Confirmacin molecular para las especies del Complejo Albitarsis (Diptera: Culicidae) de Puerto Carreo,

Vichada, Colombia y evaluacin de la cpula forzada en condiciones de laboratorio para

Anopheles albimanus de Buenaventura, Valle del Cauca, Colombia.

Diana Carolina Surez

Universidad Nacional de Colombia Ciencias, Biologa Bogot, Colombia

2011

Confirmacin molecular para las especies del Complejo Albitarsis (Diptera: Culicidae) de Puerto Carreo,

Vichada, Colombia y evaluacin de la cpula forzada en condiciones de laboratorio para Anopheles albimanus de

Buenaventura, Valle del Cauca, Colombia.

Diana Carolina Surez

Trabajo de investigacin presentado como requisito parcial para optar al ttulo de: Biloga

Directora: Ph.D. Helena Luisa Margarita Brochero

Profesora Asociada, Facultad de Agronoma

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Departamento de Biologa

Bogot, Colombia 2011

Me repugna tanto gobernar como ser gobernado; cada hombre debe ser su camino; ni sigo a nadie ni quiero que nadie me siga.

Bifilo Panclasta

Agradecimientos A la profesora Helena Brochero por su asesora cientfica y por la revisin crtica de este proyecto.

A los compaeros del rea de Gentica de insectos y Entomologa Molecular de la Facultad de Agronoma de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogot: Pilar Jimnez y Sebastin Durn por realizar las colectas en campo, la determinacin con base en caracteres morfolgicos y las pruebas de ELISA cuyos resultados fueron indispensables para el desarrollo de este trabajo.

Al personal del Laboratorio de Biotecnologa Antonio Angarita Zerda, del Laboratorio de Entomologa Molecular, Facultad de Agronoma y del Laboratorio de Biologa Molecular, Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogot por permitir el uso de las instalaciones y equipos.

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Resumen Se realiz extraccin de ADN de 206 individuos silvestres pertenecientes al complejo Albitarsis de Puerto Carreo, Vichada, Colombia y se sometieron a una reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el gen white y confirmar sus identidades taxonmicas. La especie ms abundante correspondi a Anopheles marajoara ss Galvo & Damasceno 1840 para todos los meses muestreados. Se confirm el registro de Anopheles albitarsis F, Brochero 2007 para esta zona del pas. La confirmacin taxonmica permiti asociar la abundancia y riqueza de especies para cada sitio de muestreo, as como las caractersticas biolgicas de actividad de picadura, infeccin natural por parsitos Plasmodium que afectan a humanos y sitios de cra para cada entidad biolgica. Aunque se pueden discriminar estas especies usando caracteres moleculares se desconoce si en la naturaleza An marajoara ss y An albitarsis F son entidades evolutivas diferentes, por lo que se requiere la estandarizacin de un protocolo para realizar cpula forzada que permita aproximar el estatus biolgico de especie de estos organismos con base en los postulados de la regla de Haldane. Para ello se utilizaron ejemplares de una colonia de An. albimanus Wiedemman 1840 (Diptera: Culicidae) de Buenaventura, Valle del Cauca, Colombia. Se establecieron procesos para separacin de pupas, mantenimiento de adultos, cpula artificial modificando variables ambientales como temperatura, luz natural/artificial y se disecaron espermatecas de las hembras sometidas a inseminacin. Aunque no se obtuvo descendencia viable en ninguno de estos ensayos esta metodologa se constituye en una gua de los ensayos que deben hacerse cuando se realizan cruces dirigidos usando anofelinos silvestres para evaluar el aislamiento reproductivo que pueda existir entre los organismos estudiados.

Palabras clave: Malaria, Anopheles, Puerto Carreo, Colombia.

Abstract DNA was extracted from 206 wild individuals belonging to the Albitarsis complex from Puerto Carreo, Vichada, Colombia. DNA extracts of each mosquito were subjected to a PCR reaction to amplify the gene white in order to confirm their taxonomic identity. The most abundant species in all sampled months was Anopheles marajoara ss Galvo & Damasceno 1840. The record of Anopheles albitarsis F Brochero 2007 in this area was confirmed. Based on this taxonomic confirmation it was possible to associate species abundance and richness for each sampling site and the biological characteristics of biting activity, natural infection with Plasmodium parasites that affect humans, and breeding sites for each biological entity. Although An. marajoara ss and A. albitarsis F can be discriminated using molecular characters, it is unclear whether in nature are different evolutionary entities, for this reason it is necessary to standardize a protocol for forced mate, which is one of the

tools to approximate the biological status of species for these organisms, based on the postulates of Haldane's rule. To standardize the protocol, were used individuals of a colony of An. albimanus Wiedemman 1840 (Diptera: Culicidae) from Buenaventura, Valle del Cauca, Colombia. In this work it was established processes for the separation of pupae, adult maintenance, artificial copulation with changes in environmental variables such as temperature, daylight or artificial light, and dissected spermathecae of inseminated females. Although no viable progeny was obtained in any assay, this methodology provides a guide to the tests to be done when performing directed crosses with wild anopheline to assess the reproductive isolation that may exist between the organisms studied.

Keywords: Malaria, Anopheles, Puerto Carreo, Colombia.

XIII

Contenido Pg.

Resumen .................................................................................................................................... XI

Lista de figuras ........................................................................................................................ XIV

Lista de tablas ........................................................................................................................... XV

Introduccin ................................................................................................................................. 1

Mtodos ........................................................................................................................................ 7

Resultados .................................................................................................................................. 16

Discusin .................................................................................................................................... 23

Conclusiones .............................................................................................................................. 29

Fuentes de financiacin ............................................................................................................. 30

Bibliografa ................................................................................................................................. 31

XIV

Lista de figuras Pg.

Ilustracin 1. Ubicacin geogrfica de los barrios y criaderos. E: Barrio La Esperanza, F: Barrio La Florida, G: Barrio Gaitn, GR: Barrio Gabriel Robledo. P: Barrio La Primavera y SB: Barrio Simn Bolvar. ...................................................................................................................................................................... 7 Ilustracin 2. (Izq) Posicin de las terminalias para la cpula PA: Poro anal, Gc: Gonocoxito, Ge: Gonoestilo. (Der) Cpula. Fotografas de: Diana Carolina Surez, Cesil Solis (2011). ............................ 13 Ilustracin 3. Amplicones de algunas muestras sometidas al protocolo de extraccin con fenol:cloroformo. La flecha indica un producto de amplificacin no esperado de aproximadamente 750 pb. Fotografa de: Diana Carolina Surez (2011). ................................................................................... 16 Ilustracin 4. Abundancia en los criaderos muestreados para el 2009. ....................................................... 18 Ilustracin 5. Abundancia mensual en el ao 2009. Am: An. marajoara ss, Aa: An. albitarsis F. .............. 19 Ilustracin 6. Abundancia en las localidades muestreadas en 2009. E: Barrio La Esperanza, F: Barrio La Florida, G: Barrio Gaitn, GR: Barrio Gabriel Robledo. P: Barrio La Primavera y SB: Barrio Simn Bolvar. ................................................................................................................................................................... 19 Ilustracin 7. Abundancia en los ambientes intra- y peridomicilio. ............................................................. 19 Ilustracin 8. Abundancia por hora en el ao 2009. ...................................................................................... 20 Ilustracin 9. (Izq) Espermateca observada en campo claro. (Der) Espermateca observada en campo oscuro. Fotografa de: Diana Carolina Surez (2011). ................................................................................... 22 Ilustracin 10. (Izq) Espermateca observada en campo claro. (Der) Espermateca observada en campo oscuro. Fotografa de: Diana Carolina Surez (2011). ................................................................................... 22

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Lista de tablas Pg.

Tabla 1. Coordenadas geogrficas de las localidades muestreadas (Jimenez et al., 2011). ......................... 8 Tabla 2. Caracterizacin y coordenadas geogrficas de los criaderos muestreados y nmero de ejemplares An. marajoara sl para la confirmacin molecular en este estudio. ............................................... 9 Tabla 3. Protocolos de cpula forzada para anofelinos. ............................................................................... 12 Tabla 4. Estrategias metodolgicas para la evaluacin del aislamiento reproductivo (Pereira-Lima et al. 2004). ...................................................................................................................................................................... 14 Tabla 5. Diseccin de espermatecas y testculos para anofelinos (Methods in Anopheles Resarch, 2007). ................................................................................................................................................................................. 14 Tabla 6. Metodologas de cuidado de An. albimanus inmaduros en el laboratorio con las que se llevaron a cabo los ensayos para la evaluacin de la viabilidad. .................................................................... 15 Tabla 7. Determinacin taxonmica con base en el tamao de un fragmento de gen white amplificado de especmenes procesados con dos protocolos de extraccin de ADN. Am ss: An. marajoara ss, Aa F: An. albitarsis F, ND: No determinado, NA: Sin producto de amplificacin. .............................................. 16 Tabla 8. Variables de los ensayos de cpula forzada. #: Nmero de hembras, h: Edad en horas, A: Tiempo de alimentacin, AE: Acetato de etilo, E: Eter, H: Luz halgena, Am: Luz amarilla, C: Cpula, M: Muerte, D: Descendencia. ............................................................................................................................. 21 Tabla 9. Promedio y desviacin estndar de la cuantificacin de los estados del ciclo de vida de An. albimanus bajo dos metodologas de cuidado. MT: Metodologa tradicional, MS: Metodologa sugerida, H: Huevos, N: Nacimientos, P: Pupaciones, E: Emergencias, He: Hembras, Ma: Machos. ................... 22

Introduccin La malaria en Colombia y en Puerto Carreo, Vichada. El grupo de vigilancia y control de enfermedades transmisibles del Instituto Nacional de Salud (INS) (2010) reporta que cerca de 85% del territorio rural colombiano se encuentra por debajo de los 1.600 metros sobre el nivel del mar y presenta condiciones climticas, geogrficas y epidemiolgicas aptas para la transmisin de malaria, siendo la Costa Pacfica, el Valle del Ro Cauca y las regiones de Urab, Orinoqua y Amazona, las reas de mayor riesgo. Adems estiman que aproximadamente 25 millones de personas se encuentran en algn nivel de riesgo de enfermar o morir a causa de la enfermedad (Protocolo de vigilancia y control de malaria 2010). Para el ao 2009 se presentaron 21.727 casos de malaria por Plasmodium falciparum, 62.126 por Plasmodium vivax, 638 de malaria mixta y una mortalidad de 7 casos. En el 2010 se reportaron 32.664 casos de malaria por P. falciparum, 82.193 por P. vivax, 1.411 de malaria mixta y la mortalidad lleg a 23 casos. Hasta la semana 40 de 2011 se presentaron 12.361 casos por P. falciparum, 36.259 por P. vivax, 644 de malaria mixta, con una mortalidad de 16 casos (INS, Sivigila 2011). Estas cifras demuestran que la malaria es un problema de salud pblica en Colombia. Puerto Carreo es la capital del departamento de Vichada, Colombia, se encuentra ubicada en la confluencia de los ros Orinoco y Meta en la franja fronteriza con la Repblica Bolivariana de Venezuela entre los 6 11 0 Latitud Norte y 67 28 0 Longitud Oeste. Con una altitud de 51 msnm, registra una temperatura media anual de 28,5 C y una precipitacin media anual de 2.059 mm con un rgimen de lluvias monomodal que va de abril a noviembre y un periodo seco entre diciembre y marzo (Diccionario Geogrfico de Colombia, 1996). De acuerdo a la Alcalda Municipal, Pastoral y Social y a la Accin Social el municipio es un receptor de poblacin desplazada por la violencia (Plan Municipal de Salud Pblica 2008 - 2011). Tiene una poblacin de 12.897 habitantes (DANE 2005), de los cuales el 23 % viven en condiciones de miseria y el 85 % estn dentro de la poblacin con necesidades bsicas insatisfechas. Estas condiciones geogrficas y socio-ecolgicas aunadas a la presencia de mosquitos vectores de malaria y circulacin de los agentes causales en humanos determinan a Puerto Carreo como una zona endmica para malaria (Plan Municipal de Salud Pblica 2008 - 2011). Segn la Secretara de Salud Departamental el 49% de los casos en el municipio proceden del rea urbana. Brochero et al. (2007) plantean que la transmisin local rural y

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periurbana es ayudada por la migracin de personas infectadas y susceptibles, as mismo la explotacin intensiva del territorio permite la creacin de criaderos para los anofelinos. El complejo Anopheles Albitarsis En Colombia, hasta el 2001 se registraron 43 especies pertenecientes al gnero Anopheles (Olano et al. 2001), de stas An. darlingi, An. albimanus, An. nueztovari, pertenecen al subgnero Nyssorhynchus y se consideran vectores primarios de malaria mientras que An. neivai, An. lepidotus, An. pseudopunctipenis, An. punctimacula como vectores secundarios o auxiliares (Protocolo de vigilancia y control de malaria, 2010). Sin embargo, debido a las dificultades taxonmicas que presentan las hembras de este gnero, se cree que pueden existir otras especies participando como vectores oportunistas, locales o auxiliares de malaria como es el caso de Anopheles marajoara sensu lato en Colombia (Brochero & Quiones 2008). En este mismo sentido Brochero et al. 2010 encuentran para Colombia por lo menos dos acervos genticos para An. marajoara, uno de los cuales podra estar asociado con transmisin de parsitos del gnero Plasmodium que afectan a humanos. Los miembros del complejo Albitarsis tambin pertenecen al subgnero Nyssorhynchus y comprende por lo menos seis especies: An. albitarsis Lynch-Arribalzaga, An. oryzalimnetes n. sp. Wilkerson & Motoki, An. marajoara Galvo & Damasceno, An. deaneorum Rosa-Freitas, An. janconnae n. sp. Wilkerson & Sallum y An. albitarsis F Brochero. Las formas inmaduras y hembras de las especies del complejo son indistinguibles mediante caracteres morfolgicos con excepcin de An. deaneorum que puede ser discriminada en el cuarto estado de su estado larval por las setas anteriores del clpeo ramificadas (Rosa-Freitas 1989). De las especies del complejo Albitarsis, se han registrado para Colombia a An. marajoara ss (Herrera et al. 1987, Collins et al. 1985, Faran 1980, Linthicum 1988) y a An. albitarsis F (Brochero 2007), esta ltima a partir de especmenes recolectados en Puerto Carreo, Vichada, Colombia. An. albitarsis F revel secuencias de la regin ITS2 de ADN ribosomal y del gen white significativamente diferentes del resto de las especies reportadas hasta entonces para el complejo. An. marajoara ss no ha sido considerada como vector de malaria en Colombia (Jimnez et al. 2011) a pesar que se ha encontrado infectada naturalmente con P. falciparum en el departamento del Meta (Herrera et al. 1987, Ahumada 2009) y experimentalmente infectada con P. vivax (Collins et al. 1985). Algunos autores sugieren que An. marajoara puede estar actuando como vector auxiliar de malaria (Brochero et al., 2010; Brochero & Quiones 2008; Jimenez et al 2011). En Puerto Carreo, An. darlingi es el vector primario de malaria y est particularmente asociado a la poca de lluvia. El reciente hallazgo de infeccin natural de An. marajoara por P. falciparum en especmenes del rea urbana (Jimenez et al. 2011) sugieren que An. marajoara podra estar manteniendo la endemicidad de la malaria en esta zona y determinan un escenario ms complejo para la malaria en la zona. An. albitarsis F es una especie

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genticamente diferente de An. marajoara (Brochero et al. 2007) que se encuentra en simpatra con sta pero se desconoce su papel como vector de malaria en Puerto Carreo. Determinacin taxonmica de las especies del complejo Albitarsis La determinacin taxonmica de los anofelinos es importante para una adecuada asociacin de las caractersticas biolgicas de las especies particularmente, las de relevancia como vectores de malaria y as orientar las estrategias de control (Calle et al. 2008). En cuanto a las especies del complejo Albitarsis, debido a que las caractersticas morfolgicas de las hembras responsables de la transmisin, son idnticas, se dificulta la vigilancia entomolgica para malaria uno de los componentes del estudio de la epidemiologa de esta enfermedad. Estos complejos de especies presentan comportamientos variables y como consecuencia unas capacidades vectoriales diferentes que deben ser tenidas en cuenta en la planeacin de estrategias de control eficaces (Coluzzi et al. 1979, Tabachnick & Black 1995). Por ejemplo, con la creciente presencia de poblaciones vectores de malaria resistentes a insecticidas, se hace indispensable realizar la determinacin taxonmica apropiada con el fin de conocer la forma en que stas desarrollan resistencia fisiolgica y transmiten estos genes a otras poblaciones de importancia (Koekemoer et al. 2002). La determinacin taxonmica basada en caracteres morfolgicos de especies de especies del complejo Albitarsis capturados en campo se realiza mediante isofamilias (obtencin y conservacin de todos los estados del ciclo de vida de la especie a partir de la ovipostura de hembras silvestres) y series entomolgicas (obtencin y conservacin de las exuvias del cuarto estado larval, la pupa y el adulto emergido) usando las claves dicotmicas disponibles de Faran & Linthicum (1981), Rubio-Palis (2000) y Gonzlez & Carrejo (2007). Adems se emplean marcadores moleculares que permiten la confirmacin de la determinacin taxonmica basada en caracteres morfolgicos. En 1995 Wilkerson et al., mediante el uso de RAPD-PCR, lograron discriminar cuatro especies del complejo Albitarsis a partir de primers RAPD diagnsticos para cada una. Sin embargo Li & Wilkerson (2005) afirmaron que la tcnica de RAPD-PCR puede ser poco fiable como mtodo de identificacin de las especies del complejo Albitarsis cuando difieren los protocolos de extraccin, los reactivos y termocicladores que se usan. Por esta razn y para llevar a cabo la identificacin de las especies del complejo Albitarsis y darle robustez a los estudios epidemiolgicos, ecolgicos y genticos estos investigadores disearon seis primers basados en el ADNr para: An. albitarsis ss, An. albitarsis B (Anopheles oryzalimnetes n. sp.), An. marajoara y An. deaneourum y posteriormente, se registr un primer especfico para An albitarsis F (Brochero et al 2007). Lehr et al. (2005) basados en ADNmt reportaron a An. albitarsis E (An. janconnae) como taxn putativo a partir de ejemplares indistinguibles de An. marajoara este hallazgo no se observa usando genes nucleares. Merrit et al. (2005) proponen un mtodo para la discriminacin de An. marajoara ss de los otros miembros del complejo Albitarsis mediante la

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amplificacin de una regin del gen white que codifica para un miembro de la superfamilia de los transportadores ABC que participa en el proceso de captacin de precursores de pigmento en los ojos de los insectos (Krzywinski & Besansky 2002, Saurin et al. 1999). Los autores reportan que slo An. marajoara ss retiene el cuarto intrn de este gen, as la presencia o ausencia de ste, que genera una diferencia de aproximadamente 100 pb, puede ser usada para distinguir rpidamente a An. marajoara ss de los otros miembros del complejo Albitarsis. Se ha concluido que la prdida de un intrn en esta regin es un carcter robusto ya que los intrones nucleares o spliceosomales no tienen la capacidad de realizar auto-splicing y por eso las inserciones o deleciones deben ser muy raras, si no eventos evolutivos nicos (Venkatesh et al. 1999).

Teniendo en cuenta que en Colombia slo se han registrado como especies miembros del Complejo Albitarsis a An. marajoara ss y An. albitarsis F uno de los objetivos de este trabajo fue realizar la determinacin molecular de los ejemplares An. marajoara sl y An. albitarsis F recolectados durante 2009 en Puerto Carreo, Vichada en el marco del proyecto Malaria Vectors Biology in Brazil: Ecology & Genetics. De esta manera es posible hacer relaciones de las caractersticas de la biologa de estas especies importantes para comprender la epidemiologa de la malaria en el rea urbana de Puerto Carreo.

Estatus biolgico de especie

Aunque la ciencia y la tecnologa han brindado las herramientas para encontrar los caracteres que permiten discriminar a estos organismos, an no es claro si en la naturaleza se trata en realidad de entidades evolutivas diferentes, es decir no se conoce su estatus biolgico de especie. La especiacin se define como el origen de barreras reproductivas entre dos taxones que pueden ser de tipo precigtico (antes de la fertilizacin) o postcigtico (despus de la fertilizacin) (Coyne & Orr 1998), por lo que las especies son entidades reales presentes en la naturaleza y no divisiones humanas subjetivas. Dobzhansky (1935) y Mayr (1942) plantearon que las especies son grupos naturales de organismos separados reproductivamente de otros grupos por mecanismos de aislamiento. Dobzhansky (1935) plante que los grupos de organismos que difieren entre s en ms de un gen no pueden mantener su identidad si se reproducen entre ellos, entonces la existencia de grupos discretos en simpatra es la evidencia de que existen mecanismos para evitar el entrecruzamiento entre estos grupos y de esta manera aislarlos entre s. Haldane (1922) plante que cuando en la descendencia de dos animales de razas diferentes, uno de los sexos est ausente, es raro o estril ese sexo es el heterocigoto (o heterogamtico), afirmacin que se ha observado en muchos taxones animales con machos heterogamticos como Mammalia, Diptera, Orthoptera, Teleostei y algunos Amphibia; y grupos con hembras heterogamticas como Aves, Lepidoptera y algunos Reptilia (Coyne, 1992; Turelli & Orr, 1995; Laurie, 1997; Orr and Presgraves, 2000; Coyne and Orr, 2004; Volff, 2005; Presgraves, 2010).

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La Regla de Haldane implica la presencia de barreras reproductivas postcigticas en organismos pertenecientes a especies diferentes (Schilthuizen 2011), por esta razn se ha empleado para confirmar el estatus biolgico de especie de algunos miembros del complejo Albitarsis: Klein et al. (1991) realizaron experimentos de hibridacin entre An. albitarsis B (An. oryzalimnetes n. sp.) y An. deaneorum y luego Da Silva et al. (2006) estudiaron el aislamiento reproductivo entre An. deaneorum y An. albitarsis ss. En ambos trabajos confirmaron que las especies estudiadas son diferentes de acuerdo a lo postulado en la regla de Haldane puesto que al realizar los cruces interespecficos se evidenci la existencia de aislamiento reproductivo postcigtico puesto que los machos hbridos presentaron anormalidades morfolgicas en sus rganos reproductivos y fueron estriles. An quedan especies en el complejo Albitarsis que deben ser sometidas a estudios de hibridacin para que sean reconocidas como unidades evolutivas independientes (Rosa-Freitas et al. 1990, Wilkerson, 1995) es decir especies diferentes, ese es el caso de An. marajoara ss versus An. albitarsis F.

Evaluacin del aislamiento reproductivo de Anopheles albimanus cepa buenaventura en condiciones de laboratorio

Es necesario realizar ensayos preliminares de cpula forzada con individuos de An. albimanus provenientes de Buenaventura, Valle del Cauca, Colombia, con dos fines: el primero es estandarizar la tcnica de cpula forzada en condiciones de laboratorio y el segundo es evaluar los postulados de la regla de Haldane en la descendencia generada mediante estos cruces. Como son individuos de la misma especie se espera que no existan barreras reproductivas (pre, postcopula) y que la tasa de inseminacin sea de un valor similar a la del apareamiento libre. Ms adelante y mediante un protocolo de cpula forzada ya estandarizado, se realizarn cruces dirigidos en campo y en el laboratorio de An. marajoara y An. albitarsis F y ser posible confirmar si los individuos que han sido as denominados son realmente especies diferentes de acuerdo a lo postulado en la Regla de Haldane.

McDaniel & Horsfall (1957) desarrollaron una tcnica de cpula inducida para mosquitos del gnero Aedes basada en reportes de observaciones del comportamiento durante el apareamiento en mntidos europeos cuyas hembras decapitan a los machos antes de la cpula. En la cabeza de los insectos se encuentra el ganglio subesoffico, que es el centro nervioso encargado de mantener la inhibicin innata de los msculos copulatorios de los machos, entonces cuando el insecto es decapitado se desinhibe la conducta copulatoria (Baker 1964). Desde entonces la tcnica ha sido utilizada por muchos investigadores que la han enriquecido o han hecho modificaciones. Por ejemplo Caravaglios (1961) plantea que no es necesario decapitar al macho y Baker et al. (1962) encontraron que las tasas de cpula aumentan cuando el macho se somete a una temperatura de 15 C de 12 a 24 h antes del proceso. En cuanto a las hembras McCuiston & White (1976) reportaron que cuando tienen el abdomen distendido por la alimentacin son copuladas con ms xito que aquellas no alimentadas. Adems debido a que la hembras requieren de ingesta de sangre para madurar sus huevos, esto garantiza que

6 Introduccin

se ha logrado al menos uno de los requisitos para la obtencin de descendencia (Methods in Anopheles Research 2009). Para aplicar la tcnica en cualquier estudio con anofelinos se debe tener en cuenta que los adultos recin emergidos no son sexualmente maduros, los machos requieren cerca de 24 h para que su terminalia rote por completo y para que los receptores sensoriales de las antenas o fibrillas maduren y se pongan erectas (Clements 1992). Las hembras necesitan de 48 a 72 h antes de que se vuelvan receptivas a los machos (Methods in Anopheles Research 2009).

Mtodos

rea de estudio Los mosquitos Anopheles incluidos en este estudio para confirmacin de la determinacin taxonmica a partir de marcadores moleculares fueron recolectados durante 2009 en Puerto Carreo, departamento de Vichada, Orinoqua, Colombia, en el marco del proyecto Malaria Vectors Biology in Brazil: Ecology & Genetics. Material entomolgico Mosquitos adultos silvestres. Cada mes, entre marzo y diciembre de 2009 (en abril no se capturaron An. marajoara y en agosto no se realiz muestreo), se recolectaron mosquitos silvestres aterrizando en humanos durante 50 minutos entre las 18 y las 6 horas durante dos noches consecutivas en ambientes intra- y peridomiciliarios de viviendas con registro de casos de malaria en las zonas urbanas y periurbanas del municipio (Jimenez et al., 2011) (Ilustracin 1).

Ilustracin 1. Ubicacin geogrfica de los barrios y criaderos. E: Barrio La Esperanza,

F: Barrio La Florida, G: Barrio Gaitn, GR: Barrio Gabriel Robledo. P: Barrio La Primavera y SB: Barrio Simn Bolvar.

Las personas que sirvieron como atrayentes humanos fueron informados de los objetivos, beneficios y posibles riesgos de la actividad. El proyecto Malaria Vectors Biology in Brazil:

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Ecology & Genetics cuenta con la aprobacin de los Comits de tica de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia y del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos de Amrica. Para evitar sesgos en el muestreo, los atrayentes humanos intercambiaron su lugar cada hora. Las hembras recolectadas se ubicaron en frascos de plstico rotulados con la informacin de captura para cada hora, dentro de cada frasco haba algodn humedecido con solucin azucarada al 10% para la alimentacin de los especmenes, as fueron transportaron al Laboratorio de Entomologa de la Facultad de Agronoma de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogot donde se alimentaron con Mus musculus segn el protocolo de Manejo de Animales Vertebrados de la Universidad Nacional de Colombia. Con estas hembras se obtuvieron isofamilias mediante ovipostura forzada (Jimenez et al., 2011). En la Tabla 1 se presentan las coordenadas geogrficas de los barrios donde se realizaron las recolectas y el mes de las mismas.

Localidad Coordenadas Mes La Esperanza (E) 612'02.9"N 6729'05.7"W Julio, Octubre La Florida (F) 611'31.7"N 6729'35.7" W Diciembre Gaitn (G) 611'9.8"N 6728'51"W Marzo Gabriel Robledo (GR) 611'37.9''N 6729'26.1''W Octubre La Primavera (P) 610'59.4"N 6729'37.5"W Marzo, Junio, Julio Simn Bolvar (SB) 611'55"N 6729'01"W Septiembre, Noviembre

Tabla 1. Coordenadas geogrficas de las localidades muestreadas (Jimenez et al., 2011). Formas inmaduras. Entre marzo y diciembre de 2009 (excepto en mayo) se inspeccionaron 21 sitios de cra aptos para mosquitos del gnero Anopheles (Tabla 2) en el rea urbana y periurbana de Puerto Carreo, Vichada y se recolectaron formas inmaduras mediante el mtodo del cucharn (Parra 2006; Service 1993). Las larvas y pupas recolectadas se transportaron con agua del criadero al Laboratorio de Entomologa de Insectos de la Facultad de Agronoma de la Sede Bogot de la Universidad Nacional de Colombia para la obtencin de series entomolgicas para la determinacin taxonmica de los individuos (manual WHO). Las exuvias del cuarto instar del estado larval y de la pupa fueron preservadas en etanol 70 %, los adultos se almacenaron en viales plsticos perforados y mantenidos en bolsas re-sellables con grnulos slica desecante.

Criadero Tipo rea Coordenadas An.

marajoara sl

Confirmacin molecular

1 Laguna Periurbana 0 0 2 Excavacin Periurbana 0 0 3 Excavacin Periurbana 610'45,33''N 672902,28W 2 1 4 Laguna Periurbana 610'25.72"N 6729'20.09"W 4 1 5 Excavacin Periurbana 610'44.66"N 6729'23.15"W 10 2

9

6 Excavacin Periurbana 610'48.3"N 6729'23.5"W 11 3 7 Excavacin Periurbana 61044,05''N 672932,07''W 34 2 8 Potrero inundado Periurbana 61040,77''N 672939,22''W 54 6 9 Excavacin Periurbana 61030,98''N 672946,27''W 21 4 10 Excavacin Periurbana 611'58.11"N 6729'05.73"W 1 0 11 Excavacin Periurbana 611'53.88"N 6729'18.55"W 4 1 12 Cao Periurbana 612'06,6''N 6729'40,3''W 0 0 13 Morichal Periurbana 611'40.2"N 6729'29.5"W 1 1 14 Excavacin Periurbana 611'37.92''N 6729`36,7"W 9 3 15 Excavacin Periurbana 611'17.15"N 6728'36.43"W 11 2 16 Laguna Periurbana 611'32.92"N 6728'31.53"W 0 0 17 Excavacin Periurbana 611'50.5"N 6728'45.8"W 10 2 18 Cao Urbana 611'9,8''N 6728'51,0''W 0 0 19 Cao Periurbana 611'33.47"N 6729'53.14"W 0 0 20 Potrero inundado Periurbana 610'45.36"N 6728'39.83"W 0 0 21 Excavacin Periurbana 611'40.28"N 6729'16.75"W 1 0

Tabla 2. Caracterizacin y coordenadas geogrficas de los criaderos muestreados y nmero de ejemplares An. marajoara sl para la confirmacin molecular en este estudio.

Determinacin taxonmica con base en caracteres moleculares

Extraccin de ADN. La extraccin de ADN se llev a cabo con la mitad posterior del abdomen de cada mosquito ya que las otras partes fueron usadas en: ensayos de ELISA para determinar infeccin natural con parsitos del gnero Plasmodium (cabeza, trax y mitad anterior del abdomen) (Jimenez et al., 2011); montaje permanente de ala y pata posterior para la coleccin de referencia del rea de Gentica de Insectos y Entomologa Molecular del Laboratorio de Entomologa de la Facultad de Agronoma, sede Bogot. Las otras partes de los mosquitos que no se utilizaron (patas anterior y media y ala) tambin fueron incluidas para la extraccin. Para algunos especmenes se realiz la extraccin de ADN usando el protocolo de fenol:cloroformo de Sambrook & Rusell (2001). El protocolo consisti en depositar el material biolgico en 200 l del buffer de extraccin junto con 4 l de proteinasa K y 5 l de dodecilsulfato sdico (SDS) al 20%. La muestra se macer y se dej en bao Mara a 55 o C durante toda la noche. Al otro da se agregaron 200 l de PCI (solucin de fenol: cloroformo: alcohol isoamlico 25:24:1), se centrifug por 13 min a 13000 rpm y se transfiri la fase acuosa con micropipeta a otro tubo rotulado. Se agregaron 200 l de CI (solucin de cloroformo: alcohol isoamlico 24:1), se centrifug por 13 min a 13000 rpm y se transfiri nuevamente la fase acuosa. Se aadieron 400 l de etanol absoluto, se congel a -20 o C por 15 min y se centrifug por 13 min a 13000 rpm, luego se retir el etanol con micropipeta. Se hizo un segundo lavado con 400 l de etanol fro al 70%, se centrifug por 18 min a 13000 rpm y se

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removi el etanol dejando la menor cantidad posible. Finalmente se dejaron secar los tubos al aire libre sobre una superficie limpia a temperatura ambiente. El ADN se re-suspendi en 30 l de Buffer TE y se almacen a -4 o C. Con este protocolo se realiz la extraccin a 12 individuos. Para la mayora de las muestras (174 individuos) se utiliz DNeasy Blood & Tissue Kit y se sigui el protocolo especfico para insectos. Los productos de extraccin se visualizaron en gel de agarosa al 1 %. El ADN extrado de todos los especmenes se almacen a -20oC en el rea de Gentica de Insectos y Entomologa Molecular del Laboratorio de Entomologa de la Facultad de Agronoma, sede Bogot de la Universidad Nacional de Colombia. Amplificacin del gen white mediante reaccin en cadena de la polimerasa. Para la confirmacin taxonmica de An.marajoara ss versus An. albitarsis F se emple el gen white de acuerdo con lo propuesto por Merrit et al. (2005) y Brochero (2006) en todos los mosquitos adultos silvestres recolectados y en algunas series por criadero inspeccionado correspondientes a las formas inmaduras recolectadas. Los primers utilizados fueron: WhF 5-ATCGCACCGAACAAGGAAACC-3 y Wh2R 5-GCCATCGAGATGGAGGAGCTG-3. La reaccin de amplificacin se llev a cabo en un volumen final de 25 l con las siguientes concentraciones: 2ul del extracto de ADN, Buffer Go-Taq 1x, MgCl2 20 mM, dNTPs 0,2 mM, WhF 2 M, Wh2R 2 M y 0,25 U de Taq-Pol. El termociclador usado fue Bio-Rad C1000TM Thermal Cycler con los siguientes parmetros: un ciclo inicial de denaturacin de 95 oC por 2 min; 35 ciclos de amplificacin de 95 oC por 30 s, 62 oC por 30 s y 72 oC por 1:30 min; y un ciclo de elongacin final de 72 oC por 10 min. Los productos de amplificacin se visualizaron en gel de agarosa al 2,5%. Se esperaba encontrar dos productos de amplificacin correspondientes a 700 y 800 pb para An. albitarisis F y An. marajoara ss respectivamente. Todos los productos de amplificacin se almacenan a -20oC en el rea de Gentica de Insectos y Entomologa Molecular del Laboratorio de Entomologa de la Facultad de Agronoma, sede Bogot de la Universidad Nacional de Colombia. Cuantificacin de ADN genmico con NanoDrop. Para cuantificar el ADN de las muestras que no generaron productos de amplificacin visibles en geles de agarosa, se emple el espectrofotmetro NanoDrop del laboratorio de Biologa Molecular del Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia. Esta evaluacin permite conocer la calidad y cantidad de ADN genmico presente de cada muestra para dilucidar por qu no se generan amplicones y as proponer estrategias encaminadas a obtener productos de amplificacin. El espectrofotmetro NanoDrop permite conocer la concentracin de ADN y de otras sustancias como ARN, protenas o fenol presentes en una muestra midiendo la capacidad que sta tiene para absorber radiacin, es decir la absorbancia (A) en un espectro de 220 a 350 nm de longitud de onda. De acuerdo a la ley de Lambert-Beer la cantidad de energa absorbida por una sustancia a cierta longitud de onda es funcin de su concentracin. Sabiendo que 1) las bases nitrogenadas del ADN absorben la mxima cantidad de energa a 260 nm, 2) las protenas tienen una absorbancia mxima a 280 nm y 3) los

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productos orgnicos como el fenol y carbohidratos absorben a 230 nm; se han propuesto dos razones de absorbancia para evaluar la calidad del ADN extrado. La A260/A280 indica un alto grado de pureza cuando tiene un valor entre 1,8 y 2,0; si se obtienen valores por encima de 2,0 quiere decir que hay contaminacin de la muestra con ARN y es conveniente tratarla con ARNasa mientras que si el valor obtenido es inferior a 1,8 en el extracto hay protenas lo que hace necesario un proceso de purificacin (Wharbug & Christian 1942). La A260/A230 debe tener un valor entre 0,3 y 0,9 si el valor es mayor es indicativo de que hay presencia de fenol u otros compuestos orgnicos en la muestra (Stulnig & Amberger 1994) y la muestra debe ser purificada. Para hacer la medicin slo se debe poner 1 l en el pedestal del NanoDrop y bajar el brazo que tiene un segundo pedestal. La muestra queda suspendida entre los dos pedestales y se hace incidir a travs de sta el haz de luz para producir la lectura en un espectro entre 220 y 350 nm. Tratamientos para purificar el ADN genmico. Se aplic un tratamiento de ARNasa cuando, de acuerdo a los anlisis con el espectrofotmetro NanoDrop una muestra tena una razn A260/A280 con un valor superior a 2,0, es decir presentaba contaminacin con ARN. El procedimiento para eliminar el ARN de las muestras fue aadir 2 l de ARNasa a cada una y dejar reposar por 40 min a temperatura ambiente; luego las muestras fueron lavadas con isopropanol. Las muestras que se trataron con ARNasa y las que tuvieron valores de A260/A280 < 1,8 y A260/A230 >0,9, es decir contaminadas con protenas y con fenol o polisacridos respectivamente se lavaron con isopropanol para retirar restos de protenas y de otros productos orgnicos. El procedimiento consisti en aadir a cada muestra 500 l de isopropanol y dejar a -20 C toda la noche; despus se centrifug a 14.000 RMP por 14 min, se retir el isopropanol volteando el tubo teniendo cuidado de no perder el pellet y luego se aaderon 500 l de etanol 70 %, para enjuagar el precipitado de ADN se debieron voltear varias veces los tubos y se centrifug de nuevo a 14.000 RPM durante 14 min, finalmente se vaci el tubo voltendolo y se pusieron a secar las muestras en una cmara de flujo laminar durante toda la noche, al otro da se resuspendi el pellet en 30 l de buffer TE. Se visualiz el ADN obtenido mediante electroforesis en gel de agarosa 1% con patrones de 100 ng/l y 50 ng/l. Cpula forzada en condiciones de laboratorio Con el objetivo de estandarizar un protocolo de cpula forzada en condiciones de laboratorio para An. albimanus se han consultado diferentes protocolos de cpula forzada para anofelinos que se resumen en la Tabla 3.

World Health Organization (1975) Methods in Anopheles Research (2007) (modificado de Ow Yang et al, 1963) Edad del Al menos 72 h Al menos 72 h

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macho Edad de la hembra Al menos 12 h 48 - 72 h

Alimentacin Antes del protocolo 2 - 4 h antes del protocolo Anestsico Eter - 0,2 ml Eter Protocolo Anestesiar al macho Anestesiar al macho Atravesar el trax del macho con el minuten Atravesar el trax del macho con el minuten Cortar la cabeza y las extremidades Anestesiar a la hembra Anestesiar a la hembra Ubicar las hembras en posicin ventral Ubicar las hembras en posicin ventral Cortar la cabeza y los tarsos III del macho

Frotar suavemente el abdomen del macho sobre el de la hembra

Tocar la terminalia del macho con la de la hembra en un ngulo de 45 Tocar la terminalia del macho con la de la hembra en un ngulo de 45

Levantar al macho y a la hembra unidos

Transferir a la hembra todava unida al macho a un recipiente para que se recupere

Transferir a la hembra todava unida al macho a un recipiente para que se recupere

Tabla 3. Protocolos de cpula forzada para anofelinos.

En los protocolos revisados no se especifica cmo deben separarse machos de hembras para garantizar que sean vrgenes al momento de realizar el procedimiento de cpula forzada. En este trabajo es posible asegurar que los ejemplares de ambos sexos no han copulado ya que se separan desde que son pupas en envases de icopor individuales, cuando surgen los adultos se ubican en jaulas separadas para machos y hembras y all se alimentan con solucin azucarada al 10%. Cuando las hembras alcanzan la edad adecuada para el procedimiento de cpula son (o no) alimentadas con Mus musculus, segn el protocolo de Manejo de Animales Vertebrados de la Universidad Nacional de Colombia. En cuanto a la alimentacin de los machos no hay ninguna especificacin por lo que se les mantiene solucin azucarada permanentemente.

Para iniciar el proceso, se anestesi un macho depositndolo en un recipiente con tapa que contiene una bola de algodn con 0,2 ml de acetato de etilo (Lima et al. 2004). Se utiliz este anestsico porque no haba disponibilidad de ter y se quera probar su utilidad en el procedimiento. Cuando se observ que el macho caa de las paredes del frasco se retiraba de ste y bajo el estreo-microscopio se atravezaba su trax con un minuten fijado a un palito. Para anestesiar a la hembra se sigui el mismo procedimiento, una vez inmvil se ubic ventralmente y se verific que continuara viva revisando los movimientos del abdomen. Se tom el macho previamente preparado que deba estar vivo, se le retir la cabeza y las patas posteriores con pinzas finas con el propsito de que no moviera a la hembra y el nico contacto fuera por el abdomen. Se acerc lentamente el abdomen del macho a la hembra en un ngulo de unos 90 aproximadamente y se permiti el contacto entre las terminalias (Ilustracin 2 Izq). Cuando se frota suavemente de atrs hacia adelante la terminalia del macho contra la de la hembra, el macho abre los gonoestilos y sujeta a la hembra con las claspetas (Ilustracin 2 Der). La forma de comprobar que sucede la cpula consiste en

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levantar al macho y a la hembra sostenida por ste, la cpula dura de 3 a 5 seg, luego el macho libera la terminalia de la hembra.

Ilustracin 2. (Izq) Posicin de las terminalias para la cpula PA: Poro anal, Gc: Gonocoxito, Ge: Gonoestilo. (Der) Cpula. Fotografas de: Diana Carolina Surez, Cesil Solis (2011).

Este mismo procedimiento se repiti con la misma pareja varias veces para aumentar la probabilidad de inseminacin. Finalmente se deposit a la hembra an anestesiada en una jaula Bug Dorm que contena un recipiente con agua para que sta depositara sus huevos y un suministro de solucin azucarada al 10 % en un copo de algodn. Un macho puede ser utilizado para inseminar a varias hembras. Despus de realizar el protocolo de cpula, las hembras son vigiladas todos los das para observar si hay ovipostura ofrecindoles ingesta sangunea da por medio.

Evaluacin de aspectos del aislamiento reproductivo

En organismos que se reproducen sexualmente se originan nuevas especies cuando se establece una barrera reproductiva entre diferentes grupos biolgicos, este aislamiento puede ocurrir antes o despus de la formacin del cigoto hbrido; las barreras precigticas son las que previenen la cpula o la fertilizacin mientras que las barreras poscigticas implican la esterilidad o inviabilidad del hbrido (Nei & Zhang, 1998). En este trabajo se han implementado estrategias metodolgicas para medir el aislamiento reproductivo que pueda generar el procedimiento de cpula forzada en condiciones de laboratorio (Tabla 4).

AISLAMIENTO REPRODUCTIVO ESTRATEGIA METODOLGICA PRECIGTICO

Cpula Conteo de las hembras copuladas Inseminacin Diseccin de espermatecas

Medicin de la tasa de inseminacin Fertilizacin Conteo de las hembras grvidas

PROSCIGTICO Esterilidad Retrocruces

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Diseccin de testculos

Inviabilidad Conteo de larvas y pupas y adultos vivos Tabla 4. Estrategias metodolgicas para la evaluacin del aislamiento reproductivo (Pereira-

Lima et al. 2004).

Para determinar si una hembra sometida al protocolo de cpula fue inseminada se disec la espermateca (Tabla 5). Se realizaron disecciones de espermatecas con algunas hembras copuladas artificialmente y otras copuladas libremente con el fin de probar y estandarizar el protocolo.

Otra forma de evaluar el aislamiento reproductivo producido por los cruces dirigidos consiste en la medicin de la tasa de inseminacin (I = No. de hembras que depositen huevos viables / No. de hembras sometidas al protocolo de cpula forzada).

Adems, la diseccin de testculos (Tabla 5) se utiliza para observar si hay diferencias morfolgicas de estos rganos entre los parentales y descendientes producto de los cruces dirigidos (Lima et al. 2004). En este trabajo no se realizan disecciones de testculos, sin embargo se recomienda que se realicen en los trabajos de hibridacin de An. marajoara ss y An. albitarsis F.

Diseccin de espermatecas Diseccin de testculos Matar a la hembra a -20 C por 5 min. Matar al macho a -20 C por 5 min.

Poner una gota de PBS en una lmina limpia Poner una gota de PBS en una lmina limpia

Ubicar a la hembra en posicin ventral para que se empape el abdomen con PBS

Ubicar al macho en posicin ventral para que se empape el abdomen con PBS

Remover la terminalia halndola suavemente con unas pinzas finas

Remover la terminalia halando suavemente los claspers con unas pinzas finas

Localizar la espermateca en el segmento VIII Poner una laminilla sobre la espermateca que se

ve como una pequea esfera oscura Observar en un microscopio con una magnificacin de 100X Observar en un estreomicroscopio

Buscar el movimiento de los espermatozoides

Tabla 5. Diseccin de espermatecas y testculos para anofelinos (Methods in Anopheles Resarch, 2007).

Individuos de An. albimanus son mantenidos en condiciones controladas de temperatura (28 C), humedad relativa (50 %) y fotoperiodo (12/12) en el Laboratorio de Entomologa de la

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Facultad de Agronoma sede Bogot. En este trabajo se evalu la viabilidad de los individuos de la colonia de An. albimanus teniendo en cuenta el nmero de nacimientos, la sobrevivencia, pupacin y emergencia (Lima et al. 2004; Somboon et al. 2005; Saeung et al. 2007) en dos ensayos con tres repeticiones cada uno. En el primer se cuidaron las larvas con la Metodologa Tradicional y se inici con tres grupos de 65 huevos; en el segundo se emple la Metodologa Sugerida y se inici con tres grupos de 92 huevos. Las estrategias de cada metodologa se resumen en la Tabla 6. Metodologa Tradicional Metodologa Recomendada

Lavado de las bandejas

Lavado con agua y jabn antibacterial.

Lavado con agua y jabn antibacterial seguido de una limpieza con etanol absoluto.

Limpieza de las bandejas

Diariamente con un gotero se retiraban partculas de la superficie del agua, luego se limpiaban las paredes de la bandeja con un pincel y se mova el agua circularmente para que los desechos se movieran al centro y se retiraban con un gotero cuando se depositaban en el fondo. Esto se repeta hasta que no quedaran ms desechos.

Cuando se observen numerosos restos de comida en el fondo de la bandeja se deben retirar con un gotero sin agitar el agua.

Tapa Tapa con red. Tapa hermtica.

Comida Pedigree alimento para perros macerado. Murina alimento para ratones macerado.

Tabla 6. Metodologas de cuidado de An. albimanus inmaduros en el laboratorio con las que se llevaron a cabo los ensayos para la evaluacin de la viabilidad.

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Resultados

Confirmacin taxonmica de las especies Mosquitos adultos silvestres. Se extrajo ADN de 12 individuos adultos silvestres con el protocolo de fenol:cloroformo (Tabla 7) de los cuales tres se determinaron como An. albitarsis F pues el producto de amplificacin se ubic cerca a los 700 pb; ocho correspondieron An. marajoara ss con un producto de amplificacin de aproximadamente 800 pb. Uno de los individuos present un patrn diferente en su producto de amplificacin ya que la banda se ubic en los 750 pb aproximadamente (Ilustracin 3).

Ilustracin 3. Amplicones de algunas muestras sometidas al protocolo de extraccin con

fenol:cloroformo. La flecha indica un producto de amplificacin no esperado de aproximadamente 750 pb. Fotografa de: Diana Carolina Surez (2011).

Se extrajo el ADN de 194 individuos con DNeasy Blood & Tissue Kit (Tabla 7), de los cuales 22 se determinaron como An. albitarsis F; 145 fueron An. marajoara ss; 25 no han sido determinados pues no se observ ningn producto de amplificacin. Las muestras correspondientes a 2 individuos generaron productos de amplificacin diferentes a los ya mencionados: en uno de estos ejemplares, la banda del producto de amplificacin se ubic cerca de los 750 pb mientras que en el otro estuvo en las 850 pb.

Fenol:Cloroformo Total DNeasy Blood & Tissue Kit Total Am ss Aa F ND NA Am ss Aa F ND NA

Silvestres adultos 8 3 1 12 145 22 2 25 194 Formas inmaduras 14 3 11 28 Tabla 7. Determinacin taxonmica con base en el tamao de un fragmento de gen white amplificado de especmenes procesados con dos protocolos de extraccin de ADN. Am ss: An. marajoara ss, Aa F:

An. albitarsis F, ND: No determinado, NA: Sin producto de amplificacin.

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Formas inmaduras. Con el protocolo de extraccin de ADN de fenol:cloroformo se procesaron 28 individuos de los cuales 14 correspondieron a An. marajoara ss y tres fueron determinados como An. albitarsis F. Once ejemplares no generaron productos de amplificacin. Cuantificacin de ADN con NanoDrop. De los ejemplares adultos silvestres se evaluaron 27 muestras en el espectrofotmetro NanoDrop, todas procesadas con DNeasy Blood & Tissue Kit: dos de las muestras analizadas correspondieron a An. marajoara ss y An. albitarsis F y se tomaron como control positivo, las otras 25 muestras correspondieron las que no generaron productos de amplificacin y se sometieron a esta prueba para conocer cules fueron las condiciones que impidieron la amplificacin del gen white. La sustancia que se utiliz para calibrar el NanoDrop o blanco fue el buffer AE suministrado con DNeasy Blood & Tissue Kit puesto que los extractos de ADN se resupenden y almacenan en este buffer. Para las muestras control la concentracin de ADN fue de 8,5 y 20,9 ng/l para An. marajoara ss y An. albitarsis F respectivamente; los valores de A260/A280 fueron 1,8 (An. albitaris F) y 1,9 (An. marajoara ss) indicando la ausencia de protenas o ARN; y se obtuvieron valores de A260/A230 de 1,0 (An. albitaris F) y 1,1 (An. marajoara ss) evidenciando la contaminacin de estas muestras con polisacridos o fenol. Para el resto de muestras analizadas se encontraron concentraciones entre 1,2 y 72,1 ng/l, todas tuvieron algn tipo de contaminacin: siete muestras estaban contaminadas nicamente con protena (A260/A280 < 1,8); 18 muestras presentaron residuos de polisacridos o fenol, de las cuales ocho adems tenan protena (A260/A280 < 1,8) y dos estaban contaminadas tambin con ARN (A260/A280 > 2,0). De acuerdo a estos resultados, las dos muestras con presencia de ARN se sometieron a tratamiento con ARNasa y todas las muestras se sometieron a lavados con isopropanol para posteriormente hacer la PCR y confirmar la determinacin taxonmica. Se evaluaron con NanoDrop 13 muestras correspondientes a formas inmaduras, stas fueron procesadas con el protocolo de extraccin fenol:cloroformo. 11 no generaron productos de amplificacin mientras que dos fueron An. marajoara ss y An. albitarsis F y se utilizaron como controles. La sustancia que se utiliz para calibrar el NanoDrop fue el buffer TE donde se resuspendieron y almacenaron los extractos de ADN. Se hallaron concentraciones de ADN entre 6,8 y 329,5ng/l; las muestras control tuvieron concentraciones de 24,4 y 16,2 ng/l para An. marajoara ss y An. albitarsis F respectivamente; para la razn A260/A280 presentaron valores de 2,2 (An. marajoara ss) y 2,5 (An. albitarsis F) indicando que las muestras control tenan contaminacin con ARN; y la A260/A230 fue de 0,7 (An. albitaris F) y 0,8 (An. marajoara ss) esto evidenci la falta de contaminacin por fenol o polisacridos. 10 muestras se encontraron contaminadas con ARN de las cuales dos adems presentaron residuos de polisacridos o fenol. Una muestra, de acuerdo con los anlisis no tena contaminacin de ningn tipo. Las diez muestras con presencia de ARN se trataron con ARNasa y todas las muestras fueron lavadas con isopropanol. Tratamientos para purificar el ADN genmico. Dos muestras de ejemplares adultos silvestres fueron tratadas con ARNasa y posteriormente lavadas con isopropanol; de stas slo se recuper ADN en una muestra de acuerdo con la visualizacin en gel de agarosa 1 %. Diez muestras de ejemplares inmaduros fueron sometidas a tratamiento con ARNasa y despus lavadas con isopropanol; en

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ninguna muestra fue posible recuperar ADN de acuerdo a la visualizacin en gel de agarosa. De las 23 muestras de mosquitos adultos silvestres que se sometieron a precipitacin con isopropanol, se recuper ADN en 20 muestras segn la visualizacin de ADN genmico. Una muestra de los ejemplares inmaduros fue tratada nicamente con isopropanol y no se recuper ADN despus de este procedimiento segn la visualizacin en gel de agarosa 1 %. Abundancia en los sitios de cra Para este trabajo se emplearon ejemplares de los criaderos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 13, 14, 15 y 17 (Duran et al.. 2011). La confirmacin de la determinacin taxonmica permiti encontrar que en los criaderos 19 y 20 no se recolectaron formas inmaduras de An. marajoara sl en tanto que en los criaderos 3, 10, 13 y 21 se obtuvo la menor abundancia para esa especie especie, mientras que en los criaderos 7, 8 y 9 se present la mayor abundancia. Los resultados indican que An. marajoara ss y An. albitarsis F no comparten criaderos ya que la primera se encuentra en los criaderos 5, 6, 14, 15 y 17 que son de tipo excavacin, 4 (tipo laguna) y 8 (tipo potrero inundado), mientras que la segunda se encuentra exclusivamente en el criadero 9 que es una excavacin (Ilustracin 4). En cuanto a la confirmacin molecular con gen white, individuos de los criaderos 3, 5, 7, 8, 9, 11, 13, 14 y 15 no generaron productos de amplificacin.

Ilustracin 4. Abundancia en los criaderos muestreados para el 2009.

Abundancia mensual, por localidad y por ambiente intra- y peridomicilio Los resultados obtenidos a partir de la determinacin molecular indican que An. marajoara ss fue, por mucho, ms abundante que An. albitarsis F durante todos los meses de muestreo en el ao 2009 (Ilustracin 5). En los resultados tambin es evidente un incremento en la abundancia, al menos de An. marajoara en los meses de lluvia, es decir de abril a noviembre, presentndose su mayor abundancia en septiembre y posteriormente una disminucin de la cantidad de individuos hasta el mes de diciembre. En el caso de An. albitarsis F tambin es posible apreciar un pequeo incremento en la abundancia durante los meses de lluvia y en la ilustracin 5 se ve que en julio se recolect la mayor cantidad de individuos de esta especie. Para obtener estos datos se sumaron todos los individuos recolectados en las diferentes localidades para cada mes.

01234

4 5 6 8 9 14 15 17

An. marajoara ssAn. albitarsis F

19

Ilustracin 5. Abundancia mensual en el ao 2009. Am: An. marajoara ss, Aa: An. albitarsis F.

En cuanto al muestreo por localidades se encontr una mayor abundancia de An. marajoara ss y de An. albitarsis F en el barrio Simn Bolivar (Ilustracin 6), adems en los barrios La Esperanza, Gabriel Robledo y La Primavera se registr la presencia de las dos especies mientras que en los barrios La Florida y Gaitn slo se recolectaron ejemplares de An. marajoara ss. Los resultados aqu presentados se obtuvieron sumando los mosquitos recolectados para cada localidad durante los meses muestreados.

Ilustracin 6. Abundancia en las localidades muestreadas en 2009. E: Barrio La Esperanza, F: Barrio La Florida, G: Barrio Gaitn, GR: Barrio Gabriel Robledo. P: Barrio La Primavera y SB: Barrio Simn

Bolvar.

Finalmente, se encontr que tanto An. marajoara ss como An. albitarsis F se encuentran en los ambientes intra- y peridomicilio y que las dos especies son ms abundantes en el peridomicilio (Ilustracin 7). Estos resultados se obtuvieron al sumar los ejemplares recolectados en los ambientes intra- y peridomicilio de todas las localidades, durante todos los meses muestreados en el ao 2009.

Ilustracin 7. Abundancia en los ambientes intra- y peridomicilio.

010203040506070

Am AA Am AA Am AA Am AA Am AA Am AA Am AA

Mar Jun Jul Sep Oct Nov Dic

0

50

100

E F G GR P SB

An. marajoara s. s.

An. albitarsis F

0

50

100

150

An. marajoara ss An. albitarsis F

Intradomicilio

Peridomicilio

20

Comportamiento de picadura La confirmacin molecular de la determinacin taxonmica permiti registrar mayor actividad a las 18 horas tanto para An. marajoara ss como para An. albitarsis F. Tambin se observ que An. marajoara ss es ms abundante que An. albitarsis F en todas las horas y que este ltimo no registr ninguna actividad entre las 2 y las 5 horas (Ilustracin 8). Estos resultados se obtuvieron sumando el total de individuos para cada hora en los meses muestreados.

Ilustracin 8. Abundancia por hora en el ao 2009.

Infeccin natural con parsitos del gnero Plasmodium spp. A 172 hembras determinadas morfolgicamente como An. marajoara sl a las que se les realiz la prueba de ELISA, tres resultaron positivas, es decir naturalmente infectadas con P. falciparum. Dos de estas hembras fueron recolectadas en el barrio La Primavera en los meses de marzo y junio en el ambiente intradomicilio entre las 18 y las 19 h mientras que la tercera hembra infectada fue recolectada en el Barrio Simn Bolvar en el mes de septiembre en el peridomicilio entre las 19 y 20 h. La determinacin molecular indic que los tres ejemplares correspondieron a An. marajoara ss.

Cpula forzada en condiciones de laboratorio

Se realizaron 35 ensayos de cpula forzada variando el tiempo de alimentacin de las hembras, la edad de stas y las condiciones en las que se lleva a cabo el protocolo como el tipo de luz del estreo-microscopio y la temperatura (Tabla 8).

Anestsico Temperatura aprox. Luz

# h A AE E 18 C 28 C H Am C M D 3 48 No

X X

X Si No No

2 72 3 h antes X

X X

Si No No 1 72 1 h antes X

X X

Si No No

4 72 1 d antes X

X X

Si No No 2 72 2 d antes X

X X

Si No No

2 96 3 h antes X

X

X Si No No 2 96 3 h antes X

X X

Si No No

0

10

20

30

40

50

18 19 20 21 22 23 0 1 2 3 4 5

An. marajoara ssAn. albitarsis F

21

1 96 2 d antes X

X X

Si No No 2 96 3 d antes X

X X

Si No No

3 120 1 d antes X

X X

Si No No 1 144 1 d antes X

X X

Si No No

4 SD 3 h antes X

X

X No Si No 8 SD 3 h antes X

X X

Si No No

Tabla 8. Variables de los ensayos de cpula forzada. #: Nmero de hembras, h: Edad en horas, A: Tiempo de alimentacin, AE: Acetato de etilo, E: Eter, H: Luz halgena, Am: Luz amarilla, C: Cpula,

M: Muerte, D: Descendencia.

De acuerdo a los protocolos de World Health Organization (1975) y Methods in Anopheles Research (2007) la copula sucede cuando es posible levantar al macho y a la hembra unidos por sus terminalias por unos pocos segundos. En 31 ensayos sucedi la cpula en mltiples ocasiones (de 5 a 10 veces) y sin embargo en ninguno se produjo descendencia.

Los primeros ensayos se realizaron a una temperatura de 28 C aproximadamente y bajo un estreo-microscopio de luz amarilla, se observ que las hembras moran despus de algunos minutos y que no eran copuladas por eso se decidi utilizar un estreo-microscopio con fuente de luz halgena, as se evit que las hembras murieran y todas fueron copuladas aunque no se logr obtener descendencia. Cuando se intent realizar el protocolo en un laboratorio ventilado a una temperatura aproximada de 18 C se volvi a utilizar estreo-microscopio de luz amarilla, en este caso las hembras eran copuladas y no moran durante el procedimiento.

El anestsico mayormente utilizado en el protocolos de cpula forzada es el ter sin embargo no se contaba con ste entonces se utiliz acetato de etilo como en el trabajo de Lima et al. (2004) en el que usan este compuesto para anestesiar a las hembras para hacer la determinacin taxonmica con base en caracteres morfolgicos pero no para someterlas a un protocolo de cpula forzada.

Evaluacin del aislamiento reproductivo

Diseccin de espermatecas. Se realizaron siete disecciones de hembras sometidas al protocolo de cpula forzada y de hembras provenientes de la colonia. De acuerdo a Methods in Anopheles Research (2007), al observar una espermateca con contenido de espermatozoides bajo un microscopio de contraste de fases en campo oscuro pueden verse anillos concntricos brillantes. En cinco de las espermatecas que se han revisado no ha sido posible observar esto (Ilustracin 9) sin embargo en dos se ha visto que brillan al ser observadas en campo oscuro (Ilustracin 10).

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Ilustracin 9. (Izq) Espermateca observada en campo claro. (Der) Espermateca observada en campo oscuro. Fotografa de: Diana Carolina Surez (2011).

Ilustracin 10. (Izq) Espermateca observada en campo claro. (Der) Espermateca observada en campo oscuro. Fotografa de: Diana Carolina Surez (2011).

Evaluacin de la viabilidad. En la Tabla 9 se pueden apreciar los resultados obtenidos de la cuantificacin de huevos, larvas, pupas y adultos de los dos ensayos ya mencionados.

H N (%) P (%) E (%) H (%) M (%)

MT 65 19 + 6,2 29,2 + 9,6 15 + 3,5 80,8 + 10,6 4 + 4,0 24,3 + 21,8 2,7 + 2,3 50 + 50,0 1,3 + 2,3 16,7 + 28,9

MS 92 47,3 + 1,5 51,4 + 1,7 26,7 + 9,5 56,4 + 20,4 17 + 5,6 64,5 + 4,4 8,3 + 4,0 46,7 + 9,5 8,7 + 1,5 53,0 + 9,5 Tabla 9. Promedio y desviacin estndar de la cuantificacin de los estados del ciclo de vida de An.

albimanus bajo dos metodologas de cuidado. MT: Metodologa tradicional, MS: Metodologa sugerida, H: Huevos, N: Nacimientos, P: Pupaciones, E: Emergencias, He: Hembras, Ma: Machos.

Discusin

A travs de los diferentes estudios de An. marajoara ss se ha encontrado que tiene caractersticas que permitiran comprometer a esta especie como un vector de malaria de importancia potencial en algunas localidades de Colombia. Esta especie se ha encontrado naturalmente infectada con P. falciparum (Herrera et al. 1987) e infectada en condiciones de laboratorio con P. vivax (Collins et al. 1985) adems, Quiones et al. (1987) reportaron que tiene niveles de resistencia a DDT; Brochero et al. (2005) encontraron que la especie se adapta bien a cambios antrpicos bruscos; y Brochero (2007) report que tiene una estructura gentica similar a la de vectores primarios de malaria. Este panorama se vuelve un poco ms complejo con el hallazgo de Brochero et al. (2007) quienes registran que An. albitarsis F se encuentra en simpatra con An. marajoara ss en Puerto Carreo y que est asociada a An. darlingi que es el vector principal de la malaria en esta rea. Este descubrimiento podra evidenciar un proceso de especiacin en el complejo Albitarsis, que implica una variabilidad gentica importante aunque con pocos cambios en la morfologa de los individuos (Coluzzi 1988; Steiner et al. 1982 citados en Brochero 2006). De ser as, es importante estudiar la biologa de An. marajoara ss y de An. albitarsis F como entidades independientes porque pueden tener capacidades vectoriales diferentes y de esta manera planear estrategias de control especie-especficas (Coluzzi et al. 1979, Tabachnick & Black 1995).

Partiendo de los planteamientos anteriores, en la localidad de Puerto Carreo, Vichada se llev a cabo el estudio de algunos aspectos de la biologa de los vectores de malaria en el marco del proyecto Malaria Vectors Biology in Brazil: Ecology & Genetics financiado por el Instituto Nacional de Estados Unidos (NIH) y la Universidad Nacional de Colombia y bajo la coordinacin de las doctoras Jan E. Conn y Helena Brochero. Al evaluar la abundancia de An. marajoara ss y de An. albitarsis F en los sitios de cra se encontr que estas dos especies no comparten criaderos pues An. albitarsis F slo se encontr en uno de los cuerpos de agua que fueron evaluados que correspondi a una excavacin periurbana. Esto es un indicio de que An. albitarsis F es una entidad biolgica diferente de An. marajoara ss, pues en su estado larval tiene una preferencia especfica por las condiciones de ese criadero, que como ya se mencion es una excavacin periurbana. Este hallazgo podra ser til si se quiere ejercer algn tipo de control diferencial sobre las larvas de estas dos especies en la localidad de Puerto Carreo con agentes biolgicos como Bacillus sphaericus o Bacillus thuringiensis israelensis (Lacey & Singer 1982). Aunque los resultados anteriores evidencian una diferencia en la distribucin de An. marajoara ss y An. albitarsis F en los sitios de cra, deben ser confirmados sometiendo a determinacin molecular mediante la amplificacin del gen white a una mayor cantidad de ejemplares provenientes de series entomolgicas de todos los criaderos ya que la muestra que se tom puede no ser representativa dado que fue solamente de 17 adultos, provenientes de las series entomolgicas.

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Al evaluar la abundancia de An. marajoara ss y An. albitarsis F se observa que generalmente se encuentran en simpatra. Sin embargo An. marajoara ss es siempre ms abundante y frecuente. En cuanto a la actividad de picadura se encontr que tanto An. marajoara ss como An. albitarsis F tienen un pico de actividad a las 18 h; An. marajoara ss est presente durante toda la noche (18-5 h) mientras que An. albitarsis F se encuentra desde las 18 h hasta la 1 de la madrugada. Lo anterior implica un comportamiento diferencial que conduce a pensar que An. marajoara ss puede ser un vector ms efectivo que An. albitarsis F en la regin, pues tiene actividad prolongada durante la noche y la madrugada y una mayor abundancia, la suma de estos factores implica que puede suceder una mayor probabilidad de transmisin de malaria, adems se encontraron especmenes infectados con P. falciparum (Jimnez et al. 2011).

Es sabido que la temperatura, la humedad relativa y las precipitaciones tienen efecto sobre la abundancia de los anofelinos y por lo tanto sobre la transmisin de la malaria (OMS, Nota descriptiva No. 94). Como se esperaba, los resultados muestran que en los meses secos la presencia de las dos especies es muy pequea en contraste con los meses de lluvia, es decir de abril a noviembre, en los que fue evidente un aumento de la cantidad de mosquitos recolectado. Esto podra explicarse porque las lluvias generan una mayor cantidad de cuerpos de agua propicios para el desarrollo de las larvas. An. marajoara ss alcanz el valor mximo de abundancia en el mes de septiembre mientras que An. albitarsis F lo alcanz en julio aunque la diferencia de su abundancia entre meses no es tan marcada como la que presenta An. marajoara ss. Aunque se evidencia una diferencia en los picos de abundancia de las dos especies aqu estudiadas, es recomendable confirmar estos resultados mediante el seguimiento de las especies por un periodo ms largo, para poder plantear conclusiones ms generales acerca de las consecuencias que tienen las estaciones de lluvia y sequa sobre la abundancia de An. marajoara ss y An. albitarsis F, particularmente por los cambios en los patrones de pluviosidad debido a la influencia de El Nio-Oscilacin del Sur (ENSO).

Las mayores abundancias de An. marajoara ss y An. albitarsis F se presentaron en los barrios Simn Bolvar y La Esperanza mientras que en los barrios La Florida y Gaitn slo estuvo presente An. marajoara ss. Es posible que el esfuerzo del muestreo realizado en el ao 2009 no haya sido suficiente para encontrar a las dos especies juntas en todas las localidades, lo que tambin pudo ser debido a la baja abundancia de An. albitarsis F (Jimnez et al. 2011). Adems es importante tener en cuenta que en los barrios La Florida y Gaitn slo se hicieron muestreos en los meses secos, es decir cuando la abundancia de anofelinos es menor. Sin embargo y de acuerdo con la distribucin geogrfica de las localidades y los criaderos estudiados es probable que An. marajoara ss y An. albitarsis F se encuentren en forma simptrica en el rea urbana y periurbana de Puerto Carreo, Vichada.

Los resultados de las pruebas de ELISA para determinar la infeccin natural de An. marajoara ss y An. albitarsis F con parsitos del gnero Plasmodium demostraron que tres hembras An. marajoara ss estaban infectadas con P. falciparum. Dos de estas hembras fueron recolectadas en el barrio La Primavera en ambientes intradomiciliarios entre las 18 y 19 h es decir cuando se presenta el pico de abundancia de An. marajoara, una en el mes de marzo, que es seco y la otra en septiembre (Jimenez et al.. 2011). Esto indica dos cosas: la primera es que aun en los meses secos existe la probabilidad de transmisin de la malaria y la segunda es que se puede contraer la enfermedad en el interior de las casas, por eso el control vectorial debe aplicarse all mediante el uso de toldillos impregnados con insecticidas como lo ha recomendado la OMS. La tercera hembra infectada fue recolectada en el Barrio Simn Bolvar en el

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mes de septiembre en el peridomicilio entre las 19 y 20 h (Jimnez et al. 2011). Estos hallazgos reafirman que en muchas reas la intensidad de la transmisin alcanza los valores ms altos durante la estacin lluviosa o inmediatamente despus (Nota descriptiva No. 94 de la OMS). An. albitarsis F se encuentra presente en estas localidades en las mismas horas pero con una baja abundancia (entre 5 y 9 veces menor para las diferentes horas y localidades), esto implica que es posible que no se hayan encontrado ejemplares de An. Albitarsis F infectados debido a su baja abundancia pero no hay que descartar la posibilidad de que puedan desempear un papel en la epidemiologa de la malaria en la zona urbana de Puerto Carreo, Vichada.

No fue posible determinar todos los ejemplares evaluados con gen white. Tres de los individuos generaron un producto de amplificacin particular pues fue de un tamao diferente a los esperados. Es posible que esto se deba a algn error en la interpretacin de las fotografas de los geles por una mala posicin en el transiluminador, por eso se recomienda realizar nuevamente amplificacin y visualizacin para estos ejemplares. Tambin puede que haya habido un error en la determinacin taxonmica morfolgica, entonces se deben revisar los voucher de pata posterior y ala para confirmarla. Sin embargo, puede darse la posibilidad de encontrar hbridos en la naturaleza, si realmente An marajoara ss y An, albitarsis F constituyen entidades biolgicas diferentes. De ser as, se tendran productos de amplificacin no esperados para cada una de estas especies estudiadas.

Los 25 ejemplares adultos silvestres que no generaron un producto de amplificacin fueron analizados con el espectrofotmetro NanoDrop para evaluar la calidad y cantidad de ADN y de esta manera poder determinar por qu no se obtuvieron productos de PCR. En todas las muestras se encontr una concentracin de ADN por encima de 1,0 ng/l, esto implica que la falta de productos de amplificacin no se debe a una baja concentracin de ADN sino a otros factores como la contaminacin con ARN, protenas, fenol o carbohidratos. Para estas muestras, procesadas con DNeasy Blood & Tissue Kit el mayor problema fue la presencia de compuestos como fenol o polisacridos este fue el caso de 20 muestras, incluyendo los controles positivos. Otro hallazgo fue la contaminacin con protenas que sucedi en 15 muestras que no incluyeron los controles; en tanto que el problema menos frecuente es la presencia de ARN que ocurri en dos muestras que tampoco fueron los controles. Un resultado inesperado fue la generacin de valores negativos para la A230 que pueden deberse a dos factores: el primero es que durante la medicin una fuente de luz externa atraviesa la muestra haciendo parecer que sta absorbe menos luz que el blanco (buffer TE); el segundo es que la muestra contenga otra sustancia adems de la sustancia blanco como etanol, esto es posible si durante la extraccin debido a una manipulacin incorrecta de las columnas quedan residuos de etanol en la muestra, muy seguramente esto es lo que sucedi ya que al repetir las mediciones se obtuvieron de nuevo valores negativos. Estos hallazgos permiten entonces, asegurando que se cuenta con ADN genmico, ajustar los protocolos de PCR para optimizar la amplificacin deseada.

Para las muestras de individuos inmaduros que fueron sometidas al protocolo de extraccin con fenol:cloroformo se encontr una concentracin de ADN por encima de 1,0 ng/l. Sorpresivamente la mayora de las muestras tenan un valor de concentracin por encima de los 200,0 ng/l. El mayor problema hallado con los anlisis en el NanoDrop fue la contaminacin con ARN, presente en diez muestras y en los dos controles. Esto se explica porque no se emple ARNasa durante el protocolo de extraccin de estas muestras. Otro problema fue la contaminacin con polisacridos o fenol presente en dos de las muestras. De todas las muestras analizadas ninguna tuvo problemas de contaminacin

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con protenas. Se cree entonces que la falta de productos de amplificacin se debe a la contaminacin por ARN o a una cantidad exagerada de ADN (Morata et al. 1998). Igualmente, se pueden estandarizar las condiciones de la PCR para lograr la amplificacin de los productos esperados.

Despus de los tratamientos con ARNasa e isopropanol se recuper ADN en la mayora de las muestras de adultos silvestres (21 de 25). Sin embargo no ocurri lo mismo con los ejemplares inmaduros ya que de ninguna de las muestras se recuper ADN. Esto es totalmente inesperado porque como se mencion anteriormente la concentracin de la mayora de las muestras estaba por encima de los 200,0 ng/l. Es necesario amplificar los extractos de ADN que se sometieron a estos protocolos para complementar la informacin que se ha presentado en este estudio.

En cuanto a los ensayos de cpula forzada es necesario decir que no tiene sentido discutir los resultados obtenidos para variables como el tiempo de alimentacin o la edad de la hembra puesto que todos generaron el mismo resultado: la falta total de descendencia. Este hallazgo no es esperado teniendo en cuenta que se emplearon especmenes que han demostrado su capacidad de reproduccin en condiciones controladas y que se puede mantener cra de la especie, la cual es usada como modelo en mltiples estudios con anofelinos. Evidentemente, el fracaso en la obtencin de descendencia se debe a factores metodolgicos. El uso de sustancias anestsicas puede incidir de manera relevante en la respuesta biolgica de las especies ante un estmulo. Se cree que existi una exposicin prolongada de los especmenes al anestsico utilizado (acetato de etilo) que pudo inhibir el xito en la transferencia y/o receptividad del esperma del macho para lograr una descendencia viable.

A pesar de esto y de acuerdo con las experiencias adquiridas en este trabajo se establecieron algunas metodologas para su realizacin. Una de stas es el uso de un estreo-microscopio de luz halgena si se trabaja a una temperatura de 28 C o de luz amarilla si se trabaja a 18 C. En los protocolos consultados no se especifica cmo debe ser el movimiento que se debe hacer con el macho para que ste logre copular a la hembra, aqu se propone que al acercar la terminalia del macho en un ngulo de 90 a la de la hembra se realice un movimiento de vaivn (cosquilleo) en la porcin ms apical de la terminalia femenina; se observ que cuando se realiza esta accin el macho abre los gonocoxitos y gonoestilos y al acercarlo a la terminalia de la hembra ste la aferra con las claspetas y es en este momento cuando se logra levantar al macho y a la hembra unidos. En este trabajo usar acetato de etilo para anestesiar no result por eso se recomienda continuar ensayando con ter ya que se sabe que ha funcionado en otros estudios ya mencionados. De acuerdo a un estudio realizado con insectos del orden Neuroptera, el acetato de etilo no genera una disminucin del tiempo de vida ni de la fertilidad (Loru et al. 2010), esto puede implicar dos cosas la primera es que el acetato de etilo tenga un efecto letal sobre los anofelinos que an no se conoce y la segunda es que se est usando de forma incorrecta con dosis muy altas o sobreexponiendo a los ejemplares.

Para los ensayos de diseccin de espermatecas se han obtenido resultados ambiguos que no estn de acuerdo con la literatura consultada. En Methods in Anopheles Research (2007) se especifica que cuando hay espermatozoides en una espermateca se ven crculos concntricos brillantes al observarla en un microscopio de contraste de fases en campo oscuro. En las espermatecas de las hembras sometidas al protocolo de cpula forzada no se observ tal cosa y en espermatecas de hembras que provenan de la colonia, cuya probabilidad de haber sido copuladas e inseminadas era cierta, tampoco se vio esa caracterstica aunque s se observ un brillo no concntrico en stas. Se requiere entonces

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continuar con estas observaciones de espermatecas de hembras vrgenes y copuladas para ratificar que el brillo que se observa corresponde a espermatozoides almacenados en este rgano.

Aunque no se pudo evaluar la viabilidad de los descendientes generados a partir del protocolo de cpula forzada s se midi el efecto que tienen los cuidados de los estados inmaduros en la viabilidad. Con base en la cuantificacin de los estados del ciclo de vida se evidenci que con la metodologa tradicional el porcentaje de nacimientos es de 29,2 + 9,6 % mientras que para la metodologa sugerida es de 51,4 + 1,7. Para las bandejas en las que se mantienen las larvas se observ que al ser tapadas hermticamente se genera un microambiente ms hmedo (se observaron gotitas de agua condensada en las paredes de las bandejas) as mismo contribuyen a disminuir la probabilidad de que el agua se contamine con microorganismos del medio. De acuerdo a estos resultados tapar hermticamente las bandejas donde se desarrollan las larvas favorece el desarrollo de los huevos e incrementa los nacimientos por lo que es recomendable seguir tapando las bandejas en el cuidado diario de la colonia. El porcentaje de pupacin fue de 80,8 + 10,6 % y de 56,4 + 20,4 % para las metodologas tradicional y sugerida respectivamente. Sin embargo los porcentajes de emergencia fueron para la metodologa tradicional de 24,3 + 21,8 y sugerida de 64,5 + 4,4 es decir, en la metodologa tradicional se obtienen ms pupas pero puede que stas no sean lo suficientemente saludables para continuar con su desarrollo mientras que con la metodologa sugerida la mayora de pupas se desarrollan en imago. Se sabe que las larvas de Anopheles se desarrollan en cuerpos quietos de agua de poca turbidez, por eso es lgico pensar que mientras las condiciones de laboratorio se parezcan ms a las condiciones naturales va a haber una mayor sobrevivencia. Se propone que las bandejas sean limpiadas nicamente cuando el agua est muy turbia o tengan mal olor para mantener lo ms quieto posible el hbitat de las larvas en el laboratorio.

Este documento constituye una gua para un investigador que pretenda realizar cruces dirigidos entre especies hermanas de anofelinos como lo son An. albitarsis F y An. marajoara ss puesto que se presentan los parmetros que deben ser evaluados y los protocolos para evidenciar si existen barreras reproductivas de acuerdo a lo postulado por Haldane.

Conclusiones

Se logr la confirmacin taxonmica de 195 individuos silvestres del Complejo Albitarsis (Diptera: Culicidae) lo que permiti relacionarlos con aspectos de su biologa, herramienta fundamental para comprender aspectos de la epidemiologa de la malaria en Puerto Carreo, Vichada, Colombia.

Se estandarizaron y desarrollaron diversos protolocos para cpula artificial en mosquitos Anopheles de acuerdo con la literatura. Se realizaron ajustes y recomendaciones a los protocolos. Debido a que los mosquitos del complejo Albitarsis no copulan en forma natural en condiciones naturales, esto es fundamental para los anlisis de aislamiento reproductivo entre especies del complejo en condiciones naturales.

Se realizaron sugerencias para la cra en condiciones de laboratorio An. albimanus lo que puede contribuir a mantener en mejores condiciones a la especie y optimizar los ensayos que con sta se llevan a cabo en condiciones controladas.

Se contribuy a la estandarizacin y adecuacin de procedimientos de biologa molecular en insectos en el rea de Genetica de Insectos y Entomologa Molecular del Laboratorio de Entomologa de la Facultad de Agronoma, sede Bogot

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Fuentes de financiacin

Universidad Nacional de Colombia, Vicerrectora de Investigacin, Divisin de Investigacin sede

Bogot Cdigo QuiPu 201010016087

National Institute of Health (NIH), United States of America, financiador del proyecto Malaria

Vectors Biology in Brazil: Genetics & Ecology

Universidad Nacional de Colombia, Proyecto Malaria Vectors Biology in Brazil: Genetics & Ecology

Cdigo QuiPu 201011012197

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