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TISSUE ENGINEERINGTISSUE ENGINEERING
COLTURA DI CHERATINOCITI E FIBROBLASTI COLTURA DI CHERATINOCITI E FIBROBLASTI
SU SUPPORTO DI PLASMASU SUPPORTO DI PLASMA
UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PARMA
Facoltà di Scienze MM. FF. NN.
Corso di Laurea Specialistica in Biologia ed Applicazioni BiomedicheCorso di Laurea Specialistica in Biologia ed Applicazioni Biomediche
RelatoriChiar. ma Prof. ssa Renata Franchi Gazzola
CorrelatoriChiar. mo Dott. Stefano Negri
Laureanda Elena Alessi
Anno Accademico 2007/2008
TISSUE ENGINEERINGTISSUE ENGINEERING
Area multidisciplinare di ricerca che ha come scopo la
rigenerazione di tessuti ed organi danneggiati del nostro
organismo
PRINCIPIPRINCIPI
Prelevare le cellule staminali del Paziente
Far crescere e differenziare le cellule su un supporto biologico
Sottoporre il Paziente al trapianto
devono possedere le seguenti caratteristiche:
tollerabilità: devono essere immunologicamente inerti (biocompatibili)
impalcatura provvisoria: dopo integrazione il biomateriale deve essere sostituito dal tessuto originario (biodegradabili)
contenuto informativo: devono comunicare e scambiare segnali con le cellule ospite
BIOMATERIALIBIOMATERIALI
LE MATRICI PIU’ IDONEE..LE MATRICI PIU’ IDONEE..
Per la crescita e differenziazione di cheratinociti e fibroblasti
autologhi, le matrici più idonee, sono di tipo naturale e si
suddividono in:
- collagene
- agarosio
- acido ialuronico
- colla di fibrina
- cellulosa
Grande interesse è rivolto verso l’utilizzo del plasma umano
come supporto di crescita per cheratinociti e fibroblasti
Isolare cheratinociti e fibroblasti umani,
utilizzando il plasma autologo per
formare lembi di cute con caratteristiche
morfo-funzionali e immunoistochimiche
simili all’epidermide normale
SCOPO TESISCOPO TESI
CASO CLINICOCASO CLINICO
V. P. di anni 65, affetta da ulcera vascolare venosa circonferenziale alla gamba sinistra.
MATERIALI E METODIMATERIALI E METODI
Estrazione e amplificazione di cheratinociti e fibroblasti
umani autologhi, prelevati da un’unica biopsia
Preparazione del supporto di plasma
Aggiunta di fibroblasti e cheratinociti a diverse densità
PREPARAZIONE SUPPORTO DI PLASMAPREPARAZIONE SUPPORTO DI PLASMA
ACIDO TRANEXAMICO
PLASMA
SOLUZIONE FISIOLOGICA
CLORURO DI CALCIO
FIBROBLASTI+
+ CHERATINOCITI
30’, 37°C, 5% CO2
CONSISTENZA DEL SUPPORTOCONSISTENZA DEL SUPPORTO
PLASMA AC. TRANEXAMICO NaCl CaCl2
QUANTITÀ DI SOLUZIONE
PER POZZETTO
5 ml 5 mg 6,5 ml 1 ml, 1% 1 ml 2 ml
5 ml 5 mg 6,5 ml 1 ml, 1,5% 1 ml 2 ml
5 ml 6 mg 6,5 ml 1 ml, 1% 1 ml 2 ml
6 ml 5 mg 5,5 ml 1 ml, 1% 1 ml 2 ml
5 ml 6 mg 6,5 ml 1 ml, 1,5% 1 ml 2 ml
5X104/cm2
FU5X104/cm2
KE
5X104/cm2
FU10X104/cm2
KE
5X104/cm2
FU15X104/cm2
KE
10X104/cm2
FU5X104/cm2
KE
10X104/cm2
FU10X104/cm2
KE
10X104/cm2
FU15X104/cm2
KE
15X104/cm2
FU5X104/cm2
KE
15X104/cm2
FU10X104/cm2
KE
15X104/cm2
FU15X104/cm2
KE
FIBROBLASTI 5X104/cm2 10X104/cm2 15X104/cm2
CHERATINOCITI 5X104/cm2 10X104/cm2 15X104/cm2
DENSITA’ DI SEMINADENSITA’ DI SEMINA
t0 FIBROBLASTI CHERATINOCITI
t1 (dopo 1 giorno) - CHERATINOCITI
t2 (dopo 4 giorni) - CHERATINOCITI
t3 (dopo 8 giorni) - CHERATINOCITI
MODALITA’ DI SEMINAMODALITA’ DI SEMINA
PRELIEVOPRELIEVO
i frammenti di cute artificiale sono stati prelevati per:
Valutazione della consistenza ottimale
Valutazione della densità cellulare ottimale
Colorazioni istochimiche ed immunoistochimiche
4 giorni 8 giorni 13 giorni
COLTURA PRIMARIACOLTURA PRIMARIA
microscopio a contrasto di fase dopo 8 giorni (400X)
cheratinociti
fibroblasti 3T3
COLTURA SECONDARIACOLTURA SECONDARIA
microscopio a contrasto di fase dopo 12 giorni (400X)
cheratinociti
cheratinociti
cheratinociti
cheratinociti
cheratinociti
fibroblasti
FIBROBLASTIFIBROBLASTI
microscopio a contrasto di fase (400X)
Derma
Fibroblasti
FIBROBLASTIFIBROBLASTI
microscopio a contrasto di fase (400X)
microscopio a contrasto di fase dopo 3 giorni (200X)
FIBROBLASTI ALL’INTERNO DEL SUPPORTO DI PLASMAFIBROBLASTI ALL’INTERNO DEL SUPPORTO DI PLASMA
cheratinociti
fibroblasti
microscopio a contrasto di fase dopo 4 giorni (200X)
Ematossilina-Eosina (400X)
FRAMMENTO DI CUTE ARTIFICIALEFRAMMENTO DI CUTE ARTIFICIALE
Ematossilina-Eosina (400X)
FIBROBLASTI FIBROBLASTI
Ematossilina-Eosina (400X)
CHERATINOCITICHERATINOCITI
immunoistochimica: vimentina (400X)
FIBROBLASTIFIBROBLASTI
CHERATINOCITICHERATINOCITI
immunoistochimica: citocheratina AE1 (400X)
MEMBRANA BASALEMEMBRANA BASALE
immunoistochimica: collageno IV
immunoistochimica: Mib1
APPLICAZIONE DELLA METODICA SULLA PAZIENTEAPPLICAZIONE DELLA METODICA SULLA PAZIENTE
INNESTO DEL LEMBO DI CUTE ARTIFICIALEINNESTO DEL LEMBO DI CUTE ARTIFICIALE
prima...
INNESTO DEL LEMBO DI CUTE ARTIFICIALEINNESTO DEL LEMBO DI CUTE ARTIFICIALE
..dopo
SVANTAGGISVANTAGGI VANTAGGIVANTAGGI
Supporto fragile e poco
maneggevole
Permette di ottenere
innesti del tutto
autologhi
Facile da preparare
Basso costo
CONCLUSIONICONCLUSIONI