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TropTrace“GeneticControlofTropicalTunaSustainabilityandTraceability”
Prof.FaustoTinti
PianodiFormazionedellaBorsadiStudio
Lefrodialimentarisonounfenomenodiffusoealtamentedannosotantopericonsumatoriquantoperle
imprese.L’erroneaetichettatura,indicatadallalocuzione“aliudproalio”,èunproblemachestacrescendo
soprattuttoperviadelsovrasfruttamentodideterminaterisorseerimpiazzoconspecieaffinidiminore
valorecommercialeeprovenientidadifferentiareegeograficherispettoaquelledichiaratesuiprodottiin
commercio.
Per fronteggiare la piaga del fenomeno fraudolento, l’utilizzo e lo sviluppo di metodologie per
l’autenticazionealimentaresonoandati incontroadunacresciutaesponenzialmentenell’ultimadecade.
Tra le diversemetodologie descritte negli ultimi anni, quelle basate sul DNA sono sicuramente le più
promettenti:essefornisconoinformazionimoltopreciseepossonoessereapplicateatuttelediversefasi
di vita di una specie e suquasi tutti i tipi di campioni (Lenstra 2003; Rasmussen andMorrissey 2008).
Pertanto l’analisidelDNAsiprofilacomeun’analisimoltoefficace,essendo ilDNAunamolecolamolto
stabile nell’ambiente, che presenta un profilo identico in tutte le cellule e manifesta una sufficiente
variabilità interspecifica, tale da consentire l’identificazione di specie (Céspedes et al.,2000). Queste
metodologiesibasanosolitamentesullaReazioneaCatenadellaPolimerasi(PCR),checonsentediprodurre
unaquantitàillimitatadicopiediunospecificomarcatoregeneticoingradodidiscriminaretralediverse
specie.Infunzionedituttociò,questimetodid’analisisonopassatidall’essereconsideratiun’areadinicchia
adiventareunadellepiùdiffuseapplicazionibiotecnologichealivelloglobale(Lou2015).
Sebbenelamaggiorpartedellecertificazioniecontrollistandardrimangonoprincipalmentefocalizzatisu
prodottiagricoliesuquelliderivantidall’allevamentodelbestiame(EuropeanCommission’sDatabaseof
Origin&Registration; http://ec.europa.eu/agriculture/quality/door/list.html), il settore nel quale si è
manifestata una presa di posizione netta sull’importanza dell’utilizzo di questi test è stato quello del
“seafood”(Marianietal.,2015).L’incrementodelleindaginimolecolarinelsettoredelseafoodhatuttavia
evidenziato una poca trasparenza nelle operazioni commerciali, sollevando polveroni mediatici spinti
soprattuttodaorganizzazioniambientaliste(Marianietal.,2014).
Nel settore seafood ci sono sicuramente delle specie focali: tra cui spiccano tutte quelle specie
comunemente raggruppate con l’indicazione “tonno”. Nel loro insieme, le sette specie di tonno
commercialmentepiù importantisonotra iprincipaliprodotti itticidelpianeta:nelsolo2014lecatture
totali ammontavano a circa 5,5milioni di tonnellate (FAO 2014), evidenziando l’importanza di questo
gruppotassonomicocomerisorsaalimentareperl’uomo.Lespecietropicalidestinateall’inscatolamento
fornisconoproteineabbondantiepococostoseperimercatidituttoilmondo,mentrepiccolequantitàdi
filettiesashimidispeciedipiùaltaqualità(i.e.Thunnusthynnus)sifannostradaversoimercatiricchiin
Asia,EuropaeNordAmerica. Il tonno inscatolarappresenta laconserva itticapiùvendutasulmercato
mondiale,conunvolumed’affarichesiaggiraintornoai19,3miliardidieurol’anno(FAO2014).Ilvalore
dimercatodeltonno inscatolaraggiunge livelliapicali in Italia,cherappresentaunodeipiù importanti
mercatimondialiedilsecondopiùgrandeproduttoreinEuropa.
Differenti protocollimolecolari sono stati testati e validati per la corretta identificazioni delle speciedi
tonno all’interno delle scatolette, al fine di fornire alle autorità, all’industria e ai consumatori validi
strumentidicontrollochepossanogarantirelasicurezzaalimentareelacorrettacommercializzazionedi
questiprodotti.Tuttavia,l’applicabilitàdeiprotocollimolecolarisuitonniinscatolaèancoracircondatada
alcuneincertezzelegateprincipalmenteallaquantitàequalitàdelDNAestraibile.IlDNAdiquestiprodotti
risultainfattiesserealquantodegradatoeframmentatoacausadeiprocessidilavorazioneeconservazione
mediantecotturadellamateriaprimaesuccessivaimmersionenelliquidodigoverno,pergarantirelaloro
conservazioneamedioelungotermine(HammesandHertel2003).
DescrizioneIlprogettoTROPTRACEsiproponel'obiettivodieffettuareunaricercacheportiallasostenibilitàdella
pescadeitonnitropicali,allacaratterizzazioneedallasicuratracciabilitàdeiprodottilungolafiliera
produttivadeltonnoinscatola,attraversol’utilizzodistandardizzateeinnovativetecnichemolecolari,al
finedievidenziareecontrastarepossibilifrodialimentari,comeperesempioquelladell’erronea
etichettatura.
Sottoquestoobiettivogenerale,sonostatiidentificatiduequestioni-chiaveditiposcientifico:
1) Ledifficoltànelcombinareedarmonizzaredatieconoscenzeutiliallagestioneintegratadistock
condivisifralediverseCommissionitonniereelediverseareegestionalipossonoesseresuperate
dallamigliore comprensione delle dinamiche ecologiche ed evolutive delle popolazioni di tonni
tropicali su tutto l'arealedidistribuzione. Inparticolare,vièun’urgentenecessitàdi sviluppare
modelligestionalicheutilizzinodatiindipendentidaquellidapesca,perdescrivereledinamichedi
popolazione con maggiore realismo biologico e per armonizzare la gestione degli stock. In
particolare,glistockditonnopinnagialla(Thunnusalbacares),sonofortementesfruttatidaalcuni
decenniascalaglobale.Datigenomicirecentementesviluppatiindicanolapresenzadiunpiùalto
livello di strutturazione geneticadi quanto assuntodalle Commissioni tonniere (Pecoraro et al.,
2016).Lapresenzadistrutturaall’internodiunapopolazionepuòrappresentareunfattoredirischio
perlaperditadidiversitàselaspecieinesameèfortementesfruttatacomenelcasodeltonnopinna
gialla.Lesottopopolazionichesubisconounariduzioneindimensioneriesconoacontrobilanciare
attraversoilflussogenicolamaggioreperditadivariabilitàdovutoall’effettodelladerivagenetica.
Inognimodo,leconseguenzegenetichealungoterminesonoesasperateperlemetapopolazioniin
quanto subiscono frequenti colli di bottiglia associati ad eventi regolari di estinzione e
ricolonizzazione. A tal proposito, per stabilire se le popolazioni di tonnopinna gialla sono state
ridotte a livelli critici per ilmantenimento della diversità genetica, in questo progetto verranno
effettuatestimedelladimensionedellapopolazioneeffettiva(Ne),chenonsonomaistatepresein
esameperquestaspecie.
2) Mantenerelatracciabilitàdeiprodotti inunafilieracomplessacomequelladeltonno,èimpresa
assai ardua. Ricostruire la storia di ogni confezione, attraverso tutti i fornitori a livello globale,
evitandodiandare incontroaderroridietichettaturadichiarandonelleconfezioniunaspecieal
postodiun’altra,èundovereperleaziendeproduttriciedunanecessitàpericonsumatori.Atal
proposito, TropTrace si prefigge di costruire un sistema di tracciabilità genetica in grado di
monitorareilpercorsodellamateriaprimadalmarealletavoledeiconsumatori.Unsistemache
possaessereassociatoaquelligiàadoperatidalleaziendeechepossafarsigarantedellalottaalle
frodialimentarieallapescaillegale.Unchiaroobiettivodelprogettoèquellodiutilizzaretessuti
delle specie di tonno comunemente inscatolate, che sono andati incontro a diversi processi di
lavorazione,inmododasvilupparedegliefficaciapproccimolecolaricheconsentanodidiscriminare
tralediversespecieindipendentementedallaqualitàedellaquantitàdelDNAadisposizione.Un
sistema in grado di assicurare la completa tracciabilità dei prodotti, in grado di smascherare
eventualifrodiechepossaconsentireintempibrevidirisalireadpossibilianomalielungolafiliera
produttiva.
Programmadiformazione
Il progetto di formazione sarà articolato al fine di ottenere dati scientifici per assicurare la
caratterizzazioneetracciabilitàdellespeciediimportanzacommercialelungolafilieraproduttiva
deltonnoinscatola.
Il/Laborsistasaràformatonelleseguentiattività
ü Campionamento
Lostudiosifocalizzeràsullequattroprincipalispecieditonnodestinateall’inscatolamento:i)tonno
pinnagialla(Thunnusalbacares);ii)tonnoobeso(Thunnusobesus);iii)tonnettostriato(Katsuwonus
pelamis)eiltonnoindopacifico(Thunnustonggol).Perognispecieverrannoanalizzatitessuticon
quattro diversi livelli di lavorazione (crudo, cotto, sterilizzato1 e sterilizzato2), che verranno
campionatipressoiprincipaliimpiantiditrasformazioneecommercializzazionedeltonnoalivello
globale.Alfinedigarantirelasignificativitàstatistica,leanalisiperognilivelloverrannoripetutein
modoindipendente3volteall’internodellaspecie,dellivellodilavorazioneedell’areadipesca,
peruntotaledi168campioni(Tabella1).
Tabella1_Disegnodicampionamento
AreaYFT BET SKJ TTON
crudo cotto ster.1 ster.2 crudo cotto ster.1 ster.2 crudo cotto ster.1 ster.2 crudo cotto ster.1 ster.2
AO 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X
IO 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X
EPO 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X
WCPO 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X
ü EstrazioneDNA
Ladifficoltàmaggiorenell’analisidelDNAprovenientedamatricicomplesse,comequelladeltonno
in scatola, è rappresenta certamente dalla sua estrazione. Risulta quindi fondamentale
l’ottimizzazionedellemetodicheestrattiveattraversoilbilanciamentodialcunicriteridigiudizio,
comeperesempio:buonaresafinaleequalitàdelDNAestratto,rapiditàdiesecuzione,economicità
e capacità di processare contemporaneamentemolti campioni. In una prima fase del progetto,
differentiprotocollidiestrazionedelDNAverrannotestatisullediversetipologieditessuto,alfine
divalutareecompararelaloroefficaciainfunzionedeicriteridigiudiziosopracitati.Nellospecifico,
verrannocomparati5metodidiestrazionealfinedivalutarelediverserese,interminidiqualitàe
quantitàdelDNAestratto (Chapelaetal.,2007):1)WizardDNACleanUpSystem(Promega);2)
Nucleospin (Clontech);3) GenomicPrep (Amersham Pharmacia Biotech); 4) CTAB precipitation
method;GeneralRapidEasyExtractionSystem(GREES)DNAKit(InCuraSrl,Italy);5)SSTNE.
Tuttigliestratti(triplicati)verrannoquantificatialQubit,misuandol’assorbanzadelDNAestrattoa
260nm,econtrollandol’impuritàdeiprodottiproteicia280nm.
ü DNAbarcoding
IprocessidilavorazionedeltonnoinscatolacausanoladegradazionedelDNAefannoemergere
difficoltà oggettive nella scelta di regioni target, che possano consentire la discriminazione
diagnosticatralespecieconsideratenelpresentestudio.
L’amplificazionedelgeneperilcitocromob(cytb),chesitrovasulgenomamitocondriale,verrà
eseguita, utilizzando un cocktail di primer, che consentirà di scegliere sequenze target
sufficientemente corte (come descritto in Botti and Giuffrà 2010). La struttura dei primer che
compongonoilcocktail(dal5’al3’)include:
1) unaporzionedel“universalsequencingprimer”(i.e.M13)(partialuniversalprimer,PUP),
chehalafunzionedifacilitarelaseguenteletturadell’interasequenzatarget,partendoda
unsingolofilamentoattraversol’allungamentodelframmentodiPCRamplificato;
2) unaporzione‘readstart’(RS),chefacilital’interpretazionedellasequenzediognifilamento
amplificato.
3) una porzione complementare alla regione fiancheggiante della sequenza target (cocktail
portion,CP).Lacomposizionedellaregionein3’nelleporzioniforwardereversedelcocktail
diprimerèdeterminatainbaseaipolimorfisminotidelleregioniCP,alfinediamplificarele
speciedinostrointeresse.
Fig.1_Rappresentazionegraficadeiprocessidiamplificazioneesequenziamento.
Gliampliconiottenutiverrannosequenziatiusando:i)unprimeruniversale(UP)al5’;ii)laregione
RS;iii)unaporzionenonpolimorficadelCPal3’(Fig.1).
InfunzionedelgradodidegradazionedelDNAestratto,sarannoamplificati3diversiframmentidi
lunghezzadiversa:
1) frammentoABdi226bpcon85SNPsidentificati;
2) frammentoAdi109bpcon45SNPsidentificati;
3) frammentoBdi95bpcon36SNPsidentificati.
Perogniframmentoverrannoutilizzatidiversicocktaildiprimereprimerdisequenziamento.
ü Analisidati
LesequenzeottenuteverrannoanalizzateconilprogrammaMEGA7(MolecularEvolutionGenetics
Analysis)edinfinelesequenzeconsensoverrannoconfrontateconlesequenzepresentiinGenBank
usandoilBLAST(BasicLocalAlignementSearchTool)dellaNCBI(NationalCenterforBiotecnology
Information,USA)perl’identificazionedelframmento.
1. Risultatiattesi
GliobiettiviprincipalidiTropTracesonoquellidiotteneredatiscientificisolidieindipendentidai
datidipescaperridurre il rischiodideterioramentodellepopolazionidi tonnopinnagialla,eal
tempostessodicreareunsistemaditracciabilitàsicuroedefficacechepossagarantirelacorretta
commercializzazionedeitonnitropicali,smascherandopotenzialifrodialimentari.
Gli obiettivi e i risultati del progetto TropTrace avranno un considerevole impatto su diversi
utilizzatorifinali: ilprogrammadiricercamiraarisponderesiaalleesigenzesocio-economichedi
consumatori, produttori e organizzazioni gestionali, sia alle necessità di avanzamento tecnico-
scientifico,fornendostrumentichepossonomigliorareigiàesistentisistemiditracciabilitàlungola
complessafilieraproduttivadeltonnoinscatola.
Generando informazioni accurate e affidabili sulla dimensione effettiva di popolazione (Ne) si
potrannomigliorare imodelli attuali di valutazione delle risorse, con potenziali benefici per gli
organidecisionaliprepostiallagestioneecosistemicadegli stock.Allo stesso tempo, sipotranno
delineare validi riferimenti per azioni di contrasto alle frodi alimentari e alla pesca illegale da
intraprenderedapartedell'industriadellapesca.Leindustrieconservierepotrannotrarrevantaggio
daidatierisultatidiTropTracepervalutaresoluzionitecnologichealternativeagliattualisistemidi
tracciabilità e rendere così i loro prodotti più sostenibili, attribuendo valore aggiunto con
certificazionidiqualitàambientale.