Il potere antimicrobico degli oli essenziali

Studio sull’attività antimicrobica degli oli essenziali di Rosmarinus officinalis L., Mentha piperita L. e Thymus vulgaris L. nei confronti degli Enterococchi.

Sabrina Bettoni

Classe 4M

Anno scolastico 2009/2010

Liceo Cantonale Lugano 1

Lavoro di maturità di biologia e chimica

Docenti responsabili: Claudio Arrivoli e Luca Paltrinieri

INDICE

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0. ABSTRACT ..................................................................... 3

1. INTRODUZIONE ............................................................. 4

1.1. SCOPO DEL LAVORO DI MATURITA’ ..................................................................................................... 4 1.2. GLI OLI ESSENZIALI .................................................................................................................................. 4 1.2.1. Definizione ................................................................................................................................................ 4 1.2.2. Gli oli essenziali nella storia ............................................................................................................... 5 1.2.3 Composizione chimica degli oli essenziali ...................................................................................... 5 1.2.4. Le proprietà degli oli essenziali ......................................................................................................... 9 1.2.5 Rintracciabilità degli oli essenziali ..................................................................................................... 9 1.2.6 Il ruolo delle essenze nelle piante ................................................................................................... 10 1.2.7. Impiego degli oli essenziali da parte dell’uomo........................................................................ 10 1.2.8 Modalità di impiego degli oli essenziali ......................................................................................... 11 1.2.9. L’azione degli oli essenziali sull’uomo .......................................................................................... 12

1.3. IL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI ESSENZIALI ..................................................................... 14 1.3.1.Il potere antimicrobico ........................................................................................................................ 14 1.3.2. Le proprietà antimicrobiche degli oli essenziali ........................................................................ 16 1.3.3. I batteri .................................................................................................................................................... 17

1.4. LE PIANTE OFFICINALI SOTTOPOSTE ALLO STUDIO ....................................................................... 20 1.4.1. Rosmarinus officinalis L. .................................................................................................................... 20 1.4.2. Thymus vulgaris L. .............................................................................................................................. 22 1.4.3. Mentha piperita L. ................................................................................................................................ 24

2. MATERIALI E METODI .................................................. 26

2.1. IL MATERIALE BIOLOGICO ........................................................................................................................ 26 2.2. LA STRUMENTAZIONE ANALITICA .......................................................................................................... 26 2.2.1. L’estrattore di oli essenziali secondo Farmacopea Europea................................................. 26 2.2.2. Il Gascromatografo con rivelazione di massa (GC-MS) ......................................................... 27 2.2.3. La MIC ...................................................................................................................................................... 28 2.2.4. La MBC ..................................................................................................................................................... 28 2.2.5. L’Aromatogramma ............................................................................................................................... 28

2.3. METODO DI ESTRAZIONE DEGLI OLI ESSENZIALI ........................................................................... 29 2.4. METODO DI ANALISI QUANTITATIVA DEGLI OLI ESSENZIALI .................................................... 30 2.5 DETERMINAZIONE DEL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI ESSENZIALI ............................. 31 2.5.1 La MIC ........................................................................................................................................................ 31 2.5.2 La MBC ....................................................................................................................................................... 32 2.5.3. L’Aromatogramma ............................................................................................................................... 33

3. RISULTATI ................................................................... 34

3.1. ESTRAZIONE DEGLI OLI ESSENZIALI ................................................................................................... 34 3.2. ANALISI QUANTITATIVA GAS CROMATOGRAFICA DEGLI OLI ESSENZIALI ............................ 35 3.2.1 Analisi quantitativa dell’olio essenziale di Mentha piperita L. .............................................. 35 3.2.2. Analisi quantitativa dell’olio essenziale di Rosmarinus officinalis L. ................................. 36 3.2.3. Analisi quantitativa dell’olio essenziale di Thymus vulgaris L. ........................................... 39

3.3. DETERMINAZIONE DEL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI ESSENZIALI ............................ 41 3.3.1. La MIC ...................................................................................................................................................... 41 3.3.2. La MBC ..................................................................................................................................................... 42 3.3.3. L’Aromatogramma ............................................................................................................................... 42

INDICE

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4. DISCUSSIONI .............................................................. 44

4.1. ESTRAZIONE DEGLI OLI ESSENZIALI ................................................................................................... 44 4.2. ANALISI CHIMICA DEGLI OLI ESSENZIALI .......................................................................................... 44 4.3. DETERMINAZIONE DEL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI ESSENZIALI ............................ 45 4.3.1. Potere antimicrobico ........................................................................................................................... 45 4.3.2 Modalità d’azione antimicrobica ....................................................................................................... 45

5. CONCLUSIONI E PROSPETTIVE FUTURE ...................... 49

6. BIBLIOGRAFIA ............................................................ 50

7. ALLEGATI .................................................................... 56

7.1 ESTRAZIONE DEGLI OLI ESSENZIALI ..................................................................................................... 56 7.2. DETERMINAZIONE DEL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI ESSENZIALI ............................ 59

8. RINGRAZIAMENTI ....................................................... 62

ABSTRACT

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0. ABSTRACT

È risaputo che da alcune piante è possibile estrarre delle miscele di sostanze organiche volatili conosciute come oli essenziali. Essi sono noti già dall’antichità e sono stati utilizzati per molteplici scopi come la cosmesi e l’alimentazione. In particolare essi venivano, e vengono tuttora impiegati in campo medico per le loro proprietà terapeutiche. Nonostante la diversa composizione chimica degli oli essenziali, essi hanno in comune alcune proprietà generali: antisettiche, antibatteriche, antifungine e antiossidanti.

In questo lavoro è stato studiato il potere antimicrobico di tre oli essenziali estratti da piante officinali coltivate in Ticino: Mentha piperita L., Rosmarinus officinalis L. e Thymus vulgaris L. Dopo aver analizzato la composizione chimica degli oli essenziali tramite GC-MS, si è proceduto con la valutazione della loro attività antimicrobica nei confronti degli enterococchi attraverso i test della MIC (determinazione della concentrazione minima inibitoria), della MBC (determinazione della concentrazione minima battericida) e dell’aromatogramma (metodo della diffusione su dischetti). Queste prove hanno dimostrato che gli oli essenziali di Mentha piperita L., Rosmarinus officinalis L. e Thymus vulgaris L. possiedono un potere antimicrobico contro gli enterococchi seppur con diversa efficacia. In particolare è stato possibile concludere che l’olio essenziale con un maggior potere antimicrobico risulta essere quello di Thymus vulgaris L. Esso infatti ha dimostrato la sua maggior efficacia in tutte e tre le prove.

INTRODUZIONE

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1. INTRODUZIONE

1.1. SCOPO DEL LAVORO DI MATURITA’

Fin dai tempi antichi le erbe venivano utilizzate per i loro principi attivi a scopo non solo culinario ma anche fitoterapico e cosmetico. Tra le proprietà conosciute vi erano anche quelle antimicrobiche delle piante officinali tanto che nei periodi delle epidemie le erbe aromatiche rappresentavano la principale forma di prevenzione contro le infezioni. È noto ad esempio l’uso del rosmarino durante i periodi di peste (Lawless, 1992). Lo scopo di questo lavoro di maturità è quello di conoscere alcuni aspetti delle piante officinali e, in modo particolare, verificare il potere antimicrobico degli oli essenziali di tre piante comuni a noi tutti quali Rosmarinus officinalis L. (rosmarino), Mentha piperita L. (menta piperita) e Thymus vulgaris L. (timo). Il potere antibatterico è l’area più studiata degli oli essenziali e questa proprietà è l’unica che è realmente ben conosciuta e usata regolarmente (Lawless, 1999). Un agente antimicrobico può avere funzione battericida, cioè essere in grado di uccidere i batteri, o batteriostatica, cioè essere capace di impedire l’accrescimento dei batteri, realizzando una condizione nota come batterio stasi (Lanciotti, 1992). Il lavoro di maturità è stato svolto presso il laboratorio didattico della Fondazione Alpina per le scienze della Vita (FASV) a Olivone. La parte sperimentale è stata preceduta dalla partecipazione ad un’escursione botanica guidata, tra i sentieri della Val di Blenio, al fine di conoscere alcune delle piante officinali del nostro territorio. A seguire, è stata effettuata una vasta ricerca bibliografica che ha condotto allo svolgimento della parte analitica vera e propria. Interessanti sono i risultati ottenuti che verranno discussi nei paragrafi seguenti. Che cosa sono dunque gli oli essenziali e da cosa sono composti? Tra le proprietà che possiedono, esistono anche quelle antimicrobiche? Quale olio essenziale analizzato manifesta un maggior potere antimicrobico?

1.2. GLI OLI ESSENZIALI

1.2.1. Definizione

Il termine di “oli essenziali” o “oli eterei” non raggruppa una categoria di composti dotati di particolari caratteristiche chimiche ma viene usato per indicare i miscugli di sostanze organiche volatili ottenute distillando le piante aromatiche in corrente di vapore acqueo. È importante distinguere gli oli essenziali dalle essenze: si parla infatti di “olio essenziale” solo dopo l’estrazione mentre di “essenza” fintanto che la miscela di sostanze si trova ancora nella pianta (Pedretti, 2003). Il termine “olio essenziale” deriva da un nome coniato nel XVI secolo dal medico e alchimista svizzero Paracelso (pseudonimo di Philipp Theophrast Bombast von Hohenheim). Egli chiamò infatti “Quinta essentia” uno dei componenti di un miscuglio estratto da una pianta (Burt, 2004). Gli oli essenziali usati in aromaterapia devono obbligatoriamente essere ottenuti per distillazione in corrente di vapore acqueo della pianta intera o di una sua parte: questo è infatti l’unico procedimento che permette di ottenere degli estratti 100% naturali, senza tracce di solventi chimici. Fanno eccezione le essenze ottenute dalle bucce dei frutti degli agrumi, come ad esempio limone, arancio e mandarino. In questo caso infatti gli estratti vengono ottenuti per spremitura dei tessuti vegetali.

INTRODUZIONE

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In passato i derivati odorosi delle piante aromatiche venivano designati con nomi diversi come aromi, oli eterei, essenze ma la Farmacopea Francese dal 1972 ha standardizzato la nomenclatura introducendo tassativamente il termine di “olio essenziale” (Pedretti, 2003).

1.2.2. Gli oli essenziali nella storia

Le piante aromatiche vengono utilizzate da migliaia di anni a scopo cosmetico ma anche in ambito medico e culinario (Ali et al., 2005). Il loro impiego rituale costituiva parte integrante della tradizione di quasi tutte le culture. In Oriente le sostanze aromatiche erano spesso considerate molto più che semplici profumi, esse venivano impiegate infatti in ambito sia liturgico che terapeutico. Le più note associazioni che utilizzarono le essenze appartenevano alla civiltà egizia. Alcuni manoscritti su papiro del 2800 a.C registrano l’uso di molte erbe medicinali, di oli e di profumi. Resine e oli venivano infatti impiegati dagli Egizi per le operazioni di imbalsamazione ma anche per la cosmesi. Dagli Egizi impararono poi soprattutto i Greci. Erodoto fu il primo a registrare il metodo della distillazione, intorno al 425 a.C, e a fornire numerosi altri dettagli riguardanti profumi e altri materiali odorosi. Anche Ippocrate, stimato universalmente come “padre della medicina”, prescriveva cure a base di unguenti aromatici (Lawless, 1992). Tra il Settimo e il Tredicesimo secolo d.C in Arabia ci furono molti miglioramenti nelle tecniche usate per la distillazione e ciò permise di ottenere oli essenziali puri e acque aromatiche (Burt, 2004). L’acqua di rose divenne uno dei profumi più diffusi e giunse in Occidente insieme ad altre essenze e al metodo della distillazione (Lawless, 1992). La prima testimonianza scritta autentica riguardante la distillazione di oli essenziali è stata attribuita a Villanova (1235-1311 d.C), fisico catalano (Burt, 2004). Durante il Medioevo, a causa dell’assenza in Europa delle piante orientali, si iniziò a sperimentare erbe indigene quali rosmarino, salvia, menta e lavanda. Già dal Sedicesimo secolo erano in vendita nelle farmacie alcuni oli noti come “oli chimici”, adibiti alla cura del corpo e della mente, e nello stesso periodo furono pubblicati numerosi erbari (Lawless, 1992). Per tutto il Rinascimento i materiali aromatici fecero parte delle farmacopee, rappresentando per secoli la principale forma di prevenzione contro le epidemie. Nel corso dei secoli successivi i farmacisti presero ad analizzare e a registrare le proprietà e applicazioni medicinali di un crescente numero di nuovi oli essenziali. Grazie alla Rivoluzione scientifica che ebbe luogo all’inizio dell’Ottocento il chimico fu in grado per la prima volta di identificare i vari componenti degli oli essenziali, chiamandoli con nomi specifici come ad esempio “geraniolo” e “limonene” (Lawless, 1992). Le entusiasmanti ricerche posero le fondamenta dello sviluppo dei sostituti sintetici degli oli e della nascita della moderna industria farmaceutica. La fitoterapia e l’aromaterapia persero la loro credibilità tanto che mezzo secolo fa l’impiego terapeutico di erbe e oli essenziali non era visto di buon occhio ed era persino ufficialmente proibito, perché visto come forma di cura arcaica. Ma gli ultimi anni sono stati testimoni di una straordinaria rinascita dell’interesse per i metodi di cura naturali. La medicina erboristica ha raggiunto un buon grado di credibilità agli occhi di molti medici e dell’opinione pubblica in generale. Il mondo scientifico sta, infatti, rivalutando il valore dei rimedi naturali: a mano a mano che vengono riconosciuti l’efficacia a volte limitata e gli effetti collaterali indesiderabili di alcuni farmaci di sintesi, gli oli essenziali tornano ad ottenere i dovuti riconoscimenti (Lawless, 1999).

1.2.3 Composizione chimica degli oli essenziali

I componenti degli oli essenziali, o meglio delle essenze, sono metaboliti secondari della pianta, cioè sono prodotti del metabolismo che non partecipano direttamente alla crescita e allo sviluppo dell'organismo (Raven et al., 2002). Nelle piante si possono individuare due tipi di metabolismo: il metabolismo primario e il metabolismo secondario (Raven et al., 2002). Il metabolismo primario consiste nella biosintesi di sostanze indispensabili per lo sviluppo e il funzionamento delle strutture biologiche. I

INTRODUZIONE

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protagonisti del metabolismo primario, detti metaboliti primari, sono molecole che si trovano in tutte le cellule vegetali. Sono metaboliti primari gli zuccheri semplici, le proteine, i grassi e gli acidi nucleici (Cronquist, 1979). Il metabolismo secondario, invece, riguarda la sintesi di moleccole le cui funzioni riguardano tutti gli aspetti delle interazioni chimiche con l’ambiente circostante. Tali metaboliti, detti secondari sono caratterizzati dal basso peso molecolare e hanno una distribuzione delimitata sia all’interno di una stessa pianta sia nelle differenti specie vegetali (Raven et al., 2002). Esempi di metaboliti secondari sono appunto i componenti degli oli essenziali (terpeni, fenoli). I vegetali infatti sono capaci di sintetizzare una grande varietà di altri composti, oltre ai metaboliti primari, indispensabili alla loro vita; alcuni di essi sono, dal punto di vista chimico, semplici mentre altri sono complessi. La biosintesi di metaboliti secondari avviene attraverso vie metaboliche che usano prodotti intermedi del metabolismo primario. Tale sintesi avviene generalmente in uno specifico tessuto o tipo di cellula, in un determinato stadio dello sviluppo. I metaboliti secondari sono prodotti in vari comparti della cellula e vengono conservati all’interno dei vacuoli. Molto spesso essi sono sintetizzati in una parte ben precisa della pianta e vengono immagazzinati in un’altra; inoltre, la loro concentrazione nella pianta varia, spesso significativamente, nel corso delle 24 ore. I processi del metabolismo primario e secondario sono strettamente connessi tra loro tuttavia, la pianta utilizza il metabolismo primario per produrre metaboliti secondari solo se il metabolismo primario possiede sufficiente energia e reagenti per svolgere a pieno le sue funzioni normali, senza che queste vengano in alcun modo alterate o interrotte (Raven et al., 2002). In condizioni favorevoli i metaboliti secondari vengono prodotti in quantità significative dalle piante, sebbene tali quantità siano decisamente inferiori in rapporto ai metaboliti primari. Le funzioni dei metaboliti secondari sono tuttora in gran parte sconosciute tuttavia, non sono più considerati dei rifiuti come una volta, ma si è potuto constatare che essi sono importanti per la sopravvivenza e la propagazione della pianta che li produce. Molti di essi agiscono come un segnale chimico che permette alla pianta di rispondere agli attacchi dell’ambiente; altri agiscono come sostanze di difesa contro gli erbivori, i patogeni e i competitori. Vi sono, inoltre, metaboliti che forniscono alla pianta protezione contro le radiazioni solari e, infine, altri che aiutano nella dispersione di polline e semi. Gli oli essenziali sono miscele molto complesse di metaboliti secondari. Ogni tipo di olio essenziale ha la sua specifica composizione chimica che varia non solo in base alla specie di pianta da cui l’olio è stato estratto ma in base alle caratteristiche specifiche della pianta da cui l’olio è stato estratto (Pedretti, 2003). Nonostante la composizione chimica degli oli essenziali sia molto complessa, è possibile riunire i componenti in alcuni gruppi fondamentali sulla base degli elementi presenti nei composti (Pedretti, 2003): � Composti contenenti carbonio e idrogeno

� idrocarburi monoterpenici (C10) alifatici e aromatici insaturi mono e biciclici: limonene, mircene, pinene, canfene, terpinene, sabinene, fellandrene, silverstrene.

� idrocarburi sesquiterpenici (C15 ): cardinene, selinene, umulene, cariofillene, cedrene. � azuleni: camazulene, eucazulene, gajazulene, vetivazulene. � idrocarburi diterpenici (C20 ): canforene, cupressene.

� Composti contenenti carbonio, idrogeno e ossigeno

� alcooli: geraniolo, linalolo, terpineolo, mentolo, nerolo, citronellolo, borneolo, mirtenolo, santalolo, farnesolo.

� aldeidi: aldeide cinnamica, aldeide benzoica, aldeide anisica, vanillina, citrale, citronellale.

� chetoni: carvone, tujone, canfora, mentone, fencone, pulegone. � eteri: eucaliptolo, safrolo, estragolo, anetolo, apiolo. � esteri: acetato di linalile, salicilato di metile, acetato di geranile, acetato di bornile,

benzoato di benzile, acetato di terpenili.

INTRODUZIONE

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� acidi organici: acido benzoico, acido cinnamico, acido salicilico, acido cuminico. � perossidi: ascaridolo � fenoli: timolo, eugenolo, carvacrolo.

I composti fenolici comprendono i flavonoidi, i tannini, le lignine e l’acido salicilico. Il termine fenolici comprende un’ampia gamma di composti, i quali hanno tutti un gruppo ossidrilico legato ad un anello aromatico (Hart at al., 2007). Essi sono presenti in quasi tutte le piante e si posso accumulare in tutte le loro parti (Raven et al., 2002).

� Composti contenenti carbonio, idrogeno, ossigeno, azoto e zolfo

� derivati solfocianici e solforati (Pedretti, 2003). Tra questi tipi di composti è possibile evidenziare tre classi principali: gli alcaloidi, i terpenoidi e i composti fenolici (Raven et al., 2002). I principali costituenti chimici degli oli sono rappresentati da terpeni che sono idrocarburi con formula generale (C5H8)n. Essi sono biomolecole costituite da multipli dell'unità isoprenica (sono chiamati anche isoprenoidi), e possono essere lineari, ciclici o entrambi. Essi rappresentano la classe più abbondante di metaboliti secondari, in quanto comprendono più di 22000 composti descritti (Raven et al., 2002). Ogni unità isoprenica è costituita da cinque atomi di carbonio, e viene legata ad altre unità isopreniche in diversi modi. Le varie unità che costituiscono i terpeni possono essere modificate e contenere elementi diversi da carbonio e idrogeno (Hart et al., 2007).

Fig. 1. Struttura della molecola di isoprene (Hart et al., 2007)

I terpeni vengono sintetizzati dalla pianta, a partire da acetato, attraverso un intermedio biochimicamente molto importante, il pirofosfato di isoprenile (Hart et al., 2007). Essendo il più ampio gruppo di sostanze naturali vegetali, i terpeni nelle piante, sono coinvolti in un’ampia varietà di processi, dalla fotosintesi e dalla crescita, alla riproduzione e alla difesa (Hart et al., 2007). Una singola pianta può sintetizzare molti differenti terpenoidi, in tempi differenti durante il suo sviluppo e localizzati in parti diverse della pianta (Raven et al., 2002). I terpeni vegetali non solo giocano un ruolo fondamentale nelle piante, ma sono anche impiegati come aromi, fragranze e medicinali (Raven et al., 2002). Essi vengono classificati in base al numero di subunità (unità isopreniche (C5H8)) contenute nella loro struttura (Hart et al., 2007).

INTRODUZIONE

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CLASSIFICAZIONE

UNITÀ

ISOPRENICHE

ATOMI DI CARBONIO

Emiterpeni

1

5

Monoterpeni 2 10

Sesquiterpeni 3 15

Diterpeni 4 20

Sesterterpeni 5 25

Triterpeni 6 30

Tetraterpeni 8 40

Tab.1. Classificazione dei terpeni in base al numero di unità isopreniche e al numero di atomi di carbonio

I composti con una sola unità isoprenica (C5) sono piuttosto rari in natura, mentre quelli con due o tre unità (C10 e C15), i cosiddetti monoterpeni e sesquiterpeni, sono assai frequenti (Hart et al., 2007). Gli oli essenziali contengono in prevalenza monoterpeni e sesquiterpeni che non hanno un peso molecolare alto e proprio per questo a temperatura ambiente sono liquidi. Sono esempi di terpeni il geraniolo, il mentolo, la canfora, il limonene e il pinene (Hart at al., 2007). Oltre ai terpeni, tra i componenti degli oli essenziali vi sono anche i fenoli o altri idrocarburi ossigenati. Talvolta sono presenti anche acidi, lattoni (composti chimici la cui struttura è costituita da un estere ciclico) e composti contenenti zolfo o azoto (Pedretti, 2003). La tipologia e la quantità dei componenti dell’olio essenziale ne determinano e ne caratterizzano le proprietà. La varietà e la ricchezza dei composti contribuisce alle caratteristiche peculiari di ciascun olio (Burt, 2004). In alcuni oli essenziali può predominare un solo costituente, in altri non c’è un singolo componente che prevale, ma un equilibrio di vari composti. Anche i componenti presenti in minime tracce possono influenzare in modo preponderante l’attività biologica dell’olio essenziale stesso (Pedretti, 2003). Dato che i componenti degli oli essenziali sono metaboliti secondari la composizione chimica dell’essenza subisce una forte influenza dell’ambiente esterno (Burt, 2004). La composizione di un’essenza è influenzata dal clima e in particolare dalla stagionalità (Piccaglia et al., 1993; Burt, 2004; van Vuuren et al., 2007a). Altri parametri importanti che influiscono sulla composizione delle essenze sono l’area geografica dove è cresciuta la pianta, l’altitudine (Rota et al., 2007), il tipo di terreno, la presenza di differenti quantità d’acqua, la pendenza del terreno, le modalità di coltivazione e, fattore molto importante, la durata della foto esposizione (esposizione alla luce del sole) infatti, la formazione delle essenze è strettamente legata all’azione della luce e del calore del sole (Burt, 2004).

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Anche i fattori genetici ed epigenetici1 influenzano la composizione di un’essenza (Ibrahim et al., 2001). È noto infatti che tra gli individui di una stessa specie è sempre possibile evidenziare una variabilità nei caratteri morfologici e biochimici (Pedretti, 2003). Per questi motivi, anche piante dello stesso genere o della stessa specie, possono produrre oli che si diversificano in parte nella composizione e nel contenuto dei diversi principi attivi (chemiovarietà).

1.2.4. Le proprietà degli oli essenziali

Le proprietà fisico-chimiche Gli oli essenziali sono, nella maggior parte dei casi, liquidi a temperatura ambiente, di consistenza oleosa e più o meno fluidi. Essi sono insolubili o poco in acqua (sulla quale galleggiano), alla quale però trasmettono il loro aroma perché lievemente idrofili. Sono invece solubili in alcol, etere, cloroformio e nella maggior parte dei solventi organici. Sono tutti dotati, a causa della loro volatilità, di odore aromatico forte e per lo più gradevole. Questa caratteristica li contraddistingue tra l’altro dagli altri oli o lipidi (Pedretti, 2003). Le proprietà biologiche Nonostante la diversa e variabile composizione chimica degli oli essenziali, essi hanno in comune alcune proprietà generali: antisettiche, antibatteriche (Nedorostova et al., 2009) e antifungine (Preuss et al., 2005). Alcuni oli essenziali possiedono inoltre anche proprietà antiossidanti, antivirali, analgesiche, antinfiammatorie, antitossiche, astringenti, digestive, drenanti, tonificanti, cicatrizzanti, immunostimolanti, mucolitiche ed espettoranti (Lawless, 1992).

1.2.5 Rintracciabilità degli oli essenziali

Le essenze sono particolarmente abbondanti nelle piante appartenenti alle famiglie delle Lamiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Cupressaceae, Geraniaceae, Lauraceae, Myrtaceae e Verbenaceae (Lawless, 1992). Esse vengono sintetizzate in diverse parti della pianta a seconda della specie (steli, foglie, gemme, fiori, frutti, semi, legno e radici), sebbene siano generalmente sintetizzate nelle parti aeree (Raven et al., 2002). Le essenze sono spesso accumulate sotto forma di minuscole goccioline, negli spazi intercellulari o in strutture di secrezione interne o esterne come ad esempio nei canali resiniferi (Pedretti, 2003), molto diffusi in tutti gli organi della maggior parte delle conifere; sono tappezzati internamente da cellule secretrici, cellule vive che producono e secernono la resina nei dotti stessi, e delimitati da una guaina con pareti ispessite (Cronquist, 1979), nelle tasche lisigene (puntini visibili ad occhio nudo nella buccia dei frutti degli agrumi che si presentano, in sezione, come cavità sferiche, non chiaramente delimitate, in prossimità dell'epidermide). Si formano in seguito alla morte e alla disgregazione delle cellule secretrici contenenti oli essenziali, che procede dal centro verso l'esterno della tasca. Il secreto è quindi costituito dagli oli essenziali e dai resti delle cellule secernenti (Cronquist, 1979) e nei peli ghiandolari esterni o tricomi ghiandolari, sottili escrescenze o appendici di piante che possono essere uni- o pluricellulari (Raven at al., 2002); tutte le cellule possono essere secernenti, però nei tricomi più elaborati (ad esempio quelli della menta), generalmente si distingue una testa formata da ghiandole secernenti ricoperte da una spessa cuticola che forma una pellicola continua (Cronquist, 1979). Il prodotto della secrezione, costituito da oli 1 Epigenetica. Col termine epigenetica s’intende lo studio dei meccanismi ereditabili di modificazione del materiale genetico che alterano l’espressione genica senza però cambiare la sequenze del genoma. Esempio di fattore epigenetico è la metilazione del DNA (Watson et al., 2008).

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essenziali, si accumula spesso al di sotto della cuticola che si stacca perciò dalla parete sottostante; la cuticola si può rompere e il prodotto della secrezione viene liberato (Pedretti, 2003). Le essenze sono presenti nelle piante in piccole quantità rispetto alla massa del vegetale, generalmente la loro quantità varia dallo 0,01% al 10% (Pedretti, 2003).

1.2.6 Il ruolo delle essenze nelle piante

Il ruolo delle essenze nella pianta resta ancora in gran parte sconosciuto; tuttavia il riconoscimento delle proprietà biologiche di molti composti degli oli essenziali ha aumentato l’interesse in questo campo per la ricerca di nuovi farmaci, antibiotici, insetticidi ed erbicidi ed ha portato ad una rivalutazione della funzione che questi assumono nelle piante, specialmente nel contesto ecologico (Enan, 2001). È noto, infatti, che molti di questi composti hanno un importante significato adattativo nella protezione contro gli erbivori e gli attacchi da parte di funghi e batteri (Raven et al., 2002). Il potere antimicrobico degli oli essenziali viene quindi già sfruttato in natura (Burt, 2004) e questo dimostra in qualche modo la loro efficacia. Gli oli essenziali possono giocare un ruolo importante anche come attrattivi per gli impollinatori e per la dispersione dei semi attraverso gli animali; ma anche come repellenti per gli insetti (Raven et al., 2002). Diverse piante producono infatti dei profumi per attirare gli insetti per farli partecipare all’impollinazione altre, al contrario, sintetizzano, per allontanarli, sostanze insetto-repellenti e persino insetticidi (Kim et al, 2004) capaci di interferire coi loro processi fisiologici e biochimici (Ibrahim et al., 2001). Le essenze possono infatti agire come segnali biochimici che vengono recepiti dagli insetti come deterrente scoraggiandoli a cibarsi della pianta e a deporvi le uova (Gatehouse, 2002). Gli insetti sono inoltre particolarmente sensibili alle molecole aromatiche perché comunicano tramite messaggi chimici; gli oli essenziali interferiscono con gli organi sensoriali degli insetti, interagendo con le loro attività (ad esempio la ricerca del loro obiettivo) e i loro comportamenti (Ibrahim et al., 2001). Gli oli essenziali nella pianta possono svolgere una funzione allelopatica e cioè intervenire nella competizione interspecifica (cioè riduzione della sopravvivenza o dell’accrescimento d'una popolazione a causa della presenza d’altre specie interferenti) tra specie diverse di piante. Il fenomeno dell’allelopatia consiste nel rilascio nel terreno, da parte di una pianta, di sostanze che inibiscono la crescita e lo sviluppo di piante concorrenti (Ibrahim, 2001). L'allelopatia riduce la competizione interspecifica, perché diminuisce o elimina altre piante potenzialmente competitrici nella disponibilità delle risorse come nutrienti, acqua o luce (Raven et al., 2002). In alcuni casi invece i composti contenuti negli oli essenziali costituiscono prodotti di rifiuto della pianta (Raven et al., 2002).

1.2.7. Impiego degli oli essenziali da parte dell’uomo

Date le numerose proprietà oggigiorno gli oli essenziali vengono utilizzati, in particolare nell’industria alimentare, come aromatizzanti e come conservanti (Nguefack et al., 2009), nell’industria cosmetica (Bakkali et al., 2008), come profumi e nell’industria farmaceutica quali componenti di medicamenti. L’utilizzo degli oli essenziali in aromaterapia costituisce meno del 2% del mercato totale (Burt, 2004). Gli oli essenziali sono inoltre utilizzati in ambito domestico come cosmetici, per bagni profumati e massaggi, per profumare gli ambienti (Lawless, 1992) e infine, come insetticidi (Enan, 2001).

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Utilizzo degli oli essenziali nella fitoterapia e nell’aromaterapia Gli oli essenziali vengono utilizzati nell’ambito della fitoterapia, dell’aromaterapia e della cosmesi (Lawless, 1999). La fitoterapia rappresenta la pratica terapeutica che prevede l'impiego delle piante officinali o degli estratti da esse ottenuti per la cura delle malattie o per il mantenimento del benessere (Heinrich et al., 2004). La fitoterapia è una delle più antiche pratiche usate dall’uomo per curare i propri disturbi, se ne trovano tracce in civiltà antichissime come quella degli egizi, degli indù, dei greci, dei cinesi e dei romani (Campanini, 2004). Con l’avvento della chimica e dei primi farmaci di sintesi, la fitoterapia è stata accantonata, per essere riscoperta, negli ultimi decenni, sia come metodo integrativo da affiancare alla medicina convenzionale, sia come rimedio alternativo (Lawless, 1999). I prodotti fitoterapici sono disponibili come estratti per esempio in capsule, compresse o tinture (miscele di alcol e acqua, in cui la pianta è lasciata a macerare per un certo periodo) che ne semplificano l’uso. È anche possibile preparare dei semplici prodotti fitoterapici come decotti o infusi (Capasso, et al.,2008). L’aromaterapia costituisce una pratica terapeutica che impiega gli oli essenziali (Lawless, 1992). La pratica aromaterapica può essere considerata una parte del più grande ambito della fitoterapia, in quanto l’olio essenziale è solo uno dei diversi modi in cui una pianta può diventare rimedio. Benché la maggior parte delle piante dalle quali si estraggono gli oli essenziali sono usate anche nella fitoterapia, è importante differenziare le qualità terapeutiche di un particolare olio da quelle della pianta, intera o preparata in altro modo. È importante ricordare che l’olio essenziale è chimicamente distinto dall’olio vegetale originato dalla pressione a freddo di frutti o semi (Lawless, 1999). Nella medicina popolare così come in aromaterapia, gli oli essenziali e le molecole aromatiche sono state usate e tutt’ora lo sono, come agenti terapeutici (Heinrich et al, 2004). Questi composti naturali esercitano significativi effetti biologici e farmacologici, dovuti principalmente alla loro natura lipofila (Lawless, 1999). Il potenziale terapeutico degli oli essenziali non è stato ancora stimato in tutta la sua portata. Resta ancora molto da scoprire riguardo il loro aspetto farmacologico, benché molte erbe medicinali siano impiegate fin dai tempi antichi. Questo è dovuto alla grande complessità della composizione degli oli essenziali, che contengono numerosissimi composti diversi (Capasso et al., 2008).

1.2.8 Modalità di impiego degli oli essenziali

Come norma generale, è preferibile impiegare gli oli essenziali solo diluiti ed omogeneizzati in una sostanza naturale neutra (eccipiente) prima di venire somministrati o applicati per via esterna. Lo rende consigliabile l’elevata concentrazione degli oli e la potenziale irritazione o il possibile danno che possono causare in forma non diluita alle mucose o alla pelle (Capasso et al., 2008). L’impiego di un buon eccipiente è spesso la chiave del successo terapeutico; il suo ruolo principale è quello di diluire e disperdere gli oli essenziali e facilitarne il dosaggio e l’assorbimento. Se l’eccipiente usato possiede inoltre delle proprietà emulsionanti, gli oli essenziali potranno mescolarsi con i liquidi acquosi, facilitando così la loro dispersione e la loro penetrazione nei tessuti (Lawless, 1999).

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Esistono diverse modalità di impiego terapeutico degli oli essenziali:

• assunzione per via orale: gli oli essenziali possono essere usati per via orale per trattare un’infezione del tubo digerente (diarrea, problemi di flora intestinale). L’ambiente del tratto digerente è essenzialmente un ambiente "acquoso": è dunque importante che gli oli essenziali ingeriti siano diluiti e ben emulsionati (grazie ad un particolare eccipiente) in una soluzione acquosa. Più l’emulsione è omogenea, più gli oli essenziali saranno attivi e non irritanti (Capasso et al., 2008)

• assunzione per via rettale: l’uso di supposte permette un assorbimento rapido ed

efficace degli oli essenziali. Questa è la via più pratica e più raccomandabile per i bambini. È anche utile per le persone che non possono assumere oli essenziali per via orale (Lawless, 1999).

• applicazione cutanea: gli oli essenziali possono essere applicati sulla pelle o sul cuoio

capelluto. Oltre ad essere usati per dei massaggi terapeutici, essi permettono di disinfettare o di trattare alcune patologie della pelle (piaghe, ascessi, funghi e micosi, infezioni varie, eczemi). Per l’applicazione sulla pelle occorre utilizzare degli eccipienti come degli oli vegetali o saponi liquidi (Lawless, 1999), oppure si può usare una preparazione di oli essenziali dispersi in una soluzione acquosa od un’emulsione (olio in acqua). Il massaggio con gli oli essenziali rappresenta spesso la forma più diffusa di trattamento per quanto riguarda la loro applicazione cutanea (Lawless, 1999). L’applicazione sulla pelle attraverso il massaggio facilita l’assorbimento e la penetrazione dell’olio. Le molecole aromatiche entrano attraverso i follicoli dei peli e le ghiandole del sudore ed essendo solubili nei lipidi possono penetrare anche attraverso il film idrolipidico della pelle. (Lawless, 1999). I capillari sanguigni sottostanti possono quindi assorbire l’olio essenziale che entra facilmente nel circolo sistemico. È stato calcolato un diverso grado di assorbimento delle componenti aromatiche nel sangue, variabile dal 4% al 25% (Campanini, 2004).

• diffusione atmosferica: gli oli essenziali sono dei prodotti aromatici, dunque

particolarmente adatti ad essere nebulizzati nell’atmosfera grazie a particolari diffusori (Campanini, 2004).

1.2.9. L’azione degli oli essenziali sull’uomo

Gli oli essenziali esercitano delle attività terapeutiche polivalenti i cui meccanismi d’azione non sono sempre chiari e univocamente individuati. Tuttavia si può dire che gli oli essenziali influenzano tutti i sistemi organici con un’azione di potenziamento delle funzioni vitali; ma accanto a questa attività ve ne sono altre, caratteristiche per un loro tropismo (risposta a uno stimolo esterno) specifico verso un organo, un sistema o un apparato. Bisogna tener presente che le azioni terapeutiche degli oli essenziali sono sempre integrate e mai isolate o limitate ad una funzione o ad un organo. I costituenti chimici delle essenze, il loro odore, il loro sapore agendo singolarmente o in sinergia determinano sempre un’azione globale che coinvolge l’unità psicosomatica dell’uomo (Pedretti, 2003).

• Azione sull’apparato digerente: il tubo gastroenterico e le ghiandole annesse sono nettamente influenzati dagli oli essenziali (Pedretti, 2003). Essi stimolano, attraverso la sollecitazione delle terminazioni nervose dei recettori gustativi e olfattivi, le secrezioni salivare, gastrica ed enterica migliorando il processo della digestione (Lee et al, 2004). Se somministrati per via interna essi agiscono anche con un meccanismo ghiandolare a seguito di una stimolazione diretta delle ghiandole gastriche secernenti. Esistono altre azioni di notevole importanza come ad esempio quella antispasmodica sulla muscolatura liscia (Hajhashemi et al, 2000; Görnemann et al., 2008), quella anti

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fermentativa, quella antiacida e quella carminativa (azione che favorisce l’espulsione di gas dall’apparato digerente). Alcuni oli essenziali infine si caratterizzano per un singolare effetto protettivo sul tratto gastroenterico, prevenendo l’insorgenza di ulcera gastrica (Gomes Silva et al, 2009).

• Azione sull’apparato cardiocircolatorio: il cuore e i vasi sanguigni sono sensibili

anch’essi alle proprietà degli oli essenziali (Lahlou et al, 2002). Alcuni oli essenziali stimolano il muscolo cardiaco mentre altri rallentano la frequenza cardiaca (Lahlou et al, 2004). Anche il diametro dei vasi sanguigni può essere influenzato dagli oli essenziali che provocano ipotensione o ipertensione tramite meccanismi muscolari o nervosi (Lahlou et al, 2001).

• Azione sul sistema nervoso: alcuni oli essenziali manifestano un particolare effetto sul

sistema nervoso centrale (Giorgetti et al, 2007) e su quello autonomo (Saeki, 2000). Alcuni oli essenziali possiedono proprietà convulsivanti (Socorro de Barros Viana et al, 2000), mentre altri hanno proprietà anticonvulsivanti (Socorro de Barros Viana et al, 2000). Altri ancora hanno proprietà stimolanti (Churl Lim et al, 2004) calmanti o sedativi (Churl Lim et al, 2004; Blanco et al., 2009). Infine esistono oli essenziali che possiedono proprietà ansiolitiche (Linck et al., 2009).

• Azione sullo stato psichico: gli oli essenziali influendo sul sistema nervoso (Masago at al., 2000) producono effetti anche sullo stato psichico (Masago at al., 2000). È possibile comunque ottenere un effetto simile sulla psiche anche mediante l’olfatto, sfruttando l’odore che promanano gli oli essenziali (Haze et al, 2002). La porzione superiore della cavità nasale è tappezzata dalle terminazioni nervose delle cellule olfattive bipolari. Le molecole volatili dell’olio essenziale si legano ai recettori delle cellule olfattive che trasducono l'informazione chimica in un impulso elettrico che, confluendo nel nervo olfattivo, va a stimolare i centri olfattivi del talamo, del bulbo e del telencefalo (Campbell, 2006). In questo modo il semplice odore degli oli essenziali è in grado di condizionare l’umore e il sistema nervoso. È possibile constatare negli oli essenziali proprietà neurocalmanti o ansiolitiche (Gomes Silva et al, 2007). e neurostimolanti o antidepressivi anche quando sono somministrati per inalazione (Pedretti, 2003). Tuttavia gli effetti dell’odore degli oli essenziali risultano essere altamente personali e non costanti nei vari individui. In questo caso quindi gli oli essenziali hanno effetti specifici su ogni individuo (Masago et al., 2000).

• Azione sul sistema endocrino: gli oli essenziali, a prescindere dal contenuto di sostanze

ormono-simili caratteristico di alcuni di essi, si comportano come degli ormoni vegetali (fito-ormoni). Gli oli essenziali giungono ai tessuti specifici regolandone l’attività metabolica, la crescita e quindi comportandosi come fattori importanti di regolazione. È nota la loro azione stimolante o inibente su alcune ghiandole endocrine; ad esempio alcuni oli essenziali stimolano la secrezione degli ormoni ipofisari (Pedretti, 2003).

• Azione sul sistema immunitario: le malattie batteriche che colpiscono l’uomo sono

divenute numerose e cresce sempre di più l’elenco dei batteri catalogati dai microbiologi perché ritenuti colpevoli di essere la causa di qualche nuova affezione. Tuttavia la malattia batterica non è mai l’effetto immediato della patogenicità di un batterio quanto la risultante di due termini interagenti tra di loro: le naturali difese immunologiche proprie di ciascuno di noi e la virulenza del microbo. Per quanto non se ne conosca il meccanismo d’azione alcuni oli essenziali hanno la facoltà di stimolare la produzione di linfociti rendendo l’organismo più pronto a respingere le aggressioni batteriche (Standen e Myers, 2004).

• Azione sull’apparato respiratorio: gran parte degli oli essenziali sono eliminati, in

quantità maggiore o minore, attraverso l’apparato respiratorio a livello del quale esercitano un’azione antisettica, antispastica, espettorante (Nicolato et al., 2009), spasmolitica e broncodilatatoria. (Gilani et al., 2009).

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• Azione sull’apparato urinario: molti costituenti degli oli essenziali in fase di eliminazione esercitano un’azione diuretica, antilitiasica e antisettica. L’azione diuretica degli oli essenziali può essere l’effetto di un’influenza sul processo di ultrafiltrazione che avviene nel glomerulo (agglomerato di capillari sanguigni nel rene) oppure la conseguenza di una modesta irritazione dell’epitelio renale indotta dai costituenti dell’olio essenziale (Pedretti, 2003).

• Antitossica: l’alta resistività degli oli essenziali rispetto a quella del sangue è in grado di

ostacolare la diffusione delle tossine. Appare più verosimile però che l’azione antitossica si esprima attraverso la captazione delle tossine circolanti da parte delle molecole aromatiche e la formazione di complessi atossici e inattivi (Pedretti, 2003).

• Azione sul tessuto tegumentario: gli oli essenziali hanno spiccate caratteristiche lipofile

che li rendono solubili nei lipidi della pelle; si parla infatti di alto potere transcutaneo. Questa proprietà può essere sfruttata: per agire sugli organi profondi e sottostanti il punto di applicazione, per veicolare altre sostanze attive e per avere effetti sistemici. Infatti superata la barriera cutanea l’olio essenziale si propaga per diffusione nei liquidi extracellulari per giungere fino al sangue e alla linfa attraverso cui giunge infine ai tessuti e agli organi (Pedretti, 2003).

• Azione battericida e/o batteriostatica: gli oli essenziali possiedono un elevato potere

battericida e batteriostatico, cioè sono in grado di uccidere o inibire i batteri patogeni (Sivropoulou et al., 1996; Burt, 2004; van Vuuren et al., 2007). Dell’azione antimicrobica degli oli essenziali se ne parlerà in modo più specifico nel paragrafo seguente.

1.3. IL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI ESSENZIALI

1.3.1.Il potere antimicrobico

Col termine “potere antimicrobico” s’intende la capacità di un agente antimicrobico di rimuovere, inibire o uccidere i microrganismi. Un agente antimicrobico è un agente chimico o fisico che interferisce con l’accrescimento e l’attività dei microbi. Questo termine designa, nell’uso comune, l’inibizione dell’accrescimento con riferimento a specifici gruppi di organismi (batteri, virus e funghi); si parla infatti di: antibatterico, antivirale e antimicotico detto anche antifungino (Pelczar et al.,1984). I numerosi processi e le sostanze impiegate come agenti antimicrobici possono manifestare la loro attività in uno dei vari modi (Lanciotti, 1992). I microrganismi vengono infatti inibiti o uccisi secondo un processo letale che inizia in uno specifico sito d’azione e una volta che è stato imposto il processo letale iniziale si instaura un effetto “domino” che può portare alla morte del microbo (Pelczar et al.,1984). Si possono individuare le seguenti modalità d’azione antimicrobica:

• Danneggiamento della parete cellulare La parete cellulare è una struttura importante, in quanto fornisce protezione e partecipa ad alcuni processi fisiologici della cellula. Alcuni agenti possono inibire la formazione del materiale della parete cellulare dei batteri, con la risultante formazione di una struttura suscettibile a lisi e quindi a morte cellulare (Pelczar et al.,1984).

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• Alterazione della permeabilità cellulare La membrana citoplasmatica preserva l’integrità dei costituenti cellulari e assicura il trasporto selettivo delle sostanze nutritive nella cellula. Un danno a questa membrana può avere come effetto l’inibizione dell’accrescimento o la morte della cellula. L’attività antimicrobica dei composti fenolici è attribuibile al loro effetto sulla permeabilità cellulare. Queste sostanze infatti hanno la capacità di annullare la permeabilità selettiva dalla membrana, permettendo la fuga dei costituenti cellulari. L’azione battericida di questi agenti può essere correlata con la fuga di azoto e fosforo dalla cellula. Nella membrana batterica risiedono parecchi enzimi e quindi un’alterazione della membrana può influenzare negativamente il funzionamento di questi enzimi (Pelczar et al.,1984).

• Alterazione delle proteine e degli acidi nucleici La sopravvivenza di una cellula è associata alla conservazione delle proteine e degli acidi nucleici. Una condizione o una sostanza che alteri queste molecole, cioè denaturi proteine o acidi nucleici, può danneggiare irreversibilmente la cellula. Temperature elevate provocano ad esempio una denaturazione di questi costituenti cellulari (Pelczar et al.,1984).

• Inibizione dell’azione enzimatica Ciascuno dei numerosi differenti enzimi presenti nella cellula rappresenta un potenziale bersaglio per un inibitore. L’inibizione delle reazioni che forniscono energia (ATP) risulta particolarmente dannosa. Alcuni agenti sono in grado di danneggiare i costituenti cellulari in misura tale che essi non sono più in grado di svolgere le normali funzioni metaboliche. Per esempio, l’attività di molti enzimi dipende da uno dei loro componenti, il gruppo solfidrilico. Un agente ossidante può alterare questo gruppo e inattivare gli enzimi (Pelczar et al.,1984).

Fig. 2. Disattivazione di un enzima tramite un agente ossidante (Pelczar et al.,1984).

• Antimetaboliti Esistono alcuni casi di inibizione il cui danno iniziale è un’interferenza in una biosintesi specifica. Molti composti essenziali per il metabolismo microbico possono essere bloccati da composti strutturalmente simili al metabolita naturale, ma lievemente diverso da esso. Tali sostanze vengono chiamate antimetaboliti (Pelczar et al.,1984)

• Inibizione della sintesi degli acidi nucleici Certe sostanze chimiche sono potenti inibitori della sintesi dell’RNA e del DNA. Due categorie di sostanze inibiscono la sintesi degli acidi nucleici: i composti che interferiscono con la formazione delle unità costitutive degli acidi nucleici, e cioè delle basi azotate, e i composti che interferiscono con la polimerizzazione dei nucleotidi in acidi nucleici. Il ruolo fondamentale del DNA e del RNA nella cellula suggerisce che qualunque interferenza con la loro formazione e funzione danneggia gravemente la cellula (Pelczar et al.,1984).

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Quando si applica un qualunque agente antimicrobico fisico o chimico, bisogna prendere in considerazione molti fattori poiché certe condizioni influenzano il tasso con cui i microrganismi vengono inibiti o uccisi. Condizioni che influenzano l’azione antimicrobica In generale la temperatura è in grado di influenzare l’attività antimicrobica di un dato agente antimicrobico in quanto un suo aumento, accelera la distruzione dei microrganismi. Una piccola quantità di agente chimico a una temperatura elevata conseguirà un risultato analogo di una maggior quantità della stessa sostanza a temperatura più bassa (Pelczar et al.,1984). Anche lo stato fisiologico degli organismi può influenzare la sensibilità ad un agente antimicrobico. Le cellule giovani, che metabolizzano attivamente, possono essere distrutte più facilmente delle cellule vecchie, nel caso di un agente che interferisce col metabolismo: le cellule che non fossero in accrescimento non verrebbero influenzate (Pelczar et al.,1984). Un altro importante fattore che influenza il potere antimicrobico è l’ambiente, cioè le proprietà chimiche e fisiche del mezzo o della sostanza in cui risiedono gli organismi. L’efficacia del calore per esempio, è molto maggiore in un ambiente acido che in uno basico. La presenza di materia organica estranea può ridurre notevolmente l’efficacia di un agente chimico antimicrobico inattivandolo o proteggendo il microrganismo dalla sua azione. Infatti l’agente antimicrobico si potrebbe combinare con la sostanza organica per formare un prodotto non microbicida, oppure si potrebbe combinare con la sostanza estranea e formare un precipitato, impedendo la sua possibile combinazione con i microrganismi, o, infine, la sostanza organica si potrebbe accumulare sulla superficie della cellula microbica, costituendo un rivestimento che riduce il contatto fra l’agente antimicrobico e la cellula (Pelczar et al.,1984).

1.3.2. Le proprietà antimicrobiche degli oli essenziali

Questa ricerca è incentrata in particolare sul potere antibatterico degli oli essenziali, e cioè sulla capacità dei loro costituenti di uccidere i batteri o di impedirne l’accrescimento. Un agente antimicrobico infatti può avere funzione battericida, cioè in grado di uccidere i batteri, o batteriostatica, cioè capace di impedire l’accrescimento dei batteri, realizzando una condizione nota come batterio stasi (Lanciotti, 1992). Il potere antibatterico è l’area più studiata degli oli essenziali e questa proprietà è l’unica che è realmente ben conosciuta e usata regolarmente (Lawless, 1999). Negli ultimi anni l’indiscriminato uso di antibiotici ha portato ad una selezione degli agenti patogeni che diventano sempre più resistenti ai tradizionali antibiotici (Gulluce et al; 2007). La lotta antimicrobica con medicamenti naturali ha riscoperto negli oli essenziali dei presidi terapeutici di tutto rispetto per il loro elevato potere battericida e batteriostatico, cioè per la loro inequivocabile capacità di uccidere i batteri patogeni o di inibirne la moltiplicazione senza interferire negativamente, quando sono somministrati per via interna, con la flora dell’intestino (Pedretti, 2003) Il potere antimicrobico degli oli essenziali è conosciuto da molti anni; in particolare gli oli essenziali di Melaleuca alternifolia L., Thymus vulgaris L., Mentha piperita L e Rosmarinus officinalis L vengono e venivano utilizzati per il trattamento di infezioni batteriche e micotiche (van Vuuren et al; 2008). I primi studi scientifici riguardanti il potere degli oli essenziali risalgono al 1887 per opera di Chamberland (Pedretti, 2003) che dimostrò l’azione microbicida degli oli essenziali di: origano, cannella e garofano sul Bacillus anthracis, di timo sul bacillo di Eberth (tifo), sullo staffilococco, sul bacillodi Loffler (difterite), sul meningococco e sul bacillo di Koch (Pedretti, 2003)

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A questi lavori seguirono i contributi di numerosi altri ricercatori. I lavori sperimentali dei primi studiosi consentirono di stabilire una gerarchia di attività antisettica degli oli essenziali usando come standard di riferimento il fenolo, l’antisettico maggiormente usato a quei tempi. Il metodo per giungere a questa determinazione fu quello messo a punto da due microbiologi inglesi, Rideal e Walker (1921), consistente nel misurare la minima concentrazione di olio essenziale capace di sterilizzare, in un certo tempo ed ad una temperatura, una sospensione batterica contenente un numero definito di cellule per millimetro cubo. In un secondo tempo la medesima operazione veniva eseguita usando come agente sterilizzante il fenolo. Il rapporto tra la minima concentrazione sterilizzante (M.C.S.) dell’olio essenziale in esame a quella del fenolo venne definito “coefficiente fenolo” (Kf = M.C.S. olio essenziale / M.C.S. fenolo). In base al test di Ridel-Walker il coefficiente fenolo deve essere interpretato come un indice che esprime quante volte l’olio essenziale esaminato è più attivo del fenolo. In epoca più recente venne messo a punto una nuova metodica per la valutazione in vitro del potere antisettico degli oli essenziali: l’aromatogramma. Esso consente d’individuare gli oli essenziali dotati di maggiore attività antimicrobica su un ben preciso ceppo batterico patogeno. Questa tecnica consiste nel misurare il diametro degli aloni di inibizione formati intorno a dischetti impregnati di oli essenziali e posti sopra una colonia batterica (Pedretti, 2003). Ma qual’ è il meccanismo d’azione che sostiene l’attività battericida degli oli essenziali? Le molecole che costituiscono gli oli essenziali superano la parete cellulare, giungono nel citoplasma del batterio ed esplicano la loro attività battericida compromettendo le funzioni vitali della cellula (Pedretti, 2003). Nonostante le proprietà antimicrobiche degli oli essenziali e dei loro componenti siano note già da molto tempo (Burt, 2004), i meccanismi d’azione non sono ancora stati studiati nel dettaglio (Lambert et al., 2001). Considerato l’elevato numero di differenti gruppi di composti chimici presenti negli oli essenziali è molto probabile che la loro attività antimicrobica non sia attribuibile ad uno specifico meccanismo ma piuttosto che ne esistano diversi (Carson et al., 2002).

1.3.3. I batteri

Per capire le modalità d’azione antimicrobica generale occorre ricordare alcune caratteristiche della cellula microbica. Una cellula vivente è rivestita generalmente da una membrana citoplasmatica, formata da un doppio strato di fosfolipidi, nel cui spessore si trovano immerse molecole di proteine e di colesterolo. Tale membrana ha un ruolo fondamentale nella mediazione degli scambi nutrizionali, respiratori ed escretori della cellula. La membrana plasmatica è semipermeabile, ossia permette il passaggio diretto, mediante diffusione, delle molecole di piccole dimensioni, come zuccheri e sali, ma non di molecole di maggiore peso molecolare, come quelle proteiche, che vengono trasportate attraverso la membrana da fenomeni di trasporto attivo; tali fenomeni implicano consumo di energia e coinvolgono le proteine-canale e appositi trasportatori. Oltre alla membrana cellulare la cellula microbica possiede anche una parete cellulare, che fornisce un rivestimento protettivo alla cellula (Campbell et al., 2006). La parete è posta esternamente alla membrana plasmatica, alla quale conferisce forma e sostegno meccanico. Ha un ruolo nel trasporto delle sostanze da e verso il citoplasma e limita la disidratazione della cellula. Essa contiene come elemento fondamentale una molecola complessa, il peptidoglicano. All’esterno, inoltre, vi può essere una seconda struttura di protezione, la capsula. Una cellula vivente infine contiene molteplici enzimi a cui sono dovuti i numerosi processi metabolici (Campbell et al., 2006). Un danno a una qualsiasi di queste parti può indurre trasformazioni che portano alla morte della cellula (Pelczar et al.,1984).

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I batteri sono microscopici organismi unicellulari procarioti, le cui dimensioni sono minori rispetto ad una cellula eucariote, ma maggiori rispetto ad un virus. In genere le cellule batteriche sono lunghe da 1 a 10 micrometri (Campbell et al., 2006). Per la loro grande varietà di adattamenti, i batteri sono gli esseri viventi più numerosi sulla Terra, diffusi in tutti gli ambienti, compresi quelli caratterizzati da condizioni all’apparenza estremamente sfavorevoli (Campbell et al., 2006). Nei batteri, essendo procarioti, non esiste un nucleo distinto e delimitato da una membrana nucleare; per cui il materiale genetico, costituito da un’unica molecola di DNA circolare (cromosoma batterico) e in alcuni batteri anche da anelli di DNA extracromosomici (plasmide), è disperso nel citoplasma della cellula. La membrana plasmatica, che racchiude il citoplasma, è ricoperta da una delle strutture più importanti che caratterizzano la cellula procariote: la parete cellulare. Essa mantiene la forma della cellula, le fornisce protezione e impedisce che scoppi se viene a trovarsi in un ambiente ipotonico (quando la concentrazione dei soluti interna alla cellula è maggiore di quella esterna). La parete cellulare dei batteri contiene una sostanza particolare , il peptidoglicano, un polimero glucidico all’interno del quale sono inseriti brevi polipeptidi (Campbell et al., 2006). In molti procarioti la parete cellulare è avvolta in uno strato mucoso detto capsula, formato da polisaccaridi o proteine. Essa aiuta la cellula ad aderire al proprio substrato o ad altre cellule, per formare una colonia. Alcuni batteri possiedono strutture filiformi, corte e sottili, ma relativamente rigide dette pili, che permettono ai procarioti di attaccarsi gli uni agli altri, oppure a tessuti e pareti di organi di altri esseri viventi, o ancora ad altre strutture (per esempio rocce). Numerosi batteri sono inoltre provvisti di uno o più flagelli, che consentono loro il movimento (Campbell et al., 2006).

Fig.3. Struttura schematizzata di un batterio (Campbell et al., 2006).

Per questo LAM sono stati presi in esame batteri enterococchi del ceppo SF68. I batteri del genere Enterococcus rientrano nel gruppo degli streptococchi e sono chiamati così poiché si sviluppano esclusivamente nel tubo intestinale dell’uomo e degli animali (Stanier et al., 1984; Ogier e Serror, 2008). Gli streptococchi sono dei microrganismi gram-positivi, immobili e catalasi-negativi. Hanno una conformazione sferica oppure ovoidale e si presentano con una tipica aggregazione in coppie o catenelle. Per la maggior parte sono anaerobi facoltativi (capaci di crescere in assenza o in presenza di ossigeno), ma sono capaci di una crescita di tipo fermentativo anche in presenza di ossigeno (Harvey et al., 2008)

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Gli enterococchi venivano considerati in passato streptococchi del gruppo2 D, attualmente però, l’analisi del DNA ha consentito di collocarli in un proprio genere, Enterococcus, di cui le specie clinicamente più importanti sono E. fecalis ed E. faecium. Gli enterococchi possono essere α-, β-, o non-emolitici (Ogier e Serror, 2008). In generale questi microrganismi non sono molto virulenti ma sono diventati importanti come causa di infezioni nosocomiali come conseguenza della loro resistenza a più antibiotici (Murray e Weinstock, 1999; Ogier e Serror, 2008), dovuta in particolare alla loro abilità ad acquisire, accumulare e trasferire elementi genetici come plasmidi e trasposoni (Koch et al., 2004). Essi si distinguono dagli streptococchi non appartenenti al gruppo D per la loro capacità di sopravvivere in presenza della bile e di idrolizzare l’esculina polisaccaridica (Harvey et al., 2008) Gli enterococchi fanno parte della flora fecale normale tuttavia, possono anche colonizzare le membrane mucose del cavo orale e la cute, inoltre questi organismi sono altamente resistenti agli agenti ambientali e chimici (Giraffa, 2002). Questi batteri possiedono specifiche caratteristiche fisiologiche: hanno un ampio intervallo di temperatura (crescono sia a 20°C che a 45°C) e sono gli unici streptococchi che possono svilupparsi ad un pH di 9.6 e in presenza di NaCl al 6.5%. Sono anche gli unici streptococchi che producono enzimi proteolitici (Facklam et al., 2002). Gli enterococchi provocano raramente la malattia in individui normali, sani (Klare et al., 2003). Tuttavia, se la resistenza dell’ospite è ridotta o l’integrità del tratto gastrointestinale o urogenitale è venuta meno, gli enterococchi possono diffondere in siti normalmente sterili, causando infezioni dell’apparato urinario, batteriemia-sepsi, endocardite batterica, infezione del tratto biliare o ascessi intra-addominali (Koch et al., 2004; Klare et al.; 2003). Alcuni ceppi risultano però resistenti alla maggior parte degli antibiotici attualmente disponibili in commercio (Klare et al. 2003; Kak e Chow, 2002). L’aumento delle infezioni nosocomiali da parte di enterococchi resistenti a più farmaci è in gran parte il risultato di una selezione dovuta all’uso indiscriminato di antibiotici negli ospedali. Una maggior accortezza nell’uso degli antibiotici costituisce un fattore importante nel controllo della comparsa di queste infezioni (Harvey et al., 2008).

Fig.4. Enterococchi (Harvey et al., 2008)

2 Esiste un particolare tipo di classificazione degli streptococchi che prende in esame il tipo di antigeni presenti sulla parete cellulare (classificazione di Lancefield); in base a questi, i vari ceppi batterici sono denominati con lettere che vanno dalla A alla U a dipendenza del tipo di antigene polisaccaridico presente (Lanciotti, 1992; Harvey et al., 2008).

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1.4. LE PIANTE OFFICINALI SOTTOPOSTE ALLO STUDIO

Come agenti antimicrobici sono stati scelti per questo lavoro di maturità tre oli essenziali provenienti da: Rosmarinus officinalis L. (rosmarino), Mentha piperita L. (menta piperita) e Thymus vulgaris L. (timo).

1.4.1. Rosmarinus officinalis L.

Fig. 5. Rosmarinus officinalis L. (Schoepke, 2000).

CLASSIFICAZIONE BOTANICA (Ceoloni, 2006): REGNO: Plantae DIVISIONE: Spermatophyta CLASSE: Dicotyledones ORDINE: Lambia FAMIGLIA: Lamiaceae (Labiateae) GENERE: Rosmarinus SPECIE: officinalis (Linné)

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DESCRIZIONE. Il rosmarino è un arbusto cespuglioso sempreverde, che raggiunge altezze tra i 50 e i 300 cm, a seconda delle varietà botaniche e delle condizioni climatiche ed ambientali. È dotato di foglie aghiformi verde-argentee, coriacee, radici profonde, fibrose e resistenti; e fusti legnosi, molto ramificati di colore marrone chiaro, eretti o sdraiati alla base.I fiori, azzurri, sono riuniti in gruppetti all’ascella delle foglie superiori (Campanini, 2004).

Il rosmarino è originario del bacino del Mediterraneo ma è attualmente coltivato in tutto il mondo (Oluwatuyi et al., 2004).

OLIO ESSENZIALE. L’olio essenziale del rosmarino viene estratto mediante distillazione in corrente di vapore dalle sommità fiorite fresche o dall’intera pianta (Campanini, 2004).

PRINCIPALI PRINCIPI ATTIVI. Pinene, canfene, cineolo, borneolo, bornilacetato, canfora, carene, limonene, cimene, mircene, fellandrene, terpinene, geraniolo, linalolo, terpineolo, verbenolo, verbenone,fencone, tujone, cariofillene e safrolo (composti contenuti nell’olio essenziale), flavonoidi, fenolacidi, triterpeni, acido carnosico, rosmaricina, diterpeni (Ceoloni, 2006).

ASPETTO E PROFUMO DELL’OLIO ESSENZIALE. L’olio essenziale estratto è un liquido mobile, incolore o giallo chiaro e ha un profumo erbaceo-mentaceo forte e fresco.

PRINCIPALI ATTIVITÀ. Antimicrobico, antiossidante (Terpinc et al., 2009), tonico generale, mucolitico, espettorante, antireumatico, antispasmodico, diuretico, stimolante biliare, della circolazione sanguigna e della corteccia surrenale, sudorifero, antisettico, cicatrizzante, tonico nervoso (favorisce la concentrazione e la memoria), antiparassitario (Ceoloni, 2006).

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1.4.2. Thymus vulgaris L.

Fig. 6. Thymus vulgaris L. (Schoepke, 2000).

CLASSIFICAZIONE BOTANICA (Ceoloni, 2006):

REGNO: Plantae DIVISIONE: Spermatophyta CLASSE: Dicotyledones ORDINE: Tubiflorales FAMIGLIA: Labiate GENERE: Thymus SPECIE: vulgaris (Linné)

DESCRIZIONE. Il timo è un arbusto nano molto aromatico, riccamente ramificato, che non resiste all’inverno a nord delle Alpi, altrimenti è perenne e sempreverde. Presenta radici legnose e fusto eretto molto ramificato, piccole foglie ovali aromatiche di color grigio-verde con margine involuto e fiori bianco-rosati o violetto chiaro (Campanini, 2004). Il timo è originario della Spagna e dell’area del Mediterraneo ma oggi cresce diffusamente in tutto il globo (Bukovskà et al., 2007).

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OLIO ESSENZIALE. Per estrarre l’olio essenziale dalla pianta si ricorre alla distillazione in corrente di vapore delle foglie e delle sommità fiorite fresche o parzialmente essiccate (Campanini, 2004).

PRINCIPALI PRINCIPI ATTIVI. timolo e carvacrolo (fino al 60%), p-cimene, pinene canfene, terpinene, borneolo, linalolo, geraniolo, tujaolo, cariofillene, esenolo (composti contenuti nell’olio essenziale), fenolacidi, tannini,flavonoidi, saponine, acidi triterpenici (Ceoloni, 2006).

ASPETTO E PROFUMO DELL’OLIO ESSENZIALE. “L’olio di timo rosso” è un distillato grezzo, “l’olio di timo bianco” è ottenuto per successiva distillazione o rettificazione, ossia purificazione della sostanza mediante distillazione frazionata. Il primo liquido presenta un colore rosso, marroncino o arancio e ha un odore erbaceo-speziato; il secondo invece assume una colorazione tendente al giallo chiaro e ha un profumo più dolce.

PRINCIPALI ATTIVITÀ. Antimicrobico, antiossidante (Sanchéz et al., 2004), antisettico, antispasmodico, antiossidante, antimicotico, antinfiammatorio, antivirale, espettorante, mucolitico (Bukovskà et al., 2007).

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1.4.3. Mentha piperita L.

Fig. 7. Mentha piperita L. (Schoepke, 2000).

CLASSIFICAZIONE BOTANICA:

REGNO: Plantae DIVISIONE: Spermatophyta CLASSE: Dicotyledones ORDINE: Tubiflorales FAMIGLIA: Lamiaceae (Labiate) GENERE: Mentha SPECIE: piperita (Linné) (Ceoloni, 2006).

DESCRIZIONE. La menta piperita è una varietà ibrida ottenuta dall’incrocio tra M. acquatica e M. spicata, molto aromatica come tutte le specie di menta. Si tratta originariamente di un ibrido coltivato, diffusosi in Inghilterra nel Diciassettesimo secolo. È ora coltivata in tutto il

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mondo. È una pianta erbacea perenne, alta fino a 100 cm. È dotata di stoloni sotterranei che ne consentono una facile propagazione. Ha foglie allungate-ovate, appuntite, peduncolate e dentate con margine piano. I fiori si trovano in lunghe infiorescenze a forma di spiga nei rami laterali. La menta piperita “bianca” presenta foglie e steli verdi, mentre quella “nera” ha foglie di colore verde scuro e fiori rossiccio-violacei (Campanini, 2004)

OLIO ESSENZIALE. L’olio essenziale viene estratto tramite distillazione in corrente di vapore della pianta fiorita (Campanini, 2004).

PRINCIPALI PRINCIPI ATTIVI. Mentolo (29-48%), mentone (20-31%), mentilacetato, mentofurano, α e β-pinene, limonene, fellandrene, terpinene, cineolo, isomentone, pipertitone, pulegone, jasmone, sabinene, aromandrene, β- cariofillene, bisabolene, bicicloelemene, viridiflorolo, timolo, carvacrolo, acetaldeide e isovalerianaldeide (composti contenuti nell’olio essenziale), flavonoidi, tannini, acido ascorbico, tocoferoli, fenolacidi (Ceoloni, 2006).

ASPETTO E PROFUMO DELL’OLIO ESSENZIALE. L’olio essenziale è un liquido giallino chiaro o verdognolo molto volatile, con penetrante odore mentaceo-erboso e canforaceo.

PRINCIPALI ATTIVITÀ. Antimicrobico, antisettico (Agarwal et al., 2009), spasmolitico (sulla muscolatura liscia dell’apparato digerente), carminativo, coleretico (aumenta la secrezione biliare), analgesico (Campanini, 2004).

MATERIALI E METODI

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2. MATERIALI E METODI

2.1. IL MATERIALE BIOLOGICO

Lo studio sperimentale ha interessato le tre piante officinali: Rosmarinus officinalis L. (rosmarino), Mentha piperita L. (menta piperita) e Thymus vulgaris L. (timo). Le piante sono state fornite dalla COFIT (Cooperativa per le piante officinali ed i fitoprodotti ticinesi). Tale cooperativa le ha raccolte nell’anno 2009 e ha provveduto all’essiccazione ottimale pari a 33 °C per 56 ore nell’essiccatoio COFIT presso l’ex Cima Norma di Dangio.

2.2. LA STRUMENTAZIONE ANALITICA

2.2.1. L’estrattore di oli essenziali secondo Farmacopea Europea

La determinazione del contenuto degli oli essenziali viene effettuata secondo il metodo definito dalla Farmacopea Europea utilizzando lo specifico distillatore il cui funzionamento viene descritto nella pagina seguente.

Fig. 8. Distillatore ufficiale secondo la Farmacopea Europea

MATERIALI E METODI

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A. Pallone a fondo tondo, a collo corto ed estremità conica a smeriglio del diametro massimo, all'interno, di 29 mm circa.

B. Apparecchio di condensazione che si adatta esattamente al collo del pallone, costituito da diverse parti saldate tra loro, in vetro resistente a debole dilatazione termica: il tappo a smeriglio K' è cavo e la tubulatura laterale K ha un orifizio del diametro di 1 mm circa che coincide con la cavità del tappo; l'estremità più larga della tubatura laterale K è smerigliata ed ha un diametro interno di 10 mm.

- un rigonfiamento piriforme J, ad apice in giù, della capacità di 3 mL

- un tubo J-L graduato a 1/100 di mL, lungo 100 -110 mm;

- un rigonfiamento a bolla L della capacità di 2 mL circa;

- un rubinetto smerigliato M a 3 vie;

- la saldatura B è a un livello di 20 mm maggiore del punto superiore della graduazione del tubo J-L

C. Apparato idoneo di riscaldamento che permette una regolazione precisa;

D. Sostegno verticale, con anello orizzontale, rivestito di materiale isolante.

2.2.2. Il Gascromatografo con rivelazione di massa (GC-MS)

La gascromatografia, nota anche come GC, è una tecnica cromatografica impiegata a scopo analitico. Essa si basa sulla diversa ripartizione di varie sostanze tra una fase stazionaria ed una fase mobile, in funzione dell'affinità di ogni sostanza con la fase mobile, costituita da un gas inerte. La fase mobile è un gas permanente (detto carrier o gas di trasporto) che fluisce attraverso una colonna in cui è invece posta la fase stazionaria. All’uscita da questa colonna un rivelatore segnala il passaggio dei diversi componenti della miscela ad un sistema di elaborazione dei segnali. Quest’ ultimo fornisce il gascromatogramma, in cui la quantità di sostanza fluita, ossia separata dal suo assorbente è diagrammata in funzione del tempo che la sostanza ha impiegato per attraversare la colonna. La GC nasce da un’idea iniziale di Martin e Synge (1941) che venne sviluppata poi in particolare da James e Martin (1952). La GC ha conosciuto il suo grande boom negli anni '60 e tuttora mantiene una grande importanza fra le tecniche di separazione di miscele complesse. Con questa tecnica è infatti possibile analizzare campioni gassosi, liquidi o solidi, purché siano opportunamente solubilizzati e possano essere vaporizzati. Questa condizione è stata poi superata dalla HPLC, un’altra tecnica che fra l’altro consente di lavorare a temperatura ambiente e dunque evita il danneggiamento di eventuali sostanze termolabili. La gascromatografia può essere applicata in tutti i campi della tecnologia e della ricerca, come ad esempio viene utilizzata per il controllo degli inquinanti atmosferici e nell’analisi degli alimenti. La GC viene usata soprattutto per l’analisi quantitativa, infatti l’altezza o l’area dei picchi possono essere correlate con la quantità dei diversi componenti della miscela analizzata. Importante sottolineare che ad ogni modo si possono usare i parametri gascromatografici per ricavare informazioni qualitative. Durante questa esperienza è stato utilizzato il gascromatografo con rilevazione di massa, ossia l’accoppiamento della gascromatografia con lo spettrometro di massa, il quale consente di effettuare analisi qualitative e quantitative di qualsiasi specie chimica, con limiti

MATERIALI E METODI

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di rilevabilità estremamente bassi. La spettroscopia di massa viene usata principalmente per determinare la massa molare; inoltre, poiché lo spettro rappresenta una sorta di “impronta digitale” delle molecole, è di fondamentale importanza per identificare sostanze incognite. Proprio per questo motivo lo spettrofotometro di massa viene spesso accoppiato al gascromatografo o al cromatografo HPLC. La GC-MS, in particolare permette di analizzare in tempo reale i singoli picchi di uscita dalla colonna, effettuando la determinazione quantitativa mediante il confronto dello spettro registrato con gli spettri memorizzati nella banca dati. In generale, questo sistema fornisce limiti di rivelabilità estremamente bassi, dall’ordine dei picogrammi (10-12 g) ed in alcuni casi anche dei femtogrammi (10-15 g), purché si lavori in condizioni operative tali da portare alla formazione del solo picco molecolare. (Cozzi et al., 1997)

2.2.3. La MIC

La MIC, concentrazione minima inibente, è un test quantitativo che utilizza la tecnica delle diluizioni. Una serie di provette allestite con terreno idoneo e contenenti diluizioni scalari dell’agente antimicrobico preso in esame sono inoculate con quantità equivalenti di una sospensione contenente il microrganismo la cui sensibilità deve essere esaminata. Dopo un adeguato periodo di incubazione si procede all’esame delle provette per determinare la concentrazione minima inibente, ossia la concentrazione più bassa di un agente antimicrobico ancora capace di impedire completamente lo sviluppo batterico (Lanciotti, 1992; Harvey et al., 2008).

2.2.4. La MBC

La MBC, concentrazione minima battericida, è un test quantitativo che viene effettuato dopo aver svolto una MIC. Si preleva una goccia di soluzione dalle provette in cui non si sono sviluppati i batteri, la si pone su una piastra di Petri contenente terreno di coltura e si semina. Dopo un adeguato periodo di incubazione si esaminano le piastre per determinare la concentrazione più bassa dell’agente antimicrobico capace di uccidere al 100 % i batteri (Harvey et al., 2008).

2.2.5. L’Aromatogramma

L’aromatogramma o metodo di diffusione su dischetti è un sistema qualitativo classico per verificare l’efficacia di un dato agente antimicrobico contro un determinato microrganismo. La sua importanza sta nel fatto di essere una tecnica diagnostica rapida e precisa oltre che economica. In questa procedura viene impiegato un dischetto di carta assorbente imbevuto con una determinata sostanza antimicrobica, il quale viene posto sulla superficie di una piastra agarizzata inoculata con il batterio da esaminare. Dopo un periodo di incubazione specifico per ogni microrganismo, viene controllata la presenza di una crescita batterica (resistenza all’agente antimicrobico) o la mancanza di sviluppo (sensibilità alla sostanza) che si manifesta con la presenza di una zona circolare, di diametro variabile a dipendenza del tipo di agente antimicrobico utilizzato e della sua concentrazione, in cui la crescita batterica è inibita (si parla di zona o alone di inibizione) (Harvey et al., 2008).

MATERIALI E METODI

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2.3. METODO DI ESTRAZIONE DEGLI OLI ESSENZIALI

Strumenti e utensili Estrattore di oli essenziali, pietra pomice (per stabilizzare l’ebollizione), pipette Pasteur. Reagenti Acqua deionizzata, solfato di sodio anidro (Na2SO4) Nota: Per quanto riguarda Mentha piperita L. la determinazione del tenore di olio essenziale non ha previsto l’utilizzo dello Xilene, come richiesto dal metodo ufficiale, in quanto tale solvente avrebbe potuto interferire nelle fasi analitiche successive. Procedimento L’estrazione degli oli essenziali è iniziata con il montaggio, come da disegno, dell’estrattore di oli essenziali. Nel pallone a fondo tondo sono stati introdotti: il materiale essiccato, alcuni granelli di pietra pomice e l’acqua deionizzata, dopodiché il pallone è stato avvitato all’estrattore. Si sono poi collegati i tubi dell’apparecchio di condensazione al rubinetto che successivamente è stato aperto. Dopo aver verificato l’assenza di eventuali bolle d’aria nell’apparecchio si è proceduto con l’accensione della piastra riscaldante e si è atteso fino all’ebollizione dell’acqua. Da questo momento si sono aspettate 2 ore durante le quali l’olio essenziale contenuto nel materiale vegetale è evaporato e poi condensato (tramite l’apparecchio di condensazione dell’estrattore) ed infine è stato raccolto nel rigonfiamento piriforme (vedi J nel disegno). A questo punto si è spenta la piastra e, quando l’apparecchio è risultato freddo si è spento il condensatore. Infine si è proceduto alla raccolta dell’olio essenziale estratto tramite l’apertura del rubinetto posto all’estremità inferiore dell’estrattore (vedi M nel disegno). Per ognuno dei tre diversi materiali biologici l’estrazione è stata fatta con una quantità specifica di materiale essiccato e di acqua deionizzata e si è portato il tutto ad una certa temperatura. Nel caso del Rosmarinus officinalis L. sono stati utilizzati 25 g di materiale essiccato (comprendente foglie e rametti sottili) e 300 mL di acqua deionizzata; la temperatura è stata invece portata a 225 °C . Per quanto riguarda la Mentha piperita L. sono stati usati 15 g di materiale essiccato (comprendente foglie e rametti) con 150mL di acqua deionizzata mentre la temperatura in questo caso è stata portata a 250 °C. Per il Thymus vulgaris L. sono stati presi 25 g di materiale essiccato (comprendente anche in questo caso foglie e rametti) e 400 mL di acqua deionizzata e si è portata la temperatura a 225 °C. Per ottenere un quantitativo sufficiente allo svolgimento delle altre parti dell’esperimento (analisi dell’olio tramite gascromatografia e misurazione del potere antimicrobico) si sono rese necessarie due estrazioni per Mentha piperita L. e quattro estrazioni per Rosmarinus officinalis L. e Thymus vulgaris L. Dopo aver estratto l’olio essenziale si è proceduto all’eliminazione delle goccioline d’acqua rimaste nell’olio prima tramite l’aspirazione diretta con una pipetta Pasteur e poi facendo passare l’olio essenziale in una pipetta Pasteur contenente solfato di sodio anidro. Le provette contenenti l’olio essenziale sono state conservate in provette ricoperte con carta alu (per evitare danneggiamenti da parte della luce) in frigorifero.

MATERIALI E METODI

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2.4. METODO DI ANALISI QUANTITATIVA DEGLI OLI ESSENZIALI

Strumenti e utensili Gas cromatografo con rivelazione di massa GC-MS (Shimadzu modello QP5000)

Procedimento

o Colonna BGB-Wax: altezza 60m, diametro 0.25 mm, spessore 0.25 µm;

o Pressione in testa alla colonna: 133.1 kPa;

o Gas carrier: azoto a flusso di colonna di 1.1 mL/min;

o Velocità lineare: 27.0 cm/s;

o Temperatura iniettore: 250°C;

o Programma di temperatura: 60°C mantenuta per 8 minuti, dopo di che aumento di 3°C/min fino a 216°C, poi aumento di 10°C/min fino alla temperatura finale di 240°C mantenuta per 12.60 min;

o Programma di pressione: 1331.1 kPa mantenuta per 8 minuti, aumento di 1.7 kPa/min fino a 221.5 kPa, poi aumento di 5.6 kPa/min fino alla pressione finale di 235.1 kPa;

o Split: 1:50;

o Flusso totale: 60.5 mL/min;

o Temperatura interfaccia: 250°C;

o Modalità di acquisizione dei dati: Scan 35.00 m/z – 450.00 m/z.

MATERIALI E METODI

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2.5 DETERMINAZIONE DEL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI ESSENZIALI

2.5.1 La MIC

Strumentazioni e utensili Autoclave (EGRO), termostato (Thermocult Boehringer Mannheim GmbH), Becco Bunsen (DVGW), Vortex Lab dancer S40 (VWR), bottiglia in vetro da 250mL (Schott Duran), provette con tappo da 13mL, provette con tappo da 3mL, pipette in vetro da 10mL, micropipette (Socorex Acura 825) da: 0,5-10µL; 20-200 µL; 100-1000 µL, vetreria di laboratorio. Reagenti Enterococchi ceppo SF 68 (Sanofi aventis) LOT: c 00017, Mueller Hinton Broth (Fluka) LOT: 1411348 44408142, Tween 80 (Sigma-Aldrich) LOT: 0001430687, oli essenziali di Rosmarinus officinalis L., Mentha piperita L. e Thymus vulgaris L., acqua deionizzata Procedimento Prima di iniziare qualunque operazione si sono sterilizzati tramite Autoclave tutti gli strumenti utilizzati (all’infuori di quelli provenienti da confezioni sigillate e sterili) e si è installato un cono di sterilità al fine di lavorare in condizioni sterili ed evitare il più possibile le contaminazioni. Questo test è stato svolto in due tappe: prima si è proceduto con la preparazione dell’inoculo e successivamente con la determinazione della MIC. L’inoculo è stato preparato con una serie di diluizioni. In una provetta da 13 mL sono stati introdotti 10mL di brodo liquido (preparato con Mueller Hinton Broth) e una capsula contenente 7.5.106 enterococchi del ceppo SF 68 (Bioflorin, Sanofi aventis). Si è poi atteso fino al completo scioglimento della capsula nel brodo (per velocizzare il processo si è mescolato il contenuto della provetta con un Vortex). Dopo di che si sono prelevati dalla provetta 1335 µL di soluzione che sono poi stati introdotti in un’altra provetta in cui erano stati messi 8665 µL di brodo liquido. Dopo aver mescolato si sono prelevati 1 mL da questa provetta introdotti poi in un’altra provetta contenente 9 mL di brodo. Quest’ultimo passaggio è stato ripetuto con altre due provette (contenenti entrambe 9mL di brodo). Alla fine si è così ottenuta una soluzione di enterococchi in brodo liquido con concentrazione 103 batteri/mL.

1 capsula Bioflorin (7.5.106 enterococchi)

1335 µL

1 mL

1 mL

1 mL

10 mL brodo liquido

8665 µL brodo liquido

9 mL brodo liquido

9 mL brodo liquido

9 mL brodo liquido

Fig. 9. Diluizioni scalari dell’inoculo

MATERIALI E METODI

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Per la determinazione della concentrazione minima inibitoria sono state allestite nove provette contenenti diverse concentrazioni dell’agente antimicrobico (32 µL/mL, 16 µL/mL, 8 µL/mL, 4 µL/mL, 2 µL/mL, 1 µL/mL, 0.5 µL/mL, 0.25 µL/mL, 0.125 µL/mL). Per ottenere concentrazioni diverse di olio essenziale è stato utilizzato il metodo delle diluizioni. Inizialmente in otto provette sono stati introdotti 1800µL di brodo di coltura liquido (MHB) e 72 µL di Tween 80, mentre una provetta è stata lasciata vuota. Nella prima provetta sono stati aggiunti 128 µL di olio essenziale e si è mescolato tutto con il Vortex. Da questa provetta sono poi stati prelevati 1000 µL di soluzione che sono poi stati introdotti in un’altra provetta (contenente già brodo di coltura e Tween 80). Dopo aver mescolato sono stati prelevati da questa provetta 1000 µL di soluzione che sono stati introdotti nella provetta successiva. L’operazione è stata ripetuta sei volte fino ad arrivare alla nona provetta che non conteneva nè il brodo liquido nè il Tween 80 ma solo i 1000 µL di soluzione prelevata dalla provetta precedente. In ogni provetta sono stati poi introdotti 100 µL di inoculo (contenente 103 germi/mL) precedentemente preparato. È stato inoltre preparato il controllo negativo costituito da una provetta contenente solamente il brodo di coltura liquido, il Tween 80 e il 1000 µL di inoculo. Tutte le provette sono state successivamente poste ad incubare nel termostato a 37 °C per 24 ore. Questo procedimento è stato ripetuto per ognuno degli oli essenziali.

2.5.2 La MBC

Strumentazioni e utensili Autoclave (EGRO), piastra riscaldante (Severin), Termostato (Thermocult Boehringer Mannheim GmbH), Becco Bunsen (DVGW), Vortex Lab dancer S40 (VWR), bottiglia in vetro da 500 mL (Schott Duran), provette con tappo da 13 mL, pipette in vetro da 10mL, piastre di Petri, micropipette (Socorex Acura 825) da: 0,5-10 µL; 20-200 µL; 100-1000 µL, anse sterili (VWR), vetreria di laboratorio. Reagenti Enterococchi ceppo SF 68 (Sanofi aventis) LOT: c 00017, Agar Mueller Hinton 2 MH2-D (Biomérieux) LOT: 775661501, Tween 80 (Sigma-Aldrich) LOT: 0001430687, oli essenziali di Rosmarinus officinalis L., Mentha piperita L. e Thymus vulgaris L., acqua deionizzata Procedimento Anche per questa prova, prima di iniziare, sono stati sterilizzati tramite Autoclave tutti gli strumenti e le sostanze utilizzati e si è lavorato sotto un cono di sterilità al fine di mantenere la sterilità ed evitare contaminazioni. Dopo aver effettuato il test per la determinazione della concentrazione minima inibente sono stati prelevati da ognuna delle provette in cui non si sono sviluppati i batteri 100µL di soluzione. In tutti e tre i casi sono stati prelevati i 100 µL dalle provette con concentrazione 8 µL, 16 µL e 32 µL. Ogni goccia (100 µL) è stata poi posta su una capsula di Petri contenente terreno di coltura (preparato precedentemente con Agar Mueller Hinton 2 MH2-D) e si è proceduto con la semina. Le piastre di Petri sono state chiuse e poste nel termostato a 37 ° C ad incubare per 24 ore.

MATERIALI E METODI

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2.5.3. L’Aromatogramma

Strumentazioni e utensili Autoclave (EGRO), termostato (Thermocult Boehringer Mannheim GmbH), Becco Bunsen (DVGW), anse sterili (VWR), dischetti di carta bibula Ø 6mm, piastre di Petri, bottiglia in vetro da 500mL (Schott Duran), pipette in vetro da 10mL, micropipette (Socorex Acura 825) da: 0,5-10µL; 20-200 µL; 100-1000 µL, vetreria di laboratorio Reagenti Enterococchi ceppo SF 68 (Sanofi aventis) LOT: c 00017, Agar Mueller Hinton 2 MH2-D (Biomérieux) LOT: 775661501, Mueller Hinton Broth (Fluka) LOT: 1411348 44408142, acqua deionizzata, oli essenziali di Rosmarinus officinalis L., Mentha piperita L. e Thymus vulgaris L. Procedimento Prima di iniziare si sono sterilizzati tramite Autoclave tutti gli strumenti utilizzati (all’infuori di quelli provenienti da confezioni sigillate e sterili come le anse e le capsule di Petri) e si è approntato un cono di sterilità al fine di lavorare in condizioni di sterilità ed evitare il più possibile le contaminazioni. Dopo questa procedura sono state preparate tre piastre di Petri per la coltura degli enterococchi utilizzando come terreno di coltura l’ Agar Mueller Hinton 2, introducendone in ogni capsula di Petri 15mL. Quando il terreno di coltura si è solidificato si è provveduto all’introduzione di 100 µL di inoculo già preparato in precedenza per le altre prove (soluzione di enterococchi SF68 in brodo liquido MHB con concentrazione di 104 batteri/mL) in ognuna delle tre piastre di Petri. Si è poi seminato l’inoculo mediante le anse sterili. Dopodiché in ogni capsula di Petri è stato posizionato sul brodo di coltura un dischetto di carta bibula sterilizzato, asciutto e senza alcuna sostanza aggiunta (serivirà come controllo negativo). Sono poi stati adagiati sul terreno di coltura, nella parte opposta del dischetto non contenente sostanze, altri tre dischetti di carta bibula sterilizzati (uno in ogni capsula di Petri) e su ognuno di essi sono stati versati 15µL di un determinato olio essenziale: sul primo olio essenziale di Rosmarinus officinalis L., sul secondo olio essenziale di Mentha piperita L. e sul terzo olio essenziale di Thymus vulgaris L..

Dischetto senza aggiunta di sostanze

Dischetto imbevuto di olio essenziale

Piastra di Petricon terreno di coltura

Fig.10. Posizionamento dei dischetti di carta bibula sul terreno di coltura nelle piastre di Petri.

Le tre piastre di Petri sono poi state chiuse e introdotte nel termostato regolato su 37°C ad incubare per 24 ore.

RISULTATI

34

3. RISULTATI

3.1. ESTRAZIONE DEGLI OLI ESSENZIALI

Pianta officinale

Prima estrazione (mL)

Seconda estrazione (mL)

Terza estrazione (mL)

Quarta estrazione (mL)

Rosmarinus Officinalis L.

0.42

0.38

0.33

0.52

Thymus vulgaris

0.43

0.46

0.45

0.50

Mentha piperita L.

0.48

0.47

-

-

Tab. 2 Resa dell’estrazione degli oli essenziali

RISULTATI

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3.2. ANALISI QUANTITATIVA GAS CROMATOGRAFICA DEGLI OLI ESSENZIALI

3.2.1 Analisi quantitativa dell’olio essenziale di Mentha piperita L.

Concentrazione % Componenti

0.29 .alpha.-Pinene 0.01 alpha- Thujene 0.04 2,5-d iethyltetrahydro- Furan 0.01 Butyric aeid N.D. RT:8.163 N.D. Camphene 0.50 .beta.-Pinene 0.29 beta- Phellandrene 0.21 beta-Myreene N.D. 4-Carene 2.93 Limonene 3.56 Euealyptol 0.01 (E)-2-Hexenal 0.24 (Z)-beta-Oeimene 0.04 gamma- Terpinene 0.05 (E)-beta-Ocimene 0.04 p-Cymene 0.03 RT:15.297 0.02 Terpinolene 0.04 n-Arnyl isovalerate

0.05 RT:17.61O 0.25 3-0ctanol 34.06 Menthone N.D. RT:23.663 0.34 Menthofuran 2.62 Isomenthone

N.D. Cyclobuta[ 1,2 :3,4 ]dicyclopentene, dec"10 0.03 Edulan I 0.28 RT:26.070 0.25 Linalool

0.08 Pinocamphone

N.D. Linalyl acetate 6.37 Menthol acetate 0.11 RT:27.950

0.16 Cyclohexanone, 5-methyl-2-( l-methyl% 0.08 RT:28.247 N.D. I, \-Dimethyl-4-methylenecyclohexam% N.D. RT:28.713 3.30 isomenthol

0.08 Terpinen-4-olo

0.09 Isopulegol 0.21 RT:30.307 0.07 RT:30.470

N.D. IsopulegoI acetate

37.89 Menthol 0.39 Pulegone 0.34 beta- Farnesene N.O. RT:31.893

0.19 .alpha.-Caryophyllene 0.04 RT:32.127

RISULTATI

36

N.D. RT:32.417 N.D. RT:32.537

0.15 (+ )-.alpha.-Terpineol N.D. Borneol 1.05 Germacrene D N.D. Piperitone oxide 1.88 Piperitone 0.32 Germacrene B N.D. Carvone 0.03 delta-Cadinene 0.01 RT:35.743

N.D.(Ref) RT:38.923 0.02 RT:39.420 0.03 RT:40.340 N.D.(Peak) RT:42.043 0.08 RT:42.450 0.08 Jasmone N.D. RT:43.400

0.07 \-Hydroxy-\,7-dimethyl-4-isopropyl-L'Io

0.43 Epiglobulol 0.09 (- )-Spathulenol 0.14 Thymol N.D.(Rei) Carvacrol 0.06 .alpha.-Cadinol

N.D. non determinato

Tab.6. Composizione chimica dell’olio essenziale di Mentha piperita L.

3.2.2. Analisi quantitativa dell’olio essenziale di Rosmarinus officinalis L.

Concentrazione % Componenti

0.18 Tricyclene 21.14 .alpha.-Pinene 0.05 alpha- Thujene 0.04 alpha-Fenchene 3.79 Camphene N.D.(Ref) RT:9.803 1.20 .beta.-Pinene 0.02 RT:IO.400 0.52 Bicyclo[3.1.0]hex-2-ene,4-methylene·% N.D.(Peak) 3-Carene 3.41 .beta.-Myrcene N.D. RT:12.033 0.38 (+ )-4-Carene 3.10 D-Limonene

7.50 Eucalyptol 0.03 RT:13.643 0.03 RT:13.813 N.O. RT:13.903 0.02 Furan, 2-penty1- N.O. RT:14.277 0.72 gamma- Terpinene 2.93 3-0ctanone

RISULTATI

37

0.35 p-Cymene 0.78 Terpinolene N.D. 1-0cten-3-one N.D.(Peak) RT:17.690 N.D. 3-Hexen-l-ol, (E)- 0.13 3-0ctano1 0.02 Nonana1 0.02 L-Fenchone N.D.(Ref) RT:20.307 0.04 p-Cymenene 0.19 RT:20.850 0.31 I-Octen-3-o1 0.02 RT:21.357 N.D. Menthone 0.14 RT:21.683 0.05 RT:22.240 0.03 RT:22.347 0.62 Chrysantenone 8.14 Camphor 0.02 RT:23.423 0.19 (E)-3(10)-Caren-2-o1 2.23 Linalool 0.14 RT:23.877 1.64 Pinocamphone 0.05 RT:24.300 0.01 RT:24.410 0.29 Pinocarvone 5.88 Bomyl acetate 4.08 Caryophyllene N.D. Terpinen-4-o1 0.15 RT:25.490 0.08 RT:25.713 0.03 RT:25.857 0.03 RT:26.033 0.07 RT:26.113 0.10 RT:26.333 0.06 RT:26.660 0.27 cis- Verbenol 0.06 RT:26.873 N.D. RT:27.003 0.47 alpha-Humulene 0.65 trans- Verbenol 0.15 RT:27.497 0.08 RT:27.650 1.74 alpha.-Terpineol 4.75 Borneo1 11.96 Verbenone 0.62 RT:28.547 0.55 Myrtanyl acetate 0.05 RT:28.833 0.16 Carvone 0.02 RT:29.027 0.05 RT:29.183 0.05 RT:29.280

N.D. 2-0eten-l-oI,3,7-dimethyI- 0.26 RT:29.653 0.05 RT:29.883 N.D. RT:29.963 1.52 RT:30.193 0.03 RT:30.560 N.D. RT:30.687 0.13 RT:30.907

RISULTATI

38

1.07 RT:31.190 1.60 RT:31.317 0.18 RT:31.453 N.D. RT:31.537 N.D. RT:31.607 0.02 RT:31.703 0.04 RT:31.893 0.04 RT:32.123 0.02 RT:33.093 N.D. RT:33.223 0.17 RT:33.470 0.01 RT:33.583 0.01 RT:33.717 N.D.(Ref) RT:34.013 N.D.(Peak) RT:34.233 0.60 CaryophyIlene oxide N.D. RT:34.903 0.05 RT:35.103 N.D. RT:35.193 0.01 RT:35.530 0.10 RT:36.087 0.02 RT:36.267 N.D. RT:36.403 0.01 RT:36.810 N.D. RT:36.983 0.04 RT:37.473 N.D.(Ref) RT:37.550 N.D.(Peak) RT:37.930 N.D.(Ref) RT:38.367 0.03 RT:38.983 0.03 RT:39.173 N.D.(Ref) RT:39.403 N.D. Thymol 0.10 RT:39.830 0.05 RT:40.037 N.D. CarvaeroI 0.03 RT:41.133 N.D.(Peak) RT:41.967 0.04 RT:42.547 0.04 RT:42.797 0.22 RT:43.257 0.69 RT:44.640 0.04 RT:44.883 N.D.(Peak) RT:45.040 0.02 RT:45.913 0.04 RT:46.270 Tentatively Identified Compound Tentatively Identified Compound

N.D. non determinato

Tab.7. Composizione chimica dell’olio essenziale di Rosmarinus officinalis L.

RISULTATI

39

3.2.3. Analisi quantitativa dell’olio essenziale di Thymus vulgaris L.

Concentrazione % Componenti

I N.D.(Rei) Tricyclene 0.12 Butanoic acid, 2-methyl-, methyl ester% 0.48 .alpha.-Pinene N.D.(Rei) RT:I0.447 0.43 alpha-Thujene 0.25 Camphene 0.12 .beta.-Pinene N.D.(Peak) beta-Thujene N.D.(Peak) RT:16.670 0.04 3-Carene 0.11 .alpha.-Phellandrene 1.03 .beta.-Myrcene 1.18 (+ )-4-Carene 0.24 Limonene • 0.52 Eucalyptol 0.07 beta-Phellandrene 0.03 2-Hexenal, (E)-

10.70 gamma- Terpinene 0.02 Ocimene 0.04 3-0ctanone 0.06 RT:24.843

7.82 p-Cymene

0.06 Terpinolene N.D.(Ref) Propanoic acid, hexyl ester 0.04 Butanoic acid, 4-pentenylester N.D.(Peak) l-Pentanol, 3-methyl- 0.03 3-Hexen- I -01 0.05 3-0ctanol

N.D.(Peak) RT:32.830 N.D.(Peak) Tanacetone N.D.(Peak) RT:33.943 0.85 I-Octen-3-01 N.D. Menthone 0.94 beta- Terpineol N.O. RT:35.600 N.O. RT:37.480 0.15 Camphor 2.15 Linalool N.D. 1-Nonen-3-01 N.D. Linalyl acetate 0.03 RT:39.863 N.D. RT:40.443 0.14 Bornyl acetate

2.77 Caryophyllene 0.50 Terpinen-e-ol 0.27 Thymol methyl ether 0.03 RT:41.890 N.D.(Peak) Isothujol N.D.(Peak) RT:43.080 N.D.(Peak) Menthol N.D.(Peak) RT:43.323 N.D.(Ref) trans-Pinocarveol 0.07 .alpha.-Caryophyllene 0.07 RT:44.847 N.D.(Ref) RT:44.930

RISULTATI

40

0.07 Neral 0.12 RT:45.193 N.D. alpha- Terpineol 0.91 Borneol 0.03 Germacrene D

0.03 RT:46.177

0.04 RT:46.483 0.03 RT:46.680 N.D. RT:46.960 0.13 Geranial N.D. Carvone N.D. Cedrene 0.27 RT:48.127

N.D.(Peak) RT:49.423 N.D.(Peak) Nerol N.D.(Ref) RT:50.120 0.16 Geranyl acetate N.D.(Peak) Calamenene 0.06 Geraniol 0.04 RT:5J.783 0.02 RT:52.487

0.02 RT:53.273 0.40 Caryophyllene oxide N.D.(Peak) RT:57.307 N.D.(Peak) RT:58.813 N.D. l-Hydroxy-I,7-dimethyl-4-isopropyl-LYo 0.04 Cubenol N.D.(Peak) RT:60.300 N.D.(Ref) Benzenemethanol, 4-(1-methylethyl)- 0.06 RT:61.033 0.02 RT:61.647 0.43 .tau.-Cadinol N.D. RT:63.467 62.48 Thymol 0.05 RT:64.570 2.92 Carvacrol 0.04 RT:65.620 0.11 RT:65.870 N.D.(Peak) RT:68.443 N.D.(Peak) RT:68.997 N.D.(Peak) RT:70.147 N.D.(Peak) RT:70.210 N.D. RT:72.060 0.07 RT:72.240 Tentatively Identified Compound

N.D. non determinato

Tab.8. Composizione chimica dell’olio essenziale di Thymus vulgaris L.

RISULTATI

41

3.3. DETERMINAZIONE DEL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI ESSENZIALI

3.3.1. La MIC

Concentrazione O.E.

(µL/mL)

Thymus vulgaris

L.

Rosmarinus

Officinalis L.

Mentha piperita L.

0.125

+

+

+

0.25 + + +

0.5 + + +

1 + + +

2 + + +

4 + + +

8 - + +

16 - - +

32 - - -

Controllo negativo

+

+

+

+ crescita degli enterococchi - assenza di crescita enterococchi Tab. 3. Determinazione della concentrazione minima inibitoria dell’olio essenziale

RISULTATI

42

3.3.2. La MBC

Concentrazione O.E.

(µL/mL)

Mentha piperita L.

Thymus vulgaris

L.

Rosmarinus

Officinalis L..

8

+

+

+

16

+

-

+

32

-

-

-

+ crescita degli enterococchi − assenza di crescita enterococchi Tab. 4. Determinazione della concentrazione minima battericida dell’olio essenziale

3.3.3. L’Aromatogramma

Pianta officinale

Ø alone di inibizione (cm)

Mentha piperita L

2

Thymus vulgaris L.

4

Rosmarinus Officinalis L

1,5

Tab. 5. Determinazione del diametro dell’alone di inibizione creato da ognuno dei tre oli essenziali tramite il test di suscettibilità agli oli essenziali o aromatogramma.

RISULTATI

43

Fig. 11. Aromatogramma

Olio essenziale di Mentha piperita L. Olio essenziale di Rosmarinus

officinalis L.

Olio essenziale di Thymus vulgaris L.

DISCUSSIONI

44

4. DISCUSSIONI

4.1. ESTRAZIONE DEGLI OLI ESSENZIALI

Per ottenere un sufficiente quantitativo di olio essenziale che permettesse lo svolgimento delle due parti dell’esperimento, ossia l’analisi chimica quantitativa dell’olio essenziale estratto e la determinazione del suo potere antimicrobico attraverso MIC e MBC, sono state necessarie più estrazioni per ogni pianta officinale. Nel caso di Mentha piperita L. sono risultate sufficienti due estrazioni, mentre per quanto riguarda Rosmarinus officinalis L. e Thymus vulgaris L. si sono dovute effettuare quattro estrazioni. Gli oli essenziali ottenuti mediante estrazione in corrente di vapore contenevano delle tracce d’acqua per cui sono stati successivamente purificati tramite solfato di sodio anidro (Na2SO4). Questa fase è stata la più delicata per quanto riguarda l’estrazione degli oli essenziali poiché questo procedimento ha ridotto la resa.

4.2. ANALISI CHIMICA DEGLI OLI ESSENZIALI

L’analisi degli oli essenziali tramite GC-MS ha rilevato in tutti e tre gli oli essenziali la presenza di numerosi e differenti composti chimici. Nel caso dell’olio di Rosmarinus officinalis L. sono 132 i tipi di sostanze che lo compongono. I composti percentualmente più presenti in questo olio essenziale sono: l’α-pinene (21.14%), il verbenone (11.96%), la canfora (8.14%) e l’eucaptolo (7.50%). Alcune percentuali concordano coi risultati di altri studi (Daferera et al., 2000, 2003; Pintore et al., 2002) secondo cui l’olio essenziale di L. risulta essere composto dal 2% al 25% da α-pinene e dal 2% al 14% da canfora. Nel caso qui analizzato è presente in percentuali abbastanza elevate anche l’eucaliptolo. In altri studi (Daferera et al., 2000, 2003; Pintore et al., 2002) questa sostanza non si trova invece tra i composti presenti in maggior percentuale. Per quanto riguarda l’olio essenziale di Mentha piperita L. sono stati rintracciati 74 composti. I maggiori componenti sono il mentolo (37.89%), il mentone (34.06%) e l’acetato di mentolo (6.37%). Questi risultati concordano quasi completamente con quelli di altri studi (Sokovic et al., 2009; Behnam et al., 2006). Nel caso qui preso in esame come anche negli altri due studi (Sokovic et al., 2009; Behnam et al., 2006) il maggior composto dell’olio essenziale risulta essere il mentolo. Anche la percentuale riscontrata in questo esperimento concorda con i risultati degli studi citati sopra, dove la percentuale di mentolo si aggira tra il 36% e il 38%. Nel caso dell’olio essenziale di Thymus vulgaris L. sono invece stati rintracciati 100 composti. I quattro maggiori componenti sono il timolo (62.48%), il γ-terpinene (10.70%), il ρ-cimene (7.82%) e il carvacrolo (2.92%). In questo caso i dati concordano pienamente con quelli di altri studi (Cosentino et al., 1999; Marino et al., 1999; Daferera et al., 2000; Juliano et al., 2000) sia per quanto riguarda i composti principali, sia per quanto riguarda le percentuali contenute nell’olio essenziale di Thymus vulgaris L.. In questi studi si è riscontrato che l’olio essenziale di Thymus vulgaris L. è costituito in primo luogo da timolo (10%-64%) seguito da carvacrolo (2%-11%), γ-terpinene (2%-31%) e ρ-cimene (10%-56%).

DISCUSSIONI

45

Le differenze tra i risultati di questa analisi e quelli della bibliografia possono probabilmente essere imputati al genotipo (Rota et al., 2008) e ai fattori ambientali e climatici (Piccaglia et al., 1993) come la stagione (Burt, 2004), l’area geografica e in particolare l’altitudine (Burt, 2004).

4.3. DETERMINAZIONE DEL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI ESSENZIALI

4.3.1. Potere antimicrobico

Il potere antimicrobico di ognuno dei tre oli essenziali è stato verificato tramite tre prove: il test della MIC (determinazione della concentrazione minima inibitoria), il test della MBC (determinazione della concentrazione minima battericida) e l’aromatogramma. È di basilare importanza svolgere il lavoro in condizioni di sterilità al fine di evitare possibili contaminazioni. Queste condizioni sono state instaurate attraverso la sterilizzazione tramite Autoclave di tutti gli strumenti utilizzati e tramite l’installazione di un cono di sterilità (creato tramite Becco Bunsen). Tramite i tre i test effettuati è stato accertato che gli oli essenziali esaminati possiedono un potere antimicrobico e che questo dipende in larga misura dal tipo di olio essenziale. Il test quantitativo per la determinazione della concentrazione minima inibitoria ha mostrato risultati diversi a dipendenza dell’olio essenziale utilizzato come agente antimicrobico. Nel caso del Rosmarinus officinalis L. è stata deteminata una concentrazione minima inibitoria di 16 µL/mL, in quello della Mentha piperita L. di 32 µL/mL e in quello del Thymus vulgaris L. di 8 µL/mL. Queste differenze hanno poi trovato conferma nel test per la determinazione della concentrazione minima battericida (vedi risultati capitolo 3.3) e nell’aromatogramma. Attraverso questo test sono stati infatti ottenuti aloni di inibizione con diametri differenti a seconda dell’olio essenziale impiegato. L’estrazione di ogni olio essenziale come pure le successive prove svolte sono state effettuate alle stesse condizioni per quanto riguarda: la durata dell’estrazione e dell’incubazione, la temperatura, la concentrazione di enterococchi e le concentrazioni di agente antimicrobico. In nessun olio essenziale sono state aggiunte ulteriori sostanze (fatta eccezione per il Tween 80, necessario per facilitare l’emulsione dell’olio essenziale nel brodo di coltura liquido) che aumentassero il loro potere antimicrobico, di conseguenza la differente attività antimicrobica deriva presumibilmente dalla diversa composizione chimica degli oli essenziali. Ogni olio essenziale infatti contiene moltissimi composti che lo rendono particolare (Prabuseenivasan et al., 2006; Sacchetti et al., 2005).

4.3.2 Modalità d’azione antimicrobica

Le proprietà antimicrobiche degli oli essenziali e dei loro componenti sono conosciute già da molto tempo (Burt, 2004) ma i meccanismi d’azione dei vari composti non sono ancora stati studiati nel dettaglio (Lambert et al., 2001). Dato l’elevato numero di differenti gruppi di composti chimici presenti negli oli essenziali è presumibile che la loro attività antimicrobica non sia attribuibile ad uno specifico meccanismo ma piuttosto che ne esistano diversi (Carson et al., 2002). Al fine di comprendere in modo più chiaro le modalità d’azione antimicrobiche può essere utile osservare la formula di struttura dei composti maggiormente presenti negli oli essenziali estratti.

DISCUSSIONI

46

timolo ρ-cimene carvacrolo

γ-terpinene mentolo mentone

α-pinene eucaliptolo verbenone

Fig. 12. Formula di struttura dei principali costituenti degli oli essenziali di Mentha piperita L., Rosmarinus officinalis L. e Thymus vulgaris L. (Burt, 2004; Hart et al., 2008).

DISCUSSIONI

47

Un’importante caratteristica degli oli essenziali e dei loro componenti è la loro idrofobia che permette loro di penetrare nella membrana cellulare incrementandone la permeabilità. Questo può provocare la fuoriuscita di ioni e di molecole dalla cellula che può causarne la morte (Burt et Reinders, 2003). Generalmente gli oli essenziali che possiedono maggiori proprietà antimicrobiche contengono un’elevata percentuale di componenti fenoliche come il carvacrolo, il timolo ed l’ eugenolo (Juliano et al., 2000; Lambert et al., 2001). Il loro meccanismo sembra essere simile a quello di altri fenoli che in genere agiscono sulla membrana plasmatica delle cellule (Burt, 2004). La struttura chimica dei singoli componenti degli oli essenziali determina la modalità d’azione antimicrobica (Dorman et Deans, 2000). È stata ad esempio confermata l’importanza della presenza del gruppo ossidrile nella componente fenolica (Ultee et al., 2002). Per contro la posizione relativa del gruppo ossidrile non sembra influenzare in modo significativo il grado dell’attività antimicrobica (Ultee et al., 2002). È apparso che i componenti degli oli essenziali agiscono sulle proteine cellulari inserite nella membrana citoplasmatica (Burt, 2004). È noto che gli enzimi dell’ATP sintetasi (coinvolti nel trasporto attivo di ioni e molecole) sono situati nella membrana citoplasmatica e sono associati a molecole lipidiche. Sono stati ipotizzati due possibili meccanismi dell’attività antimicrobica: le molecole idrocarburiche lipofile dei componenti degli oli essenziali possono accumularsi nel doppio strato fosfolipidico e distorcere l’interazione lipidi-proteine oppure possono verificarsi interazioni diverse della componente lipofila con le parti idrofobe delle proteine destabilizzandole (Burt, 2004) Per quanto riguarda le componenti non fenoliche degli oli essenziali è stato riscontrato che il tipo di gruppo alchilico (l’alchenile maggiormente rispetto all’alchile) influenza l’attività antimicrobica. Ad esempio il limonene, che possiede un gruppo alchenile, ha una maggior efficacia rispetto al ρ-cimene, che possiede invece un gruppo alchile (Dorman e Deans, 2000). Il ρ-cimene tuttavia possiede proprietà lipolitiche (Burt et al., 2007) e sembra che quest’ultimo sia un precursore del carvacrolo e del timolo nelle piante (Burt et al, 2007) e che sia anch’esso in grado di abbassare il potenziale di membrana causando una destabilizzazione della membrana citoplasmatica e la conseguente fuoriuscita di ioni. Tra i tre oli essenziali quello che ha mostrato una più potente attività antimicrobica nei confronti degli enterococchi si è rilevato essere quello di Thymus vulgaris L.. Questo olio essenziale è infatti quello che ha mostrato di possedere la più bassa concentrazione minima inibitoria e battericida e inoltre è quello che ha prodotto, nell’aromatogramma, l’alone di inibizione con diametro maggiore. Questa sua maggior potenza sembra essere associata all’elevata concentrazione di timolo (Rota et al., 2008; Sáncez et al., 2004). In altri studi riguardanti il potere antimicrobico degli oli essenziali (Ultee et al., 2002; Lambert et al., 2001) una maggior attività antimicrobica è stata associata ad oli essenziali contenenti carvacrolo, timolo ed eugenolo. Il meccanismo d’azione del carvacrolo sembra essere quello più studiato dai ricercatori. Il timolo è strutturalmente molto simile al carvacrolo anche se possiede il gruppo ossidrile in posizione diversa (questo non rende però la sua azione molto diversa da quella del carvacrolo). Entrambe le sostanze rendono permeabile la membrana cellulare (Lambert et al., 2001) e sono in grado di inibire l’attività dell’enzima ATPasi. Esse sono in grado di disintegrare la membrana esterna dei batteri gram-positivi e gram negativi (Burt et al, 2007) rilasciando lipopolisaccaridi e incrementando la permeabilità della membrana citoplasmatica all’ATP (Burt, 2004). Il carvacrolo, come anche il timolo, interagisce con la membrana cellulare allineandosi tra le catene di acidi grassi (Ultee et al., 1999). Queste distorsioni della struttura fisiologica possono causare l’espansione e la destabilizzazione della membrana, incrementandone la fluidità che alla fine porta all’aumento della permeabilità (Ultee et al., 2002). È stato dimostrato che il carvacrolo e il timolo formano dei canali attraverso la membrana cellulare allontanando le catene di acidi grassi dei fosfolipi permettendo agli ioni e alle molecole di lasciare il citoplasma (Ultee, 1999). È stato inoltre ipotizzato (Ultee et al., 2002) che il carvacrolo e il timolo agiscano come portatori transmembranici di cationi monovalenti rilasciando il loro ione idrogeno (H+) e

DISCUSSIONI

48

scambiandolo con un altro catione come ad esempio lo ione potassio (K+). La molecola diffonde poi attraverso la membrana citoplasmatica e dissocia rilasciando il catione nell’ambiente esterno (Ultee et al., 2002).

Purtroppo non è stato possibile confrontare le concentrazioni minime inibenti e le concentrazioni minime battericide dei tre oli essenziali risultate da questo lavoro con quelle di altri studi poiché non è stato trovato alcuno studio riguardante il potere antimicrobico degli oli essenziali nei confronti degli enterococchi. Nessun lavoro preso in considerazione ha utilizzato come agenti patogeni gli enterococchi ma nonostante questo è stato possibile riscontrare che in generale i batteri Gram-positivi (come gli enterococchi) subiscono una maggior inibizione da parte degli oli essenziali rispetto ai batteri Gram-negativi (Preuss et al., 2005; Nedorostova et al., 2009).

CONCLUSIONI

49

5. CONCLUSIONI E PROSPETTIVE FUTURE

In questo lavoro di maturità è stato studiato il potere antimicrobico di tre oli essenziali estratti da piante officinali coltivate in Ticino: Rosmarinus officinalis L., Mentha piperita L. e Thymus vulgaris L.. Al fine di comprendere meglio l’attività antimicrobica è stata eseguita un’analisi chimica quantitativa degli oli essenziali che ha permesso di individuarne i vari componenti. In ognuno degli oli essenziali presi in esame sono state rintracciate oltre 70 sostanze. I composti presenti negli oli essenziali possono comparire in percentuali molto varie. Le sostanze che compongono gli oli essenziali possono risultare percentualmente superiori al 30% (come nel caso del mentolo presente per il 37.89% nell’olio di Mentha piperita L.) ma possono comparire anche solo in tracce e quindi in percentuali inferiori allo 0.05%. Attraverso lo svolgimento di tre prove si è potuto verificare il potere antimicrobico di tutti gli oli essenziali presi in esame e quantificarne l’efficacia. È stato inoltre accertato che questo dipende in larga misura dal tipo di olio essenziale. Nonostante ci siano marcate differenze fra gli oli essenziali è stato possibile concludere che è sufficiente una concentrazione di 32 µL/mL di olio essenziale per inibire la crescita degli enterococchi. Dall’osservazione dei dati ottenuti si evince che l’olio essenziale che possiede il maggior potere antimicrobico nei confronti degli enterococchi del ceppo SF68 è quello di Thymus vulgaris L.. Occorre infatti una minor concentrazione di quest’olio essenziale rispetto agli altri due per inibire e uccidere gli enterococchi. In futuro sarebbe auspicabile effettuare le prove della MIC e della MBC utilizzando concentrazioni più elevate di olio essenziale. Per confermare il potere antimicrobico degli oli essenziali qui presi in esame risulta necessario un ulteriore studio effettuato in vivo come pure uno studio su altri ceppi batterici al fine di generalizzare questa proprietà. Il potere antimicrobico degli oli essenziali potrebbe essere sfruttato in casi in cui si sia sviluppata una resistenza agli antibiotici. È noto che i batteri sono in grado di sviluppare una resistenza agli antibiotici e agli agenti antisettici (Oluwatuyi et al., 2004) e perciò si rende necessario lo sviluppo di nuovi agenti antimicrobici. Per questa necessità potrebbero risultare utili gli oli essenziali con questa proprietà. Siccome la composizione chimica degli oli essenziali dipende da fattori ambientali e climatici come la stagione, l’area geografica e l’altitudine (Burt, 2004) sarebbe opportuno studiare la relazione tra questi fattori e il potere antimicrobico. In particolare sarebbe interessante determinare in quali periodi dell’anno l’olio essenziale possiede il maggior potere antimicrobico oppure a quale altitudine deve trovarsi la pianta perché essa produca l’olio essenziale con il più alto grado di potere antimicrobico. Tutto questo allo scopo di ottenere oli essenziali sempre più efficaci.

BIBLIOGRAFIA

50

6. BIBLIOGRAFIA

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ALLEGATI

56

7. ALLEGATI

7.1 ESTRAZIONE DEGLI OLI ESSENZIALI

Fig. 13. Misura della massa del materiale vegetale

Fig. 14. Aggiunta del materiale vegetale nell’estrattore

ALLEGATI

57

Fig. 15. Aggiunta dell’acqua nell’estrattore

Fig. 16. Due estrattori di oli essenziali durante il processo di estrazione

ALLEGATI

58

Fig. 17. Olio essenziale di Mentha piperita L.

Fig. 18. Olio essenziale di Rosmarinus officinalis L.

ALLEGATI

59

Fig. 19. Olio essenziale di Thymus vulgaris L.

7.2. DETERMINAZIONE DEL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI ESSENZIALI

Fig. 20. MIC

ALLEGATI

60

Fig. 21. Semina degli enterococchi sulla piastra di Petri

Fig. 22. Aromatogramma dell’olio essenziale di Rosmarinus officinalis L.

ALLEGATI

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Fig. 23. Aromatogramma dell’olio essenziale di Mentha piperita L.

Fig. 24. Aromatogramma dell’olio essenziale di Thymus vulgaris L.

RINGAZIAMENTI

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8. RINGRAZIAMENTI

Al termine di questo lavoro vorrei esprimere la mia gratitudine e riconoscenza a tutti coloro che hanno contribuito alla sua realizzazione. In particolare ringrazio:

� i professori Luca Paltrinieri e Claudio Arrivoli per i loro validi e proficui insegnamenti, per le esaurienti spiegazioni, per gli indispensabili consigli, per il prezioso aiuto e per l’appoggio che sempre mi hanno fornito

� la dottoressa Michela Pedroli per i fondamentali e accurati ragguagli, per le esaustive

delucidazioni, per la scrupolosa assistenza e la grande disponibilità

� il professor Carlo Pedroni per le interessanti precisazioni

� il laboratorio didattico della Fondazione Alpina per le scienze della Vita (FASV) a Olivone per aver gentilmente messo a disposizione la struttura e gli strumenti necessari

� la ditta IBSA per il suo prezioso e considerevole sostegno finanziario