks yang barada di dalam kolomkromatografi.Metode ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ilmuwan bernama Thompson pada tahun1850.Secara umum, teradapat dua jenis kromatografi pertukaran ion, yaitu: Kromatografi pertukaran kation, bila molekul spesifik yang diinginkan bermuatan positif dan kolom kromatografi yang digunakan bermuatan negatif.Kolom yang digunakan biasanya berupa matriksdekstranyang mengandung guguskarboksil(-CH2-CH2-CH2SO3- dan -O-CH2COO-).Larutan penyangga(buffer) yang digunakan dalam sistem ini adalahasam sitrat,asam laktat,asam asetat,asam malonat, buffer MES dan fosfat. kromatografi pertukaran anion, bila molekul spesifik yang diinginkan bermuatan negatif dan kolom kromatografi yang digunakan bermuatan positif.Kolom yang digunakan biasanya berupa matriks dekstran yang mengandung gugus -N+(CH3)3, -N+(C2H5)2H, dan N+(CH3)3.Larutan penyangga (buffer) yang digunakan dalam sistem ini adalah N-metil piperazin, bis-Tris, Tris, dan etanolamin.Metode ini banyak digunakan dalam memisahkan molekulprotein(terutamaenzim).Molekul lain yang umumnya dapat dimurnikan dengan menggunakan kromatografi pertukaran ion ini antara lain senyawaalkohol,alkaloid,asam amino, dannikotin. Fase DiamAda banyak macam penukar ion, tetapi penukar ion polisterina berikatan silang palingluas penggunaannya.Gambar 65. b menggambarkan struktur resina penukar anion dengan matriks poliestirena berikatan silang yang sama, tetapi dengan gugus tetraalkilamonium. Resina poliestirena kerng cenderng mengembangjika dimasukkan dalam pelarut.Air menetrasi ke dalam resina dan hidrasi, membentuk larutan sangat pekat dalam resina. Tekanan osmosa cenderungmenekan airlebih banyak ke dalam resina dan padatan itu mengembang, jadi volumenya bertambah. Jumlah air yang diambil resina tergantung pada ion penukar dari resina dan menurun dengan bertambahnya jumlah ikatan silang. Resina penukaran ion juga mengembang dalam pelarut organik, tetapi pengembangannya lebih kecil daripada dalam air.Fase GerakKebanyakan pemisahan kromatografi penukar ion dilakukan dalam media air sebab sifat ionisasi dari air. Dalam beberapa hal, digunakan pelarut campuran seperti air, alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak media air, reteni puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik dan oleh pH fasa gerak. Kenaikkan kadar garam dalam fasa gerak menurunkan retensi senyawa cuplikan. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion cuplikan bersaing dengan ion fasa gerak untuk gugus penukar ion pada resina.

4. Kromatografi elektroforesis

Kromatografi elektroforesis menyangkut perbedaan migrasi spesies-spesies bermuatan dalam suatu larutan di bawah pengaruh dari penggunaan suatu gradient potensial. Kecepatan migrasi setiap spesies tergantung atas ukuran, bentuk dan muatan spesiesnya. Metoda elektroforesis merupakan metoda pemisahan suatu zat berdasarkan perbedaan muatan dan massa melekul relative dari komponen-komponennya. Pemisahan terjadi karena perbedaan laju migrasi komponen-komponen bermuatan oleh pengaruh medan listrik.

2. Kromatografi Gas ( Gas Chromatography )Kromatografi gas yang biasa juga disebut dengan Gas Chromatography (GC) adalah proses pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya dengan menggunakan gas sebagai fase bergerak yang melewati suatu lapisan serapan (sorben) yang diam. Teknik instrumental ini dikenalkan pertama kali pada tahun 1950-an.

Gas Liquid Chromatography ( GLC )Gas Liquid Chromatography merupakan salah satu jenis dari kromatografi gas yang mana fase geraknya menggunakan gas dan fase diamnya menggunakkan zat Cair, Kromatografi jenis ini digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa organik yang mudah menguap misalnya, untuk menentukan komposisi kimia dari zat-zat yang tidak diketahui didalam bensin. Gas Solid Chromatography ( GSC )Gas solid Chromatography merupakan salah satu jenis dari kromatografi gas yang mana fase geraknya menggunakan gas dan fase diamnya menggunakkan zat padatKromatografi juga dapat didasarka atas prinsipnya, misalnya kromatografi partisi (partition chromatography) dan kromatografi serapan (adsorption Cromatography). (Kimia Fisika Untuk Paramedis, Estien Yazid, 2005)

Kromatografi partisi cair-cair terdiri dari suatu kolom yang berisi zat padat penunjang halus di mana pada permukaan terdapat pelarut sebagai fase diamnya. Fase kedua yaitu fase bergerak yang tidak bercampur dengan cairan dari fase diamnya akan mengalir sepanjang kolom. Komponen-komponen dari campuran akan terpartisi pada kedua fase akibat adanya perpindahan diantara kedua fase tersebut. Komponen yang terpartisi lebih banyak pada fase diam akan tertahan lebih lama di dalam kolom dibandingkan komponen yang lebih banyak terpartisi pada fase gerak.

Kromatografi adsorpsi didasrkan pada retensi zat terlarut oleh adsorpsi permukaan. Teknik ini berguna dalam pemisahan senyawa-senyawa nonpolar dan konstituen-konstituen yang sulit menguap. Pada kromatografi cair-padat, suatu substrat padat bertindak sebagai fase diam. Pemisahan tergantung pada keteseimbangan yang terbentuk pada bidang antarmuka diantara butiran-butiran fase diam dan fase cair yang bergarak serta pada kelarutan relatif zat terlarut pada fase bergaraknya. (Konsep Dasar Kimia Analitik ,S.M. Khopkar,2008)

Berdasarkan fase yang terlibat kromatografi dibedakan menjadi:a. Kromatografi gas-cair, bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnya berupa cairan yang dilapiskan pada padatan pendukung yang inert.b. Kromatografi gas-padat, bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnya berupa padatan yang dapat menyerap atau mengadsorb. c. Kromatografi cair-cair, bila fase gerak dan fase diamnya berupa cairan, di mana fase diamya dilapiskan pada permukaan padatan pendukung yang inert.d. Kromatografi cair-padat, bila fase geraknya berupa caiaran sedangkan fase diamnya berupa padatan yang amorf yang dapat menyerap.

Berdasarkan teknik yang digunakan kromatografi digolongkan menjadi :a. Kromatogragfi kolom, apabila komponen yang akan dipisahkan bergarak bersama fase gerak melalui sebuah kolom kemudian setiap komponen terpisahkan berupa zona-zona pita.b. Kromatografi planar ( kromatografi lapis tipis dan kromatografi kertas)Apabila komponen yang akan dipisahkan bergerak bersama fase gerak dalam sebuah bidang datar. Senyawa yang bergerak berupa noda (spot) yang dapat dikenali dengan bantuan metode fisika dan kimia. Posisi noda menunjukan identitas suatu senyawa atau komponen, sedangkan besar atau intensitasnya menunjukan konsentrasinya.

B. Kromatografi Kertas

Kromatografi kertas ditemukan pertama kali oleh Martri, Consden danGordon.Kromatografi kertas merupakan salah satu metode pemisahan berdasarkan distribusi suatu senyawa pada dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Pemisahan sederhana suatu campuran senyawa dapat dilakukan dengan kromatografi kertas, prosesnya dikenal sebagai analisis kapiler dimana lembaran kertas berfungsi sebagai pengganti kolom. Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan sukses besar. Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam-asam amino larut dalam air dan tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisahan asam amino adalah masalah paling sukar yang dihadapi kimiawan di akhir abad 19 dan awal abad 20. Jadi penemuan kromatografi kertas merupakan berita sangat baik bagi mereka.

Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) adalah orang pertama yang menggunakan metoda analisis asam amino dengan kromatografi kertas. Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketiak pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino diidentifikasi.Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas bukan lembaran kecil, dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut.

Kromatografi kertas adalah salah satu pengembangan dari kromatografi partisi yang menggunakan kertas sebagai padatan pendukung fasa diam. Oleh karena itu disebut kromatografi kertas. Sebagai fasa diam adalah air yang teradsorpsi pada kertas dan sebagai larutan pengembang biasanya pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan air.Dalam kromatografi kertas fasa diam didukung oleh suatu zat padat berupa bubuk selulosa. Fasa diam merupakan zat cair yaitu molekul H2O yang teradsorpsi dalam selulosa kertas.fasa gerak berupa campuran pelarut yang akan mendorong senyawa untuk bergerak disepanjang kolom kapiler. Analisis kualitatif menggunakan kromatografi kertas dilakukan dengan cara membandingkan harga relative response factor (Rf). Nilai Rf identik dengan time retention (tR) atau volume retention (VR).Harga Rf zat baku dapat diidentifikasikan komponen campuran, karena harga besaran ini bersifat khas untuk setiap zat asal digunakan jenis pengembang yang sama. Kadang-kadang pemisahan dalam satu arah belum memberikan hasil yang memuaskan. Untuk mendapatkan hasil yang lebih baik, dapat dipakai cara kromatografi kertas dua dimensi, yang mana letak kertas diubah sehingga arah pemisahan juga berubah.

Prinsip kerja kromatigrafi kertasKromatografi kertas digunanakan baik untuk analisa kualitatif maupun kuantitatif. Senyawa-senyawa yang dipisahkan kebanyakan bersifat sangat polar, misalnya assam-asam amino, gula atau pigmen-pigmen alam. Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa terjadi dalam pelarut yang bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen bergerak pada laju yang berbeda dan campuran dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak warna.Pada teknik kromatografi kertas dipotong memanjang sesuai ukuran bejana yang akan digunakan. Kertas yang dipakai adalah kertas whatman yang secara komersial tersedia dalam berbagai macam ukuran dan lembaran. Biasanya dipakai kertas whatman No.1 dengan kecepatan sedang. Tersedia juga kertas selulosa murni, kertas selulosa yang dimodifikasi, kertas asam asetil dan kertas serat kaca. Kertas asam asetil dapat digunakan untuk zat-zat hidrofobik, sedangkan untuk reagen yang korosif dapat digunakan kertas serat kaca. Untuk pemilihan kertas yang menjadi pertimbangan adalah tingkat kesempurnaan pemisahan, difusifitas pembentukan spot, efek tailing serta laju pergerakan pelarut. Kertas yang akan digunakan harus disimpan dalam ruang tertutup atau di tempat yang kering jauh dari sumber uap terutama yang mempunyai afinitas tinggi terhadap selulosa.Secara umum kromatografi kertas dilakukan dengan menotolkan larutan yang berisi sejumlah komponen pada jarak 0,5 sampai 1cm dari tepi kertas. Setelah penetesan larutan pada kertas, maka bagian bawah kertas dicelupkan dalam larutan pengambang (developing solution). Larutan ini umumnya terdiri atas campuran beberapa pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan air.Sistem ini akan terserap oleh kertas dan sebagai akibat dari gaya kapiler akan merambat sepanjang kertas tersebut. Rambatan ini dapat diusahakan dalam modus naik atau menurun. Selama proses pemisahan dilakukan, sistem secara keseluruhannya disimpan dalam tempat tertutup, ruang didalamnya telah jenuh dengan uap sistem pelarut ini.

Beberapa teknik elusi yang biasa digunakan dalam kromatografi kertas yaitu Metode Penaikan (Ascending)

Kertas digantungkan sedemikian rupa sehingga bagian bawah kertas tercelup pada pelarut yang terletak di dasar bejana. Noda harus diusahakan tidak sampai tercelup karena dapat larut dalam pelarut. Pelarut akan naik melalui serat-serat kertas oleh gaya kapiler menggerakan komponen dengan jarak yang berbeda-beda. Fase gerak akan naik melalui serat-serat dari kertas oleh gaya kapiler. Biasanya perambatan pelan dan makin lama menurun karena gaya berat. Cara yang paling sederhana. Kertas atau lapis tipis sesudah diberi sampel, tepinya setinggi kurang lebih 2,5cm dicelupkan pada eluen yang ditempatkan di dalam bejana. Eluen akan meresap pada kertas atau bahan penyangga dan bergerak naik secara kapileri sampai pada ketinggian yang dikehendaki.

Metode Penuurunan (Descending) Alat yang pokok berupa bejana yang terbuat dari gelas, platina atau logam anti karat serta bertutup untuk mencegah penguapan dari pelarut. Kertas digantung dalam bejana dengan ujung di mana aliran mulai bergerak dicelupkan dalam palung kaca yang berisi pelarut. Pertama kali fase gerak mengalir oleh gaya kapiler, setelah melewati batang gelas maka aliranya disebabkan oleh gaya gravitasi. kebalikan dari teknik ascending. Eluen dialirkan dari tepi kertas bagian atas dimana sampel diaplikasikan. Eluen akan bergerak mengalir (meresap) ke bawah melalui kertas atau bahan penyangga secara perlahan-lahan sampai batas yang dikehendaki. Agar kertas tidak lepas maka diberi penahan dari batang gelas. Jika dibanding dengan teknik ascending, maka teknik descending lebih cepat elusinya oleh karena faktor gravitasi berpengaruh pada kecepatan aliran eluen dan gerakan komponen yang memisah. Ada satu hal yang perlu mendapat perhatian pada teknik descending, yaitu cara mengalirkan eluen dan atas ke bawah. ini dapat ditempuh dengan menghubungkan kertas atau lapis tipis dengan kertas saring yang dicelupkan pada tangki atau bejana penyedia eluen.Pada kromatografi kertas lebih banyak digunakan sistem menurun sehingga lebih cepat perambatannya. Keuntungan yang lain, lembaran kertas yang digunakan lebih panjang sehingga dapat dipisahkan campuran yang lebih kompleks. Pemisahan yang terjadi berdasar atas peristiwa partisi, karena fase gerak yang digunakan adalah pelarut organik yang semi polar. Dan umumnya pelarut yang digunakan mengandung air sehingga air akan mudah terikat oleh selulosa, dan selulosa dapat mengembang menyerap air, maka air akan berfungsi sebagai fase diam.

Metode Mendatar (Radial) Metode ini sangat berbeda dari sebelumnya. Biasanya kertas dibentuk bulat yang tengahnya diberi sumbu dari benang atau gulungan kertas. Noda ditempatkan pada pusat kertas kemudian pelarut akan naik melalaui sumbu sehingga membasahi kertas untuk kemudian mengembang melingkar membawa komponan yang di pisahkan.Teknik horizontal (mendatar)Noda dicelupkan ditempatkan pada pusat dari kertas (umumnya kertas saring berbentuk bulat) yang diberi sumbu. Aliran pelarut disebabkan oleh gaya kapiler. Kertas diletakan secara horisontal sehingga sumbu tercerlup pada fase gerak. Selanjutnya fase gerak bergerak ke arah tepi kertas sambil membawa komponen-komponen campuran. Bercak-bercak yang terjadi berupa garis lengkung dengan diameter makin panjang bila bercak makin ke tepi.

Teknik pengembangan

metode satu arah (one way direction) dan metoda dua arah (two ways direction). Pada metoda satu arah, kertas atau lapis tipis dikembangkan melalui satu sisinya di mana sampel dimuatkan. Pada metoda dua arah, kertas atau lapis tipis yang telah dikembangkan, dilakukan pengembangan sekali lagi melalui tepi siku-siku kertas atau lapis tipis. Pengembangan dikerjakan di dalam suatu tangki atau bejana dan kaca sepaya tampak dan luar, dan ditutup sehingga ruang di dalam tangki akan jenuh dengan uap eluen. Kejenuhan ruangan termasuk faktor keberhasilan pemisahan.Bila permukaan pelarut telah mengembang atau bergerak pada batas tertentu, maka kertas dikeluarkan dari bejana dan batas permukaan pelarut diberi tanda lalu dikeringkan. Jika senyawa yang dipisahkan berwarna akan nampak sebagai noda-noda yang terpisah. Tetapi jika komponen zat tidak berwarna (umumnya senyawa organik), maka dapat dideteksi dengan cara fisika atau kimia. Pada cara fisika noda komponen disinari lampu ultraviolet dengan panjang gelombang 254-370 nm yang akan memberikan fluorescensi. Secara kimia noda disemprot dengan pereaksi tertentu, sehingga memberikan warna spesifik. Biasanya untuk mendeteksi asam-asam amino digunakan pereaksi ninhidrin 0,1% dalam butanol. Warna akan nampak merah-ungu sekitar 4 menit setelah dipanaskan 1000C. Setelah letak noda komponen diketahui dan diberi tanda batas, harga Rf (retardation faktor) dapat dihtung.

Nilai Rf bersifat karakteristik dan menunjukan identitas masing-masing komponen. Komponen yang paling mudah larut dalam pelarut harganya akan mendekati satu. Sedangkan komponen yang kelarutannya rendah akan mempunyai Rf hampir nol. Harga Rf dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti suhu, pelarut, kertas, sifat campuran, dan ukuran bejana. Nilai Rf dapat digunakan untuk identifikasi kualitatif dari senyawa yang tidak diketahui dengan membandingkan terhadap senyawa standar. Bila harga Rf-nya sama, berarti kedua senyawa tersebut identik. Sedangkan untuk analisa kuantitatif, komponen-komponen yang terpisah dapat dipotong-potong kemudian dilarutkan secara terpisah dalam pelarut yang sesuai untuk ditetapkan kadarnya dengan metode lain, misalnya spektrofotometri.

Struktur dasar kertas

Kertas dibuat dari serat selulosa. Selulosa merupakan polimer dari gula sederhana, yaitu glukosa. Sangat menarik untuk mencoba untuk menjelaskan kromatografi kertas dalam kerangka bahwa senyawa-senyawa berbeda diserap pada tingkatan yang berbeda pada permukaan kertas. Kompleksitas timbul karena serat-serat selulosa beratraksi dengan uap air dari atmosfer sebagaimana halnya air yang timbul pada saat pembuatan kertas. Oleh karenanya, anda dapat berpikir yakni kertas sebagai serat-serat selulosa dengan lapisan yang sangat tipis dari molekul-molekul air yang berikatan pada permukaan. Interaksi ini dengan air merupakan efek yang sangat penting selama pengerjaan kromatografi kertas.

Sifat Fisika kimia kertas Kertas terdiri dari 98 -99 % selulose, 0,3-10 % selulose, dan 0,4-0,8 % pentosan. Juga mempunyai gugus karboksilat yang dapat menimbulkan muatan negatif pada kertas. Kertas kromatografi terdapat kontaminan asam amino yang mempunyai kadar Nitrogen 15 mg/kg kertas.Senyawa lipofilik 25 mg/kg dan senyawa an organik (kadar abu) 0,04-0,07%, Senyawa kontaminan tidak mengganggu dalam pemisahan sampel pada kromatografi.Yang penting kemampuan absorbsi dan kenaikkan kapileritas masing-masing kertas. Whatman no.1 sebagai kertas standard yang digunakan, no. 3MM digunakan untuk preparatif. Sedangkan no. 4 untuk elusi yang cepat, dan 33 ET untuk elusi sangat cepat.

Ukuran kertas yang digunakan umumnya : Kromatografi menaik : panjang kertas sekitar 20 cm Kromatografi menurun : panjang kertas sampai 50 cm atau lebih Kromatografi mendatar sirkuler : diameter kertas 12 20 cm.

Kerapatan dan ketebalan kertas akan berpengaruh pada kecepatan aliran eluen, sehingga juga akan berpengaruh pada kesempurnaan pemisahan komponen-komponen. Gerakan dan pemisahan komponen juga tergantung pada jenis pelarut (eluen) yang diguriakan. . Eluen dapat terdiri atas satu macam pelarut atau campuran dan dua atau lebih pelarut, tetapi makin banyak campuran pelarut akan sulit menjenuhkan lingkungan pelat. Juga perlu diingat bahwa campuran pelarut harus saling tidak melarutkan atau bersifat immisibel, tetapi sampel harus mempunyai kelarutan yang tinggi pada eluen. Eluen yang mudah menguap dan tidak meninggalkan noda pada kertas pada umumnya lebih baik digunakan.

KLASIFIKASI KROMATOGRAFI KERTAS BERDASARKAN PELARUT YANG DIGUNAKAN

Kromatografi kertas menggunakan pelarut non polar Anggaplah anda menggunakan pelarut non polar seperti heksana untuk mengerjakan kromatogram. Molekul-molekul polar dalam campuran yang anda coba untuk pisahkan akan memiliki sedikit atraksi untuk molekul-molekul air dan molekul-molekul yang melekat pada selulosa, dan karena akan menghabiskan banyak waktunya untuk larut dalam pelarut yang bergerak. Molekul-molekul seperti ini akan bergerak sepanjang kertas diangkut oleh pelarut. Mereka akan memiliki nilai Rf yang relatif tinggi. Dengan kata lain, molekul-molekul polar akan memiliki atraksi yang tinggi untuk molekul-molekul air dan kurang untuk pelarut yang non polar. Dan karenanya, cenderung untuk larut dalam lapisan tipis air sekitar serat lebih besar daripada pelarut yang bergerak. Karena molekul-molekul ini menghabiskan waktu untuk larut dalam fase diam dan kurang dalam fase gerak, molekulmolekultidak akan bergerak sangat cepat pada kertas. Kecenderungan senyawa untuk membagi waktunya antara dua pelarut yang tidak bercampur (misalnya pelarut heksana dan air yang mana tidak bercampur) disebut sebagai partisi.Kromatografi kertas menggunakan pelarut non-polar kemudian menjadi tipe kromatografi partisi.

Kromatografi kertas menggunakan air dan pelarut polar lainnyaJika anda mempunyai air sebagai fase diam, tidak akan sangat berbeda makna antara jumlah waktu substansi menghabiskan waktu dalam campuran dalam bentuk lainnya. Seluruh substansi seharusnya setimbang kelarutannya (terlarut setimbang) dalam keduanya. Namun, kromatogram pertama yang telah anda buat mungkin merupakan tinta menggunakan air sebagai pelarut. Jika air bertindak sebagai fase gerak selayaknya menjadi fase diam, akan terdapat perbedaan mekanisme pada mekanisme kerja dan harus setimbang untuk pelarut-pelarut polar seperti alkohol, misalnya. Partisi hanya dapat terjadi antara pelarut yang tidak bercampur satu dengan lainnya. Pelarut-pelarut polar seperti alkohol rendah bercampur dengan air.

Faktor yang mempengaruhi harga Rf yaitu1.PelarutDisebabkan pentingnya koefesien partisi, maka perubahan-perubahan yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan-perubahan harga Rf

2.SuhuPerubahan dalam suhu merubah koefesien partisi dan juga kecepatan aliran

3.Ukuran dari bejanaVolume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama, seperti perubahan-perubahan komposisi pelarut sepanjang keras, maka koefesien partisi akan berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan dan komposisi mempengaruhi harga Rf.

4.KertasPengaruh utama kertas pada harga-harga Rf timbul dari perubahan ion dan serapan, yang berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas-kertas mempengaruhi kecepatan aliran , ia akan juga mempengaruhi pada keseimbangan partisi.

5.Sifat dari campuranBerbagai senyawa mengalami partisi diantara volume-volume yang sama dari fase tetap dan bergerak . Mereka hampir selalu mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap lainya hingga terhadap harga-harga Rf mereka.