UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD DE OCEONOGRAFÍA, PESQUERÍA Y CIENCIAS ALIMENTARIASESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA ALIMENTARIA

OBSERVACION MICROSCOPICA DE LAS BACTERIAS

Curso: Microbiología general y de alimentosProfesora: Mg. Ing. Nilda Quispe AlvaradoAño: 3° AHorario: 11:20 – 1:00 pmIntegrantes: Carrión Gutiérrez Leonardo

Gamarra Gutiérrez Angel

OBJETIVOS

En esta practica se aprenderán a usar las técnicas microscópicas para observar bacterias y para diferenciarlas morfológica y tintorialmente.

MARCO TEORICOTECNICA DE LA GOTA PENDIENTE

Sirve para determinar la movilidad bacteriana. Se realiza en un cubreobjetos, que lleva la muestra bacteriana en una gota de agua, y un portaobjetos excavado, que lleva la preparación al microscopio.

TECNICAS COLOREADAS

PREPARACION DE UN FROTIS.- Un frotis es una fina capa de células bacterianas que se fija al calor en la superficie de una lamina portaobjetos, que resiste a los embates de un proceso de coloración sin desprenderse y que tiene una concentración adecuada para la observación microscópica de células individuales.

COLORACION GRAM.-La coloración Gram es una coloración diferencial que permite dividir a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas. Las primeras fijan fuertemente el cristal violeta y no lo pierden en un proceso de decoloración con alcohol o con una mezcla de alcohol y acetona, y las segundas no fijan este colorante y lo pierden fácilmente en la decoloración.

1.- Técnica de la gota pendiente:

1.1) Poner puntos de vaselina en las cuatro esquinas de un cubreobjetos.1.2) Depositar una pequeña gota de agua en el centro del cubreobjetos con la ayuda de la aza de koll previamente esterilizada por esterilización a la llama.1.3) Emulsionar en el agua una pequeña porción de la masa bacteriana(Estafilococo Aureus) de un cultivo joven con la ayuda de la aguja de koll previamente esterilizada por esterilización a la llama.1.4) Adherir el cubreobjetos a un portaobjetos excavado, haciendo coincidir el centro de la gota con la parte mas profunda de la depresión.1.5) Invertir la preparación y llevarla al microscopio para su observación.1.6) Observar con el objeto de 40X, en seco, o con el de 100X, de inmersión en aceite.1.7) Considerar como movilidad positiva a los microorganismos que se desplazan rápidamente saliéndose del campo microscópico, y como movilidad negativa o inmóviles, si solamente giran en el mismo lugar.

PARTE EXPERIMENTAL

2) Técnicas coloreadas:

2.1) Preparación de un Frotis2.1.1) Limpiar con un poco de alcohol la parte superior de la lámina portaobjetos2.1.2) Dejarlo secar al aire unos segundos2.1.3) Colocar dos pequeñas gotas de agua estéril sobre la lámina2.1.4) Emulsionar la cepa y extenderla de manera rectangular 2.1.5) Dejarlo secar al aire2.1.6) Secarlo a calor suave, pasando la lámina por la llama del mechero unas cuatro veces

2.2) Coloración Gram2.2.1) Agregar cristal violeta al frotis durante 1 minuto2.2.2) Luego lavarlo con agua corriente2.2.3) Agregar lugol al frotis durante 1 minuto2.2.4) Lavarlo con agua corriente2.2.5) Agregar alcohol acetona durante 30 segundos2.2.6) Luego lavarlo con agua corriente2.2.7) Agregar safranina durante 30 segundos2.2.8) Luego lavarlo con agua corriente2.2.9) Secarlo a temperatura ambiente o con ayuda de la llama débil del mechero y finalmente observarlo en el microscopio con el objetivo de inmersión

RESULTADOS

Los microorganismos que se tiñen de color violeta reciben el nombre de gram-positivos, mientras que los microorganismo que se tiñen de color rojo, reciben el nombre de gram-negativos.• S. aureus (gota pendiente positiva) (forma: Bacilo) (color violeta) 

• B. Subtilis (gram positivo) (forma: Bacilo) (color violeta)

• E. coli (gram negativo) (forma: Bacilo) (color rojo rosado)

• Salmonella (gota pendiente positiva) (forma: Bacilo) (color violeta)

• Levadura (gram positiva) (color violeta)

CONCLUSIONES

• Se determino a través del método de la gota pendiente la movilidad de los microorganismos para determinar si son positivas o negativas + si se desplaza rápidamente saliéndose del campo microscópico.- si solamente gira en un mismo lugar.

• Se determino a través de la coloración por preparación de frotis y coloración Gram, luego de llevar el frotis por la coloración Gram, si se tiñen de violetas son Gram positivas y si se tiñen de rojo son Gram negativas.

• Según: (Davis, B. D. 1983) Coloración Gram. En esta técnica, el preparado fijado por calor se trata primeramente con cristal violeta, luego se agrega lugol como mordiente, se decolora con alcohol-acetona y finalmente se contracolorea con fucsina o safranina. Las bacterias Gram(+) serán las que resulten violeta luego del procedimiento de coloración de Gram, mientras que las Gram(-) se verán rojas.

Este fundamento coincide con los pasos realizados en el laboratorio.

DISCUSIONES

• Según (Geneser, F. 1986) La explicación de las diferencias

del comportamiento tintorial entre bacterias G(+) y G(-), debe buscarse en la estructura y composición de la pared celular bacteriana. La pared de las bacterias Gram (+) está constituída fundamentalmente por una gruesa capa de peptidoglicano (20-30nm), que es un polímero de N-acetil glucosamina y ácido N-acetil murámico. Las cadenas de peptidoglicano, se unen a través de puentes formados por aminoácidos, en arreglos que varían de una especie bacteriana a otra. En las bacterias Gram (-), la capa de peptidoglicano es mucho más delgada (3-5nm) y poseen una membrana externa de estructura compleja en cuya composición intervienen fosfolípidos, proteínas y lipopolisacáridos. 

Este fundamento coincide con el autor porque las diferencia del comportamiento del color se deben de buscar en la composición de la pared celular bacteriana.

Quevedo Fernando : Microbiología , general , Practica de laboratorio ,UNFV , lima –Perú (1967).

Mendo R. Manuel: Medios de cultivo en microbiología ,Ediciones laborales SRL ,Lima-Perú,, quina edición : 2013

Geneser, F. 1986. Histología. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires http://www.biol.unlp.edu.ar/microbiologiagral/materialdidactico01-2011.doc

BIBLIOGRAFIA