Traitements de l'échantillon biologique avant l'analyse chromatographique. Applications à la pharmacocinétique et à la toxicologie

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    09-Dec-2016

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<ul><li><p>Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVI, n 3, 2004 </p><p>Traitements de l'chantillon biologique avant l'analyse chromatographique. </p><p>Applications la pharmacocintique et la toxicologie </p><p>Sample handling and pre-treatment prior to chromatographic analysis. Applications to </p><p>pharmacokinetics and toxicology </p><p>Olivier NICOLAS'", Damien ROBERT", Marie T. KELLY2, FranoiseBRESSOLLE"* </p><p>(1) Laboratoire de Pharmacocintique Clinique (2) Centre de Formation en nologie, Facult de Pharmacie, Universit Montpellier I </p><p>34093 Montpellier Cedex - FRANCE </p><p>* Auteur qui adresser la correspondance : Dr Franoise BRESSOLLE, Laboratoire de Pharmacocintique Clinique, Facult de Pharmacie - BP 14491, Universit Montpellier I - 34093 Montpellier Cedex - FRANCE </p><p>Tel : 33 4 67 54 80 75 - Fax ; 33 4 67 54 80 75 - E-mail : FBressolle@aoi.com </p><p>RSUM Lors de la quantification des mdicaments (et de leurs meta-bolites ventuels) dans tes milieux biologiques, deux tapes sont importantes : i) le recueil et la consewation de Vchan-tillon qui doivent garantir la stabilit des analytes et ii) le prtraitement de celui-ci Cette dernire tape est particuli-rement cruciale lors d'expertises mdico-lgales. Les diffi-cults rencontres sont lies la complexit du milieu biolo-gique mais aussi aux faibles concentrations du ou des ana-lytes quantifier. Aprs un bref rappel des mthodes d'ana-lyse les plus couramment utilises pour quantifier les mdi-caments et des problmes lis au recueil des chantillons biologiques, nous prsenterons les diffrentes mthodes de pr-traitement en vue d'une analyse par chromatographic liquide haute performance ou par chromatographic en phase gazeuse. Les avantages et les inconvnients de ces mthodes et leur possibilit d'automatisation seront discuts. MOTS-CLS Matrice biologique, pr-traitement, dprotinisation, extra-ction liquide-liquide, extraction solide-liquide. </p><p>(Reu le 18 dcembre 2003 ; accept le 15 janvier 2004) </p><p>SUMMARY During the analysis of drugs and metabolites in biological matrices, two important steps must be considered, i) the sta-bility of the compounds during sample collection and stora-ge and ii) sample pretreatment. This later is a particularly crucial problem in the case of forensic analysis. The diffi-culties encountered are related to the complexity of the bio-logical matrix and to the fact that the analyte(s) are fre-quently present in extremely low concentrations. Following a brief summary of the various methods routinely used in drug analysis and the problems encountered during sample col-lection and storage, different techniques employed in the pre-paration of biological samples prior to separation by liquid or gas chromatography will be presented. The advantages and disadvantages of the techniques described will be dis-cussed in addition to the various possibilities for automa-tion. KEY-WORDS Biological matrix, P re-treatment, Deprotenisation, Liquid-Liquid extraction, Solid-phase extraction. </p><p>199 Article available at http://www.ata-journal.org or http://dx.doi.org/10.1051/ata/2004012</p></li><li><p>Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVI, n 3, 2004 </p><p>Introduction Au cours des tudes de pharmacocintique, de mtabo-lisme et en toxicologie clinique, il est ncessaire de quantifier les mdicaments et leurs metabolites ven-tuels dans des milieux biologiques complexes comme, par exemple, le sang total, le plasma, le srum, les urines, la bile, les fces, les tissus, etc (1,2). Ces matrices contiennent une multitude de substances endognes (protines dans le plasma ou acides gras dans les urines) en quantits bien suprieures celles des composs et de leurs metabolites quantifier. Nombreux sont les composs endognes prsentant des groupements fonctionnels ractifs (comme les fonc-tions carboxyliques des acides amins ou des acides gras) pouvant participer aux ractions de drivation et interfrer avec l 'analyse chromatographique des com-poss d'intrt. Le pr-traitement des chantillons est donc une tape fondamentale pour ce type d'analyse. Il devient particulirement crucial lorsqu'il s'agit de rechercher des mdicaments dans des milieux biolo-giques issus de cadavre au cours d'expertises mdico-lgales (3). Il a t rapport que les concentrations d'acides palmitique, linolique et starique, de diocyl phtalate, de squalne et de cholestrol augmentent au fur et mesure de la putrfaction (4). </p><p>Aprs un bref rappel des mthodes d'analyse les plus couramment utilises pour quantifier les mdicaments et des problmes lis au recueil des chantillons (il est important en effet de prciser dans quelles conditions ces derniers doivent tre recueillis), nous prsenterons les techniques de pr-traitement avec leurs avantages, leurs inconvnients et les possibilits d'automatisation. Afin d'illustrer les diffrents chapitres de ce manuscrit, des articles publis dans le domaine de la pharmacoci-ntique et de la toxicologie seront donns en exemple. </p><p>Mthodes d'analyse Les mthodes les plus couramment utilises sont la chromatographic en phase gazeuse (CG) avec dtection par ionisation de flamme, thermoonique, capture d'lectron ou spectromtrie de masse (SM) et la chro-matographic liquide haute performance (CLHP) avec dtection dans l'ultraviolet (UV), en fluorescence ou par lectrochimie. Mais en raison du caractre non volatil de la plupart des mdicaments, l 'analyse par CG ncessite une drvatisation pralable du compos. Par contre, la CLHP est particulirement bien adapte l 'analyse des substances non volatiles et leurs meta-bolites plus polaires. </p><p>En CLHP, l'limination des composants endognes dus la matrice est particulirement importante car ces der-</p><p>niers provoquent une dtrioration rapide des perfor-mances de la colonne analytique (baisse du nombre de plateaux thoriques, perte de slectivit, largissement des pics) et du dtecteur (saturation, augmentation du bruit de fond). En effet, ces composs peuvent s'adsor-ber irrversiblement sur la phase statonnaire comme les lipides (perte de slectivit) ou prcipiter dans la colonne comme les protines (augmentation de la pres-sion en tte de colonne). L'utilisation de pr-colonnes places juste avant la colonne analytique permet de limiter partiellement ces problmes. </p><p>Il faut galement souligner que le choix de la mthode d'extraction peut tre fonction du mode de dtection choisi. C'est ainsi que les extraits obtenus devront tre particulirement propres lorsque l'analyse est ralise par CLHP-UV basse longueur d'onde (210-220 nm) ou par CG et dtection par capture d'lectron. Depuis quelques annes la CLHP couple la spectro-mtrie de masse ou la spectromtrie de masse en tan-dem est de plus en plus utilise. Cependant, une des limites de cette mthode est sa susceptibilit l'effet matrice (5,6). L'effet matrice va perturber l'analyse qualitative et quantitative et par consquent risque de compromettre la validit des rsultats obtenus (7,8). L'effet matrice va dpendre du mode d'analyse, full scan ou SIM . Dans le mode full scan l'addi-tion d'ions issus de la matrice risque de contaminer le spectre de masse de la molcule cible. Dans le mode SIM , les interfrences peuvent tre dtectes par des rapports d'ions non valides lorsque les composs inter-frents prsentent des ions en commun avec le compo-s doser. </p><p>Problmes lis au recueil des chantillons biolo-giques avant F tape de pr-traitement Avant d'tudier les diffrentes techniques de pr-traite-ment, il est important de prciser dans quelles condi-tions l'chantillon analyser doit tre recueilli. Bien que l'analyste n'ait pas la responsabilit du recueil de l'chantillon, il devra communiquer la procdure res-pecter qui garantira son intgrit par rapport l'analy-se qui sera ralise ultrieurement. Les conditions de recueil de l'chantillon (sang total, plasma, srum, urine, bile, etc) sont souvent dfinies en fonction des proprits de l'analyte et en particulier sa stabilit au cours du processus de conservation et au cours de l'analyse elle-mme. </p><p>200 </p></li><li><p>Annales de Toxicologie Analytique vol. XVI, n 3, 2004 </p><p>Dans l'organisme, le pH sanguin est maintenu entre 7,35 et 7,45 ; cet quilibre est contrl essentiellement par la vitesse de ventilation pulmonaire (11-13). Ex-vivo, le sang ou le plasma ne possdant pas ce systme de rgulation, du C 0 2 est rgulirement perdu pendant les tapes de stockage et de manipulation. Des pertes de C 0 2 sont galement observes lors de la conserva-tion d'chantillons de bile. Le rsultat est une augmen-tation du pH de la matrice. La liaison aux protines plasmatiques des mdicaments est souvent pH dpen-dante. Par consquent, toute variation de pH ex-vivo peut modifier de faon significative le pourcentage de liaison d 'un compos aux protines plasmatiques (11-13). La stabilit des composs peut galement tre modifie par les changements de pH (14). Par exemple, les composs fonctions esters, amides, carbamates, ure, bta-lactame, lactones, hydantoines, glucuronides acyls, etc sont susceptibles d'tre dgrads (10). Le pH de l'chantillon biologique peut tre stabilis 7,4-7,5 par addition de tampon citrate ou phosphate (10). Par consquent, le maintien d'un pH stable est essentiel lorsqu'il s'agit de caractriser et de quantifier des com-poss qui sont eux mmes sensibles au pH ou qui gn-rent des metabolites thermosensibles. </p><p>Il est parfois ncessaire de quantifier un compos dans les urines (stupfiants par exemple). Pour le recueil des urines des conservateurs sont souvent ncessaires. Les cheveux et les ongles sont surtout utiliss en toxi-cologie mdico-lgale pour dtecter une exposition des poisons ou des substances illicites. Le site du prlvement doit tre not puisque par exemple la vitesse de pousse des cheveux n'est pas la mme sui-vant les zones du cuir chevelu. </p><p>II est parfois ncessaire de doser un compos dans les tissus. Il peut s'agir de biopsies obtenues par chirurgie, dans ce cas la quantit de tissu disponible pour l'analy-se est trs faible et l'chantillon est toujours contamin par du sang. Un dosage d'hmoglobine permet de cor-riger cette contamination. Il est important de noter ga-lement le site du prlvement. Le prlvement tissulai-re peut correspondre la totalit de l'organe (toxicoci-ntique, expertise mdico-lgale), dans ce cas l 'organe sera broy de faon obtenir un homognat. A cet effet, des homognisateurs type Ultraturax peuvent tre utiliss. Cependant, le facteur limitant est la ther-mosensibilit des molcules. Afin d'viter toute dgra-dation des molcules, un bon procd est la conglation des chantillons suivie d 'un broyage dans l 'azote liqui-de (15). En rgle gnrale, il faudra conditionner le prlve-ment le plus rapidement possible entre le moment de son recueil et son stockage dans des conditions qui pr-servent la matrice et la substance analyser. </p><p>Lors de la mise au point de la mthode de dosage, il faudra galement s'assurer que l 'anticoagulant choisi n 'a pas d'influence sur les performances de la mthode analytique utilise pour quantifier le compos (16,17). Rcemment, Kummerle et al (18), ont mis en viden-ce, chez l'animal, que l'hparine influenait le dosage de la doxorubicins </p><p>Elimination des composs interfrants Les lments importants considrer lors de la mise au point du traitement d 'un chantillon biologique sont 1) les proprits physico-chimiques de l 'analyte, 2) la nature de la matrice, 3) le recueil de l'chantillon avant l'tape de pr-traitement, 4) la stabilit de l'analyte pendant les diffrentes tapes du pr-traitement, 5) le solvant utilis lors de l 'tape finale (reprise de l'extrait sec), qui doit tre compatible avec le systme chroma-tographique utilis, 6) le rendement de l'extraction qui doit tre le plus lev et reproductible possible et enfin 7) la reproductibilit, la justesse et l 'exactitude de ce traitement. </p><p>Avant d'aborder les diffrentes mthodes de pr-traite-ment des chantillons en bioanalyse, il faut rappeler qu'i l est possible d'injecter directement l'chantillon biologique dans la colonne analytique en CLHP. Les injections directes sont uniquement envisageables pour des liquides biologiques (urine ou liquide cphalo-rachidien par exemple) contenant de fortes concentra-tions de l'analyte et de faibles concentrations en pro-tines. Dans ce cas, la matrice est juste dilue dans de l'eau dsionse avant l'injection. Cette approche est galement possible en CG. Une mthode permettant le dosage direct de l'thanol dans le sang total, le srum, l'urine et les selles a t dcrite par Tangermann (19). Ultrafiltration et ultracentrifugation Seule la fraction libre du mdicament est pharmacolo-giquement active. Uultrafiltration permet une limina-tion des protines par filtration du plasma travers une membrane semi-permable. Un certain nombre de kits sont commercialiss cet usage, parmi les plus utiliss on peut citer les dispositifs Centrifree et MPS micro-partition commercialiss par Amicon (20,21), Emit Free Level Filtre commercialis par Syva (22) et Molcut 2 commercialis par Millipore (23). Seules les petites molcules passent, les protines sont rete-nues la surface du filtre. D'emploi simple et rapide, ils permettent d'liminer 99 % des protines. (24). Il y a cependant un certain nombre de sources d'erreur qui sont lies 1) au risque d'adsorption des analytes sur la membrane, en particulier si l'analyte est prsent </p><p>201 </p></li><li><p>Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVI, n 3, 2004 </p><p>faible concentration, 2) au passage de l'analyte li travers la membrane, 3) l'instabilit de l'quilibre de liaison analyte/protines durant le processus de spara-tion, et enfin 4) la formation d 'un dpt de protines la surface de la membrane qui est un facteur limitant de la vitesse et de l'efficacit du processus. La sparation des composs libres peut galement tre ralise par ultracentrifugation. Le plasma est centrifu-g grande vitesse (100 000 g, 24 h). Cela permet d 'obtenir les protines et la forme lie de la molcule dans le culot et un surnageant contenant la forme libre. Cependant des erreurs sont possibles dans l'estimation du compos libre dues certains phnomnes phy-siques comme la sdimentation, la back diffusion, la viscosit et la liaison de l 'analyte aux lipoprotines qui surnagent. (22,23). </p><p>Prcipitation des protines Etant donn leur caractre de zwitterion, les protines sont charges positivement en milieu fortement acide et ngativement en milieu fortement basique. Leur prcipitation (24) peut tre obtenue par modifica-tion 1) de la force ionique (utilisation d 'une solution saline sature de sulfate d 'ammonium), 2) du pH (ajout en petite quantit d 'une solution d'acides forts : acide perchlorique ou trichloractique essentiellement, ou ajout d ' u n e solution basique toujours en faible volume : sulfate de zinc/hydroxyde de sodium ou sul-fate de zinc/hydroxyde de baryum), ou 3) de la constante dilectrique (ajout d'actonitrile, methanol, thanol ou actone). Apres centrifugation, une partie aliquote du surnageant est injecte dans le systme chromatographique. Cependant, le liquide surnageant contient d 'autres constituants cot des protines et frquemment le pic de l 'analyte peut tre accompagn de nombreux autres pics qui sont nfastes pour la sp-cificit de la m...</p></li></ul>

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