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TRABAJO PRÁCTICO N° 2•MEDIOS DE CULTIVO• SIEMBRA Y TRANSPLANTE
MEDIOS DE CULTIVO.
• Definición: es toda preparación artificial, sólida,semisólida o líquida que suministra al microorganismocada una de las sustancias fundamentales, una fuentede energía y condiciones ambientales adecuadas parael desarrollo y la supervivencia del microorganismo.
• CULTIVOS: son las poblaciones de microorganismos que se obtienen en los medios de cultivo.
• Los cultivos pueden ser:
• a) puros o axénicos
• b) mixtos
Existe gran diversidad de condiciones químicas y físicas en las cuales puede ocurrir el crecimiento
microbiano, pero siempre se requieren una fuente de energía y una fuente de carbono
Un solo tipo de microorganismo
Varios tipos de microorganismo
Todos los organismos requieren una fuente de energía para obtener ATP y generar poder reductor (NADH, NADPH) por alguno de los siguientes metabolismos:
- fotosíntesis
- respiración aerobia: aceptor final de electrones O2
- respiración anaerobia: aceptores finales de electrones: NO3, SO4, CO2, fumarato.
- fermentación: conjunto de reacciones donde compuestos orgánicos sirven como donadores y aceptores de electrones. Se produce ATP por fosforilación a nivel de sustrato.
Clasificación de Microorganismo según su fuente de energía y fuente de carbono
Composición de los medios de cultivos
• 1. Elementos energéticos y constitutivos
a) Macro elementos
b) Micro elementos o trazas
c) Factores de crecimiento
• 2. Agua
• 3. Agentes solidificantés:
1. Elementos energéticos y constitutivosa) Macro elementos
Fuente de Carbono
Fuente de nitrógeno
CO2 para autótrofos,
azúcares para heterotrofos
“Se necesita el carbono para la construcción de muchas moléculas necesarias para la célula”
“El nitrógeno es metabolizado para proveer proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de pared”
NO3-, NH3 ó N2. (autótrofos)
Aminoácidos y proteínas
1. Elementos energéticos y constitutivosa) Macro elementos
Azufre
calcio, magnesio y potasio
sodio
Producir aminoácidos (cisteína ymetionina) y diferentes coenzimas
SO42-, tiosulfatoo sulfuro
Fuente de: Se adiciona como: La célula lo utiliza para:
Fósforo Fosfatos de sódioo potasio
Funciona como BufferPara producción de ATP, fosfolipidos y Ac Nucleicos
sales inorgánicas Co factores de enzimas
Na ClEstabiliza la
presión osmótica
1. Elementos energéticos y constitutivosb) Micro elementos o trazas
Son metales que se requieren en muy pequeñas cantidades. Participan en la estructura delas enzimas, vitaminas, transportadores de electrones como citocromos. Soncontaminantes de los macroelementos y se incorporan junto a ellos en los medios decultivo.
Frecuentemente esenciales:
Cr, Co, Cu, Mn, Mo, Ni, Se, W, V, Zn
Inhibidores del crecimiento:
Au, Ag, Cd, Cr, Pb, y cualquier microelemento a concentración mayor
que 10-4 M puede resultar tóxico para el desarrollo de los microorganismos.
1. Elementos energéticos y constitutivosb) Factores de Crecimiento
Son compuestos orgánicos específicos requeridos en muy bajas
concentraciones y que no pueden ser sintetizados por la célula
Si la secuencia de producción enzimática, de un determinado componente.
(Por ej: Histidina) esta interrumpida por alguna alteración, este componente no
podrá sintetizarse por la célula y se convertirá en un factor de crecimiento.
Ejemplos de factores de crecimiento : vitaminas, como las del
complejo B algunos aminoácidos ,purinas y pirimidinas
2. Agua
•El agua representa el 80-90% del peso
total de una célula
•Es fundamental para la realización de
todos los procesos metabólicos
•Funciones enzimáticas, solvatación
de materiales orgánicos e inorgánicos,
y donación de electrones para
organismos fotosintéticos
En los medios de cultivo se usa agua destilada,
libre de iones como Ca2+ y Mg2+
3. Agentes solidificantés
Cuando se agregan a un medio de cultivo permiten aislar
colonias bacterianas. El mas utilizado es el Agar. Su uso es opcional
Placa de petri
Se adiciona el
medio de cultivo
con agar fundido
El agar se enfría
y se solidifica
Permite aislar
Colonias bacterianas
El Agar es un polisacárido ácido derivado de algas marinas, formado principalmente por galactosa con un grupo sulfato.
Se usa sin problemas en medios de cultivoporque las bacterias NO lo digieren.
Sus características:
-Funde a 80-100°C y permanece líquido hasta 50-55°C.
- Permanece sólido a 37°C, temperatura de incubación de la mayoría de las
bacterias patógenas del hombre.
-No es tóxico para las bacterias
-Utilizado al 1.5-2%, permite el aislamiento de colonias (poblaciones de
microorganismos derivadas de una única célula), lo que resulta imposible en
medios líquidos!!
-Para medios semisólidos (donde observo movilidad) empleo 0,2-0,3% de agar
- Es transparente, lo que facilita la visualización de las colonias.
Condiciones Físicas de un medio de cultivo
Temperatura
Presencia
de oxígeno
a) aerobios estrictas: requieren oxígeno para crecer.
b) anaerobios obligados: el O2 les resulta tóxico.
c) anaerobios facultativos: pueden crecer tanto en
condiciones aerobias como en condiciones anaerobias.
d) microaerófilos: necesitan bajas tensiones de O2 y una
atm enriquecida en CO2.
e) anaerobios aerotolerantes: crecen en ausencia de O2
y si son expuestos al O2 no mueren.
mesófilos: 35-37°C
psicrófilos: 15-20°C
termófilos: 50-60°C
presión osmótica
Humedad:
luz:
pH:
la mayoría de las bacterias crece en 0.1 a 1% NaCl
es importante para los microorganismos fotosintéticos
Los microorganismos necesitan un ambiente húmedo para su desarrollo
la mayoría de las bacterias crece en medio neutro o levemente alcalino
CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Por su origen
químicamente definidos
o sintéticos
naturales o complejos
Su composición química se
conoce con exactitud, cada
componente es de alta pureza
analítica y realiza un aporte
específico ej: medios para
autotrofos
Se preparan a partir de sustancias
naturales de origen animal o vegetal
de composición química no
rigurosamente constante: leche,
suero, macerado de maíz,etc
Ej: medios para quimioheterotrofos
Ej. Medio Definido o sintético; (para
fototrofos):
CO2 ……………………….. (fuente de C)
NaNO3 …………………… (fuente de N)
Na2SO4 ……………………. (fuente de S y Na)
KH2PO4 ……………………. (fuente de P y K)
Trazas ……………………… varias
H2O ………………………… (indispensable para
toda función celular)
Conjunto de sales,
Especificas Para un
determinado
tipo de
microorganismo
Ej- agar nutritivo, medio natural o
complejo; (para bacterias
quimioorganotrofas):
Peptona de carne ………….. 0.5 g
Extracto de carne ………….. 0.3 g
NaCl ………………………… 0.5 g
Agar ……………………… 1.5 – 2 g
Agua destilada ……………. 100 ml
Aditivos que no tienen una
Composición nutritiva definida
PEPTONAS: son producto de la hidrólisis ácida o
enzimática de proteínas de origen animal o
vegetal (ej. peptona de carne, peptona de soja,
peptona de caseína).
EXTRACTO DE CARNE: su función es ser
complemento vitamínico de las peptonas. Pero también
aporta: Sustancias nitrogenadas como: aminoácidos,
bases púricas y pirimídicas, ácidos orgánicos, creatina,
xantina, hipoxantina, ácido úrico, urea. Sustancias no
nitrogenadas como glucógeno, fosfatos de hexosas,
ácido láctico, sales inorgánicas.
CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Por su Consistencia
Líquidos sólidos semisólidos o blandos
No contienen
solidificante
y no permiten
el aislamiento
de colonias
incluye agar
al 0.3%
Incluyen agar en
concentraciones
de 1.5 a 2%
CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Por su Composición
Comunes Enriquecidos
incluyen una fórmula
nutritiva básica que
permite el crecimiento
de microorganismos
poco exigentes.
Tienen una alta calidad
nutritiva por el agregado
de componentes muy
ricos como leche, sangre,
huevo líquido, etc. Se
utilizan en el cultivo de
bacterias exigentes
Ej.
- comunes: AGAR NUTRITIVO
-peptona de carne
-extracto de carne
-NaCl
-agar 2%
-agua destilada
- enriquecidos: AGAR SANGRE
CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Por su función:
Medios de
enriquecimiento:
Medios Líqudos sembrados
con poblaciones mixtas de
microorganismos, favorecen
la multiplicación de ciertos
grupos e inhiben el
desarrollo de las especies
restantes.
Medios selectivos Medios diferenciales
son medios sólidos
que favorecen
la multiplicación
de un determinado
microorganismo e inhibe el
desarrollo de otrosSe logran agregando comp qcos
(Ab) o alterando las condiciones
fcas (pH).
permiten discriminar entre
diferentes tipos de bacterias
basándose en características
metabólicas particulares
de cada uno.Se logran agregando determinados
sustratos (Ej glucosa) y un sistema
indicador (Ej Rojo fenol)
Ej.
- de enriquecimiento (líq.) - selectivos (sólidos)
Caldo Mac Conkey(inhibidor + lactosa +
púrpura de bromocresol Agar Mac Conkey(inhibidor + lactosa + rojo
neutro)
Ej.
-diferencial
Agar triple azúcar hierro (TSI)
Enterobacter
Shigella
Proteus
Pseudomonas
Fermentación de: -glucosa ?; -sacarosa ?; -lactosa ?
Producción de H2S ?
El medio incluye los 3 azúcares, sal de Fe2+ y un indicador
de pH (rojo neutro)
Ej.
De transporte: medio de Stuart
medio de Cary Blair
Contiene buffer + sustancias criopresevantes (glicerol)
Control pH. Ajuste con NaOH o HCL-Cintas de pH
-Azul de bromotimol
-pHmetro
Esterilización de los medios de cultivo-Autoclave
Control de Esterilidad-Se toma una parte representativa de los medios y se incuban en estufa de cultivo a 37ºC
Medios de Transporte -Ej Medio de Stuart
Conservación de los medios de cultivo-4-10º C en refrigerador
PARTE B: SIEMBRAS Y REPIQUES
Siembra: se entiende por siembra al acto de transferir o colocar un
microorganismo en un medio de cultivo adecuado. La transferencia se
efectúa desde el hábitat natural (nicho ecológico) al medio de cultivo.
Medio de cultivoMuestras
Trasplante o repique: es la transferencia de gérmenes desde un
medio de cultivo a otro.
¿Con qué se siembra?
Ansas en anillo
y un ansa recta
Siembra en placa
con medio solido
Crecimiento de
Colonias bacterianas
Espátula de
Drigalski
¿Con qué se siembra?
Siembra
Crecimiento de
Colonias bacterianas
Micropipeta o
Pipeta pasteur
Micropipeta Pipeta pasteur
Técnica aséptica para siembras y repiques
A- se esteriliza el ansa a la llama
B- se sostiene el ansa con el índice
. Luego con el meñique .
se destapa el tubo de muestra .
La "Técnica aséptica" tiene un doble objetivo:
a) evitar que el operador se contamine con microorganismos procedentes
de las muestras o cultivos y
b) evitar la contaminación de las muestras y cultivos con microorganismos
procedentes del ambiente o del propio operador
E- se flamea el tubo, para
Evitar su contaminación
F- se tapa con el dedo meñique
C. Se flamea la boca para evitar
Contaminación
D- se sumerge el ansa para tomar
Un inoculo del tubo