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Toxicidad de Efavirenz y Toxicidad de Efavirenz y Lopinavir/r sobre los adipocitosLopinavir/r sobre los adipocitos
Pere DomingoPere DomingoUnidad de Enfermedades InfecciosasUnidad de Enfermedades InfecciosasHospital de la Santa creu i Sant PauHospital de la Santa creu i Sant PauUniversitat Autònoma de BarcelonaUniversitat Autònoma de [email protected]@santpau.cat
Pere DomingoPere DomingoUnidad de Enfermedades InfecciosasUnidad de Enfermedades InfecciosasHospital de la Santa creu i Sant PauHospital de la Santa creu i Sant PauUniversitat Autònoma de BarcelonaUniversitat Autònoma de [email protected]@santpau.cat
Contenido
•Implicaciones,consecuencias y visibilidad de la lipoatrofia
•Fármacos y lipoatrofia (EFV vs. LPV/r)
•Mecanismos patogénicos en la lipoatrofia
•El papel de la mitocondria
•EFV, LPV/r y adipocitos in vitro
•EFV, LPV/r y adipocitos ex vivo
33
Implicaciones de la lipoatrofia
• Calidad de vida
• Efectos psicológicos– Baja autoestima– Disminución de la autoconfianza– Ansiedad y depresión
• Efectos sociales– Daño en la calidad de la relaciones
sociales– Alienación social– Dificultad para encontrar ropa adecuada
• Efectos físicos (ej, dolor al sentarse)
• Disfunción sexual
• Descenso de la adherencia
O’Donovan CA et al, 7th IWADRL Nov 2005, Dublin, #34; James J et al, Dermatol Surg 2002; 28:979-986Santos CP et al, AIDS 2005;19(S4):S14-S21; Reynolds NR et al, AIDS Care Oct 2006; 18(7):663-73
44
33 3.14 3.55 3.66
Todos los estudios, principalmente hombres
2.682.77
9.11
7.11 7.22
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Estudios en VIH,Controles sanos voluntarios*
Adultos VIH+, Lipoatrofia clinicamente evidente al
comienzo*
Gra
sa e
n l
as e
xtre
mid
ades
(kg
)
*Todos los estudios utilizaron DEXA para medir la grasa.1. Engelson ES et al. Am J Clin Nutr. 1999;69:1162–1169; 2. Carr A et al. AIDS. 1998;12:F51–F58; 3. Moyle G et al. CROI 2005. Abstract 44LB; 4. McComsey GA et al, Clin Infect Dis. 2004;38:263–270; 5. Martin A et al. AIDS. 2004;18:1029–1036; 6. Milinkovic A et al. Antivir Ther. 2007;12:407–415; 7. Carr A et al. Lancet. 2004;363:429–438; 8. Slama L. Antivir Ther. 2007,in press.
La lipoatrofia se hace clínicamente evidente después de perder el 40%-50% de la grasa en la extremides
Mujer Hombre Hombre
55
Mínima ganancia en la grasa en las extremidades 48 semanas después del cambio de los NRTI
Importancia del diagnóstico temprano: La lipoatrofia es difícil de revertir
• Otros estudios dieron resultados similares
1. Engelson ES et al. Am J Clin Nutr. 1999;69:1162–1169; 2. Moyle GJ et al. AIDS. 2006;20:2043–2050;3. Carr A et al. AIDS. 1998;12:F51–F58.
Lim
b f
at (
kg)
3.412.95
8.1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Normal 1 Pacientes lipoatróficos al comienzo 2
Pacientes tras el cambio de análogos 2
6
EFVLPV/r
-5
-10
-15
0
5
10
15
20
48 960 Weeks
Ca
mb
io %
de
la
med
ian
a d
esd
e la
ba
sal
ACTG 5142 Grasa en las extremidades
LPV/r + EFV
+18
+9.8
+1.4
.013
.007
<.001
P Value
EFV 188 171LPV/r 191 166LPV/r + EFV 197 173
ACTG 5142: Efecto diferente de LPV/r y EFV sobre la grasa periférica: LPV/r < EFV
Haubrich R et al. 14th CROI 2007; Los Angeles. Abstract #38.
7
ACTG 5142: La prevalencia de lipoatrofia fue menor con Kaletra que con EFV
0%0%
17%
0%
9%
32%
21%
10%
7%0%
10%
20%
30%
40%
50%
Basal 48 semanas 96 semanas% d
e p
ac
ien
tes
co
n li
po
atr
rofi
a (
>2
0%
p
érd
ida
de
gra
sa
pe
rifé
ric
a)
EFV+2 ITIAN LPV/r +2 ITIAN LPV/r+EFV
EFV 188 171LPV/r 191 166LPV/r + EFV 197 173
Valores de P a 96s LPV/EFV vs LPV: 0,023LPV/EFV vs EFV: <0,001LPV vs EFV: 0,003
Haubrich R et al. Haubrich R et al. AIDS. 2009 Jun 1;23(9):1109-18AIDS. 2009 Jun 1;23(9):1109-18 ..
Evolución de la lipoatrofia (> 20% de pérdida de grasa en las extremidades)
8
ACTG 5142. La prevalencia de lipoatrofia fue menor con LPV/r que con EFV independientemente de los análogos utilizados
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
d4T AZT TDF
EFV
Kaletra
51%n=4
1
33%n=43
16%n=73 12%
n=676%
n=50
40%n=63
Haubrich R et al. Haubrich R et al. AIDS. 2009 Jun 1;23(9):1109-18AIDS. 2009 Jun 1;23(9):1109-18 ..
Porcentaje de pacientes con lipoatrofia por subgrupos, semana 96
9
ACTG 5142. La prevalencia de lipoatrofia fue menor con LPV/r que con EFV independientemente de la definición de lipoatrofia elegida
0
10
20
30
40
50
>10% >20% >30% >40%
EFV Kaletra
% p
acie
nte
s
32%28%
40%
17%20%
10%13%
4%
p=0,0027 p=0,0004 p=0,0016 p=0,0008
Haubrich R et al. Haubrich R et al. AIDS. 2009 Jun 1;23(9):1109-18AIDS. 2009 Jun 1;23(9):1109-18 ..
10
Estudio transversal alemán. Resultados: Características de los pacientes
LPV/r EFV
Nº de pacientes 139 165
Edad en años 44.7 45.6
Duración media del tratamiento [años]
3.4 3.6
Adeherencia autoreferedia [%] > 95 > 95
El 45% estabán tomando TDF, 28% AZT/3TC y 12% ABC/3TC
Alta concordancia entre las opiniones de los pacientes y de los médicos
Van Lunzen J et al. IAS Ciudad del Cabo Jul Van Lunzen J et al. IAS Ciudad del Cabo Jul 2009 #CDB111 2009 #CDB111
11
Estudio transversal alemán. El porcentaje de pacientes que reportan haber pérdido grasa en las piernas fue menor con Kaletra que con EFV
21
32
0
10
20
30
40
50
Kaletra EFV
p < 0,05
% p
acie
ntes
que
rep
orta
n pé
rdid
a de
gra
s en
las
pier
nas
El 79 % de los pacientes tratados con Kaletra no reportó signos de pérdida de grasa en las piernas frente a sólo 68% entre los tratados con EFV.
Van Lunzen J et al. IAS Ciudad del Cabo Jul Van Lunzen J et al. IAS Ciudad del Cabo Jul 2009 #CDB111 2009 #CDB111
13
Estudio transversal alemán. Entre los tratados con TDF/3TC o FTC también hubo menos pacientes que notaron pérdida de grasa en las piernas en el grupo de Kaletra que en el de EFV
10
22
0
10
20
30
40
50
Kaletra EFV
p < 0,05
% p
acie
ntes
que
rep
orta
n pé
rdid
a de
gra
s en
las
pier
nas
Van Lunzen J et al. IAS Ciudad del Cabo Jul Van Lunzen J et al. IAS Ciudad del Cabo Jul 2009 #CDB111 2009 #CDB111
1414
Causas de la lipoatrofia
Virus VIH
PacientePacienteGenética/AmbienteGenética/Ambiente
Lipoatrofia
HAART
15
Mecanismos fisiopatológicos de la lipodistrofia a nivel celular
• Disfunción mitocondrial• Proliferación mitocondrial y
morfología alterada2
• Ciclo celular y diferenciación adipocitaria alterada• Descenso del tamaño de los
adipocitos1-3
• Apoptosis aumentada4
• Sustitución de los adipocitos por tejido fibrosos3
• Mediadores proinflamatorios• Infiltración de macrófagos2,3
• Expresión de IL-6 y TNF - aumentada3
X 400
Control1
X 200
PatientAumento del número de adipocitos pequeños1
Patient
X 400
Incremento del número de macrófagos3
1. Bastard JP, et al. Lancet 2002: 359: 1028-312. Nolan D, et al. AIDS 2003; 17: 121-33. Jan V, et al. Antivir Ther 2004; 9: 555-644. Domingo P, et al. AIDS 1999; 13: 2261-7
16
Investigación para esclarecer el papel de Kaletra en la lipoatrofia
Mitocondria Adipocito Individuo
•Estudio 613 •ACTG 5142 •Dr. van Lunzen
•Dr. Esplugues •Dr. Domingo
T. Adiposo
Dr. A. CarrDr. Domingo
1717
Estructura mitocondrial • AND mitocondrial (mtDNA)
– 16 kb, 2-10 copias/mitocondria en la matriz
– La replicación está controlada por genes mitocondriales• La DNA polymerasa-γ mitocondrial es la
enzima requerida para la replicación del mtDNA
• La inhibición de la mtDNA polymerasa-γ conduce a la depleción del mtDNA
– Transcripción – proteínas mitocondriales• Polimerasa del RNA (mtRNA) y factores de
transcripción
• La apoptosis es parte del proceso natural celular y se incrementa durante la disfunción mitocondrial
• En el contexto de la disfunción mitocondrial– Se incrementa la apoptosis celular– Puede aparecer hiperlactatemia
Mitocondria. Estructura interna
HIV
Membrana interna
Membrana externa
Cristae
Matriz
Adipocito TEM
Chan DC, Cell June 2006; 125;7:1241-1252 McBride HM, Current Biology July 2006;16:R551-R560
1818
1. Kakuda TN. Clin Ther. 2000;22(6):685–708; 2. Birkus G et al. Antimicrob Agents Chemother. 2002;46:716–723.
Toxicida inducida por los análogos: Toxicida inducida por los análogos: Inhibición de la Inhibición de la mtDNA Polymerasa-γ
• Metodos2
• Células humanas tratadas con NRTIs
• Southern blot para cuantificar mtDNA
Los ensayos enzimáticos con NRTIs demuestran la inhibición de la
mtDNA polymerasa- 1,2: zalcitabina (ddC) > didanosina (ddI) > stavudina > zidovudina (ZDV) > lamivudina = abacavir = tenofovir
• Resultados• El grado de inhibición de la DNA
polymerase- inhibition varia con los NRTI
• Algunos NRTIs inhiben la mtDNA polymerasa-
19
Disfunción mitocondrial y apoptosis
Reactive oxygen speciesMPTP
Disfunción cadena respiratoria
Depleción DNAmt, ...
21
Inhibición aguda de la respiración mitocondrial por EFV
100 (μM)6 8 10 12 14 16 18 20
0
50
100
ControlEFV 25uM
Tiempo (min)
Co
nce
ntr
aci
ón
de
oxíg
eno
(M
)
Time (min)
Ox
yg
en
co
nc
en
tra
tio
n
0
20
40
60
80
100
%
**
***
*** *** ***
5 10 15 25 50 100
Efects of EFV (M) on respiration rate
Blas-García A, et al. 15th CROI. Boston, 2008 #984Blas-García A, et al. 15th CROI. Boston, 2008 #984
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
%
MetOHATV RTV LPV
5050 2525 1616 MMMM
Data not shownData not shown
** P< 0.01*** P< 0.001
** P< 0.01*** P< 0.001
% o
f c
on
tro
l%
of
co
ntr
ol
% o
f c
on
tro
l%
of
co
ntr
ol
22
Fig.3
Intracellular ATP levels
0
2
4
6
8
10
12
14
16
ATP
(nm
ol/m
g pr
otein
)
Control EFV10
EFV25
*
**
EFV50 µM
La inhibición de la función mitocondrial resulta en una reducción dosis dependiente del ATP intracelular
Blas-García A, et al. 15th CROI. Boston, 2008 #984Blas-García A, et al. 15th CROI. Boston, 2008 #984
23
FA ligand activated transcription factors
Preadipocyte
PPARγ C/EBPα
Organelle reconstitution
Stem cell mitosis
PPARδC/EBPβ/δSREBP1/ADD1
Adipoblast
mitosis
E2F, pRbp130/p107
Matureadipocyte
Immatureadipocyte
Lipogenic gene induction
LPL, HSL, aP2, perilipin DGAT, GLUT4
TG storage
TNF-α
TNF-α
Adipocyte differentiation: a highly regulated process
Gregoire FM, Physiological Reviews July 1998; 78(3):783-809Gregoire FM, Physiological Reviews July 1998; 78(3):783-809
2424
PPAR- gene expression relative to ACTB housekeeping gene at baseline and at 2 weeks of ZDV/3TC or d4T/3TC twice-daily in adipocytes
COX-1 gene expression relative to ACTB housekeeping gene at 6 weeks of ZDV/3TC or d4T/3TC twice-daily in monocytes
• 20 HIV- volunteers received dual NRTI therapy for 6 weeks (ZDV/3TC or d4T/3TC )
• In the absence of mtDNA depletion, thymidine analogue NRTIs down-regulate:
– Adipocyte differentiation factors (nuclear transcription factor PPAR-)
– Transcription of mitochondrial chain respiratory subunits (COX-1, Cox-2, and Cyt b)
• Negative regulatory effects impede adipogenesis and respiratory chain complexes (eg. Complex IV via COX1 inhibition)
• NRTI effects on peripheral mononuclear blood cells suggest a possible role in other tissues
Mallon PW et al. J Infect Dis. 2005;191:1686–1696.
Mechanisms of NRTI-Induced Mitochondrial Toxicity
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0.0
P = 0.003
PP
AR
-γ :
AC
TB
1.8
CO
X1
: A
CT
B
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
P = 0.01P = 0.005
0Baseline Week 6 Week 12 Follow up*
* Median = 66 weeks
Baseline Week 2
25
Effect of EFV and LPV/r on differentiating
adipocytes
Control(No drug)
0.5 μM 2 μM 4 μM
Massive cell death - no
image available
10 μM
0.5 μM 2 μM 4 μM 10 μM
EFAVIRENZ
KALETRA
Diaz-Delfín J, et al. 10th IWADRL. London, 2008 #P-01Diaz-Delfín J, et al. 10th IWADRL. London, 2008 #P-01
Control(No drug)
EFAVIRENZ
KALETRA
2 μM 4 μM 20 μM
2 μM 4 μM 20 μM
Effect of EFV and LPV/r on mature
adipocytes
26
Effect of EFV and LPV/r on gene expression
0.5 2 4 0.5 4 20 40EFV (μmol/l) LPV/r (μmol/l)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
***
***
* **
#
#
Control 10
Adipogenesis (PPARγ)Adipogenesis (PPARγ)L
og
mtD
NA
co
py
nu
mb
er
Lo
g m
tDN
A c
op
y n
um
be
r
0.5 2 4 0.5 2 4 10
Lo
g m
tDN
A c
op
y n
um
be
r
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
ControlLPV/r (μmol/l)EFV (μmol/l)
10
Mitochondrial DNAMitochondrial DNA
*P<0.05, **P<0.01, ***P< 0.001 vs. control, # EFV vs. LPV/r*P<0.05, **P<0.01, ***P< 0.001 vs. control, # EFV vs. LPV/r
Diaz-Delfín J, et al. 10th IWADRL. London, 2008 #P-01Diaz-Delfín J, et al. 10th IWADRL. London, 2008 #P-01
27
EFV increases pro-inflammatory cytokines and reduces adiponectin c/w LPV/r in human adipose cellsEFV:
4 µM - increase in levels of MCP-1 (5.3-fold), IL-5 (4.2-fold), IL-8 (18.7-fold), PAI-1 (5.7-fold) and HGF (5.5-fold)
Significant reduction of adiponectin and leptin (17% and 19% of levels vs controls respectively)
LPV/r:
No induction of MCP-1, IL-8 and PAI-I
Minor but significant reduction in release of adiponectin and leptin (71% and 76% of levels vs controls, respectively)
HGF and IL-6 were induced to a similar extent in response to LPV/r and to EFV
mRNA:
Adiponectin mRNA significantly decreased with [EFV] ≥2 µM and [LPV/r] ≥ 4 µM (EFV inhibition of mRNA significantly worse).
Leptin mRNA significantly decreased with [EFV] ≥2 µM and [LPV/r] ≥ 10 µM
Conclusions:
In human adipocytes in culture, EFV causes a higher release of pro-inflammatory cytokines and a more profound impairment in the release of adiponectin compared to LPV/r.
Domingo P et al, 5th IAS 2009, #TUPEB167
28
Efectos ex vivo de los fármacos antiretrovirales
0
20
40
60
80
100
120
140
NaiveNaive TRU+EFVTRU+EFV
P = NSP = NS
-20
0
20
40
60
80
100
120
NaiveNaive TRU-KALTRU-KAL
P = NSP = NS
AdiponectinaAdiponectina
MCP-1MCP-1
0
5
10
15
20
25
30
NaiveNaive TRU+EFVTRU+EFV
P = NSP = NS
0
5
10
15
20
25
30
35
40
NaiveNaive TRU+KAL
29
Efectos ex vivo de los fármacos antiretrovirales
0
1
2
3
4
5
6
7
8
NaiveNaive TRU+EFVTRU+EFV
P = NSP = NS
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
NaiveNaive TRU+KALTRU+KAL
P = NSP = NS
PPARPPARPPARPPAR
TNFTNFTNFTNF
-2
0
2
4
6
8
10
12
NaiveNaive TRU+EFVTRU+EFV
P = NSP = NS
0
,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
NaiveNaive TRU+KALTRU+KAL
P = NSP = NS
30
Efectos ex vivo de los fármacos antiretrovirales
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
NaiveNaive TRU+EFVTRU+EFV
P = 0,04P = 0,04P = 0,04P = 0,04
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
NaiveNaive TRU+KALTRU+KAL
P = 0,008P = 0,008P = 0,008P = 0,008
Cyt BCyt BCyt BCyt B
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
NaiveNaive TRU+KALTRU+KAL
ADNmtADNmtADNmtADNmt
1200
1400
1600
1800
2000
2200
2400
2600
2800
3000
NaiveNaive TRU+EFVTRU+EFV
31
HIV Infection Contributes to Lipodystrophy HIV Infection Contributes to Lipodystrophy Through Alteration of Gene Expression in Through Alteration of Gene Expression in
Adipose TissueAdipose Tissue
Giralt M et al. Antivir Ther. 2006;11:729–740.
• Compared to HIV-negative controls, ARV-naïve HIV-positive patients had significant
• Decreases in mRNA of COX-2, COX-4, UCP2, C/EBP-, PPAR-γ, GLUT4, LPL, leptin, and adiponectin
• Increases in PGC-1, TNF, and -2 microglobulin
PPAR- mRNA/18SrRNA (x10-4)
COX-2 mRNA/18SrRNA (x10-2)
P<0.0001P=0.0002
P<0.0001
P=0.018
P=0.045
1.5
1.0
0.5
0
TNF- mRNA/18SrRNA (x10-6)
P=0.0004
P=0.00015
2
1
0
3
4P=0.051
P=0.027
P=0.023
P=0.046
P=0.001 P=0.001
Control Naïve LDNon-LD Control Naïve LDNon-LD Control Naïve LDNon-LD
32
EFVLPV/r
-5
-10
-15
0
5
10
15
20
48 960 Weeks
Ca
mb
io %
de
la
med
ian
a d
esd
e la
ba
sal
ACTG 5142 Grasa en las extremidades
LPV/r + EFV
+18
+9.8
+1.4
.013
.007
<.001
P Value
EFV 188 171LPV/r 191 166LPV/r + EFV 197 173
ACTG 5142: Efecto diferente de LPV/r y EFV sobre la grasa periférica: LPV/r < EFV
Haubrich R et al. 14th CROI 2007; Los Angeles. Abstract #38.
33
La toxicidad grasa es bifásica
TiempoTiempoTiempoTiempo
TARcTARcTARcTARc
Gra
sa
su
bcu
tán
eaG
ras
a s
ub
cutá
nea
Gra
sa
su
bcu
tán
eaG
ras
a s
ub
cutá
nea
34
Conclusiones
• Tres factores implicados en la LD– Virus– Huésped– Fármacos
• La patogenia de la lipodistrofia es multifactorial– Mitocondria– Diferenciación – Inflamación
• EFV es más tóxico que LPV/r in vitro.
• A 48 semanas dicha toxicidad no es apreciable ex vivo.
• El curso de la LD es bifásico
35
Agradecimientos
• Hospital de la Santa Creu i Sant Pau
• Mª del Mar Gutierrez
• Mª Gracia Mateo
• Mª Antonia Sambeat
• Angels Fontanet
• Jessica Muñoz
• Jessica Martínez
Biologia U.B.Biologia U.B.
Francesc VillarroyaFrancesc Villarroya
Marta GiraltMarta Giralt
Joan C. DomingoJoan C. Domingo
Julieta DíazJulieta Díaz