한국버섯학회지

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Research ArticleJournal of Mushrooms

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J. Mushrooms 2015 March, 13(1):63-67http://dx.doi.org/10.14480/JM.2015.13.1.63Print ISSN 1738-0294, Online ISSN 2288-8853© The Korean Society of Mushroom Science

*Corresponding authorE-mail : khim61@incheon.ac.krTel : +82-32-835-8298, Fax : +82-32-835-0763

Received January 27, 2015Revised Februay 25, 2015Accepted March 23, 2015

Trametes versicolor 의한 triphenyl methane계 염료의 분해

백승아·최재혁·이태수·임경환*

인천대학교 생명과학부

Biodegradation of triphenyl methane dyes by white rot fungus, Trametes versicolor

Seung-A Baek, Jaehyuk Choi, Tae-Soo Lee and Kyung-Hoan Im*

Division of Life Sciences, Incheon National University, Incheon 406-772, Korea

ABSTRACT: White rot fungi produce lignin-degrading enzymes such as laccase, manganese peroxidase and lignin peroxidase.These extracellular oxidases efficiently degrade recalcitrant synthetic dyestuffs with diverse chemical structures. Here, weexamined the activities of lignin-degrading enzymes in Trametes versicolor using triphenyl methane dyes, crystal violet (CV) andmalachite green (MG). Both dyes were decolorized by T. versicolor in solid and liquid culture conditions. T. versicolor decolorizedMG more quickly than CV in both conditions. Among three ligninolytic enzymes, laccase was most abundantly found in thedecolorization processes of CV and MG. However, higher activity of laccase was needed to degrade CV than MG. The much lessactivity of MnP was also detected. But the increase of MnP activity was well corresponded to the decolorization efficiency of CV,suggesting the involvement of MnP in CV degrading process. However, its role in the degradation process of MG is supposed tobe subsidiary to laccase.

KEYWORDS: Crystal violet, Laccase, Malachite green, Trametes versicolor, Triphenyl methane

서 론

버섯은 예로부터 식용 및 약용으로 이용되어 왔으며 최

근에는 버섯의 다양한 생리활성 물질을 이용한 기능성 식

품소재나 대체의학 소재로써의 연구도 활발히 진행되고

있다. 또한 버섯의 리그닌 분해능을 이용하여 살충제, 제

초제, TNT 등 각종 오염물질의 분해능력에 관한 연구 역

시 활발히 진행되고 있다(Aust and Barr, 1994; Ramn

and Irineo, 2006). 그 중 다양한 난분해성 물질을 친환경

적으로 분해할 수 있는 능력을 가지고 있는 백색부후균의

가치가 증가하고 있다. 이러한 난분해성 물질의 분해는

백색부후균이 분비하는 세포외효소인 laccase, manganese

peroxidase (MnP), lignin peroxidase (LiP)에 의해 이루어

진다. 이때 이용되는 효소의 종류와 양은 버섯의 종류와

분해되는 물질에 따라 달라지는데, Phanerochaete

chrysosporium은 LiP와 MnP를 분비하여 리그닌을 분해

하고(Glenn and Gold, 1985; Tien and Kirk, 1988), 느타

리(Pleurotus ostreatus)는 리그닌 분해시 MnP와 많은 양

의 laccase를 분비한다(Palmieri et al., 1997). 본 연구에

서 이용된 구름버섯(Trametes versicolor)은 laccase와

MnP를 분비하는 것으로 알려져 있다(Johansson and

Nyman, 1987; Goudopoulou et al., 2010; Baek et al.,

2014).

현재 천연염료를 대신하여 사용되는 합성염료는 색이

다양하고 선명하며 가격이 저렴하여 섬유, 종이, 플라스틱,

음식 등 거의 모든 산업에 이용되고 있다. 이러한 합성염

료는 염색공정 후, 환경오염의 주요 원인이 되는 폐염료

를 발생시킨다. 현재 폐염료 처리에 사용되고 있는 물리

화학적인 방법이나 슬러지 처리법 등으로는 이러한 합성

염료를 처리하는데 어려움이 있다. 이러한 문제점을 해결

64 백승아·최재혁·이태수·임경환

하고자 다양한 버섯을 이용하여 합성염료의 분해하는 연

구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 한국산 구름

버섯이 tryphenyl methane계 염료 중 crystal violet (CV)

과 malachite green (MG)을 분해할 수 있는지를 조사하

고, 이에 이용되는 효소의 종류와 활성도를 측정하고자

하였다.

재료 및 방법

균주 및 배양 조건본 실험에는 담자균문 구멍장이버섯목, 구멍장이버섯과,

송편버섯속에 속하는 백색부후균인 구름버섯(Trametes

versicolor, IUM1700)을 인천대학교 버섯균주 은행(CCM;

Culture Collection of Mushrooms)에서 분양 받아 실험에

사용하였다. 분양받은 균주는 PDA 평판배지(Potato

dextrose agar; potato 200 g, dextrose 20 g, agar 20 g, 증

류수 1,000 ml)에 10일간 25oC에서 암배양한 후 실험에

사용하였다.

사용 염료 및 특징실험에는 triphenyl methane계 염료인 crystal violet

(CV; Junsei Chemical Co., Japan)과 malachite green (MG;

Shinyo Chemical Co., Japan)을 사용하였다. 각각의 염료

를 50 mg/L의 농도로 조성하여 PDA (Potato dextrose

agar) 또는 PDB (Potato dextrose broth)에 첨가하여 사용

하였다.

고체 상태에서의 탈색율고체 상태에서의 염료의 탈색율을 측정하는 방법은

Jayasinghe et al. (2008)의 방법을 따랐다. 분양 받은 균

주의 균사를 2호 cork borer를 사용하여 직경 5 mm로 뚫

어서 disc를 만든 후 염료가 첨가된 지름 88 mm PDA 배

지 한가운데에 접종하였다. 25oC의 배양기에서 암 배양하

면서 72시간 마다 균사의 생장과 염료의 탈색 정도를 측

정하였다. 고체 상태에서의 탈색율은 다음 식으로 계산하

였다.

Decolorization index (DI) = DD/MD

Mycelial diameter (MD): 균사가 성장한 직경

Decolorizing diameter (DD): 염료가 분해된 부분의 직경

액체 상태에서의 탈색율액체 상태에서의 탈색율 실험은 Jayasinghe et al. (2008)

의 방법을 참조하여 수행하였다. 30 ml의 PDB에 배양한

5 mm 직경의 균사체 disc 10개를 접종하고 진탕 배양기

에서 20 rpm으로 25oC에서 7일간 암 배양한 후 염료가

녹아있는 PDB를 20 ml 첨가하였는데 이때 염료의 최종

농도가 50 mg/L 되도록 조정하였다. 염료를 첨가한지 2

시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 9일, 11일, 13일 후에 샘플

을 취하여 탈색율을 측정하였다. 측정 방법은 배양액을

Advantec 2호 거름종이로 걸러낸 후, OPTIZEN 2120UV

(Mecasys, Korea)로 각 염료의 최대흡수파장(λmax A)에서

흡광도를 측정하였다. CV와 MG의 최대흡수파장은 각각

589 nm, 614 nm이다. 탈색율은 다음의 식을 이용하여 측

정하였다.

염료탈색율(%) = (A0-A)/A0X100

A0: 염료의 최대흡수파장에서의 흡광도

A: 샘플의 최대흡수파장에서의 흡광도

리그닌 분해효소의 활성 측정액체 상태에서의 탈색율을 측정하는 샘플을 사용하여

효소활성 정도를 측정하였다. 단백질 정량은 Bradford

(1976)의 방법을 사용했다. 1 mg/ml의 bovine serum

albumin (BSA; Sigma Chemical Co., USA)을 이용하여

standard 그래프를 그리고, 이를 기준으로 샘플의 단백질

량을 mg 단위로 측정하였으며 이것을 효소활성 측정에

사용하였다.

Lignin peroxidase (LiP)의 활성도는 DeSouza-Ticlo

(2008)와 Kirtikara et al (1995)의 방법을 참고하여 측정

하였다. H2O2가 기질인 veratryl alcohol을 산화시켜

veratrylaldehyde (ε310 = 9,300 M-1cm

-1)가 되는 정도를 측

정하였다. 125 mM d-tartaric acid buffer (pH 2.5) 400 μl

와 40 mM veratryl alcohol 50 μl, H2O2 50 μl 혼합액에

샘플 500 μl를 넣은 직후 310 nm에서 흡광도를 측정하였

다. 이를 상온에서 10분 반응시킨 후 다시 310 nm에서의

흡광도 측정하여 값의 차이를 비교하였다. 1 unit은 1분간

생성된 산화물(㎛ol)의 양으로 정의하였으며 측정된 효소

활성을 샘플의 총 단백질량으로 나누어서 계산하였다..

LiP activity (unit/mg) =

Manganese peroxidase (MnP)의 활성도의 측정은 Hong (2013)

의 방법을 따랐다. 기질로 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-

6-sulfonic acid) (ABTS; ε420 = 36,000 M-1cm

-1)를 사용하

였다. 0.2 M lactate buffer (pH 4.5) 800 μl에 ABTS 50

μl와 6 mM MnSO4 33 μl, 샘플 100 μl를 섞고 마지막으로

0.1 mM H2O2를 17 μl 첨가하였다. 상온에서 30분간 반응

시킨 후, 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 1 unit은 1분

동안 산화된 ABTS의 양(μmol)으로 정의하였다.

MnP activity (unit/mg) =

Laccase의 활성도 측정 역시 Hong (2013)의 방법을 따

Absorbance 106

Totalcolume L( )××Δ

Time min( ) ε310

Weight of totalprotein mg( )××Δ-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Absorbance 106

Totalcolume L( )××Δ

Time min( ) ε420

Weight of totalprotein mg( )××Δ-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Biodegradation of synthetic dyes by white rot fungus 65

라 기질로 ABTS (ε420 = 36,000 M-1cm

-1)를 사용하였다.

0.2 M lactate buffer (pH 4.5) 850 μl에 ABTS를 50 μl 섞

고 배양액을 100 μl 첨가한다. 그 후 상온에서 3분간 반응

시킨 다음 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 1 unit은 1

분 동안 산화된 ABTS의 양(μmol)으로 정의하였다.

Laccase activity (unit/mg) =

결과 및 고찰

고체 상태에서의 탈색율CV를 첨가한 배지에서 구름버섯의 균사는 접종 후 6일

이후부터 생장하기 시작하여 접종 48일 후 고체배지의 가

장자리까지 생장하였다(Fig. 1A). 염료가 첨가되지 않는

PDA에서의 균사생장이 접종 9일 후에 완료된 것과 비교하

면 CV는 구름버섯의 균사생장을 억제한다는 것을 알 수 있

다. CV의 탈색은 접종 12일 이후부터 시작되었으며 접종

24일 후에 DI 값이 1이 되었으며 그 후로 균사가 생장을 마

칠 때까지 DI 값이 1 전후로 유지되었다(Fig. 1A, Table 1).

MG가 첨가된 배지에서는 접종 후 3일에 균사의 생장이

관찰되었으며 접종 24일 만에 생장이 완료되었다(Fig.

1B). MG 역시 구름버섯 균사의 생장을 방해하지만 CV

배지에서 보다 MG 배지에서 균사의 생장이 2배나 빨랐

다. MG의 탈색은 균사생장과 동시에 관찰되었으며 그 탈

색 속도가 CV 탈색보다 월등히 빨라 접종 3일 만에 DI

값이 1이 되었으며 그 후로는 DI 값이 1 이상을 보여 오

히려 균사의 생장보다 염료의 탈색속도가 더 빨랐다(Fig.

1B, Table 1).

고체배지에서 구름버섯은 CV와 MG를 모두 탈색시켰

지만 균사의 생장속도와 탈색율은 다르게 나타났다. 구름

버섯의 균사는 CV 보다 MG가 첨가된 배지에서 빨리 자

랐으며 염료의 탈색도 빨랐다. 이는 구름버섯이 두 염료

중에서 MG를 더 효율적으로 탈색시킨다는 것을 의미한

다. 또한 MG 배지에서 6일 만에 DI값이 1 이상을 보인데

반해 CV배지에서는 24일이 지난 다음에 DI값이 1이 되

었다(Fig. 1, Table 1). 이는 구름버섯이 버섯의 생장을 방

해하는 두 염료 중 MG를 더 효율적으로 분해하며 균이

생장함과 동시에 세포외효소를 분비하여 MG를 분해한다

는 것을 나타낸다. 반면 CV는 MG 보다 독성이 강하며

처음 균사가 자라는 것을 억제하나 균이 PDA 배지에 있

는 영양소를 이용하여 자라며 동시에 세포외효소를 이용

하여 CV를 분해하는 것으로 판단된다.

Absorbance 106

Totalcolume L( )××Δ

Time min( ) ε420

Weight of totalprotein mg( )××Δ-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Fig. 1A. Decolorization of crystal violet on solid phase by T.versicolor.

Fig. 1B. Decolorization of malachite green on solid phase byT. versicolor.

Table 1. Decolorization of aromatic dyes on solid phase by T. versicolor. DI: decolorization index, DI = DD/MD, MD: Mycelialdiameter, DD: Decolorizing diameter. (mm): millimeter. *The MD of the initial inoculum is 5 mm.

DyeDays of cultures on solid media

0 6 12 18 24 30 36 42 48

CrystalViolet

MD(mm) 5 5 9 26 45 60 73 83 88

DD(mm) 0 0 4 21 45 60 74 83 88

DI 0.0 0.0 0.5 0.8 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

MalachiteGreen

MD(mm) 5 15 46 79 88 - - - -

DD(mm) 0 22 49 82 88 - - - -

DI 0.0 1.4 1.1 1.0 1.0 - - - -

66 백승아·최재혁·이태수·임경환

액체 상태에서의 탈색율구름버섯의 균사체는 접종 후 1-3일 동안 두 가지 염료

를 모두 급격히 탈색하였다(Fig. 2). 균 접종 후 하루 동안

CV는 47%, MG는 74%가 탈색되었으며, 측정 2일 째에

는 CV가 78%, MG는 97%까지 탈색되어 구름버섯의 빠

른 염료 탈색능력을 확인할 수 있었다. 그 이후 CV가 탈

색되는 속도는 감소하여 측정 13일 째에는 95%가 탈색되

었다. MG는 측정 3일 째에 98%가 탈색되었으며 측정 7

일 째에 모두 탈색되었다(Fig. 2). 고체배지에서와 마찬가

지로 구름버섯은 CV보다 MG를 더 신속하게 탈색하였다.

이는 CV와 MG는 같은 트리페닐메탄계의 염기성 염료로

화학적 구조도 유사하나 CV에는 MG에 없는 두 개의

methyl기가 있다. 이 추가의 methyl기가 구름버섯의 생장

을 방해하고 탈색반응을 저해하는데 중요한 역할을 하는

것으로 판단된다. 한편 전반적으로 고체배양보다 액체배

양에서 CV와 MG 탈색반응에서 차이가 적어진 것은 구

름버섯이 분비한 리그닌 분해효소들이 액체배지에서는 높

은 유동성으로 쉽게 기질과 접촉되기 때문으로 여겨진다.

또한 배지에 포함된 영양분을 쉽게 획득하여 균사생장이

왕성해지고 따라서 리그닌 분해효소도 더 많이 분비할 수

있기 때문이다. 고체배지 실험에서는 세포외효소가 두 염

료를 분해하는데 있어서 효율의 차이, 두 염료의 구름버

섯 균사생장에 미치는 독성의 차이, 및 효소가 agar의 미

세한 구멍사이로 스며드는 속도 때문에 균의 생장과 염료

의 탈색효과가 제한을 받게되기 때문에 색소간 버섯의 생

장과 색소분해율이 차이가 액체배양에서 보다 더 극대화

된 것으로 판단된다.

리그닌 분해효소의 활성버섯이 가지고 있는 효소 중 리그닌 분해에 사용하는

것으로 알려진 LiP, MnP, laccase의 활성을 탈색율 과정

에서 조사하였다. 세 가지 효소 중에서 laccase가 CV와

MG의 분해과정에서 가장 높게 측정되었으며 시간이 지

나면서 증가하는 추세를 보였다(Figs. 3, 4). MnP 활성 역

시 측정되었으나 laccase에 비해 상대적으로 낮았으며

LiP는 측정되지 않았다. CV가 첨가된 배지에서 laccase의

활성도가 꾸준히 증가하여 7일 째에 가장 높은 활성을 보

였으며 그 이후 활성도가 감소하다 13일 째에 다시 증가

하였다. MnP 는 접종 초기에는 낮았으나 하루가 지난 후

증가하여 13일 째 까지 비교적 일정하게 유지되었다(Fig.

3). MG가 첨가된 배지에서는 laccase의 활성도가 시간에

비례하여 증가하여 염료가 모두 분해된 7일 째에 최대 활

성도를 보였다. MnP는 MG가 분해되는 전 과정에서 비교

적 일정한 활성을 나타냈다(Fig. 4). 이러한 결과는 구름

버섯이 MG의 분해과정에서 laccase를 주효소로 사용하며

MnP는 laccase에 보조적으로 어떤 역할을 하고 있음을

나타낸다. 한편 CV 탈색과정에서는 laccase 뿐만 아니라

MnP 활성이 2일째부터 증가하기 시작하여 활발한 탈색과

정 동안 일정 수준으로 유지되는 걸로 보아 구름버섯에

의한 CV 탈색과정에서 MnP가 MG 탈색과정에서 보다

중요한 역할을 하며 laccase와 협동작용에 의해 CV 분해

Fig. 2. Decolorization of aromatic dyes [crystal violet (CV),malachite green (MG)] on liquid phase by T. versicolor.

Fig. 3. Activities of ligninolytic enzymes in T. versicolor indecolorizing crystal violet (CV). MnP: Manganeseperoxidase, LiP: Lignin peroxidase. Error bars denotestandard error.

Fig. 4. Activities of ligninolytic enzymes in T. versicolor indecolorizing malachite green (MG). MnP: Manganeseperoxidase, LiP: Lignin peroxidase. Error bars denotestandard error.

Biodegradation of synthetic dyes by white rot fungus 67

에 관여할 가능성이 있는 걸로 판단된다.

액체배양 조건에서 laccase 활성이 탈색율이 가장 활발

할 때보다 염료의 흡광도가 가장 낮았을 때(일반적으로

염료의 일차적 분해가 완료되었을 때) 효소활성이 가장

높은 것은 세포외효소인 색소분해효소가 액체배지에 축척

되면서 그 농도가 증가함에 기인한 것으로 추정된다. 또

다른 설명으로는 이 실험에서 방향족 화합물의 산화효소

인 laccase가 염료의 색소를 1차로 산화시켜 각 염료의 최

대흡수파장(λmax A)에서 흡광도의 변화를 초래한 것이긴

하지만 그 색소의 완전한 산화를 의미하는 것은 아니다.

따라서 laccase에 의해 생성된 색소산화의 중간산물이

laccase에 의해 다음 중간산물로 분해되는 과정이 진행되

고 있기 때문에 색소의 흡광도가 현저히 떨어진 상태에서

도 효소활성이 높은 것으로 설명 될 수 있다. LiP의 활성

도는 측정되지 않았는데 이는 구름버섯이 Azo계 염료 및

방향족 탄화수소인 안트라센(anthracene)의 분해 과정에

서도 이 효소가 분비되지 않았다고 보고된 것에 미루어

(Vyas et al., 1994; Swamy and Ramsay, 1999; Champagne

and Ramsay, 2005; Baek et al., 2014) 구름버섯은 방향

족 물질의 분해에 LiP 보다는 laccase나 MnP를 우선적으

로 분비해 사용하는 것으로 판단된다.

적 요

구름버섯(Trametes versicolor)은 phenolic compound인

CV와 MG를 효과적으로 탈색할 수 있었으며 고체와 액체

배양 상태 모두에서 CV보다 MG를 더 효과적으로 탈색

시켰다. 구름버섯에 의한 두 색소의 탈색 과정에서 phenolic

compounds를 분해하는 것으로 알려진 세 가지 효소 중

laccase의 활성이 가장 높았다. MnP 역시 적은 수치지만

활성을 나타냈으며 LiP의 활성은 나타나지 않았다. 따라

서 구름버섯에 의한 합성염료의 분해과정에서 laccase가

주로 사용되고 MnP는 탈색과정에서 보조적인 작용을 하

는 것으로 추정된다. 그러나 CV의 경우 MnP가 활발하게

염료분해에 관여하는 것으로 판단된다. 또한 MG가 대부

분 탈색되었을 때의 laccase 활성(0.16 U/mg)이 CV가 대

부분 탈색되었을 때의 활성(0.23 U/mg)보다 현저하게 낮

은 것으로 보아 구름버섯이 CV를 탈색시키는데 더 높은

활성의 laccase가 필요로 하는 것이 밝혀졌다. 본 실험에

서 한국산 구름버섯 종의 CV와 MG 탈색능력이 확인되

었으며 앞으로 한국산 구름버섯을 이용한 triphenyl

methane계에 속하는 합성염료의 분해에 관한 친환경적

처리기술 개발에 도움이 될 것으로 기대된다.

감사의 글

본 연구는 2013년도 국립 인천대학교 교내 연구비

(20130528) 지원에 의해 수행되었습니다.

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