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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica
Trabalho de Conclusão de Curso
Aplicação de modelagem matemática na cinética de
crescimento de Pediococcus pentosaceus em agitador
metabólico
Trabalho de Conclusão do Curso de Farmácia-Bioquímica da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo.
Aluno: Bernardo Salustio Pires
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Pinheiro de Souza Oliveira (FBT/FCF/USP)
Universidade de São Paulo
Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF/USP)
Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica (FBT/FCF/USP)
São Paulo - SP
Abril - 2018
SUMÁRIO
1. RESUMO ................................................................................................................................................. 3
2. LISTA DE ABREVIAÇÕES ........................................................................................................................... 4
3. INTRODUÇÃO .......................................................................................................................................... 5
3.1. BACTÉRIAS LÁTICAS E FERMENTAÇÃO ................................................................................................ 5
3.2. PEDIOCOCCUS SPP. ........................................................................................................................... 11
3.3. INULINA E PREBIÓTICOS ................................................................................................................... 12
3.4. MODELOS DE CRESCIMENTO ............................................................................................................ 14
3.4.1. LATÊNCIA (𝒕𝑳𝑨𝑮 OU Λ) ..................................................................................................................... 18
3.4.2. TAXA MÁXIMA DE CRESCIMENTO (µ𝒎𝒂𝒙) ....................................................................................... 19
3.4.3. CRESCIMENTO MÁXIMO (𝑵𝒎𝒂𝒙) ..................................................................................................... 20
4. OBJETIVOS ............................................................................................................................................ 21
4.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................................... 21
5. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................................... 22
5.1. PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL ...................................................................................................... 22
5.2. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ...................................................................................................... 22
5.2.1. CULTURAS MICROBIANAS ................................................................................................................ 22
5.2.2. ANÁLISE EXPERIMENTAL .................................................................................................................. 23
5.2.2.1. CURVA DE CRESCIMENTO CELULAR .............................................................................................. 23
5.2.2.2. MONITORAMENTO DE PH ............................................................................................................ 23
5.2.2.3. DETERMINAÇÃO DE AÇÚCARES E ÁCIDO LÁTICO .......................................................................... 23
5.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA ....................................................................................................................... 24
5.3.1. MODELO DE GOMPERTZ ................................................................................................................... 24
5.3.2. MODELO DE PRESSER ....................................................................................................................... 24
5.3.3. MODELO DE RATKOWSKY ................................................................................................................. 25
6. RESULTADOS ......................................................................................................................................... 26
6.1. ANÁLISE DA DINÂMICA DE CRESCIMENTO MICROBIANO ................................................................. 33
6.2. ANÁLISE DOS FATORES DE INFLUÊNCIA NO CRESCIMENTO MICROBIANO ........................................ 37
7. CONCLUSÕES ........................................................................................................................................ 49
8. REFERÊNCIAS ........................................................................................................................................ 50
ANEXO ........................................................................................................................................................... 58
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
3
1. RESUMO
Devido a sua grande importância na indústria alimentícia e na saúde, o
entendimento de crescimento das bactérias lácticas se torna cada vez mais importante
e estudado. Este estudo utilizou de modelos matemáticos como Gompertz, Ratkowsky
e Presser para analisar condições de cultivo e cinética de crescimento de Pediococcus
pentosaceus Mees (ATCC 43200) em cultivo em caldo MRS (de Man, Rogosa e
Sharpe) em diferentes condições de pH inicial, temperatura, agitação e concentração
de inulina. Com base nas curvas de crescimento de cada cultivo, os valores de latência
(tLAG) e taxa de crescimento (µmax) foram calculados usando de regressão linear.
A cinética de crescimento de P.pentosaceus não pôde ser analisada segundo
o modelo de Gompertz devido a limitações no experimentos, no entanto os cultivos
em condições de 0% de inulina, 100rpm e 30oC se mostraram os com melhores
resultados, sendo que o cultivo a pH = 6,5 obteve a menor latência (4,05h) e maior
produção de lactato (10,40g/L), enquanto o cultivo a pH = 5,0 obteve a maior biomassa
(2,26g/L) e menor pH (3,55) a 48h. Análises de regressão mostraram que a produção
de biomassa e lactato tinham máximo próximo a pH = 5,5 , enquanto que µmax e
latência tinham condições ideais em maiores faixas de pH (estudo até pH = 6,5),
condizendo com o modelo de Presser que prediz maior µmax em pH próximo a 6,0. A
agitação também se mostrou diretamente proporcional aos valores de µmax
encontrados, no entanto temperatura e concentração de inulina não tiveram grandes
resultados observados. O modelo de Ratkowsy, entretanto, sugere que o crescimento
seria ideal próximo a 35oC. Deste modo, o fator de maior impacto sobre o cultivo de
P.pentosaceus é o pH inicial, por afetar diretamente na biomassa, consumo de
glicose, produção de lactato, latência e µmax.
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
4
2. LISTA DE ABREVIAÇÕES
• LAB = lactic acid bacteria (bactérias ácido-láticas)
• Lag = latência
• µ = Taxa de crescimento
• umax = Taxa máxima de crescimento
• tLAG = Tempo de latência
• N = População microbiana (em g ou UFC)
• Nmax = População máxima microbiana (em g ou UFC)
• No = População inicial microbiana (em g ou UFC)
• MRS = meio de cultura artificial de Man, Rogosa e Sharpe
• UFC = Unidades formadoras de colônia
• DO = Densidade óptica
• tinf = tempo de inflexão sigmoide
• rpm = rotações por minuto
• R2 = Coeficiente de determinação da regressão
• R2 adj = Coeficiente de determinação da regressão ajustado
• R2 pred = Coeficiente de determinação da regressão previsto
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
5
3. INTRODUÇÃO
As bactérias ácido-láticas (LABs) possuem histórica importância para o ser
humano, sendo conhecidas em alimentos fermentados desde tempos antigos. As
primeiras associações de LABs com fermentações tradicionais foram descritas a mais
de 100 anos com a cepa agora denominada de Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus (DOUILLARD; DE VOS, 2014). Atualmente, o uso de LABs na fermentação
industrial representa uma indústria bilionária de queijos, iogurtes e muitos produtos
atuais, além de importância na saúde e nutrição humana, levando a grande interesse
no estudo das funções, fisiologia e cinética destas (MARKETSANDMARKETS.COM,
2016)
3.1. Bactérias láticas e fermentação
As bactérias láticas são um grande grupo de bactérias muito estudadas pela
sua função na fermentação de alimentos. Através de diversos estudos
transcripcionais, proteômicos e metabólicos feitos para entender o crescimento e
função das LABs, sabe-se atualmente que estas são um grupo geneticamente
relacionado, como mostrado na figura 1, onde estas são organizadas
filogeneticamente com base em 7 genes de housekeeping (recA, rpoD, dnaK, infC,
rplA, rpsB e rpmA).
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
6
Figura 1. Árvore filogenética baseada em 7 genes de housekeeping (recA, rpoD, dnaK, infC, rplA, rpsB e rpmA) de 38 espécies de LABs. As espécies foram coloridas de acordo com seu gênero (roxo: Leuconostoc spp.; amarelo: Lactobacillus spp.; azul: Pediococcus spp.; verde: Lactococcus spp.; rosa: Streptococcus spp.; laranja: Enterococcus spp.; cinza: Oenococcus spp.). Adicionalmente, foram usados círculos coloridos pra ilustrar nichos onde estes podem ser isolados (verde escuro: vegetais; verde: produtos alimentícios; laranja: cavidade oral; roxo: trato gastrointestinal; magenta: cavidade vaginal; azul: outros locais do corpo e isolados clínicos). FONTE: (DOUILLARD; DE VOS, 2014).
As bactérias ácido-láticas (LABs) ocupam um papel central nos processos
fermentativos, com um longo e seguro histórico de aplicação e consumo em alimentos
e bebidas fermentadas (CAPLICE; FITZGERALD, 1999). O importante papel das
bactérias ácido-láticas, do ponto de vista tecnológico, é ilustrado pela produção de
biomoléculas de alto valor agregado durante o processo fermentativo, produzindo
ácido lático como maior bioproduto do metabolismo, causando assim rápida
acidificação do material cru. Além disso, algumas culturas láticas produzem ácido
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
7
acético, ácido málico, etanol, aromas (diacetil e acetoína), bacteriocinas,
exopolissacarídeos e importantes enzimas (proteases), aumentando assim, o tempo
de prateleira e segurança microbiológica do produto fermentado, além de levar a
melhorias na textura e contribuir para o perfil sensorial agradável do produto final
contribuindo no aroma e sabor dos produtos fermentados. (LEROY; DE VUYST, 2004;
MAYO et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2011; SMIT; SMIT; ENGELS, 2005; WILLIAMS;
NOBLE; BANKS, 2001; YVON; RIJNEN, 2001).
Inicialmente, a produção de alimentos fermentados era feita com base na
fermentação espontânea, ou seja, devido ao desenvolvimento da microbiota
naturalmente presente no material cru. A qualidade do produto final não era
consistente por depender da carga microbiana e espectro desta inicialmente presente
no material cru. A direta adição de starter culture, preparações microbianas com
grande quantidade de células conhecidas a serem adicionadas ao material cru de
modo a acelerar e controlar o processo fermentativo, levou a um avanço no
processamento de alimentos e bebidas fermentadas, por permitir um maior controle e
padronização do processo e do produto final (LEROY; DE VUYST, 2004).
Atualmente, a maioria das bactérias láticas probióticas é utilizada na
formulação de bioprodutos como iogurtes, leites fermentados, sorvetes e produtos
farmacêuticos visando promover efeitos positivos à saúde e prevenção de doenças
(MATTILA-SANDHOLM et al., 2002).
Embora LABs homofermentativas, como P. pentosaceus, convertam a fonte
energética (açúcar) disponível quase completamente em ácido lático através da
redução do piruvato produzido na glicólise, este pode levar a geração de diversos
outros metabólitos, como acetato, etanol, diacetil e acetaldeído. E assim, LABs
produzem diversas substâncias voláteis que levam ao sabor e aroma característicos
de produtos fermentados como massa azeda (determinada pelo balanço
lactato/acetato), kefir ou koumiss (etanol) e manteiga ou coalhada (diacetil)
(KLEEREBEZEMAB; HOLS; HUGENHOLTZ, 2000).
Além disso, polímeros de açúcar produzidos in situ por LABs
(exopolissacarídeos) estão sendo explorados como modificadores de textura naturais
em iogurtes (DE VUYST et al., 2001; DE VUYST; DEGEEST, 1999), sorvetes
(CHRISTIANSEN; MADEIRA; EDELSTEN, 1999), sour cream (DUBOC; MOLLET,
2001) e queijo mussarela low-fat (BROADBENT et al., 2001; LOW et al., 1998). Estes
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
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polissacarídeos aumentam a viscosidade e firmeza do produto, além de reduzir a
sinérese e contribuir para a textura em produtos de baixo teor de gordura, estando
assim sob investigação para implementação industrial em produtos fermentados (DE
VUYST et al., 2001; DE VUYST; DEGEEST, 1999; MARSHALL et al., 2001).
Ao mesmo tempo, a atividade antimicrobiana demonstrada por LABs está
sendo estudada como alternativa ao uso de aditivos alimentícios químicos como
nitritos, sulfitos, ácido propiônico, ácido sórbico e ácido benzoico, comumente
utilizados na preservação de alimentos (SMITH, 1993), para combater a contaminação
e crescimento microbiano no produto final (HOLZAPFEL; GEISEN; SCHILLINGER,
1995; LÜCKE, 2000). Isso é de especial importância pois, embora conservantes sejam
necessários para preservar produtos alimentícios de estragar e preservar suas
características organolépticas (LAW, 2001) o uso de aditivos alimentares é
considerado inseguro e não natural por consumidores atualmente (Ray, 1992).
As LABs conseguem fazer esse papel através da produção de antimicrobianos
naturais, como ácidos orgânicos (ácido lático, ácido acético, ácido fórmico e ácido
capróico), gás carbônico, peróxido de hidrogênio, diacetil, etanol, reuterina,
reutericiclina e bacteriocinas (BALCIUNAS et al., 2013; MESSENS; DE VUYST,
2002).
Bacteriocinas, em especial, são proteínas ou peptídeos de baixa massa
molecular com ação antimicrobiana restrita a bactérias Gram-positivas relacionadas.
O uso de LABs produtoras de bacteriocinas na preservação de produtos alimentícios
leva, portanto, a uma vantagem tecnológica (CLEVELAND et al., 2001; NETTLES;
BAREFOOT, 1993; OLIVEIRA et al., 2012; VUYST; VANDAMME, 1994) já que a
produção in situ de bacteriocinas aumenta a competitividade das cepas presentes na
matriz do produto alimentício, contribuindo assim para a prevenção da contaminação
deste (HUGAS et al., 1995; ROSS et al., 2000; RUIZ-BARBA et al., 1994; VOGEL et
al., 1993). LABs produtoras de bacteriocina podem ser aplicadas como uma
alternativa ao uso de nitrato de potássio na prevenção da contaminação por
Clostridium em queijos, por exemplo (DELVES-BROUGHTON, 2005; NAIDU, 2000).
Estas também podem ser usadas na supressão de contaminantes que modificam o
sabor, como por exemplo, de certas cepas de L. lactis em produtos lácteos (Stanley,
1998). Além disso, bacteriocinas são ativas contra patógenos transmitidos pelos
alimentos como Clostridium botulinum, Staphylococccus aureus e Listeria
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
9
monocytogenes (NETTLES; BAREFOOT, 1993). O uso de LABs produtoras de
bacteriocinas como culturas starter para estes fins já foi documentada em salsichas
fermentadas (CALLEWAERT; HUGAS; VUYST, 2000; FOEGEDING et al., 1992;
HUGAS et al., 1995; VOGEL et al., 1993), olivas e vegetais fermentados (HARRIS,
1998; HARRIS; FLEMING; KLAENHAMMER, 1992; RUIZ-BARBA et al., 1994) e
produtos lácteos (BENKERROUM et al., 2002; BUYONG; KOK; LUCHANSKY, 1998;
FOULQUIÉ MORENO et al., 2003; GIRAFFA, 1995; MAISNIER-PATIN et al., 1992;
MCAULIFFE; HILL; ROSS, 1999; ROBERTS; ZOTTOLA; MCKAY, 1992;
RODRÍGUEZ et al., 1998).
Atualmente, consumidores prestam grande atenção na relação entre dieta e
saúde. Consequentemente, o mercado de alimentos com propriedades promotoras de
saúde, chamados de alimentos funcionais, tem demonstrado um grande crescimento
nos últimos anos. Nutracêuticos estão no centro desse movimento, por serem
componentes que contribuem para a saúde do consumidor através de ações
fisiológicas (ANDLAUER, W. AND FÜRST; ANDLAUER; FÜRST, 2002). Através de
seleção e otimização de processo, a atividade das LABs pode ser modificada para
aumentar o conteúdo de nutracêuticos em produtos alimentícios fermentados. Um
exemplo é o uso de LABs com alta produção de polióis, reduzindo assim o conteúdo
de açúcar e conteúdo calórico de produtos lácteos sem perda do sabor (WISSELINK
et al., 2002).
A ação fermentativa de certas cepas de LABs também pode levar a remoção
de fatores tóxicos ou antinutritivos, como lactose e galactose, tendo utilidade na
prevenção de eventos de intolerância a lactose ou acúmulo de galactose (WOUTERS
et al., 2002), rafinose, estaquiose e verbacose para prevenção de flatulência e dores
intestinais (HOLZAPFEL, 1997; SCALABRINI et al., 1998), taninos e ácido fítico para
aumentar biodisponibilidade de minerais (HOLZAPFEL, 1997; SHARMA; KAPOOR,
1996), e glucosídeos cianogênicos ou aminas biogênicas, para diminuir toxicidade
natural de certos alimentos como mandioca (HOLZAPFEL, 2002).
No entanto, as LABs possuem maior importância do que apenas na produção
de alimentos fermentados. Assim como em muitas plantas e animais, o corpo humano
é colonizado por LABs e estudos de culturas documentam a presença destes em
diversas partes do corpo.
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
10
A colonização das LABs no corpo humano é bem estabelecida e estudos
filogenéticos e metagenômicos identificaram LABs em diversas regiões, como pele,
cavidade oral, trato gastro-intestinal e cavidade vaginal (DAL BELLO et al., 2003;
HEILIG et al., 2002; QIN et al., 2010; VAUGHAN et al., 2002; WALTER, 2008), embora
sua quantidade varie consideravelmente (Figura 2).
Figura 2. Mapa com locais de encontro de LABs no corpo, assim como a fração estimada destas dentro a população local. A fração estimada de LABs é baseada em estudos filogenéticos e metagenomicos. O número total de bactérias (por g) é baseado em tecidos homogeneizados, fluido isolado ou centímetro quadrado de pele. FONTE: (DOUILLARD; DE VOS, 2014).
Em geral, LABs são consideradas seguras e muitas espécies estão nas listas
de Qualified Presumed Safety (QPS) da European Food Safety Authority e Generally
Regarded as Safe (GRAS) da US Food and Drug Administration, à excessão de
Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium, espécies que emergiram como causas
de infecção resistente a antibióticos do sangue, trato urinário e feridas cirúrgicas
(GILMORE et al., 2014) embora sejam usadas como starters em vários alimentos
fermentados, assim como comercializados como probióticos. O amadurecimento de
queijos, linguiças e azeitonas são exemplos de usos desse gênero nos alimentos.
(FOULQUIÉ MORENO et al., 2006).
No campo terapêutico, as bactérias láticas têm sido descritas por muitos
pesquisadores e suas aplicações podem ser resumidas como: aumento da modulação
imune e prevenção de certas doenças ou alterações em humanos como, por exemplo,
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
11
diarreias, má digestão de lactose, doenças inflamatórias intestinais, síndrome do
intestino irritado, constipação, crescimento desordenado de bactérias intestinais,
câncer de bexiga, câncer cervical, alergias, colesterol, pressão sanguínea, doenças
coronárias, infecção no trato urinário, trato respiratório superior e infecções
relacionadas (FRESE et al., 2013; HOLZAPFEL et al., 1998; MATTILA-SANDHOLM;
MÄTTÖ; SAARELA, 1999; O’SHEA et al., 2012; OUWEHAND et al., 2003;
PETSCHOW et al., 2013; SAXELIN et al., 2005).
3.2. Pediococcus spp.
As bactérias do gênero Pediococcus são Gram-positivas, homofermentativas,
sem motilidade ou capacidade esporulativa, cocos anaeróbicos facultativos de
diâmetro entre 0.6 e 1.0mm, usualmente organizados em quartetos. Podem ser
isolados de uma grande variedade de plantas e de queijos maduros e têm sido
largamente usados na fermentação de vegetais, carnes, ensilagem e produção de
queijos (PORTO et al., 2017).
P. pentosaceus consegue crescer em condições de pH entre 4.5 e 8.0 com pH
ideal em 5.5, tipicamente a temperaturas próximas a 40oC mas não 50oC e 9-10% de
NaCl. São bactérias capazes de hidrolisar arginina e utilizar maltose como fonte
energética (CAI et al., 1999; COSTER; WHITE, 1964; FRANZ et al., 2014).
A única via fermentativa de bactérias homofermentativas como P. pentosaceus
é a de Embden-Meyerhof-Parnas (figura 3), através do qual glicose é clivada para
formação de lactato (figura 4), sendo que os Pediococcus em especial tem predileção
no uso de glicose como fonte energética e de carbono (DE SOUZA DE AZEVEDO et
al., 2017).
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
12
Figura 3. Representação da glicólise através da via Embden-Meyerhof-Parnas, com grupos participantes de cada reação realçados. FONTE: (SHAFEE, 2015)
Figura 4. Representação da formação de lactato a partir de piruvato proveniente da glicólise. FONTE: (AHERN, 2017)
LABs do gênero Pediococcus também têm sido estudadas pela capacidade de
produção de bacteriocinas, conhecidas por pediocinas.
3.3. Inulina e prebióticos
A fim de aumentar esses efeitos terapêuticos tem sido estudada a capacidade
das bactérias láticas probióticas em fermentar ingredientes prebióticos como, por
exemplo, a inulina e frutooligossacarídeos (OLIVEIRA et al., 2012).
Prebióticos são ingredientes alimentares não digeríveis pelo corpo humano que
beneficiam o consumidor através da estimulação do crescimento ou atividade de um
número limitado de bactérias do cólon, melhorando assim a saúde do consumidor
(GIBSON; ROBERFROID, 1995; OLIVEIRA et al., 2011). Além disso, prebióticos
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
13
podem reprimir o crescimento de patógenos (ROBERFROID, 2001). Para serem
efetivos, estes compostos devem chegar não digeridos e absorvidos ao trato
gastrointestinal superior e ser seletivamente utilizados pelas bactérias lá presentes,
como no caso dos frutanos.
Frutano é um termo geral usado para carboidratos em que ligações frutosil-
frutose constituem a maioria das ligações glicosídicas. Estes podem ser polímeros
lineares (inulinas) ou ramificados de frutose (KAUR & GUPTA, 2002). Em geral
espécies dicotiledôneas armazenam inulinas, enquanto frutanos mais ramificados e
complexos são comuns em monocotiledôneas (VIJN; SMEEKENS, 1999).
Devido a configuração β do carbono anomérico C2 em seus monômeros de
frutose, frutanos são resistentes a hidrolise por enzimas digestivas humanas, como α-
glicosidase, maltase, isomaltase e sucrase, que são especificas para ligações α-
glicosídicas. Desse modo os frutanos são considerados oligossacarídeos não
digeríveis in vitro ou in vivo. Devido a limitada hidrólise desses compostos no
estômago, os frutanos chegam ao cólon, como confirmado em estudos in vivo em
ratos e humanos. Um estudo em homens ileostomizados em especial demonstrou que
de 86 a 88% da dose (doses de 10 a 30g) de inulina e oligofrutose é recuperada no
efluente da ileostomia, suportando a ideia de que estes compostos são praticamente
não digeríveis no intestino delgado humano. A pequena perda durante a passagem
pelo intestino delgado pode ser explicada pela fermentação da população microbiana
do íleo, a qual é cerca de 100 vezes maior em pacientes ileostomizados que na
população em geral. Outra explicação para a perda é através da hidrólise ácida ou
enzimática de frutanos de baixo peso molecular, conhecidos por serem mais sensíveis
a hidrólise que componentes de maior peso molecular (COUDRAY et al., 1997).
Inulinas e oligofrutoses podem, chegando ao cólon, alterar a composição da
flora intestinal humana resultando numa comunidade com predominância de
bifidobactérias (GIBSON et al., 1995; HIDAKA et al., 1986) já que estas são usadas
como fonte de carbono por várias espécies através de enzimas específicas como a -
frutosidase (BAÑUELOS et al., 2008).
A predominância de bifidobactérias no intestino grosso é essencial para a
prevenção de diversas doenças e a manutenção da saúde do indivíduo. Estudos
mostraram que oligofrutose e inulina modificam significativamente a composição
microbiana através da estimulação do crescimento de bifidobacterias que, por sua
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
14
parte, mudam o ambiente colônico inibindo bactérias patógenas através da formação
de bacteriocinas, competição por substrato, adesão ao epitélio gastrointestinal e
estimulação do sistema imune (BEZKOROVAINY et al., 1996; GIBSON;
ROBERFROID, 1995).
As duas espécies atualmente usadas na produção industrial de inulina são
alcachofra-de-jerusalém (Helianthus tuberosus) e chicória (Cichorium intybus), sendo
que a última é mais comumente usada para tal (DE BRUYN et al., 1992).
A inulina é processada na indústria alimentícia para produção de frutanos de
cadeia curta através de hidrólise enzimática parcial com endoinulinase e frutanos de
cadeia longa através de técnicas separação (DE LEENHEER, 2007).
A diferença no tamanho da cadeia leva a diferenças funcionais nos frutanos.
Devido a sua maior cadeia, inulina é menos solúvel que oligofrutose, formando
microcristais em água ou leite. Esses cristais não são perceptíveis na boca, porém
interagem formando uma textura cremosa, semelhante à de gorduras. Desse modo,
inulina tem sido usada com sucesso como alternativa a gorduras em patês, cremes,
produtos lácteos, doces congelados e alimentos assados (KAUR & GUPTA, 2002).
Frutanos também são não cariogênicos já que não são fermentados por
Streptococcus mutans na formação dos ácidos e glucanos responsáveis pelas cáries
dentais (KAUR & GUPTA, 2002).
3.4. Modelos de crescimento
Devido à importância do crescimento microbiano na fermentação e na
contaminação de produtos alimentícios diversos estudos foram feitos sobre os
padrões e condições deste, incluindo uma variedade de modelos matemáticos. Estes
modelos procuram descrever e prever o crescimento microbiano através do uso de
dados experimentais e sistemas fenomenológicos (LÓPEZ et al., 2004a) e suas
informações permitem prever tempo de prateleira de produtos, detecção de estágios
críticos na produção e distribuição e otimização destes (ZWIETERING et al., 1990,
1991).
Em geral, modelos de crescimento microbiano descrevem aproximadamente
um habitat fechado, ou seja, um habitat onde todos os recursos capazes de sustentar
vida são finitos e não renováveis, ao mesmo tempo que metabólitos excretados e
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
15
células mortas não são removidos e se acumulam. Isso difere do sistema de
fermentação contínua, onde recursos são continuamente adicionados e metabólitos e
células mortas são retirados ou utilizados (PELEG; CORRADINI, 2011).
O crescimento em um habitat fechado tipicamente possui quatro estágios bem
determinados: fase de latência (lag), fase exponencial, fase estacionária e fase de
declínio ou mortalidade (MCKELLAR; LU, 2004), como mostrado na figura 5.
Figura 5. Visão esquemática de uma típica curva de crescimento microbiano num habitat fechado. Fonte: (PELEG; CORRADINI, 2011).
Figura 6. Representação dos diversos estágios de crescimento microbiano (1: latência (lag), 2: transição lag-exponencial, 3: exponencial, 4: transição exponencial-
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
16
estacionário, 5: estacionário, 6: declínio), mostrando a taxa de crescimento e densidade populacional destes. Fonte: (MONOD, 1949).
A fase lag ou de latência representa um período em que as células estão em
adaptação ao novo ambiente e, portanto, não são replicantes. Nesta fase a taxa de
crescimento é igual a zero (µ = 0). Após a adaptação, há uma fase de crescimento
microbiano exponencial, na taxa máxima de crescimento daquele ambiente,
considerada constante (µ = µ𝑚𝑎𝑥). Há, entretanto, uma fase de transição entre as
duas fases, onde a taxa de crescimento é menor que a máxima (0 < µ < µ𝑚𝑎𝑥). É
proposto que isso se dá pela variação individual dentro da população celular. Mesmo
dentro de uma população isogenética há um grau de variação no estado fisiológico
das células, levando a diferenças nos tempos de adaptação e crescimento. A
determinação da latência (𝑡𝐿𝐴𝐺 ou λ), mostrada na figura 7, mostra o tempo para a
adaptação ao ambiente da cultura estudada e pode ser dividido entre o tempo de
adaptação celular (ta) e o tempo de geração de energia necessária para duplicação,
também chamado de tempo de geração (tg) (BUCHANAN; WHITING; DAMERT,
1997).
Na fase exponencial o logaritmo da população celular cresce linearmente com
o tempo até alcançar a fase estacionária, onde a população atinge seu máximo e o
crescimento microbiano volta a ser zero (µ = 0). Isso se dá pela população atingir a
maior densidade suportada pelo ambiente em consideração, fazendo com que a
limitação de nutrientes não permita a rápida produção de energia necessária para o
crescimento microbiano. Nesse caso presume-se que as células se tornem dormentes
ou reciclem nutrientes de outras células não viáveis. Há também um período de
transição para a fase estacionária, onde a taxa de crescimento ainda não é zero (0 <
µ < µ𝑚𝑎𝑥). É proposto que isso se dá pois devido a diminuição da concentração de
nutrientes, que não estão mais em excesso, fatores como a difusão dos nutrientes
pelo meio passam a afetar o crescimento microbiano, fazendo com que o declínio da
taxa de crescimento não seja homogêneo. Esta transição é mais dificilmente
observada em sistemas líquidos homogêneos, onde a agitação do ambiente leva a
difusão homogênea dos nutrientes e metabólitos (BUCHANAN; WHITING; DAMERT,
1997).
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
17
Finalmente, a fase de declínio se dá pela limitação de nutrientes e acúmulo de
metabólitos, levando a morte celular e declínio da população microbiana
(BUCHANAN; WHITING; DAMERT, 1997).
No entanto, modelos de crescimento microbiano em geral estudados em
tecnologia de alimentos apenas traduzem as primeiras três fases, ignorando a fase de
decaimento, já que a grande maioria dos produtos alimentícios deixam de ser
comestíveis muito antes do início da fase de mortalidade celular, muitas vezes antes
mesmo da fase estacionária (PELEG; CORRADINI, 2011). Deste modo, uma grande
quantidade dos modelos presentes atualmente se aproxima de equações sigmoidais,
descrevendo as fases lag, exponencial e estacionária, como mostrado na figura 5.
Figura 7. Visão esquemática de uma curva sigmoidal de crescimento microbiano, mostrando a determinação tradicional da latência. Fonte: (PELEG; CORRADINI, 2011).
Em estudos de cinética de crescimento microbiano, os dados utilizados são em
geral coletados em condições ambientais controladas, como, por exemplo, condições
constantes de temperatura, pH, osmolaridade, concentração de açúcares, atividade
da água, dentre outros. Normalmente também os fatores considerados são limitados
àqueles considerados de grande importância na cinética microbiana, como os
mencionados, enquanto que fatores como difusão de gases e nutrientes, mudanças
na solubilidade e transferência de calor são comumente desconsiderados a não ser
que estes expliquem desvios consideráveis de um crescimento esperado.
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
18
Os modelos podem ser de vários tipos, mas os mais comumente usados são
os de expressão algébrica empírica, das quais a equação de Gompertz é a mais
conhecida e comumente utilizada, e modelos logisticos de taxa de crescimento,
derivadas em geral da equação de Verhulst (PELEG; CORRADINI, 2011).
A literatura em modelos de crescimento microbiano em geral lida com a
definição, determinação e fatores que afetam três parâmetros: latência (𝑡𝐿𝐴𝐺 ou λ),
taxa máxima de crescimento (µ𝑚𝑎𝑥) e crescimento máximo (𝑁𝑚𝑎𝑥). Os três fatores
possuem significados intuitivos e utilidade no estudo microbiológico, principalmente
em tecnologia de alimentos.
3.4.1. Latência (𝒕𝑳𝑨𝑮 ou λ)
Devido a transição continua entre as fases de latência (Lag) e exponencial, a
determinação da latência não é clara, sendo tradicionalmente determinada
graficamente pela intersecção das tangentes da fase de latência (Lag) e fase
exponencial na curva de crescimento, como mostrado na figura 7, ou por regressão
não-linear usando o latência como um dos parâmetros da equação. Ambos possuem
limitações quando se considera curvas não sigmoidais ou assimétricas, como
mostrado na figura 8 (PELEG; CORRADINI, 2011).
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
19
Figura 8. Representação da limitação da definição tradicional de latência quando aplicada a curvas de crescimento não sigmoidais ou assimétricas. Fonte: (PELEG; CORRADINI, 2011).
3.4.2. Taxa máxima de crescimento (µ𝒎𝒂𝒙)
Em tecnologia de alimentos a taxa máxima de crescimento microbiano é em
geral considerada uma medida da intensidade de crescimento de um organismo e,
portanto, muitos dos modelos usados nessa área foram desenvolvidos
exclusivamente para o estudo desse parâmetro. Matematicamente, a taxa máxima de
crescimento é definida como a inclinação da curva de crescimento sigmoidal em seu
ponto de inflexão, como mostrado na figura 9.
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
20
Figura 9. Representação da determinação matemática da taxa máxima de crescimento (µ𝒎𝒂𝒙) em uma curva de crescimento microbiano sigmoidal. Fonte: (PELEG; CORRADINI, 2011).
3.4.3. Crescimento máximo (𝑵𝒎𝒂𝒙)
O crescimento máximo microbiano representa o número ou massa de células
na fase estacionária, quando não há mais crescimento microbiano no meio. Embora
esta seja uma quantidade facilmente mensurável, frequentemente a contagem
microbiana é inserida dentro de parâmetros dos modelos de crescimento na
regressão. Isso se dá porque a medição do número de células (N) ou mesmo do
número inicial de células (No) possuem erros experimentais e a inserção desses nos
parâmetros da equação evita tais erros.
A estimativa do Nmax por regressão, entretanto, pode ser complicada. Caso uma
fase estacionária bem definida não seja alcançada durante o experimento, o valor
calculado seria uma extrapolação, o que implica em incerteza (PELEG; CORRADINI,
2011).
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
21
4. OBJETIVOS
Este trabalho visa o estudo da cinética de crescimento celular da cepa
Pediococcus pentosaceus, seu consumo de glicose e produção de ácido lático,
aplicando conhecimentos de modelagem matemática e análise de dados
experimentais obtidos a partir do cultivo em agitador metabólico utilizando glicose,
frutose e inulina como fontes de carbono e diferentes condições de cultivo.
4.1. Objetivos específicos
• Avaliar a influência do meio de cultivo no crescimento celular de P.
pentosaceus e na produção de ácido lático;
• Estudar a influência de fonte alternativa de carbono (glicose, frutose e
inulina) nos cultivos em agitador metabólico no crescimento celular de
P. pentosaceus e na produção de ácido lático;
• Avaliar a cinética do processo em agitador metabólico;
• Avaliação dos resultados através das ferramentas estatísticas Minitab
17, MATLAB R2015a e Excel 2016.
• Análise da cinética observada experimentalmente em relação a
equações descritas na literatura, sendo essas os modelos de Gompertz,
Presser e Ratkowsky.
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
22
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1. Planejamento experimental
A Tabela 1 se refere ao planejamento dos ensaios de cultivo de Pediococcus
pentosaceus em agitador metabólico, tendo pH, concentração de inulina, agitação e
temperatura como variáveis.
Tabela 1. Planejamento experimental dos cultivos de P.pentosaceus em questão das variáveis pH, concentração de inulina, agitação e temperatura.
Ensaios pH Conc.
Inulina (%) Agit. (rpm)
Temp. (°C)
MRS 6,5 0,0 100 30
C 5,0 0,0 100 30
E1 4,0 0,5 50 25
E2 6,0 0,5 50 35
E3 4,0 1,5 50 25
E3' 4,0 1,5 50 35
E4 6,0 1,5 50 35
E4' 6,0 1,5 50 25
E5 4,0 0,5 150 25
E5' 4,0 0,5 150 35
E6 6,0 0,5 150 35
E6' 6,0 0,5 150 25
E7 4,0 1,5 150 25
E8 6,0 1,5 150 35
Ce 5,0 1,0 100 30
5.2. Procedimento experimental
5.2.1. Culturas microbianas
Neste projeto foram utilizados micro-organismos Pediococcus pentosaceus
Mees (ATCC 43200) em meio de cultivo sintético, denominado caldo MRS (de Man,
Rogosa e Sharpe) (DifcoTM, Sparks, USA), preparado de acordo com as instruções do
fabricante e suplementado com inulina segundo o planejamento experimental (Tabela
1).
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
23
O pré-inóculo foi preparado adicionando-se 1 mL da cultura estoque de P.
pentosaceus ATCC 43200 em frascos Erlenmeyer de 125 mL contendo 50mL de caldo
MRS. Em seguida foi feita a incubação em agitador metabólico nas condições de 100
rpm e 30°C, até alcançar uma contagem microbiana entre 107-108 UFC/mL. A partir
deste cultivo, uma alíquota de 10mL (inóculo) foi transferida para frascos Erlenmeyer
de 250mL contendo 100mL dos diferentes meios de cultivo descritos e conduzidos
segundo o planejamento experimental (Tabela 1). O cultivo em agitador metabólico foi
baseado no estudo de DAESCHEL; KLAENHAMMER, 1985.
5.2.2. Análise experimental
Foram retiradas alíquotas do processo de cultivo a cada 2 horas. As alíquotas
foram coletadas assepticamente dos cultivos para análises de pH, açúcares (glicose
e frutose), ácido lático e concentração celular, feitas cada um em triplicata. Cada uma
das análises foi feita segundo a metodologia a seguir:
5.2.2.1. Curva de crescimento celular
A concentração celular foi obtida mediante uma curva de calibração
(evidenciada abaixo) que correlaciona dendidade ótica à 600 nm (DO600nm) com
biomassa de células. Para a elaboração desta curva, alíquotas de 3 mL provenientes
do cultivo de 100 mL de inóculo de P. pentosaceus ATCC 43200 foram filtradas
através de membrana com porosidade de 0,45 µm (Millipore, Billerica, MA, USA).
Após a secagem em estufa a 100 oC por 2 horas, a biomassa foi determinada através
da utilização de balança analítica. As análises foram realizadas em triplicata.
5.2.2.2. Monitoramento de pH
A pós-acidificação dos cultivos foi avaliada utilizando-se um pHmetro modelo
400M1 (Quimis, SP, Brasil).
5.2.2.3. Determinação de açúcares e ácido lático
A determinação das concentrações de açúcares (glicose e frutose) e ácido
lático foi realizada mediante análise por Cromatografia Líquida de Alta Performance
(HPLC), modelo LC-20A Prominence (Shimadzu, Kyoto, Japão), equipado com duas
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
24
bombas (LC-20AD), uma unidade desgaseificadora (DGU-20A), um auto injector (SIL-
20ACHT), uma coluna (CTO-20AC), um detector de índice refratário (RI-210) (Shodex,
Kawasaki, Kanagawa, Japão) e uma coluna 300 x 7.8 mm (HPX-87H) (Aminex, Bio-
Rad, CA, USA).
As análises foram realizadas a temperatura ambiente utilizando
acetonitrila:água ultra pura (75%:25%) como fase móvel a um fluxo de 0.9 mL/min.
Glicose e frutose ultra pura (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) foram utilizadas nas
concentrações de 0,1 a 2,0 g/L como soluções padrão para o preparo da curva de
calibração. Todas as amostras foram analisadas em triplicata.
5.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram analisados usando os softwares Minitab 17, MATLAB
R2015a e Excel 2016, onde equações de regressão foram feitas para os valores
experimentais e gráficos para os modelos da literatura.
5.3.1. Modelo de Gompertz
log𝑒N(t) = log𝑒No +Nmax
Noe
{𝑒[−µ(t−t𝑖𝑛𝑓)]
}
Modelo largamente aplicado a crescimento microbiano em cultura isotérmica
(𝑇 = 𝑐𝑡𝑒), criado em 1825 para descrever mortalidade de populações (BUCHANAN;
WHITING; DAMERT, 1997; LÓPEZ et al., 2004b), onde:
- No = população bacteriana ou biomassa inicial
- Nmax = população bacteriana ou biomassa máxima
- µ = taxa de crescimento específica
- t𝑖𝑛𝑓 = tempo na inflexão ou tempo onde µ = µ𝑚𝑎𝑥
5.3.2. Modelo de Presser
µ𝑚𝑎𝑥
µ𝑜𝑝𝑡= (1 − 10𝑝𝐻𝑚𝑖𝑛−𝑝𝐻)(1 − 10𝑝𝐻−𝑝𝐻𝑚𝑎𝑥)
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
25
Modelo de taxa de crescimento por pH posteriormente expandido por
Tienungoon et al. (2000) para descrever o comportamento da taxa de crescimento por
toda a extensão do pH (PRESSER; RATKOWSKY; ROSS, 1997; TIENUNGOON et
al., 2000), onde:
- µ𝑚𝑎𝑥 = taxa máxima de crescimento experimental
- µ𝑜𝑝𝑡 = taxa máxima de crescimento ideal
- 𝑝𝐻 = pH do meio de cultura
- 𝑝𝐻𝑚𝑖𝑛 = pH mínimo de crescimento do microorganismo
- 𝑝𝐻𝑚𝑎𝑥 = pH máximo de crescimento do microorganismo
5.3.3. Modelo de Ratkowsky
(a) µmax = [b(T − Tmin)]2
(b) µmax = [b(T − Tmin)]2{1 − e[c(T − Tmax)]}
Modelo de taxa de crescimento microbiano em função da temperatura. O
modelo de Ratkowsky original (equação a) se baseia na observação de que a baixas
temperaturas a raiz da taxa de crescimento é linear com a temperatura (RATKOWSKY
et al., 1982). Para descrever a influência das temperaturas mínima e máxima sobre o
crescimento microbiano, entretanto, um modelo de Ratkowsky expandido (equação b)
é empregado (ZWIETERING et al., 1991), onde:
- µ𝑚𝑎𝑥 = taxa máxima de crescimento
- b = parâmetro de Ratkowsky para temperatura mínima
- T = temperatura do meio de cultura
- 𝑇𝑚𝑖𝑛 = temperatura mínima de crescimento do microorganismo
- c = parâmetro de Ratkowsky para temperatura máxima
- 𝑇𝑚𝑎𝑥 = temperatura máxima de crescimento do microorganismo
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
26
6. RESULTADOS
Os resultados da curva de calibração entre densidade ótica a 600 nm (DO600nm)
e biomassa (g/L) foram os seguintes:
Tabela 2. Concentração de celular de P. pentosaceus cultivado em meio de cultivo MRS. Resultados obtidos através das análises de biomassa por densidade ótica a 600 nm.
Diluição 1 2 3 Média D.O. Membrana*
(g) Peso (g)
Biomassa (g)
Biomassa (g/L)
S/dil 2.187 2.187 2.187 2.187 0.1251 0.1429 0.0178 1.7800
1/5 1.428 1.428 1.428 1.428 0.1246 0.1293 0.0047 0.4700
1/6 1.234 1.234 1.240 1.236 0.1285 0.1323 0.0038 0.3800
1/7 1.126 1.135 1.135 1.132 0.1295 0.1323 0.0028 0.2800
1/8 1.014 1.014 1.006 1.011 0.1300 0.1320 0.0020 0.2000
1/9 0.891 0.897 0.909 0.899 0.1295 0.1309 0.0014 0.1400
1/30 0.478 0.450 0.455 0.461 0.1291 0.1297 0.0006 0.0600
*massa da membrana de filtração: porosidade 0,45 µm (Millipore, Billerica, MA, USA)
Figura 10. Curva de calibração correlacionando densidade ótica a 600 nm e biomassa (g/L).
Desse modo a equação da curva de calibração usada para os experimentos
foi:
y = 3.283x + 0.2692R² = 0.9974
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
D.O
. (6
00
nm
)
Biomassa (g/L)
Curva de calibração
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
27
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 (𝑔
𝐿) = 3,283𝐷𝑂600𝑛𝑚 + 0,2692
Comparação de dados de massa seca com massa calculada no anexo ao fim
do trabalho (tabela 3).
Com base nos procedimentos de cultivo e análises de crescimento celular,
monitoramento de pH e determinação de açúcares e ácido lático descritos foram
obtidos os seguintes resultados:
Tabela 4. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado* em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.
Média das amostras (g/L)
Tempo (h) D.O. Massa (g/L) pH Glicose Frutose Lactato
0 0,07 0,00 6,65 15,06 1,83 0,68
2 0,18 0,00 6,47 14,93 1,75 0,79
4 0,55 0,00 6,13 14,28 1,74 1,12
6 2,35 0,45 5,34 12,59 1,66 2,73
8 4,09 0,98 4,89 10,80 1,56 4,54
10 4,57 1,12 4,71 10,39 1,51 5,99
12 5,36 1,36 4,57 9,60 1,51 6,73
24 9,44 2,61 4,11 5,66 1,16 9,23
48 7,03 1,87 3,94 2,23 1,01 11,08 *Condições de cultivo: pH 6,5; Inulina 0%; 100 rpm; 30⁰C
Determinação da regressão linear da fase exponencial para determinação de µmax no anexo ao fim deste trabalho (figura 11). Tabela 5. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado* em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.
Média das amostras (g/L)
Tempo (h) D.O. Massa (g/L) pH Glicose Frutose Lactato
0 0,093 0,00 5,00 18,63 0,79 0,62
2 0,104 0,00 4,97 18,15 0,76 0,62
4 0,127 0,00 4,96 18,09 0,76 0,67
6 0,229 0,00 4,94 17,66 0,72 0,78
8 0,392 0,00 4,89 17,28 0,69 1,06
10 0,812 0,00 4,78 16,76 0,61 1,60
12 1,927 0,32 4,54 15,85 0,15 2,67
24 9,130 2,51 3,82 6,99 0,12 5,35
48 8,317 2,26 3,55 5,94 0,00 9,70
*Condições de cultivo: pH 5,0; Inulina 0%; 100 rpm; 30⁰C
Determinação da regressão linear da fase exponencial para determinação de µmax no anexo ao fim deste trabalho (figura 12).
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
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Tabela 6. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo E1*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.
Média das amostras (g/L)
Tempo (h) D.O. Massa (g/L) Média
pH Glicose Frutose Lactato
0 0,143 0,00 4,10 21,51 5,36 0,68
2 0,172 0,00 4,11 21,06 5,34 0,68
4 0,201 0,00 4,16 21,92 5,33 0,89
6 0,262 0,00 4,07 20,96 5,29 0,93
8 0,318 0,00 4,05 20,98 5,21 1,03
10 0,428 0,00 4,11 20,97 5,23 1,15
12 0,576 0,00 4,06 20,32 4,98 2,02
24 1,375 0,15 3,85 19,10 4,66 2,45
48 4,510 1,10 3,69 17,28 4,31 5,18
* Condições de cultivo: pH 5,0; Inulina 0,5%; 50 rpm; 25⁰C
Determinação da regressão linear da fase exponencial para determinação de µmax no anexo ao fim deste trabalho (figura 13). Tabela 7. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo E3*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.
Média das amostras (g/L)
Tempo (h) D.O. Massa (g/L) Média
pH Glicose Frutose Lactato
0 0,057 0,00 4,10 21,51 5,36 0,68
2 0,088 0,00 4,10 21,06 5,34 0,68
4 0,149 0,00 4,10 21,92 5,33 0,89
6 0,224 0,00 4,08 20,96 5,29 0,93
8 0,286 0,00 4,04 20,98 5,21 1,03
10 0,410 0,00 4,09 20,97 5,23 1,15
12 0,598 0,00 4,05 20,32 4,98 2,02
24 1,355 0,14 3,83 19,10 4,66 2,45
48 3,763 0,88 3,64 17,28 4,31 5,18
* Condições de cultivo: pH 4,0; Inulina 1,5%; 50 rpm; 25⁰C
Determinação da regressão linear da fase exponencial para determinação de µmax no anexo ao fim deste trabalho (figura 14). Tabela 8. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo E3’*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.
Média das amostras (g/L)
Tempo (h) D.O. Massa (g/L) Média
pH Glicose Frutose Lactato
0 0,092 0,00 4,10 25,95 13,59 0,67
2 0,105 0,00 4,10 26,05 13,71 0,66
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
29
4 0,129 0,00 4,10 26,18 13,83 0,69
6 0,129 0,00 4,10 24,96 12,98 0,68
8 0,145 0,00 4,10 26,28 13,92 0,74
10 0,171 0,00 4,10 24,21 12,59 0,71
12 0,208 0,00 4,10 25,70 13,57 0,77
24 0,262 0,00 4,07 25,63 13,55 1,06
48 0,672 0,00 3,97 25,44 13,67 1,60
* Condições de cultivo: pH 4,0; Inulina 1,5%; 50 rpm; 35⁰C
Tabela 9. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo E5*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.
Média das amostras (g/L)
Tempo (h) D.O. Massa (g/L) Média
pH Glicose Frutose Lactato
0 0,164 0,00 4,00 20,81 4,57 0,67
2 0,079 0,00 4,00 20,78 4,53 0,67
4 0,071 0,00 4,00 21,19 4,52 0,71
6 0,104 0,00 4,00 20,81 4,52 0,76
8 0,112 0,00 4,00 20,64 4,51 0,75
10 0,109 0,00 4,00 20,58 4,50 0,77
12 0,001 0,00 4,00 20,39 4,42 0,69
24 0,157 0,00 4,00 20,86 4,79 0,83
48 0,379 0,00 4,00 19,52 4,42 1,21
* Condições de cultivo: pH 4,0; Inulina 0,5%; 150 rpm; 25⁰C
Tabela 10. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo E5’*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.
Média das amostras (g/L)
Tempo (h) D.O. Massa (g/L) Média
pH Glicose Frutose Lactato
0 0,085 0,00 4,08 20,27 5,44 0,63
2 0,126 0,00 4,08 18,94 2,55 0,67
4 0,165 0,00 4,09 20,23 5,43 0,72
6 0,198 0,00 4,06 19,61 5,26 0,74
8 0,207 0,00 4,08 20,32 5,45 0,87
10 0,215 0,00 4,11 20,15 5,34 0,83
12 0,220 0,00 4,07 19,95 5,18 0,76
24 0,252 0,00 4,05 19,70 5,14 0,84
48 0,289 0,00 4,02 18,73 4,98 0,81
* Condições de cultivo: pH 4,0; Inulina 0,5%; 150 rpm; 35⁰C
Tabela 11. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo E7*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
30
Média das amostras (g/L)
Tempo (h) D.O. Massa (g/L) Média
pH Glicose Frutose Lactato
0 0,083 0,00 4,00 28,36 12,50 0,64
2 0,098 0,00 4,00 27,38 12,36 0,64
4 0,092 0,00 4,00 27,33 11,99 0,67
6 0,142 0,00 4,00 26,99 11,84 0,67
8 0,106 0,00 4,00 26,27 11,44 0,69
10 0,106 0,00 4,00 28,02 12,29 0,69
12 0,119 0,00 4,00 28,35 13,09 0,66
24 0,135 0,00 4,00 28,30 13,09 0,80
48 0,292 0,00 4,00 27,71 12,62 1,07
* Condições de cultivo: pH 4,0; Inulina 1,5%; 150 rpm; 25⁰C
Tabela 12. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo E2*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.
Média das amostras (g/L)
Tempo (h) D.O. Massa (g/L) Média
pH Glicose Frutose Lactato
0 0,054 0,00 5,80 19,51 2,49 0,65
2 0,076 0,00 5,80 21,25 2,82 0,65
4 0,295 0,00 5,71 20,84 2,77 0,86
6 1,383 0,15 5,14 19,40 2,76 2,35
8 4,702 1,16 4,57 16,29 2,60 4,64
10 5,139 1,30 4,33 14,44 2,47 5,48
12 5,613 1,44 4,20 13,71 2,39 5,88
24 7,635 2,06 4,06 11,74 2,25 7,78
48 6,269 1,64 3,99 11,14 2,33 8,21
* Condições de cultivo: pH 6,0; Inulina 0,5%; 50 rpm; 35⁰C
Determinação da regressão linear da fase exponencial para determinação de µmax no anexo ao fim deste trabalho (figura 15). Tabela 13. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo E4*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.
Média das amostras (g/L)
Tempo (h) D.O. Massa (g/L) Média
pH Glicose Frutose Lactato
0 0,029 0,00 5,80 28,37 6,29 0,67
2 0,051 0,00 5,80 28,18 6,15 0,70
4 0,256 0,00 5,69 28,08 6,13 0,94
6 1,311 0,13 5,08 26,39 6,01 2,54
8 4,638 1,14 4,57 23,70 6,05 4,78
10 4,931 1,23 4,30 21,16 5,75 5,89
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
31
12 5,245 1,33 4,18 18,74 5,50 6,55
24 6,764 1,79 4,08 18,46 5,54 7,42
48 6,083 1,58 4,06 17,98 5,42 8,23
* Condições de cultivo: pH 6,0; Inulina 1,5%; 50 rpm; 35⁰C
Determinação da regressão linear da fase exponencial para determinação de µmax no anexo ao fim deste trabalho (figura 16). Tabela 14. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo E4’*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.
E4': pH 6,0; Inulina 1,5%; 50 rpm; 25oC
Média das amostras (g/L)
Tempo (h) D.O. Massa (g/L) Média
pH Glicose Frutose Lactato
0 0,061 0,00 5,89 31,91 7,00 0,76
2 0,077 0,00 5,89 31,13 6,80 0,77
4 0,136 0,00 5,83 30,99 6,86 0,87
6 0,373 0,00 5,71 29,78 6,66 1,11
8 1,067 0,06 5,35 28,82 6,70 2,16
10 3,268 0,73 4,90 26,17 6,42 3,60
12 4,427 1,08 4,70 24,98 6,27 4,32
24 6,946 1,85 4,16 20,48 6,10 7,78
48 6,776 1,79 3,98 16,32 5,95 9,76
* Condições de cultivo: pH 6,0; Inulina 1,5%; 50 rpm; 25⁰C
Determinação da regressão linear da fase exponencial para determinação de µmax no anexo ao fim deste trabalho (figura 17). Tabela 15. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo E6*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.
Média das amostras (g/L)
Tempo (h) D.O. Massa (g/L) Média
pH Glicose Frutose Lactato
0 0,060 0,00 5,79 19,10 3,06 0,61
2 0,077 0,00 5,78 20,51 3,19 0,65
4 0,227 0,00 5,68 20,48 3,33 0,83
6 0,856 0,00 5,33 20,19 3,34 1,68
8 3,027 0,65 4,84 19,29 2,89 3,82
10 5,088 1,28 4,54 17,49 2,84 5,88
12 5,728 1,48 4,36 14,79 2,37 6,74
24 7,687 2,07 4,07 10,80 2,36 9,21
48 6,576 1,73 4,00 9,62 2,25 9,28
* Condições de cultivo: pH 6,0; Inulina 0,5%; 150 rpm; 35⁰C
Determinação da regressão linear da fase exponencial para determinação de µmax no anexo ao fim deste trabalho (figura 18).
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
32
Tabela 16. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo E6’*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.
Média das amostras (g/L)
Tempo (h) D.O. Massa (g/L) Média
pH Glicose Frutose Lactato
0 0,081 0,00 5,85 18,83 2,48 0,60
2 0,117 0,00 5,82 20,11 5,26 0,65
4 0,407 0,00 5,70 18,53 2,46 0,91
6 1,125 0,07 5,30 17,24 2,37 1,75
8 3,570 0,82 4,93 16,02 2,39 3,22
10 4,632 1,14 4,67 14,67 2,13 4,33
12 5,395 1,37 4,50 13,91 2,04 5,11
24 8,316 2,26 4,16 9,48 1,89 7,75
48 7,699 2,08 3,97 6,88 1,99 8,96
* Condições de cultivo: pH 6,0; Inulina 0,5%; 150 rpm; 25⁰C
Determinação da regressão linear da fase exponencial para determinação de µmax no anexo ao fim deste trabalho (figura 19). Tabela 17. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo E8*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.
Média das amostras (g/L)
Tempo (h) D.O. Massa (g/L) Média
pH Glicose Frutose Lactato
0 0,041 0,00 5,77 32,80 8,10 0,83
2 0,050 0,00 5,77 31,84 7,72 0,75
4 0,194 0,00 5,72 30,14 7,55 0,96
6 0,805 0,00 5,33 28,68 7,29 1,71
8 2,802 0,58 4,83 27,07 7,17 3,70
10 4,846 1,21 4,54 25,63 6,61 5,17
12 5,467 1,40 4,36 22,74 5,87 5,84
24 7,310 1,96 4,08 19,95 5,93 8,21
48 6,384 1,68 4,00 19,41 5,58 8,54
* Condições de cultivo: pH 6,0; Inulina 1,5%; 150 rpm; 35⁰C
Determinação da regressão linear da fase exponencial para determinação de µmax no anexo ao fim deste trabalho (figura 20). Tabela 18. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo Ce*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.
Média das amostras (g/L)
Tempo (h) D.O. Massa (g/L) Média
pH Glicose Frutose Lactato
0 0,109 0,00 4,99 24,39 5,84 0,67
2 0,226 0,00 4,97 24,02 5,66 0,79
4 0,577 0,00 4,83 24,98 7,25 1,12
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
33
6 1,197 0,10 4,65 22,90 5,45 1,94
8 3,243 0,72 4,41 21,97 5,33 2,92
10 4,755 1,18 4,29 21,22 4,54 3,95
12 5,763 1,49 4,18 20,04 4,33 4,68
24 7,553 2,03 4,05 18,60 4,08 5,91
48 6,872 1,82 3,96 16,88 4,06 6,50
* Condições de cultivo: pH 5,0; Inulina 1,0%; 100 rpm; 30⁰C
Determinação da regressão linear da fase exponencial para determinação de µmax no anexo ao fim deste trabalho (figura 21).
6.1. Análise da dinâmica de crescimento microbiano
Com base nos dados experimentais de crescimento celular de P.pentosaceus
em função do tempo foi feita análise da dinâmica de crescimento microbiano.
O crescimento da biomassa microbiana nas condições de pH 6,5; Inulina 0%;
100 rpm; 30⁰C (Tabela 4), como mostra a figura 11, segue um padrão polinomial.
Figura 22. Concentração de biomassa (g/L) obtida em meio de cultivo MRS (pH 6,5; Inulina 0%; 100 rpm; 30⁰C).
A mesma constatação pode ser feita para o crescimento da concentração de
lactato pelo tempo, como mostra a figura 12.
y = -7E-05x3 + 0.0021x2 + 0.1091x - 0.1754R² = 0.9751
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Bio
mas
sa (
g/L)
Tempo de fermentação (h)
Tg = 2,83 h
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
34
Figura 23. Concentração de lactato (g/L) obtida em meio de cultivo MRS (pH 6,5; Inulina 0%; 100 rpm; 30⁰C) com equação de regressão calculada, feito no Excel 2016.
Em ambos os gráficos é observado um máximo alcançado em tempo próximo
a 35h de fermentação. Neste tempo de fermentação são obtidos os seguintes valores
máximos de biomassa e concentração de lactato através das equações de regressão:
𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 = −7 ∗ 10−5𝑡3 + 0,0021𝑡2 + 0,1091𝑡 − 0,1754
𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎𝑚𝑎𝑥 = −7 ∗ 10−5353 + 0,0021 ∗ 352 + 0,1091 ∗ 35 − 0,1754 = 3, 21𝑔/𝐿
[𝐿𝑎𝑐𝑡𝑎𝑡𝑜] = 9 ∗ 10−5𝑡3 − 0,0134𝑡2 + 0,68𝑡 − 0,2398
[𝐿𝑎𝑐𝑡𝑎𝑡𝑜]𝑚𝑎𝑥 = 9 ∗ 10−5353 − 0,0134 ∗ 352 + 0,68 ∗ 35 − 0,2398 = 11,00𝑔/𝐿
A análise da curva de crescimento microbiano também é importante para a
determinação da fase exponencial, essencial na determinação da taxa de crescimento
microbiano máxima (µmax). Através da curva de crescimento do cultivo utilizando MRS
(pH 6,5; Inulina 0%; 100 rpm; 30°C) foi determinado que a fase exponencial se situa
entre 4 e 8h de fermentação. Com base nisso foi feita análise da reta tangente à curva
exponencial por regressão linear, como mostra a figura 11, para determinação de µmax,
a qual é igual à inclinação da reta.
y = 9E-05x3 - 0.0134x2 + 0.68x - 0.2398R² = 0.9687
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
14.00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
[Lac
tato
] (g
/L)
Tempo de fermentação (h)
Tg = 2,83 h
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
35
Figura 11. Regressão linear do crescimento em fase exponencial do cultivo MRS para determinação da inclinação da reta (µmax).
Com a equação da reta determinada para a tangente da fase exponencial, foi
estimada a latência (𝑡𝐿𝐴𝐺) do cultivo como sendo o tempo em que a tangente da
inflexão cruza com o eixo, ou seja, o tempo em que 𝑚 = 0 para a tangente de µ =
µ𝑚𝑎𝑥:
0 = µmax ∗ t𝐿𝐴𝐺 + b
t𝐿𝐴𝐺 = −𝑏
µmax
Com base na equação linear da fase exponencial, portanto, é possível se
identificar a µmax e b, calculando-se assim a latência (t𝐿𝐴𝐺).
No exemplo do cultivo nas condições de pH 6,5; Inulina 0%; 100 rpm; 30⁰C, o
valor de t𝐿𝐴𝐺 = −−0,9933
0,245= 4,05ℎ
Os valores de µmax e t𝐿𝐴𝐺 para cada cultivo são mostrados na tabela 18.
Tabela 18. Planejamento experimental e resultados dos parâmetros de crescimento dos cultivos.
Condições de cultivo Parâmetros*
Ensaios pH Conc. Inulina (%) Agit. (rpm) Temp. (°C) µmax (h-1) t LAG (h)
MRS 6,5 0,0 100 30 0,24 4,05
C 5,0 0,0 100 30 0,18 10,10
y = 0.245x - 0.9933R² = 0.9978
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 2 4 6 8 10
pH=6,5; 100rpm; 0% inulina; 30oC
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
36
E1 4,0 0,5 50 25 0,04 20,20
E2 6,0 0,5 50 35 0,24 4,34
E3 4,0 1,5 50 25 0,03 19,48
E3' 4,0 1,5 50 35 0,00 -
E4 6,0 1,5 50 35 0,24 4,34
E4' 6,0 1,5 50 25 0,26 7,56
E5 4,0 0,5 150 25 0,00 -
E5' 4,0 0,5 150 35 0,00 -
E6 6,0 0,5 150 35 0,32 5,99
E6' 6,0 0,5 150 25 0,38 5,81
E7 4,0 1,5 150 25 0,00 -
E8 6,0 1,5 150 35 0,30 6,03
Ce 5,0 1,0 100 30 0,27 5,53
* µmax calculada a partir da inclinação da tangente na fase exponencial com Excel 2016 (figuras 11 a 20)
𝐭𝑳𝑨𝑮 calculada a partir da equação 𝐭𝑳𝑨𝑮 = −𝒃
µ𝐦𝐚𝐱 com base na equação de regressão na fase
exponencial
Após determinação de µmax e t𝐿𝐴𝐺, o modelo de Gompertz torna-se interessante
para estimar matematicamente o valor de biomassa máxima:
log𝑒N(t) = log𝑒No +Nmax
Noe
{𝑒[−µ(t−t𝑖𝑛𝑓)]
}
𝑁𝑚𝑎𝑥 =(𝑙𝑛𝑁 − 𝑙𝑛𝑁𝑜)𝑁𝑜
e{𝑒
[−µ(t−t𝑖𝑛𝑓)]}
O modelo, porém, depende do valor da biomassa inicial, a qual não é conhecida
no experimento (inóculo inicial foi feito em função de UFC/mL) e do tempo de inflexão,
ou seja, o tempo onde µ = µ𝑚𝑎𝑥 . A estimativa dos valores leva a grande incerteza
no valor calculado, como demonstrado na equação a seguir feita com 𝑁𝑜 = 0,01𝑔/𝐿
e 𝑡𝑖𝑛𝑓 = 5ℎ.
𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎𝑚𝑎𝑥 =(𝑙𝑛0,98 − 𝑙𝑛0,01)0,01
e{𝑒[−0,245(8−5)]}= 0,028𝑔/𝐿
Como observado, o valor de biomassa máxima obtido por esse método é muito
baixo e, portanto, inadequado para o estudo.
O modelo de crescimento de Gompertz, portanto, não pôde ser aplicado à
curva de crescimento experimental de P.pentosaceus, devido à ausência de
informações sobre a biomassa inicial e tempo de inflexão da curva sigmoidal, não
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
37
sendo assim possível analisar se este modelo reflete o crescimento da espécie nas
condições estudadas, no entanto, os parâmetros determinados (µmax e t𝐿𝐴𝐺) podem
ser usados conjuntamente aos de biomassa para análise da influência dos fatores de
cultivo sobre o crescimento microbiano.
6.2. Análise dos fatores de influência no crescimento microbiano
Foi feita uma análise do ponto final (𝑡 = 48ℎ) de cada cultivo para se analisar a
influência dos parâmetros no crescimento microbiano.
Inicialmente foi feita, com base nas tabelas 18 e 19, análise entre os diferentes
cultivos. Nesta é verificada que no ensaio denominado MRS (pH=6,5; Inulina=0%;
Agit=100rpm; T=30oC) obteve-se a menor latência (4,05h) e alto µmax (0,24h-1),
enquanto o ensaio C (pH=5,0; Inulina=0%; Agit=100rpm; T=30oC) obteve a maior
produção de biomassa (2,26g/L) e menor pH a 48h (3,55). Ambos os ensaios também
foram os com maior produção de lactato a 48h (10,40g/L e 9,08g/L, respectivamente).
Estes ensaios diferem apenas no pH inicial, levando esta condição de cultivo a ser a
primeira analisada.
Tabela 19. Valores de biomassa, pH, concentração de glicose, frutose e lactato em 48 de cultivo.
Condições de cultivo Resultados em t=48h
Ensaio pH Conc.
Inulina (%)
Agit. (rpm)
Temp. (°C)
Biomassa (g/L)
pH Consumo de glicose
(g/L)*
Consumo de frutose
(g/L)*
Produção de lactato
(g/L)*
MRS 6,5 0,0 100 30 1,87 3,94 12,84 0,82 10,40
C 5,0 0,0 100 30 2,26 3,55 12,69 0,79 9,08
E1 4,0 0,5 50 25 1,10 3,69 4,23 1,05 4,51
E2 6,0 0,5 50 35 1,64 3,99 8,37 0,16 7,57
E3 4,0 1,5 50 25 0,88 3,64 4,23 1,05 4,51
E3' 4,0 1,5 50 35 0,00 3,97 0,50 0,07 0,93
E4 6,0 1,5 50 35 1,58 4,06 10,39 0,87 7,57
E4' 6,0 1,5 50 25 1,79 3,98 15,59 1,05 9,00
E5 4,0 0,5 150 25 0,00 4,00 1,29 0,15 0,54
E5' 4,0 0,5 150 35 0,00 4,02 1,54 0,47 0,18
E6 6,0 0,5 150 35 1,73 4,00 9,48 0,81 8,67
E6' 6,0 0,5 150 25 2,08 3,97 11,95 0,49 8,36
E7 4,0 1,5 150 25 0,00 4,00 0,65 0,12 0,43
E8 6,0 1,5 150 35 1,68 4,00 13,40 2,53 7,71
Ce 5,0 1,0 100 30 1,82 3,96 7,51 1,78 5,83
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
38
* consumo de glicose e frutose e produção de lactato foram calculados pela diferença entre a concentração final e inicial destes, em módulo.
A Tabela 19 mostrou que a cepa P. pentosaceus obteve um crescimento celular
em 𝑝𝐻 = 4,0 baixo, chegando a valores de biomassa em 48h entre 0,00 e 1,10 g/L.
Estes valores são inferiores aos obtidos em 𝑝𝐻 = 6,0 onde foram obtidos valores de
biomassa em 48h entre 1,58 e 2,08g/L. Isto entra de acordo com a literatura, onde
consta que as condições ideais de cultivo de Pediococcus pentosaceus são em pH
entre 4,5 e 8,0 (CAI et al., 1999).
Este padrão foi expresso pela análise de regressão dos fatores ligados à
biomassa a 48h feita com o software Minitab 17 (com base nos dados da tabela 19)
obtendo a seguinte equação:
𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 (𝑔
𝐿) = −26,34 + 10,63𝑝𝐻 − 0,991𝑝𝐻²
R² = 0,8369
R² (aj.) = 0,8097
R² (pred) = 0,7411
Esta equação mostra que a biomassa obtida após 48h de cultivo é dependente
apenas do pH. Além disso, há um valor máximo de biomassa, como mostra a figura
24 (tabela 20 no anexo apresenta resultados numéricos para melhor visualização), de
2,16g/L em 𝑝𝐻 = 5,4. Este pH é próximo ao 𝑝𝐻 = 5,5 considerado ideal no cultivo de
P.pentosaceus (CAI et al., 1999; COSTER; WHITE, 1964; FRANZ et al., 2014).
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
39
Figura 24. Gráfico de linha representando a relação entre biomassa (g/L) e pH proveniente de análise de regressão dos dados dos cultivos, feito no software Minitab 17.
O efeito da temperatura na biomassa a 48h, entretanto, não é tão expressiva,
como mostra a tabela 21, sendo em média 12% maior a 25⁰C em relação a 35oC.
Deste modo a ausência da temperatura como fator determinante na análise de
regressão se dá por seu consideravelmente menor efeito sobre os valores de
biomassa.
Tabela 21. Valores de biomassa a 48h a 25⁰C ou 35⁰C para cada condição de cultivo (pH, agitação e %inulina).
Biomassa a 48h (g/L)
pH Agit (rpm) Inulina (%) 25⁰C 35⁰C
4,0 50 1,5 0,88 0,00
4,0 150 0,5 0,00 0,00
6,0 50 1,5 1,79 1,58
6,0 150 0,5 2,08 1,73
Por outro lado, a taxa de crescimento máxima (µmax) não demonstra a mesma
simplicidade que a biomassa. Através de análise de regressão via Minitab 17 (feita
com base nos dados da tabela 18) obtém-se a seguinte equação:
𝜇max (ℎ−1) = −2,189 + 0,976𝑝𝐻 − 0,002500𝐴𝑔𝑖𝑡 − 0,0799𝑝𝐻2 + 0,000567𝑝𝐻𝐴𝑔𝑖𝑡
R² = 0,9638
6,05,55,04,54,0
2,0
1,5
1,0
0,5
pH
Méd
ia d
e B
iom
ass
a
(g/L
)
Gráfico de Efeitos Principais para Biomassa (g/L)Médias Ajustadas
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
40
R² adj = 0,9493
R² pred = 0,8982
De acordo com a equação supracitada, a velocidade de crescimento é
dependente do pH e agitação.
Figura 25. Gráfico de contorno representando a relação entre µmax, agitação e pH proveniente de análise de regressão dos dados dos cultivos, feito no software Minitab 17.
Na Figura 25, que representa a equação acima, se verifica que dentro dos
valores estudados, a influência de ambos os valores na taxa de crescimento é positiva,
ou seja, quanto maior o pH e agitação, maior a taxa de crescimento de P.
pentosaceus.
Isto reflete parcialmente o modelo de Presser, que diz que a taxa de
crescimento é mais próxima do ideal em pH médio entre os limites de crescimento do
micro-organismo em questão. No caso de P. pentosaceus, como mostra a figura 26,
os valores de pH mínimo e máximo de crescimento são 4,5 e 8,0 respectivamente,
levando a um pH ótimo entre 6,0 e 6,5. Isso se aproxima de dados da literatura, que
sugerem um pH ideal de cultivo de P. pentosaceus igual a 5,5 (CAI et al., 1999).
pH
Ag
it
6,05,55,04,54,0
150
125
100
75
50
>
–
–
–
–
–
–
< 0,00
0,00 0,05
0,05 0,10
0,10 0,15
0,15 0,20
0,20 0,25
0,25 0,30
0,30
(h-1)
µmax
Gráfico de Contorno de µmax (h-1) versus Agit; pH
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
41
Figura 26. Gráfico de µ𝒎𝒂𝒙/µ𝒐𝒑𝒕 por pH segundo a equação de Presser, feito pelo
software MatLABs R2015a usando pHmin=4,5 e pHmax=8,0.
Em relação à agitação individualmente, obtém-se uma relação linear entre esta
e a taxa de crescimento (µmax) (figura 27), com maiores agitações conseguindo
maiores taxas.
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
42
Figura 27. Gráfico da relação entre µmax e agitação em meio de pH=5,5, feiµto pelo software MATLAB R2015a.
Já a ausência da temperatura como variável na análise de regressão pode ser
analisada através da equação expandida de Ratkowsky. Considerando a temperatura
máxima de crescimento de P. pentosaceus como 40ºC e a mínima como 3oC,
temperatura mínima demonstrada para LABs em cultura líquida (VALÍK;
MEDVED’OVÁ; LIPTÁKOVÁ, 2008) foi obtido o gráfico da figura 28. Os parâmetros
de Ratkowsky usados foram 𝑏 = 0.025 e 𝑐 = 0.180, valores derivados de estudos com
L. rhamnosus (VALÍK; MEDVED’OVÁ; LIPTÁKOVÁ, 2008).
Figura 28. Gráfico de temperatura (oC) por velocidade de crescimento (𝒈
𝑳∗𝒉), segundo
a equação expandida de Ratkowsky, feito pelo software MATLAB R2015a usando Tmin=3,0oC e Tmax=40oC.
Segundo resultados do modelo de Ratkowsky há grande influência da
temperatura na taxa de crescimento microbiano nos valores de cultivo do estudo
(considerando b = 0,025 e c = 0,180), já que o valor de µmax para 35⁰C, segundo o
modelo, é 35% maior que a 25⁰C. No entanto, isso não é visto no estudo. Este fato
pode ser explicado devido a limitações no modelo adotado pelo uso de valores de
constantes não específicas ao microorganismo do estudo devido a limitadas
informações para P. pentosaceus.
A latência (𝑡𝐿𝐴𝐺) foi analisada através de análise de regressão via Minitab 17
em relação as condições de cultivo (com base nos dados da tabela 18), chegando na
seguinte equação:
𝑡𝐿𝐴𝐺(ℎ) = 42.41 − 6.167𝑝𝐻
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
43
R² = 0,8297
R² adj = 0,8107
R² pred = 0,7382
Esta equação mostra que a latência dos cultivos depende, dentro dos valores
de cultivo do estudo, exclusivamente do pH. Como pode ser visto na figura 29, a
latência, ou seja, o tempo até atingir a fase exponencial, é menor para maiores valores
de pH.
Figura 29. Gráfico de linha representando a relação entre 𝒕𝑳𝑨𝑮(h) e pH proveniente
de análise de regressão dos dados dos cultivos, feito no software Minitab 17.
A produção total de lactato, maior produto do cultivo de P. pentosaceus, foi
analisada por regressão segundo as condições de cultivo, assim como em relação à
biomassa total via Minitab 17 (com base nos dados da tabela 19) obtendo-se a
seguinte equação:
𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢çã𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑐𝑡𝑎𝑡𝑜 (𝑔
𝐿) = 0,595 + 4,142𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎
R² = 0,9235
R² adj = 0,9176
R² pred = 0,9030
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
44
Esta equação se destaca por não mostrar relação entre qualquer das condições
de cultivo e a produção de lactato. A relação à biomassa obtida, entretanto, pode ser
analisada segundo o pH inicial de cultivo, como mostrado anteriormente, através da
equação:
𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 (𝑔
𝐿) = −26,34 + 10,63𝑝𝐻 − 0,991𝑝𝐻²
Usando das duas equações foi obtida a seguinte relação da produção de
lactato:
𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢çã𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑐𝑡𝑎𝑡𝑜 (𝑔
𝐿) = 0,595 + 4,142(−26,34 + 10,63𝑝𝐻 − 0,991𝑝𝐻2)
𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢çã𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑐𝑡𝑎𝑡𝑜 (𝑔
𝐿) = −4,105𝑝𝐻2 + 44,029𝑝𝐻 − 108,505
Esta equação mostra um máximo (figura 30), assim como a equação de
biomassa, em 𝑝𝐻 = 5,4, onde a produção de lactato a 48h é 9,55g/L.
Figura 30. Gráfico de linha representando a relação entre a produção de lactato (g/L) a 48h e pH inicial proveniente de análise de regressão dos dados dos cultivos, feito no software MATLAB 2015a
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
45
Os consumos de glicose e frutose, principais fontes energéticas disponíveis no
cultivo, foram analisados por análise de regressão (dados do da tabela 19) via Minitab
17, obtendo-se as seguintes equações:
𝐶𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒 (𝑔
𝐿) = −7,79 + 2,159𝑝𝐻 + 3,596𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎
R² = 0,8944
R² adj = 0,8768
R² pred = 0,8467
𝐶𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜 𝑑𝑒 𝑓𝑟𝑢𝑡𝑜𝑠𝑒 (𝑔
𝐿) = −0,201 + 0,479𝐼𝑛𝑢𝑙𝑖𝑛𝑎 + 0,488𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎
R² = 0,4031
R² adj = 0,3036
R² pred = 0,0891
Embora o modelo não seja suficientemente preditivo para o consumo de
frutose, é possível ver um maior consumo de frutose em presença de maior
concentração de inulina, um frutano.
No caso do consumo de glicose, este é demonstrado como baseado no pH
inicial e biomassa a 48h do cultivo. Considerando-se a biomassa a 48h de cultivo como
referente ao pH inicial do cultivo (segundo a equação 𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 (𝑔
𝐿) = −26,34 +
10,63𝑝𝐻 − 0,991𝑝𝐻²), pode-se chegar a seguinte equação:
𝐶𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒 (𝑔
𝐿) = −7,79 + 2,159𝑝𝐻 + 3,596(−26,34 + 10,63𝑝𝐻 − 0,991𝑝𝐻2)
𝐶𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒 (𝑔
𝐿) = −102,51 + 40,38𝑝𝐻 − 3,56𝑝𝐻²
Conforme esta equação e a figura 31, o consumo de glicose a 48h de cultivo
possui um máximo em pH = 5,7 onde Consumo de glicose = 12,00g/L.
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
46
Figura 31. Gráfico de linha representando a relação entre a consumo de glicose (g/L) a 48h e pH inicial proveniente de análise de regressão dos dados dos cultivos, feito no software MATLAB 2015ª Tabela 22. Tabela comparativa dos valores de biomassa, consumo de glicose e produção de lactato a 48h, latência e taxa de crescimento máximo (µmax) por pH inicial de cultivo relativo aos valores obtidos para pH = 5,5 (considerado ideal na literatura), de acordo com as análises de regressão obtidas. Valores destacados em uma escala de menor valor (vermelho) para maior valor (verde).
pH Biomassa
(g/L)
Consumo de glicose
(g/L)
Produção de lactato
(g/L)
Latência (h)
µmax (h-1)
4,0 15% 17% 20% 209% 50%
4,1 27% 27% 32% 202% 55%
4,2 38% 36% 42% 194% 59%
4,3 49% 45% 52% 187% 64%
4,4 58% 52% 61% 180% 68%
4,5 66% 60% 69% 173% 72%
4,6 74% 67% 76% 165% 75%
4,7 81% 73% 82% 158% 79%
4,8 86% 78% 87% 151% 82%
4,9 91% 83% 92% 144% 85%
5,0 95% 87% 95% 136% 88%
5,1 98% 91% 98% 129% 91%
5,2 100% 94% 100% 122% 94%
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
47
5,3 101% 97% 101% 115% 96%
5,4 101% 99% 101% 107% 98%
5,5 100% 100% 100% 100% 100%
5,6 98% 101% 98% 93% 102%
5,7 96% 101% 96% 85% 103%
5,8 92% 100% 93% 78% 105%
5,9 88% 99% 88% 71% 106%
6,0 82% 98% 83% 64% 107%
Com base nas equações de regressão foi possível se inferir que o fator de
maior impacto sobre o cultivo é o pH inicial, por afetar diretamente na biomassa,
consumo de glicose, produção de lactato, latência e taxa de crescimento máximo
(µmax).
Como mostra a tabela 22, o pH citado como ideal na literatura (CAI et al., 1999;
COSTER; WHITE, 1964; FRANZ et al., 2014) se aproxima dos valores com máximo
de biomassa (máximo em pH = 5,4), consumo de glicose (máximo em pH = 5,7) e
produção de lactato (máximo em pH = 5,4). No caso de latência e µmax, entretanto,
são obtidos melhores valores (menor latência e maior taxa de crescimento) com
maiores valores de pH.
Assim, é possível se concluir que a pH = 5,5 a bactéria P.pentosaceus fornece
ótima acidificação do meio (ideal para produção de alimentos fermentados), consumo
de glicose (para produção de alimentos de baixo teor calórico e/ou de carboidratos) e
alta biomassa final (interessante para a produção de probióticos). Em meios menos
ácidos (pH ≈ 6,0) o crescimento microbiano é mais rápido, embora menor. Isso pode
se dar por ser um meio de acidez tal a obter alta eficiência enzimática, porém menor
viabilidade celular para P.pentosaceus, levando a morte precoce de células.
Através dos cultivos não foi possível se identificar grande relação entre
temperatura e crescimento microbiano, embora cultivos a 25oC tenham obtido
ligeiramente maiores valores de biomassa final que cultivos a 35oC. Um maior número
de cultivos a diferentes temperaturas seria ideal para melhor averiguar a relação e sua
comparação com o modelo teórico de Ratkowsky (ZWIETERING et al., 1991). Através
deste modelo, entretanto, espera-se que com o aumento temperatura se observe um
aumento do crescimento microbiano (e, portanto, da biomassa final) por aumento da
eficiência enzimática e velocidade de reações químicas em geral, entretanto a partir
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
48
de uma temperatura máxima se observe morte celular, levando a declínio da biomassa
final.
A agitação do meio mostrou-se influenciar na biomassa final obtida, de modo a
se obter maiores valores em maior agitação (obtendo com 150rpm taxa de
crescimento cerca de 10% maior que a 50rpm). Isso muito provavelmente se deve à
maior homogeneização do meio em maior agitação, causando um crescimento mais
regular e ideal. Embora não tenha sido obtido segundo as condições experimentais
um valor máximo de agitação, é esperado que em valores mais altos de agitação a
biomassa produzida seja prejudicada devido a morte microbiana por cisalhamento.
Um estudo com cultivos em maior agitação seria necessário para se averiguar um
valor ideal de agitação para o crescimento de P.pentosaceus.
Embora sugerida relação entre concentração inicial de inulina e o consumo de
frutose, não foi obtido nenhum modelo suficientemente preditivo para esta relação.
Sendo a inulina um polímero de frutose é de se esperar que a presença desta leve a
maior disponibilidade de frutose para consumo e a um maior crescimento microbiano.
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
49
7. CONCLUSÕES
Este estudo possibilitou se averiguar matematicamente a influência de diversos
fatores (pH, temperatura, %inulina e agitação) sobre parâmetros do crescimento
microbiano de P.pentosaceus . Mais especificamente, as análises de condições de
cultivo levaram a conclusão de que a produção de biomassa e lactato ideal, assim
como o consumo de glicose, se dá em pH inicial próximo a 5,5 enquanto que a taxa
de crescimento (µmax) ideal se dá em maiores valores de pH inicial, agitação e
temperatura (até próximo de 30oC). Do mesmo modo, a latência para o crescimento
exponencial é ideal em maiores valores de pH inicial. Estes resultados são
exemplificados pelos ensaios MRS (pH=6,5; Inulina=0%; Agit=100rpm; T=30oC), que
obteve a menor latência (4,05h) e alto µmax (0,24h-1), e ensaio C (pH=5,0; Inulina=0%;
Agit=100rpm; T=30oC), que obteve a maior produção de biomassa (2,26g/L) e menor
pH a 48h (3,55). Ambos os ensaios também foram os com maior produção de lactato
a 48h (10,40g/L e 9,08g/L, respectivamente).
O uso do modelo de Gompertz para a modelagem da cinética de crescimento
microbiano, no entanto, não foi possível devido a limitações em relação aos dados de
crescimento, do mesmo modo que o modelo de Ratkowsky, que não correspondeu
aos achados experimentais. Estes, entretanto, demonstraram a viabilidade de uso de
modelos teóricos de crescimento microbiano para predizer dados experimentais.
Embora posteriores estudos sejam necessários para confirmar as relações dos
modelos teóricos com os dados experimentais de crescimento de P.pentosaceus.
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
50
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Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
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ANEXO
Tabela 3. Concentração celular de P. pentosaceus cultivado em meio de cultivo MRS. Resultados obtidos através de pesagem da biomassa em comparação com biomassa calculada.
Biomassa (g/L)
Biomassa (g/L)
calculada
1.78 1.78
0.47 0.36
0.38 0.30
0.28 0.25
0.20 0.22
0.14 0.20
0.06 0.06
Figura 11. Regressão linear do crescimento em fase exponencial do cultivo MRS para determinação da inclinação da reta (µmax).
y = 0.245x - 0.9933R² = 0.9978
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 2 4 6 8 10
pH=6,5; 100rpm; 0% inulina; 30oC
y = 0.1804x - 1.8229R² = 0.9998
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 5 10 15 20 25 30
pH=5,0; 100rpm; 0% inulina; 30°C
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
59
Figura 12. Regressão linear do crescimento em fase exponencial do cultivo MRS para determinação da inclinação da reta (µmax).
Figura 13. Regressão linear do crescimento em fase exponencial do cultivo MRS para determinação da inclinação da reta (µmax).
Figura 14. Regressão linear do crescimento em fase exponencial do cultivo MRS para determinação da inclinação da reta (µmax).
y = 0.0396x - 0.8R² = 1
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0 10 20 30 40 50 60
pH=4,0; 50rpm; 0,5% inulina; 25°C
y = 0.0308x - 0.6R² = 1
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 10 20 30 40 50 60
pH=4,0; 50rpm; 1,5% inulina; 25°C
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
60
Figura 15. Regressão linear do crescimento em fase exponencial do cultivo MRS para determinação da inclinação da reta (µmax).
Figura 16. Regressão linear do crescimento em fase exponencial do cultivo MRS para determinação da inclinação da reta (µmax).
y = 0.2455x - 1.066R² = 0.8895
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 2 4 6 8 10 12
pH=6,0; 50rpm; 0,5% inulina; 35°C
y = 0.235x - 1.02R² = 0.8718
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 2 4 6 8 10 12
pH=6,0; 50rpm; 1,5% inulina; 35°C
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
61
Figura 17. Regressão linear do crescimento em fase exponencial do cultivo MRS para determinação da inclinação da reta (µmax).
Figura 18. Regressão linear do crescimento em fase exponencial do cultivo MRS para determinação da inclinação da reta (µmax).
y = 0.255x - 1.9267R² = 0.9682
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 2 4 6 8 10 12 14
pH=6,0; 50rpm; 1,5% inulina; 25°C
y = 0.32x - 1.9167R² = 0.9999
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 2 4 6 8 10 12
pH=6,0; 150rpm; 0,5% inulina; 35°C
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
62
Figura 19. Regressão linear do crescimento em fase exponencial do cultivo MRS para determinação da inclinação da reta (µmax).
Figura 20. Regressão linear do crescimento em fase exponencial do cultivo MRS para determinação da inclinação da reta (µmax).
Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires
63
Figura 21. Regressão linear do crescimento em fase exponencial do cultivo MRS para determinação da inclinação da reta (µmax). Tabela 20. Valores de biomassa a 48h por pH segundo análise de regressão com enfoque ao valor máximo de biomassa, feita pelo software Minitab 17.
pH Biomassa a 48h (g/L)
4.0 0.324
4.1 0.584
4.2 0.825
4.3 1.045
4.4 1.246
4.5 1.427
4.6 1.588
4.7 1.730
4.8 1.851
4.9 1.953
5.0 2.035
5.1 2.097
5.2 2.139
5.3 2.162
5.4 2.164
5.5 2.147
5.6 2.110
5.7 2.053
5.8 1.977
5.9 1.880
6.0 1.764
y = 0.27x - 1.4933R² = 0.9927
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 2 4 6 8 10 12
pH=5,0; 100rpm; 1,0% inulina; 30°C