Vietnam J. Agri. Sci. 2019, Vol. 17, No. 3: 196-203 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2019, 17(3): 196-203 www.vnua.edu.vn

196

TÍNH ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE

TRONG PHÂN ĐOẠN GEN MÃ HÓA ENZYME CATHEPSIN D ASPARTIC PROTEASE

CỦA LOÀI GIUN MÓC TRUYỀN LÂY Ancylostoma ceylanicum

Dương Đức Hiếu1*, Bùi Khánh Linh1, Nguyễn Thu Hương2, Lê Đức Vĩnh3, Nguyễn Thị Hoàng Yến1, Nguyễn Thị Hồng Chiên1, Nguyễn Văn Phương1

1Khoa Thú y, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam 2Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng TW

3Đại học Y Dược Phạm Ngọc Thạch

*Tác giả liên hệ: ddhieu@vnua.edu.vn

Ngày nhận bài: 02.04.2019 Ngày chấp nhận đăng: 01.06.2019

TÓM TẮT

Nghiên cứu được tiến hành nhằm xác định sự tồn tại của loài giun móc chó truyền lây Ancylostoma ceylanicum

trên người tại Việt Nam, đồng thời phân tích đặc điểm đa hình đơn nucleotide trong phân đoạn gen mã hóa enzyme

cathepsin D aspartic protease của A. ceylanicum, một trong những loại enzyme thủy phân đóng vai trò quan trọng

trong vòng đời phát triển của giun móc (Williamson et al., 2004). Bằng phương pháp KOD-PCR, sự tồn tại của loài

giun móc chó truyền lây Ancylostoma ceylanicum trên người và chó tại Việt Nam được khẳng định. Kết quả so sánh

các trình tự phân đoạn gen mã hóa enzyme cathepsin D aspartic protease của A. ceylanicum cho thấy xuất hiện

nhiều đột biến điểm tại vùng Exon 7, 8, 9. Đặc biệt, 3 đột biến điểm không đồng nghĩa (1 điểm đột biến trên vùng

exon 7 và 2 điểm đột biến trên vùng exon 9) được xác định gây ra sự thay đổi về trình tự axitamin của aspartyl

protease. Kết quả nghiên cứu về tính đa hình đơn nucleotide trên vùng gen mục tiêu này của chúng tôi là cơ sở khoa

học cho việc phát triển các loại vacxin phòng bệnh giun móc hiệu quả sử dụng kháng nguyên cathepsin D aspartic

protease tái tổ hợp.

Từ khóa: Ancylostoma ceylanicum, tính đa hình đơn nucleotide, cathepsin D aspartic protease.

Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) in the Gene Segment Coding for Cathepsin D Aspartic Protease of Zoonotic Hookworm Ancylostoma ceylanicum

ABSTRACT

This study was conducted to determine the presence of the canine zoonotic hookworm species, Ancylostoma

ceylanicum, in humans in Vietnam and to analyze the single nucleotide polymorphism in the gene segment encoding

A. ceylanicum cathepsin D aspartic protease, one of the hydrolytic enzymes with an important role in the life cycle of

hookworm. The existence of Ancylostoma ceylanicum in dogs and humans in Vietnam was confirmed by KOD-PCR.

Comparative analysis of tthe sequences encoding A. ceylanicum cathepsin D aspartic protease revealed, some

mutations in exon 7, 8, and 9. Three SNPs non-synonymous mutations (one from exon 7 and two from exon 9)

caused the changes in amino acid sequences of aspatyl protease. Our results can be considered for futher studies

on the development of effective vaccine against hookworm disease using recombinant cathepsin D aspartic protease

as an antigen.

Keywords: Ancylostoma ceylanicum, single nucleotide polymorphisms, cathepsin D aspartic protease.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh giun móc là một trong những căn

bệnh truyền lây được Tổ chức Y tế thế giới

WHO xếp vào danh mục những căn bệnh bị

lãng quên tại vùng nhiệt đới, ước tính trên 700

triệu người tại các quốc gia đang phát triển bị

nhiễm căn bệnh này (Hotez et al., 2004). Đặc

biệt, Ancylostoma ceylanicum, loài giun móc

chó duy nhất có khả năng lây nhiễm và phát

Dương Đức Hiếu, Bùi Khánh Linh, Nguyễn Thu Hương, Lê Đức Vĩnh, Nguyễn Thị Hoàng Yến, Nguyễn Thị Hồng Chiên, Nguyễn Văn Phương

197

triển thành dạng trưởng thành ở cơ thể người,

đã được ghi nhận với tỷ lệ nhiễm cao trên chó

và người tại khu vực Đông Nam Á (Traub et

al., 2008; Ngui et al., 2012a; Ngui et al., 2012b;

Conlan et al., 2012; Inpankaew et al., 2014),

trong đó có Việt Nam (Dinh et al., 2015; Duong

et al., 2018). Giun móc ký sinh trong ruột vật

chủ, lấy chất dinh dưỡng từ việc hút máu, ly

giải hồng cầu, phân hủy huyết sắc tố

Hemoglobin (Hb) và các loại protein khác bằng

con đường thủy phân protein (Williamson et

al., 2004). Mebendazole và albendazole là

những loại thuốc được sử dụng phổ biến trong

việc tẩy giun. Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã

chỉ ra tính kháng thuốc trên nhóm giun truyền

qua đất, trong đó có loài giun móc Necator

americanus, do liên quan đến đột biến điểm di

truyền (Ambrose et al., 2018). Do vậy, việc

phát triển các loại thuốc tẩy giun mới, cũng

như vacxin được coi là cần thiết trong việc

phòng chống căn bệnh này. Cathepsin D

aspartic protease (aspartyl protease) là một

trong những loại enzyme thủy phân đóng vai

trò quan trọng trong việc phân hủy huyết sắc

tố trong quá trình tiêu hóa của giun móc

trưởng thành (Williamson et al., 2002;

Williamson et al., 2003a), cũng như phân hủy

mô của vật chủ trong quá trình xâm nhập và di

hành của ấu trùng (Brown et al., 1999;

Williamson et al., 2003b; Jolodar et al., 2004).

Do đóng vai trò quan trọng trong sự tồn tại và

phát triển của giun móc ở cơ thể vật chủ,

aspartyl protease được nhiều nghiên cứu đánh

giá cao về tiềm năng ứng dụng trong việc phát

triển vacxin phòng bệnh giun móc (Loukas et

al., 2005). Việc đánh giá tính đa hình đơn

nucleotide (SNPs) là cần thiết, đặc biệt là

những đột biến điểm không đồng nghĩa (non-

synonymous SNPs) dẫn đến sự sai khác trong

trình tự axit-amin có thể làm thay đổi cấu

trúc, chức năng của protein và ảnh hưởng tới

hiệu quả của vacxin phòng bệnh. Trong nghiên

cứu bước đầu này, phân đoạn gen (vùng Exon

7- Exon 8- Exon 9) mã hóa aspartyl protease

của loài giun móc truyền lây A. ceylanicum

được giải trình tự và phân tích tính đa hình

đơn nucleotide.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Mẫu và nguồn gốc mẫu

Mẫu phân chó thu thập ngẫu nhiên tại các

hộ nuôi chó tại Hà Nội và Bắc Ninh được chuyển

về Phòng thí nghiệm Ký sinh trùng - Bộ môn Ký

sinh trùng, Khoa Thú y, Học viện Nông Nghiệp

Việt Nam để xét nghiệm. Mẫu ấu trùng giun móc

người thu từ các bệnh nhân dương tính với trứng

giun móc được cung cấp bởi Viện Sốt rét - Ký

sinh trùng - Côn trùng TW (NIMPE).

2.2. Phương pháp phù nổi Fullerborn

5 gram mẫu phân chó được cho vào cốc sạch

chứa khoảng 50-60 mL dung dịch nước muối

bão hòa, dùng đũa thủy tinh khuấy đều, lọc

dung dịch qua lưới lọc và chuyển dung dịch sang

ống fancol 15 cho đầy, đặt phiến kính lên. Sau

15-20 phút trứng giun sẽ nổi lên bám vào phiến

kính, lấy ra và soi dưới kính hiển vi quang học

(x10) xác định trứng giun móc theo khóa định

danh Bowman, 2009.

2.3. Phương pháp nuôi ấu trùng trên

thạch agar

Khoảng 5 gram mẫu phân chó dương tính

với trứng giun móc được chuyển lên bề mặt đĩa

thạch agar (2%). Trứng giun móc được nuôi

trong tủ ấm 27C và kiểm tra hàng ngày. Sau

khoảng 2-3 ngày nuôi cấy, ấu trùng giun móc

được thu và bảo quản trong dung dịch cồn 70.

2.4. Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Từng ấu trung giun móc riêng rẽ được rửa

sạch bằng dung dịch PBS-Tween20 (0,1%) và

chuyển vào ống Eppendorf chứa dung dịch đệm

lysis gồm Direct PCR Lysis Reagent (Tail)

(VIAGEN Biotech, Canada), 1 M Dithiothreitol

và Proteinase K (QIAGEN, Hà Lan). Ủ hỗn hợp

lysis trong 20 phút ở 60C, 10 phút ở 95C. DNA

tổng số của ấu trùng giun móc được bảo quản

trong tủ âm (-20C) đến khi dùng.

2.5. Phương pháp KOD-PCR nhân vùng gen

mt cox1 và phân đoạn gen aspartyl protease

Cặp mồi HPo1: 5’-TTACGTAGAAGGTCAA

TTTCTTTGG-3’ và HPo2: 5’- CTACTTAACCTA

Tính đa hình đơn nucleotide trong phân đoạn gen mã hóa enzyme cathepsin D aspartic protease của loài giun móc truyền lây Ancylostoma ceylanicum

198

TACTCCGGCCTTC-3’ được thiết kế dựa trên

trình tự gen ty thể của A. ceylanicum

AP017674.1 (NCBI) nhằm nhân phân đoạn gen

mt cox1 (983 bp). Phản ứng KOD- PCR được thực

hiện sử dụng KOD Fx Neo polymerase với chu kỳ

nhiệt như sau: 94C trong 2 phút, 35 chu kỳ lặp

lại (94C - 10 giây, 63C - 30 giây, 68C - 1 phút),

68C - 5 phút và giữ sản phẩm ở 4C. Tính đặc

hiệu của phản ứng KOD-PCR được kiểm tra sử

dụng mạch khuôn DNA của các loài giun móc

A. caninum, A. ceylanicum và N. americanus làm

đối chứng. Căn cứ vào trình tự genome của

A. ceylanicum JARK01001578.1 (NCBI), cặp mồi AceyAP3F: 5’-GGTGTTCGCTTTCTGGCTCA-3’

và AceyAP3R: 5’-GGTCAATACGTAATCTTCAC

CCTTG-3’ được thiết kế phủ vùng mã hóa Exon

7, 8, 9 của aspartyl protease gen. PCR master

mix trong 25 uL phản ứng gồm 12,5 uL dung

dịch đệm 2x KOD Fx PCR, 5 uL 2 mM dNTP, 0,5

uL KOD Fx Neo polymerase, 0,75 uL 10 uM mồi

xuôi và ngược, 1ul mạch khuôn DNA và nước cất

tinh sạch. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

như sau: khởi đầu 94C trong 2 phút, 35 chu kỳ

lặp lại (biến tính 98C -10 giây, gắn mồi ở 63C -

30 giây, kéo dài ở 68C - 45 giây), kết thúc kéo

dài 68C - 5 phút và giữ sản phẩm ở 4C. Sản

phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện

di trên thạch agarose 1,5% chứa GelRed (Wako,

Nhật Bản) trong 30 phút ở 100V trong dung dịch

đệm 1X TAE.

2.6. Phương pháp TA cloning

Sản phẩm PCR của phản ứng nhân phân

đoạn gen aspartyl protease được tinh sạch bằng

bộ kit QIAquick PCR Purification (QIAGEN, Hà

Lan) và được gắn với plasmid pCR 2.1-TOPO

bằng TOPO TA Cloning kits (Thermo Fisher

Scientific, Mỹ). Sau đó, vector tách dòng gen

được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α

bằng phương pháp sốc nhiệt và được nuôi trong

môi trường SOC trong tủ ấm lắc 37C. Sau 1 giờ

nuôi cấy, tế bào E. coli được cấy chuyển trên bề

mặt thạch LB chứa Amplicilin (50 ug/mL) và

chất chỉ thị màu X-Gal, nuôi trong tủ ấm 37C

trong 12 giờ. Kiểm tra sự phát triển của khuẩn

lạc, chọn lọc các khuẩn dương tính (màu trắng)

và tiến hành phản ứng Colony PCR sử dụng cặp

mồi AceyAP3F và AceyAP3R.

Ghi chú: M: thang chuẩn DNA; giếng 1,2: mẫu ấu trùng giun móc từ chó; giếng 3,4: mẫu ấu trùng giun móc từ người

Hình 1. (A) Tính đặc hiệu của phản ứng KOD-PCR sử dụng cặp mồi HPo1

và HPo2 nhân phân đoạn gen ty thể mt cox1 nhằm sàng lọc loài giun móc A. ceylanicum;

(B) Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân phân đoạn gen ty thể mt cox1 của A. ceylanicum

trên gel Agarose 1,5%

Dương Đức Hiếu, Bùi Khánh Linh, Nguyễn Thu Hương, Lê Đức Vĩnh, Nguyễn Thị Hoàng Yến, Nguyễn Thị Hồng Chiên, Nguyễn Văn Phương

199

2.7. Phương pháp Sequencing PCR và giải

trình tự gen

Sản phẩm Colony PCR sau khi tinh sạch

được sử dụng là mạch khuôn cho phản ứng

Sequencing PCR bằng bộ kit BigDye

Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Thermo

Fisher Scientific, Mỹ). Chu trình nhiệt của phản

ứng Sequencing PCR như sau: ủ 96C trong 1

phút, 25 chu kỳ lặp lại (biến tính 96C - 10 giây,

gắn mồi ở 50C - 5 giây, kéo dài ở 60C - 4 phút)

và giữ sản phẩm ở 4C. Sản phẩm Sequencing

PCR được tinh sạch bằng hạt từ tính - Magnetic

Bead Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter,

Mỹ) và chuyển vào đĩa PCR 96 giếng. Trình tự

gen được giải mã sử dụng phương pháp Sanger

Sequencing bằng hệ thống máy giải trình tự gen

ABI Prism 3100 genetic analyzer (Applied

Biosystems, Mỹ).

2.8. Xử lý số liệu

Toàn bộ kết quả trình tự gen được xử lý,

phân tích và so sánh bằng phần mềm 4Peak và

MEGA7, đồng thời sử dụng hệ thống dữ liệu về

trình tự gen, trình tự protein từ NCBI để

tham khảo.

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tính đặc hiệu của phản ứng KOD-PCR

và kết quả sàng lọc loài giun móc truyền lây

Ancylostoma ceylanicum thu tại Việt Nam

Tính đặc hiệu của phản ứng KOD-PCR

phân biệt loài giun móc truyền lây

A. ceylanicum được kiểm tra bằng các mẫu DNA

đối chứng được tách chiết từ giun móc trưởng

thành của các loài A. caninum, A. ceylanicum và

N. americanus đã được định loài bằng hình thái

học. Kết quả thể hiện ở hình 1A cho thấy với

mẫu A. ceylanicum chỉ cho 1 dải băng duy nhất

có kích thước như dự đoán ở vị trí 983 bp, với

mẫu A. caninum thu được nhiều dải băng không

đặc hiệu và không có kết quả dương tính nào với

mẫu N. americanus. Như vậy, phản ứng KOD-

PCR sử dụng cặp mồi HPo1 và HPo2 đảm bảo

tính đặc hiệu khi phân loại loài giun

móc A. ceylanicum.

Kết quả phân lập ấu trùng giun móc truyền

lây A. ceylanicum từ chó và người bằng KOD-

PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhân phân đoạn

gen ty thể mt cox1 (983bp) được thể hiện ở hình

1B. Kết quả điện di cho thấy một dải băng sáng

rõ nét duy nhất ở mỗi làn chạy có kích thước

983 bp. Như vậy, trong các mẫu ấu trùng giun

móc thu được từ chó và người, chúng tôi đều

phát hiện sự tồn tại và phân lập thành công loài

giun móc chó truyền lây A. ceylanicum trên cả 2

vật chủ (người và chó).

3.2. Tách dòng gen aspartyl protease của

Ancylostoma ceylanicum bằng vector tách

dòng TA cloning

Với các mẫu DNA tổng số của ấu trùng giun

móc A. ceylanicum sau khi định danh bằng

phản ứng KOD-PCR, chúng tôi tiếp tục sử dụng

làm mạch khuôn nhằm nhân phân đoạn gen

aspartic protease mục tiêu có kích thước khoảng

810 bp (Hình 2).

Sau khi tinh sạch, 17 sản phẩm PCR nhân

phân đoạn gen mã hóa enzyme aspartyl

protease của A. ceylanicum phân lập từ 11 mẫu

ấu trùng giun móc từ chó và 6 mẫu từ người

được lựa chọn gắn với vector tách dòng TOPO-

TA cloning và biến nạp vào tế bào khả biến

E. coli DH5α. Ít nhất 12 khuẩn lạc dương tính

(màu trắng) của từng mẫu được lựa chọn ngẫu

nhiên (Hình 3A), kiểm tra bằng Colony PCR

(Hình 3B) và tiến hành giải trình tự gen.

3.3. Tính đa hình đơn nucleotide trong

phân đoạn gen mã hóa enzyme aspartyl

protease của Ancylostoma ceylanicum

Sau khi phân tích kết quả giải trình tự gen

và BLAST trên NCBI, chúng tôi xác định được 22

điểm SNPs trên phân đoạn gen mã hóa enzyme

aspartyl protease của loài giun móc chó truyền

lây A. ceylanicum phân lập tại Việt Nam.

Kết quả ở bảng 1 cho thấy số lượng SNPs ở

vùng Exon 8 là nhiều nhất, tuy nhiên các đột

biến điểm này đều là đột biến điểm đồng nghĩa

và không hề ảnh hưởng tới sự sai khác về trình

tự axit-amin của aspartic protease. Trong khi

đó, 3 đột biến điểm (1 SNP tại vùng Exon 7 và 2

Tính đa hình đơn nucleotide trong phân đoạn gen mã hóa enzyme cathepsin D aspartic protease của loài giun móc truyền lây Ancylostoma ceylanicum

200

SNPs tại vùng Exon 9) đều dẫn đến sự thay đổi

về axit amin. Cụ thể, codon ACA mã hóa

Threonine tại vùng Exon 7 chuyển thành bộ ba

ATA mã hóa Isoleucine (Hình 4). Tại vùng Exon

9, CTC mã hóa Leucine thành CCC mã hóa

Proline và CCT mã hóa Proline chuyển thành

TCT mã hóa Serine (Hình 5). Tính đa hình đơn

SNPs trên một số vùng gen chức năng khác của

loài giun móc cũng đã được nghiên cứu như

beta-tubulin gen mã hóa protein beta-tubulin,

một loại protein quan trọng tham gia vào quá

trình phân chia tế bào. Cơ chế của các loại thuốc

tẩy giun phổ biến như albendazole hay

mebendazole là kìm hãm quá trình hình thành

thoi vô sắc từ beta-tubulin trong thời kỳ phân

bào, do vậy tiêu diệt được giun móc (Kwa et al.,

1993; Kwa et al., 1994). Tuy nhiên, các đột biến

điểm ở vị trí F167Y hoặc F200Y trên vùng gen

mã hóa beta-tubulin trên loài giun móc Necator

americanus được xác định là marker chỉ thị cho

sự kháng thuốc tẩy giun. Sự tồn tại những đột

biến điểm này trong kiểu gen của giun móc đã

được ghi nhận ở Ghana (Ambrose et al., 2018),

Bzazil (Furtado et al., 2014) và Kenya (Diawara

et al., 2013). Một nghiên cứu của Barry et al.

(2006) về phân tích tính đa dạng trong kiểu gen

mã hóa enzyme aspartyl protease của ký sinh

trùng sốt rét Plasmodium falciparum cũng đã

chỉ ra nhiều điểm SNPs trên bề mặt cấu trúc

của protein này và có thể liên quan đến sự thay

đổi vai trò đặc tính của enzyme. Thí nghiệm

trên chuột cho thấy kháng thể kháng enzyme

aspartyl protease có thể làm giảm 16-26% số

lượng ấu trùng L3 xâm nhập và di hành qua da

chuột (Williamson et al., 2003b). Theo Loukas et

al. (2005), vacxin chế tạo từ protein aspatyl

protease tái tổ hợp sử dụng thử nghiệm đã làm

giảm số lượng giun móc trong ruột chó và giảm

số lượng trứng bài thải ra môi trường so với

nhóm đối chứng, đồng thời làm giảm mất máu

và các biến đổi bệnh tích ở ruột của chó. Tuy

nhiên, những nghiên cứu trong và ngoài nước về

tính đa hình trong kiểu gen cathepsin D

aspartic protease của giun móc, về đột biến

điểm liên quan đến sự thay đổi cấu trúc và chức

năng của loại enzyme đó, về ảnh hưởng của sự

thay đổi này đến hiệu quả của vacxin phòng

bệnh còn rất hạn chế.

Ghi chú: M: thang chuẩn DNA

Hình 2. Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân phân đoạn gen mã hóa enzyme aspartyl protease

của A. ceylanicum trên gel Agarose 1,5%

Bảng 1. Số lượng đột biến điểm (SNPs), đột biến điểm đồng nghĩa

và đột biến điểm không đồng nghĩa phát hiện trên vùng Exon 7, Exon 8 và Exon 9

của phân đoạn gen mã hóa enzyme aspartyl protease của A. ceylanicum

Exon 7 Exon 8 Exon 9

SNPs: 7 11 4

Đột biến điểm đồng nghĩa (synonymous SNPs) 6 11 2

Đột biến điểm không đồng nghĩa (non-synonymous SNPs) 1 2

Dương Đức Hiếu, Bùi Khánh Linh, Nguyễn Thu Hương, Lê Đức Vĩnh, Nguyễn Thị Hoàng Yến, Nguyễn Thị Hồng Chiên, Nguyễn Văn Phương

201

Hình 3. Hình ảnh khuẩn lạc của E. coli DH5α sau khi nuôi cấy trên thạch LB chứa

Amplicilin và X-Gal (A) và kết quả Colony PCR (B). M: thang chuẩn DNA

Ghi chú: A - Trình tự phân đoạn gen enzyme aspartyl protease của A. ceylanicum không chứa đột biến điểm

tại vùng Exon 7, B - Trình tự phân đoạn gen enzyme aspartyl protease của A. ceylanicum xảy ra đột biến điểm

tại vùng Exon 7

Hình 4. Vị trí đột biến điểm không đồng nghĩa tại vùng Exon 7 của phân đoạn gen mã hóa

enzyme aspartyl protease của A. ceylanicum phân lập tại Việt Nam sau khi so sánh với

trình tự gen (JARK01001578.1; AY181028.1) và protein (AAO22152.1) tham khảo từ NCBI

4. KẾT LUẬN

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác

định sự tồn tại của loài giun móc truyền lây

A. ceylanicum trên cả hai đối tượng vật chủ là

người và chó ở Việt Nam dựa trên kết quả KOD-

PCR nhân phân đoạn gen ty thể mt cox1. Căn

cứ vào kết quả phân tích trình tự phân đoạn gen

mã hóa cathepsin D aspartic protease của loài

A. ceylanicum, một trong những enzyme quan

trọng trong quá trình thủy phân hemoglobulin

và các loại protein trong đường tiêu hóa của

giun móc, tính đa hình đơn nucleotide được

phân tích và xác định được 3 điểm SNPs không

đồng nghĩa làm thay đổi trình tự axitamin của

enzyme thủy phân này tại vùng Exon 7 và Exon

9, cụ thể ở các vị trí ACA811ATA Thr265IIE,

CTC1030CCC Leu338Pro và CCT1036TCT

Pro340Ser căn cứ theo trình tự tham khảo

AY181028.1 và AAO22152.1 từ NCBI.

Tính đa hình đơn nucleotide trong phân đoạn gen mã hóa enzyme cathepsin D aspartic protease của loài giun móc truyền lây Ancylostoma ceylanicum

202

Ghi chú: A - Trình tự phân đoạn gen enzyme aspartyl protease của A. ceylanicum không chứa đột biến điểm

tại vùng Exon 9, B - Trình tự phân đoạn gen enzyme aspartyl protease của A. ceylanicum xảy ra đột biến điểm

tại vùng Exon 9

Hình 5. Các vị trí đột biến điểm không đồng nghĩa tại vùng Exon 9 của phân đoạn gen mã

hóa enzyme aspartyl protease của A. ceylanicum phân lập tại Việt Nam sau khi so sánh với

trình tự gen (JARK01001578.1; AY181028.1) và protein (AAO22152.1) tham khảo từ NCBI

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Ambrose R.O., Josephine E.Q., Peter S., Santosh G., Lisa M.H., Fabio P.D., Benjamin E., Adalgisa C., Debbie H., Michael D.W. & Michael C. (2018). Genetic markers of benzimidazole resistance among human hookworms (Necator americanus) in Kintampo North Municipality, Ghana. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. https://doi.org/10.4269/ajtmh.18-0727.

Barry A.E., Leliwa-Sytek A., Man K., Kasper J.M., Hartl D.L. & Day K.P. (2006). Variable SNP density in aspartyl-protease genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Gene. 376(2): 163-173.

Brown A., Girod N., Billett E.E. & Pritchard D.I. (1999). Necator americanus (human hookworm) aspartyl proteinases and digestion of skin macromolecules during skin penetration. Am J Trop Med Hyg. 60: 840-847.

Bowman D.D., Georgi J.R. & Saunders. (2009). Georgis’ Parasitology for Veterinarians. 10th ed., Elsevier.

Conlan J.V., Khamlome B., Vongxay K., Elliot A., Pallant L., Sripa B., Blacksell S.D., Fenwick S. & Thompson R.C. (2012). Soil-transmitted helminthiasis in Laos: a community-wide cross-sectional study of humans and dogs in a mass drug administration environment. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 86: 624-34.

Dương Đức Hiếu, Bùi Khánh Linh, Nguyễn Thu Hương, Lê Đức Vĩnh, Nguyễn Thị Hoàng Yến, Nguyễn Thị Hồng Chiên, Nguyễn Văn Phương

203

Diawara A., Halpenny C.M., Churcher T.S., Mwandawiro C., Kihara J., Kaplan R.M., Streit T.G., Idaghdour Y., Scott M.E., Basáñez M.G. & Prichard R.K. (2013). Association between response to albendazole treatment and β-tubulin genotype frequencies in soil-transmitted helminthes. PLOS Neglected Tropical Diseases. 7(5): 2247.

Dinh N.N., Sze F.H., Van-Anh T.N., Trong V.N., Dien V.N. & Rebecca J.T. (2015). Re-evaluation of the species of hookworms infecting dogs in Central Vietnam. Parasites & Vectors. 8: 401.

Duong D. H., Bui K. L., Nguyen T. H., Tran T. D., Eiji N., Haruhiko M., Ayako Y. & Nariaki N. (2018). Phylogenetic relationship between Ancylostoma ceylanicum populations found in dogs and humans in Vietnam. Vietnam Journal of Infectious Diseases. 6: 53.

Furtado L. F., Bello A.C., Dos Santos H.A., Carvalho M.R., Rabelo E.M. (2014). First identification of the F200Y SNP in the β-tubulin gene linked to benzimidazole resistance in Ancylostoma caninum? Veterinary Parasitology. 206 (3-4): 313-316.

Hotez P.J., Brooker S., Bethony J.M., Bottazzi M.E., Loukas A. & Xiao S. (2004). Hookworm infection, The New England Journal of Medicine. 351: 799-807.

Inpankaew T., Schar F., Dalsgaard A., Khieu V., Chimnoi W., Chhoun C., Sok D., Marti H., Muth S., Odermatt P. & Traub R.J. (2014). High prevalence of Ancylostoma ceylanicum hookworm infections in humans, Cambodia. Emerging Infectious Diseases. 20: 976-82.

Jolodar A., Fischer P., Buttner D.W., Miller D.J., Schmetz C. & Brattig N.W. (2004). Onchocerca volvulus: expression and immunolocalization of a nematode cathepsin D-like lysosomal aspartic protease. Experimental Parasitology. 107: 145-156.

Kwa M.S., Kooyman F.N., Boersema J.H. & Roos M.H. (1993). Effect of selection for benzimidazole resistance in Haemonchus contortus on beta-tubulin isotype 1 and isotype 2 genes Biochemical and Biophysical Research Communications. 191: 413-419.

Kwa M.S., Veenstra J.G. & Roos M.H. (1994). Benzimidazole resistance in Haemonchus contortus is correlated with a conserved mutation at amino acid 200 in beta-tubulin isotype 1. Molecular and Biochemical Parasitology. 63: 299-303.

Loukas A., Bethony J.M., Mendez S., Fujiwara R.T., Goud G.N., Ranjit N., Zhan B., Jones K., Bottazzi M.E. & Hotez P.J. (2005). Vaccination with recombinant aspartic hemoglobinase reduces parasite load and blood loss after hookworm infection in dogs. PLOS Medicine. 2: 295.

Ngui R., Lim Y.A., Traub R., Mahmud R. & Mistam M.S. (2012a). Epidemiological and genetic data supporting the transmission of Ancylostoma ceylanicum among human and domestic animals. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6: 1522.

Ngui R., Ching L.S., Kai T.T., Roslan M.A., Lim Y.A. (2012b). Molecular identification of human hookworm infections in economically disadvantaged communities in Peninsular Malaysia. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 86: 837-42.

Traub R.J., Inpankaew T., Sutthikornchai C., Sukthana Y. & Thompson R.C. (2008). PCR-based coprodiagnostic tools reveal dogs as reservoirs of zoonotic ancylostomiasis caused by Ancylostoma ceylanicum in temple communities in Bangkok. Veterinary Parasitology. 155: 67-73.

Williamson A.L., Brindley P.J., Abbenante G., Prociv P., Berry C., Girdwood K., Pritchard D.I., Fairlie D.P., Hotez P.J., Dalton J.P. & Loukas A. (2002). Cleavage of hemoglobin by hookworm cathepsin D aspartic proteases and its potential contribution to host specificity. The FASEB Journal. 16: 1458-1460.

Williamson A.L., Brindley P.J., Abbenante G., Datu B.J., Prociv P., Berry C., Girdwood K., Pritchard D.I, Fairlie D.P., Hotez P.J., Zhan B. & Loukas A. (2003a). Hookworm aspartic protease, Na-APR-2, cleaves human hemoglobin and serum proteins in a host-specific fashionThe Journal of Infectious Diseases. 187: 484-494.

Williamson A.L., Brindley P.J. & Loukas A. (2003b). Hookworm cathepsin D aspartic proteases: contributing roles in the host-specific degradation of serum proteins and skin macromolecules. Parasitology. 126: 179-185.

Williamson A. L., Paolo Lecchi, Bejamin E.T, Youngchol C., Peter J.H., James H.K, Lewwis C.K., Mohammed S., Charles S.C. & Alex L. (2004). A multi-enzyme cascade of hemoglobin proteolysis in the intestine of blood-feeding hookworms. Journal of Biological Chemistry. 279: 35950-35957.