Transfección transitoria del cDNA X fusionado a GFP (green fluorescent protein) en células HeLa

• Cultivo celular

• Transfección: “Lipofección”

• Microscopía de fluorescencia

•Localización subcelular

TRANSFECCIÓN

- Introducción de un DNA extraño en células eucariotas

OBJETIVO

•Expresión de proteínas para su purificacón

•Expresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el fenotipo celular

•Estudio de promotores y elementos reguladores

•Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento del RNA, modificaciones postraduccionales, etc.

•Interacción de proteínas

•Clonaje

•Terapia génica

•Etc

TIPOS DE TRANSFECCIÓN

Transfección transitoria:

-Análisis rápido (24- 72 horas). Expresión transitoria en el tiempo.

-No requiere selección

-Generalmente un porcentaje pequeño de células contiene DNA transfectado

TIPOS DE TRANSFECCIÓN

Transfección estable:

- Expresión permanente. Genera una nueva línea celular.

- Requiere selección con antibiótico

- El 100 % de células contiene el DNA transfectado integrado en su genoma

Promoter ANT-RES

Promoter “cDNA-X”

Antibiótico

Marcadores de selección eucariotas

• Metotrexato (MTX)– Mata a las células que carecen de dihidrofolato reductasa– La línea celular huesped debe ser DHFR-

– El vector contiene el gen DHFR – Incrementos en [MTX] aumenta el número de copias génicas

• G418 (Geneticina)– Bloquea la traducción– La resistencia es la neomicina fosfotransferasa ( Neor )– Células de mamífero, plantas y levaduras

• Zeocina

- Antibiótico de la familia bleomicina

- Se intercala en el DNA y provoca su rotura

- El producto del gen ble se une e impide su unión al DNA

- Células de mamífero, levaduras y bacterias

Fosfato de calcio Método simple, barato, baja eficiencia

DEAE-dextrano Método simple, barato, alta eficiencia

Liposomas catiónicos Método simple, caro, media-alta eficiencia

Electroporación, nucleofección Requiere electroporador, alta eficiencia, agresivo

Microinyección Muy laborioso, técnicas especializadas, alta eficiencia

Biobalística Células vegetales, requiere especialización

Retrovirus, Adenovirus Muy eficiente, trabajoso

En general, la eficacia de uno u otro depende del tipo celular

Métodos de Transfección

Métodos de Transfección

Transfección mediada por liposomas y endocitosis

- Los lipidos catiónicos forman estructuras micelares acomplejados con el DNA

- Estas estructuras se fusionan con la membrana celular

- Los complejos se internalizan por endocitosis

- La pared del endosoma se rompe, liberando el DNA en el citoplasma y potencialmente en el núcleo.

- El DNA, una vez dentro del núcleo sigue el proceso para la expresión génica

- Alternativamente, el DNA puede ser degradado dentro del lisosoama

“ Lipofección”

Detección de proteínas fluorescentes por microscopía de fluorescencia en células Hela transfectadas con los plásmidos pAmCyan1-N1, pZsYellow1-N1 y pHcRed1-N1

Microscopía de Fluorescencia

Tinción con Mitotracker

IncubaciónMitotracker CM-H2XRos 45 min in vivo

Tinción To-Pro3 1/500

PANEL A CONTROL NEGATIVO

PANEL B1x10-6 M Mitotracker CM-H2XRos

Medio de montaje Mowiol

Living Colors® Subcellular Localization Vectors

- Living Colors Subcellular Localization Vectors codifican proteínas de fusión de diferentes variantes de proteínas

flucorescentes y señales de localización o proteínas estructrales subcelulares que localizan la proteína fluorescente en un

órganulo o estructura subcelular específica ( actina, tubulina, mitocondria, núcleo, retículo endoplásmico, aparato de

Golgi, membrana plasmática, peroxisomas o endosomas.

-Permiten visualizar estructras subcelulares directamente por microscopía de fluorescencia en tiempo real y sin fijación, ni

uso de tinciones químicas en células transfectadas.

- Permiten marcaje múltiple (co-localización de un gen de interés) mediante el uso de proteínas fluorescentes con colores

diferentes

Uso de Living Colors® Subcellular Localization Vectors para la tinción de orgánulos celulares

Figure 2. Living Colors® AcGFP1 is ideal for multicolor and fluorescence microscopy applications. AcGFP1 and DsRed2 protein fusions were transiently transfected and visualized by fluorescence microscopy.

Panel A. pAcGFP1-Mito (mitochondria) and pDsRed2-Nuc (nucleus) in HEK 293 cells.

Panel B. pAcGFP1-Golgi (Golgi apparatus) and pDsRed2-Nuc (nucleus) in HEK 293 cells.  

Combinaciones de colores para microscopía